JP2022166249A - ヒト胎盤灌流液由来の血管形成細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞から血管形成細胞又は血管細胞を、例えば、胎盤灌流液から全有核細胞を生成する方法を提供する。【解決手段】心臓又は血管不全、疾患、障害若しくは病状を有する患者を処置する方法であり、該方法は、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、或いは胎盤灌流液若しくは灌流液細胞と胎盤若しくは非胎盤造血幹細胞又は付着胎盤幹細胞との組合せを、前記患者に投与するステップを含む。【選択図】なし
Description
本発明は、単離胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞集団、該灌流液又は灌流液細胞を含む組成
物並びに、血管形成細胞及び血管形成細胞集団を生成し、且つ心臓又は血管疾患、障害若
しくは不全を有する患者を処置するために胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を用いる方法に
関する。
物並びに、血管形成細胞及び血管形成細胞集団を生成し、且つ心臓又は血管疾患、障害若
しくは不全を有する患者を処置するために胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を用いる方法に
関する。
ヒト幹細胞は、様々な成熟ヒト細胞系統を発生させることができる全能性又は多能性前
駆細胞である。幹細胞はすべてではないとしても多くの組織に再配置させ、且つ生理的及
び解剖的機能性を回復させるために用いられ得るということを実証する根拠が存在する。
駆細胞である。幹細胞はすべてではないとしても多くの組織に再配置させ、且つ生理的及
び解剖的機能性を回復させるために用いられ得るということを実証する根拠が存在する。
多くの異なるタイプの哺乳動物幹細胞が特徴付けられている。例えば、カプランら米国
特許第5,486,359号(ヒト間葉幹細胞);Boyseら、米国特許第5,004,6
81号(胎児及び新生児造血幹細胞及び前駆細胞);Boyseら、米国特許第5,192,
553号(同);Beltrami et al, Cell 114(6):763-766 (2003)(心臓幹細胞);Forbes
et al, J. Pathol. 197(4):510-518 (2002)(肝幹細胞)を参照されたい。臍帯血及び臍
帯血由来の全有核細胞は、切除治療を受けた患者における造血機能を部分的又は完全に回
復させるために移植において用いられている。胎盤灌流液は、灌流溶液の胎盤血管系の通
過によって得られる胎盤細胞の回収及び血管系、胎盤の母体面若しくはその両方からの灌
流流体の回収を含む。哺乳動物胎盤を灌流する方法は、例えば、米国特許第7,045,
146号及び米国特許第7,255,879号に述べられている。灌流によって得られる
胎盤細胞集団は異質性であり、特に、CD34+細胞、有核細胞、例えば、顆粒球、単球
及びマクロファージ、わずかな割合(1%未満)の組織培養基質-付着胎盤幹細胞を含む
。血管形成細胞の生成における胎盤灌流液又は該灌流液由来胎盤細胞集団の使用について
は、これまで述べられたことがない。
特許第5,486,359号(ヒト間葉幹細胞);Boyseら、米国特許第5,004,6
81号(胎児及び新生児造血幹細胞及び前駆細胞);Boyseら、米国特許第5,192,
553号(同);Beltrami et al, Cell 114(6):763-766 (2003)(心臓幹細胞);Forbes
et al, J. Pathol. 197(4):510-518 (2002)(肝幹細胞)を参照されたい。臍帯血及び臍
帯血由来の全有核細胞は、切除治療を受けた患者における造血機能を部分的又は完全に回
復させるために移植において用いられている。胎盤灌流液は、灌流溶液の胎盤血管系の通
過によって得られる胎盤細胞の回収及び血管系、胎盤の母体面若しくはその両方からの灌
流流体の回収を含む。哺乳動物胎盤を灌流する方法は、例えば、米国特許第7,045,
146号及び米国特許第7,255,879号に述べられている。灌流によって得られる
胎盤細胞集団は異質性であり、特に、CD34+細胞、有核細胞、例えば、顆粒球、単球
及びマクロファージ、わずかな割合(1%未満)の組織培養基質-付着胎盤幹細胞を含む
。血管形成細胞の生成における胎盤灌流液又は該灌流液由来胎盤細胞集団の使用について
は、これまで述べられたことがない。
Beltrami et al, Cell 114(6):763-766 (2003)
Forbes et al, J. Pathol. 197(4):510-518 (2002)
本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞から血管形成細胞又は血管
細胞を、例えば、胎盤灌流液から全有核細胞を生成する方法である。
細胞を、例えば、胎盤灌流液から全有核細胞を生成する方法である。
一態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、血管系を形成する能力を有する血管
形成細胞又は血管細胞を生成する方法であり、該方法は、胎盤灌流液又は灌流液細胞を、
複数の前記細胞が血管又は心臓系の細胞、例えば、血管細胞、例えば、内皮細胞又は心臓
細胞に分化する条件下で培養するステップを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流
液又は前記胎盤灌流液細胞は、造血胎盤幹細胞、例えば、CD34+胎盤細胞を含む。本
明細書で用いられるように、「CD34+胎盤細胞」という用語は、CD34+細胞、例
えば、胎盤血又は臍帯血からではなく胎盤から得られる内皮前駆細胞を指す。別の具体的
な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞、例えば、前記CD34+胎盤幹細胞は、臍帯血由
来の同等数のCD34+細胞より高いレベルでの量の1つ又はそれ以上の血管形成関連マ
ーカーを生成する。具体的な実施形態では、前記マーカーは、CD31、VEGF-R及
び/又はCXCR4を含む。具体的な実施形態では、前記胎盤CD34+細胞はCD45
-である。より具体的な実施形態では、前記CD34+,CD45-細胞は、臍帯血由来
の同等数のCD34+細胞より高いレベルでの量の1つ又はそれ以上の血管形成関連マー
カーを生成する。具体的な実施形態では、前記マーカーは、CD31、VEGF-R及び
/又はCXCR4を含む。別の具体的な実施形態では、前記培養は、前記灌流液細胞、例
えば、前記CD34+胎盤細胞を形質転換増殖因子β(TGF-β)、線維芽細胞増殖因
子(FGF)、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)及び1つ
若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼに接触させるステップを含む。より具
体的な実施形態では、前記培養は18~24時間である。別のより具体的な実施形態では
、前記細胞は前記接触の24時間後に視認可能な血管構造を形成する。より具体的な実施
形態では、前記接触は前記細胞が24時間後に視認可能な血管構造を形成する条件下にあ
り、臍帯血由来CD34+幹細胞は視認可能な血管構造を形成せず、又は前記灌流液細胞
若しくはCD34+胎盤細胞より少ない血管構造を検出可能に形成する。別の具体的な実
施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触
はインビボにて行われる。より具体的な実施形態では、前記インビボ接触は哺乳動物にお
いて行われる。より具体的な実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。一部の実施形態
では、本明細書で述べられるCD34+細胞又はCD34+細胞集団は増殖する。
形成細胞又は血管細胞を生成する方法であり、該方法は、胎盤灌流液又は灌流液細胞を、
複数の前記細胞が血管又は心臓系の細胞、例えば、血管細胞、例えば、内皮細胞又は心臓
細胞に分化する条件下で培養するステップを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流
液又は前記胎盤灌流液細胞は、造血胎盤幹細胞、例えば、CD34+胎盤細胞を含む。本
明細書で用いられるように、「CD34+胎盤細胞」という用語は、CD34+細胞、例
えば、胎盤血又は臍帯血からではなく胎盤から得られる内皮前駆細胞を指す。別の具体的
な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞、例えば、前記CD34+胎盤幹細胞は、臍帯血由
来の同等数のCD34+細胞より高いレベルでの量の1つ又はそれ以上の血管形成関連マ
ーカーを生成する。具体的な実施形態では、前記マーカーは、CD31、VEGF-R及
び/又はCXCR4を含む。具体的な実施形態では、前記胎盤CD34+細胞はCD45
-である。より具体的な実施形態では、前記CD34+,CD45-細胞は、臍帯血由来
の同等数のCD34+細胞より高いレベルでの量の1つ又はそれ以上の血管形成関連マー
カーを生成する。具体的な実施形態では、前記マーカーは、CD31、VEGF-R及び
/又はCXCR4を含む。別の具体的な実施形態では、前記培養は、前記灌流液細胞、例
えば、前記CD34+胎盤細胞を形質転換増殖因子β(TGF-β)、線維芽細胞増殖因
子(FGF)、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)及び1つ
若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼに接触させるステップを含む。より具
体的な実施形態では、前記培養は18~24時間である。別のより具体的な実施形態では
、前記細胞は前記接触の24時間後に視認可能な血管構造を形成する。より具体的な実施
形態では、前記接触は前記細胞が24時間後に視認可能な血管構造を形成する条件下にあ
り、臍帯血由来CD34+幹細胞は視認可能な血管構造を形成せず、又は前記灌流液細胞
若しくはCD34+胎盤細胞より少ない血管構造を検出可能に形成する。別の具体的な実
施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触
はインビボにて行われる。より具体的な実施形態では、前記インビボ接触は哺乳動物にお
いて行われる。より具体的な実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。一部の実施形態
では、本明細書で述べられるCD34+細胞又はCD34+細胞集団は増殖する。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液細胞集団から血管を形成
する方法であり、該方法は、前記細胞集団を、血管形成を促進する条件に接触させるステ
ップを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は胎盤灌流液由来の全有核
細胞である。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体
的な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記
胎盤灌流液細胞集団は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的
な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞はCD34+細胞である。より具体的な実施形態で
は、前記CD34+細胞はCD34+CD45-細胞である。より具体的な実施形態では
、前記CD34+細胞又はCD34+CD45-細胞は、CD31、CXCR4又はVE
GFRの少なくとも1つを臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルで発現す
る。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない
単離CD34+細胞(例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などから単離される単離C
D34+細胞)を含む。より具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は胎盤から単離
される。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢
血又は骨髄から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯
血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFR
を発現する。別の具体的な実施形態では、前記CD34+細胞はCD34+,CD45-
細胞である。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+,CD45-細胞は臍帯血
由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFRを
発現する。
する方法であり、該方法は、前記細胞集団を、血管形成を促進する条件に接触させるステ
ップを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は胎盤灌流液由来の全有核
細胞である。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体
的な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記
胎盤灌流液細胞集団は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的
な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞はCD34+細胞である。より具体的な実施形態で
は、前記CD34+細胞はCD34+CD45-細胞である。より具体的な実施形態では
、前記CD34+細胞又はCD34+CD45-細胞は、CD31、CXCR4又はVE
GFRの少なくとも1つを臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルで発現す
る。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない
単離CD34+細胞(例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などから単離される単離C
D34+細胞)を含む。より具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は胎盤から単離
される。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢
血又は骨髄から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯
血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFR
を発現する。別の具体的な実施形態では、前記CD34+細胞はCD34+,CD45-
細胞である。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+,CD45-細胞は臍帯血
由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFRを
発現する。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、患者における血管形成又は血管形
成を促進することによって心臓又は血管不全若しくは障害を有する患者を処置する方法で
あり、該方法は、心臓又は血管不全の1つ又はそれ以上の症状の検出可能な改善又は悪化
の低下を生じさせるのに十分な量にて、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を患者に投与する
ステップを含む。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は移植可能又は
注入可能な組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液
細胞は本明細書で提供される組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流
液又は胎盤灌流液細胞は、複数のCD34+胎盤細胞、胎盤付着細胞又はその両方が補充
される。
成を促進することによって心臓又は血管不全若しくは障害を有する患者を処置する方法で
あり、該方法は、心臓又は血管不全の1つ又はそれ以上の症状の検出可能な改善又は悪化
の低下を生じさせるのに十分な量にて、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を患者に投与する
ステップを含む。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は移植可能又は
注入可能な組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液
細胞は本明細書で提供される組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流
液又は胎盤灌流液細胞は、複数のCD34+胎盤細胞、胎盤付着細胞又はその両方が補充
される。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、心臓又は血管疾患、障害、病状若しく
は不全を有する患者を処置する方法であり、該方法は、前記疾患、障害、病状又は不全を
処置するのに十分な量にて前記患者にヒト胎盤灌流液細胞を投与するステップを含む。具
体的な実施形態では、前記疾患、障害、病状又は不全は、末梢血管疾患、急性若しくは慢
性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈
疾患又はリウマチ性心疾患である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は胎
盤灌流液由来の全有核細胞である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団
は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前
記胎盤灌流液細胞はCD34+細胞である。より具体的な実施形態では、前記CD34+
細胞はCD34+CD45-細胞である。より具体的な実施形態では、前記CD34+細
胞又はCD34+CD45-細胞は、CD31、CXCR4又はVEGFRの少なくとも
1つを臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルで発現する。別の具体的な実
施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない単離CD34+細胞
を含む。より具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は胎盤から単離される。別のよ
り具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から
単離される。別のより具体的な実施形態では、CD34+細胞はCD45-細胞である。
別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞又は前記CD34+CD45-細胞
は臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVE
GFRを発現する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は足場又はマトリク
ス上にて投与される。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は静脈内投与され
る。
は不全を有する患者を処置する方法であり、該方法は、前記疾患、障害、病状又は不全を
処置するのに十分な量にて前記患者にヒト胎盤灌流液細胞を投与するステップを含む。具
体的な実施形態では、前記疾患、障害、病状又は不全は、末梢血管疾患、急性若しくは慢
性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈
疾患又はリウマチ性心疾患である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は胎
盤灌流液由来の全有核細胞である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団
は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前
記胎盤灌流液細胞はCD34+細胞である。より具体的な実施形態では、前記CD34+
細胞はCD34+CD45-細胞である。より具体的な実施形態では、前記CD34+細
胞又はCD34+CD45-細胞は、CD31、CXCR4又はVEGFRの少なくとも
1つを臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルで発現する。別の具体的な実
施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない単離CD34+細胞
を含む。より具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は胎盤から単離される。別のよ
り具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から
単離される。別のより具体的な実施形態では、CD34+細胞はCD45-細胞である。
別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞又は前記CD34+CD45-細胞
は臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVE
GFRを発現する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は足場又はマトリク
ス上にて投与される。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は静脈内投与され
る。
上記方法の一部の実施形態では、CD34+胎盤細胞は胎盤灌流液から単離され、例え
ば、胎盤灌流液細胞から単離される。一部の実施形態では、該細胞はCD44-である。
一部の実施形態では、該細胞はCD9+,CD54+,CD90+又はCD166+であ
る。一部の実施形態では、該細胞はCD9+,CD54+,CD90+及びCD166+
である。一部の実施形態では、該細胞はCD31+,CD117+,CD133+又はC
D200+である。一部の実施形態では、該細胞はCD31+,CD117+,CD13
3+及びCD200+である。一部の実施形態では、前記CD34+細胞はCD34+C
D45-細胞である。一部の他の実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯血由来の同等
数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFRを発現する。
ば、胎盤灌流液細胞から単離される。一部の実施形態では、該細胞はCD44-である。
一部の実施形態では、該細胞はCD9+,CD54+,CD90+又はCD166+であ
る。一部の実施形態では、該細胞はCD9+,CD54+,CD90+及びCD166+
である。一部の実施形態では、該細胞はCD31+,CD117+,CD133+又はC
D200+である。一部の実施形態では、該細胞はCD31+,CD117+,CD13
3+及びCD200+である。一部の実施形態では、前記CD34+細胞はCD34+C
D45-細胞である。一部の他の実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯血由来の同等
数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFRを発現する。
一部の実施形態では、CD34+細胞は胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と組み合わせら
れる。より具体的な実施形態では、CD34+細胞は胎盤細胞である。より具体的な実施
形態では、CD34+細胞は胎盤内皮前駆細胞である。他の具体的な実施形態では、CD
34+細胞は造血細胞、例えば、胎盤CD34+造血幹細胞である。具体的な実施形態で
は、造血細胞と胎盤灌流液細胞との比率は、約100:1,95:5,90:10,85
:15,80:20,75:25,70:30,65:35,60:40,55:45:
50:50,45:55,40:60,35:65,30:70,25:75,20:8
0,15:85,10:90,5:95,100:1,95:1,90:1,85:1,
80:1,75:1,70:1,65:1,60:1,55:1,50:1,45:1,
40:1,35:1,30:1,25:1,20:1,15:1,10:1,5:1,1
:1,1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,1:30,1:35,1:4
0,1:45,1:50,1:55,1:60,1:65,1:70,1:75,1:8
0,1:85,1:90,1:95,1:100等である。一部の他の実施形態では、胎
盤以外の供給源由来(例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などに由来)のCD34+
細胞はCD34+胎盤細胞と組み合わせられる。具体的な実施形態では、非胎盤CD34
+細胞とCD34+胎盤細胞との比率は、約100:1,95:5,90:10,85:
15,80:20,75:25,70:30,65:35,60:40,55:45:5
0:50,45:55,40:60,35:65,30:70,25:75,20:80
,15:85,10:90,5:95,100:1,95:1,90:1,85:1,8
0:1,75:1,70:1,65:1,60:1,55:1,50:1,45:1,4
0:1,35:1,30:1,25:1,20:1,15:1,10:1,5:1,1:
1,1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,1:30,1:35,1:40
,1:45,1:50,1:55,1:60,1:65,1:70,1:75,1:80
,1:85,1:90,1:95,1:100等である。
れる。より具体的な実施形態では、CD34+細胞は胎盤細胞である。より具体的な実施
形態では、CD34+細胞は胎盤内皮前駆細胞である。他の具体的な実施形態では、CD
34+細胞は造血細胞、例えば、胎盤CD34+造血幹細胞である。具体的な実施形態で
は、造血細胞と胎盤灌流液細胞との比率は、約100:1,95:5,90:10,85
:15,80:20,75:25,70:30,65:35,60:40,55:45:
50:50,45:55,40:60,35:65,30:70,25:75,20:8
0,15:85,10:90,5:95,100:1,95:1,90:1,85:1,
80:1,75:1,70:1,65:1,60:1,55:1,50:1,45:1,
40:1,35:1,30:1,25:1,20:1,15:1,10:1,5:1,1
:1,1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,1:30,1:35,1:4
0,1:45,1:50,1:55,1:60,1:65,1:70,1:75,1:8
0,1:85,1:90,1:95,1:100等である。一部の他の実施形態では、胎
盤以外の供給源由来(例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などに由来)のCD34+
細胞はCD34+胎盤細胞と組み合わせられる。具体的な実施形態では、非胎盤CD34
+細胞とCD34+胎盤細胞との比率は、約100:1,95:5,90:10,85:
15,80:20,75:25,70:30,65:35,60:40,55:45:5
0:50,45:55,40:60,35:65,30:70,25:75,20:80
,15:85,10:90,5:95,100:1,95:1,90:1,85:1,8
0:1,75:1,70:1,65:1,60:1,55:1,50:1,45:1,4
0:1,35:1,30:1,25:1,20:1,15:1,10:1,5:1,1:
1,1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,1:30,1:35,1:40
,1:45,1:50,1:55,1:60,1:65,1:70,1:75,1:80
,1:85,1:90,1:95,1:100等である。
一部の実施形態における胎盤灌流液は組織培養プラスチック付着胎盤幹細胞を含む。付
着幹細胞は、米国特許第7,045,148号;第7,255,879号;第7,311
,904号及び第7,311,905号;及び米国出願公開第2007/0275362
号及び2008/0032401号に詳細に述べられている細胞であり、それらの開示内
容はその全体を参照して本明細書に組み込まれる。付着胎盤幹細胞は幹細胞の1つ又はそ
れ以上の特徴を示し(例えば、幹細胞と関連するマーカーを示し、未分化状態にて培養液
中で少なくとも10~20回複製し、3つの胚葉を代表する成熟細胞に分化する能力を有
する等)、組織培養基質(例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートの表面のような
組織培養プラスチック)に付着することができる。
着幹細胞は、米国特許第7,045,148号;第7,255,879号;第7,311
,904号及び第7,311,905号;及び米国出願公開第2007/0275362
号及び2008/0032401号に詳細に述べられている細胞であり、それらの開示内
容はその全体を参照して本明細書に組み込まれる。付着胎盤幹細胞は幹細胞の1つ又はそ
れ以上の特徴を示し(例えば、幹細胞と関連するマーカーを示し、未分化状態にて培養液
中で少なくとも10~20回複製し、3つの胚葉を代表する成熟細胞に分化する能力を有
する等)、組織培養基質(例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートの表面のような
組織培養プラスチック)に付着することができる。
一実施形態では、付着胎盤幹細胞はCD200+又はHLA-G+である。具体的な実
施形態では、前記細胞はCD200+及びHLA-G+である。具体的な実施形態では、
前記幹細胞はCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細
胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹
細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記
幹細胞はCD34-,CD38-,CD45-,CD73+及びCD105+である。別
の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の
形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の1つ又はそれ以上の胚様体の形
成を容易にする。
施形態では、前記細胞はCD200+及びHLA-G+である。具体的な実施形態では、
前記幹細胞はCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細
胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹
細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記
幹細胞はCD34-,CD38-,CD45-,CD73+及びCD105+である。別
の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の
形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の1つ又はそれ以上の胚様体の形
成を容易にする。
別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はCD73+,CD105+及びCD200+であ
る。具体的な実施形態では、前記幹細胞はHLA-G+である。別の具体的な実施形態で
は、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態
では、前記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。より具体的な実施形
態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-,CD45-及びHLA-G+である。別
の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成
を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の1つ又はそれ以上の胚様体の発生を
容易にする。
る。具体的な実施形態では、前記幹細胞はHLA-G+である。別の具体的な実施形態で
は、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態
では、前記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。より具体的な実施形
態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-,CD45-及びHLA-G+である。別
の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成
を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の1つ又はそれ以上の胚様体の発生を
容易にする。
別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はCD200+及びOCT-4+である。具体的な
実施形態では、幹細胞はCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では
、前記幹細胞はHLA-G+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34
-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD3
4-,CD38-及びCD45-である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD
