CN110051839A

CN110051839A - 一种促进脐带血干细胞体外扩增和增强脐带血干细胞移植后造血重建功能的药物

Info

Publication number: CN110051839A
Application number: CN201910302459.XA
Authority: CN
Inventors: 赵萌
Original assignee: Novotel Biotechnology (xuzhou) Co Ltd
Current assignee: Novotel Biotechnology (xuzhou) Co Ltd
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2019-07-26

Abstract

本发明提供了SphK2抑制剂ABC294640促进脐带血体外扩增和增加脐带血移植后造血重建和免疫重建速度的用途。ABC294640可以有效增加脐带血中造血干数量和功能可用于脐带血干细胞的体外培养增加造血干细胞的数量，也可用于脐带血干细胞骨髓移植后加快脐带血移植后造血重建的速度和效率。本发明可应用于脐带血的扩增、存储以及脐带血干细胞移植后的治疗。

Description

一种促进脐带血干细胞体外扩增和增强脐带血干细胞移植后造血重建功能的药物

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及ABC294640用于脐带血体外扩增、脐带血的贮存、增加脐带血中造血干细胞数量和功能单位以及脐带血用于造血干细胞骨髓移植；本药物还可应用于脐带血移植后加快造血重建和免疫重建速度。

背景技术

造血干细胞是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，其主要作用是分化产生红细胞、血小板以及白细胞等各类血液免疫细胞，支持机体造血和免疫系统的更新。造血干细胞对于机体正常造血功能的维持和损伤修复有重要意义。每份脐带血来源的造血干细胞由于数量较少、功能单位较低，难以在临床骨髓移植中广泛应用。本发明用于脐带血的存贮可有效提高脐带血中造血干细胞的数量和功能单位，用于脐带血的造血干细胞骨髓移植，同时还可以应用于脐带血干细胞的临床骨髓移植病人治疗，帮助病人在移植后提高造血重建和免疫重建的速度。

ABC294640，结构如式1所示，是鞘氨醇激酶2(SphK2)的抑制剂，可以抑制SphK2的功能减少鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的产生。S1P是真核生物体的第二信使可以发挥多种重要生理功能，可促进癌组织生长和病理性炎症的发生。现在研究发现ABC294640对多种实体瘤包括胰腺肿瘤、肝癌、胆管癌和多发性骨肉瘤，有抑制肿瘤生长、减少免疫炎症反应的治疗作用，相关实验已经在美国开展临床二期实验，以色列生物制药公司RedHill报导药物YelivaTM(ABC294640)在一期临床实验中，证实该药物具有良好的安全性和耐受性，主要副作用是1-2级的疲惫感和恶心感。然而ABC294640对造血干细胞的作用还未见报道。

式1

发明内容

本发明是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的：

通常认为，SphK2基因(小鼠NCBI登录号:NP_001166032，人 Genbank Gene ID:56848)缺失会导致多种肿瘤细胞的生长缓慢、凋亡发生和成瘤能力减弱。发明人发现SphK2抑制剂ABC294640在体外可有效扩增脐带血来源的造血干细胞，增加其数量和功能单位，以及分化产生各种血液细胞的克隆形成能力。发明人还发现在脐带血骨髓移植后给予ABC294640注射可有效提高脐带血的造血重建和免疫重建速度，接受脐带血造血干细胞骨髓移植后小鼠腹腔注射ABC294640后可以使造血干细胞数量显著增加，并且血小板和血液免疫细胞恢复速度显著加快，对造血干细胞骨髓移植后的血象恢复有显著治疗作用。

本发明将现有的SphK2抑制剂ABC294640这个小分子化合物发掘出新的药用价值，将其应用脐带血骨髓移植的治疗。

因此，本发明提供了：

SphK2抑制剂在体外扩增脐带血来源造血干细胞中的应用，可用于脐带血干细胞的存储和制备；以及脐带血骨髓移植病人接受SphK2抑制剂增加病人中脐带血干细胞造血重建和免疫重建效用中的应用，其中 SphK2抑制剂抑制SphK2基因的表达或者抑制SphK2蛋白的功能，所述的SphK2抑制剂优选是ABC294640。

