CN114908049A - Hdac6抑制剂在选择性诱导t细胞扩增中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及HDAC6抑制剂，例如化合物ACY‑1215及化合物ACY241用于体外T细胞处理的新用途及方法，使用其能够简便高效地诱导TSCM细胞扩增。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及HDAC6抑制剂在选择性诱导T细胞扩增中的用途。
背景技术
记忆性干细胞样T细胞(T memory stem cells,TSCM)是T细胞的一个亚群，兼具记忆性细胞和干细胞的特点，处于记忆性T细胞早期分化阶段，能够分化为中央记忆性T细胞(central memory T cells,TCM)、效应记忆性T细胞(effector memory T cells,TEM)和效应性T细胞(effector T cells,TEF)。
现有研究表明，TSCM细胞与TCM细胞或TEM细胞相比，具有更强大的抗肿瘤能力，在机体内的生存能力也更加卓越，因此在肿瘤免疫治疗中具有很好的应用价值。由于TSCM细胞在人外周血T细胞中所占比例很少，约为2％-4％，如何诱导TSCM细胞大量增殖成为关键。
然而，现有技术中缺乏较为简便高效地扩增TSCM细胞的方法，并存在使T细胞的增殖效率降低的缺点，不利于将获得的细胞进行下一步的应用。比如，用化合物TWS119培养诱导TSCM细胞的同时，T细胞的增殖效率会大幅度降低，T细胞仅能扩增1-3倍。
这样的问题限制了TSCM细胞的应用，因此，需要一种能选择性扩增 TSCM细胞的方法，期望对T细胞的增殖效率影响较小，且不影响T细胞杀伤效率等与治疗能力相关的细胞特性。
发明内容
本发明提供了使用HDAC6抑制剂，具体为化合物ACY-1215、ACY241 选择性诱导T细胞扩增的方法，及HDAC6抑制剂在制备TSCM细胞中的用途。本发明人发现，HDAC6抑制剂如化合物ACY-1215、ACY241均在几乎不影响T细胞增殖的情况下，能够显著提升TSCM细胞占T细胞的比例，为体外扩增TSCM细胞提供了新的技术手段。
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)可调节与细胞生长、转移、凋亡相关的多种细胞途径。HDACs抑制剂可以影响多种细胞效应，诱导细胞凋亡，阻碍细胞循环，抑制血管生成，其作为一种抗肿瘤制剂被广泛研究。HDAC6因其独特的结构和功能受到越来越多的关注，成为多种疾病潜在的治疗靶点，最受关注的主要是其在肿瘤及中枢神经系统中的作用。
研究证实，HDAC6抑制剂在治疗阿尔茨海默病、脑胶质瘤及神经保护方面的作用也受到越来越多研究者的关注。目前发现的HDAC6抑制剂主要包括ACY241、ACY-1215、Tubacin、Tubastatin A等，这些抑制剂具有相似但不尽相同的特性及应用，主要用于抗肿瘤及中枢神经系统保护等方面。因HDAC6具有较高的特异性，疗效好，不良反应少，具有良好的应用前景。
化合物ACY-1215的分子式为C24H27N5O3，名称为2-(二苯基氨基)-N-[7-(羟基氨基)-7-氧代庚基]-5-嘧啶羧酰胺，分子量为433.5，CAS号为：1316214-52-4，分子结构式如下所示：
化合物ACY-1215是一种有效的选择性HDAC6抑制剂，对HDAC6 的IC50值为4.7nM，对其他亚型的IC50值均＞1μM，对HDAC8有微弱活性(IC50值为0.1μM)。ACY-1215在低剂量能有效诱导α-微管蛋白乙酰化，仅在较高剂量下引起组蛋白H3、H4上赖氨酸的乙酰化，证实了其对HDAC6的特异性抑制作用。
在波替单抗(硼替佐米)处理过的多发性骨髓瘤细胞(MM细胞)中，随着多泛素化蛋白水平的增加，该药可显著破坏聚集体的形成，表明波替单抗和该药联用可抑制蛋白酶体和聚集体形成。低剂量ACY-1215联合波替单抗可产生协同抗MM细胞增殖作用，同时延长内质网应激和促进细胞凋亡。在2种不同的异种移植SCID小鼠模型中，小鼠皮下注射人类MM细胞和静脉注射表达荧光素酶的人MM细胞后，联用上述两药，肿瘤生长明显减缓，小鼠总体存活时间显著延长。目前ACY-1215单用或与地塞米松、波替单抗、来那度胺联用的治疗方式正在进行Ⅰ期、Ⅱ期临床试验。
化合物ACY241的分子式为C24H26ClN5O3，名称为2-[(2-氯苯基)苯基氨基]-N-[7-(羟基氨基)-7-氧代庚基]-5-嘧啶甲酰胺，分子量为467.95，CAS 号为：1316215-12-9，分子结构式如下所示：