34-,CD38-,CD45-,CD73+,CD105+及びHLA-G+である。
別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体
の形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の1つ又はそれ以上の胚様体の
形成を容易にする。
実施形態では、幹細胞はCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では
、前記幹細胞はHLA-G+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34
-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD3
4-,CD38-及びCD45-である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD
34-,CD38-,CD45-,CD73+,CD105+及びHLA-G+である。
別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体
の形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の1つ又はそれ以上の胚様体の
形成を容易にする。
別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はCD73+及びCD105+であり、前記幹細胞
を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団に
おける1つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記幹細
胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹
細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記
幹細胞はOCT4+である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はOCT4+,CD
34-,CD38-及びCD45-である。
を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団に
おける1つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記幹細
胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹
細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記
幹細胞はOCT4+である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はOCT4+,CD
34-,CD38-及びCD45-である。
別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はCD73+,CD105+及びHLA-G+であ
る。具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である
。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-であ
る。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はOCT-4+である。別の具体的な実施形
態では、前記幹細胞はCD200+である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はC
D34-,CD38-,CD45-,OCT-4+及びCD200+である。別の具体的
な実施形態では、前記幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養中の胎盤幹細胞
を含む単離胎盤細胞集団由来の1つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。
る。具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である
。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-であ
る。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はOCT-4+である。別の具体的な実施形
態では、前記幹細胞はCD200+である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はC
D34-,CD38-,CD45-,OCT-4+及びCD200+である。別の具体的
な実施形態では、前記幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養中の胎盤幹細胞
を含む単離胎盤細胞集団由来の1つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。
別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はOCT-4+であり、胚様体の形成を可能にする
条件下で培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞集団における1つ又はそれ以上の
胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+及びCD1
05+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はC
D45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD200+である。より具
体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+,CD105+,CD200+,CD34
-,CD38-及びCD45-である。
条件下で培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞集団における1つ又はそれ以上の
胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+及びCD1
05+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はC
D45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD200+である。より具
体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+,CD105+,CD200+,CD34
-,CD38-及びCD45-である。
別の実施形態では、灌流液又は灌流液細胞は、一方法に従って生成される、本明細書で
述べられる胎盤幹細胞単離集団を含み、該方法は、臍帯血から排出され、且つ残留血液を
除去するために灌流された哺乳動物胎盤を灌流するステップ;前記胎盤を灌流溶液で灌流
するステップ;及び前記灌流溶液を回収するステップ(灌流後の前記灌流溶液は胎盤幹細
胞を含む胎盤細胞集団を含む);及び前記細胞集団から複数の前記胎盤幹細胞を単離する
ステップを含む。具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈及び臍動脈中を通され、胎盤
から浸出した後に回収される。別の具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈を通されて
臍動脈から回収され、又は臍動脈を通されて臍静脈から回収される。
述べられる胎盤幹細胞単離集団を含み、該方法は、臍帯血から排出され、且つ残留血液を
除去するために灌流された哺乳動物胎盤を灌流するステップ;前記胎盤を灌流溶液で灌流
するステップ;及び前記灌流溶液を回収するステップ(灌流後の前記灌流溶液は胎盤幹細
胞を含む胎盤細胞集団を含む);及び前記細胞集団から複数の前記胎盤幹細胞を単離する
ステップを含む。具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈及び臍動脈中を通され、胎盤
から浸出した後に回収される。別の具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈を通されて
臍動脈から回収され、又は臍動脈を通されて臍静脈から回収される。
より具体的な実施形態では、付着胎盤幹細胞は骨髄由来間葉幹細胞より検出可能に高い
レベルにて1つ又はそれ以上の遺伝子を発現し、前記1つ又はそれ以上の遺伝子は、
ACTG2,ADARB1,AMIGO2,ATRS-1,B4GALT6,BCHE,
C11orf9,CD200,COL4A1,COL4A2,CPA4,DMD,DSC
3,DSG2,ELOVL2,F2RL1,FLJ10781,GATA6,GPR12
6,GPRC5B,ICAM1,IER3,IGFBP7,IL1A,IL6,IL18
,KRT18,KRT8,LIPG,LRAP,MATN2,MEST,NFE2L3,
NUAK1,PCDH7,PDLIM3,PJP2,RTN1,SERPINB9,ST
3GAL6,ST6GALNAC5,SLC12A8,TCF21,TGFB2,VTN
,及びZC3H12Aからなる群より選択され、前記骨髄由来幹細胞は前記胎盤幹細胞の
多くの継代と同等の多くの継代培養を受けている。
レベルにて1つ又はそれ以上の遺伝子を発現し、前記1つ又はそれ以上の遺伝子は、
ACTG2,ADARB1,AMIGO2,ATRS-1,B4GALT6,BCHE,
C11orf9,CD200,COL4A1,COL4A2,CPA4,DMD,DSC
3,DSG2,ELOVL2,F2RL1,FLJ10781,GATA6,GPR12
6,GPRC5B,ICAM1,IER3,IGFBP7,IL1A,IL6,IL18
,KRT18,KRT8,LIPG,LRAP,MATN2,MEST,NFE2L3,
NUAK1,PCDH7,PDLIM3,PJP2,RTN1,SERPINB9,ST
3GAL6,ST6GALNAC5,SLC12A8,TCF21,TGFB2,VTN
,及びZC3H12Aからなる群より選択され、前記骨髄由来幹細胞は前記胎盤幹細胞の
多くの継代と同等の多くの継代培養を受けている。
本明細書で更に提供されるのは、胎盤灌流液又は灌流液細胞を含む組成物、例えば、医
薬組成物の使用である。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は複数の
CD34+胎盤細胞及び/又は付着胎盤幹細胞を補充される。具体的な実施形態では、該
組成物は胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と、前記灌流液又は灌流液細胞からの血管又は血
管様構造の形成を誘導する1つ又はそれ以上の作用因子とを含む。より具体的な実施形態
では、前記作用因子は、TGF-β、FGF、プラスミノーゲン、tPA及び1つ若しく
はそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼを含む。
薬組成物の使用である。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は複数の
CD34+胎盤細胞及び/又は付着胎盤幹細胞を補充される。具体的な実施形態では、該
組成物は胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と、前記灌流液又は灌流液細胞からの血管又は血
管様構造の形成を誘導する1つ又はそれ以上の作用因子とを含む。より具体的な実施形態
では、前記作用因子は、TGF-β、FGF、プラスミノーゲン、tPA及び1つ若しく
はそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼを含む。
別の具体的な実施形態では、前述の組成物のいずれもマトリクスを含む。より具体的な
実施形態では、前記マトリクスは三次元足場である。別のより具体的な実施形態では、前
記マトリクスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オル
ニチン又はビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態では、該マトリクスは羊膜
又は羊膜由来生体材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは細胞外
膜蛋白質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは合成化合物を含む。
別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは生物活性化合物を含む。別のより具体
的な実施形態では、前記生物活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体又は5,00
0ダルトン未満の有機分子である。一部の実施形態では、該マトリクスは合成分解性ポリ
マー、例えば、ポリ乳酸又はポリグリコール酸である。一部の実施形態では、該マトリク
スは移植可能な足場基質(scaffolding substrate)である。一部の実施形態では、該移
植可能な足場基質(scaffolding substrate)はコラーゲン基質又はヒアルロン酸基質で
ある。一部の実施形態では、該移植可能足場基質(scaffolding substrate)はコラーゲ
ン基質である。
実施形態では、前記マトリクスは三次元足場である。別のより具体的な実施形態では、前
記マトリクスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オル
ニチン又はビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態では、該マトリクスは羊膜
又は羊膜由来生体材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは細胞外
膜蛋白質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは合成化合物を含む。
別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは生物活性化合物を含む。別のより具体
的な実施形態では、前記生物活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体又は5,00
0ダルトン未満の有機分子である。一部の実施形態では、該マトリクスは合成分解性ポリ
マー、例えば、ポリ乳酸又はポリグリコール酸である。一部の実施形態では、該マトリク
スは移植可能な足場基質(scaffolding substrate)である。一部の実施形態では、該移
植可能な足場基質(scaffolding substrate)はコラーゲン基質又はヒアルロン酸基質で
ある。一部の実施形態では、該移植可能足場基質(scaffolding substrate)はコラーゲ
ン基質である。
更に別の態様では、本明細書で提供されるのはマトリクスを製剤化する方法であり、該
方法は胎盤灌流液又は灌流液細胞と移植可能な足場基質(implantable scaffolding subs
trate)とを組み合わせるステップを含む。一部の実施形態では、幹細胞は非付着性であ
る。一部の実施形態では、幹細胞はCD34+である。別の態様では、本明細書で提供さ
れるのは注入可能な組成物を製剤化する方法であり、該方法は胎盤灌流液又は灌流液細胞
と注入可能なヒアルロン酸又はコラーゲンとを組み合わせるステップを含む。一部の実施
形態では、幹細胞は非付着性である。一部の実施形態では、幹細胞はCD34+である。
方法は胎盤灌流液又は灌流液細胞と移植可能な足場基質(implantable scaffolding subs
trate)とを組み合わせるステップを含む。一部の実施形態では、幹細胞は非付着性であ
る。一部の実施形態では、幹細胞はCD34+である。別の態様では、本明細書で提供さ
れるのは注入可能な組成物を製剤化する方法であり、該方法は胎盤灌流液又は灌流液細胞
と注入可能なヒアルロン酸又はコラーゲンとを組み合わせるステップを含む。一部の実施
形態では、幹細胞は非付着性である。一部の実施形態では、幹細胞はCD34+である。
一部の実施形態では、胎盤灌流液細胞又は胎盤灌流液細胞を含む組成物、例えば、医薬
組成物は容器内に含まれる。該容器は一実施形態において液体の静脈内送達に好適なバッ
グである。一部の実施形態では、該容器は少なくとも約、又は最大で1×106,5×1
06,1×107,5×107,1×108,5×108,1×109,5×109又は
1×1010個の細胞、例えば、胎盤灌流液細胞、複数のCD34+胎盤細胞(例えば、
CD34+胎盤内皮前駆細胞)を補充された胎盤灌流液細胞又は付着胎盤幹細胞を補充さ
れた胎盤灌流液細胞を含む。一部の実施形態では、該容器は前記幹細胞を含む。一部の実
施形態では、該細胞はわずか5回、10回又は20回継代されている。一部の実施形態で
は、該細胞は前記容器内にて増殖されている。一部の実施形態では、前記容器内の前記細
胞は0.9% NaCl溶液中に含まれる。
組成物は容器内に含まれる。該容器は一実施形態において液体の静脈内送達に好適なバッ
グである。一部の実施形態では、該容器は少なくとも約、又は最大で1×106,5×1
06,1×107,5×107,1×108,5×108,1×109,5×109又は
1×1010個の細胞、例えば、胎盤灌流液細胞、複数のCD34+胎盤細胞(例えば、
CD34+胎盤内皮前駆細胞)を補充された胎盤灌流液細胞又は付着胎盤幹細胞を補充さ
れた胎盤灌流液細胞を含む。一部の実施形態では、該容器は前記幹細胞を含む。一部の実
施形態では、該細胞はわずか5回、10回又は20回継代されている。一部の実施形態で
は、該細胞は前記容器内にて増殖されている。一部の実施形態では、前記容器内の前記細
胞は0.9% NaCl溶液中に含まれる。
別の態様では、本明細書で提供されるのはマトリクスを製剤化する方法であり、該方法
は幹細胞を含む胎盤灌流液又は灌流液細胞と移植可能な足場基質(implantable scaffold
ing substrate)とを組み合わせるステップを含む。一部の他の実施形態では、本明細書
で提供されるのは注入可能組成物を製剤化する方法であり、該方法は、幹細胞集団と注入
可能なヒアルロン酸又はコラーゲンとを組み合わせるステップを含み、前記幹細胞はCD
34+胎盤細胞である。一部の実施形態では、前記幹細胞は胎盤灌流液細胞内に含まれる
。一部の実施形態では、該組成物は注入可能なヒアルロン酸を含む。一部の実施形態では
、該組成物は注入可能なコラーゲンを含む。
は幹細胞を含む胎盤灌流液又は灌流液細胞と移植可能な足場基質(implantable scaffold
ing substrate)とを組み合わせるステップを含む。一部の他の実施形態では、本明細書
で提供されるのは注入可能組成物を製剤化する方法であり、該方法は、幹細胞集団と注入
可能なヒアルロン酸又はコラーゲンとを組み合わせるステップを含み、前記幹細胞はCD
34+胎盤細胞である。一部の実施形態では、前記幹細胞は胎盤灌流液細胞内に含まれる
。一部の実施形態では、該組成物は注入可能なヒアルロン酸を含む。一部の実施形態では
、該組成物は注入可能なコラーゲンを含む。
本明細書で更に提供されるのは、本明細書で提供される組成物及び方法における凍結保
存胎盤灌流液又は灌流液細胞の使用である。
存胎盤灌流液又は灌流液細胞の使用である。
(3.1 定義)
本明細書で用いられるように、「SH2」という用語はCD105マーカー上のエピト
ープに結合する抗体を指す。従って、SH2+と称される細胞はCD105+である。
本明細書で用いられるように、「SH2」という用語はCD105マーカー上のエピト
ープに結合する抗体を指す。従って、SH2+と称される細胞はCD105+である。
本明細書で用いられるように、「SH3」及び「SH4」という用語はCD73マーカ
ー上に存在するエピトープに結合する抗体を指す。従って、SH3+及び/又はSH4+
と称される細胞はCD73+である。
ー上に存在するエピトープに結合する抗体を指す。従って、SH3+及び/又はSH4+
と称される細胞はCD73+である。
本明細書で用いられるように、「単離幹細胞」という用語は、幹細胞が由来する組織(
例えば胎盤)の他の非幹細胞から実質的に分離される幹細胞を指す。例えば、幹細胞の回
収及び/又は培養時に幹細胞が自然に付随する非幹細胞の少なくとも約50%、60%、
70%、80%、90%、95%又は少なくとも99%が幹細胞から除去される場合、幹
細胞は「単離」される。
例えば胎盤)の他の非幹細胞から実質的に分離される幹細胞を指す。例えば、幹細胞の回
収及び/又は培養時に幹細胞が自然に付随する非幹細胞の少なくとも約50%、60%、
70%、80%、90%、95%又は少なくとも99%が幹細胞から除去される場合、幹
細胞は「単離」される。
本明細書で用いられるように、「単離細胞集団」という用語は、細胞集団が由来する組
織(例えば胎盤)の他の細胞から実質的に分離される細胞集団を指す。例えば、幹細胞の
回収及び/又は培養時に、細胞集団又は細胞集団が由来する細胞が自然に付随する細胞の
少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%又は少なくとも99%が
幹細胞から除去される場合、幹細胞は「単離」される。本明細書で用いられるように、「
胎盤灌流液」とは、例えば、胎盤血管系を通じて、少なくとも一部の胎盤(例えばヒト胎
盤)中を通された灌流溶液のことであり、胎盤通過時に灌流溶液によって回収される複数
の細胞を含む。本明細書で用いられるように、「胎盤灌流液細胞」とは、胎盤灌流液から
単離される、又は単離可能な有核細胞、例えば、全有核細胞のことである。
織(例えば胎盤)の他の細胞から実質的に分離される細胞集団を指す。例えば、幹細胞の
回収及び/又は培養時に、細胞集団又は細胞集団が由来する細胞が自然に付随する細胞の
少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%又は少なくとも99%が
幹細胞から除去される場合、幹細胞は「単離」される。本明細書で用いられるように、「
胎盤灌流液」とは、例えば、胎盤血管系を通じて、少なくとも一部の胎盤(例えばヒト胎
盤)中を通された灌流溶液のことであり、胎盤通過時に灌流溶液によって回収される複数
の細胞を含む。本明細書で用いられるように、「胎盤灌流液細胞」とは、胎盤灌流液から
単離される、又は単離可能な有核細胞、例えば、全有核細胞のことである。
本明細書で用いられるように、「胎盤幹細胞」という用語は、形態、細胞表面マーカー
又は初代培養後の継代数にかかわらず、哺乳動物胎盤由来の幹細胞又は前駆細胞を指す。
しかし、本明細書で用いられる「胎盤幹細胞」という用語はトロホブラストを指さない。
細胞が幹細胞の少なくとも1つの特性、例えば、1つ又はそれ以上のタイプの幹細胞と関
連するマーカー又は遺伝子発現プロファイル;培養液中にて少なくとも10~40回複製
する能力;3つのすべての胚葉の細胞に分化する能力;成熟(即ち、分化)細胞特徴の欠
如などを保持する場合、その細胞は「幹細胞」とみなされる。「胎盤幹細胞」及び「胎盤
由来幹細胞」という用語は互換的に用いられ得る。
又は初代培養後の継代数にかかわらず、哺乳動物胎盤由来の幹細胞又は前駆細胞を指す。
しかし、本明細書で用いられる「胎盤幹細胞」という用語はトロホブラストを指さない。
細胞が幹細胞の少なくとも1つの特性、例えば、1つ又はそれ以上のタイプの幹細胞と関
連するマーカー又は遺伝子発現プロファイル;培養液中にて少なくとも10~40回複製
する能力;3つのすべての胚葉の細胞に分化する能力;成熟(即ち、分化)細胞特徴の欠
如などを保持する場合、その細胞は「幹細胞」とみなされる。「胎盤幹細胞」及び「胎盤
由来幹細胞」という用語は互換的に用いられ得る。
本明細書で用いられるように、マーカーが検出可能である場合、幹細胞はその特定のマ
ーカーに対して「陽性」である。例えば、CD73がバックグラウンドより(例えば、対
照アイソタイプと比べて)検出可能に多い量にて胎盤幹細胞上に検出可能であるため、胎
盤幹細胞は、例えば、CD73に対して陽性である。マーカーが細胞を少なくとも1つの
他の細胞型と識別するために用いられ得る場合、或いは細胞が存在し、又は細胞によって
発現される場合に細胞を選択し、又は単離するために用いられ得る場合、その細胞もその
マーカーに対して陽性である。
ーカーに対して「陽性」である。例えば、CD73がバックグラウンドより(例えば、対
照アイソタイプと比べて)検出可能に多い量にて胎盤幹細胞上に検出可能であるため、胎
盤幹細胞は、例えば、CD73に対して陽性である。マーカーが細胞を少なくとも1つの
他の細胞型と識別するために用いられ得る場合、或いは細胞が存在し、又は細胞によって
発現される場合に細胞を選択し、又は単離するために用いられ得る場合、その細胞もその
マーカーに対して陽性である。
本明細書で用いられるように、「マトリクス」とは物質全体に散在する細孔を特徴とす
る三次元基質を指す。該細孔は、例えば、マトリクス内での細胞、例えば、幹細胞、PD
AC及び/又は骨形成原細胞の増殖に好適である。典型的なマトリクスには、限定されな
いが、β-リン酸三カルシウム基質、β-リン酸三カルシウム-コラーゲン基質、コラー
ゲン基質、リン酸カルシウム基質、石灰化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質及
びセラミック基質が含まれる。好ましくは、マトリクスはマトリクスの細孔内に存在する
骨形成原細胞によって石灰化され得る。
る三次元基質を指す。該細孔は、例えば、マトリクス内での細胞、例えば、幹細胞、PD
AC及び/又は骨形成原細胞の増殖に好適である。典型的なマトリクスには、限定されな
いが、β-リン酸三カルシウム基質、β-リン酸三カルシウム-コラーゲン基質、コラー
ゲン基質、リン酸カルシウム基質、石灰化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質及
びセラミック基質が含まれる。好ましくは、マトリクスはマトリクスの細孔内に存在する
骨形成原細胞によって石灰化され得る。
(5.1 胎盤灌流液を用いた処置方法)
本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液から血管細胞又は血管形成細胞を生成する方法
及びそのような細胞の使用並びに、心臓又は血管不全、疾患、障害若しくは病状を有する
患者の処置における、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核
細胞の単独或いはCD34+胎盤細胞(例えば、CD34+胎盤内皮前駆細胞)及び/又
は付着胎盤幹細胞、例えば、下記の「5.3 付着胎盤幹細胞」に述べられている付着胎
盤幹細胞と組み合わせた使用である。より具体的な実施形態では、前記疾患、障害又は病
状は、末梢血管疾患、急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、
心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である。
本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液から血管細胞又は血管形成細胞を生成する方法
及びそのような細胞の使用並びに、心臓又は血管不全、疾患、障害若しくは病状を有する
患者の処置における、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核
細胞の単独或いはCD34+胎盤細胞(例えば、CD34+胎盤内皮前駆細胞)及び/又
は付着胎盤幹細胞、例えば、下記の「5.3 付着胎盤幹細胞」に述べられている付着胎
盤幹細胞と組み合わせた使用である。より具体的な実施形態では、前記疾患、障害又は病
状は、末梢血管疾患、急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、
心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である。
一態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、血管系を形成する能力を有する血管
形成細胞又は血管細胞を生成する方法であり、該方法は、胎盤灌流液又は灌流液細胞を、
複数の前記細胞が血管系又は心臓系の細胞、例えば、血管細胞、例えば、内皮細胞又は心
臓細胞に分化する条件に接触させるステップを含む。具体的な実施形態では、前記接触は
インビボである。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロであり、例えば、前
記灌流液又は灌流液細胞を、該細胞が血管系若しくは心臓系の細胞に分化し、又はそのよ
うな細胞の特徴を示す条件下にて培養する。より具体的な実施形態では、前記1つ又はそ
れ以上の特徴は血管又は血管様構造の形成を含む。別の具体的な実施形態では、前記培養
は、前記灌流液細胞、例えば、前記CD34+胎盤細胞を形質転換増殖因子β(TGF-
β)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化
因子(tPA)及び1つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼに接触させる
ステップを含む。別の実施形態では、前記接触は、前記灌流液細胞をVEGF(50~2
00ng/mL)、TGF-β(1~5ng/mL)、FGF(10~50ng/mL)
及び1つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼ(各々1~3Unit/mL)に
接触させるステップを含み、例えば、前記VEGF,TGF-β,FGF及び1つ若しく
はそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼはマトリクス、例えば、Matrigelに
含まれる。前記マトリクスメタロプロテアーゼは任意のマトリクスメタロプロテアーゼ又
はマトリクスメタロプロテイナーゼの組合せ、例えば、マトリクスメタロプロテイナーゼ
1,3及び4の組合せでよい。より具体的な実施形態では、前記培養は18~24時間で
ある。別のより具体的な実施形態では、前記細胞は前記接触の24時間後に視認可能な血
管構造を形成する。より具体的な実施形態では、前記接触は、前記細胞が24時間後に視
認可能な血管構造を形成する条件下にあり、臍帯血由来のCD34+細胞は視認可能な血
管構造、又は前記灌流液細胞若しくはCD34+胎盤細胞より検出可能に少ない血管構造
を形成しない。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具
体的な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。より具体的な実施形態では、前
記インビボ接触は哺乳動物において行われる。より具体的な実施形態では、前記哺乳動物
はヒトである。
形成細胞又は血管細胞を生成する方法であり、該方法は、胎盤灌流液又は灌流液細胞を、
複数の前記細胞が血管系又は心臓系の細胞、例えば、血管細胞、例えば、内皮細胞又は心
臓細胞に分化する条件に接触させるステップを含む。具体的な実施形態では、前記接触は
インビボである。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロであり、例えば、前
記灌流液又は灌流液細胞を、該細胞が血管系若しくは心臓系の細胞に分化し、又はそのよ
うな細胞の特徴を示す条件下にて培養する。より具体的な実施形態では、前記1つ又はそ
れ以上の特徴は血管又は血管様構造の形成を含む。別の具体的な実施形態では、前記培養
は、前記灌流液細胞、例えば、前記CD34+胎盤細胞を形質転換増殖因子β(TGF-
β)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化
因子(tPA)及び1つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼに接触させる
ステップを含む。別の実施形態では、前記接触は、前記灌流液細胞をVEGF(50~2
00ng/mL)、TGF-β(1~5ng/mL)、FGF(10~50ng/mL)
及び1つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼ(各々1~3Unit/mL)に
接触させるステップを含み、例えば、前記VEGF,TGF-β,FGF及び1つ若しく
はそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼはマトリクス、例えば、Matrigelに
含まれる。前記マトリクスメタロプロテアーゼは任意のマトリクスメタロプロテアーゼ又
はマトリクスメタロプロテイナーゼの組合せ、例えば、マトリクスメタロプロテイナーゼ
1,3及び4の組合せでよい。より具体的な実施形態では、前記培養は18~24時間で
ある。別のより具体的な実施形態では、前記細胞は前記接触の24時間後に視認可能な血
管構造を形成する。より具体的な実施形態では、前記接触は、前記細胞が24時間後に視
認可能な血管構造を形成する条件下にあり、臍帯血由来のCD34+細胞は視認可能な血
管構造、又は前記灌流液細胞若しくはCD34+胎盤細胞より検出可能に少ない血管構造
を形成しない。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具
体的な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。より具体的な実施形態では、前
記インビボ接触は哺乳動物において行われる。より具体的な実施形態では、前記哺乳動物
はヒトである。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは胎盤灌流液細胞集団から血管を形成す
る方法であり、該方法は、前記細胞集団を、血管形成を促進する条件に接触させるステッ
プを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は胎盤灌流液由来の全有核細
胞である。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体的
な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記胎
盤灌流液細胞集団は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な
実施形態では、前記胎盤灌流液細胞はCD34+細胞である。より具体的な実施形態では
、前記CD34+細胞はCD34+CD45-細胞である。より具体的な実施形態では、
前記CD34+細胞又はCD34+CD45-細胞は、CD31、CXCR4又はVEG
FRの少なくとも1つを臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルで発現する
。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は、前記灌流液から単離されない
