CN101160046A - 提供容易获得的源于外周血的细胞材料的方法及其组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及哺乳动物外周外周血干细胞优选CD34+/CD38－细胞的TVEMF扩增，也涉及来源于TVEMF扩增细胞的组合物，还涉及用所述组合物治疗疾病或修复组织的方法。

Description

提供容易获得的源于外周血的细胞材料的方法及其组合物

技术领域

本发明涉及在TVEMF-生物反应器中制备的来自外周血的成体干细胞、以及这种制备方法、其组合物和使用所述细胞或组合物治疗哺乳动物的方法。

技术背景

哺乳动物尤其是人体组织的再生长期以来是医学界的理想。迄今，人体组织的修复很大程度上通过移植来自供体的相似组织已经实现。基本上始自从双胞胎Herrick中一个向另一个的肾脏移植，以及后来南非医生Christian Barnard在1967年12月3日完成的从Denise Darval向Louis Washkansky的全世界著名的心脏移植，组织移植成为了用于延长晚期患者寿命的广泛接受的方法。

人体组织移植从它的最初应用开始就遇到了重大问题，主要是由于身体的自然免疫系统而产生的组织排斥。这通常造成应用组织移植时生命的延长非常有限(Washkansky手术后只活了18天)。

为了克服身体免疫系统的问题，很快开发出了许多抗排斥药(比如Imuran、环孢霉素)以抑制免疫系统并因此延长组织在排斥之前的应用。但是，排斥问题仍然产生对组织移植替代方法的需求。

骨髓移植也有应用，并且仍是治疗一些疾病比如白血病的所选择疗法，以修复某些组织比如骨髓，但是骨髓移植也存在问题。它需要供体匹配(不到50％能找到)；它会引起疼痛，且昂贵并具有风险。因此，骨髓移植的替代方法是非常希望得到的。组织干细胞的移植比如在美国专利No.6,129,911中的肝脏干细胞移植也有类似的限制，使得它们的广泛应用存在疑问。

近年来，研究人员试验了应用多能性胚胎干细胞作为组织移植的替代手段。应用胚胎干细胞背后的理论是它们在理论上能够用于再生身体内几乎任何组织。然而，胚胎干细胞在组织再生上的应用也遇到了问题。在这些问题中较为严重的有，所移植的胚胎干细胞的可控性受到限制，它们有时生长成肿瘤，并且可用于研究的人胚胎干细胞被患者的免疫系统所排斥(Nature，June 17，2002：Pearson，“Stem Cell Hopes Double”，news@nature.com，published online：21June 2002)。另外，胚胎干细胞的广泛应用受到伦理、道德、和政治因素的阻碍，使得它的广泛应用仍然是存在疑问的。

干细胞的多能性特点是首先在从骨髓中找到的成体干细胞中发现的。Verfaille，C.M.et al.，Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow.Nature 417，published online 20 June；doi：10.1038/nature00900，(2002)cited by Pearson，H.Stem cellhopes double.news@nature.com，published online：21 June 2002；doi：10.1038/news020617-11.

Boyse et al.，美国专利No.6,569,427 B1公开了低温保存以及低温保存的胎儿和新生儿血液可用于治疗或预防多种疾病与病症比如贫血、恶性肿瘤、自身免疫疾病、和多种免疫功能障碍及缺陷。Boyse还公开了造血重建在使用异源基因序列的基因疗法中的应用。但是，Boyse的公开由于缺乏用于治疗的细胞扩增而停止。CorCell，一个脐带血库，提供了对脐带血干细胞的扩增、低温保存、和移植的统计。”Expansion of Umbilical Cord Blood Stem Cells”，InformationSheet Umbilical Cord Blood，CorCell，Inc.(2003).一种扩增方法公开了应用一种生物反应器，该生物反应器带有位于中央的基于胶原蛋白的基质。Research Center Julich：Blood Stem Cells from theBioreactor.Press release May 17，2001。

研究继续致力于阐明有关干细胞扩增的分子机制。例如，CorCell的文章公开了被命名为Delta-1的信号分子有助于脐带血干细胞的发育。Ohishi K.et al.，Delta-1 enhances marrow and thymusrepopulating ability of human CD34+/CD38-cord blood cells.Clin.Invest.110：1165-1174(2002)。

在本申请中，术语“外周血”意思是指在哺乳动物中全身性循环或曾经循环的血液。术语“外周血细胞”意思是指在外周血中发现的细胞。

尽管在很多成熟组织中可以发现成体干细胞，但是发现它们的量更少并且更难定位。此外，组织中发现的干细胞可能专注于该组织，很少具有作为真正多能细胞的功能。然而，外周血细胞比组织中干细胞更容易获得。

因此，需要提供不基于器官移植、骨髓移植、或者胚胎干细胞的修复人体组织的方法和程序，同时还需要提供不太可能引起免疫应答的已扩增外周血干细胞的组合物，优选以治疗状况和剂量，以在数小时而不是数天内应用。

发明概述

本发明部分涉及来自哺乳动物优选人的外周血干细胞，优选其中所述干细胞是TVEMF扩增的。本发明也涉及来自哺乳动物优选人的外周血干细胞，其中所述干细胞在单位体积的数量上至少是其来源材料(例如，TVEMF扩增之前所述干细胞的外周血来源)的7倍；并且其中外周血干细胞具有与天然存在(即来源)的外周血干细胞相同或基本相同的三维结构和细胞-细胞支持(cell-to-cellsupport)以及细胞-细胞结构(cell-to-cell geometry)。此种细胞优选由此处所述的TVEMF扩增程序来制备。本发明也涉及包含这些细胞的组合物，其按照需要添加其它成分，包括药用可接受的载体、低温保存剂、和细胞培养基。

本发明也涉及制备干细胞和干细胞组合物的方法，这是通过以下步骤：将外周血混合物置于TVEMF生物反应器的培养室中，对混合物施加TVEMF，以及TVEMF扩增TVEMF生物反应器中的外周血干细胞，以制备TVEMF扩增的外周血干细胞和干细胞组合物。优选地，施加在细胞上的TVEMF为约0.05到约6.0高斯。本发明还涉及低温保存扩增干细胞的方法，这是通过将温度降低到-120℃至-196℃维持1年或更长，之后将该温度升高至适于将细胞导入哺乳动物的温度。

本发明也涉及使用本发明的干细胞和干细胞组合物治疗哺乳动物的方法。此治疗可用于组织修复和再生、以治疗疾病，或者本申请讨论的任何其它用途。本发明也包括用于治疗此处所定义任何疾病、或者用于修复组织或器官的组合物和方法，其中包含本发明的干细胞。本发明还包括本发明的组合物在制备用于治疗本文所讨论任何疾病、或者用于本文所述组织修复或再生的药物中的用途。

特别期望根据本发明的低温TVEMF扩增细胞从出生或幼龄就可获得，例如在每分钟延迟治疗都可能意味着生死之别的紧急危机中。此外，在本发明中使用外周血使得本发明细胞和组合物容易获得(至少考虑到外周血的容易获得性)。

附图简述

附图中，

图1以示意图方式举例说明生物反应器的培养载体流动回路的一个优选实施方案；

图2是本发明的TVEMF生物反应器的一个优选实施方案的侧视图；

图3是图2的TVEMF生物反应器的一个优选实施方案的侧面投影图；

图4是TVEMF生物反应器的一个优选实施方案的俯视截面图；

图5是一种TVEMF生物反应器的俯视截面图；

图6是随时间变化电磁力装置的侧视图，该装置能容纳生物反应器并向生物反应器提供随时间变化的电磁力；

图7是图6所示装置的前视图；以及

图8是图6所示装置的前视图，进一步显示其中的生物反应器。

附图详述

用最简单的话来说，旋转式TVEMF生物反应器包含细胞培养腔室和随时间变化的电磁力源。在运行中，外周血混合物被置于细胞培养腔室中。细胞培养腔室旋转一段时间，在此期间，随时间变化电磁力源在腔室内产生随时间变化的电磁力。在时间结束时，将TVEMF扩增的外周血混合物从腔室移出。在较复杂的TVEMF生物反应器系统中，随时间变化电磁力源可以集成到TVEMF生物反应器，如图2-5举例所示，但是也可与生物反应器相邻，如在图6-8中。另外，向细胞提供支持的流体载体比如细胞培养基或缓冲液(优选与加到外周血混合物中的培养基相似，如下讨论)可以周期性更新和移出。在此处描述优选的TVEMF生物反应器。

现在参看图1，其举例说明在一个完整的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器培养系统中培养载体流动回路1的一个优选实施方案，所述生物反应器培养系统带有细胞培养腔室19，优选旋转式细胞培养腔室，充氧器21，辅助培养载体定向流动的装置，优选通过使用主泵15，以及供应多支管17，其选择性输入培养载体需求，比如但不限于，营养物3、缓冲剂5、新鲜培养基7、细胞因子9、生长因子11、以及激素13。在此优选实施方案中，主泵15提供新鲜流体载体到充氧器21，流体载体在此被充入氧气并且通过细胞培养腔室19。来自细胞培养腔室19的使用后流体载体中的废物被移去并传送到废物18，剩下的细胞培养载体返回到多支管17，在使用泵15通过充氧器21循环到细胞培养腔室19之前，必要时它在此接受新鲜补充。

在培养载体流动回路1中，培养载体通过腔室19中的活细胞培养物并且围绕如图1所示的培养载体流动回路1。在此回路1中，根据化学传感器(未显示)进行调节，以维持细胞培养反应腔室19中的恒定条件。控制二氧化碳压力并导入酸或碱以校正pH值。氧气、氮气、和二氧化碳溶解在气体交换系统(未显示)中，以支持细胞呼吸。闭合回路1添加氧气，并从循环气体容量中移去二氧化碳。尽管图1是可用于本发明的培养载体流动回路的一个优选实施方案，但是本发明并不限于此。可以手动或者自动或者通过其他控制手段向生物反应器输入培养载体比如但不限于氧气、营养物、缓冲剂、新鲜培养基、细胞因子、生长因子、和激素，比如可以类似于废物和二氧化碳的控制和移除。

图2和3举例说明带有集成的随时间变化电磁力源的TVEMF生物反应器10的一个优选实施方案。图4是以优选方式用于本发明的一种旋转式TVEMF生物反应器10的横截面图。图4的TVEMF生物反应器10举例说明带有集成的随时间变化电磁力源。图5也举例说明带有集成的随时间变化电磁力源的TVEMF生物反应器的一个优选实施方案。图6-8显示带有相邻的随时间变化电磁力源的旋转式生物反应器。

现在转到图2，图2举例说明的是本发明的TVEMF生物反应器10的一个优选实施方案的侧视图。图2包含由基座112支撑的马达支架111。马达113位于马达支架111内部，且通过第一线114和第二线115连接至其内带有控制装置的控制盒116，由此通过转动控制钮117可对马达113的转速进行增量控制。马达支架111内部设置有马达113，使得马达轴118穿过支架111延伸，且马达轴118是径向的，使得轴118的中心与在径向腔室119位置的地球平面平行，优选地用包括但不限于塑料的透明材料制成。

