CN115281184A

CN115281184A - 一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和应用

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Publication number: CN115281184A
Application number: CN202211219953.8A
Authority: CN
Inventors: 王韬
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-10-08
Filing date: 2022-10-08
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2042-10-08
Also published as: CN115281184B

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和应用，属于干细胞培养技术领域，所述间充质干细胞复合冻存液中去铁胺终浓度为50‑500µM，曲恩汀终浓度为1‑20µM。本发明提供的复合冻存液相比常规的无DMSO、无血清的基础冻存液可更高效地维持人间充质干细胞长时间冻存和复苏后的细胞活率、贴壁率、增殖、干性以及分化能力，具有较高的临床研究和治疗应用价值。

Description

一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）是一类具有自我更新以及多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪以及多种组织器官的间质中。基于其在免疫调节，病原体清除以及组织器官结构功能修复等方面的重要生物学特性，间充质干细胞已被广泛应用于多种急性以及慢性疾病治疗的研究中，是再生医学技术的核心。

目前，已上市的干细胞类型产品均以细胞注射制剂形式进行规模化生产，以保障干细胞产品批次之间的稳定性。干细胞制剂通常采用超低温冻存的方式进行长期保存和运输。然而，研究发现低温冻存及复苏过程中冰晶引发的细胞机械损伤、氧化自由基以及细胞通透性的变化对干细胞的细胞活率以及免疫调节等生物学性能都有较大的影响。因此，研发出高效保持干细胞冻存及复苏后细胞活性和生物学性能的干细胞冻存保护液是干细胞产业化应用的重要前提。

传统的细胞冻存液主要是由二甲亚砜（DMSO）、胎牛血清和细胞培养基配置而成。血清是细胞生长不可或缺的成分，但动物血清作为异种血清不仅成分复杂，含有大量的氨基酸、核苷、蛋白质、激素、脂类等微量成分，并且上述成分的含量和具体作用仍没有完全确定，加之胎牛血清的来源为不同个体的胎牛，必然导致批间差异大。目前，有使用人血清、血小板裂解液或脐带血清替代胎牛血清的，但无论是动物来源的还是人类来源的血液，其成分都是未知的，且批次之间不可避免地会有差异。

由于动物源血清中存在成分不明的异种免疫源，且DMSO存在细胞毒性，在干细胞临床应用过程中会存在潜在安全性风险。因此，过去几十年大量国内外的研究聚焦于开发无DMSO、无血清的干细胞冻存液。

专利文献202111454669.4公开了一种干细胞冻存液，成分包括体积分数为20-40％基础培养基、10-20％甘油、30-60％人血白蛋白、2-6％海藻糖、0.5-2％甘氨酸或牛磺酸及6-10.5％肌醇半乳糖苷或糖苷类。所述干细胞冻存液中的肌醇半乳糖苷或糖苷类作为稳定剂，具有保护细胞表型的作用，从而提高干细胞在冻存条件下的活性。但肌醇半乳糖苷或糖苷类均是大分子物质，对干细胞微环境影响较大，并且大分子物质空间结构是否对干细胞的生长具有不良影响也没有经过验证。

据公开的国内外专利及研究资料显示，目前无DMSO、无血清的细胞冻存液主要成分包含冷冻保护剂、抗氧化物质以及维持细胞渗透压的溶剂。常用的替代DMSO的冷冻保护剂包括渗透性的甘油、乙二醇、乙酰胺等，以及非渗透性的聚维酮K30、羟乙基淀粉以及海藻糖等。抗氧化物质包括谷胱甘肽、L-肌肽、硫辛酸以及维生素C等。等渗溶剂通常采用葡萄糖氯化钠注射液、复方氨基酸溶液以及复方电解质等。

现有市售或自制的无DMSO、无血清的细胞冻存液仍无法有效抑制干细胞冻存复苏后细胞活率以及生物学功能的降低，进而对干细胞临床应用的有效性产生潜在的不良影响。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和用途，发明人发现适宜浓度的去铁胺和曲恩汀能有效提高冻存复苏后间充质干细胞的细胞活率和生物学功能。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种间充质干细胞复合冻存液，所述复合冻存液中包括基础冻存液、终浓度为50-500 µM的去铁胺和/或终浓度为1-20 µM的曲恩汀。