単離CD34+細胞(例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などから単離される単離C
D34+細胞)を含む。より具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は胎盤から単離
される。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢
血又は骨髄から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯
血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFR
を発現する。別の具体的な実施形態では、前記CD34+細胞はCD34+,CD45-
細胞である。
る方法であり、該方法は、前記細胞集団を、血管形成を促進する条件に接触させるステッ
プを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は胎盤灌流液由来の全有核細
胞である。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体的
な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記胎
盤灌流液細胞集団は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な
実施形態では、前記胎盤灌流液細胞はCD34+細胞である。より具体的な実施形態では
、前記CD34+細胞はCD34+CD45-細胞である。より具体的な実施形態では、
前記CD34+細胞又はCD34+CD45-細胞は、CD31、CXCR4又はVEG
FRの少なくとも1つを臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルで発現する
。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は、前記灌流液から単離されない
単離CD34+細胞(例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などから単離される単離C
D34+細胞)を含む。より具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は胎盤から単離
される。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢
血又は骨髄から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯
血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFR
を発現する。別の具体的な実施形態では、前記CD34+細胞はCD34+,CD45-
細胞である。
別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は前記胎盤灌流液細胞は、胎盤幹細胞又
は胎盤前駆細胞、例えば、CD34+胎盤細胞、例えば、CD34+胎盤内皮前駆細胞を
含む。本明細書で用いられるように、「CD34+胎盤細胞」という用語は、胎盤血又は
臍帯血からではなく胎盤から得られるCD34+細胞を指す。別の具体的な実施形態では
、前記胎盤灌流液細胞、例えば、前記CD34+胎盤細胞は、臍帯血由来の同等数のCD
34+細胞より高いレベルでの量の1つ又はそれ以上の血管形成関連マーカーを生成する
。より具体的な実施形態では、前記CD34+細胞はCD45-である。具体的な実施形
態では、前記マーカーは、CD31、VEGF-R及び/又はCXCR4を含む。他の実
施形態では、該CD34+細胞はCD44-である。一部の実施形態では、該CD34+
細胞はCD9+,CD54+,CD90+又はCD166+である。一部の実施形態では
、該CD34+細胞はCD9+,CD54+,CD90+及びCD166+である。一部
の実施形態では、該CD34+細胞はCD31+,CD117+,CD133+又はCD
200+である。一部の実施形態では、該CD34+細胞はCD31+,CD117+,
CD133+及びCD200+である。一部の実施形態では、前記CD34+細胞はCD
34+CD45-細胞である。一部の他の実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯血由
来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFRを発
現する。
は胎盤前駆細胞、例えば、CD34+胎盤細胞、例えば、CD34+胎盤内皮前駆細胞を
含む。本明細書で用いられるように、「CD34+胎盤細胞」という用語は、胎盤血又は
臍帯血からではなく胎盤から得られるCD34+細胞を指す。別の具体的な実施形態では
、前記胎盤灌流液細胞、例えば、前記CD34+胎盤細胞は、臍帯血由来の同等数のCD
34+細胞より高いレベルでの量の1つ又はそれ以上の血管形成関連マーカーを生成する
。より具体的な実施形態では、前記CD34+細胞はCD45-である。具体的な実施形
態では、前記マーカーは、CD31、VEGF-R及び/又はCXCR4を含む。他の実
施形態では、該CD34+細胞はCD44-である。一部の実施形態では、該CD34+
細胞はCD9+,CD54+,CD90+又はCD166+である。一部の実施形態では
、該CD34+細胞はCD9+,CD54+,CD90+及びCD166+である。一部
の実施形態では、該CD34+細胞はCD31+,CD117+,CD133+又はCD
200+である。一部の実施形態では、該CD34+細胞はCD31+,CD117+,
CD133+及びCD200+である。一部の実施形態では、前記CD34+細胞はCD
34+CD45-細胞である。一部の他の実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯血由
来の同等数のCD34+細胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFRを発
現する。
一部の実施形態では、本明細書で述べられるCD34+細胞又はCD34+細胞集団の
いずれも増殖される。
いずれも増殖される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、患者における血管形成又は血管形
成を促進することによって、心臓又は血管不全若しくは障害を有する患者を処置する方法
であり、該方法は、心臓又は血管不全の1つ又はそれ以上の症状の検出可能な改善又は悪
化の低下を生じさせるのに十分な量にて、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を患者に投与す
るステップを含む。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は移植可能又
は注入可能な組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流
液細胞は本明細書で提供される組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌
流液又は胎盤灌流液細胞は、複数のCD34+胎盤細胞、胎盤付着細胞又はその両方を補
充される。
成を促進することによって、心臓又は血管不全若しくは障害を有する患者を処置する方法
であり、該方法は、心臓又は血管不全の1つ又はそれ以上の症状の検出可能な改善又は悪
化の低下を生じさせるのに十分な量にて、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を患者に投与す
るステップを含む。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は移植可能又
は注入可能な組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流
液細胞は本明細書で提供される組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌
流液又は胎盤灌流液細胞は、複数のCD34+胎盤細胞、胎盤付着細胞又はその両方を補
充される。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、心臓又は血管疾患、障害、病状若しく
は不全を有する患者を処置する方法であり、該方法は、前記疾患、障害、病状又は不全を
処置するのに十分な量にて前記患者にヒト胎盤灌流液細胞を投与するステップを含む。具
体的な実施形態では、前記疾患、障害、病状又は不全は、末梢血管疾患、急性若しくは慢
性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈
疾患又はリウマチ性心疾患である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は胎
盤灌流液由来の全有核細胞である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団
は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前
記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない単離CD34+細胞を含む。より具
体的な実施形態では、前記CD34+細胞は胎盤から単離される。別のより具体的な実施
形態では、前記CD34+細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される。別
のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯血由来の同等数のCD34+細
胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFRを発現する。別の具体的な実施
形態では、前記胎盤灌流液細胞は足場又はマトリクス上にて投与される。別の具体的な実
施形態では、前記胎盤灌流液細胞は静脈内投与される。
は不全を有する患者を処置する方法であり、該方法は、前記疾患、障害、病状又は不全を
処置するのに十分な量にて前記患者にヒト胎盤灌流液細胞を投与するステップを含む。具
体的な実施形態では、前記疾患、障害、病状又は不全は、末梢血管疾患、急性若しくは慢
性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈
疾患又はリウマチ性心疾患である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は胎
盤灌流液由来の全有核細胞である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団
は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前
記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない単離CD34+細胞を含む。より具
体的な実施形態では、前記CD34+細胞は胎盤から単離される。別のより具体的な実施
形態では、前記CD34+細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される。別
のより具体的な実施形態では、前記CD34+細胞は臍帯血由来の同等数のCD34+細
胞より高いレベルのCD31、CXCR4又はVEGFRを発現する。別の具体的な実施
形態では、前記胎盤灌流液細胞は足場又はマトリクス上にて投与される。別の具体的な実
施形態では、前記胎盤灌流液細胞は静脈内投与される。
胎盤灌流液、灌流液細胞、灌流液若しくは灌流液細胞と他の細胞との組合せ及び同一物
を含む組成物、例えば、医薬組成物については以下に詳細に述べられる。
を含む組成物、例えば、医薬組成物については以下に詳細に述べられる。
(5.2 胎盤灌流液及び灌流液細胞を得る方法)
本明細書で提供されるのは哺乳動物胎盤から胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞を得る方法
である。本明細書で述べられるすべての実施形態では、好ましい灌流液はヒト胎盤灌流液
であり、好ましい灌流液細胞はヒト胎盤灌流液細胞である。
本明細書で提供されるのは哺乳動物胎盤から胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞を得る方法
である。本明細書で述べられるすべての実施形態では、好ましい灌流液はヒト胎盤灌流液
であり、好ましい灌流液細胞はヒト胎盤灌流液細胞である。
(5.2.1 胎盤の回収及び取扱い)
一般的に、ヒト胎盤は分娩後のその排出直後に回収される。好ましい実施形態では、胎
盤は、説明と同意後及び胎盤と関連する患者の完全な既往歴が得られた後に患者から回収
される。好ましくは、既往歴は出産後継続する。そのような既往歴は胎盤又は胎盤から回
収される幹細胞のその後の使用を調整するために用いられ得る。例えば、ヒト胎盤幹細胞
は、既往歴に照らして胎盤と関連する乳幼児又は乳幼児の両親、兄弟姉妹若しくは他の血
縁者のための個別化医療のために用いられ得る。
一般的に、ヒト胎盤は分娩後のその排出直後に回収される。好ましい実施形態では、胎
盤は、説明と同意後及び胎盤と関連する患者の完全な既往歴が得られた後に患者から回収
される。好ましくは、既往歴は出産後継続する。そのような既往歴は胎盤又は胎盤から回
収される幹細胞のその後の使用を調整するために用いられ得る。例えば、ヒト胎盤幹細胞
は、既往歴に照らして胎盤と関連する乳幼児又は乳幼児の両親、兄弟姉妹若しくは他の血
縁者のための個別化医療のために用いられ得る。
胎盤幹細胞の回収前に臍帯血及び胎盤血が除去される。一部の実施形態では、出産後に
胎盤における臍帯血が回収される。胎盤は従来の臍帯血回収プロセスに晒され得る。一実
施形態では、胎盤は、例えば、重力の力を借りて針又はカニューレを用いて放血される(
例えば、Anderson, 米国特許第5,372,581号;Hessel et al, 米国特許第5,4
15,665号を参照されたい)。通常、針又はカニューレは臍静脈に配置され、胎盤は
臍帯血を胎盤から排出するのに役立つように軽く揉まれ得る。そのような臍帯血回収は商
業的に、例えば、ニュージャージー州Cedar Knolls,LifeBank U
SA,ViaCord,Cord Blood Registry及びCryocell
にて行われ得る。好ましくは、胎盤は臍帯血回収時に組織破壊を最小限にするため、更な
る操作なしに重力で排出される。
胎盤における臍帯血が回収される。胎盤は従来の臍帯血回収プロセスに晒され得る。一実
施形態では、胎盤は、例えば、重力の力を借りて針又はカニューレを用いて放血される(
例えば、Anderson, 米国特許第5,372,581号;Hessel et al, 米国特許第5,4
15,665号を参照されたい)。通常、針又はカニューレは臍静脈に配置され、胎盤は
臍帯血を胎盤から排出するのに役立つように軽く揉まれ得る。そのような臍帯血回収は商
業的に、例えば、ニュージャージー州Cedar Knolls,LifeBank U
SA,ViaCord,Cord Blood Registry及びCryocell
にて行われ得る。好ましくは、胎盤は臍帯血回収時に組織破壊を最小限にするため、更な
る操作なしに重力で排出される。
典型的には、胎盤は、例えば、灌流又は組織解離による臍帯血回収及び幹細胞回収のた
めに出産又は分娩室から別の場所、例えば、実験室へ輸送される。好ましくは、胎盤は、
例えば、固定された近位臍帯を有する胎盤を滅菌チャック固定プラスチックバッグに入れ
、次に、断熱容器に入れることにより、滅菌断熱輸送デバイス(胎盤の温度を20~28
℃に維持)にて輸送される。別の実施形態では、胎盤は、2005年9月19日に出願さ
れた係属中の米国特許出願第11/230,760号に実質的に述べられている臍帯血回
収キットにて輸送される。好ましくは、胎盤は分娩の4~24時間後に実験室へ送られる
。一部の実施形態では、近位臍帯は臍帯血回収前に胎盤への挿入の好ましくは4~5cm
(センチメートル)以内にて固定される。他の実施形態では、近位臍帯は臍帯血回収後で
あるが胎盤の更なる処置前に固定される。
めに出産又は分娩室から別の場所、例えば、実験室へ輸送される。好ましくは、胎盤は、
例えば、固定された近位臍帯を有する胎盤を滅菌チャック固定プラスチックバッグに入れ
、次に、断熱容器に入れることにより、滅菌断熱輸送デバイス(胎盤の温度を20~28
℃に維持)にて輸送される。別の実施形態では、胎盤は、2005年9月19日に出願さ
れた係属中の米国特許出願第11/230,760号に実質的に述べられている臍帯血回
収キットにて輸送される。好ましくは、胎盤は分娩の4~24時間後に実験室へ送られる
。一部の実施形態では、近位臍帯は臍帯血回収前に胎盤への挿入の好ましくは4~5cm
(センチメートル)以内にて固定される。他の実施形態では、近位臍帯は臍帯血回収後で
あるが胎盤の更なる処置前に固定される。
幹細胞回収前の胎盤は無菌条件下にて室温又は5~25℃(摂氏)の温度で保存され得
る。胎盤は残留臍帯血を除去するために胎盤を灌流する前に48時間超、好ましくは4~
24時間保存され得る。好ましくは、胎盤は5~25℃(摂氏)の温度で抗凝固溶液中に
保存される。好適な抗凝固溶液は当分野において周知である。例えば、ヘパリン又はワル
ファリンナトリウムの溶液が用いられ得る。好ましい実施形態では、抗凝固溶液はヘパリ
ン溶液(例えば、1:1000溶液中1% w/w)を含む。好ましくは、放血された胎
盤は胎盤幹細胞が回収される前にわずか36時間保存される。
る。胎盤は残留臍帯血を除去するために胎盤を灌流する前に48時間超、好ましくは4~
24時間保存され得る。好ましくは、胎盤は5~25℃(摂氏)の温度で抗凝固溶液中に
保存される。好適な抗凝固溶液は当分野において周知である。例えば、ヘパリン又はワル
ファリンナトリウムの溶液が用いられ得る。好ましい実施形態では、抗凝固溶液はヘパリ
ン溶液(例えば、1:1000溶液中1% w/w)を含む。好ましくは、放血された胎
盤は胎盤幹細胞が回収される前にわずか36時間保存される。
哺乳動物胎盤又はその一部は、ほぼ上記のように回収及び調製されると、幹細胞を得る
ため、当分野において公知の任意の方法にて処理され得、例えば、灌流又は破壊され、例
えば、1つ又はそれ以上の組織破壊酵素で消化され得る。
ため、当分野において公知の任意の方法にて処理され得、例えば、灌流又は破壊され、例
えば、1つ又はそれ以上の組織破壊酵素で消化され得る。
(5.2.2 胎盤灌流)
例えば、Hariri,米国出願公開第2002/0123141号及び、2006年12月
28日に出願され、発明の名称が「Improved Composition for Collecting and Preservi
ng Organs」である米国出願第11/648,812号に哺乳動物胎盤を灌流する方法が
開示されている。
例えば、Hariri,米国出願公開第2002/0123141号及び、2006年12月
28日に出願され、発明の名称が「Improved Composition for Collecting and Preservi
ng Organs」である米国出願第11/648,812号に哺乳動物胎盤を灌流する方法が
開示されている。
灌流液は、上述の灌流溶液、例えば、食塩水、培地又は細胞回収組成物の胎盤血管系の
通過によって得られ得る。一実施形態では、哺乳動物胎盤は灌流溶液の臍動脈及び臍静脈
の一方又は両方の通過によって灌流される。胎盤中の灌流溶液のフローは、例えば、胎盤
への重力フローを用いて達成され得る。好ましくは、灌流溶液はポンプ、例えば、蠕動ポ
ンプを用いて胎盤中を通される。臍静脈は、例えば、滅菌チューブのような滅菌結合装置
に結合されたカニューレ、例えば、TEFLON(登録商標)又はプラスチックカニュー
レでカニューレ処置され得る。該滅菌結合装置は灌流マニホールドに結合される。
通過によって得られ得る。一実施形態では、哺乳動物胎盤は灌流溶液の臍動脈及び臍静脈
の一方又は両方の通過によって灌流される。胎盤中の灌流溶液のフローは、例えば、胎盤
への重力フローを用いて達成され得る。好ましくは、灌流溶液はポンプ、例えば、蠕動ポ
ンプを用いて胎盤中を通される。臍静脈は、例えば、滅菌チューブのような滅菌結合装置
に結合されたカニューレ、例えば、TEFLON(登録商標)又はプラスチックカニュー
レでカニューレ処置され得る。該滅菌結合装置は灌流マニホールドに結合される。
灌流に備えて、胎盤は好ましくは臍動脈及び臍静脈が胎盤の最高点に位置するように方
向付けられる(例えば、懸垂される)。胎盤は灌流液の胎盤血管系或いは胎盤血管系及び
周囲組織の通過によって灌流され得る。一実施形態では、臍動脈及び臍静脈は、柔軟なコ
ネクタを介して灌流溶液のリザーバに結合されたピペットに同時に結合される。灌流溶液
は臍静脈及び動脈に通される。灌流溶液は血管壁から浸出し、且つ/或いは血管壁を通過
して胎盤の周囲組織に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開
放容器内に回収される。灌流溶液は臍帯開口部を通じて導入され、母体の子宮壁と整合し
た胎盤壁における開口部から外部へ流出し、又は浸出することも許容され得る。別の実施
形態では、灌流溶液は臍静脈中を通されて臍動脈から回収され、又は臍動脈中を通されて
臍静脈から回収され、即ち、胎盤血管系(胎児組織)のみに通される。
向付けられる(例えば、懸垂される)。胎盤は灌流液の胎盤血管系或いは胎盤血管系及び
周囲組織の通過によって灌流され得る。一実施形態では、臍動脈及び臍静脈は、柔軟なコ
ネクタを介して灌流溶液のリザーバに結合されたピペットに同時に結合される。灌流溶液
は臍静脈及び動脈に通される。灌流溶液は血管壁から浸出し、且つ/或いは血管壁を通過
して胎盤の周囲組織に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開
放容器内に回収される。灌流溶液は臍帯開口部を通じて導入され、母体の子宮壁と整合し
た胎盤壁における開口部から外部へ流出し、又は浸出することも許容され得る。別の実施
形態では、灌流溶液は臍静脈中を通されて臍動脈から回収され、又は臍動脈中を通されて
臍静脈から回収され、即ち、胎盤血管系(胎児組織)のみに通される。
一実施形態では、例えば、臍動脈及び臍静脈は、例えば、柔軟なコネクタを介して灌流
溶液のリザーバに結合されたピペットに同時に結合される。灌流溶液は臍静脈及び動脈に
通される。灌流溶液は血管壁から浸出し、且つ/或いは血管壁を通過して胎盤の周囲組織
に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器内に回収され
る。灌流溶液は臍帯開口部を通じて導入され、母親の子宮壁と整合した胎盤壁における開
口部から外部へ流出し、又は浸出することも許容され得る。通常、「汎」法(「pan」 me
thod)と称され得るこの方法によって回収される胎盤細胞は、胎児及び母親細胞の混合物
である。
溶液のリザーバに結合されたピペットに同時に結合される。灌流溶液は臍静脈及び動脈に
通される。灌流溶液は血管壁から浸出し、且つ/或いは血管壁を通過して胎盤の周囲組織
に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器内に回収され
る。灌流溶液は臍帯開口部を通じて導入され、母親の子宮壁と整合した胎盤壁における開
口部から外部へ流出し、又は浸出することも許容され得る。通常、「汎」法(「pan」 me
thod)と称され得るこの方法によって回収される胎盤細胞は、胎児及び母親細胞の混合物
である。
別の実施形態では、灌流溶液は臍静脈中を通されて臍動脈から回収され、又は臍動脈中
を通されて臍静脈から回収される。通常、「閉回路」法と称され得るこの方法によって回
収される胎盤細胞は、ほぼ例外なく胎児性である。
を通されて臍静脈から回収される。通常、「閉回路」法と称され得るこの方法によって回
収される胎盤細胞は、ほぼ例外なく胎児性である。
閉回路灌流法は一実施形態において以下のように行われ得る。分娩後胎盤は分娩の約4
8時間以内に得られる。臍帯は固定され、クランプの上方にて切断される。臍帯は廃棄さ
れ、或いは、例えば、臍帯幹細胞を回収し、及び/又は生体材料の生成のために臍帯膜を
処理するために処理され得る。羊膜は灌流時に保持され得、又は、例えば、指による鈍的
剥離を用いて絨毛膜から分離され得る。羊膜が灌流前に絨毛膜から分離される場合、羊膜
は、例えば、廃棄され、或いは、例えば、酵素消化によって幹細胞を得て、又は、例えば
、羊膜生体材料、例えば、米国出願公開第2004/0048796号(その開示内容は
本明細書によって参照して本明細書に組み込まれる)に述べられている生体材料を生成す
るために処理され得る。例えば、滅菌ガーゼを用いて胎盤からすべての視認可能な凝血及
び残留血液を除去した後、臍帯血管は、例えば、臍帯の断面を露出するために臍帯膜を部
分的に切断することによって露出される。血管は識別され、例えば閉鎖アリゲータ・クラ
ンプを各血管の切断端を通して推し進めることによって開口される。次に、装置、例えば
、灌流デバイス又は蠕動ポンプに結合されたプラスチックチューブが各胎盤動脈に挿入さ
れる。ポンプは目的に適した任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプでよい。次に、滅菌回収
リザーバ、例えば、250mL回収バッグのような血液バッグに結合されたプラスチック
チューブが胎盤静脈に挿入される。或いは、ポンプに結合されたチューブは胎盤静脈に挿
入され、回収リザーバに結合されたチューブは胎盤動脈の一方又は両方に挿入される。次
に、胎盤が灌流溶液のある量、例えば、灌流溶液約750mLで灌流される。次に、灌流
液中の細胞が、例えば、遠心分離によって回収される。
8時間以内に得られる。臍帯は固定され、クランプの上方にて切断される。臍帯は廃棄さ
れ、或いは、例えば、臍帯幹細胞を回収し、及び/又は生体材料の生成のために臍帯膜を
処理するために処理され得る。羊膜は灌流時に保持され得、又は、例えば、指による鈍的
剥離を用いて絨毛膜から分離され得る。羊膜が灌流前に絨毛膜から分離される場合、羊膜
は、例えば、廃棄され、或いは、例えば、酵素消化によって幹細胞を得て、又は、例えば
、羊膜生体材料、例えば、米国出願公開第2004/0048796号(その開示内容は
本明細書によって参照して本明細書に組み込まれる)に述べられている生体材料を生成す
るために処理され得る。例えば、滅菌ガーゼを用いて胎盤からすべての視認可能な凝血及
び残留血液を除去した後、臍帯血管は、例えば、臍帯の断面を露出するために臍帯膜を部
分的に切断することによって露出される。血管は識別され、例えば閉鎖アリゲータ・クラ
ンプを各血管の切断端を通して推し進めることによって開口される。次に、装置、例えば
、灌流デバイス又は蠕動ポンプに結合されたプラスチックチューブが各胎盤動脈に挿入さ
れる。ポンプは目的に適した任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプでよい。次に、滅菌回収
リザーバ、例えば、250mL回収バッグのような血液バッグに結合されたプラスチック
チューブが胎盤静脈に挿入される。或いは、ポンプに結合されたチューブは胎盤静脈に挿
入され、回収リザーバに結合されたチューブは胎盤動脈の一方又は両方に挿入される。次
に、胎盤が灌流溶液のある量、例えば、灌流溶液約750mLで灌流される。次に、灌流
液中の細胞が、例えば、遠心分離によって回収される。
一実施形態では、近位臍帯は灌流時に固定され、より好ましくは、胎盤への臍帯の挿入
の4~5cm(センチメートル)以内にて固定される。
の4~5cm(センチメートル)以内にて固定される。
一部の実施形態では、臍帯血は灌流前に(例えば、重力排出によって)胎盤から除去さ
れるが、胎盤は残留血液を除去するために溶液で洗い流されない(例えば、灌流されない
)。概して、そのような実施形態における哺乳動物胎盤からの灌流流体の最初の回収は、
臍帯血及び/又は胎盤血の残留赤血球で着色される。灌流が進行し、残留臍帯血球が胎盤
から流し去られるにつれ、灌流流体はより無色になる。概して、最初に残留臍帯血球を除
去するために30~100mLの灌流流体が適切である。
れるが、胎盤は残留血液を除去するために溶液で洗い流されない(例えば、灌流されない
)。概して、そのような実施形態における哺乳動物胎盤からの灌流流体の最初の回収は、
臍帯血及び/又は胎盤血の残留赤血球で着色される。灌流が進行し、残留臍帯血球が胎盤
から流し去られるにつれ、灌流流体はより無色になる。概して、最初に残留臍帯血球を除
去するために30~100mLの灌流流体が適切である。
他の実施形態では、臍帯血は灌流前に(例えば、重力排出によって)胎盤から除去され
、胎盤は、胎盤幹細胞又は胎盤灌流液細胞を回収するための灌流前に残留血液を除去する
ために溶液で洗い流される(例えば、灌流される)。
、胎盤は、胎盤幹細胞又は胎盤灌流液細胞を回収するための灌流前に残留血液を除去する
ために溶液で洗い流される(例えば、灌流される)。
胎盤を灌流するために用いられる灌流液体の量は、回収される胎盤細胞の数、胎盤のサ
イズ、単一胎盤からなされる回収の数などにより異なり得る。種々の実施形態において、
灌流液体の量は、50mL~5000mL,50mL~4000mL,50mL~300
0mL,100mL~2000mL,250mL~2000mL,500mL~2000
mL又は750mL~2000mLでよい。典型的には、胎盤は放血後に700~800
mLの灌流液体で灌流される。
イズ、単一胎盤からなされる回収の数などにより異なり得る。種々の実施形態において、
灌流液体の量は、50mL~5000mL,50mL~4000mL,50mL~300
0mL,100mL~2000mL,250mL~2000mL,500mL~2000
mL又は750mL~2000mLでよい。典型的には、胎盤は放血後に700~800
mLの灌流液体で灌流される。
胎盤は数時間又は数日にわたって複数回灌流され得る。胎盤が複数回灌流される場合、
胎盤は容器(container)又は他の好適な容器(vessel)内にて無菌条件下で維持又は培
養され、抗凝固剤(例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロ
キシクマリン)の有無にかかわらず、且つ/或いは抗菌剤(例えば、β-メルカプトエタ
ノール(0.1mM));抗生物質、例えば、ストレプトマイシン(例えば、40~10
0μg/mlにて)、ペニシリン(例えば、40U/mlにて)、アンホテリシンB(例
えば、0.5μg/mlにて)の有無にかかわらず、細胞回収組成物又は標準灌流溶液(
例えば、リン酸緩衝食塩水(「PBS」)のような通常の食塩水で灌流され得る。一実施
形態では、胎盤が灌流及び灌流液の回収前に1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23若
しくは24時間又は2若しくは3日間以上維持又は培養されるように、単離胎盤は灌流液
を回収せずに一定時間維持又は培養される。灌流された胎盤は1又はそれ以上の追加時間
、例えば、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15
,16,17,18,19,20,21,22,23,24時間又はそれ以上の時間維持
され、例えば、700~800mL灌流流体でもう1回灌流され得る。胎盤は1,2,3
,4,5又はそれ以上の回数、例えば、1,2,3,4,5又は6時間毎に1回灌流され
得る。好ましい実施形態では、胎盤の灌流及び灌流溶液、例えば、幹細胞回収組成物の回
収は、回収有核細胞数が100細胞/mlを下回るまで繰り返される。異なる時点におけ
る灌流液は、細胞、例えば、全有核細胞の時間依存的集団を回収するために更に個々に処
理され得る。また、異なる時点に由来する灌流液はプールされ得る。
胎盤は容器(container)又は他の好適な容器(vessel)内にて無菌条件下で維持又は培
養され、抗凝固剤(例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロ
キシクマリン)の有無にかかわらず、且つ/或いは抗菌剤(例えば、β-メルカプトエタ
ノール(0.1mM));抗生物質、例えば、ストレプトマイシン(例えば、40~10
0μg/mlにて)、ペニシリン(例えば、40U/mlにて)、アンホテリシンB(例
えば、0.5μg/mlにて)の有無にかかわらず、細胞回収組成物又は標準灌流溶液(
例えば、リン酸緩衝食塩水(「PBS」)のような通常の食塩水で灌流され得る。一実施
形態では、胎盤が灌流及び灌流液の回収前に1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23若
しくは24時間又は2若しくは3日間以上維持又は培養されるように、単離胎盤は灌流液
を回収せずに一定時間維持又は培養される。灌流された胎盤は1又はそれ以上の追加時間
、例えば、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15
,16,17,18,19,20,21,22,23,24時間又はそれ以上の時間維持
され、例えば、700~800mL灌流流体でもう1回灌流され得る。胎盤は1,2,3
,4,5又はそれ以上の回数、例えば、1,2,3,4,5又は6時間毎に1回灌流され
得る。好ましい実施形態では、胎盤の灌流及び灌流溶液、例えば、幹細胞回収組成物の回
収は、回収有核細胞数が100細胞/mlを下回るまで繰り返される。異なる時点におけ
る灌流液は、細胞、例えば、全有核細胞の時間依存的集団を回収するために更に個々に処
理され得る。また、異なる時点に由来する灌流液はプールされ得る。
(5.2.3 胎盤細胞回収組成物)
灌流液は、任意の生理学的に許容可能な溶液、例えば、食塩水、培地又はより複雑な細
胞回収組成物による胎盤の灌流によって胎盤から回収され得る。細胞回収組成物は関連米
国出願公開第2007/0190042号に詳細に述べられており、共にその全体を参照
して本明細書に組み込まれる。
灌流液は、任意の生理学的に許容可能な溶液、例えば、食塩水、培地又はより複雑な細
胞回収組成物による胎盤の灌流によって胎盤から回収され得る。細胞回収組成物は関連米
国出願公開第2007/0190042号に詳細に述べられており、共にその全体を参照
して本明細書に組み込まれる。
細胞回収組成物は幹細胞の回収及び/又は培養に好適な任意の生理学的に許容可能な溶
液、例えば、食塩水(例えば、リン酸緩衝食塩水、クレブ溶液、改変クレブ溶液、イーグ
ル溶液、0.9% NaCl等)、培地(例えば、DMEM,H.DMEM等)などを含
み得る。
液、例えば、食塩水(例えば、リン酸緩衝食塩水、クレブ溶液、改変クレブ溶液、イーグ
ル溶液、0.9% NaCl等)、培地(例えば、DMEM,H.DMEM等)などを含
み得る。
細胞回収組成物は、回収時から培養時まで胎盤細胞を保存する、即ち、胎盤細胞が死滅
するのを阻止し、又は胎盤細胞の死滅を遅延させ、細胞集団における死滅する胎盤細胞の
数を減少させるなどの傾向がある1つ又はそれ以上の成分を含み得る。そのような成分は
、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤);血管拡
張剤(例えば、マグネシウムスルファート、降圧剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド(A