ACY241是一种口服有活性的选择性HDAC6抑制剂，对HDAC6和 HDAC3的IC50值分别为2.6和46nM。在多种实体瘤细胞系中，用ACY241 和紫杉醇(paclitaxel)联用，能显著增加癌细胞死亡率。在卵巢癌细胞中，较低浓度ACY241能选择性地抑制HDAC6，而高浓度导致Ⅰ类HDAC均被抑制，在体内具有较好的安全性。
目前没有关于HDAC6抑制剂类以及以上两种化合物在选择性促进记忆性干细胞样T细胞增殖中的相关报道。
具体而言，本发明包括以下内容。
1.诱导记忆性干细胞样T细胞增殖的方法，其包括使用HDAC6抑制剂处理包含或能够产生所述记忆性干细胞样T细胞的细胞群(如PBMC细胞、CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞)。
2.根据项1所述的方法，其中，所述HDAC6抑制剂为选自Tubastatin A TFA，Tubastatin A，Pracinostat(SB939)，UF010，SKLB-23bb，ACY-775， BRD73954，Citarinostat(化合物ACY-241)，HPOB，MPI-5a，CG347B， Tubastatin A HCl，Tubacin，TH34，WT161，CAY10603，ACY-738，Tinostamustine(EDO-S101)，BG45，Nexturastat A，SR-4370，化合物 ACY-1215中的一种或多种，优选选自化合物ACY-1215、化合物ACY241。
3.根据项2所述的方法，其中化合物ACY241的浓度为0.001至10uM，优选为0.001至0.1uM，更优选为0.001至0.03uM，独立地，化合物 ACY-1215的浓度为0.001至10uM，优选0.001至0.1uM，更优选0.001 至0.01uM。
4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中所述记忆性干细胞样T细胞经过基因修饰，例如表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
5.根据项4所述的方法，其中所述记忆性干细胞样T细胞包括为 CD45RO+或CD45RO-，且为CCR7+的记忆性干细胞样T细胞。
6.根据项5中任一项所述的方法，其中所述记忆性干细胞样T细胞进一步表达以下表型标志物中的一个或多个：CD45RA+、CD95+、CD27+、 CD62L+、CD28+、CD127+、PD1-、TIM3-、CD122+、PDL1-、LAG3-、CD3+、 CD4+和CD8+。
7.根据项1～4中任一项所述的方法，其中所述细胞群选自外周血单核细胞PBMC、CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞。
8.根据项1所述的方法，包括使用细胞因子诱导记忆性干细胞样T细胞，所述细胞因子为以下一种或多种细胞因子的组合：IL2、IL21、IL7和 IL15，优选地，IL2的浓度为5至10000U/ml，IL7的浓度为0.1至100ng/ml， IL21的浓度为0.1至100ng/ml，IL15的浓度为0.1至100ng/ml。
9.根据项1所述的方法，包括使用细胞激活剂诱导扩增记忆性干细胞样T细胞，所述细胞激活剂为一个或多个包被抗CD3抗体和抗CD28抗体的磁珠。
10.HDAC6抑制剂在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途，包括利用 HDAC6抑制剂制备记忆性干细胞样T细胞，其中，所述HDAC6抑制剂为选自Tubastatin A TFA，TubastatinA，Pracinostat(SB939)，UF010， SKLB-23bb，ACY-775，BRD73954，Citarinostat(ACY-241)，HPOB，MPI-5a， CG347B，Tubastatin AHCl，Tubacin，TH34，WT161，CAY10603，ACY-738，Tinostamustine(EDO-S101)，BG45，Nexturastat A，ACY-1215和SR-4370 中的一种或多种，优选选自化合物ACY-1215、化合物ACY241。
在本申请中，所述ACY241的浓度可以为0.001-100uM的范围，例如，浓度可以为0.001-100uM、0.001-10uM、0.001-3uM、0.001-1uM、0.001 -0.5uM、0.001-0.3uM、0.001-0.1uM、0.001-0.05uM、0.001-0.03uM、0.001 -0.01uM。所述ACY-1215的浓度可以为0.001-100uM，例如，浓度可以为 0.001-100uM、0.001-10uM、0.001-3uM、0.001-1uM、0.001-0.5uM、0.001 -0.3uM、0.001-0.1uM、0.001-0.05uM、0.001-0.03uM、0.001-0.01uM。