优选的，所述复合冻存液中含有去铁胺和曲恩汀，去铁胺终浓度为100 µM，曲恩汀终浓度为5 µM。

所述基础冻存液由冷冻保护剂、抗氧化剂和等渗溶液组成。

其中，冷冻保护剂选自甘油、乙二醇、乙酰胺、聚维酮K30、羟乙基淀粉、海藻糖中的一种或两种以上的组合；抗氧化剂选自谷胱甘肽、L-肌肽、硫辛酸、维生素C中的一种或两种以上的组合。

在本发明的优选实施方式中，所述冷冻保护剂为甘油，聚维酮K30和海藻糖的组合；抗氧化剂为谷胱甘肽、L-肌肽以及维生素C的组合；等渗溶液选自葡萄糖氯化钠溶液、复方氨基酸溶液和复方电解质溶液的组合。

更进一步的，按质量份数计，每100份基础冻存液包括甘油5-15份，聚维酮K30 1-4份，海藻糖0.5-2.5份，谷胱甘肽0.1-0.25份，L-肌肽0.05-0.1份，维生素C 0.1-0.3份，复方氨基酸溶液20-30份，复方电解质溶液20-30份，余量为葡萄糖氯化钠溶液。

在本发明的最优选实施方式中，所述基础冻存液包括甘油10份，聚维酮K30 2份，海藻糖1.5份，谷胱甘肽0.15份，L-肌肽0.05份，维生素C 0.3份，复方氨基酸溶液20 份，复方电解质溶液20份，葡萄糖氯化钠溶液46份。

在本发明涉及的复方氨基酸溶液、复方电解质溶液、葡萄糖氯化钠溶液、去铁胺以及曲恩汀优选为常规市售的临床级复方氨基酸注射液（18AA，5%)、复方电解质注射液(勃脉力A)、葡萄糖氯化钠注射液、注射用甲磺酸去铁胺以及盐酸曲恩汀。

第二方面，本发明提供一种间充质干细胞复合冻存液的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）用葡萄糖氯化钠溶液溶解聚维酮K30，海藻糖，谷胱甘肽，L-肌肽和维生素C，加入甘油、复方氨基酸溶液和复方电解质溶液混匀，过滤除菌，4℃条件下保存，得到基础冻存液；

（2）向上述冻存液中加入去铁胺和/或曲恩汀，溶解后过滤除菌，4℃条件下保存，得到间充质干细胞复合冻存液。

第三方面，本发明提供一种复合冻存液在间充质干细胞冻存和复苏中的应用。

所述间充质干细胞为人间充质P1-P9代干细胞，选自脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种。

在本发明的最优选实施方式中，所述间充质干细胞为为人脂肪间充质干细胞。

第四方面，本发明提供一种间充质干细胞的冻存和复苏的方法，包括如下步骤：

（1）将消化所得的人间充质干细胞悬液离心后弃上清，加入复合冻存液，使冻存液中间充质干细胞密度为1-20×10⁶细胞/mL，混匀后置于无菌的冻存管中；

（2）将冻存管放入程序降温仪中进行降温冻存，当温度达到-80℃转入液氮中保存；

（3）将冻存管从液氮中取出后迅速置于37℃水浴，震荡直至冻存液完全融化。

第五方面，本发明提供一种去铁胺和/或曲恩汀在制备间充质干细胞复合冻存液中的用途。

优选的，所述间充质干细胞复合冻存液中含有去铁胺和/或曲恩汀，去铁胺终浓度为50-500 µM，曲恩汀终浓度为1-20 µM。

在本发明的最优选实施方式中，所述间充质干细胞复合冻存液中含有去铁胺和曲恩汀，去铁胺终浓度为100 µM，曲恩汀终浓度为5 µM。

本发明提供的间充质干细胞复合冻存液具有如下有益效果：

1）本发明的间充质干细胞复合冻存液是在前期公开的不含DMSO和动物源血清的细胞冻存液配方基础上，添加具有抗氧化损伤、抗死亡、促细胞增殖并维持细胞活力的去铁胺和曲恩汀，并通过大量实验筛选出了去铁胺和曲恩汀最佳配比，证明所述复合冻存液相比常规的无DMSO、无血清的基础冻存液可更高效地维持人间充质干细胞长时间冻存和复苏后的细胞活率、贴壁率、增殖、干性以及分化能力；

