CN107586758A

CN107586758A - 一种干细胞样记忆性t细胞体外诱导剂及诱导方法

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Publication number: CN107586758A
Application number: CN201711067295.4A
Authority: CN
Inventors: 周素芳; 曾麒燕; 宾晓芸; 陈安宁
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2037-11-03
Also published as: CN107586758B

Abstract

本发明公开一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法，属于细胞诱导剂和细胞诱导方法技术领域。所述的诱导剂包括红桂木凝集素；所述的诱导剂还包括细胞因子IL‑2；所述的干细胞样记忆性T细胞为CD3+细胞的亚群。本研究发现了ALL联合细胞因子IL‑2可以在体外诱导TSCM细胞产生并促使增殖和集落形成，快速诱导CD3+T细胞扩增为TSCM，有效提高CD3+TSCM的绝对数和形成比例，其诱导效果优于单独使用红桂木凝集素或细胞因子IL‑2进行扩增的效果。

Description

一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法

技术领域

本发明属于一种细胞培养诱导剂及细胞的诱导方法，具体涉及一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂及诱导方法。

背景技术

2005年，Zhang等在研究小鼠移植物抗宿主反应疾病(graft versus hostdisease，GVHD)模型中发现，一群来源于供体的CD8+T细胞在GVHD发生的过程中持续存在，造成宿主损伤。与初始T细胞或成熟记忆性T细胞相比，这群T细胞具有干细胞的特征，即能够自我更新，在体内能够分化产生中枢性和效应性记忆性CD8+T细胞，并且产生的这些子代细胞表现出记忆性T细胞的特征，能够快速对再次免疫的抗原产生反应并且分化为效应细胞，引起GVHD。研究人员将这群细胞定义为“干细胞样记忆性T细胞”，或称为“TSCM细胞”。

TSCM细胞具备快速增殖能力，在归巢因子IL-15和IL-7作用下，能够快速的增殖，CD8+TSCM细胞在IL-15作用下能快速的分裂，这种分裂方式与干细胞非常类似，增殖的两个子代细胞中，一个子代细胞继续分化为其他细胞类型，另外一个自我复制，依然维持母代细胞的表型，因此虽然经历多代细胞分裂，部分细胞仍然处于静息状态，依然具有产生子代细胞的增值和分化能力。在IL-7的刺激下，CD4+TSCM细胞具有相似的能力。TSCM细胞一方面可分泌具有杀伤能力的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、granzyme B 等；另一方面，在遇到抗原刺激时还可迅速分化成为效应T 细胞，中央记忆性T 细胞以及效应记忆性T 细胞，发挥其快速免疫应答的功能。

TSCM细胞具有很强的抗肿瘤功能，无论在动物模型和人源化小鼠黑色素瘤模型中均观察到这种现象。研究人员推测TSCM细胞的抗肿瘤效应，除了可能由于其具有很强的增殖能力和分化能力，同时也与自身能够产生抗肿瘤的细胞因子如IFN-γ有关。另外，TSCM白血病的治疗中也表现出较强的免疫抗肿瘤能力。

这群细胞作为一种具有自我更新能力和多能性潜力的T细胞亚群，在诸多的免疫性疾病中都发挥着重要的作用。

上述研究结果提示TSCM细胞具备干细胞的特性，具有很强的增殖和分化能力，体外移植实验表明其具有很强的生存能力，TSCM细胞能有效的扩增，并保持长效的记忆T细胞能力，TSCM细胞所具备的这些特征解决了临床上移植细胞体外扩增难的问题。其次，TSCM细胞很强的生存能力使得植入体内细胞生存时间延长，并且自身能够产生具有抗肿瘤功能的细胞因子。因此人们还可以进一步探索如何利用体外扩增TSCM细胞来作为新的过继免疫治疗策略。TSCM细胞有可能成为最为有效的ACT(the adoptive cell transfer，ACT)治疗肿瘤的细胞类型。由于TSCM细胞在人体中的比例非常低，由此，探索如何能够诱导这种细胞快速扩增的方法就变得尤为重要和迫切。

红桂木凝集素(artocarpuslingnanensislectin，ALL)是一种性质稳定、凝集活性高的植物凝集素，有研究发现，ALL能诱导T细胞的活化，能促进人外周血单核细胞来源的树突状细胞的成熟及增殖。基于ALL在激活T细胞、树突状细胞增殖生长方面的重要作用，联合细胞因子IL-2，本研究试图探索ALL在体外是否可诱导人TSCM细胞的扩增，并检测其在TSCM细胞诱导生成中的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种红桂木凝集素联合细胞因子IL-2在体外诱导人外周血CD3+T细胞产生人TSCM细胞的扩增。

