WO2018147457A1 - ヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法 - Google Patents

ヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法 Download PDF

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stem cells
preservation solution
human
stem cell
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忍 柳田
智子 羽田
健人 鈴木
一郎 関矢
満 水野
尚子 片野
信武 大関
浩二 小田邉
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富士フイルム株式会社
国立大学法人 東京医科歯科大学
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    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme

Definitions

  • the present invention relates to a preservation solution for human stem cells containing human serum.
  • the present invention further relates to a human stem cell suspension containing human serum and a method for preserving human stem cells using human serum.
  • stem cells separated and collected from patient tissues are frequently used. Except for some treatments in which stem cells are collected from patients and then transplanted immediately, many autologous cell therapies are expanded in cell processing facilities to ensure the number of cells necessary to obtain a sufficient therapeutic effect . Thereafter, as soon as the necessary number of cells is obtained, the cells are transported to a medical institution for transplantation to the patient, and after arriving at the medical institution, they are immediately transplanted to the patient. Therefore, preservation of stem cells is a short period of time from transportation to arrival at a medical institution until transplantation is started.
  • Patent Document 1 includes at least a saccharide, a sodium ion, a potassium ion, a hydrogen carbonate ion and / or a carbonate ion, a phosphate ion, no glycerol, and sodium relative to the molar concentration of potassium ion.
  • a cell preservation solution for refrigerated storage is described that defines the molar concentration ratio of ions, the content of bicarbonate ions and / or carbonate ions, the type of saccharide, the osmotic pressure and the pH.
  • a cell preservation solution composed of various components is used in the method of preservation in a suspended state without freezing.
  • these components are administered together with the cells into the patient, and therefore components that do not exhibit toxicity or antigenicity must be selected.
  • transplantation when transplanting in a medical institution, cells are handled in a clean environment such as an operating room. Therefore, it is important to reduce the number of operations before transplantation as much as possible to maintain cleanliness. is there. Therefore, if transplantation can be performed without removing the cell preservation solution, it can contribute to maintaining high cleanliness.
  • An object of the present invention is to provide a human stem cell preservation solution, a human stem cell suspension, and a human stem cell preservation method capable of preserving human stem cells with high cell viability.
  • the present invention should further solve the problem of providing a human stem cell preservation solution, a human stem cell suspension, and a human stem cell preservation method that enable safe transplantation of human stem cells even in the presence of the preservation solution. It was an issue.
  • the present inventors have used at least human serum, and a preservation solution having a volume ratio of human serum to the whole preservation solution of 0.70 or more is used as a preservation solution for human stem cells. By doing so, it was found that human stem cells can be stored with high cell viability.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • a preservation solution for storing human stem cells which contains at least human serum, has a volume ratio of human serum to the whole preservation solution of 0.70 or more, and preserves human stem cells at a temperature higher than 0 ° C. liquid.
  • the preservation solution according to (1), wherein the human serum is human serum obtained by blood separation using beads coated with a blood coagulation promoting enzyme.
  • a human stem cell suspension comprising the preservation solution according to any one of (1) to (4) and human stem cells suspended in the preservation solution.
  • a method for preserving human stem cells comprising preserving a human stem cell suspension obtained by suspending human stem cells in the preservation solution according to any one of (1) to (4).
  • human stem cells can be preserved with a high cell viability, and further according to the present invention, patients can be operated without removing the preservation solution of human stem cells. Can be administered.
  • FIG. 1 shows the results of measuring cell viability.
  • FIG. 2 shows a microscopic observation image.
  • FIG. 3 shows the results of measuring cell viability.
  • FIG. 4 shows a crystal violet stained image.
  • FIG. 5 shows the appearance of the cartilage pellet.
  • FIG. 6 shows the histological evaluation of the cartilage pellet.
  • the human stem cell preservation solution of the present invention contains at least human serum, has a volume ratio of human serum to the whole preservation solution of 0.70 or more, and is a preservation solution for storing human stem cells at a temperature higher than 0 ° C. is there.
  • human stem cells when human stem cells are stored using a storage solution that contains human serum in the storage solution and the volume ratio of human serum to the whole storage solution is high (0.70 or more), the human stem cells are high.
  • the ability to preserve the cell viability and maintain the differentiation potential of human stem cells is a completely unexpected effect.
  • the preservation solution for human stem cells of the present invention is used to transport stem cells from a cell processing facility to a medical institution for transplantation, and to store stem cells for a short time from the arrival at the medical institution until the start of transplantation When performing, it can be used as a cell preservation solution for maintaining the survival rate of stem cells. Further, according to the preservation solution for human stem cells of the present invention, it is not necessary to remove the cell preservation solution when transplanting cells, and transplantation is possible even if the cell preservation solution is present.
  • a stem cell is a cell that has the ability to divide and make the same cell as itself (self-replicating ability) and the ability to differentiate into another type of cell, and can proliferate indefinitely.
  • Examples of stem cells include stem cells having pluripotency and stem cells having multipotency.
  • Pluripotency refers to the ability not to form an individual but to differentiate into all three germ layers (endoderm, mesoderm and ectoderm).
  • pluripotent stem cells embryonic stem cells (ES cells: embryonic stem cells), embryonic germ stem cells (EG cells: embryonic germ cells), nuclear transplanted ES cells (also called somatic cell-derived ES cells.
  • ES cells embryonic stem cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • nuclear transplanted ES cells also called somatic cell-derived ES cells.
