JP2010540530A - ヒト胎盤灌流液由来の血管形成細胞 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液からの血管細胞又は血管形成細胞の生成である。更に提供されるのは、心臓又は血管不全、疾患、障害若しくは病状を有する患者を処置する方法であり、該方法は、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、或いは胎盤灌流液若しくは灌流液細胞と胎盤若しくは非胎盤造血幹細胞又は付着胎盤幹細胞との組合せを、前記患者に投与するステップを含む。

Description

本発明は、単離胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞集団、該灌流液又は灌流液細胞を含む組成物並びに、血管形成細胞及び血管形成細胞集団を生成し、且つ心臓又は血管疾患、障害若しくは不全を有する患者を処置するために胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を用いる方法に関する。

ヒト幹細胞は、様々な成熟ヒト細胞系統を発生させることができる全能性又は多能性前駆細胞である。幹細胞はすべてではないとしても多くの組織に再配置させ、且つ生理的及び解剖的機能性を回復させるために用いられ得るということを実証する根拠が存在する。

多くの異なるタイプの哺乳動物幹細胞が特徴付けられている。例えば、カプランら米国特許第５，４８６，３５９号（ヒト間葉幹細胞）；Boyseら、米国特許第５，００４，６８１号（胎児及び新生児造血幹細胞及び前駆細胞）；Boyseら、米国特許第５，１９２，５５３号（同）；Beltrami et al, Cell 114(6):763-766 (2003)（心臓幹細胞）；Forbes et al, J. Pathol. 197(4):510-518 (2002)（肝幹細胞）を参照されたい。臍帯血及び臍帯血由来の全有核細胞は、切除治療を受けた患者における造血機能を部分的又は完全に回復させるために移植において用いられている。胎盤灌流液は、灌流溶液の胎盤血管系の通過によって得られる胎盤細胞の回収及び血管系、胎盤の母体面若しくはその両方からの灌流流体の回収を含む。哺乳動物胎盤を灌流する方法は、例えば、米国特許第７，０４５，１４６号及び米国特許第７，２５５，８７９号に述べられている。灌流によって得られる胎盤細胞集団は異質性であり、特に、ＣＤ３４^＋細胞、有核細胞、例えば、顆粒球、単球及びマクロファージ、わずかな割合（１％未満）の組織培養基質−付着胎盤幹細胞を含む。血管形成細胞の生成における胎盤灌流液又は該灌流液由来胎盤細胞集団の使用については、これまで述べられたことがない。

米国特許第５，４８６，３５９号 米国特許第５，００４，６８１号 米国特許第５，１９２，５５３号 米国特許第７，０４５，１４６号 米国特許第７，２５５，８７９号

Beltrami et al, Cell 114(6):763-766 (2003) Forbes et al, J. Pathol. 197(4):510-518 (2002)

本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞から血管形成細胞又は血管細胞を、例えば、胎盤灌流液から全有核細胞を生成する方法である。

一態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、血管系を形成する能力を有する血管形成細胞又は血管細胞を生成する方法であり、該方法は、胎盤灌流液又は灌流液細胞を、複数の前記細胞が血管又は心臓系の細胞、例えば、血管細胞、例えば、内皮細胞又は心臓細胞に分化する条件下で培養するステップを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は前記胎盤灌流液細胞は、造血胎盤幹細胞、例えば、ＣＤ３４^＋胎盤細胞を含む。本明細書で用いられるように、「ＣＤ３４^＋胎盤細胞」という用語は、ＣＤ３４^＋細胞、例えば、胎盤血又は臍帯血からではなく胎盤から得られる内皮前駆細胞を指す。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞、例えば、前記ＣＤ３４^＋胎盤幹細胞は、臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルでの量の１つ又はそれ以上の血管形成関連マーカーを生成する。具体的な実施形態では、前記マーカーは、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ及び／又はＣＸＣＲ４を含む。具体的な実施形態では、前記胎盤ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻細胞は、臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルでの量の１つ又はそれ以上の血管形成関連マーカーを生成する。具体的な実施形態では、前記マーカーは、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ及び／又はＣＸＣＲ４を含む。別の具体的な実施形態では、前記培養は、前記灌流液細胞、例えば、前記ＣＤ３４^＋胎盤細胞を形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）及び１つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼに接触させるステップを含む。より具体的な実施形態では、前記培養は１８〜２４時間である。別のより具体的な実施形態では、前記細胞は前記接触の２４時間後に視認可能な血管構造を形成する。より具体的な実施形態では、前記接触は前記細胞が２４時間後に視認可能な血管構造を形成する条件下にあり、臍帯血由来ＣＤ３４^＋幹細胞は視認可能な血管構造を形成せず、又は前記灌流液細胞若しくはＣＤ３４^＋胎盤細胞より少ない血管構造を検出可能に形成する。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。より具体的な実施形態では、前記インビボ接触は哺乳動物において行われる。より具体的な実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。一部の実施形態では、本明細書で述べられるＣＤ３４^＋細胞又はＣＤ３４^＋細胞集団は増殖する。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液細胞集団から血管を形成する方法であり、該方法は、前記細胞集団を、血管形成を促進する条件に接触させるステップを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は胎盤灌流液由来の全有核細胞である。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞はＣＤ３４^＋細胞である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞は、ＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲの少なくとも１つを臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルで発現する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない単離ＣＤ３４^＋細胞（例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などから単離される単離ＣＤ３４^＋細胞）を含む。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は胎盤から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルのＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを発現する。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻細胞である。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻細胞は臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルのＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを発現する。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、患者における血管形成又は血管形成を促進することによって心臓又は血管不全若しくは障害を有する患者を処置する方法であり、該方法は、心臓又は血管不全の１つ又はそれ以上の症状の検出可能な改善又は悪化の低下を生じさせるのに十分な量にて、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を患者に投与するステップを含む。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は移植可能又は注入可能な組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は本明細書で提供される組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、複数のＣＤ３４^＋胎盤細胞、胎盤付着細胞又はその両方が補充される。

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、心臓又は血管疾患、障害、病状若しくは不全を有する患者を処置する方法であり、該方法は、前記疾患、障害、病状又は不全を処置するのに十分な量にて前記患者にヒト胎盤灌流液細胞を投与するステップを含む。具体的な実施形態では、前記疾患、障害、病状又は不全は、末梢血管疾患、急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は胎盤灌流液由来の全有核細胞である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞はＣＤ３４^＋細胞である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞は、ＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲの少なくとも１つを臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルで発現する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない単離ＣＤ３４^＋細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は胎盤から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ４５⁻細胞である。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞又は前記ＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞は臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルのＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを発現する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は足場又はマトリクス上にて投与される。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は静脈内投与される。

上記方法の一部の実施形態では、ＣＤ３４^＋胎盤細胞は胎盤灌流液から単離され、例えば、胎盤灌流液細胞から単離される。一部の実施形態では、該細胞はＣＤ４４⁻である。一部の実施形態では、該細胞はＣＤ９^＋，ＣＤ５４^＋，ＣＤ９０^＋又はＣＤ１６６^＋である。一部の実施形態では、該細胞はＣＤ９^＋，ＣＤ５４^＋，ＣＤ９０^＋及びＣＤ１６６^＋である。一部の実施形態では、該細胞はＣＤ３１^＋，ＣＤ１１７^＋，ＣＤ１３３^＋又はＣＤ２００^＋である。一部の実施形態では、該細胞はＣＤ３１^＋，ＣＤ１１７^＋，ＣＤ１３３^＋及びＣＤ２００^＋である。一部の実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞である。一部の他の実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルのＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを発現する。

一部の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞は胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と組み合わせられる。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞は胎盤細胞である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞は胎盤内皮前駆細胞である。他の具体的な実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞は造血細胞、例えば、胎盤ＣＤ３４^＋造血幹細胞である。具体的な実施形態では、造血細胞と胎盤灌流液細胞との比率は、約１００：１，９５：５，９０：１０，８５：１５，８０：２０，７５：２５，７０：３０，６５：３５，６０：４０，５５：４５：５０：５０，４５：５５，４０：６０，３５：６５，３０：７０，２５：７５，２０：８０，１５：８５，１０：９０，５：９５，１００：１，９５：１，９０：１，８５：１，８０：１，７５：１，７０：１，６５：１，６０：１，５５：１，５０：１，４５：１，４０：１，３５：１，３０：１，２５：１，２０：１，１５：１，１０：１，５：１，１：１，１：５，１：１０，１：１５，１：２０，１：２５，１：３０，１：３５，１：４０，１：４５，１：５０，１：５５，１：６０，１：６５，１：７０，１：７５，１：８０，１：８５，１：９０，１：９５，１：１００等である。一部の他の実施形態では、胎盤以外の供給源由来（例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などに由来）のＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３４^＋胎盤細胞と組み合わせられる。具体的な実施形態では、非胎盤ＣＤ３４^＋細胞とＣＤ３４^＋胎盤細胞との比率は、約１００：１，９５：５，９０：１０，８５：１５，８０：２０，７５：２５，７０：３０，６５：３５，６０：４０，５５：４５：５０：５０，４５：５５，４０：６０，３５：６５，３０：７０，２５：７５，２０：８０，１５：８５，１０：９０，５：９５，１００：１，９５：１，９０：１，８５：１，８０：１，７５：１，７０：１，６５：１，６０：１，５５：１，５０：１，４５：１，４０：１，３５：１，３０：１，２５：１，２０：１，１５：１，１０：１，５：１，１：１，１：５，１：１０，１：１５，１：２０，１：２５，１：３０，１：３５，１：４０，１：４５，１：５０，１：５５，１：６０，１：６５，１：７０，１：７５，１：８０，１：８５，１：９０，１：９５，１：１００等である。

一部の実施形態における胎盤灌流液は組織培養プラスチック付着胎盤幹細胞を含む。付着幹細胞は、米国特許第７，０４５，１４８号；第７，２５５，８７９号；第７，３１１，９０４号及び第７，３１１，９０５号；及び米国出願公開第２００７／０２７５３６２号及び２００８／００３２４０１号に詳細に述べられている細胞であり、それらの開示内容はその全体を参照して本明細書に組み込まれる。付着胎盤幹細胞は幹細胞の１つ又はそれ以上の特徴を示し（例えば、幹細胞と関連するマーカーを示し、未分化状態にて培養液中で少なくとも１０〜２０回複製し、３つの胚葉を代表する成熟細胞に分化する能力を有する等）、組織培養基質（例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートの表面のような組織培養プラスチック）に付着することができる。