2）此外，发明人意外发现，经所述复合冻存液冻存后的人间充质干细胞，其复苏后的免疫调节能力得到显著增强，因此，本发明提供的复合冻存液对干细胞治疗炎症免疫性相关疾病的有效性具有潜在增强效果；

3）本发明的复合冻存液的成分明确，其中基础冻存液的所用组分均为医用药典注射剂辅料，甲磺酸去铁胺和盐酸曲恩汀均为CFDA和FDA批准的药物，具临床研究和治疗的潜在应用价值。

附图说明

图1表示经对照组1、对照组2、复合冻存液E、复合冻存液F、复合冻存液B处理的人脂肪间充质干细胞细胞周期流式图，和经对照组1、对照组2、复合冻存液E、复合冻存液F、复合冻存液B处理的人脂肪间充质干细胞处于G0-G1期、S期、G2期细胞占比的柱状图。

图2表示经对照组1、对照组2、复合冻存液E、复合冻存液F、复合冻存液B处理的人脂肪间充质干细胞表面抗原（CD29、CD44、CD34、CD45）表达量流式图。

图3第一排表示经对照组1、对照组2、复合冻存液E、复合冻存液F、复合冻存液B处理的人脂肪间充质干细胞经成脂分化诱导后进行油红O染色图；第二排表示经对照组1、对照组2、复合冻存液E、复合冻存液F、复合冻存液B处理的人脂肪间充质干细胞经成骨分化诱导后进行茜素红染色图；第三排表示经对照组1、对照组2、复合冻存液E、复合冻存液F、复合冻存液B处理的人脂肪间充质干细胞经成软骨分化诱导后进行阿利新蓝染色图。

图4表示经对照组1、对照组2、复合冻存液E、复合冻存液F、复合冻存液B处理后人脂肪间充质干细胞治疗脓毒症小鼠生存率图。

图5表示经对照组1、对照组2、复合冻存液E、复合冻存液F、复合冻存液B处理后人脂肪间充质干细胞对脓毒症小鼠血浆炎症因子IL-1β（左），IL-6（中）、TNF-α（右）水平的影响。

图6表示本发明实施例中涉及的不同配方制备的基础冻存液a、基础冻存液b、基础冻存液c。

图7表示本发明实施例中使用基础冻存液a、基础冻存液b、基础冻存液c冻存复苏后的活细胞浓度和细胞存活率。

图8表示本发明实施例中涉及的不同配方制备的间充质干细胞复合冻存液A、间充质干细胞复合冻存液B、间充质干细胞复合冻存液C、间充质干细胞复合冻存液D。

图9表示本发明实施例中使用间充质干细胞复合冻存液A、间充质干细胞复合冻存液B、间充质干细胞复合冻存液C、间充质干细胞复合冻存液D、DMSO冻存液（对照组1）、基础冻存液b（对照组2）冻存复苏后的活细胞浓度和细胞存活率。

图10表示本发明实施例中涉及的不同配方制备的间充质干细胞复合冻存液E、间充质干细胞复合冻存液F、间充质干细胞复合冻存液B、DMSO冻存液（对照组1）、基础冻存液b（对照组2）。

图11表示本发明实施例中使用间充质干细胞复合冻存液E、间充质干细胞复合冻存液F、间充质干细胞复合冻存液B、DMSO冻存液（对照组1）、基础冻存液b（对照组2）处理的人脂肪间充质干细胞细胞贴壁率变化。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明具体实施例中复方氨基酸溶液、复方电解质溶液、葡萄糖氯化钠溶液、去铁胺、曲恩汀为临床级复方氨基酸注射液（18AA，5%)、复方电解质注射液(勃脉力A)、葡萄糖氯化钠注射液、注射用甲磺酸去铁胺、盐酸曲恩汀。

DMSO冻存液由10%的DMSO，20%的胎牛血清和70%的α-MEM基础培养基配制而成。

一、基础冻存液的制备及组分筛选

（1）基础冻存液的制备

选用甘油、聚维酮K30和海藻糖三种渗透和非渗透冷冻保护剂的组合物替代DMSO；选用谷胱甘肽、L-肌肽以及维生素C作为抗氧化剂；等渗溶液为复方氨基酸注射液、复方电解质注射液以及葡萄糖氯化钠注射液。本试验设计的3种基础冻存液的配方（按质量份数计）如图6所示；