  • NtES cells Examples include a nuclear transfer embryonic stem cell) and an induced pluripotent stem cell (iPS cell: induced pluripotent stem cell).
  • Multipotency refers to the ability to differentiate into various cell types, although the cell lines that can be differentiated are limited.
  • pluripotent stem cells include hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, and skin stem cells. It is known that mesenchymal stem cells can be obtained from various tissues such as bone marrow, adipose tissue, dental pulp, placenta tissue, umbilical cord tissue, and synovium.
  • human stem cells mesenchymal stem cells are preferable.
  • human stem cells include bone marrow-derived human stem cells, adipose-derived human stem cells, dental pulp-derived human stem cells, placenta-derived human stem cells, umbilical cord-derived human stem cells, and synovial membrane-derived human stem cells, and synovial membrane-derived human stem cells are particularly preferred.
  • Serum is a pale yellow liquid component that can be made into a supernatant when blood coagulates.
  • blood is obtained by coagulating blood (whole blood) and removing coagulation factors.
  • Plasma contains a clotting component, whereas serum has little or no clotting component.
  • human serum for example, human serum obtained by blood separation operation using beads coated with blood coagulation promoting enzyme can be used, but the method of collecting human serum is not particularly limited.
  • blood separation operation for example, fresh blood collected from a human is shaken at room temperature for 30 to 60 minutes in contact with beads coated with a blood coagulation-promoting enzyme, and then centrifuged to clot and serum. And a series of operations for recovering serum.
  • serum separated and prepared from blood collected from humans using a blood component separation bag dedicated to serum preparation can be used. It is not limited to this.
  • the volume ratio of human serum to the whole preservation solution is 0.70 or more.
  • the preservation solution of the present invention is a preservation solution for storing human stem cells at a temperature higher than 0 ° C. That is, the preservation solution of the present invention is a preservation solution for preserving human stem cells without freezing.
  • the temperature during storage is not particularly limited as long as it is higher than 0 ° C, but the upper limit of the temperature is generally 50 ° C or less.
  • the lower limit of the temperature is generally 1 ° C. or higher.
  • the temperature during storage is preferably 4 to 20 ° C., more preferably 4 to 15 ° C. among the above. In the present invention, good cell viability can be achieved by storing human stem cells at a temperature higher than 0 ° C.
  • the preservation solution of the present invention may contain, in addition to human serum, at least one selected from the group consisting of Japanese Pharmacopoeia Ringer's solution, Dulbecco's modified Eagle medium, alpha minimal essential medium and alpha modified Eagle medium.
  • the preservation solution of the present invention may further contain, for example, antibiotics, antibacterial agents, antioxidants, vitamins, proteins, amino acids, pH indicators, chelating agents and the like as appropriate.
  • a human stem cell suspension comprising the above-described preservation solution of the present invention and human stem cells suspended in the above preservation solution.
  • the method for suspending human stem cells in a preservation solution is not particularly limited, and can be performed by a conventional method.
  • a human stem cell suspension can be obtained by mixing and stirring human stem cells and a preservation solution.
  • the human stem cell suspension of the present invention can be directly administered to a patient when used for medical applications such as regenerative medicine. It is an advantage of the present invention that the human stem cell suspension of the present invention can be administered to a patient without removing the preservation solution.
  • the concentration of cells in the human stem cell suspension of the present invention can be appropriately set according to conditions such as cell type, cell use, cell size, and storage period, and is not particularly limited. It is about 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 10 cells / mL, preferably about 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 9 cells / mL.
  • human stem cells when suspended in a preservation solution may be passaged cells or non-passaged cells. When the cells are passaged, the number of passages is not particularly limited, but for example, once (passage1 ) To 9 times (passage 9), preferably 1 time (passage 1) to 5 times (passage 5), more preferably 1 time (passage 1) to 3 times (passage 3).
  • the present invention also relates to a method for preserving human stem cells using the preservation solution of the present invention. That is, according to the present invention, there is further provided a method for storing human stem cells, comprising storing a human stem cell suspension obtained by suspending human stem cells in the storage solution of the present invention.
  • the human stem cell suspension can be stored under conditions that do not freeze.
  • save is as above-mentioned in this specification, if it is higher than 0 degreeC, it will not specifically limit.
  • the upper limit of the temperature is generally 50 ° C. or lower, preferably 45 ° C. or lower, more preferably 40 ° C. or lower, still more preferably 37 ° C. or lower, further preferably 20 ° C. or lower, Especially preferably, it is 15 degrees C or less.
  • the lower limit of the temperature is generally 1 ° C. or higher, preferably 2 ° C. or higher, more preferably 4 ° C. or higher.
  • the temperature during storage is preferably 4 to 20 ° C., more preferably 4 to 15 ° C. among the above.
  • the storage period of human stem cells is not particularly limited, but is generally 5 minutes to 14 days, for example.
  • the storage container can be appropriately selected and used in consideration of the cell type, storage temperature, storage period, use of the cell after storage, and the like.
  • the storage container for example, a tube, a flask, an infusion bag, a cell culture bag, a syringe or the like can be used.
  • the human stem cells stored by the storage method of the present invention preferably have a high survival rate, colony forming ability and differentiation ability after storage.
  • the method for measuring the cell viability is not particularly limited.
  • the number of living cells can be determined by determining the number of living cells by using live / dead (registered trademark) assay kit (Logos Biosystems) according to the procedure described in the instruction manual. Viability can be assessed.
