CN107072189A

CN107072189A - 用于改善干细胞稳定性的组合物

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Publication number: CN107072189A
Application number: CN201580036349.3A
Authority: CN
Inventors: 罗廷灿; 禹相奎
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-07-08
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: JP6741597B2; EP3178318B1; EP3178318A1; CN107072189B; US10172347B2; KR101597604B1; KR20160006127A; EP3178318A4; US20170105406A1; JP2017521378A; WO2016006782A1

Abstract

本发明涉及一种能够改善干细胞的储存稳定性的组合物。更具体地，本发明涉及用于改善干细胞的冷冻储存稳定性的包含血清和血浆的组合物。根据本发明的用于改善干细胞的储存稳定性的组合物可保持超过90％的存活率至少9天而不改变干细胞的性质、数目或大小，且因此可用于供细胞疗法使用的干细胞的长期运输和具有良好效果的细胞治疗注射产品的制备。

Description

用于改善干细胞稳定性的组合物

技术领域

本发明涉及用于改善干细胞储存稳定性的组合物，且更具体地，涉及用于改善干细胞的冷冻储存稳定性的组合物，所述组合物包含血清或血浆。

背景技术

干细胞是指能够分化成为至少两种细胞同时具有自我复制能力的细胞，且可分为全能(totipotent)干细胞、多潜能(pluripotent)干细胞和多能(multipotent)干细胞。

全能干细胞是具有全能性质的能够发育成为一个完美个体的细胞，且通过卵细胞和精子受精后这些性质由具有至多8-细胞阶段的细胞所拥有。当分离这些细胞并移植入子宫时，这些细胞可发育成一个完整个体。全能干细胞(能够发育成为源自外胚层、中胚层和内胚层的多种细胞和组织)源自内细胞团，所述内细胞团位于受精后4-5天生成的囊胚内。这些细胞称为"胚胎干细胞"且可分化成为多种其他组织细胞，但不形成新的有生命的生物体。多能干细胞是能够分化成仅对包含这些细胞的组织和器官具有特异性细胞的干细胞。

多能干细胞首先从成人骨髓分离(Y.Jiang等人，Nature,418:41,2002)，且此后，其在数种其他成人组织中得以确认(C.M.Verfaillie等人，Trends Cell Biol.12:502,2002)。然而，成人组织诸如骨髓中的干细胞存在很少，且在无分化诱导下难以培养这些细胞，且因此，在无特异性筛选的培养基下难以培养这些细胞。换言之，其缺点在于难以在体外分离干细胞并保存该细胞。

近来，发现了脂肪组织是多能干细胞的新的来源(B.Cousin等人，BBRC,301:1016,2003；A.Miranville等人，Circulation,110:349,2004；S.Gronthos等人，J.CellPhysiol.189:54,2001；M.J.Seo等人，BBRC,328:258,2005)，且已报导未分化的细胞群体包含在通过脂肪提取(吸脂)获得的人脂肪组织中，且在体外具有分化成脂肪细胞、骨形成细胞、成肌细胞和软骨细胞的潜力(P.A.Zuk等人，Tissue Eng.7:211,2001；A.M.Rodriguez等人，BBRC,315:255,2004)。此外，通过动物模型实验已知，源自脂肪组织的细胞具有肌肉再生能力和促进神经血管分化的能力。脂肪组织具有能够大量提取的优势，且因此，其已作为补充现有不足的干细胞的新来源受到关注。

能够大量获得的干细胞已作为用于将干细胞本身进行注射的细胞治疗剂更多地使用，以实现医药领域的主要目的，包括治疗不能治愈的疾病、美容、化妆品等。

培养干细胞后，当将医疗步骤直接用于患者时，用于细胞治疗剂目的的干细胞没有问题。然而，取决于患者病况，当需要控制用于干细胞医疗步骤的时间时，培养干细胞后需要长期储存。此外，当需要长期运输至用于实践经培养的干细胞的地点时，提供稳定的干细胞至关重要。为此，需要持续约5-10天的长时间段维持干细胞的高存活率。然而，目前，当长时间段保存干细胞而无冷冻时，存在的问题是细胞存活率十分低。同时，细胞冷冻方法在融化时引起细胞存活率显着恶化，且从生物学的角度在干细胞功能性等方面存在问题。此外，在冷冻(freezing)状态运输相比在冷藏(refrigeration)状态中运输更加困难。