在某些实施方式中，其还包括以下步骤：分离获得外周血单核细胞 PBMC、CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞。
在某些实施方式中，所述方法还包括：向上述分离的细胞例如PBMC 等加入一种或多种T细胞激活因子。所述T细胞激活因子包括：CD3抗体、CD28抗体、4-1BB抗体、CD80抗体、CD86抗体、PHA、PMA和/ 或离子霉素。这些因子可以以任何常用的形式，例如溶解在溶液中或固定在载体上的形式进行添加。具体的添加时机及频率例如为开始培养前后及培养中，例如为数天(例如1，2，3，4天)1次，只要能够实现本发明的效果即可，不限于此。
在某些实施方式中，所述方法还包括：向能够产生所述记忆性干细胞样T细胞的细胞群，例如经分离的所述PBMC加入一种或多种细胞因子；所述细胞因子包括选自下组的一种或多种：IL4、IL2、IL15、IL7、IL21、 IFN和TNF。同样地，这些细胞因子也可以以任何常用的形式，例如溶解在溶液中或固定在载体上的形式进行添加。具体的添加浓度及时机只要能够实现本发明的效果即可，不限于实施例给出的方式。
在某些实施方式中，所述方法还包括干细胞培养基；其中所述干细胞培养基包括选自下组的一种或多种：DMEM培养基、1640培养基、MEM 培养基、KBM-581培养基、AIM培养基、MACS培养基和X-VIVO培养基等常用于干细胞培养的培养基。
本发明的方法特别适用于CAR-T细胞，当用于CAR-T细胞(例如，本发明的分别表达GPC3-41BB-CAR、BCMA-41BB-CAR、CD19-41BB-CAR 的T细胞)时，CAR-T细胞的杀伤能力和CAR的表达稳定，基本不受影响。
附图说明
图1为加入不同浓度的化合物HDAC6抑制剂时T细胞增殖情况。
图2为HDAC6抑制剂提高TSCM细胞(T细胞)的细胞占比。A，共培养第7天的细胞占比，B为共培养第12天的细胞占比。
图3为HDAC6抑制剂对T细胞表型的影响示意图。A为以CCR7作为纵轴，CD45RO作为横轴的结果，B为以CD62L作为纵轴，CD8作为横轴的结果。
图4为加入HDAC6抑制剂后的CAR-T细胞参数。A为扩增倍数，B 为平均细胞直径，C为扩增倍数，D为平均细胞直径。
图5为HDAC6抑制剂促进TSCM细胞(CAR-T细胞)的形成。A为流式图，B为流式结果。
图6为HDAC6抑制剂对CAR-T细胞杀伤毒性的影响的细胞图。
图7为HDAC6抑制剂促进肿瘤细胞反复刺激后CAR-T细胞的增殖。 A为扩增倍数，B为平均细胞直径。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐述本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1构建用于制备CAR-T细胞的慢病毒载体
在本实施例中，制备了靶向GPC3、CD19、BCMA的CAR-T的细胞。具体为，首先人工合成了以下包含CAR结构的片段：
GPC3-41BB-CAR由前导序列(核苷酸如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示，在以下CAR中使用了相同的前导序列)、GPC3 ScFv(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应氨基酸序列如SEQ ID NO.7 所示)、CD8铰链区和跨膜区(核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)、41BB(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、CD3zeta(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)从5’端至3’端依次拼接构建而成。
CD19-41BB-CAR由前导序列(同上)、CD19 ScFv(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)、CD8铰链区和跨膜区 (核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、41BB(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、CD3zeta(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)从5’端至3’端依次拼接构建而成。