  • the cell viability When stored for 48 hours in a thermostat set at 4 ° C. by the storage method of the present invention, the cell viability is preferably 60% or more. When stored for 48 hours in a thermostat set at 13 ° C. by the storage method of the present invention, the cell viability is preferably 60% or more. When stored for 48 hours in a thermostat set at 37 ° C. according to the storage method of the present invention, the cell viability is preferably 40% or more.
  • the method for evaluating whether or not human stem cells have colony forming ability is not particularly limited, and can be evaluated by a conventional method. For example, cells after storage in a culture dish are seeded, and cultured in an appropriate medium (for example, ⁇ minimum essential medium containing antibiotics and fetal calf serum) at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for a predetermined period ( For example, after 14 days), staining is performed with a 1% crystal violet solution, and colony forming ability can be evaluated by observing whether colonies are formed.
  • an appropriate medium for example, ⁇ minimum essential medium containing antibiotics and fetal calf serum
  • the method for evaluating whether human stem cells have differentiation potential is not particularly limited, and can be evaluated by a conventional method.
  • the cells after storage are transferred to a tube, and TGF- ⁇ 3 (Transforming growth factor- ⁇ 3) (final concentration: 10 ng / ml, Miltenyi Biotec KK) and BMP2 (Bone Morphogenetic Protein-2) (final concentration: Culturing is performed in a cartilage differentiation medium containing 1 ⁇ g / ml (Medtronic).
  • the medium can be changed every 3 to 4 days, and cartilage differentiation ability can be evaluated by histological evaluation by observing a toluidine blue-stained image of the cartilage pellet 21 days after the start of culture.
  • Fresh blood was collected from three healthy volunteers, and serum was separated and collected using a blood component separation bag (CellAid (registered trademark), JMS Co., Ltd.). Specifically, the collected fresh blood was shaken at room temperature for 30 minutes in contact with beads coated with a blood coagulation promoting enzyme, and then separated into clot and serum by centrifugation. The separated serum was filtered through a 0.45 ⁇ m nylon filter (Thermo Fisher Scientific), then transferred to another storage bag and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • CellAid registered trademark
  • JMS Co., Ltd. Specifically, the collected fresh blood was shaken at room temperature for 30 minutes in contact with beads coated with a blood coagulation promoting enzyme, and then separated into clot and serum by centrifugation. The separated serum was filtered through a 0.45 ⁇ m nylon filter (Thermo Fisher Scientific), then transferred to another storage bag and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • Synovial-derived human stem cells Human synovial tissue was collected from 10 donors. The collected synovial tissue was immersed in a 3 mg / mL collagenase solution (Sigma-Aldrich) and digested at 37 ° C. for 3 hours. Thereafter, the solution after digestion reaction was passed through a cell strainer (pore size 70 ⁇ m, Greiner Bio-One) to obtain synovial cells. The obtained synovial cells were cultured in an ⁇ -minimum essential medium (Thermo Fisher Scientific) containing antibiotic-antimycotic (final concentration 1%, Thermo Fisher Scientific) and fetal bovine serum (final concentration 10%). Culturing was performed at 37 ° C. under two atmospheres. The number of cells was counted with Luna-FL (trade name) (Logos Biosystems).
  • Test Example 1 Confirmation of effect of preservation solution on cell survival rate
  • Synovial-derived human stem cells obtained by the method described in ⁇ Preparation of synovial-derived human stem cells> were treated with TrypLE (trade name) Select (Thermo Fisher). (Scientific). 2 ⁇ 10 6 synovial membrane-derived human stem cells were obtained by using 100 ⁇ l of human serum (preservation solution 1) obtained by the method described in ⁇ collecting human serum>, 100 ⁇ l of glucose-acetated Ringer's solution (KYOWA CritiCare) (preservation solution 2). And the cell suspension was stored in a storage tube (Sumitomo Bakelite).
  • the cell suspension stored in each preservation solution is stored for 48 hours in a thermostat set at 4 ° C., 13 ° C., and 37 ° C., respectively. did.
  • the cell viability of the cells after storage is determined using the live / dead (registered trademark) assay kit (Logos Biosystems) according to the procedure described in the instruction manual, and the cell viability before and after storage (%) Asked. Further, the cell morphology after storage was observed with a microscope.
  • FIG. 1 graph
  • FIG. 2 photo
  • the survival rate of cells stored in human serum of preservation solution 1 is 4 ° C, 13 ° C, and 37 ° C compared to Ringer's solution not containing human serum of preservation solution 2.
  • a significant difference was observed at 37 ° C.
  • FIG. 2 as a result of observing the morphology of the cells before and after storage, no change was observed in the morphology.
  • no viable cells were observed when the preservation solution 2 was stored at 37 ° C. for 48 hours.
  • Test Example 2 Confirmation of effect of preservation solution using bovine serum Synovial human stem cells (passage 2) obtained by the method described in ⁇ Preparation of synovial human stem cells> were treated with TrypLE (trade name) Select (Thermo). (Fisher Scientific). 1 ⁇ 10 5 synovial-derived human stem cells are suspended in 500 ⁇ l of ⁇ minimum essential medium (Gibco) (preservation solution 3) and 500 ⁇ l of fetal bovine serum (preservation solution 4), respectively, and the cell suspension is stored in a storage tube ( Sumitomo Bakelite).