尽管目前常规用于保存干细胞的技术在冷藏状态中，存在将人脂肪组织衍生的间充质干细胞在冷藏条件下悬浮并保存在盐水中的技术，但在该情况中，当将细胞保存48小时或更久时，难以具有70％或更高的存活率。确认了当添加蔗糖或白蛋白以克服困难时，直至48小时至72小时，存活率为70％或更高，并改善了储存稳定性(韩国特许第10-2008-0103637号)。然而，72小时后，由于存活率快速降低，需要开发用于在冷藏条件下(4℃)改善储存稳定性的组合物，进而包括在细胞治疗剂中的干细胞可长时间稳定维持高存活率。

因此，本发明的发明人在长时间冷冻储存中维持干细胞的高存活率方面做出了努力，且结果是，发现了当包含血清或血浆时，维持冷藏状态的干细胞的高存活率至少9天，并完成了本发明。已存在其中人血清用作细胞培养的培养基组合物的情况(韩国特许第10-0394430号)，然而，并未公开包含人血清或人血浆的用于改善干细胞储存稳定性的组合物。

发明内容

本发明的目的是提供用于改善干细胞冷冻储存稳定性的组合物，其包含具有5-80％(v/v)含量的血清或血浆。

本发明的另一目的是提供包含如上文所述的组合物的细胞治疗注射产品。

为实现上述目的，本发明提供用于改善干细胞冷冻储存稳定性的组合物，其包含具有5-80％(v/v)含量的血清或血浆。

本发明还提供包含上述组合物的细胞治疗注射产品。

附图简述

图1说明了用不同浓度(10、20和30％)的自体血清和包含0.3％白蛋白的防腐剂冷冻储存干细胞后，基于0-144小时的保留时间，0.5x10⁷个干细胞的存活率的比较。对照组使用包含0.3％白蛋白的防腐剂。

图2说明了用不同浓度(10、20和30％)的自体血清和包含0.3％白蛋白的防腐剂冷冻储存干细胞后，基于0-144小时的保留时间，1x10⁷个干细胞的存活率的比较。对照组使用包含0.3％白蛋白的防腐剂。

图3说明了用不同浓度(10、20和30％)的同种异体血清和包含0.3％白蛋白的防腐剂冷冻储存干细胞后，基于0-144小时的保留时间，0.5x10⁷个干细胞的存活率的比较。对照组使用包含0.3％白蛋白的防腐剂。

图4说明了用不同浓度(10、20和30％)的同种异体血清和包含0.3％白蛋白的防腐剂冷冻储存干细胞后，基于0-144小时的保留时间，1x10⁷个干细胞的存活率的比较。对照组使用包含0.3％白蛋白的防腐剂。

图5说明了干细胞#1的对照组(盐水/0.3％白蛋白)和对应于各自具有不同情况的实验组(1-6)的用于改善储存稳定性的组合物中，细胞数、存活率和细胞大小的变化的比较结果。

图6说明了干细胞#2的对照组(盐水/0.3％白蛋白)和对应于各自具有不同情况的实验组(1-6)的用于改善储存稳定性的组合物中，细胞数、存活率和细胞大小的变化的比较结果。

图7说明了防腐剂的pH对细胞存活率的影响。

图8说明了血清和血浆对细胞活力效果的比较结果。

图9说明了白蛋白对细胞活力的影响。

图10说明了血清浓度对细胞活力效果的比较结果。

最佳模式

除非另外定义，本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同的含义。一般而言，本文使用的命名法为本领域公知和通用。

本发明中，发现了在冷藏状态中干细胞95％或更高的存活率通过包含血清或血浆的干细胞防腐剂维持，由此干细胞的储存稳定性得以改善。根据本发明的包含血清或血浆的干细胞防腐剂能够维持干细胞在冷藏状态的高存活率至少9天，其可用于稳定提供用于细胞疗法的干细胞。

本文使用的术语“细胞治疗注射产品"或“细胞治疗剂”意为能够包含干细胞以治疗组织缺陷或在缺陷位点或其附近部分注射用于肠胃外施用(即作为注射形式)由此纠正缺陷的药物组合物。