BCMA-41BB-CAR由前导序列(同上)、BCMA ScFv(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，对应氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)、CD8铰链区和跨膜区(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、41BB(核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示)、CD3zeta(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)从5’端至3’端依次拼接构建而成。
将这些人工片段构建到慢病毒载体(LV100A，System Biosciences公司) 中，随后依照其说明书记载的方式转染获得慢病毒，分别得到 GPC3-41BB-CAR、BCMA-41BB-CAR、CD19-41BB-CAR慢病毒。
实施例2通过慢病毒感染获得CAR-T细胞
通过Ficoll分离液分离新鲜人外周血，获得大于1×107的外周血单核淋巴细胞(PBMC)。用PBS稀释抗人CD3及抗人CD28抗体(上海近岸生物科技有限公司，使其终浓度达到1μg/ml。然后，向细胞培养皿中加入稀释后的抗体混合液，然后将其均匀铺至细胞培养皿中，于室温孵育2小时。 2小时后，用PBS洗涤一次抗体混合液。随后，将分离的PBMC用含有Xvivo15培养基、5％FBS、200U/ml IL2 T或Xvivo15培养基、5％FBS、 20ng/ml IL21、10ng/ml IL7的淋巴细胞培养液进行重悬，使其终浓度达到 1×106个细胞/ml，加入放置抗体混合液的培养皿中于37℃、5％CO2培养 24小时，以激活T细胞。
取一定量的T细胞培养液，加入终浓度为1mg/ml的synperonic F108 混匀，于水浴锅加热至37℃，配制为感染试剂。随后，准备实验所需细胞培养皿。先取1mg/ml抗人CD3抗体和0.5mg/ml抗人CD28抗体用PBS 缓冲液按1:1000的体积比稀释并混匀，然后用retronectin(重组人纤维连接片段，TAKARA公司，T100B，1mg/ml)试剂按1:40的体积比稀释并混匀，然后将其均匀铺至细胞培养皿中，于室温孵育2小时。2小时后，用PBS 进行洗涤，细胞培养皿准备完成。
用所配感染试剂稀释已激活的T细胞，每皿细胞密度为1*106/ml，并按MOI＝3的比例分别加入实施例1所制备的各种慢病毒并混匀。随后均匀铺在所述细胞培养皿中，进行慢病毒感染，从而获得了分别表达 GPC3-41BB-CAR、BCMA-41BB-CAR、CD19-41BB-CAR的T细胞。
感染后监测细胞密度，使这些感染后的细胞的密度维持在1×106个细胞/ml。14天后，观察到总细胞数的扩增在10-100倍的范围。
实施例3：不影响T细胞增殖的HDAC6抑制剂浓度。
将新鲜人外周血经Ficoll分离获得的外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)，PBMC细胞(5*105/ml)与CD3/CD28磁珠 (Dynabeads)、IL21(25ng/ml)、IL7(20ng/ml)以及不同浓度(3，1，0.5，0.3， 0.1，0.03，0.01uM)的化合物ACY-1215或ACY241共培养12天，每2天换新鲜培养基并补加化合物和细胞因子，并取细胞进行台盼蓝染色计数，检测T细胞增殖倍数，将实验结果示于图1。
结果显示，如图1所示，在两组中，与对照相比，T细胞的相对扩增倍数均随化合物浓度的降低而增加，显示T细胞增殖抑制的逐步减轻。尤其是在为0.1，0.03，0.01uM的低剂量时，化合物ACY-1215及ACY241 均对T细胞增殖不显示抑制。
实施例4：HDAC6抑制剂促进TSCM细胞(T细胞)的增殖。
在本实施例中，发明人对浓度进一步进行细化，使用了0.1，0.03，0.01， 0.003，0.001uM的抑制剂化合物进行了共培养。