  • ⁇ minimum essential medium Gibco
  • fetal bovine serum preservation solution 4
  • the cell suspension stored in each preservation solution was stored in a thermostat set at 18 ° C. for 3 days.
  • the cell viability of the cells after storage was determined using the live / dead (registered trademark) assay kit (Logos Biosystems) according to the procedure described in the instruction manual, and the cell viability (%) before and after storage. Asked.
  • FIG. 3 graph
  • the preservation solution 3 showed almost the same result as the cell viability after the preservation solution 2 (FIG. 1) was stored at 13 ° C. for 48 hours.
  • the survival rate of the cells preserved with fetal calf serum of preservation solution 4 was lower than that of preservation solution 3. From the results of Test Example 1 and Test Example 2, it was shown that it was important that the serum used for the cell preservation solution was human serum.
  • Test Example 3 Confirmation of Effect of Preservation Solution on Colony Forming Ability
  • Synovial human stem cells obtained by the method described in ⁇ Preparation of synovial human stem cells> are TrypLE (trade name) Select (Thermo Fisher). (Scientific). 2 ⁇ 10 6 synovial membrane-derived human stem cells were obtained by using 100 ⁇ l of human serum (preservation solution 1) obtained by the method described in ⁇ collecting human serum>, 100 ⁇ l of glucose-acetated Ringer's solution (KYOWA CritiCare) (preservation solution 2). And the cell suspension was stored in a storage tube (Sumitomo Bakelite).
  • the cell suspension stored in each preservation solution was stored for 48 hours in a thermostat set at 4 ° C., 13 ° C. and 37 ° C., respectively.
  • . 1 ⁇ 10 4 cells stored for 48 hours in a 60 cm 2 culture dish are seeded and ⁇ -minimum essential containing antibiotic-antimycotic (final concentration 1%, Thermo Fisher Scientific) and fetal bovine serum (final concentration 10%) Culturing was performed at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere in a medium (Thermo Fisher Scientific). 14 days after sowing, staining was performed with 1% crystal violet solution, and formed colonies were observed.
  • Test Example 4 Confirmation of Effect of Preservation Solution on Cartilage Differentiation Capability
  • Synovial human stem cells obtained by the method described in ⁇ Preparation of synovial human stem cells> were treated with TrypLE (trade name) Select (Thermo Fisher). (Scientific). 2 ⁇ 10 6 synovial membrane-derived human stem cells were obtained by using 100 ⁇ l of human serum (preservation solution 1) obtained by the method described in ⁇ collecting human serum>, 100 ⁇ l of glucose-acetated Ringer's solution (KYOWA CritiCare) (preservation solution 2). And the cell suspension was stored in a storage tube (Sumitomo Bakelite).
  • the cell suspension stored in each preservation solution was stored for 48 hours in a thermostat set at 4 ° C., 13 ° C. and 37 ° C., respectively. .
  • FIG. 5 (appearance) and FIG. 6 (histological observation image).
  • FIG. 5 a significant difference was observed in the size of the cartilage pellets prepared from the cells preserved with the human serum of the preservation solution 1 as compared with the Ringer's solution containing no human serum of the preservation solution 2.
