CN101166820A - 用于修复上皮和其它细胞及组织的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及哺乳动物血液干细胞优选CD34+/CD38－细胞的TVEMF扩增，还涉及来源于TVEMF扩增细胞的组合物，还涉及使用所述组合物治疗疾病或病症或者修复皮肤、口或耳组织的方法。

Description

用于修复上皮和其它细胞及组织的方法和组合物

发明领域

本发明涉及组织修复，更具体地讲是涉及使用在TVEMF生物反应器中制备的血液干细胞修复皮肤、口和内耳组织以及其它包含上皮细胞的组织，还涉及该制备方法、其组合物以及使用所述细胞或组合物治疗哺乳动物的方法。

发明背景

哺乳动物、尤其人类组织的再生长期以来一直是医学界的愿望。迄今为止，人体组织的修复大部分是依靠移植来自供体的相似组织来实现。组织移植基本上是以自Herrick双胞胎中一个到另一个的肾脏移植开始的，后来，南非医生Christian Barnard在1967年12月3日将Denise Darval的心脏移植给Louis Washkansky，这使得这一技术举世闻名，从此组织移植成为了用于延长晚期病人寿命的广泛接受的方法。

人体组织移植从其最初应用开始就遇到了重大问题，主要是由于身体的天然免疫系统而产生的组织排斥。这经常造成应用组织移植仅能延长非常有限的寿命(Washkansky手术后只活了18天)。

为了克服身体免疫系统的问题，很快开发出了许多抗排斥药(比如Imuran、环孢霉素)以抑制免疫系统并因此延长组织在排斥之前的应用。但是，排斥问题仍然产生了对组织移植替代方法的需求。

骨髓移植也已用于修复某些组织如骨髓，并且仍是治疗一些疾病如白血病的优选疗法，但是骨髓移植也存在问题。它需要供体匹配(能找到的情况低于50％)；它会引起疼痛，且昂贵并具有风险。因此，非常希望得到骨髓移植的替代方法。组织干细胞的移植比如在美国专利No.6,129,911中的肝脏干细胞移植也有类似的局限性，使得它们的广泛应用存在疑问。

近年来，研究人员使用多能性胚胎干细胞作为组织移植的替代方案进行了实验。使用胚胎干细胞所基于的理论是它们在理论上能够用于再生身体内几乎任何组织。然而，胚胎干细胞在组织再生上的应用也遇到了问题。在这些问题中较为严重的有，所移植的胚胎干细胞的可控性有限，它们有时生长成为肿瘤，并且可用于研究的人胚胎干细胞将受到患者免疫系统的排斥(Nature，June 17，2002：Pearson，“Stem Cell Hopes Double”，news@nature.com，publishedonline：21 June 2002)。另外，胚胎干细胞的广泛应用还负担了伦理、道德和政治因素，使得其广泛应用仍然存在疑问。

修复包含上皮细胞的组织是特别期望的。上皮细胞包含覆盖在哺乳动物整个身体表面(皮肤)上的上皮组织。甚至口腔的覆膜也包含上皮细胞，并与多种其它组织和细胞类型相互关联。这些细胞支持牙齿，帮助产生唾液或者有助于其它口腔功能。并且，一些上皮细胞特化成为感受器，比如内耳上皮毛细胞。皮肤、口和耳对于哺乳动物的存活和健康生活以及感觉感知是至关重要的。

因此，口和皮肤组织的修复和再生已经通过使用抗生素和其它产品的治疗来实现，其通过防止损伤部位感染来促进愈合，这些损伤对于口组织来说主要来自于手术。但是，这些方法不显著降低身体通过使用其自身修复系统修复组织所花费的时间。

听觉损伤在哺乳动物中通常是普遍的，是影响数百万人的严重残障。听觉损伤可由多种原因引起，包括感染、机械损伤、巨响、衰老以及化学品诱导的耳毒性，其损伤神经元和/或外周听觉系统的毛细胞。外周听觉系统由听觉感受器、柯蒂氏器中的毛细胞以及主要听觉神经元(耳蜗中的螺旋神经节神经元)组成。外周听觉系统的损伤是大部分听觉缺损的原因。

螺旋神经节神经元(“SGN”)是主要的传入听觉神经元，将信号从外周听觉感受器(柯蒂氏器中的毛细胞)通过耳蜗神经传递到脑。第八神经将螺旋神经节中的主要听觉神经元与脑干连接起来。第八神经还将前庭神经节神经元(“VGN”)与脑干连接起来，前庭神经节神经元是负责平衡的主要传入感觉神经元，并且将来自内耳椭圆囊、球囊和壶腹的信号传递到脑。螺旋神经节中主要传入神经元的破坏已被归结为听觉损伤的主要原因。

另外，沿着从外耳道到中枢神经系统的听觉通路中任何地方的损伤都可导致听觉丧失。听觉器官可分为外耳和中耳、内耳以及听觉神经和中枢听觉通路。尽管在物种之间有一些变化，但一般特征对所有哺乳动物来说都是共同的。听觉刺激通过外耳道、鼓膜和听骨链机械传递到内耳。中耳和乳突正常情况下充满空气。外耳和中耳疾病通常通过干扰这种机械传递而产生传导性听觉丧失。传导性听觉丧失的常见原因包括外耳道阻塞，例如可由外耳道闭锁或耵聍造成；鼓膜增厚或穿孔，例如可由外伤或感染造成；听骨链成员的固定或吸收；以及咽鼓管阻塞造成的中耳空间中积液。

听觉信息通过神经上皮细胞(毛细胞)和内耳中SGN的作用由机械信号转换成神经传导的电脉冲。所有SGN的中央纤维在脑桥脑干的耳蜗核中形成突触。来自耳蜗核的听觉投射是双侧性的(bilateral)，主要神经核位于下丘、丘脑的内侧膝状体以及颞叶的听觉皮层中。涉及听觉的神经元数量从耳蜗到听觉脑干和听觉皮层显著增加。所有听觉信息通过有限数量的毛细胞进行转换，其中数量较少的所谓内毛细胞是至关重要的，因为它们形成约90％主要听觉神经元的突触。比较而言，在耳蜗核的水平上，所涉及的神经元数目以十万计。因此，听外周(auditory periphery)中相对少量毛细胞的损伤即可导致显著的听觉丧失。因此，许多感觉神经丧失的原因都可归结为内耳损伤。这种类型的听觉丧失可以是渐进性的。另外，随着动物的衰老，由于耳解剖学的改变，听觉的敏锐性显著降低。

在胚胎发生过程中，前庭神经节、螺旋神经节以及听囊来源于相同的神经发生外胚层——听板。因此，前庭和听觉系统共有许多特征，包括毛细胞的外周神经元神经分布以及到脑干核的中心投射。这些系统都对于耳毒素敏感，耳毒素包含治疗性药物、抗肿瘤剂、食物或药物中的污染物以及环境和工业污染物。耳毒性药物包括广泛使用的化学治疗剂顺铂(cisplatin)及其类似物，普遍使用的氨基糖苷类抗生素例如用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染的庆大霉素，奎宁及其类似物，水杨酸盐及其类似物和袢利尿药。

这些药物对听觉细胞和螺旋神经节神经元的毒效应经常是其治疗有用性的限制因素。例如，抗菌性氨基糖苷类例如庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素等已知具有严重的毒性，尤其是耳毒性和肾毒性，所述毒性降低了这些抗微生物剂的有用性。氨基糖苷类抗生素一般用作广谱抗微生物剂，其有效针对例如革兰氏阳性、革兰氏阴性和抗酸性菌。敏感微生物包含埃希氏菌属(Escherichiaspp.)、嗜血杆菌属(Hemophilus spp.)、李斯特菌属(Listeria spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、肠杆菌属(Enterbacter spp.)、Lalmonella spp.、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、分枝杆菌属(Mycobacteria spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)和沙雷氏菌属(Serratia spp.)。尽管如此，但氨基糖苷类主要用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染，例如，与青霉素联合使用以实现协同效应。如该家族的通用名所指出，所有的氨基糖苷类抗生素都含有以糖苷连接的氨基糖。

中耳炎是用于描述中耳感染的术语，中耳感染是非常普遍的，尤其是在儿童中。就中耳感染而言，一般以例如应答或预防方式全身性施用抗生素。全身性施用抗生素以对抗中耳感染一般使在中耳中达到治疗水平的滞后时间延长，并且需要高初始剂量以达到这样的水平。这些缺陷使获得治疗水平的能力复杂化，并且可能妨碍将一些抗生素一起应用。全身性施用在感染达到晚期时经常是很有效的，但此时可能已经对中耳和内耳结构造成了永久性损伤。显然，耳毒性是抗生素施用的剂量限制性副作用。

例如，在60到120天中每天给予2克链霉素的患者中有近75％显示出某种前庭损伤，而在每天给予1克时，发生率降为25％(美国专利No.5,059,591)。观察到了听觉损伤：每天接受1克，持续时间超过一周的患者中，有4％到15％发生可测量的听觉丧失，其慢慢恶化，并且如果治疗继续可能导致完全的永久性耳聋。耳毒性也是顺铂的严重剂量限制性副作用，顺铂是一种铂配位络合物，已证明对多种人类癌症有效，包括睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、以及头和颈癌。顺铂损伤听觉和前庭系统。由于其抗炎、止痛、抗发热以及抗血栓效应，水杨酸类(例如阿司匹林)是最常用的的治疗性药物。不幸的是，它们具有耳毒性副作用。它们常引起耳鸣(“耳中的鸣响”)和暂时性听觉丧失。但是，如果所述药物在更长的时间中以高剂量使用，听觉损伤可能变成持久且不可逆的。因此，存在对于预防、降低或治疗内耳疾病和听觉损伤的发生率和/或严重性的手段的需求，所述听觉损伤涉及内耳组织尤其是内耳毛细胞以及任选的相关听觉神经。特别有意义的是作为耳毒性治疗药物的有害副作用出现的病症，所述耳毒性治疗药物包含顺铂及其类似物、氨基糖苷类抗生素、水杨酸盐及其类似物或袢利尿药。所需的是再生内耳毛细胞以恢复听觉的方法。本发明提供了实现这些目的和其它目的的方法。

干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞中发现。Verfaille，C.M.et al.，Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow.Nature 417，published online 20 June；doi：10.1038/nature00900，(2002)cited by Pearson，H.Stem cellhopes double.news@nature.com，published online：21 June 2002；doi：10.1038/news020617-11。

Boyse et al.，美国专利No.6,569,427 B1公开了低温保存以及低温保存的胎儿和新生儿血液可用于治疗或预防多种疾病与病症如贫血、恶性肿瘤、自身免疫病和多种免疫功能障碍及缺陷。Boyse还公开了使用异源基因序列的造血重建在基因治疗中的应用。但是，Boyse的公开缺乏用于治疗应用的细胞扩增。脐带血库CorCell提供了对脐带血干细胞扩增、低温保存和移植的统计。“Expansion ofUmbilical Cord Blood Stem Cells”，Information Sheet UmbilicalCord Blood，CorCell，Inc.(2003).一种扩增方法公开了使用一种生物反应器，所述生物反应器具有位于中央的基于胶原蛋白的基质。Research Center Julich：Blood Stem Cells from the Bioreactor.Pressrelease May 17，2001。