NP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナ
トリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン又はマグネ
シウムスルファート、ホスホジエステラーゼ阻害剤など);ネクローシス阻害剤(例えば
、2-(1H-Indol-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジン
ジチオカルバマート又はクロナゼパム);TNF-α阻害剤;及び/又は酸素運搬パーフ
ルオロカーボン(例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデシルブロミド
など)でよい。
するのを阻止し、又は胎盤細胞の死滅を遅延させ、細胞集団における死滅する胎盤細胞の
数を減少させるなどの傾向がある1つ又はそれ以上の成分を含み得る。そのような成分は
、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤);血管拡
張剤(例えば、マグネシウムスルファート、降圧剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド(A
NP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナ
トリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン又はマグネ
シウムスルファート、ホスホジエステラーゼ阻害剤など);ネクローシス阻害剤(例えば
、2-(1H-Indol-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジン
ジチオカルバマート又はクロナゼパム);TNF-α阻害剤;及び/又は酸素運搬パーフ
ルオロカーボン(例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデシルブロミド
など)でよい。
細胞回収組成物は1つ又はそれ以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セ
リンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、リボヌクレアーゼ又はデオキ
シリボヌクレアーゼなどを含み得る。そのような酵素には、限定されないが、コラゲナー
ゼ(例えば、コラゲナーゼI,II,III又はIV、クロストリジウム・ヒストリチク
ム(Clostridium histolyticum)由来コラゲナーゼなど);ディスパーゼ、サーモリシン
、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼなどが含まれる。
リンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、リボヌクレアーゼ又はデオキ
シリボヌクレアーゼなどを含み得る。そのような酵素には、限定されないが、コラゲナー
ゼ(例えば、コラゲナーゼI,II,III又はIV、クロストリジウム・ヒストリチク
ム(Clostridium histolyticum)由来コラゲナーゼなど);ディスパーゼ、サーモリシン
、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼなどが含まれる。
細胞回収組成物は殺菌的又は静菌的に有効量の抗生物質を含み得る。一部の非限定的実
施形態では、抗生物質はマクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(
例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セ
フィキシム又はセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリ
ン(例えば、ペニシリンV)又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシ
ン又はノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の
実施形態では、抗生物質はグラム陽性菌及び/又はグラム陰性菌、例えば、シュードモナ
ス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・アウレウス(Stap
hylococcus aureus)などに対して活性を示す。
施形態では、抗生物質はマクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(
例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セ
フィキシム又はセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリ
ン(例えば、ペニシリンV)又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシ
ン又はノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の
実施形態では、抗生物質はグラム陽性菌及び/又はグラム陰性菌、例えば、シュードモナ
ス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・アウレウス(Stap
hylococcus aureus)などに対して活性を示す。
細胞回収組成物は、以下の1つ又はそれ以上の化合物:アデノシン(約1mM~約50
mM);D-グルコース(約20mM~約100mM);マグネシウムイオン(約1mM
~約50mM);20,000ダルトン超の分子量の高分子、一実施形態では内皮統合性
及び細胞生存性を維持するのに十分な量にて存在(例えば、約25g/l~約100g/
l又は約40g/l~約60g/lにて存在する合成若しくは天然コロイド、デキストラ
ンのような多糖又はポリエチレングリコール);酸化防止剤(例えば、約25μM~約1
00μMにて存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グ
ルタチオン、ビタミンC又はビタミンE);還元剤(例えば、約0.1mM~約5mMに
て存在するN-アセチルシステイン);細胞へのカルシウム進入を防止する作用物質(例
えば、約2μM~約25μMにて存在するベラパミル);ニトログリセリン(例えば、約
0.05g/L~約0.2g/L);抗凝固剤、一実施形態では残留血液の凝固を防止す
るのに役立つのに十分な量にて存在(例えば、約1000単位/l~約100,000単
位/lの濃度にて存在するヘパリン又はヒルジン);又はアミロライド含有化合物(例え
ば、約1.0μM~約5μMにて存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライ
ド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド又はイソブチルアミロライド)
も含み得る。
mM);D-グルコース(約20mM~約100mM);マグネシウムイオン(約1mM
~約50mM);20,000ダルトン超の分子量の高分子、一実施形態では内皮統合性
及び細胞生存性を維持するのに十分な量にて存在(例えば、約25g/l~約100g/
l又は約40g/l~約60g/lにて存在する合成若しくは天然コロイド、デキストラ
ンのような多糖又はポリエチレングリコール);酸化防止剤(例えば、約25μM~約1
00μMにて存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グ
ルタチオン、ビタミンC又はビタミンE);還元剤(例えば、約0.1mM~約5mMに
て存在するN-アセチルシステイン);細胞へのカルシウム進入を防止する作用物質(例
えば、約2μM~約25μMにて存在するベラパミル);ニトログリセリン(例えば、約
0.05g/L~約0.2g/L);抗凝固剤、一実施形態では残留血液の凝固を防止す
るのに役立つのに十分な量にて存在(例えば、約1000単位/l~約100,000単
位/lの濃度にて存在するヘパリン又はヒルジン);又はアミロライド含有化合物(例え
ば、約1.0μM~約5μMにて存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライ
ド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド又はイソブチルアミロライド)
も含み得る。
(5.2.4 胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞)
胎盤灌流液は細胞の異質な回収を含む。通常、胎盤灌流液は使用前に赤血球を欠失して
いる。そのような欠失は赤血球を有核血球から分離する公知の方法により行われ得る。あ
る実施形態では、灌流液又は灌流細胞は凍結保存される。一部の他の実施形態では、胎盤
灌流液又は灌流液細胞は胎児細胞のみ又は胎児細胞と母親細胞との組合せを含む。
胎盤灌流液は細胞の異質な回収を含む。通常、胎盤灌流液は使用前に赤血球を欠失して
いる。そのような欠失は赤血球を有核血球から分離する公知の方法により行われ得る。あ
る実施形態では、灌流液又は灌流細胞は凍結保存される。一部の他の実施形態では、胎盤
灌流液又は灌流液細胞は胎児細胞のみ又は胎児細胞と母親細胞との組合せを含む。
通常、単一胎盤灌流由来の胎盤灌流液は約1億~約5億個の有核細胞を含む。一部の実
施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞はCD34+細胞、例えば、造血幹細胞若しくは
前駆細胞又は内皮前駆細胞を含む。そのような細胞はより具体的な実施形態において、C
D34+CD45-幹細胞若しくは前駆細胞、CD34+CD45+幹細胞若しくは前駆
細胞、骨髄前駆細胞、リンパ前駆細胞及び/又は赤芽球前駆細胞を含み得る。他の実施形
態では、胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は付着胎盤幹細胞、例えば、CD34-幹細胞、
例えば、上記「5.1 胎盤灌流液を用いた処置方法」に述べられている細胞を含む。他
の実施形態では、胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は、例えば、内皮前駆細胞、骨前駆細胞
及びナチュラルキラー細胞を含む。一部の実施形態では、胎盤から回収され、且つ赤血球
を欠失した胎盤灌流液又はそのような灌流液から単離された灌流液細胞は、例えば、フロ
ーサイトメトリー、例えば、FACS解析により定量されるように、約6~7%ナチュラ
ルキラー細胞(CD3-,CD56+);約21~22% T細胞(CD3+);約6~
7% B細胞(CD19+);約1~2%内皮前駆細胞(CD34+,CD31+);約
2~3%神経前駆細胞(ネスチン+);約2~5%造血前駆細胞(CD34+);及び約
0.5~1.5%付着胎盤幹細胞(例えば、CD34-,CD117-,CD105+及
びCD44+)を含む。
施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞はCD34+細胞、例えば、造血幹細胞若しくは
前駆細胞又は内皮前駆細胞を含む。そのような細胞はより具体的な実施形態において、C
D34+CD45-幹細胞若しくは前駆細胞、CD34+CD45+幹細胞若しくは前駆
細胞、骨髄前駆細胞、リンパ前駆細胞及び/又は赤芽球前駆細胞を含み得る。他の実施形
態では、胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は付着胎盤幹細胞、例えば、CD34-幹細胞、
例えば、上記「5.1 胎盤灌流液を用いた処置方法」に述べられている細胞を含む。他
の実施形態では、胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は、例えば、内皮前駆細胞、骨前駆細胞
及びナチュラルキラー細胞を含む。一部の実施形態では、胎盤から回収され、且つ赤血球
を欠失した胎盤灌流液又はそのような灌流液から単離された灌流液細胞は、例えば、フロ
ーサイトメトリー、例えば、FACS解析により定量されるように、約6~7%ナチュラ
ルキラー細胞(CD3-,CD56+);約21~22% T細胞(CD3+);約6~
7% B細胞(CD19+);約1~2%内皮前駆細胞(CD34+,CD31+);約
2~3%神経前駆細胞(ネスチン+);約2~5%造血前駆細胞(CD34+);及び約
0.5~1.5%付着胎盤幹細胞(例えば、CD34-,CD117-,CD105+及
びCD44+)を含む。
ヒト胎盤灌流液中のCD34+幹細胞又は前駆細胞は、臍帯血から単離される同等数の
CD34+細胞より検出可能に高いレベルの血管形成関連マーカー、例えば、CD31、
VEGF-R及び/又はCXCR4を発現する。一部の実施形態では、VEGFと共にE
NDOCULT(登録商標)培地(CFU-Hillコロニーの増殖のため;StemC
ell Technologies,Inc.)において培養される、単一灌流に由来す
るヒト胎盤灌流液単核細胞は、最大約20、例えば、1,2,3,4,5,6,7,8,
9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19又は20個のCFU
-Hillコロニー(内皮細胞前駆細胞)を生成する。液体培養物中のCFU-Hill
コロニーの発達は、例えば、ENDOCULT(登録商標)培地における7日間の培養に
て、例えば、ヒト胎盤灌流液から得られる内皮前駆細胞によるジアセチル化低密度リポ蛋
白質(Dil-acLDL)の取込みを測定することによって実証及び評価され得る。
CD34+細胞より検出可能に高いレベルの血管形成関連マーカー、例えば、CD31、
VEGF-R及び/又はCXCR4を発現する。一部の実施形態では、VEGFと共にE
NDOCULT(登録商標)培地(CFU-Hillコロニーの増殖のため;StemC
ell Technologies,Inc.)において培養される、単一灌流に由来す
るヒト胎盤灌流液単核細胞は、最大約20、例えば、1,2,3,4,5,6,7,8,
9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19又は20個のCFU
-Hillコロニー(内皮細胞前駆細胞)を生成する。液体培養物中のCFU-Hill
コロニーの発達は、例えば、ENDOCULT(登録商標)培地における7日間の培養に
て、例えば、ヒト胎盤灌流液から得られる内皮前駆細胞によるジアセチル化低密度リポ蛋
白質(Dil-acLDL)の取込みを測定することによって実証及び評価され得る。
他の実施形態では、CD34+細胞はCD44-である。一部の実施形態では、CD3
4+細胞はCD9+,CD54+,CD90+又はCD166+である。一部の実施形態
では、CD34+細胞はCD9+,CD54+,CD90+及びCD166+である。一
部の実施形態では、CD34+細胞はCD31+,CD117+,CD133+又はCD
200+である。一部の実施形態では、CD34+細胞はCD31+,CD117+,C
D133+及びCD200+である。
4+細胞はCD9+,CD54+,CD90+又はCD166+である。一部の実施形態
では、CD34+細胞はCD9+,CD54+,CD90+及びCD166+である。一
部の実施形態では、CD34+細胞はCD31+,CD117+,CD133+又はCD
200+である。一部の実施形態では、CD34+細胞はCD31+,CD117+,C
D133+及びCD200+である。
一実施形態では、ヒト胎盤灌流液細胞は培養されると血管又は血管様構造を生成する。
HPP細胞の血管形成は、例えば、TGF-β(形質転換増殖因子β)、線維芽細胞増殖
因子(FGF)、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)及びマ
トリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)の存在下、マトリクス、例えば、ECMATR
IX(商標)上での細胞、例えば、約5×105個の細胞の培養によって実証され得る。
血管及び血管様構造は約18~24時間後に形成する。同じ条件下で培養される臍帯血単
核細胞では有意な血管形成はみられない。血管形成は灌流液細胞をVEGF(50~20
0ng/mL)、TGF-β(1~5ng/mL)、FGF(10~50ng/mL)及
び1つ以上のマトリクスメタロプロテアーゼ(各々1~3Unit/mL)に接触させて培養
することによってもみられ、例えば、前記VEGF,TGF-β,FGF及び1つ以上の
マトリクスメタロプロテアーゼはマトリクス、例えば、Matrigelに含まれる。
HPP細胞の血管形成は、例えば、TGF-β(形質転換増殖因子β)、線維芽細胞増殖
因子(FGF)、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)及びマ
トリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)の存在下、マトリクス、例えば、ECMATR
IX(商標)上での細胞、例えば、約5×105個の細胞の培養によって実証され得る。
血管及び血管様構造は約18~24時間後に形成する。同じ条件下で培養される臍帯血単
核細胞では有意な血管形成はみられない。血管形成は灌流液細胞をVEGF(50~20
0ng/mL)、TGF-β(1~5ng/mL)、FGF(10~50ng/mL)及
び1つ以上のマトリクスメタロプロテアーゼ(各々1~3Unit/mL)に接触させて培養
することによってもみられ、例えば、前記VEGF,TGF-β,FGF及び1つ以上の
マトリクスメタロプロテアーゼはマトリクス、例えば、Matrigelに含まれる。
更に、ヒト胎盤灌流液由来のCD34+CD45-細胞は、CD34+CD45+細胞
より検出可能に高い血管形成マーカーCD31及び/又はVEGFRの発現を有する。
より検出可能に高い血管形成マーカーCD31及び/又はVEGFRの発現を有する。
通常、胎盤灌流液及び灌流液細胞は、臍帯血細胞と比べて低いMHCクラスIの発現を
有し、MHCクラスIIマーカーに対して概して陰性である。
有し、MHCクラスIIマーカーに対して概して陰性である。
(5.2.5 胎盤細胞の単離、選別及び特徴付け)
哺乳動物胎盤由来細胞、例えば、灌流液細胞又は灌流液由来幹細胞は、最初にフィコー
ル勾配遠心分離により他の細胞から精製(即ち、単離)され得る。そのような遠心分離は
遠心速度などの任意の標準プロトコルに従い得る。一実施形態では、例えば、胎盤から回
収される細胞は室温で15分間、5000xgでの遠心分離によって灌流液から回収され
、これは細胞を、例えば、汚染細片及び血小板から分離する。別の実施形態では、胎盤灌
流液は約200mlに濃縮され、フィコール上に穏やかに層状にされ、22℃で20分間
、約1100xgにて遠心分離され、細胞の低密度界面層が更なる処理のために回収され
る。
哺乳動物胎盤由来細胞、例えば、灌流液細胞又は灌流液由来幹細胞は、最初にフィコー
ル勾配遠心分離により他の細胞から精製(即ち、単離)され得る。そのような遠心分離は
遠心速度などの任意の標準プロトコルに従い得る。一実施形態では、例えば、胎盤から回
収される細胞は室温で15分間、5000xgでの遠心分離によって灌流液から回収され
、これは細胞を、例えば、汚染細片及び血小板から分離する。別の実施形態では、胎盤灌
流液は約200mlに濃縮され、フィコール上に穏やかに層状にされ、22℃で20分間
、約1100xgにて遠心分離され、細胞の低密度界面層が更なる処理のために回収され
る。
細胞ペレットは上述の新鮮細胞回収組成物又は幹細胞維持に好適な培地、例えば、2U
/mlヘパリン及び2mM EDTA(GibcoBRL社、ニューヨーク)を含むIM
DM血清非含有培地に再懸濁され得る。全単核細胞断片は、例えば、製造業者の推奨手順
に従ってLymphoprep(Nycomed Pharma社、ノルウェー・オスロ
)を用いて単離され得る。
/mlヘパリン及び2mM EDTA(GibcoBRL社、ニューヨーク)を含むIM
DM血清非含有培地に再懸濁され得る。全単核細胞断片は、例えば、製造業者の推奨手順
に従ってLymphoprep(Nycomed Pharma社、ノルウェー・オスロ
)を用いて単離され得る。
本明細書で用いられるように、胎盤細胞、例えば、幹細胞又は前駆細胞を胎盤灌流液又
は胎盤灌流液細胞から「単離する」とは、細胞が無傷の哺乳動物胎盤において通常関連す
る細胞の少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90
%、95%又は99%を除去するということである。臓器由来の細胞が無傷臓器において
通常関連する細胞の50%未満を含む細胞集団に存在する場合、その細胞は「単離」され
る。
は胎盤灌流液細胞から「単離する」とは、細胞が無傷の哺乳動物胎盤において通常関連す
る細胞の少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90
%、95%又は99%を除去するということである。臓器由来の細胞が無傷臓器において
通常関連する細胞の50%未満を含む細胞集団に存在する場合、その細胞は「単離」され
る。
上述の灌流によって得られる胎盤細胞、例えば、付着胎盤幹細胞は、例えば、更に、又
は最初に、例えば、0.2% EDTAを含む0.05%トリプシン溶液(Sigma社
、ミズーリ州セントルイス)を用いて分別的トリプシン処理(differential trypsinizat
ion)によって単離され得る。通常、幹細胞が約5分以内にプラスチック面から単離する
のに対し、胎盤灌流液中の他の付着細胞集団は通常20~30分超のインキュベーション
を必要とするため、付着胎盤幹細胞の分別的トリプシン処理(differential trypsinizat
ion)が可能である。分離した胎盤幹細胞は、例えば、Trypsin Neutral
izing Solution(TNS,Cambrex社)を用いてトリプシン処理及
びトリプシン中和後に回収され得る。付着細胞の単離の一実施形態では、例えば、約5~
10×106個の細胞のアリコートが複数のT75フラスコ、好ましくはフィブロネクチ
ン被覆T75フラスコの各々に入れられる。そのような実施形態では、細胞は市販のMe
senchymal Stem Cell Growth Medium(MSCGM)
(Cambrex社)で培養され、組織培養インキュベータ(37℃,5% CO2)に
入れられ得る。10~15日後、非付着細胞はPBSで洗浄することによりフラスコから
除去される。次に、PBSはMSCGMに置き換えられる。好ましくは、フラスコは種々
の付着細胞型の存在、特に線維芽細胞様細胞群の識別及び増殖について毎日検査される。
は最初に、例えば、0.2% EDTAを含む0.05%トリプシン溶液(Sigma社
、ミズーリ州セントルイス)を用いて分別的トリプシン処理(differential trypsinizat
ion)によって単離され得る。通常、幹細胞が約5分以内にプラスチック面から単離する
のに対し、胎盤灌流液中の他の付着細胞集団は通常20~30分超のインキュベーション
を必要とするため、付着胎盤幹細胞の分別的トリプシン処理(differential trypsinizat
ion)が可能である。分離した胎盤幹細胞は、例えば、Trypsin Neutral
izing Solution(TNS,Cambrex社)を用いてトリプシン処理及
びトリプシン中和後に回収され得る。付着細胞の単離の一実施形態では、例えば、約5~
10×106個の細胞のアリコートが複数のT75フラスコ、好ましくはフィブロネクチ
ン被覆T75フラスコの各々に入れられる。そのような実施形態では、細胞は市販のMe
senchymal Stem Cell Growth Medium(MSCGM)
(Cambrex社)で培養され、組織培養インキュベータ(37℃,5% CO2)に
入れられ得る。10~15日後、非付着細胞はPBSで洗浄することによりフラスコから
除去される。次に、PBSはMSCGMに置き換えられる。好ましくは、フラスコは種々
の付着細胞型の存在、特に線維芽細胞様細胞群の識別及び増殖について毎日検査される。
哺乳動物胎盤から回収される細胞の数及びタイプは、例えば、標準的細胞検出法、例え
ば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学(例えば、組織特異的又は細胞マー
カー特異的抗体による染色)蛍光標識細胞分取(FACS)、磁気細胞単離(MACS)
を用いて形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学又は共焦点顕微鏡
検査を用いた細胞の形態の検査により、且つ/或いは当分野において周知の技法、例えば
、PCR及び遺伝子発現プロファイリングを用いて遺伝子発現の変化を測定することによ
ってモニタリングされ得る。これらの技法は1つ以上の特定のマーカーに対して陽性であ
る細胞を特定するためにも用いられ得る。例えば、CD34に対する抗体を用いて、上記
技法を用いて細胞が検出可能な量のCD34を含むかどうかを判定することができる。そ
うであれば、その細胞はCD34+である。同様に、細胞がRT-PCRによって検出可
能な十分のOCT-4 RNA又は成熟細胞より有意に多いOCT-4 RNAを生成す
る場合、その細胞はOCT-4+である。細胞表面マーカー(例えば、CD34のような
CDマーカー)及びOCT-4のような幹細胞特異的遺伝子の配列に対する抗体は当分野
において周知である。
ば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学(例えば、組織特異的又は細胞マー
カー特異的抗体による染色)蛍光標識細胞分取(FACS)、磁気細胞単離(MACS)
を用いて形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学又は共焦点顕微鏡
検査を用いた細胞の形態の検査により、且つ/或いは当分野において周知の技法、例えば
、PCR及び遺伝子発現プロファイリングを用いて遺伝子発現の変化を測定することによ
ってモニタリングされ得る。これらの技法は1つ以上の特定のマーカーに対して陽性であ
る細胞を特定するためにも用いられ得る。例えば、CD34に対する抗体を用いて、上記
技法を用いて細胞が検出可能な量のCD34を含むかどうかを判定することができる。そ
うであれば、その細胞はCD34+である。同様に、細胞がRT-PCRによって検出可
能な十分のOCT-4 RNA又は成熟細胞より有意に多いOCT-4 RNAを生成す
る場合、その細胞はOCT-4+である。細胞表面マーカー(例えば、CD34のような
CDマーカー)及びOCT-4のような幹細胞特異的遺伝子の配列に対する抗体は当分野
において周知である。
胎盤細胞、特に、フィコール分離、分別的付着(differential adherence)又はその両
方の組合せによって単離された細胞は、蛍光標識細胞分取器(FACS)を用いて選別さ
れ得る。蛍光標識細胞分取(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づく、細胞を含む粒子を
分離するための周知の方法である(Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165)。
個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起は小さな電荷を生じさせ、混合物からの正及
び負の粒子の電磁分離を可能にする。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的抗体又は
リガンドは特徴のある蛍光標識で標識される。細胞はセルソーターを通じて処理され、使
用抗体に結合する能力に基づいて細胞の単離を可能にする。FACS選別粒子は、分離及
びクローニングを容易にするために96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェル
に直接沈着され得る。
方の組合せによって単離された細胞は、蛍光標識細胞分取器(FACS)を用いて選別さ
れ得る。蛍光標識細胞分取(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づく、細胞を含む粒子を
分離するための周知の方法である(Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165)。
個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起は小さな電荷を生じさせ、混合物からの正及
び負の粒子の電磁分離を可能にする。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的抗体又は
リガンドは特徴のある蛍光標識で標識される。細胞はセルソーターを通じて処理され、使
用抗体に結合する能力に基づいて細胞の単離を可能にする。FACS選別粒子は、分離及
びクローニングを容易にするために96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェル
に直接沈着され得る。
一選別スキームでは、胎盤由来幹細胞はCD34,CD38,CD44,CD45,C
D73,CD105,OCT-4及び/又はHLA-Gマーカーの発現に基づいて選別さ
れる。これは、培養液中の付着特性に基づいて幹細胞を選択する手順に関連して達成され
得る。例えば、付着選択ステム(adherence selection stem)はマーカー発現に基づいて
選別前又は選別後に達成され得る。一実施形態では、例えば、細胞は最初にCD34の発
現に基づいて選別される。CD34-細胞は保持され、CD200+HLA-G+である
細胞は他のすべてのCD34-細胞から分離される。別の実施形態では、胎盤由来細胞は
CD200及び/又はHLA-Gマーカーの発現に基づく。例えば、これらのマーカーの
いずれかを示す細胞は更なる使用のために単離される。例えば、CD200及び/又はH
LA-Gを発現する細胞は、具体的な実施形態では、CD73及び/又はCD105の発
現、或いはSH2,SH3又はSH4抗体に認識されるエピトープ、或いはCD34,C
D38又はCD45の発現欠如に基づいて更に選別され得る。例えば、一実施形態では、
胎盤細胞はCD200,HLA-G,CD73,CD105,CD34,CD38及びC
D45の発現又は発現欠如により選別され、CD200+,HLA-G+,CD73+,
CD105+,CD34-,CD38-及びCD45-である胎盤細胞は、更なる使用の
ために他の胎盤細胞から単離される。
D73,CD105,OCT-4及び/又はHLA-Gマーカーの発現に基づいて選別さ
れる。これは、培養液中の付着特性に基づいて幹細胞を選択する手順に関連して達成され
得る。例えば、付着選択ステム(adherence selection stem)はマーカー発現に基づいて
選別前又は選別後に達成され得る。一実施形態では、例えば、細胞は最初にCD34の発
現に基づいて選別される。CD34-細胞は保持され、CD200+HLA-G+である
細胞は他のすべてのCD34-細胞から分離される。別の実施形態では、胎盤由来細胞は
CD200及び/又はHLA-Gマーカーの発現に基づく。例えば、これらのマーカーの
いずれかを示す細胞は更なる使用のために単離される。例えば、CD200及び/又はH
LA-Gを発現する細胞は、具体的な実施形態では、CD73及び/又はCD105の発
現、或いはSH2,SH3又はSH4抗体に認識されるエピトープ、或いはCD34,C
D38又はCD45の発現欠如に基づいて更に選別され得る。例えば、一実施形態では、
胎盤細胞はCD200,HLA-G,CD73,CD105,CD34,CD38及びC
D45の発現又は発現欠如により選別され、CD200+,HLA-G+,CD73+,
CD105+,CD34-,CD38-及びCD45-である胎盤細胞は、更なる使用の
ために他の胎盤細胞から単離される。
別の実施形態では、胎盤灌流液細胞はCD34+の発現及び1つ若しくはそれ以上の血
管形成マーカー、例えば、CXCR4,VEGFR及び/又はCD31の発現に基づいて
選別される。
管形成マーカー、例えば、CXCR4,VEGFR及び/又はCD31の発現に基づいて
選別される。
別の実施形態では、細胞を分離するために磁気ビーズが用いられ得る。細胞は、磁気ビ
ーズ(直径0.5~100μm)に結合する能力に基づいて粒子を分離する方法である磁
気細胞単離(MACS)法を用いて選別され得る。特定の細胞表面分子又はハプテンを特
異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾が磁性ミクロスフェアに
対して行われ得る。次に、ビーズは結合を許容するために細胞と混合される。次に、細胞
は特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を分離するために磁界の中を通される。一実施
形態では、次に、これらの細胞は単離され、更なる細胞表面マーカーに対する抗体に結合
した磁気ビーズと再混合され得る。細胞は再度磁界の中を通され、両方の抗体に結合した
細胞を単離する。次に、そのような細胞はクローン単離用のマイクロタイターディッシュ
のような別個の皿に希釈され得る。
ーズ(直径0.5~100μm)に結合する能力に基づいて粒子を分離する方法である磁
気細胞単離(MACS)法を用いて選別され得る。特定の細胞表面分子又はハプテンを特
異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾が磁性ミクロスフェアに
対して行われ得る。次に、ビーズは結合を許容するために細胞と混合される。次に、細胞
は特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を分離するために磁界の中を通される。一実施
形態では、次に、これらの細胞は単離され、更なる細胞表面マーカーに対する抗体に結合
した磁気ビーズと再混合され得る。細胞は再度磁界の中を通され、両方の抗体に結合した
細胞を単離する。次に、そのような細胞はクローン単離用のマイクロタイターディッシュ
のような別個の皿に希釈され得る。
また、胎盤細胞は細胞形態及び増殖特徴に基づいて特徴付けられ、且つ/或いは選別さ
れ得る。例えば、胎盤細胞、例えば、付着胎盤幹細胞は、例えば、培養液中の線維芽細胞
様の外観を有し、且つ/或いはこれに基づいて選択されると特徴付けられ得る。また、胎
盤細胞は胚様体様体部を形成する能力を有し、且つ/或いはこれに基づいて選択されると
特徴付けられ得る。一実施形態では、例えば、線維芽細胞様形状であり、CD73及びC
D105を発現し、培養液中に1つ又はそれ以上の胚様体様体部を生成する胎盤細胞は、
他の胎盤細胞から単離される。別の実施形態では、培養液中に1つ又はそれ以上の胚様体
様体部を生成するOCT-4+胎盤細胞は他の胎盤細胞から単離される。
れ得る。例えば、胎盤細胞、例えば、付着胎盤幹細胞は、例えば、培養液中の線維芽細胞
様の外観を有し、且つ/或いはこれに基づいて選択されると特徴付けられ得る。また、胎
盤細胞は胚様体様体部を形成する能力を有し、且つ/或いはこれに基づいて選択されると
特徴付けられ得る。一実施形態では、例えば、線維芽細胞様形状であり、CD73及びC