  • it was the same size as the cartilage pellet produced from the cells before storage. From this, it was shown that preservation using the preservation solution 1 maintains the cartilage differentiation ability of the synovial human stem cells.
  • no cartilage pellet was formed regardless of the type of the storage solution.

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Abstract

本発明の課題は、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができる、ヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法を提供することである。本発明によれば、ヒト幹細胞の保存液であって、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上であり、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液が提供される。

Description

ヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法
　本発明は、ヒト血清を含むヒト幹細胞の保存液に関する。本発明はさらに、ヒト血清を含むヒト幹細胞懸濁液、およびヒト血清を用いるヒト幹細胞の保存方法に関する。
　近年、生きた細胞を患者へ移植して治療を行う再生医療が盛んになってきた。移植する細胞が治療効果を発揮するには、移植に用いる直前までその細胞の生存率を高く維持することが必要であり、そのため、細胞の活性を維持したまま保存する技術に関する研究が行われている。
　再生医療のうち、患者自身の細胞を用いる自家細胞治療においては、患者組織から分離および採取される幹細胞が頻用されている。患者より幹細胞を採取後に直ちに移植する一部の治療を除き、多くの自家細胞治療においては十分な治療効果を得るために必要な細胞数を確保するべく、細胞加工施設等で拡大培養が行われる。その後、必要な細胞数が得られ次第、患者へ移植するために医療機関へ輸送され、医療機関に到着後、直ちに患者へ移植される。そのため、幹細胞の保存は、輸送中および医療機関に到着してから移植が開始されるまでの短い時間となる。
　細胞を短時間保存する方法としては、凍結を行わずに懸濁状態で保存する方法が知られている。例えば、特許文献１には、少なくとも糖類と、ナトリウムイオンと、カリウムイオンと、炭酸水素イオンおよび／または炭酸イオンと、リン酸イオンを含有し、グリセロールを含有せず、カリウムイオンのモル濃度に対するナトリウムイオンのモル濃度の比、炭酸水素イオンおよび／または炭酸イオンの含有量、糖類の種類、浸透圧およびｐＨを規定した冷蔵保存用細胞保存液が記載されている。
特許第４９４７９４８号公報
　上記した通り、凍結を行わずに懸濁状態で保存する方法においては、多種の成分から成る細胞保存液が用いられている。保存液にて保存した細胞を患者に移植する際、これらの成分が細胞と共に患者体内へ投与されるため、毒性や抗原性を示さない成分を選択しなければならない。
　また、医療機関での移植に際しては、手術室等での清潔な環境にて細胞を取り扱うことから、可能な限り、移植前の作業数を少なくすることが清潔度を維持するためにも重要である。そのため、細胞保存液を除去することなく、移植を行うことができれば、高い清潔度を維持することに貢献できる。
　本発明は、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができる、ヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、保存液が存在していても安全にヒト幹細胞を移植することを可能とするヒト幹細胞の保存液、ヒト幹細胞懸濁液およびヒト幹細胞の保存方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上である保存液をヒト幹細胞の保存液として使用することによって、ヒト幹細胞を、高い細胞生存率で保存できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　ヒト幹細胞の保存液であって、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上であり、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液。
（２）　ヒト血清が、血液凝固促進酵素をコートしたビーズを用いた血液分離操作により得られるヒト血清である、（１）に記載の保存液。
（３）　さらに、日本薬局方リンゲル液、ダルベッコ改変イーグル培地、アルファ最小必須培地およびアルファ改変イーグル培地から成る群より選ばれる少なくとも一以上を含む、（１）または（２）に記載の保存液。
（４）　ヒト幹細胞が、滑膜由来のヒト幹細胞である、（１）から（３）のいずれか一に記載の保存液。
（５）　（１）から（４）の何れか一に記載の保存液と、上記保存液に懸濁されたヒト幹細胞とを含む、ヒト幹細胞懸濁液。
（６）　ヒト幹細胞懸濁液が患者に直接投与される、（５）に記載のヒト幹細胞懸濁液。
（７）　（１）から（４）のいずれか一に記載の保存液にヒト幹細胞を懸濁することにより得られるヒト幹細胞懸濁液を保存することを含む、ヒト幹細胞の保存方法。
（８）　ヒト幹細胞懸濁液を４～２０℃の温度で保存する、（７）に記載の保存方法。
　本発明の保存液、幹細胞懸濁液および保存方法によれば、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができ、さらに本発明によれば、ヒト幹細胞の保存液を除去する操作なしに患者へ投与することができる。
図１は、細胞生存率を測定した結果を示す。 図２は、顕微鏡観察像を示す。 図３は、細胞生存率を測定した結果を示す。 図４は、クリスタルバイオレット染色像を示す 図５は、軟骨ペレットの外観を示す。 図６は、軟骨ペレットの組織学的評価を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明のヒト幹細胞の保存液は、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上であり、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液である。
　細胞の凍結保存のための細胞保存液に血清（ウシ胎児血清が頻用）を添加することは知られている。これに対し、本発明においては、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するという条件（即ち、細胞を凍結しない条件）においてヒト幹細胞を保存するために用いる保存液として、ウシ胎児血清ではなく、ヒト血清を用いることによって、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができ、ヒト幹細胞の分化能を維持できることが示された。