在本申请中，术语“外周血”指在哺乳动物中全身循环或已经循环的血。术语“外周血细胞”指可见于外周血中的细胞。

尽管成体干细胞可见于多种成熟组织，但其数量较少且更难以定位。

取自哺乳动物时，一般将外周血抽进一个或多个注射器中，所述注射器中优选含有抗凝血剂。脐带血优选在出生后以本领域公知的方式直接取得。可将所述血保存在注射器中或者转移到另一容器中。接着可将所述血分离成其各个部分：白细胞、红细胞和血浆。这在离心机(旋转血容器直至血分离的装置)中实现或通过沉降(将沉淀物注入血容器中以使血分离的过程)实现。其次，一旦血液被分离，红细胞(RBC)在底部，白细胞(WBC)在中间，血浆在顶部，则将白细胞移出用于保存。中间层也称为“血沉棕黄层”，含有目的血液干细胞；血的其它部分是不需要的。就一些库而言，这就将是它们处理的范围。但是，其它库会通过从WBC中移出单核细胞(在此情况下是白细胞的一个亚群)来继续处理血沉棕黄层。尽管不是所有人都赞同此方法，但其保存的较少，保存细胞所需的低温氮也较少。

处理血液的另一种方法是在分离器比如Cobe Spectra细胞分离器中对所有收集到的血进行一轮或多轮(优选三轮)连续的流式白细胞分离术。这一方法将具有一个细胞核的血细胞从其它血细胞中分离出来。干细胞是具有一个细胞核的组中的一部分。

优选地，从血液样品中移除红细胞。尽管人们可能具有相同的HLA型(是干细胞移植所需的)，但其也可能具有不同的血型。通过移除RBC可以使对干细胞移植的有害反应最小化。因此，通过除去RBC，干细胞样品更有可能与更多的人相容。RBC还可能在融化时破裂，释放出游离的血红蛋白。这种类型的血红蛋白可严重影响接受移植者的肾脏。另外，当RBC破裂时，干细胞的生存力降低。

同时，尤其是在低温保存血或将血转移至另一哺乳动物时，可以检测血以确保不存在传染病或遗传性疾病，比如HIV/AIDS、肝炎、白血病或免疫疾病。如果存在这些疾病，则可弃用所述血，或在指出未来使用者需要考虑的相关风险后使用。

因此，需要提供修复人体组织的方法和过程，其不基于器官移植、骨髓移植或者胚胎干细胞，而是提供不太可能引起免疫应答扩增的干细胞组合物，以在数天内应用。更优选地，需要提供再生内耳毛细胞以修复听觉的方法和过程；修复口组织的方法及其过程；以及修复皮肤组织的方法及其过程。本发明提供了实现这些目的及其它目的的方法和过程。

发明概述

本发明涉及修复、再生、补充上皮细胞或组织和/或皮肤、口和内耳的其他相关组织的方法。具体地，本发明针对修复以下组织的方法：受到损伤或擦伤的皮肤组织、接受口腔手术(优选牙龈手术)的口组织、受到听觉损伤(例如由于药物耳毒性、自然听觉丧失或巨响造成)的内耳组织。用于治疗患有皮肤、口和/或耳病症的哺乳动物(优选人)的本发明方法包括将治疗有效量的血来源的经扩增成体干细胞引入所述哺乳动物，所述经扩增干细胞每单位体积的细胞数量已被扩增为其来源血中每单位体积的细胞数量的至少七倍，其中TVEMF扩增的干细胞保持其三维几何结构(geometry)及其细胞-细胞支持(cell-to-cell support)和细胞-细胞几何结构(cell-to-cell geometry)。所述方法包括在足以允许人体系统利用所述血细胞有效修复受损组织的时间中进行这样的引入。

本发明还部分涉及来自哺乳动物优选人的血液干细胞，优选其中所述血液干细胞是TVEMF扩增的。本发明还涉及来自哺乳动物优选人的经TVEMF扩增的血液干细胞，其中所述血液干细胞在单位体积的数量上是其来源材料(例如TVEMF扩增之前干细胞的血来源)的至少7倍；并且其中血液干细胞具有与天然存在的(即来源的)血液中干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。本发明还涉及用于治疗皮肤、口或耳疾病的包含这些细胞的组合物，其按照需要添加其它成分，包括可药用载体、低温保存剂和细胞培养基。

本发明还涉及通过以下步骤制备用于治疗皮肤、口和耳疾病的干细胞和干细胞组合物的方法：将血混合物置于TVEMF生物反应器的培养室中，在TVEMF生物反应器中对血混合物施加TVEMF，以及TVEMF扩增血液干细胞以制备经TVEMF扩增的血液干细胞和干细胞组合物。优选地，施加在细胞上的TVEMF为约0.05高斯到约6.0高斯。本发明还涉及通过以下步骤低温保存所述经扩增干细胞的方法：将其温度降低至-120℃到-196℃并持续一年或更长，之后将温度升高到适于将所述细胞引入哺乳动物的温度。

本文也包含了本发明组合物用于治疗对这种治疗有需要的口、耳和/或皮肤，或者用于制备用于上述治疗的药剂的用途。

附图简述

附图中，

图1以示意图方式举例说明了生物反应器的培养载体流动回路(flowloop)的一个优选实施方案；

图2是本发明的TVEMF生物反应器的一个优选实施方案的侧视图；

图3是图2的TVEMF生物反应器的一个优选实施方案的侧面投影图；

图4是TVEMF生物反应器的一个优选实施方案的俯视截面图；

图5是TVEMF生物反应器的俯视横截面图；

图6是随时间变化电磁力装置的侧视图，该装置能容纳生物反应器并向生物反应器提供随时间变化的电磁力；

图7是图6所示装置的前视图；

图8是图6所示装置的前视图，进一步显示其中的生物反应器。

附图详述

用最简单的话来说，旋转式TVEMF生物反应器包含细胞培养腔室和随时间变化的电磁力源。在运行中，血混合物被置于细胞培养腔室中。细胞培养腔室旋转一段时间，在此期间，随时间变化电磁力源在腔室内产生随时间变化的电磁力。在该期间结束时，将TVEMF扩增的血混合物从腔室移出。在较复杂的TVEMF生物反应器系统中，随时间变化电磁力源可以集成到TVEMF生物反应器，如图2-5所示，但是也可与生物反应器相邻，如在图6-8中。另外，向细胞提供支持的流体载体如培养基或缓冲液(优选与下文讨论的加入血混合物的培养基相似)可以周期性更新和移出。本文描述优选的TVEMF生物反应器。

现在参看图1，其展示了在一个完整的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器培养系统中培养载体流程1的一个优选实施方案，所述生物反应器培养系统带有细胞培养腔室19，优选旋转式细胞培养腔室，充氧器21，辅助培养载体定向流动的装置，优选通过使用主泵15，以及供应多支管17，其选择性输入这种培养载体需求，例如但不限于营养物3、缓冲剂5、新鲜培养基7、细胞因子9、生长因子11以及激素13。在此优选实施方案中，主泵15提供新鲜流体载体到充氧器21，流体载体在此被充入氧气并且通过细胞培养腔室19。来自细胞培养腔室19的已使用流体载体中的废物被移去并传送到废物18，剩下的细胞培养载体返回到多支管17，必要时它在此接受新鲜补充，之后使用泵15通过充氧器21循环到细胞培养腔室19。

在培养载体流程1中，培养载体通过腔室19中的活细胞培养物并且围绕如图1所示的培养载体流动回路1循环。在此回路1中，根据化学传感器(未显示)进行调节，以维持细胞培养反应器腔室19中的恒定条件。控制二氧化碳压力并引入酸或碱以校正pH值。氧气、氮气和二氧化碳溶解在气体交换系统(未显示)中，以支持细胞呼吸。闭合回路1添加氧气，并从循环气体容量中移去二氧化碳。尽管图1是可用于本发明的培养载体流动回路的一个优选实施方案，但是本发明并不限于此。可以手动、自动或者通过其他控制手段向生物反应器输入培养载体例如但不限于氧气、营养物、缓冲剂、新鲜培养基、细胞因子、生长因子和激素，比如可以类似于废物和二氧化碳的控制和移除。

图2和3展示了带有集成的随时间变化电磁力源的TVEMF生物反应器10的一个优选实施方案。图4是以优选方式用于本发明的一种旋转式TVEMF生物反应器10的横截面图。图4的TVEMF生物反应器10举例说明带有集成的随时间变化电磁力源。图5也举例说明带有集成的随时间变化电磁力源的TVEMF生物反应器的一个优选实施方案。图6-8显示带有相邻的随时间变化电磁力源的旋转式生物反应器。

现在转到图2，图2展示的是本发明的TVEMF生物反应器10的一个优选实施方案的侧视图。图2包含由基座112支撑的马达外罩111。马达113位于马达外罩111内部，且通过第一线114和第二线115连接至其内带有控制装置的控制盒116，由此通过转动控制钮117可对马达113的转速进行增量控制。马达外罩111内部设置有马达113，使得马达轴118纵向穿过外罩111延伸，且马达轴118是径向的，使得轴118的中心与在径向腔室119位置的地球平面平行，优选地用包括但不限于塑料的透明材料制成。

在此优选实施方案中，径向腔室119连接到轴118使得腔室119围绕径向轴旋转，而径向轴与水平面平行。腔室119被线圈120所缠绕。线圈120的尺寸和缠绕圈数使得，当优选为0.1mA到1000mA的方波电流供应在线圈120上时，在腔室119内产生优选为0.05高斯到6高斯的随时间变化的电磁力。线圈120在轴118的末端通过线123和124连接至第一环121和第二环122。然后，环121和122与第一电磁传送线125和第二电磁传送线128相接触，使得腔室119可以旋转同时电流恒定地供应到线圈120上。电磁发生装置126与线125、128相连接。通过旋转电磁发生装置钮127调节其输出，从而使得电磁发生装置126提供方波到线125、128和线圈120上。

图3是可用于本发明中的图2所示TVEMF生物反应器10的侧面投影图。

现在转到图4展示的带有培养腔室230的旋转式TVEMF生物反应器10，该腔室优选是透明的，并且适于在其中含有血混合物，另外包含外壳220，其包括第一290和第二291圆柱形横向末端帽构件，该构件与第一228和第二229末端表面相对，末端表面设置成安装内部圆柱管状玻璃构件293和外部管状玻璃构件294。提供合适的压力密封。在内部293与外部294管状构件之间是环形线加热器296，其用于获得细胞生长的合适的培养温度。所述线加热器296也可用作随时间变化的电磁力装置，用以给培养腔室230提供随时间变化的电场，或者，如图5所述，独立的线圈144可用于提供随时间变化的电磁力。第一末端帽构件290和第二末端帽构件291具有内部弯曲表面，其与末端表面228、229相邻，以促进腔室230内的混合物流动更平滑。第一末端帽构件290和第二末端帽构件291分别具有第一中央流体传递轴颈构件292和第二中央流体传递轴颈构件295，其分别旋转式安装在输入轴223和输出轴225上。每个传递轴颈构件294、295具有凸缘以承载在末端帽构件290、291中的凹陷沉孔中，并且其上附着第一锁紧垫圈环297和第二锁紧垫圈环298以防止相对于轴223、225的径向运动。每个轴颈构件294、295具有中间环形凹陷，其与径向扩展的、沿圆周布置的通道相连。轴颈构件292、295上的每个环形凹陷通过末端帽构件290和291中的第一放射状设置通道278和第二放射状设置通道279分别与第一输入偶合件203和第二输入偶合件204相偶合。放射状通道278或279中的载体流动通过轴颈构件294或295中的第一环形凹陷和径向通道，以允许载体通过轴颈构件292、295进入到达轴颈292、295的每个末端，在此其进入围绕轴223、225。

附着在末端帽构件290和291的是包含滚珠轴承的第一管状轴承支架205和第二管状轴承支架206，该滚珠轴承相对地支撑输入轴223和输出轴225上的外部支架220。第一轴承支架205具有附着的第一链轮210，其用于为外部支架220提供旋转驱动，其旋转方向围绕输入轴223和输出轴225以及径向轴221。第一轴承支架205和第二轴承支架206也具备从线加热器296和任何其它传感器向外供电的功能。