D105を発現し、培養液中に1つ又はそれ以上の胚様体様体部を生成する胎盤細胞は、
他の胎盤細胞から単離される。別の実施形態では、培養液中に1つ又はそれ以上の胚様体
様体部を生成するOCT-4+胎盤細胞は他の胎盤細胞から単離される。
別の実施形態では、胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液又は灌流液細胞はコロニー形成単位
アッセイにより識別され、特徴付けられ得る。コロニー形成単位アッセイは当分野におい
て一般的に公知である。
アッセイにより識別され、特徴付けられ得る。コロニー形成単位アッセイは当分野におい
て一般的に公知である。
胎盤灌流液又は灌流液細胞は、当分野において公知の標準的技法、例えば、トリパンブ
ルー排除アッセイ、フルオレセインジアセタート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取
込みアッセイ(生存能を評価);及びチミジン取込みアッセイ、MTT細胞増殖アッセイ
(増殖を評価)を用いて生存能、増殖可能性及び寿命について評価され得る。寿命は当分
野において周知の方法により、例えば、拡大した培養物において倍加する集団の最大数を
求めることにより判定され得る。
ルー排除アッセイ、フルオレセインジアセタート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取
込みアッセイ(生存能を評価);及びチミジン取込みアッセイ、MTT細胞増殖アッセイ
(増殖を評価)を用いて生存能、増殖可能性及び寿命について評価され得る。寿命は当分
野において周知の方法により、例えば、拡大した培養物において倍加する集団の最大数を
求めることにより判定され得る。
胎盤幹細胞は当分野において公知の他の技法、例えば、所望細胞の選択的増殖(正の選
択)、不要細胞の選択的破壊(負の選択);例えば、ダイズ凝集素のように混合集団にお
ける細胞凝集性の差に基づく分離;凍結融解処置;濾過;従来のゾーン遠心分離法;遠心
分離水簸(逆流遠心分離(counter-streaming centrifugation));単位重力分離(unit
gravity separation);向流分配;電気泳動などを用いて他の胎盤細胞から分離され得
る。
択)、不要細胞の選択的破壊(負の選択);例えば、ダイズ凝集素のように混合集団にお
ける細胞凝集性の差に基づく分離;凍結融解処置;濾過;従来のゾーン遠心分離法;遠心
分離水簸(逆流遠心分離(counter-streaming centrifugation));単位重力分離(unit
gravity separation);向流分配;電気泳動などを用いて他の胎盤細胞から分離され得
る。
(5.3 付着胎盤幹細胞)
付着胎盤幹細胞は、組織培養基質に付着し、且つ非胎盤細胞型に分化する能力を有する
、胎盤又はその一部から得られる幹細胞である。付着胎盤幹細胞は起源が胎児又は母親で
あり得る(即ち、母親又は胎児の遺伝子型を有し得る)。付着胎盤幹細胞の集団若しくは
胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、起源が専ら胎児若しくは母親である胎盤幹細胞を含み得
、又は胎児及び母親起源の胎盤幹細胞の混合集団を含み得る。胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞
を含む細胞の集団は、下述の形態、マーカー及び培養特徴により特定及び選択され得る。
本明細書で述べられる組成物及び方法において使用可能な付着胎盤幹細胞並びにそのよう
な細胞を得て培養する方法は、米国特許第7,045,148号;第7,255,879
号;第7,311,904号及び第7,311,905号;並びに米国出願公開第200
7/0275362号及び第2008/0032401号に詳細に述べられており、その
開示内容はその全体を参照して本明細書により組み込まれる。
付着胎盤幹細胞は、組織培養基質に付着し、且つ非胎盤細胞型に分化する能力を有する
、胎盤又はその一部から得られる幹細胞である。付着胎盤幹細胞は起源が胎児又は母親で
あり得る(即ち、母親又は胎児の遺伝子型を有し得る)。付着胎盤幹細胞の集団若しくは
胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、起源が専ら胎児若しくは母親である胎盤幹細胞を含み得
、又は胎児及び母親起源の胎盤幹細胞の混合集団を含み得る。胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞
を含む細胞の集団は、下述の形態、マーカー及び培養特徴により特定及び選択され得る。
本明細書で述べられる組成物及び方法において使用可能な付着胎盤幹細胞並びにそのよう
な細胞を得て培養する方法は、米国特許第7,045,148号;第7,255,879
号;第7,311,904号及び第7,311,905号;並びに米国出願公開第200
7/0275362号及び第2008/0032401号に詳細に述べられており、その
開示内容はその全体を参照して本明細書により組み込まれる。
(5.3.1 物理的及び形態的特徴)
本明細書で提供される組成物及び方法において使用可能な付着胎盤幹細胞は、初代培養
又は細胞培養にて培養されると、組織培養基質、例えば、組織培養容器表面(例えば、組
織培養プラスチック)に付着する。培養液中の付着胎盤幹細胞は概して線維芽細胞様の星
状外観を呈し、多くの細胞質突起(cyotplasmic process)が細胞体中央部から伸長して
いる。しかし、付着胎盤幹細胞は同じ条件下で培養される線維芽細胞と形態学的に識別可
能である。それは、付着胎盤幹細胞が線維芽細胞より多数のそのような突起を示すためで
ある。形態学的に、付着胎盤幹細胞は、培養時に概してより丸く、又は丸石様形態を呈す
る造血幹細胞とも識別可能である。
本明細書で提供される組成物及び方法において使用可能な付着胎盤幹細胞は、初代培養
又は細胞培養にて培養されると、組織培養基質、例えば、組織培養容器表面(例えば、組
織培養プラスチック)に付着する。培養液中の付着胎盤幹細胞は概して線維芽細胞様の星
状外観を呈し、多くの細胞質突起(cyotplasmic process)が細胞体中央部から伸長して
いる。しかし、付着胎盤幹細胞は同じ条件下で培養される線維芽細胞と形態学的に識別可
能である。それは、付着胎盤幹細胞が線維芽細胞より多数のそのような突起を示すためで
ある。形態学的に、付着胎盤幹細胞は、培養時に概してより丸く、又は丸石様形態を呈す
る造血幹細胞とも識別可能である。
(5.3.2 細胞表面、分子及び遺伝子マーカー)
単離付着胎盤幹細胞及び付着胎盤幹細胞集団は、幹細胞又は幹細胞を含む細胞集団を特
定し、且つ/或いは単離するために用いられ得る複数のマーカーを発現する。付着胎盤幹
細胞及び幹細胞集団(即ち、2個又はそれ以上の胎盤幹細胞)は、胎盤又はその任意の一
部(例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤葉、臍帯など)から直接得られる幹細胞及び幹細胞含有
細胞集団を含む。
単離付着胎盤幹細胞及び付着胎盤幹細胞集団は、幹細胞又は幹細胞を含む細胞集団を特
定し、且つ/或いは単離するために用いられ得る複数のマーカーを発現する。付着胎盤幹
細胞及び幹細胞集団(即ち、2個又はそれ以上の胎盤幹細胞)は、胎盤又はその任意の一
部(例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤葉、臍帯など)から直接得られる幹細胞及び幹細胞含有
細胞集団を含む。
一般的に、付着胎盤幹細胞はCD73,CD105,CD200,HLA-G及び/又
はOCT-4マーカーを発現し、CD34,CD38又はCD45を発現しない。胎盤幹
細胞はHLA-ABC(MHC-1)及びHLA-DRも発現し得る。
はOCT-4マーカーを発現し、CD34,CD38又はCD45を発現しない。胎盤幹
細胞はHLA-ABC(MHC-1)及びHLA-DRも発現し得る。
一実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はCD200+又はHLA-G+である。具体的
な実施形態では、該幹細胞はCD200+及びHLA-G+である。具体的な実施形態で
は、前記幹細胞はCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では、前記
幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前
記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、
前記幹細胞はCD34-,CD38-,CD45-,CD73+及びCD105+である
。別の具体的な実施形態では、前記CD200+又はHLA-G+幹細胞は、胚様体の形
成を可能にする条件下、該幹細胞を含む胎盤細胞集団における胚様体の形成を促進する。
な実施形態では、該幹細胞はCD200+及びHLA-G+である。具体的な実施形態で
は、前記幹細胞はCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形態では、前記
幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前
記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、
前記幹細胞はCD34-,CD38-,CD45-,CD73+及びCD105+である
。別の具体的な実施形態では、前記CD200+又はHLA-G+幹細胞は、胚様体の形
成を可能にする条件下、該幹細胞を含む胎盤細胞集団における胚様体の形成を促進する。
別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はCD73+,CD105+及びCD200+
である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はHLA-G+である。別の具体的な実
施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な
実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。より具体的
な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-,CD45-及びHLA-G+で
ある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+,CD105+及びCD20
0+であり、該幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下にて培養さ
れると、該集団における1つ又はそれ以上の胚様体の形成を促進する。
である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はHLA-G+である。別の具体的な実
施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な
実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。より具体的
な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-,CD45-及びHLA-G+で
ある。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+,CD105+及びCD20
0+であり、該幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下にて培養さ
れると、該集団における1つ又はそれ以上の胚様体の形成を促進する。
別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はCD200+及びOCT-4+である。具体
的な実施形態では、該幹細胞はCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形
態では、前記幹細胞はHLA-G+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はC
D34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は
CD34-,CD38-及びCD45-である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞
はCD34-,CD38-,CD45-,CD73+,CD105+及びHLA-G+で
ある。別の具体的な実施形態では、該幹細胞は、該幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の
形成を可能にする条件下にて培養されると、該集団による1つ又はそれ以上の胚様体の生
成を促進する。
的な実施形態では、該幹細胞はCD73+及びCD105+である。別の具体的な実施形
態では、前記幹細胞はHLA-G+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はC
D34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は
CD34-,CD38-及びCD45-である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞
はCD34-,CD38-,CD45-,CD73+,CD105+及びHLA-G+で
ある。別の具体的な実施形態では、該幹細胞は、該幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の
形成を可能にする条件下にて培養されると、該集団による1つ又はそれ以上の胚様体の生
成を促進する。
別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はCD73+,CD105+及びHLA-G+
である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45
-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD4
5-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はOCT-4+である。別の具体的
な実施形態では、前記幹細胞はCD200+である。より具体的な実施形態では、前記幹
細胞はCD34-,CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。
別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、前記幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の形
成を可能にする条件下にて培養されると、該集団における胚様体の形成を促進する。
である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45
-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD4
5-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はOCT-4+である。別の具体的
な実施形態では、前記幹細胞はCD200+である。より具体的な実施形態では、前記幹
細胞はCD34-,CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。
別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、前記幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の形
成を可能にする条件下にて培養されると、該集団における胚様体の形成を促進する。
別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はCD73+及びCD105+であり、前記幹
細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下にて培養されると、前記
集団における1つ又はそれ以上の胚様体の形成を促進する。具体的な実施形態では、前記
幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前
記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、
前記幹細胞はOCT-4+である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はOCT-4
+,CD34-,CD38-及びCD45-である。
細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下にて培養されると、前記
集団における1つ又はそれ以上の胚様体の形成を促進する。具体的な実施形態では、前記
幹細胞はCD34-,CD38-又はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前
記幹細胞はCD34-,CD38-及びCD45-である。別の具体的な実施形態では、
前記幹細胞はOCT-4+である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はOCT-4
+,CD34-,CD38-及びCD45-である。
別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はOCT-4+であり、胚様体の形成を可能に
する条件下にて培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞集団における1つ又はそれ
以上の胚様体の形成を促進する。具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+及びC
D105+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又
はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD200+である。よ
り具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+,CD105+,CD200+,CD
34-,CD38-及びCD45-である。
する条件下にて培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞集団における1つ又はそれ
以上の胚様体の形成を促進する。具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+及びC
D105+である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD34-,CD38-又
はCD45-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD200+である。よ
り具体的な実施形態では、前記幹細胞はCD73+,CD105+,CD200+,CD
34-,CD38-及びCD45-である。
付着胎盤幹細胞は酵素消化又は灌流、例えば、上述の哺乳動物胎盤の灌流によって得ら
れ得る。具体的な実施形態では、灌流溶液が臍静脈中を通されて臍動脈から回収され、又
は臍動脈中を通されて臍静脈から回収される。付着胎盤幹細胞は実質的に専ら胎児起源で
あり得、即ち、例えば、集団における胎盤幹細胞の90%、95%,99%又は99.5
%超が胎児起源である。付着胎盤幹細胞を得るための胎盤組織の酵素消化は、米国特許出
願公開第2007/0275362号に述べられており、その開示内容はその全体を参照
して本明細書に組み込まれる。
れ得る。具体的な実施形態では、灌流溶液が臍静脈中を通されて臍動脈から回収され、又
は臍動脈中を通されて臍静脈から回収される。付着胎盤幹細胞は実質的に専ら胎児起源で
あり得、即ち、例えば、集団における胎盤幹細胞の90%、95%,99%又は99.5
%超が胎児起源である。付着胎盤幹細胞を得るための胎盤組織の酵素消化は、米国特許出
願公開第2007/0275362号に述べられており、その開示内容はその全体を参照
して本明細書に組み込まれる。
付着胎盤幹細胞は、他の実施形態において、骨髄由来間葉幹細胞と比べてより検出可能
に高いレベルにて1つ又はそれ以上の遺伝子を発現し、該1つ又はそれ以上の遺伝子はA
CTG2,ADARB1,AMIGO2,ATRS-1,B4GALT6,BCHE,C
11orf9,CD200,COL4A1,COL4A2,CPA4,DMD,DSC3
,DSG2,ELOVL2,F2RL1,FLJ10781,GATA6,GPR126
,GPRC5B,ICAM1,IER3,IGFBP7,IL1A,IL6,IL18,
KRT18,KRT8,LIPG,LRAP,MATN2,MEST,NFE2L3,N
UAK1,PCDH7,PDLIM3,PJP2,RTN1,SERPINB9,ST3
GAL6,ST6GALNAC5,SLC12A8,TCF21,TGFB2,VTN,
ZC3H12A、又は前述の任意の組合せであり、該細胞は同等の条件下で増殖される。
具体的な実施形態では、胎盤幹細胞特異的又は臍帯幹細胞特異的遺伝子はCD200であ
る。
に高いレベルにて1つ又はそれ以上の遺伝子を発現し、該1つ又はそれ以上の遺伝子はA
CTG2,ADARB1,AMIGO2,ATRS-1,B4GALT6,BCHE,C
11orf9,CD200,COL4A1,COL4A2,CPA4,DMD,DSC3
,DSG2,ELOVL2,F2RL1,FLJ10781,GATA6,GPR126
,GPRC5B,ICAM1,IER3,IGFBP7,IL1A,IL6,IL18,
KRT18,KRT8,LIPG,LRAP,MATN2,MEST,NFE2L3,N
UAK1,PCDH7,PDLIM3,PJP2,RTN1,SERPINB9,ST3
GAL6,ST6GALNAC5,SLC12A8,TCF21,TGFB2,VTN,
ZC3H12A、又は前述の任意の組合せであり、該細胞は同等の条件下で増殖される。
具体的な実施形態では、胎盤幹細胞特異的又は臍帯幹細胞特異的遺伝子はCD200であ
る。
(5.4 胎盤灌流液細胞の培養)
(5.4.1 培地)
単離胎盤細胞、例えば、灌流液細胞又はそれから得られる細胞、例えば、胎盤幹細胞若
しくは胎盤幹細胞集団又は胎盤幹細胞が生じる細胞若しくは胎盤組織は、細胞培養を開始
し、又は細胞培養に播種するために用いられ得る。一般的に、細胞は細胞外マトリクス又
はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン(例えば、天然又は変性)、ゼラチン、フィ
ブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞外膜蛋白質(例えば、MATRIG
EL(BD Discovery Labware社、マサチューセッツ州ベッドフォー
ド(Bedford))でコーティングされていない、又はコーティングされた滅菌組織培養容
器に移される。
(5.4.1 培地)
単離胎盤細胞、例えば、灌流液細胞又はそれから得られる細胞、例えば、胎盤幹細胞若
しくは胎盤幹細胞集団又は胎盤幹細胞が生じる細胞若しくは胎盤組織は、細胞培養を開始
し、又は細胞培養に播種するために用いられ得る。一般的に、細胞は細胞外マトリクス又
はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン(例えば、天然又は変性)、ゼラチン、フィ
ブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞外膜蛋白質(例えば、MATRIG
EL(BD Discovery Labware社、マサチューセッツ州ベッドフォー
ド(Bedford))でコーティングされていない、又はコーティングされた滅菌組織培養容
器に移される。
胎盤細胞は当分野において細胞、例えば、幹細胞の培養にとって許容可能であると認識
されている任意の培地及び任意の条件下にて培養され得る。好ましくは、培地は血清を含
む。胎盤灌流液細胞又は胎盤幹細胞は、例えば、ITS(インスリン-トランスフェリン
-セレン)、LA+BSA(リノール酸-ウシ血清アルブミン)、ブドウ糖、L-アスコ
ルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むD
MEM-LG(ダルベッコ改変最小培地(Dulbecco's Modified Essential Medium)、低
糖)/MCDB201(ニワトリ線維芽細胞基礎培地);10%ウシ胎仔血清(FBS)
を含むDMEM-HG(高糖);15% FBSを含むDMEM-HG;10% FBS,
10%ウマ血清及びヒドロコルチゾンを含むIMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地(Is
cove's modified Dulbecco's medium));10% FBS,EGF及びヘパリンを含むM
199;10% FBS,GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを含むα-ME
M(最小必須培地);10% FBS,GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを
含むDMEMなどにて培養され得る。好ましい培地は、2% FBS、ITS、LA+B
SA、ブドウ糖、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF及びペニシリン/ストレプトマ
イシンを含むDMEM-LG/MCDB-201である。
されている任意の培地及び任意の条件下にて培養され得る。好ましくは、培地は血清を含
む。胎盤灌流液細胞又は胎盤幹細胞は、例えば、ITS(インスリン-トランスフェリン
-セレン)、LA+BSA(リノール酸-ウシ血清アルブミン)、ブドウ糖、L-アスコ
ルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むD
MEM-LG(ダルベッコ改変最小培地(Dulbecco's Modified Essential Medium)、低
糖)/MCDB201(ニワトリ線維芽細胞基礎培地);10%ウシ胎仔血清(FBS)
を含むDMEM-HG(高糖);15% FBSを含むDMEM-HG;10% FBS,
10%ウマ血清及びヒドロコルチゾンを含むIMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地(Is
cove's modified Dulbecco's medium));10% FBS,EGF及びヘパリンを含むM
199;10% FBS,GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを含むα-ME
M(最小必須培地);10% FBS,GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを
含むDMEMなどにて培養され得る。好ましい培地は、2% FBS、ITS、LA+B
SA、ブドウ糖、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF及びペニシリン/ストレプトマ
イシンを含むDMEM-LG/MCDB-201である。
胎盤細胞を培養するために用いられ得る他の培地には、DMEM(高糖又は低糖)、イ
ーグル基礎培地、ハムF10培地(F10)、ハムF-12培地(F12)、イスコフ改
変ダルベッコ培地、間葉幹細胞増殖培地(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium)(M
SCGM)、Liebovitz’s L-15培地、MCDB、DMEM/F12、R
PMI 1640、アドバンストDMEM(Gibco社)、DMEM/MCDB201
(Sigma社)及びCELL-GRO FREEが含まれる。
ーグル基礎培地、ハムF10培地(F10)、ハムF-12培地(F12)、イスコフ改
変ダルベッコ培地、間葉幹細胞増殖培地(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium)(M
SCGM)、Liebovitz’s L-15培地、MCDB、DMEM/F12、R
PMI 1640、アドバンストDMEM(Gibco社)、DMEM/MCDB201
(Sigma社)及びCELL-GRO FREEが含まれる。
培地は、例えば、血清(例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、好ましくは約2~15%(
v/v);ウマ血清(ES);ヒト血清(HS));βメルカプトエタノール(BME)
、好ましくは約0.001%(v/v);1つ又はそれ以上の増殖因子、例えば、血小板
由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bF
GF)、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮
増殖因子(VEGF)及びエリスロポエチン(EPO);L-バリンを含むアミノ酸;並
びに微生物汚染を制御する1つ又はそれ以上の抗生物質及び/又は抗真菌剤、例えば、単
独又は組合せでのペニシリンG、ストレプトマイシンスルファート、アンホテリシンB、
ゲンタマイシン及びニスタチンを含む、1つ又はそれ以上の成分を補充され得る。
v/v);ウマ血清(ES);ヒト血清(HS));βメルカプトエタノール(BME)
、好ましくは約0.001%(v/v);1つ又はそれ以上の増殖因子、例えば、血小板
由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bF
GF)、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮
増殖因子(VEGF)及びエリスロポエチン(EPO);L-バリンを含むアミノ酸;並
びに微生物汚染を制御する1つ又はそれ以上の抗生物質及び/又は抗真菌剤、例えば、単
独又は組合せでのペニシリンG、ストレプトマイシンスルファート、アンホテリシンB、
ゲンタマイシン及びニスタチンを含む、1つ又はそれ以上の成分を補充され得る。
胎盤灌流液又は灌流液細胞は、標準的組織培養条件、例えば、組織培養皿又はマルチウ
ェルプレートにて培養され得る。また、胎盤灌流液又は灌流液細胞は懸滴法を用いて培養
され得る。この方法では、胎盤幹細胞は約5mL培地において1mL当たり約1×104
個の細胞にて懸濁され、培地の1つ又はそれ以上の液滴が組織培養容器、例えば、100
mLペトリ皿の蓋の内側に配置される。例えば、液滴は、例えば、マルチチャネルピペッ
タからの単一液滴又は多重液滴であり得る。その蓋は慎重に反転され、一定量の液体、例
えば、皿の雰囲気における含水量を維持するのに十分な滅菌PBSを含む皿の底部の上部
に配置され、幹細胞が培養される。
ェルプレートにて培養され得る。また、胎盤灌流液又は灌流液細胞は懸滴法を用いて培養
され得る。この方法では、胎盤幹細胞は約5mL培地において1mL当たり約1×104
個の細胞にて懸濁され、培地の1つ又はそれ以上の液滴が組織培養容器、例えば、100
mLペトリ皿の蓋の内側に配置される。例えば、液滴は、例えば、マルチチャネルピペッ
タからの単一液滴又は多重液滴であり得る。その蓋は慎重に反転され、一定量の液体、例
えば、皿の雰囲気における含水量を維持するのに十分な滅菌PBSを含む皿の底部の上部
に配置され、幹細胞が培養される。
(5.4.2 胎盤細胞の拡大及び増殖)
単離胎盤細胞、例えば、灌流液若しくは灌流液細胞若しくは幹細胞又はそのような細胞
の単離集団(例えば、幹細胞又は幹細胞集団が通常インビボにて関連する胎盤細胞の少な
くとも約50%から分離される幹細胞又は幹細胞集団)は、インビトロにて増殖及び拡大
され得る。例えば、胎盤細胞集団は、細胞が70~90%コンフルエンスまで増殖するの
に十分な時間、即ち、細胞及びそれらの子孫が組織培養容器の培養表面領域の70~90
%を占めるまで組織培養容器、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどにて培
養され得る。
単離胎盤細胞、例えば、灌流液若しくは灌流液細胞若しくは幹細胞又はそのような細胞
の単離集団(例えば、幹細胞又は幹細胞集団が通常インビボにて関連する胎盤細胞の少な
くとも約50%から分離される幹細胞又は幹細胞集団)は、インビトロにて増殖及び拡大
され得る。例えば、胎盤細胞集団は、細胞が70~90%コンフルエンスまで増殖するの
に十分な時間、即ち、細胞及びそれらの子孫が組織培養容器の培養表面領域の70~90
%を占めるまで組織培養容器、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどにて培
養され得る。
胎盤幹細胞は細胞増殖を可能にする密度にて培養容器に播種され得る。例えば、細胞は
低密度(例えば、約1,000~約5,000細胞/cm2)から高密度(例えば、約5
0,000又はそれ以上の細胞/cm2)までにて播種され得る。好ましい実施形態では
、細胞は空気中約0~約5体積パーセントCO2にて培養される。一部の好ましい実施形
態では、細胞は空気中約2~約25パーセントO2、好ましくは空気中約5~20パーセ
ントO2にて培養される。好ましくは、細胞は約25℃~約40℃、好ましくは37℃で
培養される。好ましくは、細胞はインキュベータにて培養される。培地は、例えば、バイ
オリアクターを用いて静置又は攪拌され得る。好ましくは、胎盤幹細胞は低酸化ストレス
下にて増殖される(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロー
ル、N-アセチルシステインなどを加えて)。
低密度(例えば、約1,000~約5,000細胞/cm2)から高密度(例えば、約5
0,000又はそれ以上の細胞/cm2)までにて播種され得る。好ましい実施形態では
、細胞は空気中約0~約5体積パーセントCO2にて培養される。一部の好ましい実施形
態では、細胞は空気中約2~約25パーセントO2、好ましくは空気中約5~20パーセ
ントO2にて培養される。好ましくは、細胞は約25℃~約40℃、好ましくは37℃で
培養される。好ましくは、細胞はインキュベータにて培養される。培地は、例えば、バイ
オリアクターを用いて静置又は攪拌され得る。好ましくは、胎盤幹細胞は低酸化ストレス
下にて増殖される(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロー
ル、N-アセチルシステインなどを加えて)。
70~90%コンフルエンスが得られると、細胞は継代され得る。例えば、細胞は組織
培養表面から分離するために当分野において周知の技法を用いて酵素処理、例えば、トリ
プシン処理され得る。ピペット採取によって細胞を除去し、細胞を計数した後、約20,
000~100,000個の幹細胞、好ましくは約50,000個の幹細胞が新鮮培地を
含む新たな培養容器に継代される。通常、新たな培地は幹細胞が除去された培地と同じタ
イプである。本明細書で提供される方法及び組成物において有用な付着胎盤幹細胞は、少
なくとも1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,18又は20