　なお、血清を添加した培地を用いて細胞を培養することも周知である。細胞培養が始まった頃には細胞と同種の血清がよいという理由からヒト細胞の培地にヒト血清を添加することも行われていたが、その後、ウシ胎児血清の方が良好な増殖を示すことなどから、ヒト血清は培地成分としてはあまり使用されていない（細胞培養なるほどＱ＆Ａ、第９２頁、２００４年、羊土社）。また、血清（ヒト血清、ウシ血清など）には、種々の細胞増殖促進物質、細胞障害保護因子および栄養因子などが含まれているが、上記以外にも細胞増殖阻害因子、分化促進因子および補体等が含まれており、これらの因子が細胞に障害を与えることも知られている（細胞培養なるほどＱ＆Ａ、第８８頁及び第９０頁、２００４年、羊土社）。上記のことからも、保存液にヒト血清を含み、さらに、保存液全体に対するヒト血清の体積比が高い（０．７０以上）保存液を用いてヒト幹細胞を保存した場合に、ヒト幹細胞を高い細胞生存率で保存することができ、かつヒト幹細胞の分化能を維持できたことは全く予想外な効果である。
　本発明のヒト幹細胞の保存液は、再生医療分野において、細胞加工施設から移植を行う医療機関への輸送、並びに医療機関に到着してから移植が開始されるまでの短時間の幹細胞の保存を行う場合において、幹細胞の生存率を維持するための細胞保存液として利用可能である。また、本発明のヒト幹細胞の保存液によれば、細胞を移植する際に細胞保存液を除く作業を必要とせず、細胞保存液が存在していても移植が可能である。
　幹細胞とは、分裂して自分と同じ細胞を作る能力（自己複製能）と、別の種類の細胞に分化する能力とを有し、際限なく増殖できる細胞である。
　幹細胞としては、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞、および多分化能　（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞を挙げることができる。
　多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）とは、個体は形成しないが、三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞系列の全てに分化し得る能力を指す。多能性を有する幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ）、核移植ＥＳ細胞（体細胞由来ＥＳ細胞とも言う。ｎｔＥＳ細胞：ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）などを挙げることができる。
　多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）とは、分化可能な細胞系列が限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力を指す。多分化能を有する幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、および皮膚幹細胞などを挙げることができる。間葉系幹細胞は，骨髄、脂肪組織、歯髄、胎盤組織、さい帯組織、滑膜などの種々の組織から取得できることが知られている。
　ヒト幹細胞としては、間葉系幹細胞が好ましい。
　ヒト幹細胞としては、例えば、骨髄由来ヒト幹細胞、脂肪由来ヒト幹細胞、歯髄由来ヒト幹細胞、胎盤由来ヒト幹細胞、さい帯由来ヒト幹細胞および滑膜由来ヒト幹細胞が挙げられ、滑膜由来ヒト幹細胞が特に好ましい。
　血清とは、血液が凝固した際に上澄みにできる淡黄色の液体成分であり、換言すれば血液（全血）を凝固させ凝固因子を除いたものである。血漿が凝固成分を含むのに対して、血清は凝固成分をほとんど含まないか、含んだとしても少量のものを指す。
　ヒト血清としては、例えば、血液凝固促進酵素をコートしたビーズを用いた血液分離操作により得られるヒト血清を用いることができるが、ヒト血清の採取方法は特には限定されない。
　血液分離操作としては、例えば、ヒトより採取した新鮮な血液を、血液凝固促進酵素がコートされたビーズと接触させながら室温にて３０～６０分間振とうし、次いで、遠心分離により血餅と血清に分離、その後、血清を回収する一連の操作が挙げられる。ヒト血清の調製手段として、ヒトより採取した血液から血清調製専用血液成分分離バッグ（セルエイド（登録商標）、株式会社ジェイ・エム・エス）を用いて分離および調製した血清を用いることができるが、これに限定されない。
　本発明の保存液においては、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上である。保存液全体に対するヒト血清の体積比を上記の通りにすることにより、良好な細胞生存率を達成することができる。
　本発明の保存液は、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液である。即ち、本発明の保存液は、ヒト幹細胞を凍結しない状態で保存するための保存液である。保存する際の温度は、０℃より高ければ特に限定されないが、温度の上限は、一般的には５０℃以下である。温度の下限は、一般的には１℃以上である。保存する際の温度は、上記の中でも好ましくは４～２０℃であり、より好ましくは４～１５℃である。本発明においては、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存することにより、良好な細胞生存率を達成することができる。
　本発明の保存液は、ヒト血清のほかに、日本薬局方リンゲル液、ダルベッコ改変イーグル培地、アルファ最小必須培地およびアルファ改変イーグル培地から成る群より選ばれる少なくとも一以上を含んでいてもよい。
　本発明の保存液にはさらに、例えば抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、ビタミン、タンパク質、アミノ酸、ｐＨ指示薬、キレート剤等を適宜含有させることもできる。
　本発明によれば、上記した本発明の保存液と、上記保存液に懸濁されたヒト幹細胞とを含む、ヒト幹細胞懸濁液が提供される。
　ヒト幹細胞を保存液に懸濁する方法は特に限定されず、常法により行うことができる。例えば、ヒト幹細胞と保存液とを混合して撹拌することによりヒト幹細胞懸濁液を得ることができる。
　本発明のヒト幹細胞懸濁液は、再生医療などの医療用途に使用する場合、患者に直接投与することができる。本発明のヒト幹細胞懸濁液は保存液を除去することなく、患者に投与することができることは本発明の利点の一つである。
　本発明のヒト幹細胞懸濁液における細胞の濃度は、細胞の種類、細胞の用途、細胞の大きさ、および保存期間等の条件に応じて適宜設定することができ、特に限定されないが、例えば、１．０×１０4～１．０×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度であり、好ましくは１．０×１０5～１．０×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度である。また、保存液に懸濁する際のヒト幹細胞は、継代した細胞でも継代していない細胞でもよく、継代した細胞である場合、継代数は特に限定されないが、例えば、１回（ｐａｓｓａｇｅ１）～９回（ｐａｓｓａｇｅ９）、好ましくは１回（ｐａｓｓａｇｅ１）～５回（ｐａｓｓａｇｅ５）、より好ましくは１回（ｐａｓｓａｇｅ１）～３回（ｐａｓｓａｇｅ３）である。
　本発明は、本発明の保存液を用いたヒト幹細胞の保存方法にも関する。即ち、本発明によればさらに、本発明の保存液にヒト幹細胞を懸濁することにより得られるヒト幹細胞懸濁液を保存することを含む、ヒト幹細胞の保存方法が提供される。
　保存の方法としては、ヒト幹細胞懸濁液を凍結させない条件で保存することができる。保存する際の温度は、本明細書中において上記した通りであるが、０℃より高ければ特に限定されない。温度の上限は、一般的には５０℃以下であり、好ましくは４５℃以下であり、より好ましくは４０℃以下であり、さらに好ましくは３７℃以下であり、さらに好ましくは２０℃以下であり、特に好ましくは１５℃以下である。温度の下限は、一般的には１℃以上であり、好ましくは２℃以上であり、より好ましくは４℃以上である。保存する際の温度は、上記の中でも好ましくは４～２０℃であり、より好ましくは４～１５℃である。