内部滤器装置235包括内部管状组件215和外部管状组件216，其沿它们的长度方向具有孔或洞，该装置有带孔的第一217和第二218内部滤器装置末端帽组件。内部管状组件215构建成两部分，其两部分带有互锁的位于中央的偶合部分，其每一部分分别附着于末端帽217或218。外部管状组件216设置在第一217和第二内部滤器装置末端帽组件之间。

所述末端帽组件217、218分别被旋转式支持在输入轴223和输出轴225之上。内部组件215通过钉和中央定位的(interfitting)凹槽219旋转式附着至输出轴225。十微米织法的聚酯布224布置在外部组件216的外表面之上，并且附着在任一末端的O环。因为内部组件215被偶合钉附着在输出驱动轴225上的槽，所以输出驱动轴225可旋转内部组件215。所述内部组件215与第一217和第二218末端帽相偶合，所述帽支持外部组件216。输出轴225延伸通过第一静止支架240中的轴承，并与第一链轮241相偶合。如举例所示，输出轴225具有管状孔222，其从位于密封之间的第一静止支架240中的第一端口或通道289延伸至内部组件215，使得流体载体的流动可从内部组件215中通过静止支架240而退出。

内部组件235的第一217和第二218末端帽与外部支架220中的轴颈292、295之间是叶片组件50a和50b的第一227和第二226毂。在输入轴223上的第二毂226通过钉231偶合至输入轴223，使得第二毂226随输入轴223旋转。每个毂227、226具有轴向延伸的通道，用于传送载体使之穿过毂。

输入轴223延伸穿过第二静止支架260中的轴承，该支架用于旋转式支持输入轴223。第二径向通道267延伸穿过输入轴223到保持垫圈和环的过渡位置，所述垫圈和环设置在面板与支架260之间的第二环状凹陷232中。第二末端帽组件291中的第三放射状通道272允许凹陷中流体载体从第二末端帽组件291中退出。尽管没有显示，第三通道272通过管线和Y型连接头连接至通道278和279的每个。

图4中显示样品端口，其中沿第一轴延伸的第一钻孔237与腔室230的角233相交，形成受限的开口234。该钻孔237在一端带有沉孔和带螺纹的环，以螺纹形容纳圆柱形阀组件236。阀组件236具有互补成形的顶端，以接合开口234并稍微突出到腔室230的内部。阀组件236上的O环243提供密封。沿第二轴的第二钻孔244与第一钻孔237相交在O环243与开口234之间的位置。弹性体或塑料阻塞物245封闭了第二钻孔244，并且可用皮下注射器进入用以取样品。为了取样品，阀组件236向后移，以使得开口234和钻孔244可以进入。然后可使用注射器提取样品，开口234可被重新封闭。没有外部污染到达TVEMF生物反应器10的内部。

在运行中，载体输入到第二端口或通道266，而后到轴通道，由此通过第三放射状通道272到达第一放射状设置的通道278和第二放射状设置的通道279。当载体通过轴颈292、294中的径向通道进入腔室230时，载体撞击在毂227、226的末端表面228、229上，并放射状以及轴向分散而通过毂227、226中的通道。通过毂227、226的载体撞击在末端帽组件217、218上，并且放射状分散开来。进入流体载体的液流因此放射状向外离开径向轴221，并以螺旋管形式流动，通过聚酯布224以及滤器装置235中的开口从每个末端退出，以经过通道266和289退出。通过控制外部支架220、腔室230和内部滤器装置235的旋转速度和旋转方向，可获得任何期望类型的载体动作。然而，很重要的是可以在连续供应新鲜流体载体的同时获得回转器操作这一事实。

如果不使用集成式环形线加热器296施加随时间变化的电磁力，可通过另一个优选的随时间变化电磁力源进行施加。例如，图6-8举例说明了随时间变化电磁力设备140，其提供电磁力给生物反应器中的细胞培养物，所述生物反应器不带有集成式随时间变化电磁力、而是带有相邻的随时间变化电磁力装置。具体地，图6是随时间变化电磁力装置140的一个优选实施方案。图6是装置140的侧面投影图，其中包含支持基座145，支持在基座145之上的圆柱体线圈支持物146，其中线圈147围绕支持物146缠绕。图7是图6中举例说明的随时间变化电磁力装置140的前投影图。图8是随时间变化电磁力装置140的前投影图，其举例说明在运行中整个生物反应器148放入圆柱体线圈支持物146中，该支持物146由支持基座145所支持并由线圈147所缠绕。因为随时间变化电磁力装置140邻近生物反应器148，随时间变化电磁力装置140可重复使用。另外，因为随时间变化电磁力装置140邻近生物反应器148，装置140可用于在所有类型的生物反应器中产生电磁力，优选旋转型。

运行中，在TVEMF扩增期间，本发明的TVEMF生物反应器10在细胞培养腔室中包含血混合物。在TVEMF扩增期间，可以评估并调节含有血混合物的腔室的旋转速度，以使得血混合物基本上保持在径向轴处或者在径向轴周围。确保提高转速以防止与壁撞击。例如，如果血混合物中的血液干细胞在旋转循环的向下侧时过分向内向下落以及在旋转循环的向上侧时过分向外并且不充分向上，则优选提高转速。最优情况下，建议用户优选地选择旋转速率以使得壁碰撞频率和强度尽可能小，从而维持血液干细胞的三维几何结构以及它们的细胞-细胞支持和细胞-细胞几何结构。本发明优选的速率是从5到120RPM，更优选从10到30RPM。

血混合物可优选地通过优选为透明的培养腔室视觉上评价，并手动调节。血混合物的评价和调节也可通过传感器(例如，激光)自动进行，该传感器监测血液干细胞在TVEMF生物反应器10中的位置。指示过多细胞运动的传感器读数将自动引起相应调节转速的机制。

另外，在运行中，本发明预期电磁发生装置被打开并调节，使得方波输出在含有血混合物的腔室中产生期望的电磁场，优选在0.05高斯到6高斯的范围。

优选地，所述方波具有约2到约25周/秒的频率，更优选约5到约20周/秒，例如约10周/秒，并且导体的RMS值为约1到1000mA，优选1到6mA。但是，这些参数并不意在限制本发明的TVEMF，因为它们可基于本发明的其它方面而变化。例如，可通过标准设备比如EN131Cell Sensor Gauss Meter测量TVEMF。

按照本发明所预期，在不偏离本发明范围的情况下，可对受到随时间变化电磁力的旋转式生物反应器作出多种改变，因此上文描述中所含的所有内容应该被理解为举例说明，而不是限制。

本发明优选实施方案详述

本发明涉及修复、补充和再生人体皮肤、口和耳组织特别是其中的上皮组织的方法。

本发明可通过下文所述优选实施方案更完整的进行描述，但并不仅限于此。

在本发明的优选实施方案中描述了制备成体干细胞的方法，所述干细胞可协助身体修复、替换和再生组织，尤其是皮肤、口和耳组织，尤其是其中的上皮组织。从患者体内移出血细胞。这些细胞的亚群目前称为成体干细胞。将所述血细胞置于如本文所述的生物反应器中。所述生物反应器容器以一定速度旋转，使得血细胞悬浮以维持其三维几何结构及其细胞-细胞支持和几何结构。在所述细胞在所述反应器中的时间内，可以对其提供营养物，使其暴露于激素、细胞因子或生长因子，和/或进行遗传修饰，并且优选除去有毒物质。通常所除去的有毒物质是来自血细胞，其包括死亡细胞的有毒颗粒物以及颗粒细胞和巨嗜细胞的有毒物质。扩增这些细胞的亚群，产生大量细胞。所述细胞的扩增是受控的，使得这些细胞在足够的时间里(优选在七天内)扩增至少七倍。接着所述细胞优选静脉注射，但也可直接注射进需要修复的组织中或者与其紧邻部位，使身体的天然系统修复和再生组织。

下文的定义意在辅助描述和理解本发明内容中所定义的术语。这些定义并不意味将这些术语限制在少于通过本申请所描述的内容。另外，关于TVEMF包括几种定义，在此方面的所有定义应被理解为互相补充，而不应理解为互相抵触。

本申请全篇中使用的术语“成体干细胞”指多能性细胞，其是未分化的且能产生多种分化细胞。在本发明中，成体干细胞优选CD34+/CD38-。成体干细胞也称为体细胞干细胞(somatic stemcells)，并且不是直接来源于胚胎的胚胎干细胞。

本申请全篇中使用的术语“血”指哺乳动物中成体干细胞的两种主要来源：外周血或脐带血。“外周血”是全身性血，即哺乳动物中全身性循环的或者已循环的血。所述哺乳动物不指胎儿。就本发明目的而言，没有理由区分位于相同循环回路中不同部分的外周血。术语“脐带血”指来自胎儿或婴儿的脐带和/或胎盘的血。脐带血是已知最丰富的干细胞来源之一。术语“脐带”不以任何方式将本发明的术语“脐带血”限制在来自脐带的血；胎儿或婴儿胎盘的血与脐带的血是混合的。就本发明目的而言，没有理由区分位于相同循环回路中不同部分的血。一般可以在婴儿出生后立刻收集50-100ml脐带血。优选地，所有这些血均可用于本发明的治疗方法。

本申请全篇中使用的术语“血细胞”指来自血的细胞；“外周血细胞”指来自外周血的细胞；“脐带血细胞”指来自脐带血的细胞。能够复制的血细胞可经过TVEMF生物反应器中的TVEMF扩增，并可存在于本发明的组合物中。

本申请全篇中使用的术语“血液干细胞”指来自血的成体干细胞。血液干细胞是成体干细胞，其如上文所述也称为体细胞干细胞，而不是直接来源于胚胎的胚胎干细胞。优选地，本发明的血液干细胞是CD34+/CD38-细胞。

本申请全篇中使用的术语“血液干细胞组合物”或其提法指本发明的血液干细胞，所述血液干细胞(1)其每单位体积数量是天然存在血液来源的至少7倍，并且具有与自然存在的血液干细胞相同或非常相似的三维几何结构和细胞-细胞几何结构和细胞-细胞支持，和/或(2)已经过TVEMF扩增，并保持了上述的三维几何结构和支持。本发明血液干细胞组合物中的血液干细胞与某种载体在一起，所述载体可以是可药用载体、血浆、血、白蛋白、细胞培养基、生长因子、铜螯合剂、激素、缓冲剂、低温保存剂或某种其它物质。涉及天然存在的血时，优选将本发明的血液干细胞与其原始的血(即外周血、脐带血、混合外周血与脐带血或其它血)来源相比。但是，如果这一比较不可用，则天然存在的血可指这些血的平均或典型特征(优选相同的哺乳动物物种)作为本发明血液干细胞的来源。

本发明的“血液干细胞药物组合物”是适于对哺乳动物优选人施用的血液干细胞组合物。这样的组合物包含治疗有效量的经扩增(优选TVEMF扩增)血液干细胞以及可药用载体。经扩增的血液干细胞的治疗有效量(本文其它部分也有讨论)优选为至少1000个干细胞，更优选至少10⁴个干细胞，还更优选至少10⁵个干细胞，更优选至少10⁷到10⁹个干细胞或甚至更多的干细胞，比如10¹²个干细胞。这些数量的经扩增干细胞可以以一次或多次剂量施用。如本申请全篇中所指出，施用于患者的干细胞的数量可能受限于根据本发明扩增增殖的来源血中原始可用的干细胞数量。不限于理论地，相信在施用之后未被身体利用的干细胞将简单的通过天然身体系统除去。

本申请全篇中使用的术语“血混合物”指血/血细胞与辅助所述细胞扩增的物质的混合物，该物质比如用于细胞生长的培养基，该物质将放置于TVEMF生物反应器中(比如在细胞培养腔室中)。所述“血混合物”血细胞可简单地通过将全血与诸如细胞培养基之类的物质混合而存在于血混合物中。血混合物也可由本申请全篇中所述含有血液干细胞的来自血的细胞制备物(如“血沉棕黄层”)制成。优选地，血混合物包含CD34+/CD38-血液干细胞以及Dulbecco’s培养基(DMEM)。优选地，约一半的血混合物是细胞培养基如DMEM。