将新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)，PBMC细胞(5*105/ml)与CD3/CD28磁珠 (Dynabeads)、IL21(25ng/ml)、IL7(20ng/ml)以及不同浓度(0.1，0.03，0.01， 0.003，0.001uM)的化合物ACY-1215或ACY241共培养12天，每2天换新鲜培养基并补加化合物和细胞因子。在第7天，第12天分别取细胞孵育，检测TSCM细胞的流式抗体(CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、 CD62L、CCR7、CD95、CD122、CD127、CD27、CD28、PD1、TIM3、 PDL1、LAG3，均为赛默飞公司)并用流式细胞仪(BD公司)检测。实验结果分别示于图2A，B。
结果显示，在0.01，0.003，0.001uM的浓度下，化合物ACY-1215及 ACY241均能够显著提升CD45RO-CCR7+CD62L+CD95+即TSCM细胞占 CD3细胞比例、以及CD45RO-CCR7+CD62L+CD95+即TSCM细胞占CD8 细胞比例。在0.003，0.001uM的浓度下，化合物ACY-1215及ACY241能够显著提升CD45RO-CCR7+ CD62L+ CD95+即TSCM细胞占CD4细胞的比例。
实施例5：HDAC6抑制剂化合物对T细胞表型的影响。
将新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)，PBMC细胞(5*105/ml)与CD3/CD28磁珠 (Dynabeads)、IL21(25ng/ml)、IL7(20ng/ml)以及0.01，0.003，0.001uM的化合物ACY-1215或ACY241共培养12天，每2天换新鲜培养基并补加化合物和细胞因子，第12天取细胞孵育检测TSCM细胞的流式抗体(CD3、 CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CD62L、CCR7、CD95、CD122、CD127、 CD27、CD28、PD1、TIM3、PDL1、LAG3，赛默飞公司)并用流式细胞仪(同上)检测。实验结果示于图3。A为以CCR7作为纵轴，CD45RO作为横轴的结果，B为以CD62L作为纵轴，CD8作为横轴的结果。
结果显示，关于HDAC6抑制剂化合物对T细胞表型的影响，在图3 中，在第一行的Q1象限中，对照为34.7％，0.01，0.003，0.001uM的化合物ACY-241组分别为45.8％，47.0％，57.1％；而0.01，0.003，0.001uM 的化合物ACY-1215组分别为52.5％，58.8％，55.2％。由此可知，与对照相比，在0.01，0.003，0.001uM的化合物ACY-1215及ACY241组中，为 CD45RO-CCR7+表型的T细胞的比例，即TSCM细胞的比例均显著提升。同时，与对照相比，各浓度的化合物ACY-1215及ACY241共培养后，CD8 和CD62L蛋白的表达稳定，表明对CD4/CD8表型无明显影响，能够持续维持归巢蛋白CD62L的高表达。
实施例6：化合物HDAC6抑制剂不影响CAR-T细胞增殖。
新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)，同实施例2地制备了CAR-T细胞 GPC3-41BB-CAR。将CAR-T细胞(GPC3-41BB-CAR,5*105/ml)与 CD3/CD28磁珠(Dynabeads)、IL21(25ng/ml)、IL7(20ng/ml)以及不同浓度 (0.5，0.1，0.05uM，示于图4A，B；或0.1，0.03，0.01uM，示于图4C，D)化合物ACY-1215或ACY241共培养12天，每2天换新鲜培养基并补加化合物和细胞因子,并在不同时间点取细胞进行台盼蓝染色计数，检测 CAR-T细胞增殖效果。实验结果示于图4，A5表示化合物ACY-1215，A1 表示化合物ACY241。
结果显示，在0.5，0.1，0.05uM化合物ACY-1215及ACY241组中，以上化合物对CAR-T细胞的增殖曲线与对照组没有显著差别，CAR-T细胞的平均细胞直径亦保持同样的趋势。在0.1，0.03，0.01uM化合物 ACY241及0.03，0.01uM化合物ACY-1215组中，与对照相比，CAR-T细胞的扩增曲线有极轻微的降低，几乎没有影响。0.1，0.03，0.01uM浓度下化合物ACY241及化合物ACY-1215对平均细胞直径亦几乎没有影响。
实施例7：化合物HDAC6抑制剂促进TSCM细胞(CAR-T细胞) 的增殖。