本发明的另一目的是提供一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导扩增的方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂，所述的诱导剂包括红桂木凝集素；

所述的诱导剂还包括细胞因子IL-2；

所述的干细胞样记忆性T细胞为CD3+细胞的亚群。

优选的，所述的CD3+细胞的亚群是指在CD3+细胞中选定CD45RA⁺CD45RO ^－的细胞亚群，进一步再选出CD62L⁺CCR7⁺的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定CD95 ⁺CD122⁺双阳性细胞。

一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，具体步骤为：

（1）将分选获得的CD3+细胞置于添加有流式细胞术用抗体的细胞培养液中培养；

（2）在培养液中加入诱导剂红桂木凝集素和细胞因子IL-2进行诱导培养；

（3）诱导培养完成后，分选出CD3+ TSCM细胞。

优选的，所述的红桂木凝集素的浓度为2.5~10ug/ml，所述的细胞因子IL-2的浓度为5~25 ng/ml。

优选的，所述的红桂木凝集素的浓度为7.5ug/ml，所述的细胞因子IL-2的浓度为12.5ng/ml。

优选的，所述的TSCM细胞培养时间在6~8天左右。

优选的，所述的流式细胞术用抗体包括human CD3-APC、FITC、human CD8-APC、human CD8-Pacific blue、humanCD45RA-PE、human CD45RO-PE-Cy5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-FITC、human CD95-PE-Cy5和human CD122-PE的一种或多种。

一种红桂木凝集素在制备干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂的应用。

一种红桂木凝集素和细胞因子IL-2在制备干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂的应用。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：

本研究发现了ALL联合细胞因子IL-2可以在体外诱导TSCM细胞产生并促使增殖和集落形成，快速诱导CD3+ T细胞扩增为TSCM，有效提高CD3+ TSCM的绝对数和形成比例，其诱导效果优于单独使用红桂木凝集素或细胞因子IL-2进行扩增的效果。

ALL联合细胞因子IL-2可以在体外诱导TSCM细胞产生，具有一定的浓度梯度依赖性，其中最佳的浓度组合是7.5ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2。随着处理时间的延长，能够诱导产生更多的TSCM细胞。但是，如果处理时间过长，细胞会出现一定程度的死亡。因此，诱导TSCM的最佳时间为6~8天。

本发明提供的ALL、细胞因子IL-2具有安全性高，不存在药物毒性，能为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。

附图说明

图1是构建的流式检测TSCM细胞的模板。

图2是ALL+IL-2处理组对TSCM细胞扩增结果。

图3是ALL处理组对TSCM细胞扩增结果。

图4是IL-2处理组对TSCM细胞扩增结果。

图5是不同浓度ALL，IL-2，以及ALL+IL-2组合对TSCM细胞增殖率的影响；

其中A1~A4分别为：2.5ug/ml、5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml的ALL；

B1~B4分别为：5ng/ml、7.5ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml的IL-2；

C1~C16分别为：2.5ug/ml ALL+5ng/ml IL-2、2.5ug/ml ALL+7.5ng/ml IL-2、

2.5ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2、2.5ug/ml ALL+25ng/ml IL-2、5ug/ml ALL+5ng/mlIL-2、

5ug/ml ALL+7.5ng/ml IL-2、5ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2、5ug/ml ALL+25ng/ml IL-2、

7.5ug/ml ALL+5ng/ml IL-2、7.5ug/ml ALL+7.5ng/ml IL-2、7.5ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2、7.5ug/ml ALL+25ng/ml IL-2、10ug/ml ALL+5ng/ml IL-2、10ug/ml ALL+7.5ng/ml IL-2、

10ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2和10ug/ml ALL+25ng/ml IL-2。