本文使用的术语“赋形剂”指除了具有药理特性的有效组分的药物组合物之外，以预先确定的体积和重量添加用于促进处理或添加以维持液体形式的材料，等。用于维持液体形式的赋形剂的实例一般包括盐水、Hartman-D溶液、PBS(磷酸盐缓冲盐水)等，但可包含其他含有多种组分的材料。

本文使用的术语"脂肪组织衍生的干细胞"是从脂肪组织分离的未分化的干细胞，且其分离方法如下。脂肪组织衍生的干细胞可通过下述方法分离：培养包含通过吸脂获得悬浮于盐水中的脂肪的悬浮液，用胰蛋白酶处理附着至培养容器的干细胞层以回收处理的干细胞或通过使用刮刀刮取来回收干细胞。

本发明的干细胞能够通过下述方法获得。

首先，分离通过吸脂从腹部脂肪获得的人脂肪组织并用PBS洗涤。随后，将分离的组织切细，通过使用添加了胶原酶的DMEM培养基分解，并用PBS洗涤，随后离心。去除上清并用PBS洗涤沉淀，随后离心。使用100μm网孔去除漂浮的材料，并用PBS洗涤获得的细胞。获得的细胞在DMEM(10％FBS，2mM NAC，0.2mM抗坏血酸)培养基中培养，且一晚后，未粘附至培养容器的细胞用PBS洗涤。随后，传代培养残留的细胞同时每两天用角质形成细胞-SFM培养基(FBS、NAC、抗坏血酸、钙、rEGF、胰岛素、bFGF和氢化可的松)替换培养基，由此可分离脂肪组织衍生的间充质干细胞。除上述方法之外，干细胞可通过本领域之前已知的方法获得。

在本发明例示性的实施方案中，人脂肪组织衍生的间充质干细胞悬浮于包含10～50％(v/v)自体或同种异体人血清和0.3％白蛋白的组合物中或悬浮于包含人血浆和0.3％白蛋白的组合物中，且随后，细胞的大小和性质、细胞数目及其存活率依赖于在冷藏状态(4℃)中的时间进行分析。

因此，根据本发明的目的，提供了用于改善干细胞的冷冻储存稳定性的组合物，其包含具有5-80％(v/v)含量的血清或血浆。

在本发明中，血清的含量优选为10-50％(v/v)，且血浆的含量优选为5-50％(v/v)，但其每种含量不限于此。

本发明的血清特征在于，其为源自哺乳动物(包括人)的血清或血浆。此外，其优选为源自同种的血清或血浆，且可为自体血清或同种异体血清或血浆，而无限制。

在本发明中，冷冻储存优选具有0.1-10℃的温度范围，但冷冻储存的温度范围不限于此。

在本发明中，用于改善干细胞冷冻储存稳定性的组合物可进一步包含白蛋白和赋形剂，其中白蛋白的含量优选为0.1-1％(v/v)，更优选0.2-0.5％(v/v)，但白蛋白的含量不限于此。此外，赋形剂优选为选自下组的至少任一种：盐水、Hartmann-D溶液和PBS，但不限于此。

"v/v"意为其中通过添加1-80％的血清和0.1-1％的白蛋白至悬浮于盐水中的干细胞体积(体积百分比)使总体积(体积百分比)为100％。

在本发明中，干细胞的浓度优选为1.0x10⁵-1.0x10⁹个细胞/ml，且更优选地1.0x10⁶-1.0x10⁸个细胞/ml，但干细胞的浓度不限于此。

在本发明中，干细胞优选选自下组：脂肪、脐带血、骨髓、肌肉、胎盘和皮肤，且在这些中，干细胞最优选为脂肪组织衍生的干细胞，但本发明不限于此。此外，干细胞的特征在于其为源自哺乳动物(包括人)的干细胞。

根据本发明的另一目的，提供了包含用于改善干细胞冷冻保存稳定性的组合物的细胞治疗注射产品，，所述组合物包含血清或血浆。

根据本发明的注射产品可以本领域一般已知的含量填充的注射形式制备，所述含量取决于患者缺陷的构成和种类而不同。

根据本发明的注射产品可在待治疗缺陷的附近区域或缺陷区域注射，且能够由该注射纠正的缺陷可为皱纹、妊娠纹、疤痕、皮肤凹陷、嘴唇形成功能障碍、牙周缺陷、软组织缺陷、骨缺陷、烧伤、皮肤溃疡等。然而，缺陷的种类不限于此。