一実施形態では、付着胎盤幹細胞はＣＤ２００^＋又はＨＬＡ−Ｇ^＋である。具体的な実施形態では、前記細胞はＣＤ２００^＋及びＨＬＡ−Ｇ^＋である。具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ４５⁻，ＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の１つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。

別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋及びＣＤ２００^＋である。具体的な実施形態では、前記幹細胞はＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ４５⁻及びＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の１つ又はそれ以上の胚様体の発生を容易にする。

別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はＣＤ２００^＋及びＯＣＴ−４^＋である。具体的な実施形態では、幹細胞はＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ４５⁻，ＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋及びＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団由来の１つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。

別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋であり、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記集団における１つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＯＣＴ４^＋である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＯＣＴ４^＋，ＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。

別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋及びＨＬＡ−Ｇ^＋である。具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＯＣＴ−４^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ４５⁻，ＯＣＴ−４^＋及びＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養中の胎盤幹細胞を含む単離胎盤細胞集団由来の１つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。

別の実施形態では、付着胎盤幹細胞はＯＣＴ−４^＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞集団における１つ又はそれ以上の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋，ＣＤ２００^＋，ＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。

別の実施形態では、灌流液又は灌流液細胞は、一方法に従って生成される、本明細書で述べられる胎盤幹細胞単離集団を含み、該方法は、臍帯血から排出され、且つ残留血液を除去するために灌流された哺乳動物胎盤を灌流するステップ；前記胎盤を灌流溶液で灌流するステップ；及び前記灌流溶液を回収するステップ（灌流後の前記灌流溶液は胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団を含む）；及び前記細胞集団から複数の前記胎盤幹細胞を単離するステップを含む。具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈及び臍動脈中を通され、胎盤から浸出した後に回収される。別の具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈を通されて臍動脈から回収され、又は臍動脈を通されて臍静脈から回収される。

より具体的な実施形態では、付着胎盤幹細胞は骨髄由来間葉幹細胞より検出可能に高いレベルにて１つ又はそれ以上の遺伝子を発現し、前記１つ又はそれ以上の遺伝子は、
ＡＣＴＧ２，ＡＤＡＲＢ１，ＡＭＩＧＯ２，ＡＴＲＳ−１，Ｂ４ＧＡＬＴ６，ＢＣＨＥ，Ｃ１１ｏｒｆ９，ＣＤ２００，ＣＯＬ４Ａ１，ＣＯＬ４Ａ２，ＣＰＡ４，ＤＭＤ，ＤＳＣ３，ＤＳＧ２，ＥＬＯＶＬ２，Ｆ２ＲＬ１，ＦＬＪ１０７８１，ＧＡＴＡ６，ＧＰＲ１２６，ＧＰＲＣ５Ｂ，ＩＣＡＭ１，ＩＥＲ３，ＩＧＦＢＰ７，ＩＬ１Ａ，ＩＬ６，ＩＬ１８，ＫＲＴ１８，ＫＲＴ８，ＬＩＰＧ，ＬＲＡＰ，ＭＡＴＮ２，ＭＥＳＴ，ＮＦＥ２Ｌ３，ＮＵＡＫ１，ＰＣＤＨ７，ＰＤＬＩＭ３，ＰＪＰ２，ＲＴＮ１，ＳＥＲＰＩＮＢ９，ＳＴ３ＧＡＬ６，ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５，ＳＬＣ１２Ａ８，ＴＣＦ２１，ＴＧＦＢ２，ＶＴＮ，及びＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群より選択され、前記骨髄由来幹細胞は前記胎盤幹細胞の多くの継代と同等の多くの継代培養を受けている。

本明細書で更に提供されるのは、胎盤灌流液又は灌流液細胞を含む組成物、例えば、医薬組成物の使用である。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は複数のＣＤ３４^＋胎盤細胞及び／又は付着胎盤幹細胞を補充される。具体的な実施形態では、該組成物は胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と、前記灌流液又は灌流液細胞からの血管又は血管様構造の形成を誘導する１つ又はそれ以上の作用因子とを含む。より具体的な実施形態では、前記作用因子は、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、プラスミノーゲン、ｔＰＡ及び１つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼを含む。

別の具体的な実施形態では、前述の組成物のいずれもマトリクスを含む。より具体的な実施形態では、前記マトリクスは三次元足場である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン又はビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態では、該マトリクスは羊膜又は羊膜由来生体材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは細胞外膜蛋白質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは合成化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは生物活性化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記生物活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体又は５，０００ダルトン未満の有機分子である。一部の実施形態では、該マトリクスは合成分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸又はポリグリコール酸である。一部の実施形態では、該マトリクスは移植可能な足場基質（scaffolding substrate）である。一部の実施形態では、該移植可能な足場基質（scaffolding substrate）はコラーゲン基質又はヒアルロン酸基質である。一部の実施形態では、該移植可能足場基質（scaffolding substrate）はコラーゲン基質である。

更に別の態様では、本明細書で提供されるのはマトリクスを製剤化する方法であり、該方法は胎盤灌流液又は灌流液細胞と移植可能な足場基質（implantable scaffolding substrate）とを組み合わせるステップを含む。一部の実施形態では、幹細胞は非付着性である。一部の実施形態では、幹細胞はＣＤ３４^＋である。別の態様では、本明細書で提供されるのは注入可能な組成物を製剤化する方法であり、該方法は胎盤灌流液又は灌流液細胞と注入可能なヒアルロン酸又はコラーゲンとを組み合わせるステップを含む。一部の実施形態では、幹細胞は非付着性である。一部の実施形態では、幹細胞はＣＤ３４^＋である。

一部の実施形態では、胎盤灌流液細胞又は胎盤灌流液細胞を含む組成物、例えば、医薬組成物は容器内に含まれる。該容器は一実施形態において液体の静脈内送達に好適なバッグである。一部の実施形態では、該容器は少なくとも約、又は最大で１×１０^６，５×１０^６，１×１０^７，５×１０^７，１×１０^８，５×１０^８，１×１０^９，５×１０^９又は１×１０^１０個の細胞、例えば、胎盤灌流液細胞、複数のＣＤ３４^＋胎盤細胞（例えば、ＣＤ３４^＋胎盤内皮前駆細胞）を補充された胎盤灌流液細胞又は付着胎盤幹細胞を補充された胎盤灌流液細胞を含む。一部の実施形態では、該容器は前記幹細胞を含む。一部の実施形態では、該細胞はわずか５回、１０回又は２０回継代されている。一部の実施形態では、該細胞は前記容器内にて増殖されている。一部の実施形態では、前記容器内の前記細胞は０．９％ ＮａＣｌ溶液中に含まれる。

別の態様では、本明細書で提供されるのはマトリクスを製剤化する方法であり、該方法は幹細胞を含む胎盤灌流液又は灌流液細胞と移植可能な足場基質（implantable scaffolding substrate）とを組み合わせるステップを含む。一部の他の実施形態では、本明細書で提供されるのは注入可能組成物を製剤化する方法であり、該方法は、幹細胞集団と注入可能なヒアルロン酸又はコラーゲンとを組み合わせるステップを含み、前記幹細胞はＣＤ３４^＋胎盤細胞である。一部の実施形態では、前記幹細胞は胎盤灌流液細胞内に含まれる。一部の実施形態では、該組成物は注入可能なヒアルロン酸を含む。一部の実施形態では、該組成物は注入可能なコラーゲンを含む。

本明細書で更に提供されるのは、本明細書で提供される組成物及び方法における凍結保存胎盤灌流液又は灌流液細胞の使用である。

（３．１ 定義）
本明細書で用いられるように、「ＳＨ２」という用語はＣＤ１０５マーカー上のエピトープに結合する抗体を指す。従って、ＳＨ２^＋と称される細胞はＣＤ１０５^＋である。

本明細書で用いられるように、「ＳＨ３」及び「ＳＨ４」という用語はＣＤ７３マーカー上に存在するエピトープに結合する抗体を指す。従って、ＳＨ３^＋及び／又はＳＨ４^＋と称される細胞はＣＤ７３^＋である。

本明細書で用いられるように、「単離幹細胞」という用語は、幹細胞が由来する組織（例えば胎盤）の他の非幹細胞から実質的に分離される幹細胞を指す。例えば、幹細胞の回収及び／又は培養時に幹細胞が自然に付随する非幹細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は少なくとも９９％が幹細胞から除去される場合、幹細胞は「単離」される。

本明細書で用いられるように、「単離細胞集団」という用語は、細胞集団が由来する組織（例えば胎盤）の他の細胞から実質的に分離される細胞集団を指す。例えば、幹細胞の回収及び／又は培養時に、細胞集団又は細胞集団が由来する細胞が自然に付随する細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は少なくとも９９％が幹細胞から除去される場合、幹細胞は「単離」される。本明細書で用いられるように、「胎盤灌流液」とは、例えば、胎盤血管系を通じて、少なくとも一部の胎盤（例えばヒト胎盤）中を通された灌流溶液のことであり、胎盤通過時に灌流溶液によって回収される複数の細胞を含む。本明細書で用いられるように、「胎盤灌流液細胞」とは、胎盤灌流液から単離される、又は単離可能な有核細胞、例えば、全有核細胞のことである。

本明細書で用いられるように、「胎盤幹細胞」という用語は、形態、細胞表面マーカー又は初代培養後の継代数にかかわらず、哺乳動物胎盤由来の幹細胞又は前駆細胞を指す。しかし、本明細書で用いられる「胎盤幹細胞」という用語はトロホブラストを指さない。細胞が幹細胞の少なくとも１つの特性、例えば、１つ又はそれ以上のタイプの幹細胞と関連するマーカー又は遺伝子発現プロファイル；培養液中にて少なくとも１０〜４０回複製する能力；３つのすべての胚葉の細胞に分化する能力；成熟（即ち、分化）細胞特徴の欠如などを保持する場合、その細胞は「幹細胞」とみなされる。「胎盤幹細胞」及び「胎盤由来幹細胞」という用語は互換的に用いられ得る。