将新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)，制备CAR-T细胞(GPC3-41BB-CAR,5*105/ml) 与CD3/CD28磁珠(Dynabeads)、IL21(25ng/ml)、IL7(20ng/ml)以及0.1， 0.03，0.01uM化合物ACY-1215或化合物ACY241共培养12天，每2天换新鲜培养基并补加化合物和细胞因子，在第12天分别取细胞孵育检测 TSCM细胞的流式抗体，其中用于检测TSCM细胞特性的抗体使用了CD3、 CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CD62L、CCR7、CD95、CD122、CD127、 CD27、CD28、PD1、TIM3、PDL1、LAG3，用于检测上述CAR的流式抗体使用了靶向GPC3抗体(ACROBiosystems公司)并用流式细胞仪(同上)检测。实验结果示于图5，图5A中两种化合物浓度均为0.1uM，图5B 中从上到下分别以CAR，CD8，CD62L表达为横轴。
结果显示，如图5A所示，在化合物ACY-1215或ACY241组中，与对照组相比，在Q1象限中分布的CD45RO-CCR7+表型细胞比例升高(图 1)，表明化合物ACY-1215或ACY241均能够显著提升TSCM细胞 (CD45RO-CCR7+)比例，同时，与对照组相比，在Q6象限中分布的表达PDL1+LAG3+的细胞比例降低，表明化合物ACY-1215或ACY241降低了耗竭性蛋白PDL1，LAG3的表达。
如图5B所示，与对照组(84.2％)相比，与0.1，0.03，0.01uM化合物ACY-1215及ACY241共培养时细胞的CAR表达率稳定(例如，87.6％， 86.6％，90.6％)。在化合物0.1，0.03，0.01uM ACY-1215或ACY241组中， CD8蛋白表达稳定，流式图显示CD62L蛋白表达稳定。表明化合物 ACY-1215或ACY241不会对CAR-T细胞中CAR的表达造成显著影响。
实施例8：HDAC6抑制剂对CAR-T细胞杀伤毒性的影响。
新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)，将如实施例2地制备的CAR-T细胞 (GPC3-41BB-CAR,5*105/ml)与CD3/CD28磁珠(Dynabeads)、IL21(25 ng/ml)、IL7(20ng/ml)以及化合物ACY-1215(0.1uM)或ACY241(0.1uM) 共培养12天，在第7天，第12天分别取CAR-T细胞与Huh-7细胞(购自中科院细胞库)按细胞数1:1共孵育48h，显微镜拍照观察以及流式检测 CAR-T细胞对Huh-7细胞的杀伤效果，同时设置了仅Huh-7细胞(标记为 Huh-7组)和Huh-7细胞与普通T细胞共孵育(标记为Huh-7+T组)的对照组，将镜下照片示于图6，各组上方的图为与化合物共培养第7天的细胞，下方的图为共培养第12天的细胞。
结果显示：在Huh-7组与Huh-7+T组中，仍能够辨认出Huh-7细胞的形态，在化合物ACY-1215或ACY241处理组CAR-T细胞对Huh-7细胞均具有极高的杀伤效果，与对照组相似，可100％杀死Huh-7细胞。这是由于TSCM的体外细胞杀伤能力一般弱于终末期分化的细胞，试验表明化合物ACY-1215或ACY241处理对杀伤能力没有负面影响，不会造成细胞杀伤能力的损失。
实施例9：HDAC6抑制剂促进肿瘤细胞反复刺激后CAR-T细胞的增殖。
新鲜人外周血经Ficoll分离获得外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)，上述制备的CAR-T细胞(GPC3-41BB-CAR, 5*105/ml)与CD3/CD28磁珠(Dynabeads)、IL21(25ng/ml)、IL7(20ng/ml) 以及化合物ACY-1215(0.5，0.1，0.05uM)共培养12天，在第12天分别取CAR-T细胞与辐照(X-RAD细胞辐照仪，辐照剂量为30Gy)的Huh7细胞按细胞数1:1共培养，培养基为Xvivo15，每4天重新补加辐照的Huh7 细胞作为一次刺激，共刺激2次，每次用台盼蓝计数细胞增殖情况。
实验结果如图7所示，与对照组相比，化合物ACY-1215处理组在0.5， 0.1，0.05uM浓度下时，第8天CAR-T细胞的扩增倍数及趋势均高于对照组，CAR-T细胞的平均细胞直径亦保持同样的趋势。
综上所述，在使用HDAC6抑制剂处理包含或能够产生所述记忆性干细胞样细胞的细胞群时，无论是分离的PBMC还是经过基因编辑得到的 CAR-T细胞，在处理一段时间后，都能够显著提升TSCM细胞占T细胞比例，且对T细胞增殖效果没有显著的影响。
由于HDAC6抑制剂是在体内具有较好的安全性的试剂，因此可以期待HDAC6抑制剂在治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病或病毒感染疾病中的应用，尤其是CAR-T细胞中TSCM细胞比例的增加，可被用于对受试者进行个性化诊断和治疗等。