附图说明：

图1.体外用SphK2抑制剂ABC294640处理脐带血干细胞可有效增加脐带血中造血干细胞的数量。

A图方框中标示的是人源脐带血单核细胞在体外培养扩增后，脐带血造血干细胞数目的分析，显示SphK2抑制剂ABC294640处理后，较溶剂对照组，脐带血造血干细胞比例增加；B图是统计体外培养扩增后抑制剂组和溶剂对照组中造血干细胞的数目。结果表明SphK2抑制剂 ABC294640处理脐带血干细胞可有效增加脐带血中造血干细胞的数量。

图2.体外用SphK2抑制剂ABC294640处理脐带血干细胞可有效增加脐带血中造血干细胞分化成各种血液细胞的克隆形成能力。

A图是经过体外培养扩增后的脐带血单核细胞后，接种于MethoCult 造血干细胞克隆形成培养基所形成的粒-巨噬细胞集落，红系集落和混合集落。B图是统计抑制剂组和溶剂对照组体外扩增后脐带血单核细胞的克隆形成数目。结果表明体外用SphK2抑制剂ABC294640处理脐带血干细胞可有效增加脐带血中造血干细胞分化成各种血液细胞的克隆形成能力。

图3.接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂ABC294640显著提高造血干细胞骨髓移植后人源血液细胞的嵌合率。

A图是接受了人体脐带血CD34阳性细胞的人源化免疫缺陷鼠即 NSG小鼠经过SphK2抑制剂ABC294640和单纯溶剂注射处理的流程图。 B图是4周后抑制剂组和溶剂对照组小鼠骨髓中人源血液细胞的嵌合率结果。结果表明接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂 ABC294640显著提高脐带血来源造血干细胞骨髓移植后血液细胞的嵌合率。

图4.接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂ABC294640显著加快白细胞恢复速度。

图5.接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂ABC294640显著加快血小板的恢复速度。

具体实施方式

结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例1

体外用SphK2抑制剂ABC294640处理脐带血干细胞可有效增加脐带血中造血干细胞的数量。

实验用脐带血来自广东省妇幼保健院，将其在洁净操作台中与 PBS 1:1混均，随后通过单核淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，分离出脐带血中的单核细胞。将细胞分为两组，每组各6份，每份20万细胞，将其培养于U型底的96孔板，培养基为造血干细胞专用的stem cell techology公司2SFEM培养基，培养环境为5％O₂和5％CO₂的低氧环境培养1w，每两天换液一次。其中一组用SphK2抑制剂ABC294640给药刺激，给药浓度为0.5μM；另外一组为溶剂对照组。SphK2抑制剂 ABC294640购置于Selleck公司，溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，为计算人体脐带血中造血干细胞的数目，通过造血干细胞领域公认的分子标记系统CD34+CD38-CD49f+CD45RA-,结合流式细胞仪对造血干细胞数量进行统计定量。具体方法为将U型底96孔板直接无刹车500g 离心5分钟，弃掉上清，随后每孔加入100ulPBS和0.5ul CD34，CD38， CD49f，CD45RA的抗体组合，冰上孵育1h，随后加入100ulPBS清洗细胞，无刹车500g离心5分钟，加入100ulPBS进行流式细胞仪计数分析，得到人体脐带血培养之后造血干细胞数目。我们应用Graphpad6.0 进行t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。

结果显示，体外用SphK2抑制剂ABC294640处理脐带血干细胞可有效增加脐带血中造血干细胞的数量。(图1)**P＜0.01。

实施例2

体外用SphK2抑制剂ABC294640处理脐带血干细胞可有效增加脐带血中造血干细胞分化成各种血液细胞的克隆形成能力。

分别选择实施例1中的溶剂对照组与抑制剂组体外扩增之后的细胞各3份，每份25万细胞，将其用6孔板接种于MethoCult造血干细胞克隆形成培养基，该培养基会形成粒-巨噬细胞集落，红系集落和混合集落。培养环境同案例1，培养时间为10天，培养完成后用光学显微镜拍照数克隆个数。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05 标示差异的显著性。

结果显示，体外用SphK2抑制剂ABC294640处理脐带血干细胞可有效增加脐带血中造血干细胞分化成各种血液细胞的克隆形成能力。 (图2)*P＜0.05。

实施例3

接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂ABC294640显著提高造血干细胞骨髓移植后人源血液细胞的嵌合率。