本申请全篇中使用的术语“TVEMF”指“随时间变化的电磁力(Time Varying Electromagnetic Force)”。如上文所讨论的，本发明的TVEMF是方波(遵循傅立叶曲线)。优选地，方波频率为约10周/秒，导体RMS值为约1到1000mA，优选1到6mA。但是，这些参数并不意在限制本发明的TVEMF，因为这些可根据本发明的其它方面而变化。例如，可通过标准设备比如EN131Cell SensorGauss Meter进行测量TVEMF。

本申请全篇中使用的术语“TVEMF生物反应器”指施加TVEMF的旋转式生物反应器，如上文附图说明中所更详细描述的。施加到生物反应器上的TVEMF优选为0.05到6.0高斯，优选0.05-0.5高斯。参阅如图2、3、4和5，作为TVEMF生物反应器的实例(不意味着限制)。在一个简单的实施方案中，本发明的TVEMF生物反应器使得封闭的血混合物在适当的高斯水平下(根据施加的TVEMF)旋转，并允许其中的血细胞(包括干细胞)扩增。优选地，TVEMF生物反应器允许交换生长培养基(优选带有添加剂)并允许对血混合物充氧气。所述TVEMF生物反应器提供用于细胞生长数天或更多的机制。不限于任何理论地，所述TVEMF生物反应器使得反应器中的细胞受到TVEMF，以使TVEMF穿过细胞或接触细胞，从而使细胞经历TVEMF扩增。在TVEMF扩增过程中，TVEMF生物反应器优选以5到120rpm、更优选10到30rpm的速率旋转，以使壁碰撞频率和强度尽可能小，从而维持血流细胞的三维几何结构以及细胞-细胞支持和细胞-细胞几何结构。

本申请全篇中使用的术语“TVEMF扩增的血细胞”指在置于TVEMF生物反应器中并受到约0.05至6.0高斯的TVEMF之后每单位体积数量增加的血细胞。每单位体积数量上的增加是细胞在TVEMF生物反应器中复制的结果，使得生物反应器中细胞总数增加。每单位体积中细胞数量增加明确地不是因为流体体积的简单减少，例如，血液体积从70ml减少到10ml从而每ml细胞的数量增加。

本申请全篇中使用的术语“TVEMF扩增的血液干细胞”指在置于TVEMF生物反应器并受到约0.05至6.0高斯的TVEMF之后每单位体积数量增加的血液干细胞。每单位体积干细胞数量上的增加是细胞在TVEMF生物反应器中复制的结果，使得生物反应器中干细胞总数增加。每单位体积中干细胞数量的增加明确地不是因为流体体积的简单减少，例如，血液体积从70ml减少到10ml从而每ml干细胞的数量增加。

本申请全篇中使用的术语“TVEMF扩增”(TVEMF-expanding)指在TVEMF(旋转)反应器中在TVEMF存在下TVEMF反应器中细胞进行复制(分裂并生长)的步骤。血液干细胞(优选CD34+/CD38-干细胞)优选复制且不经历进一步分化，使得所有或基本上所有根据本发明扩增的CD34+/CD38-干细胞在其处于生物反应器中的时间内进行复制而不发生分化。“基本上所有”意在指至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、再优选至少95％、再优选至少97％、最优选至少99％的CD34+/CD38-细胞不因为发生分化而使其在TVEMF扩增过程中不再是CD34+/CD38-。

本申请全篇中使用的术语“TVEMF扩增”指通过让细胞受到约0.05到约6.0高斯的TVEMF而使TVEMF生物反应器中的血细胞(优选血液干细胞)数量增加的过程。优选地，血液干细胞数量的增加在每单位体积的数量上是原始血来源的至少7倍。根据本发明的TVEMF生物反应器中的血液干细胞的扩增提供了维持或具有与TVEMF扩增前血液干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构的血液干细胞。TVEMF扩增的其它方面也可提供本发明的血液干细胞的异乎寻常的特征。不限于理论地，TVEMF扩增不只提供高浓度的维持三维几何结构和细胞-细胞支持以及几何结构的脐带血干细胞。不限于理论地，TVEMF可以在TVEMF扩增期间影响干细胞的一些特性，例如上调促进生长的基因，或者下调阻止生长的基因。总之，TVEMF扩增使得促进血液干细胞生长而不发生分化。

本申请全篇中使用的术语“TVEMF扩增的细胞”指经历了TVEMF扩增过程的细胞。

本申请全篇中使用了术语“修复”、“补充”和“再生”。这些术语并不意在彼此抵触，而是涉及总体的组织修复。

在本申请全篇中，提到修复皮肤、口或耳组织、治疗皮肤、口或耳疾病或病症等并不是排他性的，而是指组织修复的总体目标，其中组织中的改善源于施用本文讨论的干细胞。就这些组织而言，补充和修复上皮细胞和组织是优选的，但是也可以进行其它形式的修复，比如修复与耳中听觉及听觉丧失相关的神经，例如本发明中可存在皮肤和口中的结缔组织和/或神经组织。尽管本发明部分涉及有症状、可能危及生命的疾病或病症，但是本发明也意在包括对较小修复的治疗，甚至是在哺乳动物(优选人)健康上的症状或问题被注意到之前，通过早期引入扩增的干细胞对这些疾病/病症进行防止/预防。

本申请全篇中使用的术语“有毒物质”或者相关术语可指对细胞(优选血液干细胞)或者对患者有毒性的物质。具体地，术语有毒物质指死细胞、巨噬细胞以及可以是血中特有的或不常见的物质(如外周血中的镰刀状细胞、脐带血中的母体尿或废物或者其它组织或废物)。其它有毒物质在本申请中有所讨论。从血液中除去这些物质是本领域中特别是将血制品引入患者的相关领域中公知的。

本申请全篇中使用的术语“骨髓采集术”指将针插入骨髓并抽取骨髓。这样的采集术是本领域公知的。

本申请全篇中使用的术语“自体”指供体(扩增之前血液干细胞的来源)和受体是同一哺乳动物的情况。本发明包括自体皮肤、口和耳组织的修复及补充。

本申请全篇中使用的术语“异体”指供体(扩增之前血液干细胞的来源)和受体不是同一哺乳动物的情况。本发明包括异体皮肤、口和耳组织的修复及补充。

本申请全篇中使用的术语“CD34+”指血细胞表面存在表面抗原(CD34)。在所有的发育状态下，CD34蛋白都存在于造血干细胞的表面。

本申请全篇中使用的术语“CD38-”指血细胞表面缺乏表面抗原(CD38)。CD38不存在于本发明干细胞的表面。

本申请全篇中使用的术语“细胞-细胞几何结构”指细胞的几何结构，包括细胞彼此之间相对的间距、距离和物理关系。例如，本发明的TVEMF扩增干细胞彼此保持与在体内相同的关系。所述扩增的细胞处于细胞之间自然间距的范围内，这与例如无法保持这种距离的二维扩增容器相反。

本申请全篇中使用的术语“细胞-细胞支持”指一个细胞对相邻细胞提供的支持。例如，在体内健康组织和细胞与其它细胞保持相互作用，例如化学的、激素的、神经的(可用/合适时)相互作用。在本发明中，这些相互作用维持在正常的功能参数范围内，例如，这意味着它们不会开始对其他细胞传送有毒或损伤信号(除非这是天然血环境中存在的)。

本申请全篇中使用的术语“三维几何结构”指细胞在三维状态下的几何结构(与其天然状态相同或非常近似)，这与例如在培养皿中培养的细胞的二维几何结构相反，在培养皿中所述细胞变得扁平和/或伸展。

对于上述三个定义中的每一个而言，涉及维持本发明干细胞的细胞-细胞支持和几何结构以及三维几何结构时，术语“基本相同”指本发明的TVEMF扩增细胞中提供正常的几何结构和支持，使得所述细胞不以例如失去功能、不能修复组织或者对其它细胞有毒或有害的方式发生改变。

为了更完整的描述耳的功能以及本发明提供的再生，给出如下定义：

本申请全篇中使用的术语“外耳”或相关术语包括耳廓、耳道和鼓膜外层。声音进入耳道。在鼓膜处，声能(气压的改变)转换成鼓膜运动的机械能。

本申请全篇中使用的术语“中耳”或相关术语作为阻抗匹配转换器(impedance-matching transformer)，匹配耳道中空气的阻抗与内耳外淋巴的阻抗。

本申请全篇中使用的术语“内耳”或相关术语提供转换成基底膜行波模式的机械能。最后的能量转换发生在这里。

本申请全篇中使用的术语“外毛细胞”或相关术语包括三排约12000个细胞。尽管它们比内毛细胞多很多，但是它们仅接收来自VIII神经听觉部分的神经纤维的神经分布中的约5％。这些细胞含有肌肉样纤维，其在受到刺激后收缩并微调基底膜对行波运动的反应。由于其反应受到调节，因此健康的内毛细胞将随着刺激发出响声。此“响声”提供了耳声发射(Otoacoustic Emissions)的声源。

本申请全篇中使用的术语“内毛细胞”或相关术语是一排约3500个细胞。这些细胞接收来自VII神经声音部分的神经纤维的神经分布中约95％。这些细胞主要负责产生人的听觉。丧失或损坏时，通常发生重度至完全的听觉丧失。

本申请全篇中使用的术语“内沟(inner sulcus)”或相关术语是内毛细胞的惰性支持细胞。

关于上文所定义术语或其它本申请全篇中所使用术语的其它表述不意味着受到上述定义的限制，而是可对这些定义作出贡献。在本申请全篇中提供了关于本发明多个方面的信息，这并不意味着只限制在它所包含的章节，而是意味着对从整体上理解本发明作出贡献。

本发明涉及提供快速可用的TVEMF扩增的血液干细胞来源，所述干细胞用于修复、补充和再生人的内耳、皮肤和口组织。本发明可通过如下文所描述的优选实施方案进行更完整的描述，但是并不意在仅限于此。

关于上文所定义术语或其它本申请全篇中所使用术语的其它表述不意味着受到上述定义的限制，而是可对这些定义作出贡献。在本申请全篇中提供了关于本发明多个方面的信息，这并不意味着只限制在它所包含的章节，而是意味着对从整体上理解本发明作出贡献。

操作方法-制备TVEMF扩增的血液干细胞组合物

在本发明的优选实施方案中描述了用于制备TVEMF扩增的血液干细胞的方法，所述干细胞可协助身体修复、替换和再生皮肤、口或耳组织和/或补充细胞如内耳上皮细胞，或者可用于皮肤、口或耳病症的研究或治疗。

在此优选方法中，血收集自哺乳动物，优选灵长类哺乳动物，更优选人，例如按照本申请全篇所述和按照本领域已知完成，优选如本领域公知地通过注射器完成。血液可在收集后立即扩增并使用，或以扩增或未扩增的形式低温保存备用。只以不威胁到受试者的量取血。优选地，收集约10到约500ml血；更优选约100-300ml，甚至更优选150-200ml。本发明的血收集不意味着限制，而是也可包括例如其它直接收集哺乳动物血的方法、合并来自一个或多个来源的血的方法、例如通过由商品或其它来源间接获得血的方法，包括例如来自“血库”的低温保存的外周血或脐带血或以其它方式保存的以备将来使用的血液。