本发明中，如果需要，细胞治疗注射产品可进一步包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、pH调节剂、无痛化剂(soothing agents)、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。

实施例

此后，本发明将参照下列实施例进行更详细地说明。这些实施例仅用于阐释本发明，且对本领域的技术人员显而易见的是本发明的保护范围不应理解为受这些实施例的限制。

实施例1：人脂肪衍生的间充质干细胞的分离和培养

通过吸脂从腹部脂肪分离获得人脂肪组织并用PBS洗涤。切细分离的组织并通过使用添加了1型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养基在37℃分解2小时。使用PBS洗涤用胶原酶处理的组织并在1000rpm离心5分钟。取出上清并用PBS洗涤沉淀，随后在1000rpm离心5分钟。通过使用100μm网孔过滤去除漂浮的材料，且获得的细胞用PBS洗涤，并在DMEM(10％FBS，2mM NAC(N-乙酰基-L-半胱氨酸)和0.2mM抗坏血酸)培养基中培养。一晚后，用PBS洗涤未附着至培养容器的细胞，且随后，传代培养细胞同时每两天用角质形成细胞-SFM培养基(5％FBS，2mM NAC，0.2mM抗坏血酸，0.09mM钙，5ng/ml rEGF，5μg/ml胰岛素，10ng/ml bFGF和74ng/ml氢化可的松)替换培养基，由此分离脂肪组织衍生的间充质干细胞。

实施例2：实验组的构成和每种赋形剂的pH测量

2-1：实验组的构成

在4℃冷藏储存通过实施例1的方法分离的四种不同的脂肪细胞干细胞，并分析用于冷藏制剂细胞治疗注射产品的干细胞的存活率。

表1

将四种分离的脂肪细胞干细胞用于构成如表1所示的实验组。构成了包含0.3％白蛋白的干细胞对照组、包含0.3％白蛋白+10％自体血清的实验组、包含0.3％白蛋白+10％同种异体血清的实验组、包含0.3％白蛋白+20％自体血清的实验组、包含0.3％白蛋白+20％同种异体血清的实验组、包含0.3％白蛋白+30％自体血清的实验组和包含0.3％白蛋白+30％同种异体血清的实验组，并分析了其存活率。

2-2：每种赋形剂的pH值

在本实施例中分析了用于改善干细胞储存稳定性的组合物的每种赋形剂的pH。

pH是氢离子浓度的数值，且一般盐水的pH具有约5.5-8.0的宽范围。当将白蛋白和人血清添加至盐水时，与PBS比较了pH变化。正常健康状态中的pH意为其中细胞、血液、体液等保持在弱碱性的情况。

对于pH分析，通过Orion Star A111(Thermo Scientific Inc.)分析了包含在用于改善干细胞储存稳定性的组合物中的白蛋白和人血清的pH变化。此外，由于pH受温度影响，在20℃-24℃范围的室温测量了pH。

表2

pH测量(SA:盐水+0.3％白蛋白)

结果是，可从表2确认当仅添加白蛋白时，pH仅略微增加，但当添加人血清时，维持在弱碱性pH。

此后，对此，在实施例3中分析了悬浮于包含0.3％白蛋白的盐水中的干细胞对照组、悬浮于分别包含10、20和30％自体人血清和0.3％白蛋白的盐水的干细胞实验组和悬浮于分别包含10、20和30％同种异体人血清和0.3％白蛋白的盐水的干细胞实验组的活力。

实施例3：依赖于时间的干细胞的大小和性质分析

用PBS洗涤通过实施例1的方法分离的脂肪细胞干细胞，并悬浮于包含0.3％白蛋白的盐水中。随后，分别向其中添加10％、20％和30％自体人血清和同种异体人血清，由此获得的细胞构成实施例2的对照组和实验组。

将具有1.0x10⁷个细胞/ml浓度的每实验组的干细胞填充在3cc注射器中并在4℃冷冻储存。0、24、48、72、96、120和144小时后，分析了在冷藏制剂细胞治疗注射产品中使用的干细胞的大小和性质。