本明細書で用いられるように、マーカーが検出可能である場合、幹細胞はその特定のマーカーに対して「陽性」である。例えば、ＣＤ７３がバックグラウンドより（例えば、対照アイソタイプと比べて）検出可能に多い量にて胎盤幹細胞上に検出可能であるため、胎盤幹細胞は、例えば、ＣＤ７３に対して陽性である。マーカーが細胞を少なくとも１つの他の細胞型と識別するために用いられ得る場合、或いは細胞が存在し、又は細胞によって発現される場合に細胞を選択し、又は単離するために用いられ得る場合、その細胞もそのマーカーに対して陽性である。

本明細書で用いられるように、「マトリクス」とは物質全体に散在する細孔を特徴とする三次元基質を指す。該細孔は、例えば、マトリクス内での細胞、例えば、幹細胞、ＰＤＡＣ及び／又は骨形成原細胞の増殖に好適である。典型的なマトリクスには、限定されないが、β−リン酸三カルシウム基質、β−リン酸三カルシウム−コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、石灰化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質及びセラミック基質が含まれる。好ましくは、マトリクスはマトリクスの細孔内に存在する骨形成原細胞によって石灰化され得る。

臍帯血（ＣＢ）又はヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）中のＣＤ３４及び／又はＣＤ４５を発現している有核灌流液細胞の割合を示すグラフ図である。 ＣＤ３１、ＣＸＣＲ４及び／又はＶＥＧＦＲを発現している臍帯血（ＣＢ）又はヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）由来のＣＤ３４^＋細胞の割合を示すグラフ図である。 ｑＲＴ−ＰＣＲによるＨＰＰ ＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻及びＣＤ３４＋ＣＤ４５^＋細胞における遺伝子発現解析を示すグラフ図である。ヒト胎盤灌流液ＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻及びＣＤ３４^＋，ＣＤ４５^＋細胞におけるＣＤ３４及びＣＤ４５の相対的発現は、臍帯血由来のＣＤ３４^＋細胞におけるＣＤ３４及びＣＤ４５の発現に正規化されている。相対的定量（ＲＱ）（Ｙ軸）は２^{−ΔΔＣｔ}として示される。 ギル改変（Gill’s Modified）ヘマトキシリン染色法で染色されたＣＦＵ−Ｈｉｌｌコロニーを示す写真図である（倍率２００倍）。コロニーはＥＮＤＯＣＵＬＴ（登録商標）培地にて２週間培養されたヒト胎盤灌流液細胞の培養物から発達した。 ９６ウェルプレートの１ウェル当たり１０^６個の細胞にてＥＣＭａｔｒｉｘ上で１８〜２４時間培養されたＨＰＰ細胞による血管形成を示す写真図である（倍率：２００倍）。 ＨＰＰによるインビボ骨形成活性を示すグラフ図である。 移植２１日後に足場の中央部にて撮影された画像を示す写真図である。（Ａ）Ｖｉｔｏｓｓ及びＨＰＰ細胞（Ｂ）細胞を有さないＶｉｔｏｓｓ。図６Ａにみられるように、血管に近接して多くのＣＤ３４陽性細胞（矢印）が認められる。原倍率２００倍、スケールバー１００μｍ；原色：ａＳＭＡレッド（ＡＦ５９４）、ＣＤ３４グリーン（フロウレセイン（flourescein））。 移植４２日後に足場の中央部にて撮影された画像を示す写真図である。（Ａ）Ｖｉｔｏｓｓ及びＨＰＰ（Ｂ）細胞を有さないＶｉｔｏｓｓ。図７Ａにみられるように、ＣＤ３４陽性細胞（矢印）は血管に近接して認められない。原倍率２００倍、スケールバー１００μｍ、ａＳＭＡレッド（ＡＦ５９４）。 二匹の動物に関する２１日目におけるＨＰＰ細胞を有する群における血管形成の統計的に有意な増進を示す画像解析を示すグラフ図である。Ｙ軸−α平滑筋アクチンの発現パーセント。

（５．１ 胎盤灌流液を用いた処置方法）
本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液から血管細胞又は血管形成細胞を生成する方法及びそのような細胞の使用並びに、心臓又は血管不全、疾患、障害若しくは病状を有する患者の処置における、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞の単独或いはＣＤ３４^＋胎盤細胞（例えば、ＣＤ３４^＋胎盤内皮前駆細胞）及び／又は付着胎盤幹細胞、例えば、下記の「５．３ 付着胎盤幹細胞」に述べられている付着胎盤幹細胞と組み合わせた使用である。より具体的な実施形態では、前記疾患、障害又は病状は、末梢血管疾患、急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である。

一態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、血管系を形成する能力を有する血管形成細胞又は血管細胞を生成する方法であり、該方法は、胎盤灌流液又は灌流液細胞を、複数の前記細胞が血管系又は心臓系の細胞、例えば、血管細胞、例えば、内皮細胞又は心臓細胞に分化する条件に接触させるステップを含む。具体的な実施形態では、前記接触はインビボである。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロであり、例えば、前記灌流液又は灌流液細胞を、該細胞が血管系若しくは心臓系の細胞に分化し、又はそのような細胞の特徴を示す条件下にて培養する。より具体的な実施形態では、前記１つ又はそれ以上の特徴は血管又は血管様構造の形成を含む。別の具体的な実施形態では、前記培養は、前記灌流液細胞、例えば、前記ＣＤ３４^＋胎盤細胞を形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）及び１つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼに接触させるステップを含む。別の実施形態では、前記接触は、前記灌流液細胞をＶＥＧＦ（５０〜２００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−β（１〜５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍＬ）及び１つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼ（各々１〜３Unit／ｍＬ）に接触させるステップを含み、例えば、前記ＶＥＧＦ，ＴＧＦ−β，ＦＧＦ及び１つ若しくはそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼはマトリクス、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌに含まれる。前記マトリクスメタロプロテアーゼは任意のマトリクスメタロプロテアーゼ又はマトリクスメタロプロテイナーゼの組合せ、例えば、マトリクスメタロプロテイナーゼ１，３及び４の組合せでよい。より具体的な実施形態では、前記培養は１８〜２４時間である。別のより具体的な実施形態では、前記細胞は前記接触の２４時間後に視認可能な血管構造を形成する。より具体的な実施形態では、前記接触は、前記細胞が２４時間後に視認可能な血管構造を形成する条件下にあり、臍帯血由来のＣＤ３４^＋細胞は視認可能な血管構造、又は前記灌流液細胞若しくはＣＤ３４^＋胎盤細胞より検出可能に少ない血管構造を形成しない。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。より具体的な実施形態では、前記インビボ接触は哺乳動物において行われる。より具体的な実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは胎盤灌流液細胞集団から血管を形成する方法であり、該方法は、前記細胞集団を、血管形成を促進する条件に接触させるステップを含む。具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は胎盤灌流液由来の全有核細胞である。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビトロにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記接触はインビボにて行われる。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞はＣＤ３４^＋細胞である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞は、ＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲの少なくとも１つを臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルで発現する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は、前記灌流液から単離されない単離ＣＤ３４^＋細胞（例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄などから単離される単離ＣＤ３４^＋細胞）を含む。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は胎盤から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルのＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを発現する。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻細胞である。

別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は前記胎盤灌流液細胞は、胎盤幹細胞又は胎盤前駆細胞、例えば、ＣＤ３４^＋胎盤細胞、例えば、ＣＤ３４^＋胎盤内皮前駆細胞を含む。本明細書で用いられるように、「ＣＤ３４^＋胎盤細胞」という用語は、胎盤血又は臍帯血からではなく胎盤から得られるＣＤ３４^＋細胞を指す。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞、例えば、前記ＣＤ３４^＋胎盤細胞は、臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルでの量の１つ又はそれ以上の血管形成関連マーカーを生成する。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ４５⁻である。具体的な実施形態では、前記マーカーは、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ及び／又はＣＸＣＲ４を含む。他の実施形態では、該ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ４４⁻である。一部の実施形態では、該ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ９^＋，ＣＤ５４^＋，ＣＤ９０^＋又はＣＤ１６６^＋である。一部の実施形態では、該ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ９^＋，ＣＤ５４^＋，ＣＤ９０^＋及びＣＤ１６６^＋である。一部の実施形態では、該ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３１^＋，ＣＤ１１７^＋，ＣＤ１３３^＋又はＣＤ２００^＋である。一部の実施形態では、該ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３１^＋，ＣＤ１１７^＋，ＣＤ１３３^＋及びＣＤ２００^＋である。一部の実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞である。一部の他の実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルのＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを発現する。

一部の実施形態では、本明細書で述べられるＣＤ３４^＋細胞又はＣＤ３４^＋細胞集団のいずれも増殖される。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、例えば、患者における血管形成又は血管形成を促進することによって、心臓又は血管不全若しくは障害を有する患者を処置する方法であり、該方法は、心臓又は血管不全の１つ又はそれ以上の症状の検出可能な改善又は悪化の低下を生じさせるのに十分な量にて、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を患者に投与するステップを含む。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は移植可能又は注入可能な組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は本明細書で提供される組成物内に含まれる。別の具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、複数のＣＤ３４^＋胎盤細胞、胎盤付着細胞又はその両方を補充される。

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、心臓又は血管疾患、障害、病状若しくは不全を有する患者を処置する方法であり、該方法は、前記疾患、障害、病状又は不全を処置するのに十分な量にて前記患者にヒト胎盤灌流液細胞を投与するステップを含む。具体的な実施形態では、前記疾患、障害、病状又は不全は、末梢血管疾患、急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は胎盤灌流液由来の全有核細胞である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は単一胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞集団は前記灌流液から単離されない単離ＣＤ３４^＋細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は胎盤から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４^＋細胞は臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルのＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを発現する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は足場又はマトリクス上にて投与される。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は静脈内投与される。