具体配置方法为：用葡萄糖氯化钠注射液溶解聚维酮K30，海藻糖，谷胱甘肽，L-肌肽和维生素C，混匀后加入甘油、复方氨基酸溶液和复方电解质溶液，充分混匀后使用0.22µm过滤器过滤除菌，4℃条件下保存。

（2）人脂肪间充质干细胞冻存及复苏

S1：取P5代人脂肪间充质干细胞，当细胞融合度达到85%左右使用TrypLE消化细胞，随后用α-MEM基础培养基稀释以终止消化获得细胞悬液，离心后弃上清，分别使用上述3种基础冻存液进行重悬，混匀后置于无菌冻存管中，细胞密度控制在约1 × 10⁷ cells/mL，设置DMSO冻存液为对照组；

S2：随后将冻存管放入程序降温仪中进行降温冻存，当温度达到-80℃转入液氮保存；

S3：冻存1个月后，将冻存管从液氮中取出后迅速置于37℃水浴，震荡直至细胞冻存悬液完全融化（冻存液1mL复苏时间约3min）。

（3）细胞计数及活率检测

复苏的细胞冻存悬液离心后，去除冻存液并使用α-MEM基础培养基将细胞浓度稀释到约1× 10⁶ cells/mL。取10 µL细胞悬液和10 µL AOPI试剂混匀后加到载玻片中，使用CountStar细胞计数仪进行细胞的计数和活率检测，结果如图7所示。

在三种不同配方的基础冻存液中，基础冻存液b所冻存的干细胞复苏后的细胞活率最高，但与含DMSO的对照组相比，其对干细胞的冻存复苏过程中的保护效果仍较差（冻存细胞活率：88.782% vs. 91.79%）。因此，有必要在后续实施例中在基础冻存液b配方基础上添加可抗细胞死亡并促进细胞活力的物质，进而对冻存液的冻存效果进行进一步优化。

二、间充质干细胞复合冻存液的制备及组分筛选

因此，申请人尝试将其作为组合物加入到基础冻存液b中。通过比较添加不同浓度的去铁胺和曲恩汀的复合冻存液处理下人脂肪间充质干细胞冻存复苏后活率的变化，筛选出最佳的配比的复合冻存液配方。

（1）间充质干细胞复合冻存液的制备

在基础细胞冻存液b分别添加不同浓度的去铁胺和曲恩汀组合物，具体配方如图8所示。

具体配置方法为：在基础细胞冻存液b中添加不同浓度的甲磺酸去铁胺和盐酸曲恩汀，充分混匀后使用0.22µm过滤器过滤除菌，4℃条件下保存。

（2）人脂肪间充质干细胞冻存及复苏

S1：取P5代人脂肪间充质干细胞，当细胞融合度达到85%左右使用TrypLE消化细胞，随后用α-MEM基础培养基稀释以终止消化获得细胞悬液，离心后弃上清，分别使用上述4种不同配方复合冻存液进行重悬，混匀后置于无菌的冻存管中，细胞密度控制在约1 ×10⁷cells/mL，设置DMSO冻存液为对照组1，基础冻存液b为对照组2；

（3）细胞计数及活率检测

复苏的细胞冻存悬液离心后，去除冻存液并使用α-MEM基础培养基将细胞浓度稀释到1× 10⁶ cells/mL左右。取10 µL细胞悬液和10 µL AOPI试剂混匀后加到载玻片中，使用CountStar细胞计数仪进行细胞的计数和活率检测，结果如图9所示。

图中结果显示，不同浓度的去铁胺和曲恩汀配比的复合冻存液处理组相比于对照组2（基础冻存液b），人脂肪间充质干细胞复苏后的细胞活率均显著提高；其中复合冻存液B的冻存复苏后的细胞活率高达97.457%，显著高于对照组1（DMSO冻存液）（91.35%），进一步说明其冻存效果最佳。