3-1：自体血清实验组

对于细胞1，制备了其中0.5x10⁷个干细胞悬浮于包含0.3％白蛋白盐水中的对照组，和其中0.5x10⁷个干细胞悬浮于分别包含10、20和30％自体血清/0.3％白蛋白的三个干细胞实验组。

对于细胞2，制备了其中1.0x10⁷个干细胞悬浮于包含0.3％白蛋白盐水中的对照组，和其中1.0x10⁷个干细胞悬浮于分别包含10、20和30％自体血清/0.3％白蛋白的三个干细胞实验组。

将细胞1的对照组和三个实验组的全部的干细胞和细胞2的对照组和三个实验组的全部的干细胞填充在3cc注射器中，并在4℃冷冻储存。0、24、48、72、96、120和144小时后，分析了细胞的大小和性质及总细胞数。通过使用Countess^TM Automated Cell Counter(Invitrogen)分析干细胞的细胞数和大小，并用裸眼分析其性质。

表3

表4

表5

表6

其结果示于表3(细胞1的细胞数)、表4(细胞1的大小)、表5(细胞2的细胞数)和表6(细胞2的大小)。

如表3-6所示，对照组的细胞大小减少约15-25％；同时，包含自体人血清的实验组的细胞大小减少约3-10％，由此在包含自体人血清的实验组中细胞大小的变化并不显著。同时，未观察到对照组和实验组的细胞性质的变化，且在对照组和实验组间总细胞数不存在差异。

3-2：同种异体血清实验组

对于细胞3，分别制备了其中0.5x10⁷个干细胞悬浮于包含0.3％白蛋白的盐水中的对照组和其中0.5x10⁷个干细胞悬浮于包含10、20和30％同种异体血清/0.3％白蛋白的盐水中的三个干细胞实验组。

对于细胞4，分别制备了其中1x10⁷个干细胞悬浮于包含0.3％白蛋白的盐水中的对照组和其中1x10⁷个干细胞悬浮于包含10、20和30％同种异体血清/0.3％白蛋白的盐水中的三个干细胞实验组。

将细胞3的对照组和三个实验组的全部的干细胞和细胞4的对照组和三个实验组的全部的干细胞填充在3cc注射器中，并在4℃冷冻储存。0、24、48、72、96、120和144小时后，分析了细胞的大小和性质及总细胞数。通过使用Countess^TM Automated Cell Counter(Invitrogen)分析干细胞的细胞数和大小，并用裸眼分析其性质。

表7

表8

表9

表10

其结果示于表7(细胞3的细胞数)、表8(细胞3的大小)、表9(细胞4的细胞数)和表10(细胞4的大小)。

如表7-10所示，对照组的细胞大小减少约20％；同时，包含同种异体人血清的实验组的细胞大小减少约3-10％，由此在包含同种异体人血清的实验组中细胞大小的变化并不显著。同时，未观察到对照组和实验组的细胞性质的变化，且在对照组和实验组间总细胞数不存在差异。

实施例4：干细胞依赖于时间的存活率分析

通过与实施例3相同的条件分析了依赖于时间的干细胞的存活率。

用PBS洗涤分离的脂肪细胞干细胞，并悬浮于包含0.3％白蛋白的盐水中。随后，向其中分别添加10％、20％和30％自体人血清和同种异体人血清，由此获得的细胞分别构成对照组和实验组。将具有1.0x10⁷个细胞/ml浓度的每个实验组的干细胞填充在3cc注射器中并在4℃冷冻储存。0、24、48、72、96、120和144小时后，分析了在冷藏制剂细胞治疗注射产品中使用的干细胞的存活率。通过以1:1的比率混合细胞和台盼蓝溶液测量干细胞的存活率并通过Countess^TM Automated Cell Counter(Invitrogen)分析。

结果是，在包含人血清的组合物中，确认了存活率高且细胞数并不显著变化，随血清浓度的增加，存活率也增加，且相比仅包含0.3％白蛋白的对照组，细胞稳定性的保留期也变得更长。(图1、2、3和4)。