在此优选实施方案中，径向腔室119连接到轴118使得腔室119围绕径向轴旋转，而径向轴与地球平面平行。腔室119被线圈120所缠绕。线圈120的尺寸和缠绕圈数使得，当优选为0.1mA到1000mA的方波电流供应在线圈120上时，在腔室119内产生优选为0.05高斯到6高斯的随时间变化的电磁力。线圈120在轴118的末端通过线123和124连接至第一环121和第二环122。然后，环121和122与第一电磁传送线125和第二电磁传送线128相接触，使得腔室119可以旋转同时电流恒定地供应到线圈120上。电磁发生装置126与线125、128相连接。通过旋转电磁发生装置钮127调节其输出，从而使得电磁发生装置126提供方波到线125、128和线圈120上。

图3是可用于本发明中的图2所示TVEMF生物反应器10的侧面投影图。

现在转到图4中举例说明的带有培养腔室230的旋转式TVEMF生物反应器10，该腔室优选是透明的，并且适于在其内含有外周血混合物，另外包含外部支架220，其包括第一290和第二291圆柱形横向末端帽构件，该构件与第一228和第三229末端表面相对，末端表面设置成接受内部圆柱管状玻璃构件293和外部管状玻璃构件294。提供合适的压力密封。在内部293与外部294管状构件之间是环形线加热器296，其用于获得细胞生长的合适的培养温度。所述线加热器296也可用作随时间变化的电磁力装置，用以给培养腔室230提供随时间变化的电场，或者，如图5所述，独立的线圈144可用于提供随时间变化的电磁力。第一末端帽构件290和第二末端帽构件291具有内部弯曲表面，其与末端表面228、229相邻，以促进腔室230内的混合物流动更平滑。第一末端帽构件290和第二末端帽构件291分别具有第一中央流体传递轴颈构件292和第二中央流体传递轴颈构件295，其分别旋转式接受在输入轴223和输出轴225上。每个传递轴颈构件294、295具有凸缘以承载在末端帽构件290、291中的凹陷沉孔中，并且其上附着第一锁紧垫圈环297和第二锁紧垫圈环298以防止相对于轴223、225的径向运动。每个轴颈构件294、295具有中间环形凹陷，其与径向扩展的、沿圆周布置的通道相连。轴颈构件292、295上的每个环形凹陷通过末端帽构件290和291中的第一放射状设置通道278和第二放射状设置通道279分别与第一输入偶合件203和第二输入偶合件204相偶合。放射状通道278或279中的载体流动通过轴颈构件294或295中的第一环形凹陷和径向通道，以允许载体通过轴颈构件292、295进入到达轴颈292、295的每个末端，在此其进入围绕轴223、225。

附着在末端帽构件290和291的是包含滚珠轴承的第一管状轴承支架205和第二管状轴承支架206，该滚珠轴承相对地支撑输入轴223和输出轴225上的外部支架220。第一轴承支架205具有附着的第一链轮210，其用于为外部支架220提供旋转驱动，其旋转方向围绕输入轴223和输出轴225以及径向轴221。第一轴承支架205和第二轴承支架206也具备从线加热器296和任何其它传感器向外供电的功能。

内部滤器装置235包括内部管状组件215和外部管状组件216，其沿它们的长度方向具有孔或洞，该装置有带孔的第一217和第二218内部滤器装置末端帽组件。内部管状组件215构建成两部分，其两部分带有互锁的位于中央的偶合部分，其每一部分分别附着于末端帽217或218。外部管状组件216设置在第一217和第二内部滤器装置末端帽组件之间。

所述末端帽组件217、218分别被旋转式支持在输入轴223和输出轴225之上。内部组件215通过钉和中央定位的(interfitting)凹槽219旋转式附着至输出轴225。十微米织法的聚酯布224布置在外部组件216的外表面之上，并且附着在任一末端的O环。因为内部组件215被偶合钉附着在输出驱动轴225上的槽，所以输出驱动轴225可旋转内部组件215。所述内部组件215与第一217和第二218末端帽相偶合，所述帽支持外部组件216。输出轴225延伸通过第一静止支架240中的轴承，并与第一链轮241相偶合。如举例所示，输出轴225具有管状孔222，其从位于密封之间的第一静止支架240中的第一端口或通道289延伸至内部组件215，使得流体载体的流动可从内部组件215中通过静止支架240而退出。

内部组件235的第一217和第二218末端帽与外部支架220中的轴颈292、295之间是叶片组件50a和50b的第一227和第二226毂。在输入轴223上的第二毂226通过钉231偶合至输入轴223，使得第二毂226随输入轴223旋转。每个毂227、226具有轴向延伸的通道，用于传送载体使之穿过毂。

输入轴223延伸穿过第二静止支架260中的轴承，该支架用于旋转式支持输入轴223。第二径向通道267延伸穿过输入轴223到保持垫圈和环的过渡位置，所述垫圈和环设置在面板与支架260之间的第二环状凹陷232中。第二末端帽组件291中的第三放射状通道272允许凹陷中流体载体从第二末端帽组件291中退出。尽管没有显示，第三通道272连接穿过管线和Y型至通道278和279的每个。

图4中显示样品端口，其中沿第一轴延伸的第一钻孔237与腔室230的角233相交，形成受限的开口234。该钻孔237在一端带有沉孔和带螺纹的环，以螺纹性接受圆柱形阀组件236。阀组件236具有互补成形的顶端，以接合开口234并稍微突出到腔室230的内部。阀组件236上的O环243提供密封。沿第二轴的第二钻孔244与第一钻孔237相交在O环243与开口234之间的位置。弹性体或塑料阻塞物245封闭了第二钻孔244，并且可用皮下注射器进入用以取样品。为了取样品，阀组件236向后移，以使得开口234和钻孔244可以进入。然后可使用注射器提取样品，开口234可被重新封闭。没有外部污染到达TVEMF生物反应器10的内部。

在运行中，载体输入到第二端口或通道266，而后到轴通道，由此通过第三放射状通道272到达第一放射状设置的通道278和第二放射状设置的通道279。当载体通过轴颈292、294中的径向通道进入腔室230时，载体撞击在毂227、226的末端表面228、229上，并放射状以及轴向分散而通过毂227、226中的通道。通过毂227、226的载体撞击在末端帽组件217、218上，并且放射状分散开来。进入流体载体的液流因此放射状向外离开径向轴221，并以螺旋管形式流动，通过聚酯布224以及滤器装置235中的开口从每个末端退出，以经过通道266和289退出。通过控制外部支架220、腔室230和内部滤器装置235的旋转速度和旋转方向，可获得任何期望类型的载体动作。然而，重要的是这种事实，可以在连续供应新鲜流体载体的同时获得回转器操作。

如果不使用集成式环形线加热器296施加随时间变化的电磁力，可通过另一个优选的随时间变化电磁力源进行施加。例如，图6-8举例说明了随时间变化电磁力设备140，其提供电磁力给生物反应器中的细胞培养物，所述生物反应器不带有集成式随时间变化电磁力、而是带有相邻的随时间变化电磁力装置。具体地，图6是随时间变化电磁力装置140的一个优选实施方案。图6是装置140的侧面投影图，其中包含支持基座145，支持在基座145之上的圆柱体线圈支持物146，其中线圈147围绕支持物146缠绕。图7是图6中举例说明的随时间变化电磁力装置140的前投影图。图8是随时间变化电磁力装置140的前投影图，其举例说明在运行中整个生物反应器148放入圆柱体线圈支持物146中，该支持物146由支持基座145所支持并由线圈147所缠绕。因为随时间变化电磁力装置140邻近生物反应器148，随时间变化电磁力装置140可重复使用。另外，因为随时间变化电磁力装置140邻近生物反应器148，装置140可用于在所有类型的生物反应器中产生电磁力，优选旋转型。

运行中，在TVEMF扩增期间，本发明的TVEMF生物反应器10在细胞培养腔室中包含外周血混合物。在TVEMF扩增期间，可以评估并调节含有外周血混合物的腔室的旋转速度，以使得外周血混合物基本上保持在径向轴处或者在径向轴周围。确保提高转速以防止与壁撞击。例如，如果外周血混合物中的外周血干细胞在旋转循环的向下侧时过分向内向下落以及在旋转循环的向上侧时过分向外并且不充分向上，则优选提高转速。最优情况下，建议用户优选地选择旋转速率以使得壁碰撞频率和强度尽可能小，从而维持外周血干细胞的三维几何结构以及它们的细胞-细胞支持和细胞-细胞几何结构。本发明优选的速率是从5到120 RPM，更优选从10到30RPM。

外周血混合物可优选地通过透明培养腔室优选地在视觉上评价，并手动调节。外周血混合物的评价和调节也可通过传感器(例如，激光)自动进行，该传感器监测外周血干细胞在TVEMF生物反应器10中的位置。指示过多细胞运动的传感器读数将自动引起相应调节转速的机制。

另外，在运行中，本发明预期电磁发生装置被打开并调节，使得方波输出在含有外周血混合物的腔室中产生期望的电磁场，优选在0.05高斯到6高斯的范围。

优选地，所述方波的频率约2至约25周/秒，更优选约5至约20周/秒，例如约10周/秒，并且导体的RMS值约1至约1000mA，优选约1至约6mA。然而，这些参数并不意味着限制本发明的TVEMF，因为这可以基于本发明的其它方面而有变化。例如可以通过标准装备比如EN131细胞传感器高斯测量仪来测量TVEMF。

按照本发明所预期，在不偏离本发明范围的情况下，可对受到随时间变化电磁力的旋转式生物反应器作出多种改变，因此本文所含的所有内容应该被理解为举例说明，而不是限制。

本发明优选实施方案的详细说明

下文的定义用于辅助描述和理解本发明内容中所定义的术语。这些定义并不意味将这些术语限制在少于通过本申请所描述的内容。另外，关于TVEMF包括几种定义，在此方面的所有定义应被理解为互相补充，而不应理解为互相抵触。

按照贯穿本申请的应用，术语“成体干细胞”指多能性细胞，其是未分化的且能产生多种分化细胞。在本发明中，成体干细胞优选CD34+/CD38-。成体干细胞还被称为体细胞干细胞，而不是直接来源于胚胎的胚胎干细胞。

按照贯穿本申请的应用，术语“外周血”指全身的血液，也即在哺乳动物全身性循环或已经循环的血液。所述哺乳动物不是胎儿。对于本发明的目的，没有理由区分位于相同循环回路中不同部分处的血液。

按照贯穿本申请的应用，术语“外周血细胞”指来自外周血的细胞。能够复制的外周血细胞可在TVEMF生物反应器中经历TVEMF扩增，并且可存在于本发明的组合物中。

按照贯穿本申请的应用，术语“外周血干细胞”指来自外周血的成体干细胞。外周血干细胞是成体干细胞，也称为体细胞干细胞(somatic stem cell)，而不是直接来自胚胎的胚胎干细胞。优选地，本发明的外周血干细胞是CD34+/CD38-细胞。