胎盤灌流液、灌流液細胞、灌流液若しくは灌流液細胞と他の細胞との組合せ及び同一物を含む組成物、例えば、医薬組成物については以下に詳細に述べられる。

（５．２ 胎盤灌流液及び灌流液細胞を得る方法）
本明細書で提供されるのは哺乳動物胎盤から胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞を得る方法である。本明細書で述べられるすべての実施形態では、好ましい灌流液はヒト胎盤灌流液であり、好ましい灌流液細胞はヒト胎盤灌流液細胞である。

（５．２．１ 胎盤の回収及び取扱い）
一般的に、ヒト胎盤は分娩後のその排出直後に回収される。好ましい実施形態では、胎盤は、説明と同意後及び胎盤と関連する患者の完全な既往歴が得られた後に患者から回収される。好ましくは、既往歴は出産後継続する。そのような既往歴は胎盤又は胎盤から回収される幹細胞のその後の使用を調整するために用いられ得る。例えば、ヒト胎盤幹細胞は、既往歴に照らして胎盤と関連する乳幼児又は乳幼児の両親、兄弟姉妹若しくは他の血縁者のための個別化医療のために用いられ得る。

胎盤幹細胞の回収前に臍帯血及び胎盤血が除去される。一部の実施形態では、出産後に胎盤における臍帯血が回収される。胎盤は従来の臍帯血回収プロセスに晒され得る。一実施形態では、胎盤は、例えば、重力の力を借りて針又はカニューレを用いて放血される（例えば、Anderson, 米国特許第５，３７２，５８１号；Hessel et al, 米国特許第５，４１５，６６５号を参照されたい）。通常、針又はカニューレは臍静脈に配置され、胎盤は臍帯血を胎盤から排出するのに役立つように軽く揉まれ得る。そのような臍帯血回収は商業的に、例えば、ニュージャージー州Ｃｅｄａｒ Ｋｎｏｌｌｓ，ＬｉｆｅＢａｎｋ ＵＳＡ，ＶｉａＣｏｒｄ，Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ及びＣｒｙｏｃｅｌｌにて行われ得る。好ましくは、胎盤は臍帯血回収時に組織破壊を最小限にするため、更なる操作なしに重力で排出される。

典型的には、胎盤は、例えば、灌流又は組織解離による臍帯血回収及び幹細胞回収のために出産又は分娩室から別の場所、例えば、実験室へ輸送される。好ましくは、胎盤は、例えば、固定された近位臍帯を有する胎盤を滅菌チャック固定プラスチックバッグに入れ、次に、断熱容器に入れることにより、滅菌断熱輸送デバイス（胎盤の温度を２０〜２８℃に維持）にて輸送される。別の実施形態では、胎盤は、２００５年９月１９日に出願された係属中の米国特許出願第１１／２３０，７６０号に実質的に述べられている臍帯血回収キットにて輸送される。好ましくは、胎盤は分娩の４〜２４時間後に実験室へ送られる。一部の実施形態では、近位臍帯は臍帯血回収前に胎盤への挿入の好ましくは４〜５ｃｍ（センチメートル）以内にて固定される。他の実施形態では、近位臍帯は臍帯血回収後であるが胎盤の更なる処置前に固定される。

幹細胞回収前の胎盤は無菌条件下にて室温又は５〜２５℃（摂氏）の温度で保存され得る。胎盤は残留臍帯血を除去するために胎盤を灌流する前に４８時間超、好ましくは４〜２４時間保存され得る。好ましくは、胎盤は５〜２５℃（摂氏）の温度で抗凝固溶液中に保存される。好適な抗凝固溶液は当分野において周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウムの溶液が用いられ得る。好ましい実施形態では、抗凝固溶液はヘパリン溶液（例えば、１：１０００溶液中１％ ｗ／ｗ）を含む。好ましくは、放血された胎盤は胎盤幹細胞が回収される前にわずか３６時間保存される。

哺乳動物胎盤又はその一部は、ほぼ上記のように回収及び調製されると、幹細胞を得るため、当分野において公知の任意の方法にて処理され得、例えば、灌流又は破壊され、例えば、１つ又はそれ以上の組織破壊酵素で消化され得る。

（５．２．２ 胎盤灌流）
例えば、Hariri,米国出願公開第２００２／０１２３１４１号及び、２００６年１２月２８日に出願され、発明の名称が「Improved Composition for Collecting and Preserving Organs」である米国出願第１１／６４８，８１２号に哺乳動物胎盤を灌流する方法が開示されている。

灌流液は、上述の灌流溶液、例えば、食塩水、培地又は細胞回収組成物の胎盤血管系の通過によって得られ得る。一実施形態では、哺乳動物胎盤は灌流溶液の臍動脈及び臍静脈の一方又は両方の通過によって灌流される。胎盤中の灌流溶液のフローは、例えば、胎盤への重力フローを用いて達成され得る。好ましくは、灌流溶液はポンプ、例えば、蠕動ポンプを用いて胎盤中を通される。臍静脈は、例えば、滅菌チューブのような滅菌結合装置に結合されたカニューレ、例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）又はプラスチックカニューレでカニューレ処置され得る。該滅菌結合装置は灌流マニホールドに結合される。

灌流に備えて、胎盤は好ましくは臍動脈及び臍静脈が胎盤の最高点に位置するように方向付けられる（例えば、懸垂される）。胎盤は灌流液の胎盤血管系或いは胎盤血管系及び周囲組織の通過によって灌流され得る。一実施形態では、臍動脈及び臍静脈は、柔軟なコネクタを介して灌流溶液のリザーバに結合されたピペットに同時に結合される。灌流溶液は臍静脈及び動脈に通される。灌流溶液は血管壁から浸出し、且つ／或いは血管壁を通過して胎盤の周囲組織に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器内に回収される。灌流溶液は臍帯開口部を通じて導入され、母体の子宮壁と整合した胎盤壁における開口部から外部へ流出し、又は浸出することも許容され得る。別の実施形態では、灌流溶液は臍静脈中を通されて臍動脈から回収され、又は臍動脈中を通されて臍静脈から回収され、即ち、胎盤血管系（胎児組織）のみに通される。

一実施形態では、例えば、臍動脈及び臍静脈は、例えば、柔軟なコネクタを介して灌流溶液のリザーバに結合されたピペットに同時に結合される。灌流溶液は臍静脈及び動脈に通される。灌流溶液は血管壁から浸出し、且つ／或いは血管壁を通過して胎盤の周囲組織に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器内に回収される。灌流溶液は臍帯開口部を通じて導入され、母親の子宮壁と整合した胎盤壁における開口部から外部へ流出し、又は浸出することも許容され得る。通常、「汎」法（「pan」 method）と称され得るこの方法によって回収される胎盤細胞は、胎児及び母親細胞の混合物である。

別の実施形態では、灌流溶液は臍静脈中を通されて臍動脈から回収され、又は臍動脈中を通されて臍静脈から回収される。通常、「閉回路」法と称され得るこの方法によって回収される胎盤細胞は、ほぼ例外なく胎児性である。

閉回路灌流法は一実施形態において以下のように行われ得る。分娩後胎盤は分娩の約４８時間以内に得られる。臍帯は固定され、クランプの上方にて切断される。臍帯は廃棄され、或いは、例えば、臍帯幹細胞を回収し、及び／又は生体材料の生成のために臍帯膜を処理するために処理され得る。羊膜は灌流時に保持され得、又は、例えば、指による鈍的剥離を用いて絨毛膜から分離され得る。羊膜が灌流前に絨毛膜から分離される場合、羊膜は、例えば、廃棄され、或いは、例えば、酵素消化によって幹細胞を得て、又は、例えば、羊膜生体材料、例えば、米国出願公開第２００４／００４８７９６号（その開示内容は本明細書によって参照して本明細書に組み込まれる）に述べられている生体材料を生成するために処理され得る。例えば、滅菌ガーゼを用いて胎盤からすべての視認可能な凝血及び残留血液を除去した後、臍帯血管は、例えば、臍帯の断面を露出するために臍帯膜を部分的に切断することによって露出される。血管は識別され、例えば閉鎖アリゲータ・クランプを各血管の切断端を通して推し進めることによって開口される。次に、装置、例えば、灌流デバイス又は蠕動ポンプに結合されたプラスチックチューブが各胎盤動脈に挿入される。ポンプは目的に適した任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプでよい。次に、滅菌回収リザーバ、例えば、２５０ｍＬ回収バッグのような血液バッグに結合されたプラスチックチューブが胎盤静脈に挿入される。或いは、ポンプに結合されたチューブは胎盤静脈に挿入され、回収リザーバに結合されたチューブは胎盤動脈の一方又は両方に挿入される。次に、胎盤が灌流溶液のある量、例えば、灌流溶液約７５０ｍＬで灌流される。次に、灌流液中の細胞が、例えば、遠心分離によって回収される。

一実施形態では、近位臍帯は灌流時に固定され、より好ましくは、胎盤への臍帯の挿入の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内にて固定される。

一部の実施形態では、臍帯血は灌流前に（例えば、重力排出によって）胎盤から除去されるが、胎盤は残留血液を除去するために溶液で洗い流されない（例えば、灌流されない）。概して、そのような実施形態における哺乳動物胎盤からの灌流流体の最初の回収は、臍帯血及び／又は胎盤血の残留赤血球で着色される。灌流が進行し、残留臍帯血球が胎盤から流し去られるにつれ、灌流流体はより無色になる。概して、最初に残留臍帯血球を除去するために３０〜１００ｍＬの灌流流体が適切である。

他の実施形態では、臍帯血は灌流前に（例えば、重力排出によって）胎盤から除去され、胎盤は、胎盤幹細胞又は胎盤灌流液細胞を回収するための灌流前に残留血液を除去するために溶液で洗い流される（例えば、灌流される）。

胎盤を灌流するために用いられる灌流液体の量は、回収される胎盤細胞の数、胎盤のサイズ、単一胎盤からなされる回収の数などにより異なり得る。種々の実施形態において、灌流液体の量は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ，５０ｍＬ〜４０００ｍＬ，５０ｍＬ〜３０００ｍＬ，１００ｍＬ〜２０００ｍＬ，２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ，５００ｍＬ〜２０００ｍＬ又は７５０ｍＬ〜２０００ｍＬでよい。典型的には、胎盤は放血後に７００〜８００ｍＬの灌流液体で灌流される。