具体而言，确认了作为包含30％血清的干细胞的实验组3维持在98％或更多的显著高的存活率直至144小时，且即使是包含10-20％血清的实验组，也展现90％或更多的显著高的存活率直至72小时。此外，在自体血清实验组(图1和2)和同种异体血清实验组(图3和4)间依赖于细胞的保留时间的存活率效果不存在差异。

因此，确认了通过人血清用于改善干细胞的储存稳定性的组合物可维持144小时或更长的长期存活率，且在自体血清和同种异体血清间效果不存在差异。

实施例5：新实验组的构成

确认实施例中自体血清和同种异体血清间效果不存在差异后，构成实验组以检查依赖于每种血清浓度和血浆的细胞稳定性。

对照组(SA:盐水+0.3％白蛋白)和六个包括不同血清浓度(10-50％)或血浆(PRP)的实验组示于表11，并测量其细胞冷冻储存稳定性直至第9天。

表11

5-1：干细胞

通过实施例1的方法分离的两种不同的脂肪细胞干细胞在4℃冷冻储存，并分析了用于冷藏制剂细胞治疗注射产品的干细胞的存活率。

将对应的干细胞制备成4.9x 10⁸个细胞的含量(具体地，1.0x 10⁷个细胞/ml的数目为49)。融化两次传代培养的细胞(在5T175烧瓶中融化的6.0x 10⁶个细胞)，并培养(将3次传代培养的4.9x 10⁷个细胞在49T175烧瓶中培养)，并在第四次传代培养时回收细胞(4.9x 10⁸个细胞)，并填充和实验。

将在第四次传代培养回收的细胞分成7管，每管具有7.0x 10⁷个细胞，并与示于表11的7种防腐剂(7ml)混合。随后，对于每个实验组(防腐剂)，在第0、1、2、3、5、7和9天，将细胞填充在7个注射器(3cc)中，每个注射器具有1ml细胞。对于第0天的样品，直接测量细胞数、存活率和细胞大小，且对于剩余样品，在冷冻储存1、2、3、5、7和9天后测量细胞数、存活率和细胞大小Cedex。

5-2：血清和血浆

为分离血清，通过使用不包含抗凝血剂的血液收集管收集血液(10ml)并直立放置于冷藏状态10分钟。在1000RCF关闭制动实施离心15分钟以去除纤维蛋白，且随后，回收血清(为分离的上清)。回收的血清置于1700rpm关闭制动离心5分钟，收集上清并通过使用0.2μm注射器过滤器灭菌制备。

为分离血浆，将抗凝血剂(2cc)注射入注射器(20cc)，并收集血液。随后，通过Dr.PRP试剂盒首先分离血浆和红细胞，随后在3200rpm离心6分钟，以凝结血小板，并二次分离剩余的材料。二次分离后，用10cc注射器以其中PRP(包含血小板的血浆)和PPP(不包含血小板的血浆)得以分离的状态缓慢去除上述PPP(4ml)，并充分混合剩余的PRP(4ml)待用。

5-3：赋形剂的pH

如实施例2-2中实践，对于每个实验组，分析了用于改善干细胞储存稳定性的组合物的赋形剂的pH。

对于pH分析，通过Orion Star A111(Thermo Scientific Inc.)分析包含在用于改善干细胞储存稳定性的组合物中的白蛋白和人血清的pH的变化。

表12

pH测量(SA:盐水+0.3％白蛋白)

结果是，包含向其中添加血清的干细胞储存稳定剂的平均pH值测量为8.2，且通过使用8.4％碳酸氢钠(NaHCO₃)作为pH缓冲剂的盐水(pH＝7.3)的pH确定为8.2。在血浆的情况中，由于量显著小，不可能测量pH。

实施例6：干细胞的细胞数、存活率和大小依赖于时间的变化

用PBS洗涤通过实施例1的方法分离的脂肪细胞干细胞，并通过与实施例5-1相同的方法制备。如表11所示按对照组和六个实验组构成两种脂肪细胞干细胞，并检查其细胞数、存活率和细胞大小直至第9天。

结果是，确认了不包含血清或血浆的对照组(SA:盐水+0.3％白蛋白)维持约80％存活率直至第3天。然而，包含10％血浆或10％血清的实验组相比于对照组展现增加至多50％或更多的存活率(图5和6)。