因此，基于上述结果，本发明的人间充质干细胞复合冻存液的优选配方如下：100质量份基础冻存液b（甘油10%，聚维酮K30 2%，海藻糖1.5%，谷胱甘肽0.15%，L-肌肽0.05%，维生素C 0.3%，复方氨基酸溶液20 %，复方电解质溶液20%，葡萄糖氯化钠溶液46%）中添加终浓度为100 µM甲磺酸去铁胺和终浓度为5 µM盐酸曲恩汀。

三、间充质干细胞复合冻存液冻存效果验证

为进一步表征本发明筛选得到的复合冻存液对人间充质干细胞冻存复苏过程中的高效保护作用，本发明还从干细胞细胞的贴壁率、增殖、干性指标、分化能力以及免疫调节能力等方面开展了相应的实验研究，验证其冻存效果。

（1）复合冻存液配置及实验分组

具体实验分组如图10所示：

具体配置方法为：在基础冻存液b中添加上述浓度的甲磺酸去铁胺和/或盐酸曲恩汀，充分混匀后使用0.22 µm过滤器过滤除菌，放入4℃条件下保存。

（2）人脂肪间充质干细胞冻存及复苏

S1：取P5代人脂肪间充质干细胞，当细胞融合度达到85%左右使用TrypLE消化细胞，随后用α-MEM基础培养基稀释以终止消化获得细胞悬液，离心后弃上清，分别使用上述5种冻存液进行重悬，混匀后置于无菌冻存管中，细胞密度控制在约1 × 10⁷cells/mL；

S2：随后将冻存管放入程序降温仪中进行降温冻存，当温度达到-80℃转入液氮保存。

（3）细胞贴壁率检测

相比于细胞活率检测，细胞贴壁率更能反映冻存复苏过程对细胞活力的影响。因此，本发明通过比较不同配方的冻存液对人脂肪间充质干细胞冻存不同时间后的细胞贴壁率，进一步论证本发明所述的复合冻存液的有益效果。具体步骤如下：

S1：上述5种冻存液（对照组1-2，复合冻存液B、E、F）处理的人脂肪间充质干细胞分别于冻存后的第1，6，12月进行细胞复苏。复苏后的细胞悬液离心去上清后，加入α-MEM基础培养基进行稀释，取10 μL 细胞悬液并使用细胞计数仪进行细胞贴壁前计数；

S2：选取1 x 10⁶接种到25 cm²的细胞培养瓶中，进行贴壁培养3h；

S3：随后使用TrypLE消化细胞，用α-MEM基础培养基稀释以终止消化，获得的细胞悬液离心后去上清，加入10 mL的α-MEM基础培养基进行重悬，取10 μL 细胞悬液，并使用细胞计数仪进行细胞计数，计算得出贴壁后的细胞总数；

S4：细胞贴壁率（%）= 贴壁后细胞总数/1 × 10⁶ × 100%。

不同实验分组细胞在冻存后的第1，6，12个月的细胞贴壁率结果如图11所示。

图中结果显示，使用复合冻存液B冻存的人脂肪间充质干细胞在冻存后1个月复苏的细胞贴壁率高达93%以上，优于对照组1（91.92%），对照组2（83.19%）以及单独添加去铁胺和曲恩汀的复合冻存液E（89.78%）和复合冻存液F（91.39%）。随着冻存时间的延长（冻存12个月），仅有复合冻存液B处理的细胞复苏后细胞贴壁率仍保持90%以上，证明了复合冻存液B对人脂肪间充质干细胞的冻存效果最佳。

（4）细胞增殖检测

研究表明干细胞冻存复苏的过程对其增殖能力有所影响，因此，本发明还通过流式细胞仪检测不同配方冻存液对人脂肪间充质干细胞细胞周期的影响，来论证本发明所述的复合冻存液的有益效果。该部分实验使用的细胞周期检测试剂和方法为常规的市售细胞周期检测试剂盒。具体步骤如下：

S1：上述5种冻存液（对照组1-2，复合冻存液B、E、F）处理的人脂肪间充质干细胞于冻存后1个月进行细胞复苏，复苏后的细胞悬液离心去上清后，进行计数后，接种1 × 10⁵细胞到T25细胞培养瓶中，于细胞培养箱中培养48h；