回又はそれ以上継代されていてよい。
培養表面から分離するために当分野において周知の技法を用いて酵素処理、例えば、トリ
プシン処理され得る。ピペット採取によって細胞を除去し、細胞を計数した後、約20,
000~100,000個の幹細胞、好ましくは約50,000個の幹細胞が新鮮培地を
含む新たな培養容器に継代される。通常、新たな培地は幹細胞が除去された培地と同じタ
イプである。本明細書で提供される方法及び組成物において有用な付着胎盤幹細胞は、少
なくとも1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,18又は20
回又はそれ以上継代されていてよい。
(5.4.3 胎盤細胞集団)
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、付着胎盤幹細胞、CD34+胎盤細胞(例えば、C
D34+胎盤内皮前駆細胞)、胎盤以外の供給源(例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨
髄など)由来のCD34+細胞、幹細胞ではない胎盤細胞又は胎盤細胞でない細胞が補充
され得る。
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、付着胎盤幹細胞、CD34+胎盤細胞(例えば、C
D34+胎盤内皮前駆細胞)、胎盤以外の供給源(例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨
髄など)由来のCD34+細胞、幹細胞ではない胎盤細胞又は胎盤細胞でない細胞が補充
され得る。
単離胎盤細胞集団、例えば、灌流液又は胎盤灌流液細胞は、非幹細胞又は非胎盤細胞の
1つ又はそれ以上の集団と組み合わせられ得る。例えば、胎盤細胞の単離集団は、血液(
例えば、胎盤血又は臍帯血)、血液由来幹細胞(例えば、胎盤血又は臍帯血由来の幹細胞
)、血液由来有核細胞集団、骨髄由来間葉細胞、骨由来幹細胞集団、粗骨髄(crude bone
marrow)、成体(体性)幹細胞、組織内に含まれる幹細胞集団、培養幹細胞、完全に分
化した細胞の集団(例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓
細胞等)などと組み合わせられ得る。単離胎盤細胞集団における細胞は、各集団における
全有核細胞の数を比較し、約100,000,000:1,50,000,000:1,
20,000,000:1,10,000,000:1,5,000,000:1,2,
000,000:1,1,000,000:1,500,000:1,200,000:
1,100,000:1,50,000:1,20,000:1,10,000:1,5
,000:1,2,000:1,1,000:1,500:1,200:1,100:1
,50:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1;1:2;1:5;1:10
;1:100;1:200;1:500;1:1,000;1:2,000;1:5,0
00;1:10,000;1:20,000;1:50,000;1:100,000;
1:500,000;1:1,000,000;1:2,000,000;1:5,00
0,000;1:10,000,000;1:20,000,000;1:50,000
,000;又は約1:100,000,000の比率にて別のタイプの複数の細胞と組み
合わせられ得る。単離胎盤細胞集団における細胞は、複数の細胞型の複数の細胞とも組み
合わせられ得る。
1つ又はそれ以上の集団と組み合わせられ得る。例えば、胎盤細胞の単離集団は、血液(
例えば、胎盤血又は臍帯血)、血液由来幹細胞(例えば、胎盤血又は臍帯血由来の幹細胞
)、血液由来有核細胞集団、骨髄由来間葉細胞、骨由来幹細胞集団、粗骨髄(crude bone
marrow)、成体(体性)幹細胞、組織内に含まれる幹細胞集団、培養幹細胞、完全に分
化した細胞の集団(例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓
細胞等)などと組み合わせられ得る。単離胎盤細胞集団における細胞は、各集団における
全有核細胞の数を比較し、約100,000,000:1,50,000,000:1,
20,000,000:1,10,000,000:1,5,000,000:1,2,
000,000:1,1,000,000:1,500,000:1,200,000:
1,100,000:1,50,000:1,20,000:1,10,000:1,5
,000:1,2,000:1,1,000:1,500:1,200:1,100:1
,50:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1;1:2;1:5;1:10
;1:100;1:200;1:500;1:1,000;1:2,000;1:5,0
00;1:10,000;1:20,000;1:50,000;1:100,000;
1:500,000;1:1,000,000;1:2,000,000;1:5,00
0,000;1:10,000,000;1:20,000,000;1:50,000
,000;又は約1:100,000,000の比率にて別のタイプの複数の細胞と組み
合わせられ得る。単離胎盤細胞集団における細胞は、複数の細胞型の複数の細胞とも組み
合わせられ得る。
1つでは、胎盤灌流液又は灌流液細胞の単離集団は複数のCD34+細胞と組み合わせ
られる。そのようなCD34+細胞は、例えば、未処理胎盤血、臍帯血又は末梢血内;胎
盤血、臍帯血又は末梢血由来の全有核細胞内;胎盤血、臍帯血又は末梢血由来のCD34
+細胞の単離集団内;未処理骨髄内;骨髄由来の全有核細胞内;骨髄由来のCD34+細
胞の単離集団内などに含まれ得る。具体的な実施形態では、造血幹細胞はCD34+胎盤
内皮前駆細胞である。
られる。そのようなCD34+細胞は、例えば、未処理胎盤血、臍帯血又は末梢血内;胎
盤血、臍帯血又は末梢血由来の全有核細胞内;胎盤血、臍帯血又は末梢血由来のCD34
+細胞の単離集団内;未処理骨髄内;骨髄由来の全有核細胞内;骨髄由来のCD34+細
胞の単離集団内などに含まれ得る。具体的な実施形態では、造血幹細胞はCD34+胎盤
内皮前駆細胞である。
(5.5 胎盤細胞バンクの作製)
胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は細胞バンクに保存され得る。好ましい実施形態では、
胎盤灌流液又は灌流液細胞はヒト灌流液又は灌流液細胞である。灌流液又は灌流液細胞は
ユニット、例えば、単一胎盤又は単一胎盤の単一灌流から回収される全灌流液又は細胞に
て保存され得る。複数の灌流又は複数の胎盤由来の灌流液又は灌流液細胞はユニットに組
み合わせられ得る。
胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は細胞バンクに保存され得る。好ましい実施形態では、
胎盤灌流液又は灌流液細胞はヒト灌流液又は灌流液細胞である。灌流液又は灌流液細胞は
ユニット、例えば、単一胎盤又は単一胎盤の単一灌流から回収される全灌流液又は細胞に
て保存され得る。複数の灌流又は複数の胎盤由来の灌流液又は灌流液細胞はユニットに組
み合わせられ得る。
細胞、例えば、分娩後の胎盤由来の幹細胞、胎盤灌流液細胞又はその組合せは、胎盤幹
細胞の一組のロット、例えば、一組の個々に投与される用量を生成するために多くの異な
る方法にて培養され得る。そのようなロットは、例えば、胎盤灌流液又は酵素消化胎盤組
織由来の幹細胞から得られ得る。複数の胎盤から得られる複数組のロットの胎盤細胞は、
例えば、長期保存のために胎盤細胞バンクに構成され得る。一般的に、付着幹細胞は種培
養を形成するために胎盤物質の初期培養から得られ、初期培養は約同数の倍加(doubling
)由来の細胞集団を形成するために制御条件下にて拡大される。好ましくは、ロットは単
一胎盤の組織から得られるが、複数の胎盤の組織から得られ得る。
細胞の一組のロット、例えば、一組の個々に投与される用量を生成するために多くの異な
る方法にて培養され得る。そのようなロットは、例えば、胎盤灌流液又は酵素消化胎盤組
織由来の幹細胞から得られ得る。複数の胎盤から得られる複数組のロットの胎盤細胞は、
例えば、長期保存のために胎盤細胞バンクに構成され得る。一般的に、付着幹細胞は種培
養を形成するために胎盤物質の初期培養から得られ、初期培養は約同数の倍加(doubling
)由来の細胞集団を形成するために制御条件下にて拡大される。好ましくは、ロットは単
一胎盤の組織から得られるが、複数の胎盤の組織から得られ得る。
一実施形態では、胎盤細胞ロットは以下のように得られる。胎盤灌流液細胞は、好まし
くは、胎盤血管系のみを通しての1つ又はそれ以上の胎盤の灌流によって、好ましくは、
残留血液を除去するために臍帯血を排出され、且つ灌流された胎盤から得られ、結果とし
て生じる灌流液中の細胞は遠心分離によって回収され、赤血球が除去される。これらの細
胞は回収され、都合の良い容量の培地に再懸濁され、初期継代細胞と定義付けられる。
くは、胎盤血管系のみを通しての1つ又はそれ以上の胎盤の灌流によって、好ましくは、
残留血液を除去するために臍帯血を排出され、且つ灌流された胎盤から得られ、結果とし
て生じる灌流液中の細胞は遠心分離によって回収され、赤血球が除去される。これらの細
胞は回収され、都合の良い容量の培地に再懸濁され、初期継代細胞と定義付けられる。
次に、初期継代細胞は拡大培養に播種するために用いられる。拡大培養は別個の細胞培
養装置、例えば、NUNC(商標)によるCell Factoryの任意の構成でよい
。初期継代培養における細胞は、例えば、1×103,2×103,3×103,4×1
03,5×103,6×103,7×103,8×103,9×103,1×104,1
×104,2×104,3×104,4×104,5×104,6×104,7×104
,8×104,9×104又は10×104個の幹細胞で拡大培養に播種するため、任意
の程度に細分され得る。好ましくは、各拡大培養に播種するために約2×104~約3×
104個の0代継代細胞が用いられる。拡大培養数は初期継代細胞数に依存し得、幹細胞
が得られる特定の胎盤に依存して数が多く、又は少なくなり得る。
養装置、例えば、NUNC(商標)によるCell Factoryの任意の構成でよい
。初期継代培養における細胞は、例えば、1×103,2×103,3×103,4×1
03,5×103,6×103,7×103,8×103,9×103,1×104,1
×104,2×104,3×104,4×104,5×104,6×104,7×104
,8×104,9×104又は10×104個の幹細胞で拡大培養に播種するため、任意
の程度に細分され得る。好ましくは、各拡大培養に播種するために約2×104~約3×
104個の0代継代細胞が用いられる。拡大培養数は初期継代細胞数に依存し得、幹細胞
が得られる特定の胎盤に依存して数が多く、又は少なくなり得る。
拡大培養は培養液中の細胞密度が一定値、例えば、約1×105細胞/cm2に達する
まで増殖される。細胞はこの時点において回収されて凍結保存され、又は上述のように新
たな拡大培養に継代され得る。細胞は使用前に、例えば、2,3,4,5,6,7,8,
9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19又は20回継代され
得る。好ましくは、集団倍加の累積数の記録が拡大培養時に維持される。初期継代培養由
来の細胞は、2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,18,20,
22,24,26,28,30,32,34,36,38若しくは40倍加又は最大60
倍加で拡大され得る。しかし、好ましくは、細胞集団を個々の用量に分割する前の集団倍
加数は約15~約30、好ましくは約20倍加である。細胞は拡大プロセス全体にわたっ
て継続的に培養され、又は拡大期間中の1又はそれ以上の時点において凍結され得る。
まで増殖される。細胞はこの時点において回収されて凍結保存され、又は上述のように新
たな拡大培養に継代され得る。細胞は使用前に、例えば、2,3,4,5,6,7,8,
9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19又は20回継代され
得る。好ましくは、集団倍加の累積数の記録が拡大培養時に維持される。初期継代培養由
来の細胞は、2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,18,20,
22,24,26,28,30,32,34,36,38若しくは40倍加又は最大60
倍加で拡大され得る。しかし、好ましくは、細胞集団を個々の用量に分割する前の集団倍
加数は約15~約30、好ましくは約20倍加である。細胞は拡大プロセス全体にわたっ
て継続的に培養され、又は拡大期間中の1又はそれ以上の時点において凍結され得る。
個々の用量に用いられる細胞は凍結され、例えば、後の使用のために凍結保存され得る
。個々の用量は、例えば、約百万~約一億の細胞/mlを含み得、全部で約106~約1
09個の細胞を含み得る。
。個々の用量は、例えば、約百万~約一億の細胞/mlを含み得、全部で約106~約1
09個の細胞を含み得る。
従って、一実施形態では、ヒト分娩後胎盤由来の初代培養胎盤幹細胞を第一の複数の集
団倍加に拡大するステップ;前記胎盤幹細胞を凍結保存してMaster Cell B
ankを形成するステップ;Master Cell Bank由来の複数の胎盤幹細胞
を第二の複数の集団倍加に拡大するステップ;前記胎盤幹細胞を凍結保存してWorki
ng Cell Bankを形成するステップ;Working Cell Bank由
来の複数の胎盤幹細胞を第三の複数の集団倍加に拡大するステップ;及び前記胎盤幹細胞
を個々の用量に凍結保存するステップを含む方法によって胎盤幹細胞バンクを作製するこ
とができ、前記個々の用量は胎盤幹細胞バンクを集合的に構成する。具体的な一実施形態
では、前記個々の用量は約104~約105個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施形
態では、前記個々の用量は約105~約106個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施
形態では、前記個々の用量は約106~約107個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実
施形態では、前記個々の用量は約107~約108個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な
実施形態では、前記個々の用量は約108~約109個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的
な実施形態では、前記個々の用量は約109~約1010個の胎盤幹細胞を含む。
団倍加に拡大するステップ;前記胎盤幹細胞を凍結保存してMaster Cell B
ankを形成するステップ;Master Cell Bank由来の複数の胎盤幹細胞
を第二の複数の集団倍加に拡大するステップ;前記胎盤幹細胞を凍結保存してWorki
ng Cell Bankを形成するステップ;Working Cell Bank由
来の複数の胎盤幹細胞を第三の複数の集団倍加に拡大するステップ;及び前記胎盤幹細胞
を個々の用量に凍結保存するステップを含む方法によって胎盤幹細胞バンクを作製するこ
とができ、前記個々の用量は胎盤幹細胞バンクを集合的に構成する。具体的な一実施形態
では、前記個々の用量は約104~約105個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施形
態では、前記個々の用量は約105~約106個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施
形態では、前記個々の用量は約106~約107個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実
施形態では、前記個々の用量は約107~約108個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な
実施形態では、前記個々の用量は約108~約109個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的
な実施形態では、前記個々の用量は約109~約1010個の胎盤幹細胞を含む。
好ましい実施形態では、胎盤が得られるドナー(例えば、母親)は少なくとも1つの病
原体について試験される。母親が試験病原体に対して陽性反応を示す場合、胎盤由来のロ
ット全体が廃棄される。そのような試験は、0継代細胞の樹立前後又は拡大培養時を含む
、胎盤幹細胞ロットの作製時にいつでも行われ得る。その存在が試験される病原体には、
限定されないが、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、ヒト免疫不全ウ
イルス(I型及びII型)、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどが含まれる。
原体について試験される。母親が試験病原体に対して陽性反応を示す場合、胎盤由来のロ
ット全体が廃棄される。そのような試験は、0継代細胞の樹立前後又は拡大培養時を含む
、胎盤幹細胞ロットの作製時にいつでも行われ得る。その存在が試験される病原体には、
限定されないが、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、ヒト免疫不全ウ
イルス(I型及びII型)、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどが含まれる。
(5.6 胎盤細胞の保存)
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞並びに胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と付着胎盤幹細胞及
び/又はCD34+胎盤細胞との組合せは保存され、即ち、長期保存を可能にする条件又
は、例えば、アポトーシス若しくはネクローシスによる細胞死を阻害する条件下に置かれ
得る。
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞並びに胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と付着胎盤幹細胞及
び/又はCD34+胎盤細胞との組合せは保存され、即ち、長期保存を可能にする条件又
は、例えば、アポトーシス若しくはネクローシスによる細胞死を阻害する条件下に置かれ
得る。
発明の名称が「Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preservi
ng Organs,」である、関連する米国出願公開第2007/0190042号(その開示内
容はその全体を参照して本明細書により組み込まれる)に述べられているように、細胞は
、例えば、アポトーシス阻害剤、ネクローシス阻害剤及び/又は酸素運搬パーフルオロカ
ーボンを含む組成物を用いて保存され得る。
ng Organs,」である、関連する米国出願公開第2007/0190042号(その開示内
容はその全体を参照して本明細書により組み込まれる)に述べられているように、細胞は
、例えば、アポトーシス阻害剤、ネクローシス阻害剤及び/又は酸素運搬パーフルオロカ
ーボンを含む組成物を用いて保存され得る。
一実施形態では、胎盤細胞集団は、前記細胞集団を、例えば、乳剤又は別の相における
アポトーシス阻害剤及び酸素運搬パーフルオロカーボンを含む細胞回収組成物に接触させ
ることによって保存され得、前記アポトーシス阻害剤はアポトーシス阻害剤と接触されな
い細胞集団と比べて、幹細胞集団におけるアポトーシスを低減又は防止するのに十分な量
及び時間にて存在する。種々の実施形態において、前記アポトーシス阻害剤はカスパーゼ
阻害剤又はJNK阻害剤である。別の実施形態では、細胞回収組成物は乳化剤、例えば、
レシチンを更に含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロ
カーボンは細胞を接触させる時点において約0℃~約25℃である。より具体的な別の実
施形態では、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは細胞を接触させる
時点において約2℃~10℃又は約2℃~約5℃である。より具体的な別の実施形態では
、前記接触は前記細胞集団の輸送時に行われる。より具体的な別の実施形態では、前記接
触は前記細胞集団の凍結及び融解時に行われる。アポトーシス阻害剤は臓器保存化合物、
例えば、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、UW溶液(米国特
許第4,798,824号に述べられている;ViaSpanとしても公知;Southard e
t al, Transplantation 49(2):251-257 (1990) も参照されたい)若しくはStern et al.,
米国特許第5,552,267号(その開示内容は参照して本明細書に組み込まれる)
に述べられている溶液又はその組合せと組み合わせられ得る。
アポトーシス阻害剤及び酸素運搬パーフルオロカーボンを含む細胞回収組成物に接触させ
ることによって保存され得、前記アポトーシス阻害剤はアポトーシス阻害剤と接触されな
い細胞集団と比べて、幹細胞集団におけるアポトーシスを低減又は防止するのに十分な量
及び時間にて存在する。種々の実施形態において、前記アポトーシス阻害剤はカスパーゼ
阻害剤又はJNK阻害剤である。別の実施形態では、細胞回収組成物は乳化剤、例えば、
レシチンを更に含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロ
カーボンは細胞を接触させる時点において約0℃~約25℃である。より具体的な別の実
施形態では、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは細胞を接触させる
時点において約2℃~10℃又は約2℃~約5℃である。より具体的な別の実施形態では
、前記接触は前記細胞集団の輸送時に行われる。より具体的な別の実施形態では、前記接
触は前記細胞集団の凍結及び融解時に行われる。アポトーシス阻害剤は臓器保存化合物、
例えば、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、UW溶液(米国特
許第4,798,824号に述べられている;ViaSpanとしても公知;Southard e
t al, Transplantation 49(2):251-257 (1990) も参照されたい)若しくはStern et al.,
米国特許第5,552,267号(その開示内容は参照して本明細書に組み込まれる)
に述べられている溶液又はその組合せと組み合わせられ得る。
該方法の別の実施形態では、胎盤細胞は灌流時にアポトーシス阻害剤及び酸素運搬パー
フルオロカーボン、臓器保存化合物或いはその組合せを含む細胞回収組成物に接触させら
れる。別の実施形態では、前記細胞は組織破壊プロセス、例えば、酵素消化時に接触させ
られる。別の実施形態では、胎盤細胞は灌流による回収後又は組織破壊、例えば、酵素消
化による回収後に前記細胞回収化合物に接触させられる。
フルオロカーボン、臓器保存化合物或いはその組合せを含む細胞回収組成物に接触させら
れる。別の実施形態では、前記細胞は組織破壊プロセス、例えば、酵素消化時に接触させ
られる。別の実施形態では、胎盤細胞は灌流による回収後又は組織破壊、例えば、酵素消
化による回収後に前記細胞回収化合物に接触させられる。
通常、胎盤細胞の回収、集積及び単離時に低酸素及び機械的負荷による細胞ストレスを
最小限にし、又は排除することが好ましい。従って、該方法の別の実施形態では、胎盤灌
流液、胎盤灌流液細胞、胎盤幹細胞又は幹細胞集団は、前記保存時に6時間未満、回収、
集積又は単離時に低酸素状態に晒され、低酸素状態は通常以下の血中酸素濃度である酸素
濃度である。より具体的な実施形態では、前記細胞集団は前記保存時に2時間未満、前記
低酸素状態に晒される。より具体的な別の実施形態では、前記細胞集団は回収、集積又は
単離時に1時間未満若しくは30分未満、前記低酸素状態に晒され、又は低酸素状態に晒
されない。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は回収、集積又は単離時に剪断応力
に晒されない。
最小限にし、又は排除することが好ましい。従って、該方法の別の実施形態では、胎盤灌
流液、胎盤灌流液細胞、胎盤幹細胞又は幹細胞集団は、前記保存時に6時間未満、回収、
集積又は単離時に低酸素状態に晒され、低酸素状態は通常以下の血中酸素濃度である酸素
濃度である。より具体的な実施形態では、前記細胞集団は前記保存時に2時間未満、前記
低酸素状態に晒される。より具体的な別の実施形態では、前記細胞集団は回収、集積又は
単離時に1時間未満若しくは30分未満、前記低酸素状態に晒され、又は低酸素状態に晒
されない。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は回収、集積又は単離時に剪断応力
に晒されない。
胎盤灌流液及び灌流液細胞は小さい容器、例えば、アンプル内の、例えば、凍結保存培
地に凍結保存され得る。好適な凍結保存培地には、限定されないが、例えば、増殖培地又
は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、C2695,C2639若しく
はC6039(Sigma社)を含む培地が含まれる。好ましくは、凍結保存培地は、例
えば、約10%(v/v)の濃度でのDMSO(ジメチルスルホキシド)を含む。凍結保
存培地は更なる作用物質、例えば、メチルセルロース及び/又はグリセロールを含み得る
。好ましくは、胎盤細胞は凍結保存時に約1℃/分にて冷却される。好ましい凍結保存温
度は約-80℃~約-180℃、好ましくは約-125℃~約-140℃である。凍結保
存細胞は使用のために融解前に液体窒素に移され得る。一部の実施形態では、例えば、ア
ンプルが約-90℃に達すると、アンプルは液体窒素保存領域に移される。好ましくは、
凍結保存細胞は約25℃~約40℃の温度に、好ましくは約37℃の温度まで融解される
。
地に凍結保存され得る。好適な凍結保存培地には、限定されないが、例えば、増殖培地又
は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、C2695,C2639若しく
はC6039(Sigma社)を含む培地が含まれる。好ましくは、凍結保存培地は、例
えば、約10%(v/v)の濃度でのDMSO(ジメチルスルホキシド)を含む。凍結保
存培地は更なる作用物質、例えば、メチルセルロース及び/又はグリセロールを含み得る
。好ましくは、胎盤細胞は凍結保存時に約1℃/分にて冷却される。好ましい凍結保存温
度は約-80℃~約-180℃、好ましくは約-125℃~約-140℃である。凍結保
存細胞は使用のために融解前に液体窒素に移され得る。一部の実施形態では、例えば、ア
ンプルが約-90℃に達すると、アンプルは液体窒素保存領域に移される。好ましくは、
凍結保存細胞は約25℃~約40℃の温度に、好ましくは約37℃の温度まで融解される
。
(5.7 胎盤細胞の使用)
(5.7.1 胎盤細胞集団)
本明細書で提供されるのは、心臓又は血管疾患、障害若しくは不全を有する患者を処置
する方法であり、該方法は、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全
有核細胞及びそのような細胞の他の細胞、例えば、内皮前駆細胞、造血幹細胞若しくは臍
帯血との組合せを含む胎盤細胞集団を、前記患者に投与するステップを含む。本明細書で
用いられるように、「処置する」は、心臓又は血管疾患、障害、病状若しくは不全又はそ
の任意のパラメータ若しくは症状の治癒、修復、改善、重症度の軽減又は経時変化の低下
を包含する。種々の実施形態において、前記疾患、障害、病状又は不全は末梢血管疾患、
急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧
疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である。
(5.7.1 胎盤細胞集団)
本明細書で提供されるのは、心臓又は血管疾患、障害若しくは不全を有する患者を処置
する方法であり、該方法は、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全
有核細胞及びそのような細胞の他の細胞、例えば、内皮前駆細胞、造血幹細胞若しくは臍
帯血との組合せを含む胎盤細胞集団を、前記患者に投与するステップを含む。本明細書で
用いられるように、「処置する」は、心臓又は血管疾患、障害、病状若しくは不全又はそ
の任意のパラメータ若しくは症状の治癒、修復、改善、重症度の軽減又は経時変化の低下
を包含する。種々の実施形態において、前記疾患、障害、病状又は不全は末梢血管疾患、
急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧
疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である。
胎盤灌流液細胞及び胎盤灌流液細胞集団或いはそれらから得られる幹細胞は、幹細胞又
は幹細胞から分化した細胞を必要とする患者への投与に備え、エクスビボ又はインビボに
て特定の細胞型に分化するように誘導され得る。例えば、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞
は、インビボでの臓器新生及び損傷の修復のために損傷臓器に注入され得る。そのような
損傷は、例えば、動脈又は静脈閉塞、梗塞、虚血などによって引き起こされ得る。
は幹細胞から分化した細胞を必要とする患者への投与に備え、エクスビボ又はインビボに
て特定の細胞型に分化するように誘導され得る。例えば、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞
は、インビボでの臓器新生及び損傷の修復のために損傷臓器に注入され得る。そのような
損傷は、例えば、動脈又は静脈閉塞、梗塞、虚血などによって引き起こされ得る。
胎盤灌流液及び灌流液細胞は、幹細胞を分化させる条件下にて培養されずに投与され得
る。或いは、灌流液又は灌流液細胞は投与前に、例えば、約1~20日間、例えば、血管
形成又は血管培地にて培養され得る。一部の実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞は
単離されてマトリクス上に播種され、次に、例えば、約1~20日間、血管形成又は血管
培地にて培養され得る。別の実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば、約1
~20日間、例えば、血管形成又は血管培地にて培養され、次に、マトリクス上に播種さ
れ、次に、例えば、約1~20日間、本明細書で述べられる骨形成培地にて培養され得る
。
る。或いは、灌流液又は灌流液細胞は投与前に、例えば、約1~20日間、例えば、血管
形成又は血管培地にて培養され得る。一部の実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞は
単離されてマトリクス上に播種され、次に、例えば、約1~20日間、血管形成又は血管
培地にて培養され得る。別の実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば、約1
~20日間、例えば、血管形成又は血管培地にて培養され、次に、マトリクス上に播種さ
れ、次に、例えば、約1~20日間、本明細書で述べられる骨形成培地にて培養され得る
。
単独での、又は幹細胞若しくは前駆細胞集団、例えば、胎盤幹細胞と組み合わせた胎盤
灌流液又は灌流液細胞は、インビトロ又はインビボでの組織又は臓器の作製に用いられ得
る。胎盤から得られる細胞、例えば、灌流液、灌流液細胞、胎盤幹細胞又は前駆細胞は、
マトリクスに播種し、その後、細胞を分化させてマトリクスに集合させ、又はこれを許容
する条件下にて培養するために用いられ得る。本明細書で提供される方法によって得られ
る組織及び臓器は、研究及び治療目的を含む様々な目的に用いられ得る。
灌流液又は灌流液細胞は、インビトロ又はインビボでの組織又は臓器の作製に用いられ得
る。胎盤から得られる細胞、例えば、灌流液、灌流液細胞、胎盤幹細胞又は前駆細胞は、
マトリクスに播種し、その後、細胞を分化させてマトリクスに集合させ、又はこれを許容
する条件下にて培養するために用いられ得る。本明細書で提供される方法によって得られ
る組織及び臓器は、研究及び治療目的を含む様々な目的に用いられ得る。
別の実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、マッチ又はミスマッチHLA型
造血細胞移植を含む自己移植及び同種移植に用いられる。胎盤灌流液及び/又は灌流液細
胞の同種造血細胞移植としての使用の一実施形態では、宿主はドナー細胞の免疫学的拒絶
を低減し、又は免疫寛容を生じさせるために処置される(例えば、米国特許第5,800
,539号及び第5,806,529号を参照されたい)。別の実施形態では、宿主は免
疫学的拒絶を低減し、又は免疫寛容を生じさせるために処置されない。
造血細胞移植を含む自己移植及び同種移植に用いられる。胎盤灌流液及び/又は灌流液細
胞の同種造血細胞移植としての使用の一実施形態では、宿主はドナー細胞の免疫学的拒絶
を低減し、又は免疫寛容を生じさせるために処置される(例えば、米国特許第5,800
,539号及び第5,806,529号を参照されたい)。別の実施形態では、宿主は免
疫学的拒絶を低減し、又は免疫寛容を生じさせるために処置されない。
単独での、又は1つ若しくはそれ以上の他の幹細胞集団と組み合わせた胎盤灌流液又は
灌流液細胞は、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、
粘膜組織、性腺又は毛髪の幹細胞又は前駆細胞を増強し、又は置き換えるために治療移植
プロトコルにて用いられ得る。加えて、胎盤灌流液又は灌流液細胞は、典型的には前駆細
胞が用いられ得る治療又は研究プロトコルにおいて特定のクラスの前駆細胞(例えば、軟
骨細胞、肝細胞、造血細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞、筋肉前駆細胞)の代わりに用い
られ得る。
灌流液細胞は、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、
粘膜組織、性腺又は毛髪の幹細胞又は前駆細胞を増強し、又は置き換えるために治療移植
プロトコルにて用いられ得る。加えて、胎盤灌流液又は灌流液細胞は、典型的には前駆細
胞が用いられ得る治療又は研究プロトコルにおいて特定のクラスの前駆細胞(例えば、軟
骨細胞、肝細胞、造血細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞、筋肉前駆細胞)の代わりに用い
られ得る。
胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば、外傷、代謝障害又は疾患から生じる組織及び臓