图6是不同浓度ALL、IL-2和ALL+IL-2组合对TSCM细胞集落生成的影响。

图7不同浓度ALL、IL-2和ALL+IL-2组合对TSCM细胞生成比率的影响。

图8 培养时间对生成TSCM细胞的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

1 材料

健康人的外周成分血由南宁市血液中心提供。

2 主要试剂和仪器

人外周血淋巴细胞分离液( 天津市灏洋生物制天津市灏洋生物制品科技有限公司)，ＲPMI-1640培养基( Gibco，美国)，胎牛血清( FBS)( Gibco，美国)，青－链霉素双抗(Gibco，美国)，生物安全柜，细胞培养箱( Thermo)，离心机( Eppendorf)，光学倒置生物显微镜( Leica)，分析型流式，细胞仪( BD)，流式细胞术用抗体包括human CD3-APC、 FITC、human CD8-APC、human CD8-Pacific blue、humanCD45RA-PE、human CD45RO-PE-Cy5、humanCD62L-PE-Cy7、human CCR7-FITC、human CD95-PE-Cy5和human CD122-PE 均购自BDPharmingen。

3 主要方法

3.1 分离人外周血T细胞( peripheral blood mononuclearcells，PBMCs) 的分离2.5mL 抗凝人外周成分血，加入等体积的生理盐水稀释，混匀后把稀释后的血贴壁缓缓加入已装有2.5mL 人外周淋巴细胞分离液的15 mL 离心管中，2500 r /min 离心25 min，离心后，小心吸取悬于液体中间白膜层细胞，转移至15 mL离心管中，加入5倍体积的PBS 缓冲液洗细胞，1500 r /min离心10 min ，弃上清液。重复清洗细胞1次。用RPMI-1640完全培养基悬浮细胞，37℃ 5% CO2培养箱培养3~4 h，转移悬浮细胞至新培养瓶。

3.2 构建流式检测TSCM细胞的方法：采取4步法来鉴定和分析TSCM细胞。首先选定CD3+细胞，然后在CD3+细胞中选定CD45RA⁺CD45RO ^－的细胞亚群，进一步再选出CD62L⁺CCR7⁺的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定CD95 ⁺CD122⁺双阳性的细胞；该群细胞就是本研究所要关注的TSCM细胞。

3.3 刺激因子对生成TSCM细胞的影响：在96孔板中设置各处理组。对照组：不加任何刺激。ALL组：分别加2.5ug/ml、 5ug/m、7.5ug/ml、10ug/ml的ALL。

IL-2组：分别加5ng/ml、7.5ng/ml、12.5ng/m、25ng/ml的IL-2。

ALL+IL-2联合组：分别加2.5ug/ml ALL+5ng/ml IL-2、2.5ug/ml ALL+7.5ng/mlIL-2、

2.5ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2、2.5ug/ml ALL+25ng/ml IL-2、 5ug/ml ALL+5ng/mlIL-2、

10ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2、10ug/ml ALL+25ng/ml IL-2，培养0~12天，倒置显微镜下观察细胞的生长，并记录细胞集落。

CCK实验每孔加入CCK-8溶液10μl，37℃继续培养2小时，用Bio-Rad酶标仪在450nm处检测吸光度值，计算增殖率。实验重复3 次。测吸光度值，计算增殖率；增殖率( %) =(阳性对照组OD 值－阴性对照组的OD 值) /阴性对照组的OD 值× 100%。

3.4 细胞亚群的检测和分析在细胞培养的第2、4、6、8、10和12天，分别收取细胞标记抗体(human CD3-APC、FITC、human CD8-APC、human CD8-Pacific blue、humanCD45RA-PE、human CD45RO-PE-Cy5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-FITC、human CD95-PE-Cy5和human CD122-PE) 检测TSCM的比例。

4 统计学处理

采用SPSS 13. 0 分析软件进行统计分析，计量资料所有结果统一用均数±标准差(mean ± SD) 表示。各个实验组与对照组之间采用单因素方差分析进行比较，以P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

实施例2

5.结果

5.1 构建流式检测TSCM细胞的方法

本研究首先构建了一个流式检测TSCM细胞的模板，见图1，将刺激后的T细胞进行抗体标记，在分析的过程中，采取4步法来鉴定和分析TSCM细胞。首先选定CD3+细胞，然后在CD3+细胞中选定CD45RA⁺CD45RO ^－的细胞亚群，进一步再选CD62L⁺CCR7⁺的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定CD95 ⁺CD122⁺双阳性的细胞。该群细胞就是本研究所要关注的TSCM细胞。