S2：用TrypLE消化细胞获得细胞悬液，1000 g离心5 min后，弃上清。用1 mL预冷的PBS润洗细胞一次，离心后收集细胞；

S3：细胞沉淀用1 mL预冷的70%乙醇混匀，4℃固定2 h，1000 g离心5 min后弃上清，用1 mL预冷的PBS重悬，然后再次1000 g离心5 min沉淀细胞；

S4：在细胞样品加入0.5 mL新鲜配置的碘化丙啶染色液，轻轻混匀重悬细胞，37℃避光孵育30min；

S5：细胞悬液用400目筛网过滤，用流式细胞仪在488 nm波长处检测，采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

细胞周期检测结果中S和G2期的细胞为处于增殖状态的细胞，将S和G2期细胞所占的比例相加，即可得到整体处于增殖状态细胞的比例。具体结果如图1中所示：使用复合冻存液B冻存的人脂肪间充质干细胞的增殖活性最高（S+G2：46.48%），优于对照组1的DMSO冻存液冻存的细胞（S+G2：42.33%）。对照组2中使用基础冻存液b冻存的细胞增殖活力最低（S+G2：31.8%），而单独添加去铁胺和曲恩汀的复合冻存液E和复合冻存液F，其冻存后细胞的增殖活力相对于对照组2均有所提高（S+G2：37.57%和39.63%）。以上结果说明，基础冻存液中添加去铁胺和曲恩汀均可以显著提高冻存复苏后干细胞的增值能力，而二者组合使用，冻存效果更佳且优于传统的DMSO冻存液。

（5）干细胞表面抗原检测

干细胞极易受到外环境的影响而发生分化，进而改变其表面抗原的表达。脂肪间充质干细胞具有多种特异性的表面抗原，包括CD29，CD44，CD73, CD90，CD105 等。通常可使用流式细胞仪检测不同的阳性和阴性表面抗原来鉴定干细胞的干性特征。本发明中通过检测2种阳性（CD29和CD44）以及2种阴性（CD34和CD45）表面抗原指标来评定不同冻存液处理后细胞的干性特征的差异，具体步骤如下：

S1：上述5种冻存液（对照组1-2，复合冻存液B、E、F）处理的人脂肪间充质干细胞于冻存后1个月进行细胞复苏，复苏后的细胞悬液离心去上清，PBS洗涤后配制成浓度为1 ×10⁶ 细胞每100 µL的单细胞悬液，每个实验组细胞等分为5份；

S2：每份细胞（1 × 10⁶ /100 µL)中分别加入CD29，CD44, CD34和CD45单克隆抗体10 µL；阴性对照的细胞中加入10 µL体积的FITC Mouse IgG1、APC Mouse IgG2b以及PEMouse IgG1抗体，室温孵育30 min后，用PBS洗涤2次后，用流式细胞仪检测。

结果如图2所示，不同配方的冻存液冻存的人脂肪间充质干细胞的阳性干性指标（CD29和CD44）均大于95%，阴性指标（CD34和CD45）均小于2%。说明本发明所述的复合冻存液处理间充质干细胞后不影响其干性特征。

（6）干细胞分化能力检测

间充质干细胞具有多向分化潜能，在特定条件下对间充质干细胞进行刺激，可诱导干细胞定向分化成特定功能的细胞，例如脂肪细胞、成骨细胞以及成软骨细胞。因此，通常可以通过检测间充质干细胞冻存复苏后分化能力的变化情况反映干细胞的干性和生物学功能。本发明中检测了不同配方冻存液冻存复苏后人脂肪间充质干细胞的分化潜能的变化情况。本发明中所用的诱导分化培养基均为常规的市售商品，使用方法按照相应的说明书进行操作。大体实验方案如下：

S1：成脂分化诱导：使用上述5种冻存液（对照组1-2，复合冻存液B、E、F）冻存1个月的人脂肪间充质干细胞进行复苏，随后按照1 × 10⁵/孔的细胞密度接种到6孔板中，置于培养箱中培养，待细胞融合度达到100%时，弃去原培养基，加入2 mL成脂诱导培养基进行培养，每4天更换培养基（A液和B液交替作用3次），第16天作用进行油红O染色，观察成脂情况；