器への損傷を修復するために用いられ得る。そのような実施形態では、疾患の結果として
損傷した組織又は臓器を再生し、又は回復させるために、患者は単独で、又は他の幹細胞
若しくは前駆細胞集団と組み合わせられた胎盤灌流液又は灌流液細胞を投与され得る。
器への損傷を修復するために用いられ得る。そのような実施形態では、疾患の結果として
損傷した組織又は臓器を再生し、又は回復させるために、患者は単独で、又は他の幹細胞
若しくは前駆細胞集団と組み合わせられた胎盤灌流液又は灌流液細胞を投与され得る。
(5.7.2 胎盤灌流液又は灌流液細胞を含む組成物)
本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液若しくは灌流液細胞又はこれらに由来する生体
分子を含み、或いはこれに由来する組成物である。胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば
、研究又は治療学に用いる任意の生理的に許容可能又は医学的に許容可能な化合物、組成
物又はデバイスと組み合わせられ得る。
本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液若しくは灌流液細胞又はこれらに由来する生体
分子を含み、或いはこれに由来する組成物である。胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば
、研究又は治療学に用いる任意の生理的に許容可能又は医学的に許容可能な化合物、組成
物又はデバイスと組み合わせられ得る。
(5.7.2.1 凍結保存胎盤灌流液又は灌流液細胞)
本明細書で述べられる胎盤灌流液又は灌流液細胞は保存され、例えば、後の使用のため
に凍結保存され得る。幹細胞のような細胞の凍結保存の方法は当分野において周知である
。胎盤幹細胞集団は患者に容易に投与され得る形態にて調製され得る。例えば、本明細書
で提供されるのは、医学的用途に適した容器内に含まれる胎盤幹細胞集団である。そのよ
うな容器は、例えば、胎盤幹細胞集団が容易に分配され得る滅菌プラスチックバッグ、フ
ラスコ、ジャー又は他の容器でよい。例えば、容器は血液バッグ又はレシピエントへの液
体の静脈内投与に適した他のプラスチック製の医学的に許容可能なバッグでよい。好まし
くは、容器は組み合わせた幹細胞集団の凍結保存を可能にする容器である。
本明細書で述べられる胎盤灌流液又は灌流液細胞は保存され、例えば、後の使用のため
に凍結保存され得る。幹細胞のような細胞の凍結保存の方法は当分野において周知である
。胎盤幹細胞集団は患者に容易に投与され得る形態にて調製され得る。例えば、本明細書
で提供されるのは、医学的用途に適した容器内に含まれる胎盤幹細胞集団である。そのよ
うな容器は、例えば、胎盤幹細胞集団が容易に分配され得る滅菌プラスチックバッグ、フ
ラスコ、ジャー又は他の容器でよい。例えば、容器は血液バッグ又はレシピエントへの液
体の静脈内投与に適した他のプラスチック製の医学的に許容可能なバッグでよい。好まし
くは、容器は組み合わせた幹細胞集団の凍結保存を可能にする容器である。
凍結保存胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、単一のドナー又は複数のドナー由来の胎盤
灌流液又は胎盤灌流液細胞を含み得る。胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、対象レシピエ
ントに対して完全にHLAマッチ又は部分的若しくは完全にHLAミスマッチであり得る
。
灌流液又は胎盤灌流液細胞を含み得る。胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、対象レシピエ
ントに対して完全にHLAマッチ又は部分的若しくは完全にHLAミスマッチであり得る
。
従って、一実施形態では、本明細書で提供されるのは容器内の胎盤灌流液又は胎盤灌流
液細胞を含む組成物である。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は凍
結保存される。別の具体的な実施形態では、容器はバッグ、フラスコ又はジャーである。
より具体的な実施形態では、前記バッグは滅菌プラスチックバッグである。より具体的な
実施形態では、前記バッグは前記胎盤幹細胞集団の静脈内投与に好適であり、これを可能
にし、又は容易にする。該バッグは、投与前又は投与時に胎盤幹細胞と1つ又はそれ以上
の他の溶液、例えば、薬剤との混合を可能にするために互いに連結した複数の管腔又はコ
ンパートメントを含み得る。別の具体的な実施形態では、該組成物は、胎盤灌流液又は胎
盤灌流液細胞の凍結保存を容易にする1つ又はそれ以上の化合物を含む。別の具体的な実
施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は生理的に許容可能な水性溶液中に含ま
れる。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容可能な水性溶液は0.9% NaC
l溶液である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、前記
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞のレシピエントにHLAマッチした胎盤細胞を含む。別の
具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、前記胎盤灌流液又は胎盤
灌流液細胞のレシピエントに少なくとも部分的にHLAミスマッチした胎盤細胞を含む。
別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は複数のドナーに由来す
る。
液細胞を含む組成物である。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は凍
結保存される。別の具体的な実施形態では、容器はバッグ、フラスコ又はジャーである。
より具体的な実施形態では、前記バッグは滅菌プラスチックバッグである。より具体的な
実施形態では、前記バッグは前記胎盤幹細胞集団の静脈内投与に好適であり、これを可能
にし、又は容易にする。該バッグは、投与前又は投与時に胎盤幹細胞と1つ又はそれ以上
の他の溶液、例えば、薬剤との混合を可能にするために互いに連結した複数の管腔又はコ
ンパートメントを含み得る。別の具体的な実施形態では、該組成物は、胎盤灌流液又は胎
盤灌流液細胞の凍結保存を容易にする1つ又はそれ以上の化合物を含む。別の具体的な実
施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は生理的に許容可能な水性溶液中に含ま
れる。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容可能な水性溶液は0.9% NaC
l溶液である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、前記
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞のレシピエントにHLAマッチした胎盤細胞を含む。別の
具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、前記胎盤灌流液又は胎盤
灌流液細胞のレシピエントに少なくとも部分的にHLAミスマッチした胎盤細胞を含む。
別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は複数のドナーに由来す
る。
(5.7.2.2 医薬組成物)
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞はインビボでの使用のために医薬組成物に製剤化され得
る。そのような医薬組成物は、インビボ投与のために医薬的に許容可能な担体、例えば、
食塩水又は他の許容される生理的に許容可能な溶液中の胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を
含む。本明細書で提供される医薬組成物は胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞の任意の実施形
態を含み得る。医薬組成物は胎児、母親或いは胎児及び母親胎盤細胞を含み得る。本明細
書で提供される医薬組成物は、単一の患者若しくは胎盤又は複数の患者若しくは胎盤から
得られる胎盤細胞を更に含み得る。
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞はインビボでの使用のために医薬組成物に製剤化され得
る。そのような医薬組成物は、インビボ投与のために医薬的に許容可能な担体、例えば、
食塩水又は他の許容される生理的に許容可能な溶液中の胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を
含む。本明細書で提供される医薬組成物は胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞の任意の実施形
態を含み得る。医薬組成物は胎児、母親或いは胎児及び母親胎盤細胞を含み得る。本明細
書で提供される医薬組成物は、単一の患者若しくは胎盤又は複数の患者若しくは胎盤から
得られる胎盤細胞を更に含み得る。
本明細書で提供される医薬組成物は任意の数の胎盤細胞を含み得る。例えば、胎盤細胞
、例えば、灌流液細胞の単一単位用量は、種々の実施形態において、約、少なくとも又は
わずか1×105,5×105,1×106,5×106,1×107,5×107,1
×108,5×108,1×109,5×109,1×1010,5×1010,1×1
011又はそれ以上の胎盤細胞を含み得る。
、例えば、灌流液細胞の単一単位用量は、種々の実施形態において、約、少なくとも又は
わずか1×105,5×105,1×106,5×106,1×107,5×107,1
×108,5×108,1×109,5×109,1×1010,5×1010,1×1
011又はそれ以上の胎盤細胞を含み得る。
細胞は、例えば、生理的に許容可能な溶液、例えば、食塩水、例えば、リン酸緩衝食塩
水、0.9% NaCl溶液などにて投与され得る。
水、0.9% NaCl溶液などにて投与され得る。
本明細書で提供される医薬組成物は、50%生細胞又はそれ以上(即ち、少なくとも約
50%の集団内の細胞が機能しており、又は生存している)を含む細胞、例えば、胎盤灌
流液細胞の集団を含み得る。好ましくは、少なくとも約60%の集団内の細胞が生存可能
である。より好ましくは、少なくとも約70%、80%、90%、95%又は99%の医
薬組成物中の集団内の細胞が生存可能である。
50%の集団内の細胞が機能しており、又は生存している)を含む細胞、例えば、胎盤灌
流液細胞の集団を含み得る。好ましくは、少なくとも約60%の集団内の細胞が生存可能
である。より好ましくは、少なくとも約70%、80%、90%、95%又は99%の医
薬組成物中の集団内の細胞が生存可能である。
本明細書で提供される医薬組成物は、例えば、生着を促進する1つ又はそれ以上の化合
物(例えば、抗T細胞受容体抗体、免疫抑制剤など);安定剤、例えば、アルブミン、デ
キストラン40、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプンなどを含み得る。
物(例えば、抗T細胞受容体抗体、免疫抑制剤など);安定剤、例えば、アルブミン、デ
キストラン40、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプンなどを含み得る。
本明細書で提供される細胞の集団は外科的に移植され、注入され、送達され(例えば、
カテーテル又はシリンジを通じて)、或いは、例えば、修復又は増強を必要とする部位に
て患者に直接又は間接的に投与され得る。本明細書で提供される細胞の集団又は組成物、
例えば、医薬組成物は、経口、鼻腔、動脈内、非経口、静脈内、眼部、筋肉内、皮下、腹
腔内、脳内、心室内、脳室内、くも膜下腔内、嚢内、脊髄内及び/又は脊髄周囲投与され
得る。
カテーテル又はシリンジを通じて)、或いは、例えば、修復又は増強を必要とする部位に
て患者に直接又は間接的に投与され得る。本明細書で提供される細胞の集団又は組成物、
例えば、医薬組成物は、経口、鼻腔、動脈内、非経口、静脈内、眼部、筋肉内、皮下、腹
腔内、脳内、心室内、脳室内、くも膜下腔内、嚢内、脊髄内及び/又は脊髄周囲投与され
得る。
(5.7.2.3 胎盤細胞馴化培地)
例えば、付着胎盤幹細胞を伴う胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、CD34+胎盤細胞又は
それらの組合せは、馴化培地、即ち、灌流液又は細胞によって分泌又は排出される1つ又
はそれ以上の生体分子を含む培地を作製するために用いられ得る。種々の実施形態におい
て、馴化培地は胎盤細胞が少なくとも1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11
,12,13,14日間又はそれ以上の日数、増殖した培地を含む。他の実施形態では、
馴化培地は胎盤細胞が少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%コンフルエンス又は最大100%コンフルエンスまで増殖した培地を含む。そのよ
うな馴化培地は、胎盤細胞又は別の種類の細胞、例えば、幹細胞の別個の集団の培養を支
持するために用いられ得る。別の実施形態では、馴化培地は胎盤幹細胞が成熟細胞型に分
化させられた培地を含む。別の実施形態では、馴化培地は胎盤灌流液細胞及び非胎盤幹細
胞が培養された培地を含む。
例えば、付着胎盤幹細胞を伴う胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、CD34+胎盤細胞又は
それらの組合せは、馴化培地、即ち、灌流液又は細胞によって分泌又は排出される1つ又
はそれ以上の生体分子を含む培地を作製するために用いられ得る。種々の実施形態におい
て、馴化培地は胎盤細胞が少なくとも1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11
,12,13,14日間又はそれ以上の日数、増殖した培地を含む。他の実施形態では、
馴化培地は胎盤細胞が少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%コンフルエンス又は最大100%コンフルエンスまで増殖した培地を含む。そのよ
うな馴化培地は、胎盤細胞又は別の種類の細胞、例えば、幹細胞の別個の集団の培養を支
持するために用いられ得る。別の実施形態では、馴化培地は胎盤幹細胞が成熟細胞型に分
化させられた培地を含む。別の実施形態では、馴化培地は胎盤灌流液細胞及び非胎盤幹細
胞が培養された培地を含む。
(5.7.2.4 胎盤細胞を含むマトリクス)
本明細書で更に提供されるのは、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を含むマトリクス、ヒ
ドロゲル、足場などである。
本明細書で更に提供されるのは、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を含むマトリクス、ヒ
ドロゲル、足場などである。
胎盤細胞、例えば、灌流液又は灌流液細胞は、天然マトリクス、例えば、羊膜材料のよ
うな胎盤生体材料上に播種され得る。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から
直接切開された羊膜;固定又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥した(即ち、<20%
H2O)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜など
であり得る。胎盤細胞が播種され得る好ましい胎盤生体材料は、Hariri, 米国出願公開第
2004/0048796号に述べられている。
うな胎盤生体材料上に播種され得る。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から
直接切開された羊膜;固定又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥した(即ち、<20%
H2O)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜など
であり得る。胎盤細胞が播種され得る好ましい胎盤生体材料は、Hariri, 米国出願公開第
2004/0048796号に述べられている。
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、例えば、注射に適したヒドロゲル溶液中に懸濁され
得る。そのような組成物に好適なヒドロゲルにはRAD16のような自己集合性ペプチド
が含まれる。一実施形態では、細胞を含むヒドロゲル溶液は、移植のために分散された細
胞を有するマトリクスを形成するために、例えば、鋳型において硬化することを許容され
得る。また、そのようなマトリクスにおける胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、移植前に
細胞が有糸分裂的に増殖されるように培養され得る。ヒドロゲルは、例えば、ゲルを形成
するために水分子を補足する三次元開口格子構造を形成するために共有、イオン又は水素
結合を介して架橋した有機高分子(天然又は合成)である。ヒドロゲル形成材料には、イ
オンで架橋した多糖、例えば、アルギナート及びその塩、ペプチド、ポリホスファジン(
polyphosphazine)及びポリアクリラート或いは、それぞれ温度又はpHによって架橋し
たポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロック共重合体のようなブロック
重合体が含まれる。一部の実施形態では、ヒドロゲル又はマトリクスは生分解性である。
得る。そのような組成物に好適なヒドロゲルにはRAD16のような自己集合性ペプチド
が含まれる。一実施形態では、細胞を含むヒドロゲル溶液は、移植のために分散された細
胞を有するマトリクスを形成するために、例えば、鋳型において硬化することを許容され
得る。また、そのようなマトリクスにおける胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、移植前に
細胞が有糸分裂的に増殖されるように培養され得る。ヒドロゲルは、例えば、ゲルを形成
するために水分子を補足する三次元開口格子構造を形成するために共有、イオン又は水素
結合を介して架橋した有機高分子(天然又は合成)である。ヒドロゲル形成材料には、イ
オンで架橋した多糖、例えば、アルギナート及びその塩、ペプチド、ポリホスファジン(
polyphosphazine)及びポリアクリラート或いは、それぞれ温度又はpHによって架橋し
たポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロック共重合体のようなブロック
重合体が含まれる。一部の実施形態では、ヒドロゲル又はマトリクスは生分解性である。
一部の実施形態では、製剤はin situにて重合可能なゲルを含む(例えば、米国
特許出願公開第2002/0022676号; Anseth et al., J. Control Release, 78(
l-3):199-209 (2002); Wang et al, Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003) を参照され
たい。
特許出願公開第2002/0022676号; Anseth et al., J. Control Release, 78(
l-3):199-209 (2002); Wang et al, Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003) を参照され
たい。
一部の実施形態では、重合体は荷電側基又はその一価イオン性塩を有する水性溶液、例
えば、水、緩衝食塩溶液若しくは水性アルコール溶液に少なくとも部分的に可溶性である
。陽イオンと反応され得る酸性側基を有する重合体の例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ
(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸との共重合体、ポリ
(ビニルアセタート)及びスルホン化ポリスチレンのようなスルホン化重合体である。ア
クリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテル単量体又は重合体との反応によって形成され
る酸性側基を有する共重合体も用いられ得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸
基、ハロゲン化(好ましくはフッ素化)アルコール基、フェノールOH基及び酸性OH基
である。
えば、水、緩衝食塩溶液若しくは水性アルコール溶液に少なくとも部分的に可溶性である
。陽イオンと反応され得る酸性側基を有する重合体の例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ
(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸との共重合体、ポリ
(ビニルアセタート)及びスルホン化ポリスチレンのようなスルホン化重合体である。ア
クリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテル単量体又は重合体との反応によって形成され
る酸性側基を有する共重合体も用いられ得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸
基、ハロゲン化(好ましくはフッ素化)アルコール基、フェノールOH基及び酸性OH基
である。
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は三次元フレームワーク又は足場上に播種され、インビ
ボにて移植され得る。そのようなフレームワークは、組織形成を刺激し、或いは本明細書
で提供される方法の実施を増強又は向上させる任意の1つ又はそれ以上の増殖因子、細胞
、薬剤又は他の成分と組み合わせて移植され得る。
ボにて移植され得る。そのようなフレームワークは、組織形成を刺激し、或いは本明細書
で提供される方法の実施を増強又は向上させる任意の1つ又はそれ以上の増殖因子、細胞
、薬剤又は他の成分と組み合わせて移植され得る。
本明細書で提供される方法において用いられ得る足場の例には、不織マット、多孔質発
泡体又は自己集合性ペプチドが含まれる。不織マットはグリコール酸と乳酸との合成吸収
性共重合体から構成される繊維(例えば、PGA/PLA)(VICRYL,Ethic
on,Inc.、ニュージャージー州サマービル(Somerville))を用いて形成され得る
。凍結乾燥(freeze-drying)又は凍結乾燥(lyophilization)(例えば、米国特許第6
,355,699号を参照されたい)のようなプロセスによって形成される、例えば、ポ
リ(ε-カプロラクトン)/ポリ(グリコール酸)(PCL/PGA)共重合体から構成
される発泡体も足場として用いられ得る。
泡体又は自己集合性ペプチドが含まれる。不織マットはグリコール酸と乳酸との合成吸収
性共重合体から構成される繊維(例えば、PGA/PLA)(VICRYL,Ethic
on,Inc.、ニュージャージー州サマービル(Somerville))を用いて形成され得る
。凍結乾燥(freeze-drying)又は凍結乾燥(lyophilization)(例えば、米国特許第6
,355,699号を参照されたい)のようなプロセスによって形成される、例えば、ポ
リ(ε-カプロラクトン)/ポリ(グリコール酸)(PCL/PGA)共重合体から構成
される発泡体も足場として用いられ得る。
また、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、リン酸一、リン酸二、リン酸三、α-リン酸
三、β-リン酸三及びリン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト
、カルシウムスルファート、カルシウムフルオライド、カルシウムオキシド、カルシウム
カーボナート、マグネシウムカルシウムホスファート、BIOGLASS(登録商標)の
ような生物活性ガラス及びその混合物を含むがこれらに限定されない、生理的に許容可能
なセラミック材料上に播種され、又はこれと接触させられ得る。現在市販されている多孔
質生体適合性セラミック材料には、SURGIBONE(登録商標)(CanMedic
a Corp.、カナダ)、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomate
rial France、フランス)、CEROS(登録商標)(Mathys,AG、
スイスBettlach)及びミネラル化コラーゲン骨移植製品、例えば、HEALOS
(商標)(DePuy,Inc.、マサチューセッツ州Raynham)及びVITOS
S(登録商標)、RHAKOSS(商標)並びにCORTOSS(登録商標)(Orth
ovita社、ペンシルベニア州Malvern)が含まれる。フレームワークは天然及
び/又は合成材料の混合物(mixture)、混合物(blend)又は合成物でよい。
三、β-リン酸三及びリン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト
、カルシウムスルファート、カルシウムフルオライド、カルシウムオキシド、カルシウム
カーボナート、マグネシウムカルシウムホスファート、BIOGLASS(登録商標)の
ような生物活性ガラス及びその混合物を含むがこれらに限定されない、生理的に許容可能
なセラミック材料上に播種され、又はこれと接触させられ得る。現在市販されている多孔
質生体適合性セラミック材料には、SURGIBONE(登録商標)(CanMedic
a Corp.、カナダ)、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomate
rial France、フランス)、CEROS(登録商標)(Mathys,AG、
スイスBettlach)及びミネラル化コラーゲン骨移植製品、例えば、HEALOS
(商標)(DePuy,Inc.、マサチューセッツ州Raynham)及びVITOS
S(登録商標)、RHAKOSS(商標)並びにCORTOSS(登録商標)(Orth
ovita社、ペンシルベニア州Malvern)が含まれる。フレームワークは天然及
び/又は合成材料の混合物(mixture)、混合物(blend)又は合成物でよい。
別の実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、例えば、生体吸収性材料、例え
ば、PGA,PLA,PCL共重合体若しくは混合物(blend)又はヒアルロン酸から作
製されるマルチフィラメント糸から構成され得るフェルト上に播種され、又はこれと接触
させられ得る。
ば、PGA,PLA,PCL共重合体若しくは混合物(blend)又はヒアルロン酸から作
製されるマルチフィラメント糸から構成され得るフェルト上に播種され、又はこれと接触
させられ得る。
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、別の実施形態では、合成構造であり得る発泡体足場
上に播種され得る。そのような発泡体足場は、修復、置換又は増強される身体における特
定の構造の一部のような有用な形状に成形され得る。一部の実施形態では、フレームワー
クは細胞付着を増進するため、胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液細胞の接種前に、例えば、
0.1M酢酸で処理され、次に、ポリリジン、PBS及び/又はコラーゲン中でインキュ
ベートされる。マトリクスの外面は、例えば、マトリクスのプラズマコーティング或いは
1つ又はそれ以上の蛋白質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖蛋白質、グ
リコサミノグリカン(例えば、ヘパリンスルファート、コンドロイチン-4-スルファー
ト、コンドロイチン-6-スルファート、デルマタンスルファート、ケラチンスルファー
トなど)、細胞マトリクス及び/又は他の材料、例えば、限定されないが、ゼラチン、ア
ルギナート、寒天、アガロース及び植物ゴムなどの付加により、細胞の付着若しくは増殖
及び組織の分化を向上させるために改変され得る。
上に播種され得る。そのような発泡体足場は、修復、置換又は増強される身体における特
定の構造の一部のような有用な形状に成形され得る。一部の実施形態では、フレームワー
クは細胞付着を増進するため、胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液細胞の接種前に、例えば、
0.1M酢酸で処理され、次に、ポリリジン、PBS及び/又はコラーゲン中でインキュ
ベートされる。マトリクスの外面は、例えば、マトリクスのプラズマコーティング或いは
1つ又はそれ以上の蛋白質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖蛋白質、グ
リコサミノグリカン(例えば、ヘパリンスルファート、コンドロイチン-4-スルファー
ト、コンドロイチン-6-スルファート、デルマタンスルファート、ケラチンスルファー
トなど)、細胞マトリクス及び/又は他の材料、例えば、限定されないが、ゼラチン、ア
ルギナート、寒天、アガロース及び植物ゴムなどの付加により、細胞の付着若しくは増殖
及び組織の分化を向上させるために改変され得る。
一部の実施形態では、足場は非血栓形成性にさせる材料を含み、又はこれで処理される
。また、これらの処理及び材料は内皮増殖、移動及び細胞外マトリクス沈着を促進し、維
持し得る。これらの処理及び材料の例には、限定されないが、天然材料、例えば、基底膜
蛋白質、例えば、ラミニン及びIV型コラーゲン、合成材料、例えば、EPTFE及びセ
グメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、PURSPAN(商標)(The P
olymer Technology Group,Inc.、カリフォルニア州バーク
レー)が含まれる。足場はヘパリンのような抗血栓剤も含み得る。また、足場は胎盤灌流
液又は灌流液細胞による播種前に表面電荷を変えるために処置され得る(例えば、プラズ
マによるコーティング)。
。また、これらの処理及び材料は内皮増殖、移動及び細胞外マトリクス沈着を促進し、維
持し得る。これらの処理及び材料の例には、限定されないが、天然材料、例えば、基底膜
蛋白質、例えば、ラミニン及びIV型コラーゲン、合成材料、例えば、EPTFE及びセ
グメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、PURSPAN(商標)(The P
olymer Technology Group,Inc.、カリフォルニア州バーク
レー)が含まれる。足場はヘパリンのような抗血栓剤も含み得る。また、足場は胎盤灌流
液又は灌流液細胞による播種前に表面電荷を変えるために処置され得る(例えば、プラズ
マによるコーティング)。
一実施形態では、胎盤幹細胞は約0.5×106~約8×106細胞/mLにて好適な
足場上に播種され、又はこれと接触させられる。
足場上に播種され、又はこれと接触させられる。
(5.7.3 不死化胎盤細胞株)
哺乳動物胎盤細胞は、増殖促進蛋白質の生成及び/又は活性が外部因子によって調節可
能であるように、増殖促進遺伝子、即ち、適切な条件下でトランスフェクトされた細胞の
増殖を促進する蛋白質をコードする遺伝子を含む、任意の好適なベクターによるトランス
フェクションによって条件的に不死化され得る。好ましい実施形態では、増殖促進遺伝子
は、限定されないが、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT
抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス又はヒトパピローマウイルスのE
7蛋白質のような癌遺伝子である。
哺乳動物胎盤細胞は、増殖促進蛋白質の生成及び/又は活性が外部因子によって調節可
能であるように、増殖促進遺伝子、即ち、適切な条件下でトランスフェクトされた細胞の
増殖を促進する蛋白質をコードする遺伝子を含む、任意の好適なベクターによるトランス
フェクションによって条件的に不死化され得る。好ましい実施形態では、増殖促進遺伝子
は、限定されないが、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT
抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス又はヒトパピローマウイルスのE
7蛋白質のような癌遺伝子である。
増殖促進蛋白質の外部調節は、増殖促進遺伝子を外部調節可能なプロモーター、例えば
、その活性が、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度又は細胞と接触する培地の組
成を改変することによって制御され得るプロモーターの制御下に置くことによって達成さ
れ得る。一実施形態では、テトラサイクリン(tet)制御遺伝子発現系が用いられ得る
(Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1518-1523, 1996を参照されたい)。tetの非存在下
、このベクター内のtet制御トランスアクチベーター(tTA)は、tetオペレータ
ー配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるphCMV*
-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌(Escherichia coli)のトランスポ
ゾン10由来tet抵抗性オペロンのリプレッサー(tetR)の融合蛋白質及び単純ヘ
ルペスウイルスのVP16の酸性ドメインである。tetの低非毒性濃度(例えば、0.
01~1.0μg/mL)はtTAによるトランス活性化をほぼ完全に消失させる。
、その活性が、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度又は細胞と接触する培地の組
成を改変することによって制御され得るプロモーターの制御下に置くことによって達成さ
れ得る。一実施形態では、テトラサイクリン(tet)制御遺伝子発現系が用いられ得る
(Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1518-1523, 1996を参照されたい)。tetの非存在下
、このベクター内のtet制御トランスアクチベーター(tTA)は、tetオペレータ
ー配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるphCMV*
-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌(Escherichia coli)のトランスポ
ゾン10由来tet抵抗性オペロンのリプレッサー(tetR)の融合蛋白質及び単純ヘ
ルペスウイルスのVP16の酸性ドメインである。tetの低非毒性濃度(例えば、0.