人源化免疫缺陷鼠即NSG小鼠从百奥赛图公司购买，在无特定病原体的洁净(SPF)环境中饲养。首先我们选用20只8周大NSG小鼠进行X射线辐射损伤，剂量为450cGy，每只辐射小鼠尾静脉注射75000 个从案例1脐带血单核细胞中磁珠分选的CD34+脐带血干细胞。接下来将已进行骨髓移植小鼠分为两组，每组各10只，每两天进行一次 ABC294640的腹腔注射，对照组注射溶剂对照(1：1生理盐水：PEG400) 溶液。SphK2抑制剂ABC294640购置于Selleck公司，溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，最终用聚乙二醇400(PEG400)与生理盐水的混合液(1：1)稀释为终浓度10mg/kg。

用药方案是第一天进行小鼠辐射损伤，第二天开始注射抑制剂与溶剂对照，随后每两天进行一次给药注射，共观察4周。第4周提取对照组与ABC294640处理组小鼠骨髓细胞，具体实施为将其脱颈处死，取其股骨与胫骨，用1毫升注射器冲出骨髓腔中骨髓，吹散为单细胞悬液，红细胞裂解液裂解2分钟去除红细胞，70um滤网过滤，得到骨髓单细胞悬液。

为计算人源脐带血干细胞在小鼠中的嵌合率，通过人源的CD45 与小鼠来源的CD45将其区分开来，结合流式细胞仪对其进行统计定量。具体方法为取出200万骨髓细胞，加入0.5ul人源CD45和0.5ul 鼠源CD45抗体，冰上孵育1h。随后加入1毫升PBS清洗细胞，500g 离心5min，弃掉上清，加入300ulPBS，进行流式细胞仪计数分析，得到脐带血细胞在小鼠骨髓中的嵌合率。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05标示差异的显著性。

结果显示，接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂 ABC294640显著提高造血干细胞骨髓移植后人源血液细胞的嵌合率。 (图3)**P＜0.01。

实施例4

接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂ABC294640显著加快白细胞恢复速度。

SphK2抑制剂的配制与实施例3一致，选用百奥赛图公司购买的 20只8周大NSG小鼠，分为两组，每组各10只，小鼠的骨髓移植与随后的给药处理都与实施例3相同，抑制剂ABC294640与溶剂对照的注射与实施例3相同，也是辐射后第二天开始注射，随后每两天注射一次，剂量为10mg/kg，一直注射到该实验结束。分别在第一周，第二周，第三周和第四周小鼠尾静脉取血于抗凝管中，采用血常规检测外周血白细胞数目。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05 标示差异的显著性。

结果显示，ABC294640治疗组较溶剂对照组，外周血中白细胞数量显著增加，说明接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂 ABC294640显著加快白细胞恢复速度。(图4)*P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001。

实施例5

接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂ABC294640显著加快血小板的恢复速度。

SphK2抑制剂的配制与实施例3一致，选用百奥赛图公司购买的 20只8周大NSG小鼠，分为两组，每组各10只，小鼠的骨髓移植与随后的给药处理都与实施例3相同，抑制剂ABC294640与溶剂对照的注射与实施例3相同，也是辐射后第二天开始注射，随后每两天注射一次，剂量为10mg/kg，一直注射到该实验结束。分别在第一周，第二周，第三周和第四周小鼠尾静脉取血于抗凝管中，采用血常规检测外周血血小板数目。我们应用Graphpad6.0进行t检验分析，用P＜0.05 标示差异的显著性。

结果显示，ABC294640治疗组较溶剂对照组，外周血中血小板数量显著增加，说明接受脐带血移植后的人源化小鼠，注射抑制剂 ABC294640显著加快血小板恢复速度。(图5)*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

以上为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护。

Claims

1.SphK2抑制剂在促进脐带血干细胞体外扩增中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述SphK2抑制剂提高脐带血中造血干细胞的数量和功能。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述SphK2抑制剂用于提高脐带血用于造血干细胞骨髓移植的有效单位。

4.SphK2抑制剂在制备用于促进脐带血干细胞移植后造血重建和免疫重建的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的药物增强造血干细胞骨移植后的造血重建能力。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的药物用于提高病人血小板数量。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的药物用于提高病人血液免疫细胞数量。

8.权利要求1-7中任一项所述的应用，其中的SphK2抑制剂抑制SphK2基因的表达或者抑制SphK2蛋白的功能。

9.如权利要求8所述的应用，其中所述的SphK2抑制剂是ABC294640。