S2：成骨分化诱导：使用上述5种冻存液（对照组1-2，复合冻存液B、E、F）冻存1个月的人脂肪间充质干细胞进行复苏，随后按照1 × 10⁵/孔的细胞密度接种到6孔板中，置于培养箱中培养，待细胞融合度达到60%-70%时，弃去原培养基，加入2 mL成骨诱导分化完全培养基进行培养，每隔3天更新培养基，诱导2-4周后，进行茜素红染色，观察成骨情况；

S3：成软骨分化诱导：使用上述5种冻存液（对照组1-2，复合冻存液B、E、F）冻存1个月的人脂肪间充质干细胞进行复苏，随后将4 × 10⁵个细胞转移到15 mL离心管中，离心去上清后，使用预混液重悬洗涤2次后，加入0.5 mL的成软骨诱导分化完全培养基重悬，150g离心5 min。随后将离心管盖子拧松，放置于培养箱中培养24-48h，直到细胞团出现聚拢的现象，轻弹离心管的底部使细胞球悬浮在培养基中。随后每3天换液一次，连续诱导3-4周后，对细胞团进行阿利新蓝染色，观察成软骨情况。

经成脂诱导后，人脂肪间充质干细胞油红O染色呈阳性，细胞形态由长梭形转变为扁平、肥大且含有大量被染成棕红色脂滴的脂肪细胞；经成骨诱导后，人脂肪间充质干细胞中出现大量被茜素红染成红色的钙结节；经成软骨诱导后，人脂肪间充质干细胞细胞的胞浆内出现亮蓝色的蛋白聚糖颗粒。

不同配方冻存液处理的干细胞的成脂、成骨和成软骨的染色结果如图3所示：对照组1和复合冻存液B与其他实验组相比，其成脂、成骨以及成软骨的染色的程度均更高，说明其冻存复苏后的干细胞的干性和分化能力更强。进一步证实了本发明的复合冻存液具有高效保护冻存复苏过程中间充质干细胞干性和生物学功能的作用。

（7）体内免疫调节能力检测

研究报道表明，间充质干细胞回输治疗多种急慢性疾病的主要作用机制在于其对免疫系统的调节能力。近年来有研究发现，间充质干细胞冻存复苏的过程会对其免疫调节能力产生一定的抑制作用，而这一过程主要与冻存复苏过程中产生的氧化损伤有关。因此，为进一步明确本发明中的复合冻存液是否可以有效的保护间充质干细胞在体内的免疫调节能力，我们采用了免疫系统严重紊乱的脓毒症小鼠模型，通过输入不同配方冻存液冻存复苏后的人脂肪间充质干细胞，研究其对脓毒症小鼠生存率以及免疫水平的影响。具体方案如下：

Ⅰ、脓毒症小鼠模型的构建

盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture，CLP）诱导的脓毒症模型是公认的脓毒症的金标准模型，也是人类脓毒症临床前试验中最常见的实验动物模型。本研究选用C57BL/6小鼠，采用18 G针尖在双侧结扎的1 cm盲肠上进行2次贯穿，构建小鼠脓毒症模型。假手术组小鼠仅开胸不结扎盲肠和穿孔，作为实验对照。

Ⅱ、尾静脉输入人脂肪间充质干细胞

CLP术后6h，取上述5种冻存液（对照组1-2，复合冻存液B、E、F）冻存的P5代人脂肪间充质干细胞，37℃快速复温解冻后直接使用复方电解质溶液稀释细胞浓度至2.5 ×105/ 100 µL。取200 µL细胞悬液通过尾静脉注射的方式输入至小鼠体内。

Ⅲ、小鼠生存率检测

CLP术后每12 h观察并统计小鼠的生存率，一直持续到术后168 h。

结果如图4，CLP模型组的7天生存率为13.3%；对照组1（DMSO冻存液）和对照组2（基础冻存液b）处理后的干细胞，输入脓毒症小鼠后其7天生存率得到显著提高（分别为20% 和24%）；相比之下，在基础成分冻存液的中添加了去铁胺或曲恩汀的复合冻存液E和F组的脓毒症小鼠的生存率得到进一步提高（均为31.6%），而同时添加这两种物质的复合冻存液B组的脓毒症小鼠的生存率最高（为42.3%）。以上结果说明，本发明所述的添加去铁胺和曲恩汀的复合冻存液对脓毒症小鼠的治疗效果最佳。