01~1.0μg/mL)はtTAによるトランス活性化をほぼ完全に消失させる。
一実施形態では、ベクターは選択可能なマーカー、例えば、薬剤耐性を付与する蛋白質
をコードする遺伝子を更に含む。細菌ネオマイシン耐性遺伝子(neoR)は、本発明の
方法の範囲内に用いられ得るそのようなマーカーの1つである。neoRを保持する細胞
は、例えば、100~200μg/mL G418の増殖培地への付加のような当業者に
は公知の手段によって選択され得る。
をコードする遺伝子を更に含む。細菌ネオマイシン耐性遺伝子(neoR)は、本発明の
方法の範囲内に用いられ得るそのようなマーカーの1つである。neoRを保持する細胞
は、例えば、100~200μg/mL G418の増殖培地への付加のような当業者に
は公知の手段によって選択され得る。
トランスフェクションは、レトロウイルス感染を含むがこれに限定されない、当業者に
は公知の任意の様々な手段によって達成され得る。一般的に、細胞培養物は、ベクターの
産生細胞株から回収される馴化培地とN2補充を含むDMEM/F12との混合物による
インキュベーションによってトランスフェクトされ得る。例えば、上述のように調製され
た胎盤細胞培養物は1容積の馴化培地及び2容積のN2補充を含むDMEM/F12にお
いて約20時間のインキュベーションにより、例えば、5日間後にインビトロにて感染さ
れ得る。次に、選択可能なマーカーを保持するトランスフェクトされた細胞が上述のよう
に選択され得る。
は公知の任意の様々な手段によって達成され得る。一般的に、細胞培養物は、ベクターの
産生細胞株から回収される馴化培地とN2補充を含むDMEM/F12との混合物による
インキュベーションによってトランスフェクトされ得る。例えば、上述のように調製され
た胎盤細胞培養物は1容積の馴化培地及び2容積のN2補充を含むDMEM/F12にお
いて約20時間のインキュベーションにより、例えば、5日間後にインビトロにて感染さ
れ得る。次に、選択可能なマーカーを保持するトランスフェクトされた細胞が上述のよう
に選択され得る。
トランスフェクション後、培養物は増殖を可能にし、例えば、細胞の少なくとも約30
%が24時間にて倍加することを可能にする表面上に継代される。好ましくは、基質は、
ポリオルニチン(10μg/mL)及び/又はラミニン(10μg/mL)をコーティン
グされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン/ラミニン基質、ポリリジン/ラ
ミニン基質或いはフィブロネクチンで処理された表面である。次に、培養物は、1つ又は
それ以上の増殖増強因子を補充され得、又は補充され得ない増殖培地を3~4日毎に付与
される。培養物が50%未満コンフルエンスである場合、増殖増強因子が増殖培地に加え
られ得る。
%が24時間にて倍加することを可能にする表面上に継代される。好ましくは、基質は、
ポリオルニチン(10μg/mL)及び/又はラミニン(10μg/mL)をコーティン
グされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン/ラミニン基質、ポリリジン/ラ
ミニン基質或いはフィブロネクチンで処理された表面である。次に、培養物は、1つ又は
それ以上の増殖増強因子を補充され得、又は補充され得ない増殖培地を3~4日毎に付与
される。培養物が50%未満コンフルエンスである場合、増殖増強因子が増殖培地に加え
られ得る。
条件的に不死化された胎盤幹細胞株は、80~95%コンフルエントの場合、例えば、
トリプシン処理による標準的な技法を用いて継代され得る。一部の実施形態では、最大で
約第20継代まで選択を維持することは有益である(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を
含む細胞に対するG418の付加により)。細胞は長期保存のために液体窒素において凍
結されてもよい。
トリプシン処理による標準的な技法を用いて継代され得る。一部の実施形態では、最大で
約第20継代まで選択を維持することは有益である(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を
含む細胞に対するG418の付加により)。細胞は長期保存のために液体窒素において凍
結されてもよい。
上述のように調製された、条件的に不死化されたヒト胎盤幹細胞株からクローン細胞株
が単離され得る。一般的に、そのようなクローン細胞株は、例えば、限界希釈法による標
準的な技法を用いて、又はクローニングリング(cloning ring)を用いて単離され、拡大
され得る。一般的に、クローン細胞株は上述のように供給及び継代され得る。
が単離され得る。一般的に、そのようなクローン細胞株は、例えば、限界希釈法による標
準的な技法を用いて、又はクローニングリング(cloning ring)を用いて単離され、拡大
され得る。一般的に、クローン細胞株は上述のように供給及び継代され得る。
一般的に、クローンであってよく、しかしクローンである必要はない条件的に不死化さ
れたヒト胎盤幹細胞株は、分化を促進する培養条件下にて増殖促進蛋白質の生成及び/又
は活性を抑制することによって分化するように誘導され得る。例えば、増殖促進蛋白質を
コードする遺伝子が外部調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば、温
度又は培地の組成は増殖促進遺伝子の転写を抑制するように変更され得る。上述のテトラ
サイクリン制御遺伝子発現系では、分化は増殖促進遺伝子の転写を抑制するためにテトラ
サイクリンの付加によって達成され得る。一般的に、分化を開始するために4~5日間の
1μg/mLテトラサイクリンで十分である。更なる分化を促進するため、増殖培地に更
なる作用物質が含まれ得る。
れたヒト胎盤幹細胞株は、分化を促進する培養条件下にて増殖促進蛋白質の生成及び/又
は活性を抑制することによって分化するように誘導され得る。例えば、増殖促進蛋白質を
コードする遺伝子が外部調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば、温
度又は培地の組成は増殖促進遺伝子の転写を抑制するように変更され得る。上述のテトラ
サイクリン制御遺伝子発現系では、分化は増殖促進遺伝子の転写を抑制するためにテトラ
サイクリンの付加によって達成され得る。一般的に、分化を開始するために4~5日間の
1μg/mLテトラサイクリンで十分である。更なる分化を促進するため、増殖培地に更
なる作用物質が含まれ得る。
(5.7.4 アッセイ)
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、幹細胞増殖、拡大及び/又は分化に対する培養条件
、環境要因、分子(例えば、生体分子、無機低分子等)などの影響を、そのような条件に
晒されない胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と比べて判定するために、アッセイにて用いら
れ得る。
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、幹細胞増殖、拡大及び/又は分化に対する培養条件
、環境要因、分子(例えば、生体分子、無機低分子等)などの影響を、そのような条件に
晒されない胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と比べて判定するために、アッセイにて用いら
れ得る。
好ましい実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は分子との接触時の増殖、拡大
又は分化の変化についてアッセイされる。例えば、アルカリホスファターゼ活性及び/又
はカルシウムミネラル化をモニタリングすることによって骨形成分化がアッセイされ得る
。
又は分化の変化についてアッセイされる。例えば、アルカリホスファターゼ活性及び/又
はカルシウムミネラル化をモニタリングすることによって骨形成分化がアッセイされ得る
。
一実施形態では、例えば、本明細書で提供されるのは胎盤灌流液細胞の増殖を調節する
化合物を同定する方法であり、該方法は増殖を可能にする条件下にて前記灌流液細胞を前
記化合物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない複数の前
記細胞と比べて前記細胞の増殖の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤灌
流液細胞の増殖を調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物
は増殖のインヒビターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は増殖
のエンハンサーとして同定される。
化合物を同定する方法であり、該方法は増殖を可能にする条件下にて前記灌流液細胞を前
記化合物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない複数の前
記細胞と比べて前記細胞の増殖の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤灌
流液細胞の増殖を調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物
は増殖のインヒビターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は増殖
のエンハンサーとして同定される。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは複数の胎盤細胞の拡大を調節する化合物
を同定する方法であり、該方法は拡大を可能にする条件下にて胎盤灌流液細胞を前記化合
物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない複数の細胞と比
べて前記細胞の拡大の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤細胞の拡大を
調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物は拡大のインヒビ
ターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は拡大のエンハンサーと
して同定される。
を同定する方法であり、該方法は拡大を可能にする条件下にて胎盤灌流液細胞を前記化合
物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない複数の細胞と比
べて前記細胞の拡大の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤細胞の拡大を
調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物は拡大のインヒビ
ターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は拡大のエンハンサーと
して同定される。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液細胞の分
化を調節する化合物を同定する方法であり、該方法は分化を可能にする条件下にて前記細
胞を前記化合物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない細
胞と比べて前記幹細胞の分化の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤細胞
の増殖を調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物は分化の
インヒビターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は分化のエンハ
ンサーとして同定される。
化を調節する化合物を同定する方法であり、該方法は分化を可能にする条件下にて前記細
胞を前記化合物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない細
胞と比べて前記幹細胞の分化の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤細胞
の増殖を調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物は分化の
インヒビターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は分化のエンハ
ンサーとして同定される。
(6 実施例)
以下の実施例は例示のために示されるものであって、決して限定するものであると理解
してはならない。特許文献、非特許文献又はその他の文献であろうと、本明細書で引用さ
れるすべての文献はあらゆることを目的として参照して本明細書により組み込まれる。
以下の実施例は例示のために示されるものであって、決して限定するものであると理解
してはならない。特許文献、非特許文献又はその他の文献であろうと、本明細書で引用さ
れるすべての文献はあらゆることを目的として参照して本明細書により組み込まれる。
(6.1 胎盤灌流液細胞からの血管形成細胞の生成)
「5.2 胎盤灌流液及び灌流液細胞を得る方法」に上述されたように得られた胎盤灌
流液から赤血球を消失させ、様々な単核細胞型のパーセントを求めるために分析した。表
1は同定された細胞型を詳述している。
「5.2 胎盤灌流液及び灌流液細胞を得る方法」に上述されたように得られた胎盤灌
流液から赤血球を消失させ、様々な単核細胞型のパーセントを求めるために分析した。表
1は同定された細胞型を詳述している。
別の実験では、ヒト胎盤灌流液由来のCD34+胎盤細胞がCD34+,CD45-細
胞の亜集団を含み、当該亜集団は、一定数の有核細胞において、臍帯血より高いパーセン
トで存在することが明らかとなった。図1を参照されたい。
胞の亜集団を含み、当該亜集団は、一定数の有核細胞において、臍帯血より高いパーセン
トで存在することが明らかとなった。図1を参照されたい。
別の実験では、血管形成関連マーカーCD31、CXCR4及びVEGFRを発現する
細胞のパーセントを求めるため、ヒト胎盤灌流液由来のCD34+細胞をフローサイトメ
トリーにより分析した。臍帯血由来CD34+細胞より高いパーセントのHPP由来CD
34+細胞が、これらのマーカーを発現した。図2を参照されたい。
細胞のパーセントを求めるため、ヒト胎盤灌流液由来のCD34+細胞をフローサイトメ
トリーにより分析した。臍帯血由来CD34+細胞より高いパーセントのHPP由来CD
34+細胞が、これらのマーカーを発現した。図2を参照されたい。
別の実験では、胎盤CD34+,CD45-細胞における遺伝子発現を分析するために
定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を用いた。CD34+,CD45-及びC
D34+,CD45+細胞集団をFACS ARIA(BD Biosciences社
)により同じヒト胎盤灌流液(HPP)から単離し、Applied Biosyste
ms社製のFAST 7900HT機器及びプライマー/プローブを用いてCD34,C
D45,CD31及びVEGFR発現のqRT-PCR解析のためのRNA調製に供した
。図3に示すように、CD31及びVEGFR発現はCD34+CD45+細胞よりHP
P CD34+CD45-細胞のほうが高い。これらのデータは、HPP CD34+細
胞が血管形成的であり、加えて、血管形成活性がCD34+CD45-集団においてより
高いということを示唆した。
定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を用いた。CD34+,CD45-及びC
D34+,CD45+細胞集団をFACS ARIA(BD Biosciences社
)により同じヒト胎盤灌流液(HPP)から単離し、Applied Biosyste
ms社製のFAST 7900HT機器及びプライマー/プローブを用いてCD34,C
D45,CD31及びVEGFR発現のqRT-PCR解析のためのRNA調製に供した
。図3に示すように、CD31及びVEGFR発現はCD34+CD45+細胞よりHP
P CD34+CD45-細胞のほうが高い。これらのデータは、HPP CD34+細
胞が血管形成的であり、加えて、血管形成活性がCD34+CD45-集団においてより
高いということを示唆した。
内皮細胞の前駆体を同定するCFU-Hillコロニーアッセイを用いて、HPP細胞
の血管形成活性を求めた。上記実施例6.3に従って回収したヒト胎盤灌流液由来の単核
細胞を約2週間、ENDOCULT(登録商標)培地(StemCell Techno
logies,Inc.)にて培養した。次に、CFU-Hillコロニーを明らかにす
るためにギル改変(Gill’s Modified)ヘマトキシリン染色法で細胞培養物を染色した。
アッセイにおいて5体の別個のドナー由来の106個の灌流液細胞当たり、それぞれ0,
19,7,11及び6つのCFU-Hillコロニーを確認した。図4を参照されたい。
別のアッセイにより、ENDOCULT(登録商標)培地における培養の第7日目にヒト
胎盤灌流液由来の内皮前駆細胞によるDil-acLDL(ジアセチル低比重リポ蛋白)
の取込みを確認した。
の血管形成活性を求めた。上記実施例6.3に従って回収したヒト胎盤灌流液由来の単核
細胞を約2週間、ENDOCULT(登録商標)培地(StemCell Techno
logies,Inc.)にて培養した。次に、CFU-Hillコロニーを明らかにす
るためにギル改変(Gill’s Modified)ヘマトキシリン染色法で細胞培養物を染色した。
アッセイにおいて5体の別個のドナー由来の106個の灌流液細胞当たり、それぞれ0,
19,7,11及び6つのCFU-Hillコロニーを確認した。図4を参照されたい。
別のアッセイにより、ENDOCULT(登録商標)培地における培養の第7日目にヒト
胎盤灌流液由来の内皮前駆細胞によるDil-acLDL(ジアセチル低比重リポ蛋白)
の取込みを確認した。
ヒト胎盤灌流液細胞も培養液中で血管を発達させることが示された。細胞がTGF-β
、FGF、プラスミノーゲン、tPA及びマトリクスメタロプロテアーゼの存在下にて培
養されるIn Vitro Angiogenesis Assay Kit(Chem
icon社 カタログ番号ECM625)を用いて、96ウェルプレートの1ウェル当た
り約106個の細胞にてECMATRIX(商標)上で上記実施例6.3に従って得られ
たヒト胎盤灌流液細胞を18~24時間培養した。細胞は24時間後に視認可能な血管構
造を形成した。図5を参照されたい。本質的に同じ条件下にて臍帯血細胞培養物において
有意な管形成を認めなかった。
、FGF、プラスミノーゲン、tPA及びマトリクスメタロプロテアーゼの存在下にて培
養されるIn Vitro Angiogenesis Assay Kit(Chem
icon社 カタログ番号ECM625)を用いて、96ウェルプレートの1ウェル当た
り約106個の細胞にてECMATRIX(商標)上で上記実施例6.3に従って得られ
たヒト胎盤灌流液細胞を18~24時間培養した。細胞は24時間後に視認可能な血管構
造を形成した。図5を参照されたい。本質的に同じ条件下にて臍帯血細胞培養物において
有意な管形成を認めなかった。
(6.2 胎盤灌流液細胞を用いたインビボ血管形成)
本実施例は、骨組織の形成に示されるように、ヒト胎盤灌流液細胞が齧歯類モデルに投
与されると、血管系の形成を引き起こすことを実証する。
本実施例は、骨組織の形成に示されるように、ヒト胎盤灌流液細胞が齧歯類モデルに投
与されると、血管系の形成を引き起こすことを実証する。
骨治癒には血管形成/血管新生が必要である。例えば、Matsumoto et al., Amer. J. P
athology 169: 1440-1457 (2006) (adult human peripheral blood-derived CD34+subpop
ulation has both angiogenic and osteogenic activity) and Matsumoto et al., Bone
2008 pages 1-6を参照されたい。本実験ではヒト胎盤灌流液(HPP)の細胞によるイン
ビボ骨形成活性及び血管形成について述べる。
athology 169: 1440-1457 (2006) (adult human peripheral blood-derived CD34+subpop
ulation has both angiogenic and osteogenic activity) and Matsumoto et al., Bone
2008 pages 1-6を参照されたい。本実験ではヒト胎盤灌流液(HPP)の細胞によるイン
ビボ骨形成活性及び血管形成について述べる。
骨形成活性:6週齢無胸腺ラットの頭蓋冠の各側に頭蓋欠損(3mm×5mm)を作出
した。各左側欠損をHealos(DePuy Orthopaedics Inc.、
インディアナ州ワルシャワ(Warsaw))キャリア単独で処置し、一方、各右側欠損を陽性
対照(Healos+骨形態形成蛋白質2(BMP-2))、陰性対照(空欠損(empty
defect))又はHPP+Healosで処置した。八匹のラットを各処置群に割り当てた
。移植の4週後にラットを殺処分した。組織学的解析のために頭蓋冠を処理し、表2にお
けるプロトコルに従って組織切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E染色)で染色し
た。
した。各左側欠損をHealos(DePuy Orthopaedics Inc.、
インディアナ州ワルシャワ(Warsaw))キャリア単独で処置し、一方、各右側欠損を陽性
対照(Healos+骨形態形成蛋白質2(BMP-2))、陰性対照(空欠損(empty
defect))又はHPP+Healosで処置した。八匹のラットを各処置群に割り当てた
。移植の4週後にラットを殺処分した。組織学的解析のために頭蓋冠を処理し、表2にお
けるプロトコルに従って組織切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E染色)で染色し
た。
4を最大量として0~4の採点システムにより、欠損部への骨内部成長の量を評価した
(*Healos単独(空欠損(empty defect)))と比べてp<.05)(図6参照)
。
(*Healos単独(空欠損(empty defect)))と比べてp<.05)(図6参照)
。
血管形成:足場のみを移植された動物群と比べて、HPP播種足場を皮下移植された動
物群における外植片において血管新生が示された。
物群における外植片において血管新生が示された。
(材料及び方法)
皮下足場移植:6週齢(試験開始時)雄Hsd:RH-Foxn1rnu無胸腺ラット
に足場を移植した。被験群に対して5×106細胞/mLにてHPPを受動的に吸着され
た円径5mmの足場(Vitoss Bone Graft Substitute,O
rthovita社)をラットに移植した。対照群にはVitossのみを移植した。ラ
ットに麻酔をかけ、群により背部、腹部又は大腿部に移植片を皮下に入れた。手術後第2
1日目及び42日目にCO2窒息により選択ラットを安楽死処分した。移植片を回収し、
10%標準緩衝ホルマリンに入れた。パラフィンに包埋した後、免疫蛍光染色のために5
μm切片を処理した。
皮下足場移植:6週齢(試験開始時)雄Hsd:RH-Foxn1rnu無胸腺ラット
に足場を移植した。被験群に対して5×106細胞/mLにてHPPを受動的に吸着され
た円径5mmの足場(Vitoss Bone Graft Substitute,O
rthovita社)をラットに移植した。対照群にはVitossのみを移植した。ラ
ットに麻酔をかけ、群により背部、腹部又は大腿部に移植片を皮下に入れた。手術後第2
1日目及び42日目にCO2窒息により選択ラットを安楽死処分した。移植片を回収し、
10%標準緩衝ホルマリンに入れた。パラフィンに包埋した後、免疫蛍光染色のために5
μm切片を処理した。
免疫蛍光染色:ラット組織における移植ヒト細胞を検出するため、1:50希釈にてヒ
ト特異的CD34内皮細胞マーカーマウスモノクローナル抗体(クローンQBEnd/1
0)IgG1(Novocastra社 カタログ番号NCL-L-END)で免疫組織
化学的染色を行った(n=2)。ヒト及びラット平滑筋細胞を検出するため、1:30希
釈にてDako社 カタログ番号M0851からのα平滑筋アクチン(aSMA)マウス
モノクローナル(クローン1A4)を用いた。二次抗体は以下の通りであった:CD34
にはVector M.O.M.免疫検出キットフルオレセイン カタログ番号FMK-
2201、aSMAにはAlexa Flour 594結合のヤギ抗マウス(Mole
cular Probes社 A21135)。陽性対照は34の異なるヒト組織を有す
るヒト組織マイクロアレイ(Pantomics,Inc カタログ番号MNO341)
からなり、陰性対照はMax Arrayマウス組織マイクロアレイスライド(Zyme
dラボ カタログ番号75-2013)であった。
ト特異的CD34内皮細胞マーカーマウスモノクローナル抗体(クローンQBEnd/1
0)IgG1(Novocastra社 カタログ番号NCL-L-END)で免疫組織
化学的染色を行った(n=2)。ヒト及びラット平滑筋細胞を検出するため、1:30希
釈にてDako社 カタログ番号M0851からのα平滑筋アクチン(aSMA)マウス
モノクローナル(クローン1A4)を用いた。二次抗体は以下の通りであった:CD34
にはVector M.O.M.免疫検出キットフルオレセイン カタログ番号FMK-
2201、aSMAにはAlexa Flour 594結合のヤギ抗マウス(Mole
cular Probes社 A21135)。陽性対照は34の異なるヒト組織を有す
るヒト組織マイクロアレイ(Pantomics,Inc カタログ番号MNO341)
からなり、陰性対照はMax Arrayマウス組織マイクロアレイスライド(Zyme
dラボ カタログ番号75-2013)であった。
簡潔に説明すると、スライドを56℃で30分間焼成し、キシレンで脱パラフィンし(
各々5分の3回の変更)、再水和し(100%~70%エタノールに通す)、-20℃で
メタノール中0.5%過酸化水素にて内因性ペルオキシダーゼに対してブロックした。レ
ンジ加熱された0.01Mクエン酸塩緩衝液(pH6.0)にて抗原回復を行った(2サ
イクル、各10分)。アビジン及びビオチンブロックを15分間行った。Mouse-o
n-Mouse(M.O.M.)キット(Vector Laboratories社)
を用いて製造業者のプロトコルに従ってCD34染色を行った。第二の一次抗体(aSM
A)を4℃で一晩インキュベートし、対応する二次抗体(AF594)を室温で20分間
インキュベートした。すべてのステップの間でスライドをPBSで各々3回、5分間洗浄
した。核染色のために4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液
を5分間適用した。水性封入剤を用いてスライドの上にカバースリップを置いた。
各々5分の3回の変更)、再水和し(100%~70%エタノールに通す)、-20℃で
メタノール中0.5%過酸化水素にて内因性ペルオキシダーゼに対してブロックした。レ
ンジ加熱された0.01Mクエン酸塩緩衝液(pH6.0)にて抗原回復を行った(2サ
イクル、各10分)。アビジン及びビオチンブロックを15分間行った。Mouse-o
n-Mouse(M.O.M.)キット(Vector Laboratories社)
を用いて製造業者のプロトコルに従ってCD34染色を行った。第二の一次抗体(aSM
A)を4℃で一晩インキュベートし、対応する二次抗体(AF594)を室温で20分間
インキュベートした。すべてのステップの間でスライドをPBSで各々3回、5分間洗浄
した。核染色のために4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液
を5分間適用した。水性封入剤を用いてスライドの上にカバースリップを置いた。
画像解析:適切な落射蛍光フィルタセット及び撮像ソフトウェア(Nis Eleme
nts Basic Research)を備えたNikon Eclipse E80
0を用いてスライドを観察した。血管形成を評価するため、各スライドを5つの異なるフ
ィールドにて20倍の倍率で評価し、Nis Elementsソフトウェアによってフ
ィールドにおける発現のパーセントを測定することによりaSMA発現をアッセイした。
nts Basic Research)を備えたNikon Eclipse E80
0を用いてスライドを観察した。血管形成を評価するため、各スライドを5つの異なるフ
ィールドにて20倍の倍率で評価し、Nis Elementsソフトウェアによってフ
ィールドにおける発現のパーセントを測定することによりaSMA発現をアッセイした。
(結果)
HPPを投与される動物における内因的血管形成の増進:aSMAに対する陽性免疫染
色及び内皮細胞におけるCD34の欠如により、レシピエントに対する移植細胞のパラク
リン作用による増進した血管形成を確認した。より初期の時点(21日)(n=2)にお
いて対照群より多くの血管新生を認め、これらの新血管における特異的なヒト内皮細胞マ
ーカーのエビデンスはなかったが、血管に近接する一部の細胞はCD34に対して染色さ
れた(図7)。より後期の時点(42日)において増進した血管形成を認めたが、21日
時点に対してより低い程度であり、HPP群において陽性CD34細胞を認めなかった(
図8)。
HPPを投与される動物における内因的血管形成の増進:aSMAに対する陽性免疫染
色及び内皮細胞におけるCD34の欠如により、レシピエントに対する移植細胞のパラク
リン作用による増進した血管形成を確認した。より初期の時点(21日)(n=2)にお
いて対照群より多くの血管新生を認め、これらの新血管における特異的なヒト内皮細胞マ
ーカーのエビデンスはなかったが、血管に近接する一部の細胞はCD34に対して染色さ
れた(図7)。より後期の時点(42日)において増進した血管形成を認めたが、21日
時点に対してより低い程度であり、HPP群において陽性CD34細胞を認めなかった(
図8)。
画像解析は対照群(Vitoss単独)と比べて21日目におけるHPP群における統
計的に有意により高い血管形成を示し(p<0.01)、42日目における群において統
計的に有意な差を認めなかった(図9)。
計的に有意により高い血管形成を示し(p<0.01)、42日目における群において統
計的に有意な差を認めなかった(図9)。
本発明は、本明細書で述べられる具体的な実施形態に範囲を限定されてはならない。実
際、本明細書で述べられることに加えて本発明の様々な改変が前述の説明から当業者には
明らかになるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
際、本明細書で述べられることに加えて本発明の様々な改変が前述の説明から当業者には
明らかになるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
本明細書で引用されるすべての文献は、個々の公開物、特許又は特許出願が具体的に個
々に示されるがごとく、その全体を参照してあらゆることを目的として本明細書により組
み込まれる。いずれの公開物の引用も出願日前のその開示に対するものであり、本発明が
先行発明のためにそのような公開物に先行する権利がないという承認と理解されるべきで
はない。
々に示されるがごとく、その全体を参照してあらゆることを目的として本明細書により組
み込まれる。いずれの公開物の引用も出願日前のその開示に対するものであり、本発明が
先行発明のためにそのような公開物に先行する権利がないという承認と理解されるべきで
はない。
Claims (27)
- 胎盤灌流液細胞の集団から血管を形成する方法であって、前記細胞の集団を血管の形成
を促進する条件に接触させるステップを含む方法。 - 前記胎盤灌流液細胞の集団が胎盤灌流液由来の全有核細胞である、請求項1に記載の方
法。 - 前記接触が、前記細胞をVEGF(50~200ng/mL)、TGF-β(1~5n
g/mL)、FGF(10~50ng/mL)及び1つ又はそれ以上のマトリクスメタロ
プロテアーゼ(各々1~3Unit/mL)に接触させるステップを含む、請求項1に記載の
方法。 - 前記接触がインビトロにて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触がインビボにて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記胎盤灌流液細胞の集団が、単一の胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む
、請求項1に記載の方法。 - 前記胎盤灌流液細胞がCD34+細胞である、請求項6に記載の方法。
- 前記CD34+細胞がCD34+CD45-細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記CD34+細胞又はCD34+CD45-細胞が、CD31、CXCR4又はVE
GFRの少なくとも1つを、臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルで発現
する、請求項6又は7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記胎盤灌流液細胞の集団が、前記灌流液から単離されない単離CD34+細胞を含む
、請求項1に記載の方法。 - 前記CD34+細胞が胎盤から単離される、請求項10に記載の方法。
- 前記CD34+細胞が、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される、請求項10
に記載の方法。 - 前記CD34+細胞が、CD31、CXCR4又はVEGFRを臍帯血由来の同等数の
CD34+細胞より高いレベルで発現する、請求項10に記載の方法。 - 前記CD34+細胞がCD34+,CD45-細胞である、請求項10に記載の方法。
- 心臓又は血管疾患、障害、病状若しくは不全を有する患者を処置する方法であって、前
記疾患、障害、病状又は不全を処置するのに十分な量にてヒト胎盤灌流液又はヒト胎盤灌
流液細胞を前記患者に投与するステップを含む方法。 - 前記疾患、障害、病状又は不全が、末梢血管疾患、急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症
、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性
心疾患である、請求項15に記載の方法。 - 前記胎盤灌流液細胞が胎盤灌流液由来の全有核細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記胎盤灌流液細胞の集団が、単一の胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む
、請求項15に記載の方法。 - 前記胎盤灌流液細胞がCD34+細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記CD34+細胞がCD34+CD45-細胞である、請求項19に記載の方法。
- 前記CD34+細胞又はCD34+CD45-細胞が、CD31、CXCR4又はVE
GFRの少なくとも1つを臍帯血由来の同等数のCD34+細胞より高いレベルで発現す
る、請求項19又は20に記載の方法。 - 前記胎盤灌流液細胞の集団が、前記灌流液から単離されない単離CD34+細胞を含む
、請求項15に記載の方法。 - 前記CD34+細胞が胎盤から単離される、請求項22に記載の方法。
- 前記CD34+細胞が、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される、請求項22
に記載の方法。 - 前記CD34+細胞が、CD31、CXCR4又はVEGFRを臍帯血由来の同等数の
CD34+細胞より高いレベルで発現する、請求項22に記載の方法。 - 前記胎盤灌流液細胞が足場又はマトリクス上にて投与される、請求項15に記載の方法
。 - 前記胎盤灌流液細胞が静脈内投与される、請求項15に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US99567907P | 2007-09-26 | 2007-09-26 | |
US60/995,679 | 2007-09-26 | ||
JP2020136719A JP2020189872A (ja) | 2007-09-26 | 2020-08-13 | ヒト胎盤灌流液由来の血管形成細胞 |
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