按照贯穿本申请的应用，术语“外周血干细胞组合物”或对其引用是指本发明的外周血细胞，或者(1)每单位体积的数量至少是天然存在的外周血源的7倍并且与天然存在的外周血细胞具有相同或类似的三维几何结构和细胞-细胞几何结构以及细胞-细胞支持，和/或者(2)经历TVEMF扩增并维持上文提到的几何结构和支持。伴随外周血干细胞的是某种载体，或者是药用可接受的载体、血浆、血液、白蛋白、细胞培养基、生长因子、铜螯合剂、激素、缓冲剂、低温保存剂、或者一些其它物质。参考天然存在的外周血，优选比较本发明的外周血干细胞与它们的原始外周血来源。但是，如果此比较不可用，那么天然存在的外周血可指外周血的平均或典型特征，优选相同哺乳动物物种作为本发明外周血干细胞的来源。

按照贯穿本申请的应用，术语“外周血混合物”指外周血细胞与允许所述细胞扩增的物质的混合物，该物质比如用于细胞生长的培养基，该物质可放置于TVEMF生物反应器中(比如在细胞培养腔室中)。所述外周血细胞可简单地通过将全外周血与诸如细胞培养基之类的物质相混合而存在于外周血混合物中。此外，外周血混合物也可由来自外周血的细胞制备物比如“血沉棕黄层”制成，按照贯穿本申请所述，该外周血含有外周血干细胞。优选地，外周血混合物包含CD34+/CD38-外周血干细胞以及Dulbecco’s培养基(DMEM)。优选的，至少一半的外周血混合物是细胞培养基比如DMEM。

按照贯穿本申请的应用，术语“TVEMF”指“随时间变化的电磁力(Time Varying Electromagnetic Force)”。如上所讨论，本发明的TVEMF是方波(在傅立叶曲线之后)。优选地，所述方波的频率是约10周/秒，并且导体的RMS值约1至约1000mA，优选约1至约6mA。然而，这些参数并不意味着限制本发明的TVEMF，因为这可以基于本发明的其它方面而有变化。例如可以通过标准装备比如EN131细胞传感器高斯测量仪来测量TVEMF。

按照贯穿本申请的应用，术语“TVEMF生物反应器”指施加TVEMF的旋转式生物反应器，如上文附图说明中所更详细描述的。施加到生物反应器上的TVEMF优选在0.05到6.0高斯的范围内，优选0.05-0.5高斯。例如如图2、3、4和5，作为TVEMF生物反应器的实例(不意味着限制)。在一个简单的实施方案中，本发明的TVEMF生物反应器使得封闭的外周血混合物在适当的高斯水平下(根据施加的TVEMF)旋转，并允许其中的外周血细胞(包括干细胞)扩增。优选地，TVEMF生物反应器允许交换生长培养基(优选带有添加剂)并允许对外周血混合物充氧气。所述TVEMF生物反应器提供用于细胞生长数天或更多的机制。不限于任何理论，所述TVEMF生物反应器使得反应器中的细胞受到TVEMF，以使得TVEMF穿过细胞，因此使之经历TVEMF扩增。

按照贯穿本申请的应用，术语“TVEMF扩增的外周血细胞”指在置于TVEMF生物反应器中并受到约0.05至6.0高斯的TVEMF之后每单位体积数量增加的外周血细胞。每单位体积数量上的增加是细胞在TVEMF生物反应器中复制的结果，使得细胞总数增加。每单位体积中细胞数量增加明确地不是因为流体体积的简单减少，例如，血液体积从70ml减少到10ml从而每ml细胞的数量增加。

按照贯穿本申请的应用，术语“TVEMF扩增的外周血干细胞”指在置于TVEMF生物反应器并受到约0.05至6.0高斯的TVEMF之后每单位体积数量增加的外周血干细胞。每单位体积干细胞数量上的增加是细胞在TVEMF生物反应器中复制的结果，使得生物反应器中干细胞总数增加。每单位体积中干细胞数量的增加明确地不 是因为流体体积的简单减少，例如，血液体积从70ml减少到10ml从而每ml干细胞的数量增加。

按照贯穿本申请的应用，术语“TVEMF扩增”(TVEMF-expanding)指在TVEMF(旋转)反应器中在TVEMF存在下TVEMF反应器中细胞进行复制(分裂并生长)的步骤。外周血干细胞(优选CD34+/CD38-干细胞)优选复制且不经历进一步分化，使得在生物反应器中期间，根据本发明扩增的所有或基本所有CD34+/CD38-干细胞复制但不分化。“基本所有”意思是指至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少97％、最优选至少99％的CD34+/CD38-细胞不分化，使得它们在TVEMF扩增期间不再是CD34+/CD38-。

按照贯穿本申请的应用，术语“TVEMF扩增”(TVEMF-expansion)指TVEMF生物反应器中的外周血细胞，优选外周血干细胞，通过让细胞受到约0.05到约6.0高斯的TVEMF，使之数量增加的过程。优选地，外周血干细胞，其数量的增加在每单位体积的数量上至少是起始外周血来源的7倍。根据本发明的TVEMF生物反应器中的外周血干细胞的扩增提供了维持或具有与TVEMF扩增前外周血干细胞相同或基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构的外周血干细胞。TVEMF扩增的其它方面也可提供本发明的外周血干细胞的异乎寻常的特征。不受到理论的限制，TVEMF扩增不只提供高浓度的维持三维几何结构和细胞-细胞支持的外周血干细胞。不受到理论的限制，TVEMF可以在TVEMF扩增期间干细胞的一些性质，例如上调促进生长的基因，或者下调阻止生长的基因。总之，TVEMF扩增导致了促进生长但是总体上不导致分化。

按照贯穿本申请的应用，术语“TVEMF扩增的细胞”指经历了TVEMF扩增过程的细胞。

贯穿本申请，修复组织、治疗疾病或病况并非意味着排他性的，而是涉及总体上组织修复的目的，其中组织的改善是由于施用如本文所讨论的干细胞。尽管本发明部分地涉及症状性并且可能危及生命的疾病或病况的治疗，但本发明还意味着包括治疗小的修复，以及甚至在哺乳动物(优选人)健康的症状或问题被注意到之前通过早期导入扩增的干细胞而阻止/预防疾病或病况。

贯穿本申请，使用术语“修复”、“补充”和“再生”。这些术语并没有互相排他性的，而是涉及总体上的组织修复。

按照贯穿本申请的应用，术语“有毒物质”或者相关术语可指对细胞优选外周血干细胞、或者对患者有毒性的物质。具体地，术语有毒物质指死细胞、巨噬细胞、以及可以是外周血中特有的或不常见的物质(如镰刀状细胞、或者其它组织或废物)。其它有毒物质在本申请中有所讨论。从血液中除去这些物质是本领域中公知的，尤其是涉及将血液制品导入患者的领域。

按照贯穿本申请的应用，术语“骨髓提取”(apheresis of bonemarrow)表示将针插入骨中并抽取骨髓。这种提取是本领域公知的。

按照贯穿本申请的应用，术语“自体”是指供体(扩增前外周血干细胞的来源)和受体是同一哺乳动物的情况。

按照贯穿本申请的应用，术语“异体”是指供体(扩增前外周血干细胞的来源)和受体不是同一哺乳动物的情况。

按照贯穿本申请的应用，术语“CD34+”是指在血细胞表面上存在表面抗原(CD34)。CD34蛋白在所有发育状态中存在于造血干细胞表面上。

按照贯穿本申请的应用，术语“CD38-”是指在血细胞表面上缺少表面抗原(CD38)。CD38不存在于本发明干细胞的表面上。

按照贯穿本申请的应用，术语“细胞-细胞几何结构”是指细胞互相之间的几何结构，其中包括间隔、间距和物理关系。例如，本发明TVEMF扩增的干细胞互相之间位于体内。所述扩增细胞在细胞之间天然间隔的界限内，相对而言例如二维扩增容器，其中不保持这种间隔。

按照贯穿本申请的应用，术语“细胞-细胞支持”表示一个细胞向邻近细胞提供的支持。例如，健康组织和细胞维持与体内其它细胞的相互作用比如化学、激素、神经(其中适用/适当)相互作用。在本发明中，这些相互作用维持在正常功能参数范围内，意思是指例如它们不开始向其它细胞发送有毒或破坏性信号(除非在天然血液环境中如此进行)。

按照贯穿本申请的应用，术语“三维几何结构”是指细胞在三维状态(与其天然状态相同或非常相似)的几何结构，与例如生长于Petri培养皿中细胞中所发现的二维几何结构相反，其中细胞被编变和/或拉抻。

对于以上三个定义中每一个，涉及维持本发明干细胞的细胞-细胞支持和几何结构以及三维几何结构时，术语“基本相同”意思是指在本发明的TVEMF扩增的细胞中提供正常的几何结构和支持，使得所述细胞不以这种方式改变，这种方式例如使得失去功能、修复组织、或者对其它细胞有毒或有害。

关于上文所定义术语或其它本申请中所使用术语的其它陈述不意味着受到上述定义的限制，而是可对这些定义作出贡献。在本申请中提供了关于本发明各个方面的信息，这并不意味着只限制在它所包含的部分，而是意味着对从整体上理解本发明作出贡献。

本发明涉及到提供快速可用的TVEMF扩增的外周血干细胞的来源，用于修复、补充和再生哺乳动物优选人体组织。本发明可通过如下文描述的优选实施方案进行更完整的描述，但是不应理解为限制于此。

操作方法—制备TVEMF扩增的外周血干细胞组合物

以及使用该组合物

在本发明的一个优选实施方案中，描述了用于制备TVEMF扩增的外周血干细胞的方法，所述干细胞可协助身体修复、替换和再生组织或者可用于研究中。

外周血从哺乳动物收集，优选灵长类哺乳动物，更优选人，例如本申请中所述以及本领域已知，并且优选通过本领域公知的注射器。例如可以收集外周血，并且立即扩增或者低温保藏供以后使用。仅仅从人中以不危机对象的量获取外周血。优选地收集约10至约500ml外周血，更优选100-300ml，甚至更优选150-200ml。根据本发明收集外周血没有限制性含义，但也可以包括例如直接收集哺乳动物外周血、合并来自一个或多个来源的外周血，间接收集外周血例如通过从商业或其他来源获得血液，包括例如从“血库”中的低温保藏血。

典型地，当直接从哺乳动物收集时，将外周血抽取到一或多个注射器中，优选其中含有抗凝剂。外周血然后可以分离很多份；白细胞、红细胞和血浆。这通过离心机(旋转血液容器直至分开血液的装置)或者通过沉淀(例如注射沉淀物到血液容器使得血液分离的扩增)进行。第二，一旦外周血被分成红细胞(RBC)在底部，白细胞(WBC)在中间，和血浆在顶部，取出所述白细胞保存。中间层也称“血沉棕黄层”含有目标外周血干细胞，不需要该血液的其它部分。对于一些血库，这将是他们加工处理的程度。然而，另一些血库将通过从WBC中取出单个核细胞(在此情况下是白细胞的一个亚类)从而基序处理血沉棕黄层。尽管并非每个人同意该方法，这样保存更少并且保存所述细胞所需低温液氮更少。