确认了当血清浓度为50％时，细胞存活率最高，但在包含30％血清的实验组中，展现90％或更高的细胞存活率直至第9天(图5和6)。

因此，确认了当通过使用包含血清或血浆的防腐剂冷冻储存干细胞时，干细胞的储存稳定性得以改善，由此可长期储存干细胞而不改变细胞数、存活率和细胞大小。

实施例7：干细胞储存稳定剂的比较

如在实施例6中的干细胞#1(图5)和干细胞#2(图6)的存活率分析结果，发现了细胞1和细胞2间很少显示差异，且因此，在实施例7中分析了每种稳定剂对于细胞1的效果。

pH为对干细胞的储存稳定剂具有影响的因素之一，为检查其影响，将碳酸氢钠(NaHCO₃)用作pH缓冲剂，且稳定剂的pH确定为8.2。结果是，对照组(SA:盐水+0.3％白蛋白)的细胞存活时间最多为1天(图7)。因此，发现确定pH为8.2的稳定剂对细胞稳定性的促进无效果。

接下来，相互比较了血清和血浆的效果。应当理解的是，相比于对照组，在包含10％血清或10％血浆的稳定剂中，存活率增加至多50％或更多，且确认了血清和血浆间无显著差异，但展现了稳定性的相似趋势(图8)。

为理解包含在稳定剂中的白蛋白的效果，检查了使用30％血清/盐水和30％血清/SA(盐水+0.3％白蛋白)的干细胞的储存稳定性。结果是，确认了当包括0.3％白蛋白时，细胞稳定性略微更高(图9)。然而，应当理解的是两个实验组间的差异直至第9天无显著差异，由此混合血清和白蛋白对稳定剂的效果无显著影响。

因此，通过增加血清浓度作为用于改善储存稳定剂的效果的方法比较了干细胞的储存稳定性。通过测量将血清/SA(盐水+0.3％白蛋白)实验组中的血清浓度增加至10、30和50％后获得的结果是，包含50％血清的稳定剂展现最高的存活率。此外，确认了即使在包含10％血清的稳定剂中，80％或更高的存活率维持了7天，且即使在包含30％血清的稳定剂中，90％或更高的非常高的存活率展现了9天(图10)。该确认表明血清对于维持冷藏状态的细胞的存活率具有显著功能。

工业实用性

根据本发明的用于促进干细胞的冷冻储存稳定性的组合物能够维持超过90％的存活率持续至少9天而不改变干细胞的数目和干细胞的性质和大小，其可用于供细胞疗法使用的干细胞的长期运输和具有良好效果的细胞治疗注射产品的制备。

本发明的具体实施方案如上文详细说明。然而，对本领域的技术人员显而易见的是具体的描述仅为理想的示例性实施方案且不应理解为是对本发明保护范围的限制。因此，本发明实质性的保护范围通过附加的权利要求及其等同进行限定。

Claims

1.一种用于改善干细胞的冷冻储存稳定性的组合物，其包含具有5-80％(v/v)含量的血清或血浆。

2.权利要求1的组合物，其中所述血浆的含量为10-50％(v/v)。

3.权利要求1的组合物，其中所述血浆的含量为5-50％(v/v)。

4.权利要求1的组合物，其中所述冷冻储存温度范围为0.1-10℃。

5.权利要求1的组合物，其进一步包含白蛋白和赋形剂。

6.权利要求5的组合物，其中所述白蛋白的含量为0.1-1％(v/v)。

7.权利要求5的组合物，其中所述白蛋白的含量为0.2-0.5％(v/v)。

8.权利要求5的组合物，其中所述赋形剂为选自下组的至少任一种：盐水、Hartmann-D溶液和PBS。

9.权利要求1的组合物，其中所述干细胞浓度为1.0x10⁵-1.0x10⁹个细胞/ml。

10.权利要求1的组合物，其中所述干细胞源自选自下组的组织：脂肪、脐带血、骨髓、肌肉、胎盘和皮肤。

11.一种细胞治疗注射产品，其包含权利要求1-10中任一项的用于改善干细胞的冷冻储存稳定性的组合物。

12.权利要求11的细胞治疗注射产品，其进一步包含选自下组的一种或多种：悬浮剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、pH调节剂、无痛化剂、缓冲剂、含硫还原剂和抗氧化剂。