胎盤は数時間又は数日にわたって複数回灌流され得る。胎盤が複数回灌流される場合、胎盤は容器（container）又は他の好適な容器（vessel）内にて無菌条件下で維持又は培養され、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）の有無にかかわらず、且つ／或いは抗菌剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ））；抗生物質、例えば、ストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌにて）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌにて）、アンホテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／ｍｌにて）の有無にかかわらず、細胞回収組成物又は標準灌流溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）のような通常の食塩水で灌流され得る。一実施形態では、胎盤が灌流及び灌流液の回収前に１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３若しくは２４時間又は２若しくは３日間以上維持又は培養されるように、単離胎盤は灌流液を回収せずに一定時間維持又は培養される。灌流された胎盤は１又はそれ以上の追加時間、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４時間又はそれ以上の時間維持され、例えば、７００〜８００ｍＬ灌流流体でもう１回灌流され得る。胎盤は１，２，３，４，５又はそれ以上の回数、例えば、１，２，３，４，５又は６時間毎に１回灌流され得る。好ましい実施形態では、胎盤の灌流及び灌流溶液、例えば、幹細胞回収組成物の回収は、回収有核細胞数が１００細胞／ｍｌを下回るまで繰り返される。異なる時点における灌流液は、細胞、例えば、全有核細胞の時間依存的集団を回収するために更に個々に処理され得る。また、異なる時点に由来する灌流液はプールされ得る。

（５．２．３ 胎盤細胞回収組成物）
灌流液は、任意の生理学的に許容可能な溶液、例えば、食塩水、培地又はより複雑な細胞回収組成物による胎盤の灌流によって胎盤から回収され得る。細胞回収組成物は関連米国出願公開第２００７／０１９００４２号に詳細に述べられており、共にその全体を参照して本明細書に組み込まれる。

細胞回収組成物は幹細胞の回収及び／又は培養に好適な任意の生理学的に許容可能な溶液、例えば、食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水、クレブ溶液、改変クレブ溶液、イーグル溶液、０．９％ ＮａＣｌ等）、培地（例えば、ＤＭＥＭ，Ｈ．ＤＭＥＭ等）などを含み得る。

細胞回収組成物は、回収時から培養時まで胎盤細胞を保存する、即ち、胎盤細胞が死滅するのを阻止し、又は胎盤細胞の死滅を遅延させ、細胞集団における死滅する胎盤細胞の数を減少させるなどの傾向がある１つ又はそれ以上の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤又はＪＮＫ阻害剤）；血管拡張剤（例えば、マグネシウムスルファート、降圧剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン又はマグネシウムスルファート、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）；ネクローシス阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−Ｉｎｄｏｌ−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバマート又はクロナゼパム）；ＴＮＦ−α阻害剤；及び／又は酸素運搬パーフルオロカーボン（例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデシルブロミドなど）でよい。

細胞回収組成物は１つ又はそれ以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、リボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼなどを含み得る。そのような酵素には、限定されないが、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ，ＩＩ，ＩＩＩ又はＩＶ、クロストリジウム・ヒストリチクム（Clostridium histolyticum）由来コラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼなどが含まれる。

細胞回収組成物は殺菌的又は静菌的に有効量の抗生物質を含み得る。一部の非限定的実施形態では、抗生物質はマクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシム又はセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）又はキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン又はノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質はグラム陽性菌及び／又はグラム陰性菌、例えば、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）などに対して活性を示す。

細胞回収組成物は、以下の１つ又はそれ以上の化合物：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）；マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；２０，０００ダルトン超の分子量の高分子、一実施形態では内皮統合性及び細胞生存性を維持するのに十分な量にて存在（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ又は約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌにて存在する合成若しくは天然コロイド、デキストランのような多糖又はポリエチレングリコール）；酸化防止剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭにて存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣ又はビタミンＥ）；還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭにて存在するＮ−アセチルシステイン）；細胞へのカルシウム進入を防止する作用物質（例えば、約２μＭ〜約２５μＭにて存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）；抗凝固剤、一実施形態では残留血液の凝固を防止するのに役立つのに十分な量にて存在（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度にて存在するヘパリン又はヒルジン）；又はアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭにて存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド又はイソブチルアミロライド）も含み得る。

（５．２．４ 胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞）
胎盤灌流液は細胞の異質な回収を含む。通常、胎盤灌流液は使用前に赤血球を欠失している。そのような欠失は赤血球を有核血球から分離する公知の方法により行われ得る。ある実施形態では、灌流液又は灌流細胞は凍結保存される。一部の他の実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞は胎児細胞のみ又は胎児細胞と母親細胞との組合せを含む。

通常、単一胎盤灌流由来の胎盤灌流液は約１億〜約５億個の有核細胞を含む。一部の実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞はＣＤ３４^＋細胞、例えば、造血幹細胞若しくは前駆細胞又は内皮前駆細胞を含む。そのような細胞はより具体的な実施形態において、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻幹細胞若しくは前駆細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５^＋幹細胞若しくは前駆細胞、骨髄前駆細胞、リンパ前駆細胞及び／又は赤芽球前駆細胞を含み得る。他の実施形態では、胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は付着胎盤幹細胞、例えば、ＣＤ３４−幹細胞、例えば、上記「５．１ 胎盤灌流液を用いた処置方法」に述べられている細胞を含む。他の実施形態では、胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は、例えば、内皮前駆細胞、骨前駆細胞及びナチュラルキラー細胞を含む。一部の実施形態では、胎盤から回収され、且つ赤血球を欠失した胎盤灌流液又はそのような灌流液から単離された灌流液細胞は、例えば、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳ解析により定量されるように、約６〜７％ナチュラルキラー細胞（ＣＤ３⁻，ＣＤ５６^＋）；約２１〜２２％ Ｔ細胞（ＣＤ３^＋）；約６〜７％ Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋）；約１〜２％内皮前駆細胞（ＣＤ３４^＋，ＣＤ３１^＋）；約２〜３％神経前駆細胞（ネスチン^＋）；約２〜５％造血前駆細胞（ＣＤ３４^＋）；及び約０．５〜１．５％付着胎盤幹細胞（例えば、ＣＤ３４⁻，ＣＤ１１７⁻，ＣＤ１０５^＋及びＣＤ４４^＋）を含む。

ヒト胎盤灌流液中のＣＤ３４^＋幹細胞又は前駆細胞は、臍帯血から単離される同等数のＣＤ３４^＋細胞より検出可能に高いレベルの血管形成関連マーカー、例えば、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ及び／又はＣＸＣＲ４を発現する。一部の実施形態では、ＶＥＧＦと共にＥＮＤＯＣＵＬＴ（登録商標）培地（ＣＦＵ−Ｈｉｌｌコロニーの増殖のため；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において培養される、単一灌流に由来するヒト胎盤灌流液単核細胞は、最大約２０、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０個のＣＦＵ−Ｈｉｌｌコロニー（内皮細胞前駆細胞）を生成する。液体培養物中のＣＦＵ−Ｈｉｌｌコロニーの発達は、例えば、ＥＮＤＯＣＵＬＴ（登録商標）培地における７日間の培養にて、例えば、ヒト胎盤灌流液から得られる内皮前駆細胞によるジアセチル化低密度リポ蛋白質（Ｄｉｌ−ａｃＬＤＬ）の取込みを測定することによって実証及び評価され得る。

他の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ４４⁻である。一部の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ９^＋，ＣＤ５４^＋，ＣＤ９０^＋又はＣＤ１６６^＋である。一部の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ９^＋，ＣＤ５４^＋，ＣＤ９０^＋及びＣＤ１６６^＋である。一部の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３１^＋，ＣＤ１１７^＋，ＣＤ１３３^＋又はＣＤ２００^＋である。一部の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３１^＋，ＣＤ１１７^＋，ＣＤ１３３^＋及びＣＤ２００^＋である。

一実施形態では、ヒト胎盤灌流液細胞は培養されると血管又は血管様構造を生成する。ＨＰＰ細胞の血管形成は、例えば、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）及びマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の存在下、マトリクス、例えば、ＥＣＭＡＴＲＩＸ（商標）上での細胞、例えば、約５×１０^５個の細胞の培養によって実証され得る。血管及び血管様構造は約１８〜２４時間後に形成する。同じ条件下で培養される臍帯血単核細胞では有意な血管形成はみられない。血管形成は灌流液細胞をＶＥＧＦ（５０〜２００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−β（１〜５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍＬ）及び１つ以上のマトリクスメタロプロテアーゼ（各々１〜３Unit／ｍＬ）に接触させて培養することによってもみられ、例えば、前記ＶＥＧＦ，ＴＧＦ−β，ＦＧＦ及び１つ以上のマトリクスメタロプロテアーゼはマトリクス、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌに含まれる。

更に、ヒト胎盤灌流液由来のＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５^＋細胞より検出可能に高い血管形成マーカーＣＤ３１及び／又はＶＥＧＦＲの発現を有する。

通常、胎盤灌流液及び灌流液細胞は、臍帯血細胞と比べて低いＭＨＣクラスＩの発現を有し、ＭＨＣクラスＩＩマーカーに対して概して陰性である。

（５．２．５ 胎盤細胞の単離、選別及び特徴付け）
哺乳動物胎盤由来細胞、例えば、灌流液細胞又は灌流液由来幹細胞は、最初にフィコール勾配遠心分離により他の細胞から精製（即ち、単離）され得る。そのような遠心分離は遠心速度などの任意の標準プロトコルに従い得る。一実施形態では、例えば、胎盤から回収される細胞は室温で１５分間、５０００ｘｇでの遠心分離によって灌流液から回収され、これは細胞を、例えば、汚染細片及び血小板から分離する。別の実施形態では、胎盤灌流液は約２００ｍｌに濃縮され、フィコール上に穏やかに層状にされ、２２℃で２０分間、約１１００ｘｇにて遠心分離され、細胞の低密度界面層が更なる処理のために回収される。

細胞ペレットは上述の新鮮細胞回収組成物又は幹細胞維持に好適な培地、例えば、２Ｕ／ｍｌヘパリン及び２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社、ニューヨーク）を含むＩＭＤＭ血清非含有培地に再懸濁され得る。全単核細胞断片は、例えば、製造業者の推奨手順に従ってＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ社、ノルウェー・オスロ）を用いて単離され得る。