另一种分离外周血细胞的方法是将全部收集的白细胞在分离器比如Cobe Spectra细胞分离器中进行一或多轮(优选3轮)连续流白细胞去除(leukapheresis)。这种处理将使具有一个核的外周血细胞与其它外周血细胞相分离。所述干细胞是具有一个核的组的一部分。分离血细胞的其它方法是本领域已知的。

优选从外周血样品中去除RBC。尽管人们可能焗油相同的HLA类型(对于干细胞移植是需要的)，它们可以不具有相同的血液类型。通过去除RBC，可以尽可能减少对干细胞移植的不良反应。因此，通过去除RBC，干细胞样品具有与更多人相容的更好机会。当RBC解冻时还可能破裂，从而释放游离血红蛋白。这种类型的血红蛋白能严重影响接受移植的人的肾脏。此外，当RBC破裂时干细胞的活力降低。

另外，尤其是如果低温保存外周血或者将外周血转移入另一哺乳动物，可以检验该血液以确保不存在传染病或遗传病，比如HIV/AIDS、肝炎、白血病或免疫疾病。如果存在这种疾病，该血液可以抛弃或者使用同时具有与代理人将来可能有未来的使用者可以考虑。

在本发明另一实施方案中，可以从供体获得血细胞。在收集之前，优选用G-CSF(优选量0.3ng至5ug，更优选1ng/kg至100ng/kg，甚至更优选5ng/kg至20ng/kg，甚至更优选6ng/kg)在3天中每12小时处理供体然后在第4天中处理一次供体。在一种优选方法中，还施用相似量的GM-CSF。另一些替代方案是单独使用GM-CSF、或者使用其它生长因子分子、白细胞介素。然后从供体收集血液，并可以外周血混合物整体使用或者如本申请所讨论首先分离成细胞部分，在此所述细胞部分包括干细胞(CD34+/CD38-)被用于制备待扩增的外周血混合物。例如，可以通过将供体血总体积通过分离器比如Cobe Spectra细胞分离器进行3轮连续流白细胞去除。优选地所扩增干细胞被重新导入同一供体，其中供体需要如本文所讨论的组织修复。然而，如本文所指，还可以使用异体导入。对于本领域一般技术人员，其它收集前施用都将是显而易见的。

优选地，从外周血中除去红细胞，包括外周血干细胞的剩余细胞与合适培养基一起置于TVEMF生物反应器中(见“外周血混合物”)，比如见此处所描述的。在本发明一个更优选的实施方案中，仅仅将上文所述的“血沉棕黄层”(其包括外周血干细胞，如本申请所讨论的)置于TVEMF生物反应器中。其它实施方案包括移去其他非干细胞以及外周血成分，以制备不同的外周血制备物。这种外周血制备物甚至可含有作为剩下的仅有外周血组分的CD34+/CD38-外周血干细胞。除去外周血细胞中的非干细胞类型可通过负性分离技术(negative separation techniques)来实现，其比如但不限于沉降和分离。许多负性分离方法是本领域公知的。但是，正性选择技术也可使用，并且在本发明中是优选的。用于除去血液中多种组分和正性选择CD34+/CD38-的方法是本领域中已知的，只要它们不裂解或者不可逆地损伤所期望的外周血干细胞就可以使用。例如，可应用对CD34+/CD38-有选择性的亲和方法。优选地，从外周血中制备如上文所述的“血沉棕黄层”，然后从“血沉棕黄层”中分离出其中的CD34+/CD38-细胞用于TVEMF扩增。

所收集的外周血，或者如上文所述的期望细胞部分，必须置于TVEMF生物反应器中用于TVEMF扩增。如上文所讨论的，术语“外周血混合物”包含外周血(或者期望细胞部分，例如没有红细胞的外周血，或者优选从外周血中分离出的CD34+/CD38-外周血干细胞)与允许这些细胞扩增的物质的混合物，这些物质比如用于细胞生长的介质，其将置于TVEMF生物反应器中。细胞培养基、允许细胞生长和扩增的介质是本领域公知的。优选地，允许细胞扩增的物质是细胞培养基，更优选是Dulbecco’s培养基。细胞培养基的组分显然必须不杀死或损伤细胞。在TVEMF扩增之前或期间，其它组分也可添加到外周血混合物中。例如，外周血可置于带有Dulbecco’s培养基的生物反应器中，并且另外添加5％的(或者其它所需量，比如在约1％到10％的范围)人血清白蛋白。外周血混合物的其它添加物，包括但不限于生长因子、铜螯合剂、细胞因子、激素和其它可增强TVEMF扩增的物质，也可在外周血置于生物反应器中之前，在生物反应器外部或内部加入到外周血中。优选地，来自一个个体的外周血收集物的全部体积(优选人外周血量为约10ml到约500ml，更优选100ml到约300ml，甚至更优选150ml到约200ml外周血)与细胞培养基比如Dulbecco’s培养基(DMEM)相混合，并且添加5％人血清白蛋白，以制备外周血混合物用于TVEMF扩增。例如，对于50至100ml外周血样，优选使用约25至约100mlDMEM/5％人血清白蛋白，使得外周血混合物的总体积在置于生物反应器时为约75到约200ml。作为一般规则，收集外周血越多越好；例如，如果从一个个体收集了超过200ml，优选使用此外周血中的所有干细胞。在可获得更大体积的情况下，例如通过合并外周血(从相同或不同来源)，可以优选多于一个剂量。当外周血收集物合并并一起TVEMF扩增时，使用灌注TVEMF生物反应器是特别有用的。

本发明的铜螯合剂可以是任何无毒性铜螯合剂，并且优选是青霉胺或盐酸三乙撑四胺。更优选地，所述青霉胺是D(-)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸(D(-)-2-Amino-3-Mercaptor-3-Methylbutanic Acid，Sigma-Aldrich)，其溶于DMSO中并以约10ppm的量加到外周血混合物中。所述铜螯合剂还可以施用给哺乳动物，然后直接从该哺乳动物收集外周血。在从所述哺乳动物收集外周血之前，优选地这种施用超过1天，更优选超过2天。无论是加到外周血混合物自身中或者施用给供血哺乳动物、或者两者都进行，铜螯合剂的目的是在TVEMF扩增之前降低外周血中铜的量。不限于理论，相信可用铜量的降低可以增强TVEMF扩增。

术语“置于TVEMF生物反应器中”没有限制性含义，外周血混合物可完全在生物反应器外部制成，然后再将混合物置于生物反应器中。外周血混合物也可全部在生物反应器内部混合。例如，外周血(或其细胞部分)可与Dulbecco’s培养基并且添加5％人血清白蛋白一起置于生物反应器中，培养基和血清白蛋白或者是已经存在于生物反应器中，或者是同时添加到生物反应器中，或者在外周血之后加入到生物反应器中。

待置入TVEMF生物反应器的本发明的优选外周血混合物包含以下成分：分离自外周血样品的血沉棕黄层的CD34+/CD38-干细胞，和Dulbecco’s培养基，其与CD34+/CD38-细胞一共约150-250ml，优选约200ml。更优选地，将G-CSF(粒细胞集落刺激因子)包括在外周血混合物中。优选地，G-CSF的存在量足以刺激外周血干细胞的TVEMF扩增。更优选地，在TVEMF扩增之前外周血混合物中存在的G-CSF的量是约25到约200ng/ml混合物，更优选约50到约150ng/ml混合物，再优选是约100ng/ml。

TVEMF生物反应器容器(含有包括外周血干细胞的外周血混合物)以一定速度旋转，该速度使得外周血干细胞悬浮并维持其三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。优选地，旋转速度是5-120rpm；更优选是10-30rpm。这些旋转速度没有限制性含义，旋转速度将至少部分依赖于生物反应器类型和细胞培养室大小以及放入其中的样品。在细胞位于TVEMF生物反应器期间，优选向它们供应营养物和新鲜培养基(例如，DMEM和5％人血清白蛋白，见上流体载体的讨论)，使其接触到激素、细胞因子、和/或生长因子(优选G-CSF)；并除去有毒物质。从TVEMF生物反应器中的外周血细胞中除去的有毒物质包括垂死细胞的有毒颗粒物质以及粒细胞和巨噬细胞的有毒物质。细胞的TVEMF扩增受到控制，使得细胞优选扩增(每单位体积的数量增加)至少七倍。优选地，外周血干细胞(以及其它细胞，如果存在的话)经过至少4天的TVEMF扩增，优选约7到约14天，更优选约7到约10天，再优选约7天。TVEMF扩增可在TVEMF生物反应器中持续到长达160天。尽管TVEMF扩增甚至可长于160天，此种长度的扩增不是本发明的一种优选实施方案。

优选地，TVEMF扩增在TVEMF生物反应器中在约26℃到约41℃的温度实施，更优选地，在37℃的温度实施。

监测正在经历TVEMF扩增的细胞的总体扩增的一个方法是通过视觉检查。外周血干细胞典型地是暗红色。优选地，用于形成外周血混合物的培养基在颜色上是浅色或无色。一旦生物反应器开始旋转并且施加TVEMF，细胞优选聚集在生物反应器容器中央，培养基围绕在有颜色的细胞簇周围。通氧气和添加其它营养物通常不影响通过构建在生物反应器上观察窗(典型是透明塑料的)观察细胞簇的能力。簇的形成对于帮助干细胞保持它们的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构是重要的；如果所述簇分散且细胞开始接触到生物反应器容器的壁，则提高转速(手动或自动)使得中央的细胞簇可再次形成。在细胞簇形成后不久测量可观察的细胞簇直径，其可与此后的簇直径做比较，以显示出TVEMF生物反应器中细胞大概的增长数。在TVEMF扩增期间细胞数量增加的测量也可以按照常规生物反应器领域已知的许多方法进行。自动传感器也可包括在TVEMF生物反应器中，以监测和测量簇尺寸的增加。

TVEMF扩增过程可被仔细监测，例如由实验室技术人员监测，其将检查细胞簇的形成以确保细胞在生物反应器中保持成簇状态，并且当细胞簇开始分散时将增加生物反应器的旋转。用于监测细胞簇和监测生物反应器内外周血混合物粘性的自动系统也可用于监测细胞簇。细胞簇粘性的改变在TVEMF扩增过程开始约两天后就可明显观察到，并且可在该时间附近增加TVEMF生物反应器的旋转速度。TVEMF生物反应器转速在TVEMF扩增过程中可以变化。优选地，旋转速度适时改变使得正在经历TVEMF扩增的细胞不与TVEMF生物反应器容器的侧面接触。

并且，实验室技术人员可以在TVEMF扩增期间，例如一天一次、或每两天一次，人工(例如使用注射器)，如上文所讨论的，往生物反应器中加入新鲜培养基和优选地其它所需的添加物比如营养物和生长因子，并且抽出含有细胞废物和毒素的旧培养基。新鲜培养基和其它添加物也可在TVEMF扩增期间自动泵入TVEMF生物反应器，废物则自动排出。