当从哺乳动物直接收集时，一般将血抽入一个或多个注射器中，其中优选含有抗凝血剂。血可保存在注射器或者转移到其他容器中。接着可将血分离成其各个部分；白细胞、红细胞和血浆。这在离心机(旋转血液容器直至血分离的装置)中实现或者通过沉降(将沉淀物注入血液容器中以使血分离的过程)实现。其次，一旦血液被分离，红细胞(RBC)在底部，白细胞(WBC)在中间，血浆在顶部，则将白细胞移出用于保存。中间层也称为“血沉棕黄层”，含有目的血液干细胞；血的其它部分是不需要的。就一些库而言，这就将是它们处理的范围。但是，其它库会通过从WBC中移出单核细胞(在此情况下是白细胞的一个亚群)来继续处理血沉棕黄层。尽管不是所有人都赞同此方法，但其保存的较少，保存细胞所需的低温氮也较少。

分离血细胞的另一种方法是在分离器比如Cobe Spectra细胞分离器中对所有收集到的血进行一轮或多轮(优选三轮)连续的流式白细胞分离术。这一方法将具有一个细胞核的血细胞从其它血细胞中分离出来。干细胞是具有一个细胞核的组中的一部分。分离血细胞的其他方法是本领域已知的。

优选地，从血液样品中移除RBC。尽管人们可能具有相同的HLA型(是干细胞移植所需的)，但其也可能具有不同的血型。通过移除RBC可以使对干细胞移植的有害反应最小化。因此，通过除去RBC，干细胞样品更有可能与更多的人相容。RBC还可能在融化时破裂，释放出游离的血红蛋白。这种类型的血红蛋白可严重影响接受移植者的肾脏。另外，当RBC破裂时，干细胞的生存力降低。

同时，尤其是在低温保存血或将血转移至另一哺乳动物时，可以检测血以确保不存在传染病或遗传性疾病，比如HIV/AIDS、肝炎、白血病或免疫疾病。如果存在这些疾病，则可弃用所述血，或在指出未来使用者需要考虑的相关风险后使用。

在本发明的另一个实施方案中，血细胞可从供体获得。在收集之前，在3天中每12小时使用G-CSF(优选以0.3ng到5μg的量，更优选1ng/kg到100ng/kg，再优选5ng/kg到20ng/kg，再优选6ng/kg)处理供体，然后第四天处理一次。在优选方法中，还施用相似量的GM-CSF。其它替代方案是单独使用GM-CSF或其它生长因子分子、白介素。接着从供体收集血，其可以以血液混合物整体使用或者首先如本申请全篇中所讨论地分离成细胞组分，其中包括干细胞(CD34+/CD38-)的细胞部分用于制备待扩增的血液混合物。细胞可被分离，例如，通过分离器如Cobe Spectra细胞分离器使供体的总血液体积进行3轮连续的流式白细胞分离术。优选地，将扩增的干细胞再引入同一供体，该供体需要修复皮肤、口或耳，如本文所述。但是，也可应用异体引入，如本文所述。其它收集前施用(pre-collection administration)对于本领域技术人员来说是显而易见的。

优选地，从血中除去红细胞，并将包括血液干细胞的剩余细胞与合适培养基一起置于TVEMF生物反应器中(见“血混合物”)，如本文所述。在本发明更优选的实施方案中，置于TVEMF生物反应器中的细胞材料仅为上文所述的“血沉棕黄层”(其包括血液干细胞，如本文所述)。其它实施方案包括移除其他非干细胞以及血成分，以制备不同的血制备物。这些血制备物甚至可含有作为剩下的仅有血组分的CD34+/CD38-血液干细胞。除去血细胞中的非干细胞类型可通过负性分离技术(negative separation techniques)来实现，其比如但不限于沉降和分离。许多负性分离方法是本领域公知的。但是，正性选择技术也可使用，并且在本发明中是优选的。用于除去血中多种组分和正性选择CD34+/CD38-的方法是本领域中已知的，只要它们不裂解或者不可逆地损伤所需的血液干细胞就可以使用。例如，可应用对CD34+/CD38-有选择性的亲和方法。优选地，从血中制备如上文所述的“血沉棕黄层”，然后从“血沉棕黄层”中分离出其中的CD34+/CD38-细胞用于TVEMF扩增。

所收集的血或如上文所述的所需细胞部分必须置于TVEMF生物反应器中用于TVEMF扩增。如上文所讨论的，术语“血混合物”包括血(或者所需细胞部分，例如没有红细胞的血，或者优选从血中分离出的CD34+/CD38-血液干细胞)与允许这些细胞扩增的物质的混合物，这些物质比如用于细胞生长的培养基，其将置于TVEMF生物反应器中。细胞培养基、允许细胞生长和扩增的培养基是本领域公知的。优选地，允许细胞扩增的物质是细胞培养基，更优选是Dulbecco’s培养基。显然，细胞培养基的组分必须不杀死或损伤细胞。在TVEMF扩增之前或期间，其它组分也可添加到血混合物中。例如，可将血置于带有Dulbecco’s培养基的生物反应器中，并且另外添加5％(或者其它所需量，比如在约1％到10％的范围)人血清白蛋白。也可在将血置于生物反应器中之前，在生物反应器外部或内部在血中加入血混合物的其它添加物，包括但不限于生长因子、铜螯合剂、细胞因子、激素和其它可增强TVEMF扩增的物质。优选地，来自一名个体的血收集物的全部体积(优选人血的量为约10ml到约500ml，更优选约100ml到约300ml血，再优选约150ml到约200ml血)与细胞培养基如Dulbecco’s培养基(DMEM)混合，并且添加5％人血清白蛋白，以制备用于TVEMF扩增的血混合物。例如，对于50到100ml血样品，优选使用约25到约100mlDMEM/5％人血清白蛋白，使得血混合物的总体积在置于生物反应器时为约75到约200ml。作为一般规则，收集的血越多越好；如果从一个个体收集了超过100ml，则优选使用所有的这些血。在可获得更大体积的情况下，例如通过合并(来自相同或不同来源的)血，可以优选多于一个剂量。当合并血收集物并一起TVEMF扩增时，使用灌注式TVEMF生物反应器是特别有用的。

本发明的铜螯合剂可以是任何无毒铜螯合剂，优选为青霉胺或盐酸曲恩汀。更优选地，青霉胺是溶于DMSO中的D(-)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸(Sigma-Aldrich)，以约10ppm的量添加到血混合物中。从哺乳动物直接收集血时，也可对所述哺乳动物施用所述铜螯合剂。优选在从哺乳动物收集血之前一天以上、更优选两天以上进行这样的施用。铜螯合剂的目的是在TVEMF扩增之前降低血液中铜的量，无论是加入到血混合物或施用给血供体哺乳动物或者两者皆有。不限于理论地，相信可用铜量的减少可增强TVEMF扩增。

术语“置于TVEMF生物反应器中”没有限制性含义，血混合物可完全在生物反应器外部制成，然后再将混合物置于生物反应器中。血混合物也可全部在生物反应器内部混合。例如，可将血(或其细胞部分)置于生物反应器中并补充Dulbecco’s培养基和5％人血清白蛋白，所述培养基和血清白蛋白预先存在于生物反应器中、与血同时添加到生物反应器中或者在血之后添加到生物反应器中。

本发明的优选血混合物包含以下成分：分离自血样品的血沉棕黄层的CD34+/CD38-干细胞和Dulbecco’s培养基，含有CD34+/CD38-细胞的所述培养基总体积约为150-250ml，优选200ml。更优选地，血混合物中包含G-CSF(粒细胞集落刺激因子)。优选地，G-CSF的存在量足以增强血液干细胞的TVEMF扩增。更优选地，在TVEMF扩增之前血混合物中存在的G-CSF的量是约25到约200ng/ml混合物，更优选约50到约150ng/ml混合物，再优选是约100ng/ml。

TVEMF生物反应器容器(含有包括血液干细胞的血混合物)以一定速度旋转，该速度使得血液干细胞悬浮并维持其三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。优选地，旋转速度为5-120rpm，更优选10-30rpm。这些速度并不意在限制，旋转速度将至少部分取决于生物反应器的类型和细胞培养腔室的尺寸以及其中放置的样品。在细胞位于TVEMF生物反应器期间，优选对其供应营养物和新鲜培养基(DMEM和5％人血清白蛋白，见上文流体载体的讨论)，使其接触激素、细胞因子和/或生长因子(优选G-CSF)；并除去有毒物质。从TVEMF生物反应器中的血细胞中除去的有毒物质包括垂死细胞的有毒颗粒物质以及粒细胞和巨噬细胞的有毒物质。细胞的TVEMF扩增受到控制，使得细胞优选在足够量的时间内扩增(每单位体积的数量增加)至少七倍。优选地，血液干细胞(以及其它细胞，如果存在的话)经过至少4天的TVEMF扩增，优选约7到约14天，更优选约7到约10天，再优选约7天。TVEMF扩增可在TVEMF生物反应器中持续到长达160天。尽管TVEMF扩增甚至可长于160天，但此种长度的扩增不是本发明的优选实施方案。

优选地，TVEMF扩增在TVEMF生物反应器中以约26到约41℃的温度实施，更优选地，以37℃的温度实施。

监测正在经历TVEMF扩增的细胞的总体扩增的一个方法是通过视觉检查。血液干细胞一般为暗红色。优选地，用于形成血混合物的培养基的颜色为浅色或无色。一旦生物反应器开始旋转并且施加TVEMF，细胞优选聚集在生物反应器容器中央，培养基围绕在有颜色的细胞簇周围。通氧气和添加其它营养物通常不影响通过构建在生物反应器上的观察窗(一般是透明塑料的)观察细胞簇。簇的形成对于帮助干细胞保持它们的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构是重要的；如果所述簇分散且细胞开始接触到生物反应器容器的壁，则提高转速(手动或自动)使得中央的细胞簇可再次形成。在细胞簇形成后迅速测量可观察的细胞簇直径，其可与此后的簇直径做比较，以显示出TVEMF生物反应器中细胞大概的增长数。在TVEMF扩增期间细胞数量增加的测量也可以按照本领域已知用于常规生物反应器的许多方法进行。TVEMF生物反应器中也可包括自动传感器，以监测和测量簇尺寸的增加。

TVEMF扩增过程可被仔细监测，例如由实验室技术人员监测，其将检查细胞簇的形成以确保细胞在生物反应器中保持成簇状态，并且当细胞簇开始分散时将增加生物反应器的旋转。用于监测细胞簇和监测生物反应器内血混合物粘性的自动系统也可用于监测细胞簇。细胞簇粘性的改变在TVEMF扩增过程开始约两天后就可明显观察到，并且可在该时间附近增加TVEMF生物反应器的旋转速度。TVEMF生物反应器转速在TVEMF扩增过程中可以变化。优选地，旋转速度适时改变使得正在经历TVEMF扩增的细胞不与TVEMF生物反应器容器的侧面接触。

并且，在TVEMF扩增过程中，实验室技术人员可以例如一天一次、或每两天一次地人工(例如使用注射器)向生物反应器中加入新鲜培养基和优选的如上文所述其它所需添加剂如营养物和生长因子，并且抽出含有细胞废物和毒素的旧培养基。新鲜培养基和其它添加剂也可在TVEMF扩增期间自动泵入TVEMF生物反应器，废物则自动排出。

在置于TVEMF生物反应器并进行TVEMF扩增之后约7到约14天，血液干细胞可增加到它们初始数量的至少七倍。优选地，TVEMF扩增持续约7到10天，更优选约7天。因此不需要在TVEMF扩增期间进行干细胞数量的测量。如上文及本申请全篇中所述，本发明的TVEMF扩增的血液干细胞具有与天然存在的非TVEMF扩增的血液干细胞基本上相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