本明細書で用いられるように、胎盤細胞、例えば、幹細胞又は前駆細胞を胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞から「単離する」とは、細胞が無傷の哺乳動物胎盤において通常関連する細胞の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％を除去するということである。臓器由来の細胞が無傷臓器において通常関連する細胞の５０％未満を含む細胞集団に存在する場合、その細胞は「単離」される。

上述の灌流によって得られる胎盤細胞、例えば、付着胎盤幹細胞は、例えば、更に、又は最初に、例えば、０．２％ ＥＤＴＡを含む０．０５％トリプシン溶液（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）を用いて分別的トリプシン処理（differential trypsinization）によって単離され得る。通常、幹細胞が約５分以内にプラスチック面から単離するのに対し、胎盤灌流液中の他の付着細胞集団は通常２０〜３０分超のインキュベーションを必要とするため、付着胎盤幹細胞の分別的トリプシン処理（differential trypsinization）が可能である。分離した胎盤幹細胞は、例えば、Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＮＳ，Ｃａｍｂｒｅｘ社）を用いてトリプシン処理及びトリプシン中和後に回収され得る。付着細胞の単離の一実施形態では、例えば、約５〜１０×１０^６個の細胞のアリコートが複数のＴ７５フラスコ、好ましくはフィブロネクチン被覆Ｔ７５フラスコの各々に入れられる。そのような実施形態では、細胞は市販のＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ社）で培養され、組織培養インキュベータ（３７℃，５％ ＣＯ_２）に入れられ得る。１０〜１５日後、非付着細胞はＰＢＳで洗浄することによりフラスコから除去される。次に、ＰＢＳはＭＳＣＧＭに置き換えられる。好ましくは、フラスコは種々の付着細胞型の存在、特に線維芽細胞様細胞群の識別及び増殖について毎日検査される。

哺乳動物胎盤から回収される細胞の数及びタイプは、例えば、標準的細胞検出法、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的又は細胞マーカー特異的抗体による染色）蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気細胞単離（ＭＡＣＳ）を用いて形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学又は共焦点顕微鏡検査を用いた細胞の形態の検査により、且つ／或いは当分野において周知の技法、例えば、ＰＣＲ及び遺伝子発現プロファイリングを用いて遺伝子発現の変化を測定することによってモニタリングされ得る。これらの技法は１つ以上の特定のマーカーに対して陽性である細胞を特定するためにも用いられ得る。例えば、ＣＤ３４に対する抗体を用いて、上記技法を用いて細胞が検出可能な量のＣＤ３４を含むかどうかを判定することができる。そうであれば、その細胞はＣＤ３４^＋である。同様に、細胞がＲＴ−ＰＣＲによって検出可能な十分のＯＣＴ−４ ＲＮＡ又は成熟細胞より有意に多いＯＣＴ−４ ＲＮＡを生成する場合、その細胞はＯＣＴ−４^＋である。細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４のようなＣＤマーカー）及びＯＣＴ−４のような幹細胞特異的遺伝子の配列に対する抗体は当分野において周知である。

胎盤細胞、特に、フィコール分離、分別的付着（differential adherence）又はその両方の組合せによって単離された細胞は、蛍光標識細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて選別され得る。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光特性に基づく、細胞を含む粒子を分離するための周知の方法である（Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165）。個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起は小さな電荷を生じさせ、混合物からの正及び負の粒子の電磁分離を可能にする。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドは特徴のある蛍光標識で標識される。細胞はセルソーターを通じて処理され、使用抗体に結合する能力に基づいて細胞の単離を可能にする。ＦＡＣＳ選別粒子は、分離及びクローニングを容易にするために９６ウェル又は３８４ウェルプレートの個々のウェルに直接沈着され得る。

一選別スキームでは、胎盤由来幹細胞はＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４４，ＣＤ４５，ＣＤ７３，ＣＤ１０５，ＯＣＴ−４及び／又はＨＬＡ−Ｇマーカーの発現に基づいて選別される。これは、培養液中の付着特性に基づいて幹細胞を選択する手順に関連して達成され得る。例えば、付着選択ステム（adherence selection stem）はマーカー発現に基づいて選別前又は選別後に達成され得る。一実施形態では、例えば、細胞は最初にＣＤ３４の発現に基づいて選別される。ＣＤ３４⁻細胞は保持され、ＣＤ２００^＋ＨＬＡ−Ｇ^＋である細胞は他のすべてのＣＤ３４⁻細胞から分離される。別の実施形態では、胎盤由来細胞はＣＤ２００及び／又はＨＬＡ−Ｇマーカーの発現に基づく。例えば、これらのマーカーのいずれかを示す細胞は更なる使用のために単離される。例えば、ＣＤ２００及び／又はＨＬＡ−Ｇを発現する細胞は、具体的な実施形態では、ＣＤ７３及び／又はＣＤ１０５の発現、或いはＳＨ２，ＳＨ３又はＳＨ４抗体に認識されるエピトープ、或いはＣＤ３４，ＣＤ３８又はＣＤ４５の発現欠如に基づいて更に選別され得る。例えば、一実施形態では、胎盤細胞はＣＤ２００，ＨＬＡ−Ｇ，ＣＤ７３，ＣＤ１０５，ＣＤ３４，ＣＤ３８及びＣＤ４５の発現又は発現欠如により選別され、ＣＤ２００^＋，ＨＬＡ−Ｇ^＋，ＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋，ＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である胎盤細胞は、更なる使用のために他の胎盤細胞から単離される。

別の実施形態では、胎盤灌流液細胞はＣＤ３４^＋の発現及び１つ若しくはそれ以上の血管形成マーカー、例えば、ＣＸＣＲ４，ＶＥＧＦＲ及び／又はＣＤ３１の発現に基づいて選別される。

別の実施形態では、細胞を分離するために磁気ビーズが用いられ得る。細胞は、磁気ビーズ（直径０．５〜１００μｍ）に結合する能力に基づいて粒子を分離する方法である磁気細胞単離（ＭＡＣＳ）法を用いて選別され得る。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾が磁性ミクロスフェアに対して行われ得る。次に、ビーズは結合を許容するために細胞と混合される。次に、細胞は特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を分離するために磁界の中を通される。一実施形態では、次に、これらの細胞は単離され、更なる細胞表面マーカーに対する抗体に結合した磁気ビーズと再混合され得る。細胞は再度磁界の中を通され、両方の抗体に結合した細胞を単離する。次に、そのような細胞はクローン単離用のマイクロタイターディッシュのような別個の皿に希釈され得る。

また、胎盤細胞は細胞形態及び増殖特徴に基づいて特徴付けられ、且つ／或いは選別され得る。例えば、胎盤細胞、例えば、付着胎盤幹細胞は、例えば、培養液中の線維芽細胞様の外観を有し、且つ／或いはこれに基づいて選択されると特徴付けられ得る。また、胎盤細胞は胚様体様体部を形成する能力を有し、且つ／或いはこれに基づいて選択されると特徴付けられ得る。一実施形態では、例えば、線維芽細胞様形状であり、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現し、培養液中に１つ又はそれ以上の胚様体様体部を生成する胎盤細胞は、他の胎盤細胞から単離される。別の実施形態では、培養液中に１つ又はそれ以上の胚様体様体部を生成するＯＣＴ−４^＋胎盤細胞は他の胎盤細胞から単離される。

別の実施形態では、胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液又は灌流液細胞はコロニー形成単位アッセイにより識別され、特徴付けられ得る。コロニー形成単位アッセイは当分野において一般的に公知である。

胎盤灌流液又は灌流液細胞は、当分野において公知の標準的技法、例えば、トリパンブルー排除アッセイ、フルオレセインジアセタート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ（生存能を評価）；及びチミジン取込みアッセイ、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（増殖を評価）を用いて生存能、増殖可能性及び寿命について評価され得る。寿命は当分野において周知の方法により、例えば、拡大した培養物において倍加する集団の最大数を求めることにより判定され得る。

胎盤幹細胞は当分野において公知の他の技法、例えば、所望細胞の選択的増殖（正の選択）、不要細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば、ダイズ凝集素のように混合集団における細胞凝集性の差に基づく分離；凍結融解処置；濾過；従来のゾーン遠心分離法；遠心分離水簸（逆流遠心分離（counter-streaming centrifugation））；単位重力分離（unit gravity separation）；向流分配；電気泳動などを用いて他の胎盤細胞から分離され得る。

（５．３ 付着胎盤幹細胞）
付着胎盤幹細胞は、組織培養基質に付着し、且つ非胎盤細胞型に分化する能力を有する、胎盤又はその一部から得られる幹細胞である。付着胎盤幹細胞は起源が胎児又は母親であり得る（即ち、母親又は胎児の遺伝子型を有し得る）。付着胎盤幹細胞の集団若しくは胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、起源が専ら胎児若しくは母親である胎盤幹細胞を含み得、又は胎児及び母親起源の胎盤幹細胞の混合集団を含み得る。胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、下述の形態、マーカー及び培養特徴により特定及び選択され得る。本明細書で述べられる組成物及び方法において使用可能な付着胎盤幹細胞並びにそのような細胞を得て培養する方法は、米国特許第７，０４５，１４８号；第７，２５５，８７９号；第７，３１１，９０４号及び第７，３１１，９０５号；並びに米国出願公開第２００７／０２７５３６２号及び第２００８／００３２４０１号に詳細に述べられており、その開示内容はその全体を参照して本明細書により組み込まれる。

（５．３．１ 物理的及び形態的特徴）
本明細書で提供される組成物及び方法において使用可能な付着胎盤幹細胞は、初代培養又は細胞培養にて培養されると、組織培養基質、例えば、組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）に付着する。培養液中の付着胎盤幹細胞は概して線維芽細胞様の星状外観を呈し、多くの細胞質突起（cyotplasmic process）が細胞体中央部から伸長している。しかし、付着胎盤幹細胞は同じ条件下で培養される線維芽細胞と形態学的に識別可能である。それは、付着胎盤幹細胞が線維芽細胞より多数のそのような突起を示すためである。形態学的に、付着胎盤幹細胞は、培養時に概してより丸く、又は丸石様形態を呈する造血幹細胞とも識別可能である。