Ⅳ、血浆炎症因子水平检测

研究表明，干细胞主要是通过免疫调控的作用来改善脓毒症小鼠机体的炎症水平，进而提高小鼠的生存率。干细胞输入后对小鼠的免疫水平的调控可以通过检测血浆中促炎（IL-1β，IL-6和TNF-α）的变化来反映。因此，本发明还通过检测不同配方冻存液处理后，干细胞对脓毒症小鼠血浆炎症因子的影响来反映不同冻存液配方对其免疫调控能力的变化情况。

在干细胞输入后6h对小鼠进行麻醉，通过眼眶采血的方式，获得不同实验组小鼠的全血约200 µL，加入含有EDTA-2K的EP管中。2000g 离心10min后分离出血浆。通过常规市售的细胞因子ELISA检测试剂盒分别检测血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

结果如图5所示，与假手术组相比，CLP模型组脓毒症小鼠血浆中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著升高，而不同配方冻存液处理的干细胞输入后均可显著抑制其血浆水平，说明干细胞输入发挥了免疫调节的作用。具体来说，对照组1冻存的干细胞治疗脓毒症小鼠后其血浆中的IL-1β、 IL-6和TNF-α浓度相较于未治疗组（CLP）分别降低了23%，34%和49%；对照组2冻存的干细胞的对三种促炎因子的抑制效果与对照组1相近；单独添加去铁胺或曲恩汀的复合冻存液E和F冻存的干细胞其对脓毒症小鼠血浆炎症因子的水平的抑制作用相比于对照组1和2有进一步降低的趋势；而同时添加了去铁胺和曲恩汀的复合冻存液B组治疗后的脓毒症小鼠血浆中的IL-1β、 IL-6和TNF-α浓度分别降低56%，59% 以及64%，且更接近假手术组的促炎因子的水平。该部分结果进一步说明了，经添加去铁胺和曲恩汀的复合冻存液B处理后的人脂肪间充质干细胞相比于传统的DMSO冻存液，具有更强的免疫调节能力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种间充质干细胞复合冻存液，所述复合冻存液中包括基础冻存液、终浓度为50-500 µM的去铁胺和/或终浓度为1-20 µM的曲恩汀。

2.根据权利要求1所述的复合冻存液，其特征在于，所述基础冻存液由冷冻保护剂、抗氧化剂和等渗溶液组成，其中，冷冻保护剂选自甘油、乙二醇、乙酰胺、聚维酮K30、羟乙基淀粉、海藻糖中的一种或两种以上的组合；抗氧化剂选自谷胱甘肽、L-肌肽、硫辛酸、维生素C中的一种或两种以上的组合。

3.根据权利要求1所述的复合冻存液，其特征在于，所述复合冻存液中含有去铁胺和曲恩汀，去铁胺终浓度为100 µM，曲恩汀终浓度为5 µM。

4.根据权利要求2所述的复合冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂为甘油，聚维酮K30和海藻糖的组合；抗氧化剂为谷胱甘肽、L-肌肽以及维生素C的组合；等渗溶液选自葡萄糖氯化钠溶液、复方氨基酸溶液和复方电解质溶液的组合。

5.根据权利要求2所述的复合冻存液，其特征在于，按质量份数计，每100份基础冻存液包括甘油5-15份，聚维酮K301-4份，海藻糖0.5-2.5份，谷胱甘肽0.1-0.25份，L-肌肽0.05-0.1份，维生素C 0.1-0.3份，复方氨基酸溶液20-30份，复方电解质溶液20-30份，余量为葡萄糖氯化钠溶液。

6.根据权利要求5所述的复合冻存液，其特征在于，所述基础冻存液包括甘油10份，聚维酮K302份，海藻糖1.5份，谷胱甘肽0.15份，L-肌肽0.05份，维生素C 0.3份，复方氨基酸溶液20 份，复方电解质溶液20份，葡萄糖氯化钠溶液46份。

7.一种权利要求1-6任一所述的间充质干细胞复合冻存液的制备方法，具体包括以下步骤：

8.一种权利要求1-6任一所述的复合冻存液在间充质干细胞冻存和复苏中的应用，所述间充质干细胞为人间充质P1-P9代干细胞，选自脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种。