在置于TVEMF生物反应器并进行TVEMF扩增之后约7到约14天，外周血干细胞可增加到它们初始数量的至少七倍。优选地，TVEMF扩增持续约7到10天，更优选约7天。因此不需要在TVEMF扩增期间进行干细胞数量的测量。如上文所显示的并贯穿本申请，本发明的TVEMF扩增的外周血干细胞具有与天然存在的非TVEMF扩增的外周血干细胞相同或基本上相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

完成TVEMF扩增后，TVEMF生物反应器中的细胞材料包含在本发明组合物中的本发明的干细胞。可以从所述组合物中除去多种物质或者向其添加多种物质供进一步使用。本发明的另一个实施方案涉及离体哺乳动物外周血干细胞组合物，其功能是协助身体系统或组织进行修复、补充和再生组织，例如，贯穿本申请所描述的组织。所述组合物包含TVEMF扩增的外周血干细胞，优选外周血干细胞的每单位体积数量至少是其来源外周血中每单位体积数量的七倍。例如，优选地，如果将一定体积中的数量X的外周血干细胞置于TVEMF生物反应器，则TVEMF扩增之后，从该相同体积的置于TVEMF生物反应器的外周血干细胞中得到的外周血干细胞的数量将至少是7X(除非在扩增过程中取出细胞)。尽管此至少7倍的扩增对于本发明的实施不是必要的，但此扩增对于治疗目的是特别优选的。例如，如果需要的话，TVEMF扩增的细胞的数量可以只是天然存在的外周血中的外周血干细胞数量的两倍。优选地，TVEMF扩增的细胞是在每单位体积天然存在外周血中的外周血干细胞数量的约4倍到约25倍的范围。本发明也涉及包含来自哺乳动物的外周血干细胞的组合物，其中所述外周血干细胞每单位体积中的数量是来自哺乳动物的天然存在外周血中外周血干细胞数量的至少七倍；并且其中外周血干细胞具有与天然存在的外周血干细胞相同或相似或基本上相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。本发明的组合物可包含药用可接受载体，包括但不限于血浆、血液、白蛋白、细胞培养基、生长因子、铜螯合剂、激素、缓冲剂或者低温保存剂。“药用可接受载体”意思是允许将干细胞导入哺乳动物优选人类的试剂。此载体可包括本文提及的物质，具体包括可用于输血的任何物质，比如血液、血浆、白蛋白，还有盐水或缓冲液(优选添加白蛋白的缓冲液)，优选来自所述组合物将导入的哺乳动物。术语将组合物“导入”哺乳动物，意思是指向动物“施用”组合物。优选地，将本发明的干细胞施用给哺乳动物通过静脉注射来进行。然而，也可以使用其它形式的施用，包括例如，直接注射入器官或需要修复的位点附近，直肠施用(尤其是对于结肠疾病)，以及其它方法比如本领域公知的方法，优选将干细胞导入需要修复的过渡区域。甚至更优选地，与可接受量的G-CSF以及注射，例如0.3ng至5ug的量，更优选1ng/kg至100ng/kg，甚至更优选5ng/kg至20ng/kg，甚至更优选6ng/kg。在本发明组合物中的干细胞可以与本领域一般状况所述药用载体一起施用。有待在组合物中施用的根据本发明扩增的干细胞的量是治疗有效量(以下还将讨论)，优选至少1000个干细胞，更优选至少10⁴个干细胞，甚至更优选至少10⁵个干细胞，甚至更优选至少10⁷至10⁹个干细胞的量，或者甚至更多干细胞比如10¹²个干细胞。可以通过一次或更多次施用这些数目的扩增干细胞。如本申请中所指出，施用给患者的干细胞数目可能受来源血液中开始可获得干细胞的数目、乘以根据本发明的扩增。不限于理论，相信施用后不被身体所用的干细胞简单地通过自然身体系统被去除。“可接受载体”通常指本发明外周血干细胞可在其中存活的任何物质，即无论是TVEMF扩增之后、低温保存之前或之后、还是导入(施用)到哺乳动物之前对细胞没有毒性。这种载体是本领域公知的，并且可以包括很宽范围的物质，包括贯穿本申请针对此目的所描述的物质。例如，血浆、血液、白蛋白、细胞培养基、缓冲剂和低温保存剂都是本发明可接受的载体。期望的载体部分取决于期望的用途。

本领域已知的其它扩增方法(不使用TVEMF)不提供外周血干细胞在数量至少是天然存在外周血的至少七倍的扩增并且同时还保持外周血干细胞三维几何结构和细胞-细胞支持不变。TVEMF扩增的外周血干细胞具有与所来源外周血相同或基本上相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构，或保持其不变。所述组合物可包含TVEMF扩增的外周血干细胞，优选地在Dulbecco’s培养基悬浮液中或者在准备用于低温保存的溶液中。所述组合物优选没有有毒颗粒物质，例如垂死细胞以及粒细胞和巨噬细胞的有毒物质或内容物。所述组合物可以是包含TVEMF扩增的外周血干细胞的低温保存组合物，这是通过降低组合物到-120℃到-196℃的温度，并且保持低温保存组合物在此温度范围直到其用于治疗或其它应用。如下文所讨论，优选地，在低温保存之前尽可能多的从组合物中除去有毒物质。

本发明的另一个实施方案涉及使用TVEMF扩增外周血干细胞组合物用于再生组织和/或治疗疾病比如自身免疫疾病(如上文所讨论)的方法，所使用的外周血干细胞组合物或者是经过低温保存的或者是TVEMF扩增完成后不久的。细胞可被导入到哺乳动物身体中，优选人类，例如静脉注射或者直接注射到待修复组织，以允许身体固有系统修复和再生组织。优选地，导入哺乳动物身体的组合物不含有毒物质以及可造成对所施用TVEMF扩增的外周血干细胞有不利反应的其它物质。该方法(和组合物)可潜在地用于修复哺乳动物优选人的生命关键器官和其它组织，这种潜在应用包括但不限于肝脏组织、心脏组织、造血组织、血管、皮肤组织、肌肉组织、肠组织、胰脏组织、中枢神经系统细胞、骨、软骨组织、结缔组织、肺组织、脾组织、脑组织和其它身体组织。所述细胞容易获得用于治疗或研究，所述治疗或研究需要个体血细胞，尤其是如果已经发生疾病并且需要没有该疾病的细胞。

实施例1-TVEMF生物反应器中实际的TVEMF扩增

如下表1所示收集外周血并扩增外周血细胞。

A)收集和维持细胞

如上所述通过注射器从人供体获得人外周血(约0.75×10⁶细胞/ml)并悬于Iscove’s改良Dulbecco’s培养基中

实施例1-TVEMF生物反应器中实际的TVEMF扩增

如下表1所示收集外周血并扩增外周血细胞。

A)收集和维持细胞

如上所述通过注射器从人供体获得人外周血(75ml；约0.75×10⁶细胞/ml)并悬于Iscove’s改良Dulbecco’s培养基(IMDM)(GIBCO，Grand Island，NY)中，其中添加20％的5％人白蛋白(HA)、100ng/ml重组人G-CSF(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)、和100ng/ml重组人干细胞因子(SCF)(Amgen)。外周血混合物置于如图2和3所示的TVEMF生物反应器中。在37℃、6％CO₂以及正常空气O₂/N比下进行TVEMF扩增。如本申请中所述，TVEMF生物反应器初始以10转/分钟的速度旋转，然后根据需要调节，以保持外周血细胞悬于生物反应器中。向生物反应器施加6mA的时间变化电流。施加到外周血混合物的方波TVEMF为约0.5高斯。(频率：约10周/秒)。

每一至二天更换/更新TVEMF生物反应器中外周血混合物中的培养基。第10天时，从TVEMF生物反应器中取出细胞并用PBS洗涤和进行分析。结果列于表1中。对照数据表示未扩增的人外周血样品；扩增样品表示TVEMF扩增后的各自对照样品。

表1

对照1	细胞计数310,000	活力99％
			对照2	细胞计数305,000	活力98％
对照3	细胞计数325,000	活力100％
			对照4	细胞计数340,000	活力98％
对照5	细胞计数325,000	活力98％
			对照6	细胞计数330,000	活力98％
对照7	细胞计数315,000	活力99％
			对照8	细胞计数350,000	活力98％
对照9	细胞计数320,000	活力98％
			对照10	细胞计数300,000	活力98％
扩增样品1	细胞计数3,200,000对应CD34+增加：是	活力98％
			扩增样品2	细胞计数3,400,000对应CD34+增加：是	活力100％
扩增样品3	细胞计数3,550,000对应CD34+增加：是	活力100％
			扩增样品4	细胞计数3,500,000对应CD34+增加：是	活力98％
扩增样品5	细胞计数3,450,000对应CD34+增加：是	活力99％
			扩增样品6	细胞计数3,400,000对应CD34+增加：是	活力98％
扩增样品7	细胞计数3,200,000对应CD34+增加：是	活力98％
			扩增样品8	细胞计数3,550,000对应CD34+增加：是	活力99％
扩增样品9	细胞计数3,400,000对应CD34+增加：是	活力99％
			扩增样品10	细胞计数3,500,000对应CD34+增加：是	活力98％

从表1可以看出，与未扩增对照相比，外周血细胞的TVEMF扩增导致细胞数在10天中大致增加10倍。每1-2天更换/更新一次细胞生长的培养基。

B)TVEMF扩增细胞的分析

用计数室(一种诸如血细胞计数器的装置，通过将一定体积的对照细胞悬液或者扩增样品置于具有微格栅的专门制造显微镜载玻片上并计数样品中细胞数目来使用)获得对照和扩增样品的总细胞计数。TVEMF扩增10天后对照样品和扩增样品中总细胞计数的结果显示于表1中。

如下确定表1中相应CD34+增加的指标：用人CD34选择试剂盒(EasySep positive selection，StemCell Technologies)将扩增样品中CD34+细胞与其中的其它细胞相分离，用如上所指计数室进行计数，并用FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson)确认。通过克隆形成分析计数CFU-GEMM和CFU-GM。通过台盼蓝拒染试验确定细胞活力(其中活细胞是活的，无活性细胞是死的)。所有扩增样品中“是”的答案表明，CD34+细胞数以对应总细胞计数的量增加。

C)造血集落形成细胞的量的增加

在此TVEMF扩增组织培养系统中培养供体外周血细胞显著增加造血集落形成细胞的数目。经过独立分析测定，直至第7天一直观察到CFU-GM(高达7倍)和CFU-GEMM(高达9倍)集落形成细胞数的稳定增加，而没有显著的平台。

D)CD34+细胞的增加

在此TVEMF扩增组织培养系统中培养来自正常供体的MNC显著增加CD34+细胞的数目。经过独立分析测定，通过6天培养，CD34+细胞的平均数目增加10倍并在此天进入平台期。

操作方法-低温保存

如上文所提及的，从哺乳动物优选人中收集外周血。优选从外周血中至少除去红细胞。外周血干细胞(如果需要，以及其它细胞和培养基)置于TVEMF生物反应器中，受到随时间变化电磁力，并且扩增。如果在TVEMF扩增之前没有去除RBC，优选在TVEMF扩增之后将它们去除。TVEMF扩增之后的细胞可低温保存。此处提供关于低温保存TVEMF扩增的外周血干细胞的方法以及包含这些细胞的组合物的进一步细节，具体见下文。

在TVEMF扩增之后，TVEMF扩增的细胞，包括TVEMF扩增的外周血干细胞，可以转移到至少一个含有至少一种低温保护剂的低温保存容器中。TVEMF扩增的外周血干细胞优选地首先用溶液(例如，缓冲溶液或所期望的低温保存溶液)进行清洗以除去培养基和TVEMF扩增过程中存在的其它组分，接着优选将其混合在允许对细胞低温保存的溶液中。这种溶液通常称为低温保存剂、低温保存溶液或者低温保护剂。所述细胞被转移到合适的低温容器中，此容器一般降温至-120℃到-196℃，优选约-130℃到约-150℃，并且维持在此温度。优选地这种温度降低缓慢并仔细进行，以免在冷冻过程中破坏或至少尽可能少破坏干细胞。当需要时，细胞的温度(约低温容器的温度)上升到与导入人体相容的温度(通常从约为室温到约为体温)，然后TVEMF扩增的细胞可以导入哺乳动物体内，优选人类，例如如本申请所讨论。

冷冻细胞通常有破坏性。不限于理论，在降温过程中，细胞内的水结冰。然后可通过对细胞膜的渗透作用、细胞脱水、溶质浓缩、以及冰晶形成而发生损伤。随着在细胞外部形成冰，有效水从溶液中被除去并从细胞中吸取水分，造成渗透压脱水并提高了溶质浓度，最终破坏了细胞。(作为讨论，见Mazur，P.，1977，Cryobiology 14：251-272.)