（５．３．２ 細胞表面、分子及び遺伝子マーカー）
単離付着胎盤幹細胞及び付着胎盤幹細胞集団は、幹細胞又は幹細胞を含む細胞集団を特定し、且つ／或いは単離するために用いられ得る複数のマーカーを発現する。付着胎盤幹細胞及び幹細胞集団（即ち、２個又はそれ以上の胎盤幹細胞）は、胎盤又はその任意の一部（例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤葉、臍帯など）から直接得られる幹細胞及び幹細胞含有細胞集団を含む。

一般的に、付着胎盤幹細胞はＣＤ７３，ＣＤ１０５，ＣＤ２００，ＨＬＡ−Ｇ及び／又はＯＣＴ−４マーカーを発現し、ＣＤ３４，ＣＤ３８又はＣＤ４５を発現しない。胎盤幹細胞はＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣ−１）及びＨＬＡ−ＤＲも発現し得る。

一実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はＣＤ２００^＋又はＨＬＡ−Ｇ^＋である。具体的な実施形態では、該幹細胞はＣＤ２００^＋及びＨＬＡ−Ｇ^＋である。具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ４５⁻，ＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００^＋又はＨＬＡ−Ｇ^＋幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下、該幹細胞を含む胎盤細胞集団における胚様体の形成を促進する。

別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋及びＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ４５⁻及びＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋及びＣＤ２００^＋であり、該幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下にて培養されると、該集団における１つ又はそれ以上の胚様体の形成を促進する。

別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はＣＤ２００^＋及びＯＣＴ−４^＋である。具体的な実施形態では、該幹細胞はＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ４５⁻，ＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋及びＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、該幹細胞は、該幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下にて培養されると、該集団による１つ又はそれ以上の胚様体の生成を促進する。

別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋及びＨＬＡ−Ｇ^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＯＣＴ−４^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻、ＣＤ４５⁻、ＯＣＴ−４^＋、及びＣＤ２００^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、前記幹細胞を含む胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下にて培養されると、該集団における胚様体の形成を促進する。

別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋であり、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下にて培養されると、前記集団における１つ又はそれ以上の胚様体の形成を促進する。具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＯＣＴ−４^＋である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＯＣＴ−４＋，ＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。

別の実施形態では、単離付着胎盤幹細胞はＯＣＴ−４^＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下にて培養されると、前記幹細胞を含む単離胎盤細胞集団における１つ又はそれ以上の胚様体の形成を促進する。具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ７３^＋及びＣＤ１０５^＋である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻又はＣＤ４５⁻である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ２００^＋である。より具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ７３^＋，ＣＤ１０５^＋，ＣＤ２００^＋，ＣＤ３４⁻，ＣＤ３８⁻及びＣＤ４５⁻である。

付着胎盤幹細胞は酵素消化又は灌流、例えば、上述の哺乳動物胎盤の灌流によって得られ得る。具体的な実施形態では、灌流溶液が臍静脈中を通されて臍動脈から回収され、又は臍動脈中を通されて臍静脈から回収される。付着胎盤幹細胞は実質的に専ら胎児起源であり得、即ち、例えば、集団における胎盤幹細胞の９０％、９５％，９９％又は９９．５％超が胎児起源である。付着胎盤幹細胞を得るための胎盤組織の酵素消化は、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号に述べられており、その開示内容はその全体を参照して本明細書に組み込まれる。

付着胎盤幹細胞は、他の実施形態において、骨髄由来間葉幹細胞と比べてより検出可能に高いレベルにて１つ又はそれ以上の遺伝子を発現し、該１つ又はそれ以上の遺伝子はＡＣＴＧ２，ＡＤＡＲＢ１，ＡＭＩＧＯ２，ＡＴＲＳ−１，Ｂ４ＧＡＬＴ６，ＢＣＨＥ，Ｃ１１ｏｒｆ９，ＣＤ２００，ＣＯＬ４Ａ１，ＣＯＬ４Ａ２，ＣＰＡ４，ＤＭＤ，ＤＳＣ３，ＤＳＧ２，ＥＬＯＶＬ２，Ｆ２ＲＬ１，ＦＬＪ１０７８１，ＧＡＴＡ６，ＧＰＲ１２６，ＧＰＲＣ５Ｂ，ＩＣＡＭ１，ＩＥＲ３，ＩＧＦＢＰ７，ＩＬ１Ａ，ＩＬ６，ＩＬ１８，ＫＲＴ１８，ＫＲＴ８，ＬＩＰＧ，ＬＲＡＰ，ＭＡＴＮ２，ＭＥＳＴ，ＮＦＥ２Ｌ３，ＮＵＡＫ１，ＰＣＤＨ７，ＰＤＬＩＭ３，ＰＪＰ２，ＲＴＮ１，ＳＥＲＰＩＮＢ９，ＳＴ３ＧＡＬ６，ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５，ＳＬＣ１２Ａ８，ＴＣＦ２１，ＴＧＦＢ２，ＶＴＮ，ＺＣ３Ｈ１２Ａ、又は前述の任意の組合せであり、該細胞は同等の条件下で増殖される。具体的な実施形態では、胎盤幹細胞特異的又は臍帯幹細胞特異的遺伝子はＣＤ２００である。

（５．４ 胎盤灌流液細胞の培養）
（５．４．１ 培地）
単離胎盤細胞、例えば、灌流液細胞又はそれから得られる細胞、例えば、胎盤幹細胞若しくは胎盤幹細胞集団又は胎盤幹細胞が生じる細胞若しくは胎盤組織は、細胞培養を開始し、又は細胞培養に播種するために用いられ得る。一般的に、細胞は細胞外マトリクス又はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン（例えば、天然又は変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞外膜蛋白質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ社、マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford））でコーティングされていない、又はコーティングされた滅菌組織培養容器に移される。

胎盤細胞は当分野において細胞、例えば、幹細胞の培養にとって許容可能であると認識されている任意の培地及び任意の条件下にて培養され得る。好ましくは、培地は血清を含む。胎盤灌流液細胞又は胎盤幹細胞は、例えば、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノール酸−ウシ血清アルブミン）、ブドウ糖、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−ＬＧ（ダルベッコ改変最小培地（Dulbecco's Modified Essential Medium）、低糖）／ＭＣＤＢ２０１（ニワトリ線維芽細胞基礎培地）；１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−ＨＧ（高糖）；１５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ；１０％ ＦＢＳ，１０％ウマ血清及びヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's modified Dulbecco's medium））；１０％ ＦＢＳ，ＥＧＦ及びヘパリンを含むＭ１９９；１０％ ＦＢＳ，ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）及びゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ（最小必須培地）；１０％ ＦＢＳ，ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）及びゲンタマイシンを含むＤＭＥＭなどにて培養され得る。好ましい培地は、２％ ＦＢＳ、ＩＴＳ、ＬＡ＋ＢＳＡ、ブドウ糖、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−ＬＧ／ＭＣＤＢ−２０１である。

胎盤細胞を培養するために用いられ得る他の培地には、ＤＭＥＭ（高糖又は低糖）、イーグル基礎培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉幹細胞増殖培地（Mesenchymal Stem Cell Growth Medium）（ＭＳＣＧＭ）、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培地、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ １６４０、アドバンストＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ社）及びＣＥＬＬ−ＧＲＯ ＦＲＥＥが含まれる。

培地は、例えば、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ））；βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つ又はそれ以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；並びに微生物汚染を制御する１つ又はそれ以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤、例えば、単独又は組合せでのペニシリンＧ、ストレプトマイシンスルファート、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン及びニスタチンを含む、１つ又はそれ以上の成分を補充され得る。

胎盤灌流液又は灌流液細胞は、標準的組織培養条件、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートにて培養され得る。また、胎盤灌流液又は灌流液細胞は懸滴法を用いて培養され得る。この方法では、胎盤幹細胞は約５ｍＬ培地において１ｍＬ当たり約１×１０^４個の細胞にて懸濁され、培地の１つ又はそれ以上の液滴が組織培養容器、例えば、１００ｍＬペトリ皿の蓋の内側に配置される。例えば、液滴は、例えば、マルチチャネルピペッタからの単一液滴又は多重液滴であり得る。その蓋は慎重に反転され、一定量の液体、例えば、皿の雰囲気における含水量を維持するのに十分な滅菌ＰＢＳを含む皿の底部の上部に配置され、幹細胞が培養される。

（５．４．２ 胎盤細胞の拡大及び増殖）
単離胎盤細胞、例えば、灌流液若しくは灌流液細胞若しくは幹細胞又はそのような細胞の単離集団（例えば、幹細胞又は幹細胞集団が通常インビボにて関連する胎盤細胞の少なくとも約５０％から分離される幹細胞又は幹細胞集団）は、インビトロにて増殖及び拡大され得る。例えば、胎盤細胞集団は、細胞が７０〜９０％コンフルエンスまで増殖するのに十分な時間、即ち、細胞及びそれらの子孫が組織培養容器の培養表面領域の７０〜９０％を占めるまで組織培養容器、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどにて培養され得る。

胎盤幹細胞は細胞増殖を可能にする密度にて培養容器に播種され得る。例えば、細胞は低密度（例えば、約１，０００〜約５，０００細胞／ｃｍ^２）から高密度（例えば、約５０，０００又はそれ以上の細胞／ｃｍ^２）までにて播種され得る。好ましい実施形態では、細胞は空気中約０〜約５体積パーセントＣＯ_２にて培養される。一部の好ましい実施形態では、細胞は空気中約２〜約２５パーセントＯ_２、好ましくは空気中約５〜２０パーセントＯ_２にて培養される。好ましくは、細胞は約２５℃〜約４０℃、好ましくは３７℃で培養される。好ましくは、細胞はインキュベータにて培養される。培地は、例えば、バイオリアクターを用いて静置又は攪拌され得る。好ましくは、胎盤幹細胞は低酸化ストレス下にて増殖される（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなどを加えて）。