TVEMF扩增完成后，TVEMF生物反应器中的细胞物质包含本发明组合物中的本发明干细胞。对于其他应用，可从组合物中除去或加入多种物质。本发明的另一个实施方案涉及离体哺乳动物血液干细胞组合物，其功能为协助身体系统或组织修复、补充和再生组织，例如，本申请全篇中描述的组织。所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，优选其数量为原始血液来源中每单位体积血液干细胞数量的至少7倍。例如，优选地，如果X数量的血液干细胞以某体积置于TVEMF生物反应器中，那么TVEMF扩增后，TVEMF生物反应器中血液干细胞的数量将是至少7X(不包括扩增过程中移出的细胞)。尽管这种至少7倍的扩增并不是实行本发明所必需的，但是这种扩增对于治疗目的而言是特别优选的。比如，需要时，TVEMF扩增的细胞可以只是天然存在的血中血液干细胞数量的2倍。优选地，TVEMF扩增的细胞的范围为每单位体积天然存在的血中干细胞数量的约4倍到约25倍。本发明还涉及包含来自哺乳动物的血液干细胞的组合物，其中所述血液干细胞每单位体积的数量是来自哺乳动物的天然存在的血的至少7倍；并且其中所述血液干细胞具有与天然存在的血中的干细胞相同或相似或基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。本发明的组合物可包含可药用载体；包括但不限于血浆、血、白蛋白、细胞培养基、生长因子、铜螯合剂、激素、缓冲剂或低温保存剂。“可药用载体”指允许将所述干细胞导入哺乳动物(优选人)的试剂。这种载体可包括本文提及的物质，具体地，包括任何可用于输血的物质，例如血液、血浆、白蛋白，还包括盐水或缓冲液(优选补充了白蛋白的缓冲剂)，优选来自待引入所述组合物的哺乳动物。术语将组合物“引入”哺乳动物意在指向动物“施用”组合物。优选地，通过静脉内对哺乳动物施用本发明的干细胞。但是，如本领域公知地，也可应用其它施用形式。具体地，可应用例如直接注射到口或耳，或者口或耳附近的组织，或者对皮肤局部给药或例如皮下注射。甚至更优选地，这种注射还包含可接受量的G-CSF，例如以0.3ng到5μg的量，更优选1ng/kg到100ng/kg，更优选5ng/kg到20ng/kg，甚至更优选6ng/kg。施用干细胞可包含可药用载体，例如本领域的一般描述所述。待施用的本发明扩增干细胞的量为治疗有效量(下文也有讨论)，优选至少1000个干细胞，更优选至少10⁴个干细胞，更优选至少10⁵个干细胞，甚至更优选至少10⁷到10⁹个干细胞的量，或者甚至更多干细胞，比如10¹²个干细胞。可以以一次剂量或多次剂量施用这些数量的扩增干细胞。如本申请所述，施用于患者的干细胞数量可受限于通过本发明的扩增来增殖的来源血中原始可用的干细胞数量。不限于理论地，相信在施用之后未被身体利用的干细胞将简单地通过天然身体系统移除。“可用载体”通常指本发明血液干细胞可在其中存活的任何物质，即无论是TVEMF扩增之后、低温保存之前或之后、还是引入(施用)哺乳动物之前都对细胞没有毒性。这种载体是本领域公知的，并且可以包括多种物质，包括本申请全篇中就此目的描述的物质。例如，血浆、血、白蛋白、细胞培养基、缓冲剂和低温保存剂都是本发明的可用载体。期望的载体部分取决于期望的用途。

本领域已知的其它扩增方法(不使用TVEMF)不提供血液干细胞在数量至少是天然存在血的至少七倍的扩增并且同时还保持血液干细胞三维几何结构和细胞-细胞支持不变。TVEMF扩增的血液干细胞具有与所来源血相同或基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构，或保持其不变。所述组合物可包含TVEMF扩增的血液干细胞，优选地悬浮在Dulbecco’s培养基中或者准备用于低温保存的溶液中。所述组合物优选没有有毒颗粒物质，例如垂死细胞以及粒细胞和巨噬细胞的有毒物质或内容物。所述组合物可以是包含TVEMF扩增的血液干细胞的低温保存组合物，这是通过降低组合物到-120℃到-196℃的温度，并且保持低温保存组合物在此温度范围直到其用于治疗或其它应用。如下文所讨论地，优选在低温保存之前尽可能多的从组合物中除去有毒物质。

本发明的另一个实施方案涉及使用TVEMF扩增的血液干细胞药物组合物再生组织和/或细胞以修复皮肤、耳和口组织以及治疗相关病症的方法，所述血液干细胞组合物是经过低温保存的或者是刚刚完成TVEMF扩增的。可通过如静脉内注射或直接注射到待修复的组织来将细胞引入哺乳动物体内(优选人)，以允许身体的天然系统修复和再生组织。优选地，引入哺乳动物身体的组合物不含有毒物质以及可造成对所施用TVEMF扩增的血液干细胞有不利反应的其它物质。当治疗或研究需要个体血细胞，尤其是如果已经发生疾病并且需要无该疾病的细胞时，所述细胞可便利地用于所述治疗或研究。对于例如在生命后期发生听觉丧失的人来说，保存的扩增外周血或脐带血可能是有用的。

实施例1-TVEMF生物反应器中细胞的实际TVEMF扩增

收集外周血并如表1所示扩增外周血细胞，描述如下。

A)收集与维持细胞

如上文所述通过注射器从10个人类供体中收集人外周血(75ml；约0.75×10⁶个细胞/ml)，并悬浮在同样体积为约75ml的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(IMDM)(GIBCO，Grand Island，NY)中以制备血混合物，所述培养基中补充了20％的5％人白蛋白(HA)，100ng/ml重组人G-CSF(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)和100ng/ml重组人干细胞因子(SCF)(Amgen)。10个小的血样(每名供体一个)留作对照样品。将外周血混合物置于如本文图2和3所示的TVEMF生物反应器中。TVEMF扩增在37℃，6％CO₂及正常空气中O₂/N比例下进行。TVEMF生物反应器最初以10转/分钟(rpm)的速度旋转，然后如本申请所述按需要进行调节，以保持外周血细胞悬浮在生物反应器中。对生物反应器施加6mA随时间变化的电流。对外周血混合物施加的方波TVEMF约为0.5高斯。(频率：约10周/秒)。TVEMF生物反应器中外周血混合物中的培养基每一到两天进行更换/更新。在第10天，将细胞从TVEMF生物反应器中移出，用PBS洗涤并进行分析。结果示于表1。对照数据指没有进行扩增的人外周血样品；扩增样品指TVEMF扩增后的各个对照样品。

表1

对照1	细胞计数310,000	成活力  98％
			对照2	细胞计数330,000	成活力  100％
对照3	细胞计数320,000	成活力  98％
			对照4	细胞计数340,000	成活力  100％
对照5	细胞计数250,000	成活力  98％
			对照6	细胞计数360,000	成活力  100％
对照7	细胞计数300,000	成活力  98％
			对照8	细胞计数350,000	成活力  100％
对照9	细胞计数200,000	成活力  98％
			对照10	细胞计数350,000	成活力  100％
扩增样品1	细胞计数3,200,00对应CD34+增加：是	成活力98％
			扩增样品2	细胞计数3,550,000对应CD34+增加：是	成活力  98％
扩增样品3	细胞计数3,350,000对应CD34+增加：是	成活力  98％
			扩增样品4	细胞计数4,200,000对应CD34+增加：是	成活力  98％
扩增样品5	细胞计数3,100,000对应CD34+增加：是	成活力  98％
			扩增样品6	细胞计数3,950,000对应CD34+增加：是	成活力  98％
扩增样品7	细胞计数3,000,000对应CD34+增加：是	成活力  98％
			扩增样品8	细胞计数3,750，000对应CD34+增加：是	成活力  98％
扩增样品9	细胞计数3,000,000对应CD34+增加：是	成活力  98％
			扩增样品10	细胞计数4,000,000对应CD34+增加：是	成活力  98％

从表1中可以看出，与未扩增的对照相比，外周血细胞的TVEMF扩增使得其细胞数量在10天里增加了约10倍，CD34+细胞也有相应地增加。细胞生长的培养基每1-2天更换/更新一次。

B)分析TVEMF扩增的细胞

使用计数板(例如血细胞计数器之类的装置，其使用是通过将一定体积的对照细胞悬浮液或扩增样品置于特制的带有微网的显微镜载玻片上，并对样品中的细胞数进行计数)获得对照和扩增样品的总细胞计数。对照样品和TVEMF扩增10天后的扩增样品中的总细胞计数的结果在表1中显示。

如下测定表1中显示的相应CD34+的增加：使用人CD34选择试剂盒(EasySep阳性选择，StemCell Technologies)将扩增样品中的CD34+细胞与其它细胞分离开，并如上文所述使用计数板进行计数，然后使用FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson)进行确认。通过克隆发生测定对CFU-GEMM和CFU-GM进行计数。通过台盼兰排除测试测定细胞成活力(其中成活细胞是活细胞，非成活细胞是死细胞)。在所有扩增样品中，答案“是”表示CD34+细胞以与总细胞计数相应的量增加。

操作方法-修复口组织

从至少15位将要接受口腔手术(优选牙龈手术)的人类患者中提取外周血(优选约250ml)，并例如按以上实施例中所述进行TVEMF扩增。还制备来自每位供体的血浆。在10天的TVEMF扩增之后，将TVEMF扩增细胞从生物反应器中移出，并用含有5％人血清白蛋白的肝素化盐水洗涤，然后使用例如100微米尼龙筛或其它合适的过滤系统进行过滤，以除去细胞聚集体。有毒物质也将被除去。接着，如下文的讨论，所述细胞可分别与约1.0ml或约20ml各个供体的血浆混合，以制备血液干细胞药物组合物，用于将所有TVEMF扩增细胞自体引入到供体身体。(也可应用异体引入。)优选引入的干细胞数量在本申请中有所讨论，最优选在约1ml或约20ml的体积中有约10⁵到约10⁹个干细胞。

在5个已经接受了牙龈手术的供体中，包含1ml血浆和TVEMF扩增血液干细胞的血液干细胞组合物将直接注射进毗邻牙龈手术中受损组织的口组织。在另外5个供体中，包含20ml血浆和TVEMF扩增血液干细胞的血液干细胞组合物将注射进入供体的外周血流。

这些实验的预期结果是，口腔医生监测的复原时间将显著短于不进行细胞治疗的患者。

在上文所述条件下在动物模型上进行的实验也预期展示出使用本发明对口组织的修复，从而使所述修复的相关病症、疾病或目的在施用本发明的组合物后得到改善，所述展示是基于组织学或病理学分析，或者其它所需分析。

操作方法-修复皮肤组织

从至少15只兔中提取外周血(优选约50ml)，并例如按以上实施例中所述进行TVEMF扩增。还制备来自每只供体的血浆。在对约40ml所收集的血进行10天的TVEMF扩增之后，将TVEMF扩增细胞从生物反应器中移出，并用含有5％人血清白蛋白的肝素化盐水洗涤，然后使用例如100微米尼龙筛或其它合适的过滤系统进行过滤，以除去细胞聚集体。有毒物质也将被除去。

接着，将5个TVEMF扩增的组合物与市售的Neosporin(Warner-Lambert)混合(优选将所有细胞与约1ml到约100ml、优选约10ml到约50ml、在此情况下为约15ml的Neosporin混合)，以制备用于局部给药的血液干细胞药物组合物。每只兔有两块皮肤擦伤(即去掉皮肤层，刮擦，而不是深入的伤口)，两块相距接近，但是不互相接触。优选地，擦伤是(尽管本实施例涉及自体引入，但异体引入也可使用)。优选引入的干细胞的数量在本申请中有所讨论，最优选约10⁵到约10⁹个干细胞。将用于局部施用的药用组合物直接应用于一个擦伤；另一个应用纯Neosporin。