综上，本申请提供了诱导干细胞样细胞增殖的方法。该方法能够快速、简便和/或稳定地诱导干细胞样细胞增殖。本申请提供的方法可以在体外诱导记忆性干细胞样T细胞增殖。此外，本申请提供的方法能够被借鉴用以制备干细胞样细胞增殖诱导剂。本申请提供的方法还能够用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病或病毒感染疾病。此外，本申请的方法可被用于对受试者进行个性化诊断和治疗。例如，能用于诱导包含经T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)修饰的T细胞的记忆性干细胞样T细胞的增殖。
Claims (10)
1.诱导记忆性干细胞样T细胞增殖的方法，其包括使用HDAC6抑制剂处理包含或能够产生所述记忆性干细胞样T细胞的细胞群(如PBMC细胞、CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述HDAC6抑制剂为选自Tubastatin A TFA，Tubastatin A，Pracinostat(SB939)，UF010，SKLB-23bb，ACY-775，BRD73954，Citarinostat(化合物ACY-241)，HPOB，MPI-5a，CG347B，Tubastatin A HCl，Tubacin，TH34，WT161，CAY10603，ACY-738，Tinostamustine(EDO-S101)，BG45，Nexturastat A，SR-4370，化合物ACY-1215中的一种或多种，优选选自化合物ACY-1215、化合物ACY241。
3.根据权利要求2所述的方法，其中化合物ACY241的浓度为0.001至10uM，优选为0.001至0.1uM，更优选为0.001至0.03uM，独立地，化合物ACY-1215的浓度为0.001至10uM，优选0.001至0.1uM，更优选0.001至0.01uM。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中所述记忆性干细胞样T细胞经过基因修饰，例如表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述记忆性干细胞样T细胞包括为CD45RO+或CD45RO-，且为CCR7+的记忆性干细胞样T细胞。
6.根据权利要求5中任一项所述的方法，其中所述记忆性干细胞样T细胞进一步表达以下表型标志物中的一个或多个：CD45RA+、CD95+、CD27+、CD62L+、CD28+、CD127+、PD1-、TIM3-，CD122+、PDL1-、LAG3-、CD3+、CD4+和CD8+。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述细胞群选自外周血单核细胞PBMC、CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，包括使用细胞因子诱导记忆性干细胞样T细胞，所述细胞因子为以下一种或多种细胞因子的组合：IL2、IL21、IL7和IL15，优选地，IL2的浓度为5至10000U/ml，IL7的浓度为0.1至100ng/ml，IL21的浓度为0.1至100ng/ml，IL15的浓度为0.1至100ng/ml。
9.根据权利要求1所述的方法，包括使用细胞激活剂诱导扩增记忆性干细胞样T细胞，所述细胞激活剂为一个或多个包被抗CD3抗体和抗CD28抗体的磁珠。
10.HDAC6抑制剂在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途，包括利用HDAC6抑制剂制备记忆性干细胞样T细胞，其中，所述HDAC6抑制剂为选自Tubastatin A TFA，Tubastatin A，Pracinostat(SB939)，UF010，SKLB-23bb，ACY-775，BRD73954，Citarinostat(ACY-241)，HPOB，MPI-5a，CG347B，Tubastatin A HCl，Tubacin，TH34，WT161，CAY10603，ACY-738，Tinostamustine(EDO-S101)，BG45，Nexturastat A，ACY-1215和SR-4370中的一种或多种，优选选自化合物ACY-1215、化合物ACY241。
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