5.2 检测ALL、IL-2 对TSCM细胞扩增效果的影响

加ALL和IL-2处理的细胞2、4、6、8、10、12天后，细胞生长良好，聚集成团并形成丰富集落；高倍镜下可见细胞染色质疏松、胞质丰富；单独加ALL处理的细胞，生长良好，能够聚集成集落，但是细胞密度、集落的丰富度不如加ALL+IL-2联合处理的细胞；单独加IL-2处理的组能够促使细胞增殖，但是不能形成集落。结果如图2~图4。

5.3 不同浓度的ALL+IL-2浓度处理对细胞增殖，集落形成和TSCM产生率的影响

处理6天之后，用CCK8方法对各处理组促进T细胞的增殖情况进行检测发现，随着ALL和IL-2浓度的增加，细胞的增殖得到显著的促进。单纯ALL处理T细胞，细胞增殖率随着ALL的浓度增加而增大，IL-2处理组的增殖幅度则较小，ALL+IL-2联合处理组的细胞增殖率均比单纯ALL处理组、IL-2处理组的高，其中7.5ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2处理的细胞增殖率最高。（见图5）

处理6天之后，观察并记录各处理组促进T细胞的集落生成情况时检测发现，单纯ALL处理T细胞，细胞生成集落的数量随着ALL的浓度增加而增大，而单纯用IL-2处理的细胞集落的生成不明显，ALL+IL-2联合处理组的细胞集落数生成也依赖ALL的浓度呈现增长。（见图6）

处理6天之后，应用已构建的流式检测TSCM细胞的模板对诱导产生的TSCM细胞进行检测发现，随着ALL浓度的增加，TSCM细胞的产生比例显著增加促进。单纯ALL处理T细胞，细胞增殖率随着ALL的浓度增加而增大，单纯IL-2处理组的几乎没有诱导TSCM细胞的生成，ALL+IL-2联合处理组诱导产生的TSCM细胞比率均比单纯ALL处理组的高，其中7.5ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2处理诱导产生的TSCM细胞比率最高。（见图7）

5.4 培养时间对生成TSCM细胞的影响

根据ALL、IL-2 浓度对T细胞增殖和集落生成的影响，我们选取了对细胞增殖和集落生成均能产生的浓度为7.5ug/ml ALL+12.5ng/ml IL-2的组合来刺激生成TSCM细胞。通过分别培养2、4、6、8、10和12天后，用已构建的流式检测TSCM细胞的模板对生成TSCM的比例进行检测发现，处理后TSCM的细胞比例分别为3.04%、7.34%、 11.65%、12.52%、8. 29%和5.25%，见图8。说明随着培养时间的增长TSCM细胞的比例逐渐增高，并且在6~8天左右达到最高，10天之后后TSCM的比例则下降。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。

Claims

1.一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂，其特征在于，所述的诱导剂包括红桂木凝集素；

所述的诱导剂还包括细胞因子IL-2；

所述的干细胞样记忆性T细胞为CD3+细胞的亚群。

2.根据权利要求1所述的干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂，其特征在于，所述的CD3+细胞的亚群是指在CD3+细胞中选定CD45RA⁺CD45RO ^－的细胞亚群，进一步再选出CD62L⁺CCR7⁺的细胞亚群，随后在这个亚群细胞的基础上，选定CD95 ⁺CD122⁺双阳性细胞。

3.一种干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，其特征在于，具体步骤为：

（3）诱导培养完成后，分选出CD3+ TSCM细胞。

4.根据权利要求3所述的干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，其特征在于，所述的红桂木凝集素的浓度为2.5~10ug/ml，所述的细胞因子IL-2的浓度为5~25 ng/ml。

5.根据权利要求3所述的干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，其特征在于，所述的红桂木凝集素的浓度为7.5ug/ml，所述的细胞因子IL-2的浓度为12.5ng/ml。

6.根据权利要求3所述的干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，其特征在于，所述的TSCM细胞培养时间在6~8天左右。

7.根据权利要求3所述的干细胞样记忆性T细胞体外诱导方法，其特征在于，所述的流式细胞术用抗体包括human CD3-APC、FITC、human CD8-APC、human CD8-Pacific blue、humanCD45RA-PE、human CD45RO-PE-Cy5、human CD62L-PE-Cy7、human CCR7-FITC、humanCD95-PE-Cy5和human CD122-PE的一种或多种。

8.一种红桂木凝集素在制备干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂的应用。

9.一种红桂木凝集素和细胞因子IL-2在制备干细胞样记忆性T细胞体外诱导剂的应用。