预期覆盖所述干细胞组合物的擦伤的愈合时间将为只覆盖纯Neosporin的一半以内。

在5个供体中，将如上文所描述进行洗涤的TVEMF扩增血液干细胞组合物重悬于5ml供体自身血浆中，以制备用于静脉注射的药物血液干细胞组合物。此组合物将直接注射进每个供体的外周血流中。在剩下的5个供体中，只把对照血浆与Neosporin混合，然后血浆注射进入供体的血流中。同样，在注射药物血液干细胞组合物的情况下，每只兔的两个擦伤之一用Neosporin覆盖，另一个不覆盖任何药剂。

预期注射药物干细胞组合物的兔的擦伤愈合时间将为只接受血浆注射的供体兔的一半时间以内。

在动物模型上或其他需要修复皮肤的情况下进行的实验也预期展示出使用本发明对皮肤组织的修复，从而使所述修复的相关病症、疾病或目的在施用本发明的组合物后得到改善，所述展示是基于组织学或病理学分析，或者其它所需分析。

还预期对也具有皮肤擦伤的人进行上述操作方法，从收集约100ml外周血开始。预期接受注射或局部施用药物干细胞组合物的人的擦伤愈合时间将为具有相似擦伤却只接受血浆注射的人的一半时间以内。

操作方法-修复耳组织

从至少5位患听觉丧失的人患者(“供体”)中提取(通过注射器抽取)外周血(优选约100ml)。优选的，在取血前，在3天中每12小时用6ng/kg G-CSF处理供体，然后第四天处理一次，之后在第四天取血。通过用分离器例如Cobe Spectra细胞分离器使所收集细胞经过3轮连续的流式白细胞分离术来收集外周血细胞。还制备来自每位供体的血浆。如上文实施例1所述将所述血细胞与相近量(与所分离的血液体积相近)的IMDM混合，以制备血混合物，接着仍如上文实施例1所述进行TVEMF扩增。在10天的TVEMF扩增之后，将TVEMF扩增细胞从生物反应器中移出，并用含有5％人血清白蛋白的肝素化盐水洗涤，然后使用例如100微米尼龙筛或其它合适的过滤系统进行过滤，以除去细胞聚集体。有毒物质也将被除去。

将所述细胞悬浮在每个供体自己的血浆中，以制备药物血液干细胞组合物，接着施用给每个供体。在三个供体中，将少量扩增细胞注射到一个耳中毗邻内耳上皮毛细胞的耳组织中。在另外两个供体中，将少量扩增细胞注射到一个耳的基底动脉中。

在使用本发明的药物血液干细胞组合物治疗后，预期功能性内耳上皮毛细胞的数量将显著增加，优选3到20倍，并且听觉能力将在约一个月的时间里显著改善。

在上文所述条件下在动物模型上进行的实验也预期展示出使用本发明对耳组织的修复，从而使所述修复的相关病症、疾病或目的在施用本发明的组合物后得到改善，所述展示是基于组织学或病理学分析，或者其它所需分析。

操作方法-低温保存

如上文所提及的，从哺乳动物(优选人)中收集血。优选至少从血中除去红细胞。血液干细胞(及所需的其它细胞和培养基)置于TVEMF生物反应器中，受到随时间变化电磁力，并且扩增。如果在TVEMF扩增前未除去RBC，则优选在TVEMF扩增之后除去。TVEMF扩增的细胞可低温保存。此处提供关于低温保存TVEMF扩增的血液干细胞和包含这种细胞的组合物的方法的其他细节，具体见下文。

在TVEMF扩增之后，优选将TVEMF扩增的细胞(包括TVEMF扩增的血液干细胞)转移到至少一个含有至少一种低温保护剂的低温保存容器中。优选地，首先用溶液(例如，缓冲溶液或所期望的低温保存溶液)洗涤TVEMF扩增的血液干细胞，以除去培养基和TVEMF扩增过程中存在的其它组分，接着将其混入允许对细胞低温保存的溶液中。这种溶液一般称为低温保存剂、低温保存液或防冻剂。将所述细胞转移到合适的低温容器中，此容器一般降温至-120℃到-196℃，优选约-130℃到约-150℃，并且维持在此温度。优选在冷冻过程中缓慢且小心地降低温度，以不损伤所述干细胞或至少使损伤最小化。当需要时，将细胞的温度(即低温容器的温度)上升到与引入人体相容的温度(通常从约为室温到约为体温)，然后TVEMF扩增的细胞被导入哺乳动物体内，优选人类，例如如上文所讨论。

冷冻细胞通常有破坏性。不限于理论地，在降温过程中，细胞内的水结冰。然后可能通过对细胞膜的渗透作用、细胞脱水、溶质浓缩、以及冰晶形成而产生损伤。随着在细胞外部形成冰，有效水从溶液中被除去并从细胞中吸取水分，造成渗透脱水并提高溶质浓度，最终破坏细胞。(讨论参阅Mazur，P.，1977，Cryobiology 14：251-272.)

不同物质具有不同的冰点。优选地，待用于低温保存的血液干细胞组合物包含尽可能少的污染物质，以尽可能使结晶和冷冻过程中对细胞壁的损伤最小。

这些损伤作用可通过以下来降低或甚至避开：(a)应用低温保护剂，(b)控制冷冻速率，以及(c)在足够低的温度保存，以尽可能减少降解反应。

在本发明中优选包括低温保存剂。可使用的低温保护剂包括但不限于足量的二甲基亚砜(DMSO)(Lovelock，J.E.and Bishop，M.W.H.，1959，Nature 183：1394-1395；Ashwood-Smith，M.J.，1961，Nature 190：1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret，A.P.，1960，Ann.N.Y.Acad.Sci.85：576)、聚乙二醇(Sloviter，H.A.and Ravdin，R.G.，1962，Nature 196：548)、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、i-赤鲜醇、D-核糖醇、D-甘露醇(Rowe，A.W.，et al.，1962，Fed.Proc.21：157)、D-山梨醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化胆碱(Bender，M.A.，et al.，1960，J.Appl.Physiol.15：520)、氨基酸葡萄糖溶液或者氨基酸(PhanThe Tran and Bender， M.A.，1960，Exp.Cell Res.20：651)、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油酯(Lovelock，J.E.，1954，Biochem.J.56：265)和无机盐(Phan The Tran and Bender，M.A.，1960，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.104：388；Phan The Tran and Bender，M.A.，1961 inRadiobiology，Proceedings of the Third Australian Conference onRadiobiology，IIbery，P. L.T.，ed.，Butterworth，London，p.59)。在优选实施方案中使用DMSO。DMSO为液体，低浓度下对细胞无毒。作为小分子，DMSO可自由穿过细胞并通过与水结合而改变其冷冻性来保护细胞内的细胞器，以及防止形成冰而造成的损害。添加血浆(即，至浓度20-25％)可增加DMSO的保护效果。添加DMSO后，细胞应保持在0℃或更低，因为约1％浓度的DMSO在高于4℃的温度下是有毒的。我选择的与TVEMF扩增的血液干细胞组合用于总组合物的优选低温保护剂为：在60至80％氨基酸葡萄糖溶液中的20至40％二甲基亚砜溶液，或者15至25％的羟乙基淀粉溶液，或者4至6％的甘油、3至5％葡萄糖、6至10％葡聚糖T10，或者15至25％聚乙二醇或者75至85％氨基酸葡萄糖溶液。上文所述的低温保存剂的量优选是整个组合物中低温保存剂的总量(不只是添加到组合物中的物质的量)。

尽管待低温保存的本发明组合物中可存在除血细胞和低温保护剂之外的其它物质，但例如由于如上文讨论的关于冷冻机制的原因，本发明的TVEMF扩增血液干细胞组合物的低温保存优选含有尽可能少的其它物质。

优选地，将本发明的TVEMF扩增的血液干细胞组合物冷却到温度为约-120℃到约-196℃的范围，优选约-130℃到约-196℃，更优选为-130℃到约-150℃。

受控的缓慢冷却速率是重要的。不同的低温保护剂(Rapatz，G.，et al.，1968，Cryobiology 5(1)：18-25)和不同的细胞类型有不同的最佳冷却速率(对于降温速度对于外周细胞存活的影响(以及对其移植潜力的影响)可参阅如Rowe，A.W. and Rinfret，A.P.，1962，Blood20：636；Rowe，A.W.，1966，Cryobiology 3(1)：12-18；Lewis，J.P.，et al.，1967，Transfusion 7(1)：17-32；and Mazur，P.，1970，Science168：939-949)。水变成冰时的熔化热应该尽可能小。冷却过程可通过应用例如可编程冷冻设备或者甲醇浴方法来实施。

可编程冷冻装置允许确定最佳冷却速率并促进标准的可重现的冷却。可编程速率控制冷冻装置比如Cryomed或Planar允许将冷冻方案调整到期望的冷却速率曲线。其它可接受的冷冻装置可以是，例如，Sanyo Model MDF-1155ATN-152C和Model MDF-2136ATN-135C，Princeton CryoTech TEC 2000。例如，对于10％DMSO和20％血浆中的血细胞或者CD34+/CD38-细胞，最优速率为从0℃到-200℃，1到3℃/分钟。

在优选实施方案中，此冷却速率可用于本发明所述细胞。盛有所述细胞的低温容器必须在低温下稳定，并且允许快速的热传递，以便于有效控制冷冻和解冻。密封塑料管(例如Nunc、Wheatoncryules)或玻璃安瓿可用于多个小量(1-2ml)，而较大体积(100-200ml)可在聚烯烃袋(例如Delmed)中冷冻，该聚烯烃袋放在金属板之间以便在冷却期间更好的传递热量。(骨髓细胞袋通过将其置于-80℃冷冻装置中成功冷冻，幸好该冷冻装置提供了约3℃/分钟的冷却速率)。

在替代实施方案中，可应用甲醇浴冷却方法。甲醇浴方法特别适合大规模的对多个小物品实施常规低温保存。该方法不需要手动控制冷冻速率也不需要记录器监测速率。在优选的方面中，DMSO处理的细胞预先在冰上冷却并转移到装满冷冻甲醇的盘中，其随后被置于-130℃机械冰箱中(例如Harris或Revco)。甲醇浴和样品的热电偶检测显示期望的1到3℃/分钟的冷却速率。在至少两个小时之后，样品达到-80℃，然后可直接将其置于液氮(-196℃)中以永久保存。

完全冷冻之后，TVEMF扩增的干细胞可快速转移到长期低温保存容器中。在优选实施方案中，样品可低温保存在液氮(-196℃)中或者其蒸汽(-165℃)中。保存温度应低于-120℃，优选低于-130℃。高效液氮冰箱的可用性大大方便了这种保存，所述冰箱类似于具有极低真空和内部超绝热的大Thermos容器，使得热量泄漏和氮气流失都保持在绝对低值。

用于低温保存细胞的优选的装置和程序由ThermogenesisCorp.，Rancho Cordovo，CA制造，利用它们的程序将细胞温度降低到低于-130℃。在冷冻和保存期间细胞盛放于Thermogenesis血浆袋中。

其它冰箱是市售的。例如，“BioArchive”冰箱不但冷冻而且提供低温保存样品比如本发明的血或细胞的目录，例如同时管理高达3,626个冷冻血袋。此冰箱具有机械臂，当其在得到指示时将取出特定样品，确保不扰乱其它样品或使其暴露在较高温度中。其它市售的冰箱包含但不限于Sanyo Model MDF-1155 ATN-152C和ModelMDF-2136 ATN-135C，和Princeton CryoTech TEC 2000。

在TVEMF扩增的血液干细胞组合物的温度降低到低于-120℃之后，优选低于-130℃，它们可置于装置中，比如Thermogenesis冷冻装置。它们的温度保持在-120℃到-196℃，优选-130℃到-150℃。本发明的低温保存TVEMF扩增的血液干细胞组合物的温度不应长时间处于约-120℃。