不同物质具有不同的冰点。优选地，备用于低温保存的外周血干细胞组合物包含尽可能少的污染物质，以尽可能减少在结晶和冷冻过程中对细胞壁的损伤。

这些损伤作用可通过以下来降低或甚至避开：(a)应用低温保护剂，(b)控制冷冻速率，以及(c)在足够低的温度保存，以尽可能减少降解反应。

在本发明中优选包括低温保存剂。可使用的低温保护剂包括但不限于足量的，二甲基亚砜(DMSO)(Lovelock，J.E.and Bishop，M.W.H.，1959，Nature 183：1394-1395；Ashwood-Smith，M.J.，1961，Nature 190：1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret，A.P.，1960，Ann.N.Y. Acad.Sci.85：576)、聚乙二醇(Sloviter，H.A.and Ravdin，R.G，1962，Nature 196：548)、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、i-赤鲜醇、D-核糖醇、D-甘露醇(Rowe，A.W.，et al.，1962，Fed.Proc.21：157)、D-山梨醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化胆碱(Bender，M.A.，et al，1960，J.Appl.Physiol.15：520)、氨基酸葡萄糖溶液或者氨基酸(PhanThe Tran and Bender，M.A.，1960，Exp.Cell Res.20：651)、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油酯(Lovelock，J.E.，1954，Biochem.J.56：265)、和无机盐(Phan The Tran and Bender，M.A.，1960，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.104：388；Phan The Tran and Bender，M.A.，1961 inRadiobiology，Proceedings of the Third Australian Conference onRadiobiology，IIbery，P. L. T.，ed.，Butterworth，London，p.59)。在一个优选实施方案中，使用DMSO。DMSO，液体，低浓度下对细胞无毒。作为小分子，DMSO可自由穿过细胞并通过与水结合而改变其冷冻性来保护细胞内的细胞器，以及防止形成冰而造成的损害。添加血浆(即，至浓度20-25％)可增加DMSO的保护效果。添加DMSO后，细胞应保持在0℃或更低，因为DMSO约1％浓度在高于4℃的温度是有毒的。与TVEMF扩增的外周血干细胞相结合，我所选择的优选低温保护剂对其全部组成是：在60至80％氨基酸葡萄糖溶液中的20至40％二甲基亚砜溶液，或者15至25％的羟乙基淀粉溶液，或者4至6％的甘油、3至5％葡萄糖、6至10％葡聚糖T10，或者15至25％聚乙二醇或者75至85％氨基酸葡萄糖溶液。以上指出的低温保存剂的量优选是全部组合物(而不是仅加到该组合物中物质的量)中低温保存剂的总量。

尽管除外周血细胞和低温保护剂之外的其它物质可以存在于待低温保存的本发明的组合物中，优选本发明的TVEMF扩增的外周血干细胞组合物的低温保存带有尽可能少的其它物质，例如由于如上文讨论的关于冷冻机制的原因。

优选地，本发明的TVEMF扩增的外周血干细胞组合物冷却到温度为约-120℃到约-196℃的范围，优选约-130℃到约-196℃，更优选为-130℃到约-150℃。

受控的缓慢冷却速率是重要的。不同的低温保护剂(Rapatz，G.，et al.，1968，Cryobiology 5(1)：18-25)和不同的细胞类型有不同的最优冷却速率(对于降温速度对于外周细胞存活的影响(以及对于它们移植潜力的影响)可参见，例如Rowe，A.W.and Rinfret，A.P.，1962，Blood 20：636；Rowe，A.W.，1966，Cryobiology 3(1)：12-18；Lewis，J.P.，et al.，1967，Transfusion 7(1)：17-32；and Mazur，P.，1970，Science 168：939-949)。水变成冰时的熔化热应该尽可能小。冷却过程可通过应用例如可编程冷冻设备或者甲醇浴方法来实施。

可编程冷冻装置允许确定最优冷却速率并促进标准的可重现的冷却。可编程速率控制冷冻装置比如Cryomed或Planar允许将冷冻方案调整到期望的冷却速率曲线。其它可接受的冷冻装置可以是，例如，Sanyo Model MDF-1155ATN-152C和Model MDF-2136ATN-135C，Princeton CryoTech TEC 2000。例如，对于10％DMSO和20％血浆中的外周血细胞或者CD34+/CD38-细胞，最优速率为从0℃到-200℃，1到3℃/分钟。

在一个优选实施方案中，此冷却速率可用于本发明所述细胞。盛有所述细胞的低温容器必须在低温下稳定，并且允许快速的热传递，以便于有效控制冷冻和解冻。密封塑料管(例如Nunc、Wheatoncryules)或玻璃安瓿可用于多个小量(1-2ml)，而较大体积(100-200ml)可在聚烯烃袋(例如Delmed)中冷冻，该聚烯烃袋放在金属板之间以便在冷却期间更好的传递热量。(骨髓细胞袋通过将其置于-80℃冷冻装置中成功冷冻，该冷冻装置幸运地提供了约3℃/分钟的冷却速率)。

在一个替代性实施方案中，可应用甲醇浴冷却方法。甲醇浴方法特别适合大规模的对多个小物品实施常规低温保存。该方法不需要手动控制冷冻速率也不需要记录器监测速率。在一个优选的方面，DMSO处理的细胞预先在冰上冷却并转移到装满冷冻甲醇的盘中，其随后被置于-130℃机械冰箱中(例如Harris或Revco)。甲醇浴和样品的热电偶检测显示期望的1到3℃/分钟的冷却速率。在至少两个小时之后，样品达到-80℃，然后可直接将其置于液氮(-196℃)中以永久保存。

完全冷冻之后，TVEMF扩增的脐干细胞可快速转移到长期低温保存容器(比如冷冻器)中。在一个优选实施方案中，细胞可低温保存在液氮(-196℃)中或者其蒸汽(-165℃)中。保存温度应低于-120℃，优选低于-130℃。高效液氮冰箱的可用性大大方便了这种保存，所述冰箱类似于具有极低真空和内部超绝热的大Thermos容器，使得热量泄漏和氮气流失都保持在绝对低值。

用于低温保存细胞的优选的装置和程序由ThdermogenesisCorp.，Rancho Cordovo，CA所制造，利用它们的程序降低细胞温度到低于-130℃。在冷冻和保存期间细胞盛放于Thermogenesis血浆袋中。

其它冷冻器也可商业获得。例如“BioArchive”冷冻器不仅冷冻而且详细记录低温样品比如本发明的血液或细胞，例如一次管理多达3,626袋冷冻血。该冷冻器有机器人臂，接到指示时可以存取特定样品，确保其它样品不受干扰或者暴露于更高温度。其它商品冷冻器包括但不限于Sanyo Model MDF-1155 ATN-152C和ModelMDF-2136 ATN-135C，和Princeton CryoTech TEC 2000。

在TVEMF扩增的外周血干细胞组合物的温度降低到低于-120℃之后，优选低于-130℃，它们可置于装置中，比如Thermogenesis冷冻装置。它们的温度保持在-120℃到-196℃，优选-130℃到-150℃。本发明的低温保存TVEMF扩增的外周血干细胞组合物的温度不应长时间高于约-120℃。

根据本发明的低温保存的TVEMF扩增的外周血干细胞或其组合物可冷冻无限长时间，在需要时将其解冻。例如，组合物可冷冻长达18年。甚至更长的时间也是可行的，可能甚至长达血液供体的一生。

当需要时，其中装有细胞的袋可置于解冻系统中，比如Thermogenesis Plasma Thawer或者比如Thermoline Thawer系列中的其它装置。低温保存的组合物的温度升至室温。在另一个优选解冻与低温保护剂混合的细胞的方法中，装有本发明的低温保存的TVEMF扩增的外周血干细胞组合物的袋，其保存在液氮中，可将其置于液氮的气相中15分钟，然后暴露在室温环境空气中5分钟，最后在37℃水浴中尽可能快的解冻。解冻袋中内容物可以立刻用相同体积的溶液稀释，该溶液是含有2.5％(重量/体积)人血清白蛋白和5％(重量/体积)葡聚糖40(Solplex 40；Sifra，Verona，Italy)的等渗盐溶液，接着400g离心十分钟。除去上清，用新鲜白蛋白/葡聚糖溶液重悬沉降下来的细胞。可参见Rubinstein，P.et al.，Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord bloodfor unrelated bone marrow reconstitution.Proc.Natl. Acad.Sci. 92：10119-1012(1995)for Removal of Hypertonic Cryoprotectant；此优选解冻细胞方法的一个变型可见Lazzari，L.et al.，Evaluation ofthe effect of cryopreservation on ex vivo expansion of hematopoieticprogenitors from cord blood.Bone Marrow Trans.28：693-698(2001)。

在细胞升温到室温后，它们可用于研究或再生治疗。解冻的TVEMF扩增的外周血干细胞组合物可直接导入哺乳动物体内，优选人类，或者以其解冻形式例如用于期望的研究中。解冻细胞所处的溶液可以完全洗除，与另一种进行交换，或者添加到另一种中，或者根据期望进行其它操作。在导入哺乳动物体内之前，优选在马上将要导入之前，多种添加物可加入到解冻组合物(或者非低温保存的TVEMF扩增的外周血干细胞组合物)中。此类添加物包括但不限于生长因子、铜螯合剂、细胞因子、激素、适宜的缓冲剂或稀释剂。优选地，添加G-CSF。更优选地，对于人类，以约20到约40μg/kg体重的量添加G-CSF，甚至再优选地，以约30μg/kg体重的量。在导入之前，TVEMF扩增的外周血干细胞组合物可与哺乳动物自身或者合适供体的，血浆、血液或白蛋白、或者其它可与输血伴随的物质相混合。解冻的外周血干细胞可用于，例如检验对期望用于治疗或可用于治疗的药物是否有有害反应。