  本発明においてヒト幹細胞の保存期間は、特に限定されないが、一般的には、例えば５分～１４日間である。
　また保存容器は、細胞の種類、保存温度、保存期間、保存後の細胞の用途等を考慮して、適宜選択して用いることができる。保存容器としては、例えば、チューブ、フラスコ、輸液バッグ、細胞培養用バッグ、シリンジ等を用いることができる。
  本発明の保存方法により保存したヒト幹細胞は、保存後において、高い生存率、コロニー形成能および分化能を有していることが好ましい。
　細胞の生存率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ（登録商標）ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｌｏｇｏｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、取扱説明書の記載の手順に従って生細胞数を求めることにより細胞の生存率を評価することができる。
　本発明の保存方法により４℃に設定した恒温機内にて４８時間保存した場合において、細胞の生存率は好ましくは６０％以上である。
　本発明の保存方法により１３℃に設定した恒温機内にて４８時間保存した場合において、細胞の生存率は好ましくは６０％以上である。
　本発明の保存方法により３７℃に設定した恒温機内にて４８時間保存した場合において、細胞の生存率は好ましくは４０％以上である。
　ヒト幹細胞がコロニー形成能を有しているかどうかの評価方法は特に限定されず、常法により評価することができる。例えば、培養ディッシュに保存後の細胞を播種し、適当な培地（例えば、抗生物質およびウシ胎児血清を含むα最小必須培地）において５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて培養を所定の期間（例えば、１４日後）行い、１％クリスタルバイオレット液にて染色を行い、コロニーが形成されるかどうかを観察することにより、コロニー形成能を評価することができる。
　ヒト幹細胞が分化能を有しているかどうかの評価方法は特に限定されず、常法により評価することができる。例えば、保存後の細胞をチューブへ移し、ＴＧＦ－β３（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β３）（終濃度：１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　Ｋ．Ｋ．社）およびＢＭＰ２（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ－２）（終濃度：１μｇ／ｍｌ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社）を含む軟骨分化培地にて培養する。培地は３～４日毎に変え、培養開始２１日後に軟骨ペレットのトルイジンブルー染色像の観察によって組織学的評価を行うことにより、軟骨分化能を評価することができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
＜ヒト血清の採取＞
　新鮮な血液を３名の健常人ボランティアより採取し、血液成分分離バック（セルエイド（登録商標）、株式会社ジェイ・エム・エス）を用いて血清を分離および回収した。具体的には、採取した新鮮な血液を、血液凝固促進酵素がコートされたビーズと接触させながら室温にて３０分間振とうし、その後、遠心分離により血餅と血清に分離した。分離した血清は０．４５μｍのナイロン製フィルター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にてフィルターろ過し、その後、別の保存バックへ移した後、使用まで－２０℃にて保管した。
　セルエイド（登録商標）の使用方法は製造販売元が発行する添付文書（第1版、添付文書管理番号12890Z01）を参照した。
＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞
　ヒト滑膜組織を１０名のドナーより採取した。採取した滑膜組織は３ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に浸し、３７℃で３時間消化させた。その後、消化反応後液をセルストレイナー（孔径７０μｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社）に通し、滑膜細胞を得た。得られた滑膜細胞を、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（終濃度１％、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびウシ胎児血清（終濃度１０％）を含むα最小必須培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて培養を行った。細胞数はＬｕｎａ－ＦＬ（商品名）（Ｌｏｇｏｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にてカウントした。
試験例１：細胞生存率に対する保存液の影響の確認
　＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞に記載の方法にて得た滑膜由来ヒト幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ２）を、ＴｒｙｐＬＥ（商品名）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収した。２×１０6個の滑膜由来ヒト幹細胞を、＜ヒト血清の採取＞に記載の方法にて得たヒト血清１００μｌ（保存液１）、グルコース加酢酸リンゲル液（ＫＹＯＷＡ　ＣｒｉｔｉＣａｒｅ社）１００μｌ（保存液２）にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液を保存チューブ（住友ベークライト社）に入れ保存した。
　保存液１および保存液２の細胞生存率に対する影響を確認するため、各保存液に保存した細胞懸濁液を、４℃、１３℃、および３７℃にそれぞれ設定した恒温機内にて４８時間保存した。保存後の細胞の細胞生存率は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ(登録商標)ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｌｏｇｏｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、取扱説明書の記載の手順に従って生細胞数を求め、保存前後の細胞生存率（％）を求めた。また、保存後の細胞形態を顕微鏡にて観察した。
　結果を図１（グラフ）、図２（写真）に示した。
　図１に示す通り、保存液１のヒト血清にて保存した細胞の生存率は、保存液２のヒト血清を含まないリンゲル液に比べ、４℃、１３℃、および３７℃のいずれの温度条件においても生存率が高い結果となった。特に、３７℃では顕著な差が観察された。
　図２に示す通り、保存前後の細胞の形態を観察した結果、いずれも形態には変化は見られなかった。また、図１の結果と同様、保存液２を用いて３７℃にて４８時間保存した場合では生細胞は観察されなかった。
試験例２：ウシ血清を用いた保存液の影響の確認
　＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞に記載の方法にて得た滑膜由来ヒト幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ２）を、ＴｒｙｐＬＥ（商品名）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収した。１×１０5個の滑膜由来ヒト幹細胞を、α最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ社）５００μｌ（保存液３）およびウシ胎児血清５００μｌ（保存液４）にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液を保存チューブ（住友ベークライト社）に入れ保存した。
　保存液３および保存液４の細胞生存率に対する影響を確認するため、各保存液に保存した細胞懸濁液を、１８℃に設定した恒温機内にて３日間保存した。保存後の細胞の細胞生存率は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ（登録商標）ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｌｏｇｏｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、取扱説明書の記載の手順に従って生細胞数を求め、保存前後の細胞生存率（％）を求めた。
　結果を図３（グラフ）に示した。
　保存液３は、保存液２（図１）の１３℃４８時間保存後の細胞生存率とほぼ同等の結果を示した。一方、保存液４のウシ胎児血清で保存した細胞の生存率は、保存液３に比べ、低値であった。
　試験例１および試験例２の結果から、細胞保存液に用いる血清は、ヒト血清であることが重要であることが示された。
試験例３：コロニー形成能に対する保存液の影響の確認
　＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞に記載の方法にて得た滑膜由来ヒト幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ２）を、ＴｒｙｐＬＥ（商品名）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収した。２×１０6個の滑膜由来ヒト幹細胞を、＜ヒト血清の採取＞に記載の方法にて得たヒト血清１００μｌ（保存液１）、グルコース加酢酸リンゲル液（ＫＹＯＷＡ　ＣｒｉｔｉＣａｒｅ社）１００μｌ（保存液２）にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液を保存チューブ（住友ベークライト社）に入れ保存した。
　保存液１および保存液２のコロニー形成能に対する影響を確認するため、各保存液に保存した細胞懸濁液を、４℃、１３℃および３７℃にそれぞれ設定した恒温機内にて４８時間保存した。６０ｃｍ2の培養ディッシュに４８時間保存後の細胞を１×１０4個播種し、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（終濃度１％、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびウシ胎児血清（終濃度１０％）を含むα最小必須培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃にて培養を行った。播種１４日後、１％クリスタルバイオレット液にて染色を行い、形成されたコロニーを観察した。
　クリスタルバイオレット染色像を図４に示した。
　保存液１のヒト血清中に保存したグループではいずれもコロニー形成が観察された。保存液２のグループでは３７℃にて４８時間保存したものはコロニーが観察されなかった。
試験例４：軟骨分化能に対する保存液の影響の確認
　＜滑膜由来ヒト幹細胞の調製＞に記載の方法にて得た滑膜由来ヒト幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ２）を、ＴｒｙｐＬＥ（商品名）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて回収した。２×１０6個の滑膜由来ヒト幹細胞を、＜ヒト血清の採取＞に記載の方法にて得たヒト血清１００μｌ（保存液１）、グルコース加酢酸リンゲル液（ＫＹＯＷＡ　ＣｒｉｔｉＣａｒｅ社）１００μｌ（保存液２）にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液を保存チューブ（住友ベークライト社）に入れ保存した。
　保存液１および保存液２の軟骨分化能に対する影響を確認するため、各保存液に保存した細胞懸濁液を、４℃、１３℃および３７℃にそれぞれ設定した恒温機内にて４８時間保存した。
　２．５×１０5個の４８時間保存後の細胞を１５ｍｌチューブ（ＢＤ社）へ移し、ＴＧＦ－β３（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β３）（終濃度：１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　Ｋ．Ｋ．社）およびＢＭＰ２（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ－２）（終濃度：１μｇ／ｍｌ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社）を含む軟骨分化培地にて培養した。培地は３～４日毎に変え、培養開始２１日後に軟骨ペレットのトルイジンブルー染色像の観察によって組織学的評価を行った。
　結果を図５（外観）および図６（組織学的観察像）に示した。
　図５に示す通り、保存液１のヒト血清にて保存した細胞より作製した軟骨ペレットは、保存液２のヒト血清を含まないリンゲル液に比べ、その大きさに顕著な差が観察された。また、保存前の細胞から作製した軟骨ペレットと同様の大きさであった。このことから、保存液１を用いた保存では滑膜由来ヒト幹細胞の軟骨分化能が維持されることが示された。一方、３７℃での保存においては保存液の種類に拘わらず、軟骨ペレットの形成は見られなかった。
　図６に示す通り、保存液１のヒト血清にて保存した細胞より作製した軟骨ペレットは、保存液２のヒト血清を含まないリンゲル液に比べ、その染色像に顕著な差が観察された。トルイジンブルー染色は軟骨ペレットが産生する基質の程度を評価する方法であるが、この結果から、保存液１で保存した細胞は軟骨形成能に加え、基質産生能も維持することが示された。

Claims (8)

  1. ヒト幹細胞の保存液であって、少なくともヒト血清を含有し、保存液全体に対するヒト血清の体積比が０．７０以上であり、ヒト幹細胞を０℃より高い温度で保存するための保存液。
  2. ヒト血清が、血液凝固促進酵素をコートしたビーズを用いた血液分離操作により得られるヒト血清である、請求項１に記載の保存液。
  3. さらに、日本薬局方リンゲル液、ダルベッコ改変イーグル培地、アルファ最小必須培地およびアルファ改変イーグル培地から成る群より選ばれる少なくとも一以上を含む、請求項１または２に記載の保存液。
  4. ヒト幹細胞が、滑膜由来のヒト幹細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の保存液。
  5. 請求項１から４の何れか一項に記載の保存液と、前記保存液に懸濁されたヒト幹細胞とを含む、ヒト幹細胞懸濁液。
  6. ヒト幹細胞懸濁液が患者に直接投与される、請求項５に記載のヒト幹細胞懸濁液。
  7. 請求項１から４のいずれか一項に記載の保存液にヒト幹細胞を懸濁することにより得られるヒト幹細胞懸濁液を保存することを含む、ヒト幹細胞の保存方法。
  8. ヒト幹細胞懸濁液を４～２０℃の温度で保存する、請求項７に記載の保存方法。
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