根据本发明的低温保存的TVEMF扩增的血液干细胞或其组合物可冷冻无限长时间，在需要时将其解冻。例如，组合物可冷冻长达18年。甚至更长的时间也是可行的，可能甚至长达血供体的一生。

需要时，可将其中装有细胞的袋置于解冻系统中，比如Thermogenesis Plasma Thawer或Thermoline Thawer系列中的其它装置。低温保存的组合物的温度升至室温。在另一个优选解冻与低温保护剂混合的细胞的方法中，可将保存在液氮中的装有本发明的低温保存的TVEMF扩增的血液干细胞组合物的袋置于液氮的气相中15分钟，然后暴露在室温环境空气中5分钟，最后在37℃水浴中尽可能快的解冻。解冻的袋立刻用相同体积的溶液稀释，该溶液是含有2.5％(重量/体积)人血清白蛋白和5％(重量/体积)葡聚糖40(Solplex 40；Sifra，Verona，Italy)的等渗盐溶液，接着400g离心十分钟。除去上清，用新鲜白蛋白/葡聚糖溶液重悬沉降下来的细胞。可参阅Rubinstein，P. et al.，Processing and cryopreservation ofplacental/umbilical  cord  blood for unrelated bone marrowreconstitution.Proc.Natl.Acad.Sci.92：10119-1012(1995)  forRemoval of Hypertonic Cryoprotectant；此优选解冻细胞方法的一种变化形式可见Lazzari，L.et al.，Evaluation of the effect ofcryopreservation on ex vivo expansion of hematopoietic progenitorsfrom cord blood.Bone Marrow Trans.28：693-698(2001)。

在细胞升温到室温后，它们可用于研究或再生治疗。解冻的TVEMF扩增的血液干细胞组合物可直接引入哺乳动物体内，优选人类，或者以其解冻形式用于期望的研究中。其中存在解冻细胞的溶液可被完全洗去，并换成或加入其他溶液或按需要进行操作。在引入哺乳动物体内之前，优选在马上将要引入之前，可将多种添加剂加入解冻组合物(或者非低温保存的TVEMF扩增的血液干细胞组合物)中。此类添加剂包括但不限于生长因子、铜螯合剂、细胞因子、激素、适宜的缓冲剂或稀释剂。优选地，添加G-CSF。更优选地，对于人类，以约20到约40μg/kg体重的量添加G-CSF，甚至再优选地，以约30μg/kg体重的量。在引入之前，TVEMF扩增的血液干细胞组合物可与哺乳动物自身或者合适供体的血浆、血液或白蛋白、或者其它物质(例如可伴随输血的物质)混合。解冻的血液干细胞可用于例如检验对期望用于治疗或可用于治疗的药物是否有有害反应。

尽管FDA尚未批准在美国将扩增的血液干细胞用于组织再生，但是这一批准看起来即将来临。直接注射足量的扩增血液干细胞应能够如本申请中所讨论的用于再生皮肤、耳和口组织。

本发明的TVEMF扩增的血液干细胞组合物应以足够实现组织修复或再生或者足够治疗目标疾病或病症的量引入哺乳动物体内，优选人类。优选地，将至少20ml每ml含10⁷到10⁹干细胞的TVEMF扩增的血液干细胞组合物用于任何治疗，优选一次全部使用，尤其是当发生外伤后需要立即组织修复的情况。此量对75-80kg的人体是特别优选的。待引入其来源哺乳动物的组合物中的TVEMF扩增的血液干细胞的量部分取决于来源血物质中存在的细胞数量(特别是如果可用的数量相当有限时)。引入患者的TVEMF扩增的血液干细胞的优选范围可以是，比如，约10ml到约50ml的TVEMF扩增的血液干细胞组合物，其每ml含10⁷到10⁹干细胞，或者可能更多。尽管我们知道高浓度的任何物质施用给哺乳动物都可能是有毒的或者甚至是致死的，但是引入所有的哺乳动物血液干细胞，例如在TVEMF扩增后至少7倍，不可能造成TVEMF扩增的血液干细胞过量。在使用来自多个供体或同一供体多次收集的血的情况下，引入哺乳动物的血液干细胞的数量可以更高。同样，可引入患者的TVEMF细胞的剂量不受从一个个体收集所提供的血数量的限制；多次施用可更容易应用，例如每天一次或两次，或每周一次，或其它施用时间方案。并且，在治疗组织时，所述组织类型可能准许使用尽可能多的TVEMF扩增的血液干细胞或使用较小的剂量。例如，与其他组织相比，肝脏可能是最易于治疗的，并且可能需要较少的干细胞。

应该理解，尽管上文所描述的实施方案通常涉及低温保存TVEMF扩增的血液干细胞，但是TVEMF扩增也可以在对已经过低温保存的、非扩增、或者非TVEMF扩增的血液干细胞解冻之后进行。同时，如果期望低温保存，则可以在冷冻细胞之前或之后进行TVEMF扩增。例如，许多血库有低温保存的组合物，其包含处于冷冻保存状态的血液干细胞，以备在某时间点的需要。这些组合物可根据传统方法解冻，然后按照此处所述进行TVEMF扩增，其包括按照此处所述的TVEMF过程的变化形式。此后，如上文所述，此TVEMF扩增的血液干细胞被认为是本发明的组合物。在低温保存之前进行TVEMF扩增是优选的，例如假如发生外伤，已经扩增了患者的血液干细胞就不需要再花费宝贵的额外数天来准备。

同样，尽管不优选，但应注意本发明的TVEMF扩增的血液干细胞可低温保存，然后解冻，然后如果不使用，再低温保存。在冷冻所述细胞之前优选进行TVEMF扩增(即数量的增加，而不是尺寸)。所述细胞也可在冷冻接着解冻之后进行扩增，即便在冷冻之前已经进行过扩增。

血液干细胞的扩增可能需要若干天。在立刻提供血液干细胞是很重要的情况下，比如生死攸关的情况或外伤的情况，尤其在如果需要在将细胞重新引入之前完成研究的情况下，可能没有数天时间去等待血液干细胞扩增。因此，预先估计到治疗每拖延一分钟都可决定生死的紧急情况，就特别期望从出生时就有可用的扩增血液干细胞。

还应该理解，在TVEMF扩增后经过或不经过低温保存，本申请的TVEMF扩增的血液干细胞均可引入哺乳动物，优选来源哺乳动物(血来源的哺乳动物)。但是，这样的引入无需仅限于来源哺乳动物(自体)；TVEMF扩增细胞也可转移给不同的哺乳动物(异体)。

还应该理解，尽管血(脐带血(优选低温保存的)或外周血(优选新抽取的)是本发明优选的成体干细胞来源，但来自骨髓的成体干细胞也可以以与本发明血液干细胞相似的方式进行TVEMF扩增并使用。骨髓不是易得的干细胞来源，而是必需通过采集术(apheresis)或其它昂贵且疼痛的方法进行收集。

本发明也包括研究皮肤、口或耳/听觉病症或其它疾病状态的方法，包括将TVEMF扩增的干细胞引入用于此疾病状态的测试系统。这样的系统可包括但不限于例如患有此疾病的哺乳动物、用于研究所述疾病的适当动物模型或用于研究所述疾病的体外测试系统。如本领域技术人员所公知，TVEMF扩增血液干细胞可用于研究多种疾病可能的治疗方法。

在扩增、保存、和解冻的完整过程中，本发明的血液干细胞均维持其三维几何结构及其细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

尽管本文描述了优选的实施方案，本领域技术人员会理解本发明包括了多种变化与改良。本发明的范围不限于上文所描述的实施方案。

Claims (35)

1.修复上皮组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的药物血液干细胞组合物的步骤，所述组合物包含扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然存在的血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然存在的血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

2.修复上皮组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少2倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

3.根据权利要求2的方法，其中每单位体积中TVEMF扩增的血液干细胞数目是至少7倍。

4.修复皮肤组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

5.修复皮肤组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少2倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

6.根据权利要求5的方法，其中每单位体积中TVEMF扩增的血液干细胞数目是至少7倍。

7.权利要求6的方法，其中所述施用步骤包括通过局部、静脉内注射和皮下注射中的至少一种施用方法施用所述药物血液干细胞组合物。

8.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物是人类。

9.权利要求5的方法，其在施用步骤之前还包括以下步骤：

a.将血混合物置于TVEMF生物反应器的培养腔室中；

b.使TVEMF生物反应器中的血混合物受到TVEMF，并对血液干细胞进行TVEMF扩增，直至每单位体积中的TVEMF扩增血液干细胞数目是置于TVEMF生物反应器中的每单位体积中血液干细胞数目的7倍以上；和

c.将TVEMF扩增细胞与可药用载体混合，以形成药物血液干细胞组合物。

10.权利要求9的方法，还包括从TVEMF扩增细胞中除去有毒物质。

11.权利要求9的方法，其中所述血混合物包含与其它血液成分分离开的CD34+/CD38-血液干细胞。

12.修复口组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

13.修复口组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少2倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

14.根据权利要求13的方法，其中每单位体积中TVEMF扩增的血液干细胞数量是至少7倍。

15.权利要求14的方法，其中所述施用步骤包括通过局部、静脉内注射和注射进牙龈组织中的至少一种施用方法施用所述血液干细胞药物组合物。

16.权利要求15的方法，其中所述哺乳动物是人类。

17.权利要求13的方法，其在施用步骤之前还包括以下步骤：

a.将血混合物置于TVEMF生物反应器的培养腔室中；

b.使TVEMF生物反应器中的血混合物受到TVEMF，并对血液干细胞进行TVEMF扩增，直至每单位体积中的TVEMF扩增血液干细胞数目是置于TVEMF生物反应器中的每单位体积中血液干细胞数目的7倍以上；和

c.将TVEMF扩增细胞与可药用载体混合，以形成血液干细胞药物组合物。

18.权利要求17的方法，还包括从TVEMF扩增的细胞中除去有毒物质。

19.权利要求17的方法，其中所述血混合物包含与其它血液成分分离开的CD34+/CD38-血液干细胞。

20.修复内耳组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

21.修复内耳组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少2倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

22.根据权利要求2的方法，其中每单位体积中TVEMF扩增的血液干细胞数量是至少7倍。

23.权利要求22的方法，其中所述施用步骤包括通过局部、静脉内注射和注射进牙龈组织中的至少一种施用方法施用所述血液干细胞药物组合物。

24.权利要求23的方法，其中所述哺乳动物是人类。

25.权利要求21的方法，其在施用步骤之前还包括以下步骤：

a.将血混合物置于TVEMF生物反应器的培养腔室中；

b.在TVEMF生物反应器中使血混合物受到TVEMF，并对血液干细胞进行TVEMF扩增，直至每单位体积中的TVEMF扩增血液干细胞数目是置于TVEMF生物反应器中的每单位体积中血液干细胞数目的7倍以上；和

c.将TVEMF扩增细胞与可药用载体混合，以形成血液干细胞药物组合物。

26.权利要求25的方法，其还包括从TVEMF扩增细胞中除去有毒物质。

27.权利要求25的方法，其中所述血混合物包含与其它血液成分分离开的CD34+/CD38-血液干细胞。

28.用于修复哺乳动物上皮组织的血液干细胞药物组合物，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然存在的血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然存在的血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

29.用于修复哺乳动物皮肤组织的血液干细胞药物组合物，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

30.用于修复哺乳动物口组织的血液干细胞药物组合物，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

31.用于修复哺乳动物内耳组织的血液干细胞药物组合物，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。

32.权利要求28的组合物在制备用于修复上皮组织的药物中的用途。

33.权利要求29的组合物在制备用于修复皮肤组织的药物中的用途。

34.权利要求30的组合物在制备用于修复口组织的药物的用途。

35.权利要求31的组合物在制备用于修复内耳组织的药物中的用途。

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