尽管FDA尚未批准在美国将扩增的外周血干细胞用于组织再生，但是此批准看起来是即将来临的。足量的扩增外周血干细胞的直接注入应能够用于再生生命关键器官，比如心脏、肝脏、胰脏、皮肤、肌肉、肠、脾脏、脑、以及本申请提到的其它组织。

本发明的TVEMF扩增的外周血干细胞组合物应以足够实现组织修复或再生或者足够治疗目标疾病或病症的量导入哺乳动物体内，优选人类。优选地，至少20ml每ml含10⁷到10⁹干细胞的TVEMF扩增的外周血干细胞组合物用于任何治疗，优选一次全部使用，尤其是当外伤发生需要立即组织修复的情况。此量对75-80kg的人体是特别优选的。待导入其来源哺乳动物的组合物中的TVEMF扩增的外周血干细胞的量部分取决于来源外周血材料中存在的细胞数目(尤其是如果只有非常有限的量可以获得)。导入患者的TVEMF扩增的外周血干细胞的优选范围可以是，比如，约10ml到约50ml的TVEMF扩增的外周血干细胞组合物，其每ml含10⁷到10⁹干细胞，或者可能更多。尽管我们知道高浓度的任何物质施用给哺乳动物都可以是有毒的或者甚至是致死的，但是导入所有的哺乳动物外周血干细胞，例如在TVEMF扩增后至少7倍，不可能造成TVEMF扩增的外周血干细胞过量。在使用来自多个供体或者同一供体多次收集的外周血的情况下，导入哺乳动物的外周血干细胞的数量可以更高。同样，可导入患者的TVEMF细胞的剂量不受从一个个体收集所提供的外周血数量的限制；多次施用，例如每天一次或两次，或每周一次，或其它施用时间方案，可更容易应用。并且，在准备对组织进行治疗时，此类型的组织可准许使用可提供的尽可能多的TVEMF扩增的外周血干细胞，或者使用较少剂量。例如，肝脏可能更容易治疗并且可能要求比其它组织更少的干细胞。

应理解的是，尽管上文所描述的实施方案通常涉及低温保存TVEMF扩增的外周血干细胞，但是TVEMF扩增也可以在对已经过低温保存的、非扩增、或者非TVEMF扩增的外周血干细胞解冻之后进行。另外，如果希望低温保存，可以在冷冻细胞之前和之后都进行TVEMF扩增。例如，血库有低温保存的组合物，其包含处于冷冻保存状态的外周血干细胞，以备在某时间点的需要。这些组合物可根据传统方法解冻，然后按照此处所述进行TVEMF扩增，其包括按照此处所述的TVEMF过程的变化形式。此后，如上文所述，此TVEMF扩增的外周血干细胞被认为是本发明的组合物。在低温保存之前进行TVEMF扩增是优选的，例如假如发生外伤，已经扩增了患者的外周血干细胞就不需要再花费宝贵的额外数天来准备。

同样，尽管不是优选，应注意本发明的TVEMF扩增的外周血干细胞可低温保存，然后解冻，然后如果不使用，再低温保存。细胞在冷冻之前，优选进行TVEMF扩增(即，增加数目，而非大小)。细胞也可以在冷冻然后解冻之后扩增，即使冷冻之前已经扩增也可以。

外周血干细胞的扩增可能需要几天。在立即供应外周血干细胞非常重要的情况下，比如生死关头或者创伤性损伤，尤其是如果需要在再次导入细胞之前完成研究，可能等不了几天等待外周血干细胞的扩增。因此，特别期望从出生就可提供这种扩增好的外周血干细胞，以准备每分钟延迟治疗都可能意味着生死之别的紧急情况。

同样，应理解的是，在TVEMF扩增后经过或不经过低温保存，本申请的TVEMF扩增的外周血干细胞可导入哺乳动物，优选来源哺乳动物(外周血来源的哺乳动物)。然而，这种导入不需限于仅仅来源哺乳动物(自体)，TVEMF扩增的细胞也可以输入不同哺乳动物(异体)。

同样，应理解的是，尽管外周血是本发明成体干细胞的优选来源，来自骨髓的成体干细胞也可以被TVEMF扩增并以与外周血干细胞相似的方式用于本发明。骨髓不是容易获得的干细胞来源，而必须通过成分输血(apheresis)或者一些其它昂贵规和疼痛的方法来收集。

本发明还包括研究疾病状态的方法，其包括将TVEMF扩增的干细胞导入疾病状态试验系统。这种系统可以包括但不限于，例如具有该疾病的哺乳动物，研究该疾病的适当动物模型，或者研究该疾病的体外试验系统。TVEMF扩增的外周血干细胞可用于研究下列疾病的可能疗法：

I.源于正常血细胞产生与成熟的功能衰竭或功能障碍的疾病，过度增殖性干细胞病，再生障碍性贫血，全血细胞减少症，血小板减少症，红细胞再生障碍，由于药物、辐射、或者感染、先天性原因造成的布-戴氏综合征(Blackfan-Diamond syndrome)；

II.造血系统恶性肿瘤、急性淋巴母细胞(淋巴细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性恶性骨髓硬化症、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、不明原因的骨髓化生(agnogenic myelometaplasia)、Waldenstrom’s巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；

III.具有以下疾病的患者中的免疫抑制：恶性、实体肿瘤、恶性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、睾丸癌、胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、淋巴瘤；

IV.自身免疫性疾病，类风湿性关节炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多发性硬化、和系统性红斑狼疮；

V.遗传性(先天性)疾病，贫血、家族性再生障碍性、范科尼氏综合征、布卢姆综合征、纯红细胞再生障碍(PRCA)、先天性角化不良症、布-戴氏综合征、先天性红细胞生成障碍综合征I-IV、Chwachmann-Diamond综合征、二氢叶酸还原酶缺乏症、formamino转移酶缺乏症、莱-尼综合征(Lesch-Nyhansyndrome)、先天性球形细胞增多症、先天性椭圆形细胞增多症、先天性口形红细胞增多、先天性无Rh病、突发性夜间血红蛋白尿、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、丙酮酸激酶变体I、II、III缺乏症、先天性红细胞生成素敏感、缺乏、镰状细胞病和性状、地中海贫血α、β、γ高铁血红蛋白血症、先天性免疫病、重症联合免疫缺陷病(SCID)、裸淋巴细胞综合征、离子载体反应性联合、免疫缺陷(ionophore-responsive combinedimmunodeficiency)、加帽异常联合免疫缺陷(combinedimmunodeficiency with a capping abnormality)、核苷磷酸化酶缺乏症、粒细胞肌动蛋白缺乏症、婴儿粒细胞缺乏症、戈谢病(Gaucher’s disease)、腺苷脱氨酶缺乏症、科斯特曼综合征、网状组织发生不全、先天性白细胞功能障碍综合征；以及

VI.其它，包括骨硬化症、骨髓硬化症、获得性溶血性贫血、获得性免疫缺陷、造成原发性或继发性免疫缺陷的传染病、细菌感染(例如布鲁氏菌病、利斯特菌病、肺结核、麻风)、寄生虫感染(例如疟疾、利什曼病)、真菌感染、由于衰老吞噬细胞症造成的涉及淋巴细胞组成比例失衡和免疫功能减退的病症、科斯特曼粒细胞缺乏症、慢性肉芽肿病、谢-希综合征(Chediak-Higachisyndrome)、中性粒细胞肌动蛋白缺乏症、中性粒细胞膜GP-180缺乏症、代谢贮积疾病(metabolic storage disease)、粘多糖贮积症、粘脂贮积症、涉及免疫机制的混杂疾病、威-奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症。

在全部扩增、保存、和解冻过程中，本发明的外周血干细胞维持它们的三维几何结构和它们的细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

尽管此处描述了优选的实施方案，本领域技术人员理解本发明包括多种改变与修饰。本发明的范围不限于上文所描述的实施方案。

Claims (55)

1.来自哺乳动物的外周血干细胞，

其中所述外周血干细胞每单位体积的数目是天然存在的外周血的至少7倍；和

其中所述外周血干细胞具有与天然存在的外周血干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持及细胞-细胞几何结构。

2.包含权利要求1的外周血干细胞以及可接受载体的组合物。

3.权利要求2的组合物，其中所述可接受载体是以下至少一种：血浆、血液、白蛋白、细胞培养基、缓冲剂和低温保存剂，并且其中所述组合物任选地还包含生长因子、铜螯合剂和激素中至少一种。

4.权利要求3的组合物，其中如果存在的话所述生长因子是G-CSF，并且其中如果存在的话所述铜螯合剂是D-青霉胺。

5.权利要求2的组合物，其中所述组合物处于足以低温保存所述外周血干细胞的温度。

6.根据权利要求2的组合物，其中低温保存剂以足以低温保存所述细胞的量存在，并且其中所述组合物处于约-120℃到约-196℃的温度。

7.根据权利要求6的组合物，其中所述温度是约-130℃到约-150℃。

8.根据权利要求2的组合物，还包含药用可接受载体。

9.根据权利要求3的组合物，其中所述组合物包含选自下组的低温保存剂的总量：60到80％氨基酸葡萄糖溶液中的20到40％二甲基亚砜溶液；15到25％的羟乙基淀粉溶液；4到6％的甘油、3到5％葡萄糖和6到10％葡聚糖T10；15到25％聚乙二醇；和75到85％氨基酸葡萄糖溶液。

10.权利要求2的组合物，其中所述组合物不含有毒物质。

11.来自哺乳动物的外周血干细胞，其中所述外周血干细胞是TVEMF扩增的。

12.权利要求11的TVEMF扩增的外周血干细胞，其中单位体积中TVEMF扩增的外周血干细胞的数量至少是TVEMF扩增的外周血干细胞所来源的外周血中每单位体积的干细胞数量的2倍。

13.权利要求12的TVEMF扩增的外周血干细胞，其中TVEMF扩增的外周血干细胞每单位体积的数量是至少7倍。

14.包含权利要求13的外周血干细胞和可接受载体的组合物。

15.包含权利要求13的TVEMF扩增外周血干细胞的组合物，其中所述可接受载体是下组中至少一种：血浆、血液、白蛋白、细胞培养基、缓冲剂和低温保存剂，并且其中所述组合物任选地还包含生长因子、铜螯合剂和激素中至少一种。

16.权利要求15的组合物，其中如果存在的话所述生长因子是G-CSF，并且其中如果存在的话所述铜螯合剂是D-青霉胺。

17.根据权利要求14的组合物，其中所述组合物还包含选自下组的低温保存剂的总量：60到80％氨基酸葡萄糖溶液中的20到40％二甲基亚砜溶液；15到25％的羟乙基淀粉溶液；4到6％的甘油、3到5％葡萄糖和6到10％葡聚糖T10；15到25％聚乙二醇；和75到85％氨基酸葡萄糖溶液。

18.权利要求14的组合物，其中所述组合物处于足以低温保存所述外周血干细胞的温度。

19.根据权利要求14的组合物，其中存在低温保存剂，并且其中所述组合物处于约-120℃到约-196℃的温度。

20.根据权利要求14的组合物，其中所述温度是从约-130℃到约-150℃。

21.权利要求14的组合物，其中所述组合物不含有毒物质。

22.制备外周血干细胞组合物的方法，其包括以下步骤：

a.将外周血混合物置于TVEMF生物反应器的培养腔室中；和

b.使外周血混合物受到TVEMF，并在TVEMF生物反应器中对外周血干细胞进行TVEMF扩增以制备外周血干细胞组合物。

23.根据权利要求22的方法，其中所述TVEMF是约0.05到约6.0高斯。

24.根据权利要求22的方法，其中所述TVEMF扩增持续进行直到TVEMF扩增的外周血干细胞每单位体积的数量是放置于TVEMF生物反应器中外周血干细胞每单位体积的数量的7倍以上。

25.根据权利要求22的方法，其还包括在将外周血混合物置于TVEMF生物反应器中之前收集外周血。

26.权利要求25的方法，其中所述外周血是人的外周血。

27.根据权利要求22的方法，其还包括在将外周血加到外周血混合物中之前，从外周血保存设备中收集解冻的低温保存外周血。

28.权利要求22的方法，其还包括在TVEMF扩增之前从外周血混合物中除去有毒物质的步骤。

29.权利要求22的方法，其中TVEMF生物反应器具有集成的TVEMF源。

30.权利要求22的方法，其中TVEMF生物反应器具有相邻的TVEMF源。

31.权利要求22的方法，其中外周血混合物包含与其它外周血组分分离开的CD34+/CD38-外周血干细胞。

32.权利要求22的方法，其中外周血混合物包含与其它外周血组分分离开的血沉棕黄层。

33.权利要求22的方法，其中外周血混合物包含不含红细胞的外周血。

34.权利要求22的方法，其还包括以下步骤：将外周血干细胞组合物的TVEMF扩增细胞转移到具有一定温度的低温容器，和以受控速率将低温容器的温度降低到-120℃至-196℃的温度。

35.权利要求34的方法，其还包括以下步骤：在以受控速率降低温度到-120℃至-196℃之前，从外周血干细胞组合物中除去有毒物质。

36.权利要求34的方法，其还包括，在降温步骤之后，在一段时间内保持低温容器的温度在-120℃到-196℃的步骤。

37.权利要求36的方法，其中所述一段时间为至少一年。

38.权利要求36的方法，其还包括，在所述降温和保持温度之后，以受控速率将低温容器升温至适于将外周血干细胞组合物导入哺乳动物的温度的步骤。

39.权利要求38的方法，其中有毒物质已经从所述升温的外周血干细胞组合物中被除去。

40.权利要求34的方法，其还包括在降低温度的步骤之前将低温保存剂加到外周血干细胞组合物的TVEMF扩增细胞中的步骤。

41.通过根据权利要求22的方法制备的包含外周血干细胞和可接受载体的组合物。

42.修复哺乳动物组织的方法，其包括以下步骤：将治疗有效量的包含权利要求1的外周血干细胞和药用可接受载体的组合物施用给哺乳动物。

43.修复哺乳动物组织的方法，其包括以下步骤：将治疗有效量的包含权利要求11的TVEMF扩增的外周血干细胞和药用可接受载体的组合物施用给哺乳动物。

44.权利要求43的方法，其中待修复组织是人体组织。

45.权利要求44的方法，其中所述哺乳动物是TVEMF扩增之前外周血干细胞的来源。

46.权利要求44的方法，其中待修复组织是选自下组中的至少一种：肝脏组织、心脏组织、造血组织、血管、皮肤组织、肌肉组织、肠组织、胰脏组织、中枢神经系统细胞、骨、软骨组织、结缔组织、肺组织、脾组织和脑组织。

47.权利要求43的方法，其中待施用给哺乳动物的TVEMF扩增的外周血干细胞的量是至少20ml含10⁷到10⁹个干细胞/ml的组合物。

48.治疗哺乳动物疾病的方法，其包括将治疗有效量的包含权利要求1的外周血干细胞和药用可接受载体的组合物施用给哺乳动物的步骤。

49.治疗哺乳动物疾病的方法，其包括将治疗有效量的包含权利要求11的TVEMF扩增的外周血干细胞和药用可接受载体的组合物施加给哺乳动物的步骤。

50.权利要求49的方法，其中所述哺乳动物是人并且其中所述哺乳动物是TVEMF扩增之前外周血干细胞的来源。

51.权利要求50的方法，其中待施用给所述哺乳动物的TVEMF扩增外周血干细胞的量是至少20ml具有10⁷至10⁹个干细胞/ml的组合物。

52.权利要求50的方法，其中所述疾病是选自下组中的至少一种：源于正常血细胞产生与成熟的功能衰竭或功能障碍的疾病，过度增殖性干细胞病，再生障碍性贫血，全血细胞减少症，血小板减少症，红细胞再生障碍，由于药物、辐射、或者感染、先天性原因造成的布-戴氏综合征(Blackfan-Diamond syndrome)；造血系统恶性肿瘤、急性淋巴母细胞(淋巴细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性恶性骨髓硬化症、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、不明原因的骨髓化生(agnogenicmyelometaplasia)、Waldenstrom’s巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；具有以下疾病的患者中的免疫抑制：恶性、实体肿瘤、恶性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、睾丸癌、胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、淋巴瘤；自身免疫性疾病，类风湿性关节炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多发性硬化、和系统性红斑狼疮；遗传性(先天性)疾病，贫血、家族性再生障碍性、范科尼氏综合征、布卢姆综合征、纯红细胞再生障碍(PRCA)、先天性角化不良症、布-戴氏综合征、先天性红细胞生成障碍综合征I-IV、Chwachmann-Diamond综合征、二氢叶酸还原酶缺乏症、formamino转移酶缺乏症、莱-尼综合征(Lesch-Nyhansyndrome)、先天性球形细胞增多症、先天性椭圆形细胞增多症、先天性口形红细胞增多、先天性无Rh病、突发性夜间血红蛋白尿、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、丙酮酸激酶变体I、II、III缺乏症、先天性红细胞生成素敏感、缺乏、镰状细胞病和性状、地中海贫血α、β、γ高铁血红蛋白血症、先天性免疫病、重症联合免疫缺陷病(SCID)、裸淋巴细胞综合征、离子载体反应性联合、免疫缺陷(ionophore-responsive combined immunodeficiency)、加帽异常联合免疫缺陷(combined immunodeficiency with a capping abnormality)、核苷磷酸化酶缺乏症、粒细胞肌动蛋白缺乏症、婴儿粒细胞缺乏症、戈谢病(Gaucher’s disease)、腺苷脱氨酶缺乏症、科斯特曼综合征、网状组织发生不全、先天性白细胞功能障碍综合征；骨硬化症、骨髓硬化症、获得性溶血性贫血、获得性免疫缺陷、造成原发性或继发性免疫缺陷的传染病、细菌感染(例如布鲁氏菌病、利斯特菌病、肺结核、麻风)、寄生虫感染(例如疟疾、利什曼病)、真菌感染、由于衰老吞噬细胞症造成的涉及淋巴细胞组成比例失衡和免疫功能减退的病症、科斯特曼粒细胞缺乏症、慢性肉芽肿病、谢-希综合征(Chediak-Higachi syndrome)、中性粒细胞肌动蛋白缺乏症、中性粒细胞膜GP-180缺乏症、代谢贮积疾病(metabolic storage disease)、粘多糖贮积症、粘脂贮积症、涉及免疫机制的混杂疾病、威-奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、和α1-抗胰蛋白酶缺乏症。

53.研究疾病状态的方法，其包括将TVEMF扩增的干细胞导入所述疾病状态的试验系统。

54.权利要求53的方法，其中所述疾病状态是选自下组中的至少一种：源于正常血细胞产生与成熟的功能衰竭或功能障碍的疾病，过度增殖性干细胞病，再生障碍性贫血，全血细胞减少症，血小板减少症，红细胞再生障碍，由于药物、辐射、或者感染、先天性原因造成的布-戴氏综合征(Blackfan-Diamond syndrome)；造血系统恶性肿瘤、急性淋巴母细胞(淋巴细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性恶性骨髓硬化症、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、不明原因的骨髓化生(agnogenicmyelometaplasia)、Waldenstrom’s巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；具有以下疾病的患者中的免疫抑制：恶性、实体肿瘤、恶性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、睾丸癌、胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、淋巴瘤；自身免疫性疾病，类风湿性关节炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多发性硬化、和系统性红斑狼疮；遗传性(先天性)疾病，贫血、家族性再生障碍性、范科尼氏综合征、布卢姆综合征、纯红细胞再生障碍(PRCA)、先天性角化不良症、布-戴氏综合征、先天性红细胞生成障碍综合征I-IV、Chwachmann-Diamond综合征、二氢叶酸还原酶缺乏症、formamino转移酶缺乏症、莱-尼综合征(Lesch-Nyhansyndrome)、先天性球形细胞增多症、先天性椭圆形细胞增多症、先天性口形红细胞增多、先天性无Rh病、突发性夜间血红蛋白尿、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、丙酮酸激酶变体I、II、III缺乏症、先天性红细胞生成素敏感、缺乏、镰状细胞病和性状、地中海贫血α、β、γ高铁血红蛋白血症、先天性免疫病、重症联合免疫缺陷病(SCID)、裸淋巴细胞综合征、离子载体反应性联合、免疫缺陷(ionophore-responsive combined immunodeficiency)、加帽异常联合免疫缺陷(combined immunodeficiency with a capping abnormality)、核苷磷酸化酶缺乏症、粒细胞肌动蛋白缺乏症、婴儿粒细胞缺乏症、戈谢病(Gaucher’s disease)、腺苷脱氨酶缺乏症、科斯特曼综合征、网状组织发生不全、先天性白细胞功能障碍综合征；骨硬化症、骨髓硬化症、获得性溶血性贫血、获得性免疫缺陷、造成原发性或继发性免疫缺陷的传染病、细菌感染(例如布鲁氏菌病、利斯特菌病、肺结核、麻风)、寄生虫感染(例如疟疾、利什曼病)、真菌感染、由于衰老吞噬细胞症造成的涉及淋巴细胞组成比例失衡和免疫功能减退的病症、科斯特曼粒细胞缺乏症、慢性肉芽肿病、谢-希综合征(Chediak-Higachi syndrome)、中性粒细胞肌动蛋白缺乏症、中性粒细胞膜GP-180缺乏症、代谢贮积疾病(metabolic storage disease)、粘多糖贮积症、粘脂贮积症、涉及免疫机制的混杂疾病、威-奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、和α1-抗胰蛋白酶缺乏症。

55.来自哺乳动物的骨髓干细胞，其中所述骨髓干细胞是TVEMF扩增的。

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