７０〜９０％コンフルエンスが得られると、細胞は継代され得る。例えば、細胞は組織培養表面から分離するために当分野において周知の技法を用いて酵素処理、例えば、トリプシン処理され得る。ピペット採取によって細胞を除去し、細胞を計数した後、約２０，０００〜１００，０００個の幹細胞、好ましくは約５０，０００個の幹細胞が新鮮培地を含む新たな培養容器に継代される。通常、新たな培地は幹細胞が除去された培地と同じタイプである。本明細書で提供される方法及び組成物において有用な付着胎盤幹細胞は、少なくとも１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１２，１４，１６，１８又は２０回又はそれ以上継代されていてよい。

（５．４．３ 胎盤細胞集団）
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、付着胎盤幹細胞、ＣＤ３４^＋胎盤細胞（例えば、ＣＤ３４^＋胎盤内皮前駆細胞）、胎盤以外の供給源（例えば、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄など）由来のＣＤ３４^＋細胞、幹細胞ではない胎盤細胞又は胎盤細胞でない細胞が補充され得る。

単離胎盤細胞集団、例えば、灌流液又は胎盤灌流液細胞は、非幹細胞又は非胎盤細胞の１つ又はそれ以上の集団と組み合わせられ得る。例えば、胎盤細胞の単離集団は、血液（例えば、胎盤血又は臍帯血）、血液由来幹細胞（例えば、胎盤血又は臍帯血由来の幹細胞）、血液由来有核細胞集団、骨髄由来間葉細胞、骨由来幹細胞集団、粗骨髄（crude bone marrow）、成体（体性）幹細胞、組織内に含まれる幹細胞集団、培養幹細胞、完全に分化した細胞の集団（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞等）などと組み合わせられ得る。単離胎盤細胞集団における細胞は、各集団における全有核細胞の数を比較し、約１００，０００，０００：１，５０，０００，０００：１，２０，０００，０００：１，１０，０００，０００：１，５，０００，０００：１，２，０００，０００：１，１，０００，０００：１，５００，０００：１，２００，０００：１，１００，０００：１，５０，０００：１，２０，０００：１，１０，０００：１，５，０００：１，２，０００：１，１，０００：１，５００：１，２００：１，１００：１，５０：１，２０：１，１０：１，５：１，２：１，１：１；１：２；１：５；１：１０；１：１００；１：２００；１：５００；１：１，０００；１：２，０００；１：５，０００；１：１０，０００；１：２０，０００；１：５０，０００；１：１００，０００；１：５００，０００；１：１，０００，０００；１：２，０００，０００；１：５，０００，０００；１：１０，０００，０００；１：２０，０００，０００；１：５０，０００，０００；又は約１：１００，０００，０００の比率にて別のタイプの複数の細胞と組み合わせられ得る。単離胎盤細胞集団における細胞は、複数の細胞型の複数の細胞とも組み合わせられ得る。

１つでは、胎盤灌流液又は灌流液細胞の単離集団は複数のＣＤ３４^＋細胞と組み合わせられる。そのようなＣＤ３４^＋細胞は、例えば、未処理胎盤血、臍帯血又は末梢血内；胎盤血、臍帯血又は末梢血由来の全有核細胞内；胎盤血、臍帯血又は末梢血由来のＣＤ３４^＋細胞の単離集団内；未処理骨髄内；骨髄由来の全有核細胞内；骨髄由来のＣＤ３４^＋細胞の単離集団内などに含まれ得る。具体的な実施形態では、造血幹細胞はＣＤ３４^＋胎盤内皮前駆細胞である。

（５．５ 胎盤細胞バンクの作製）
胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は細胞バンクに保存され得る。好ましい実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞はヒト灌流液又は灌流液細胞である。灌流液又は灌流液細胞はユニット、例えば、単一胎盤又は単一胎盤の単一灌流から回収される全灌流液又は細胞にて保存され得る。複数の灌流又は複数の胎盤由来の灌流液又は灌流液細胞はユニットに組み合わせられ得る。

細胞、例えば、分娩後の胎盤由来の幹細胞、胎盤灌流液細胞又はその組合せは、胎盤幹細胞の一組のロット、例えば、一組の個々に投与される用量を生成するために多くの異なる方法にて培養され得る。そのようなロットは、例えば、胎盤灌流液又は酵素消化胎盤組織由来の幹細胞から得られ得る。複数の胎盤から得られる複数組のロットの胎盤細胞は、例えば、長期保存のために胎盤細胞バンクに構成され得る。一般的に、付着幹細胞は種培養を形成するために胎盤物質の初期培養から得られ、初期培養は約同数の倍加（doubling）由来の細胞集団を形成するために制御条件下にて拡大される。好ましくは、ロットは単一胎盤の組織から得られるが、複数の胎盤の組織から得られ得る。

一実施形態では、胎盤細胞ロットは以下のように得られる。胎盤灌流液細胞は、好ましくは、胎盤血管系のみを通しての１つ又はそれ以上の胎盤の灌流によって、好ましくは、残留血液を除去するために臍帯血を排出され、且つ灌流された胎盤から得られ、結果として生じる灌流液中の細胞は遠心分離によって回収され、赤血球が除去される。これらの細胞は回収され、都合の良い容量の培地に再懸濁され、初期継代細胞と定義付けられる。

次に、初期継代細胞は拡大培養に播種するために用いられる。拡大培養は別個の細胞培養装置、例えば、ＮＵＮＣ（商標）によるＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙの任意の構成でよい。初期継代培養における細胞は、例えば、１×１０^３，２×１０^３，３×１０^３，４×１０^３，５×１０^３，６×１０^３，７×１０^３，８×１０^３，９×１０^３，１×１０^４，１×１０^４，２×１０^４，３×１０^４，４×１０^４，５×１０^４，６×１０^４，７×１０^４，８×１０^４，９×１０^４又は１０×１０^４個の幹細胞で拡大培養に播種するため、任意の程度に細分され得る。好ましくは、各拡大培養に播種するために約２×１０^４〜約３×１０^４個の０代継代細胞が用いられる。拡大培養数は初期継代細胞数に依存し得、幹細胞が得られる特定の胎盤に依存して数が多く、又は少なくなり得る。

拡大培養は培養液中の細胞密度が一定値、例えば、約１×１０^５細胞／ｃｍ^２に達するまで増殖される。細胞はこの時点において回収されて凍結保存され、又は上述のように新たな拡大培養に継代され得る。細胞は使用前に、例えば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０回継代され得る。好ましくは、集団倍加の累積数の記録が拡大培養時に維持される。初期継代培養由来の細胞は、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８若しくは４０倍加又は最大６０倍加で拡大され得る。しかし、好ましくは、細胞集団を個々の用量に分割する前の集団倍加数は約１５〜約３０、好ましくは約２０倍加である。細胞は拡大プロセス全体にわたって継続的に培養され、又は拡大期間中の１又はそれ以上の時点において凍結され得る。

個々の用量に用いられる細胞は凍結され、例えば、後の使用のために凍結保存され得る。個々の用量は、例えば、約百万〜約一億の細胞／ｍｌを含み得、全部で約１０^６〜約１０^９個の細胞を含み得る。

従って、一実施形態では、ヒト分娩後胎盤由来の初代培養胎盤幹細胞を第一の複数の集団倍加に拡大するステップ；前記胎盤幹細胞を凍結保存してＭａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋを形成するステップ；Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ由来の複数の胎盤幹細胞を第二の複数の集団倍加に拡大するステップ；前記胎盤幹細胞を凍結保存してＷｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋを形成するステップ；Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ由来の複数の胎盤幹細胞を第三の複数の集団倍加に拡大するステップ；及び前記胎盤幹細胞を個々の用量に凍結保存するステップを含む方法によって胎盤幹細胞バンクを作製することができ、前記個々の用量は胎盤幹細胞バンクを集合的に構成する。具体的な一実施形態では、前記個々の用量は約１０^４〜約１０^５個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^５〜約１０^６個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^６〜約１０^７個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^７〜約１０^８個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^８〜約１０^９個の胎盤幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０^９〜約１０^１０個の胎盤幹細胞を含む。

好ましい実施形態では、胎盤が得られるドナー（例えば、母親）は少なくとも１つの病原体について試験される。母親が試験病原体に対して陽性反応を示す場合、胎盤由来のロット全体が廃棄される。そのような試験は、０継代細胞の樹立前後又は拡大培養時を含む、胎盤幹細胞ロットの作製時にいつでも行われ得る。その存在が試験される病原体には、限定されないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（Ｉ型及びＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどが含まれる。

（５．６ 胎盤細胞の保存）
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞並びに胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と付着胎盤幹細胞及び／又はＣＤ３４^＋胎盤細胞との組合せは保存され、即ち、長期保存を可能にする条件又は、例えば、アポトーシス若しくはネクローシスによる細胞死を阻害する条件下に置かれ得る。

発明の名称が「Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs,」である、関連する米国出願公開第２００７／０１９００４２号（その開示内容はその全体を参照して本明細書により組み込まれる）に述べられているように、細胞は、例えば、アポトーシス阻害剤、ネクローシス阻害剤及び／又は酸素運搬パーフルオロカーボンを含む組成物を用いて保存され得る。

一実施形態では、胎盤細胞集団は、前記細胞集団を、例えば、乳剤又は別の相におけるアポトーシス阻害剤及び酸素運搬パーフルオロカーボンを含む細胞回収組成物に接触させることによって保存され得、前記アポトーシス阻害剤はアポトーシス阻害剤と接触されない細胞集団と比べて、幹細胞集団におけるアポトーシスを低減又は防止するのに十分な量及び時間にて存在する。種々の実施形態において、前記アポトーシス阻害剤はカスパーゼ阻害剤又はＪＮＫ阻害剤である。別の実施形態では、細胞回収組成物は乳化剤、例えば、レシチンを更に含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは細胞を接触させる時点において約０℃〜約２５℃である。より具体的な別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは細胞を接触させる時点において約２℃〜１０℃又は約２℃〜約５℃である。より具体的な別の実施形態では、前記接触は前記細胞集団の輸送時に行われる。より具体的な別の実施形態では、前記接触は前記細胞集団の凍結及び融解時に行われる。アポトーシス阻害剤は臓器保存化合物、例えば、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、ＵＷ溶液（米国特許第４，７９８，８２４号に述べられている；ＶｉａＳｐａｎとしても公知；Southard et al, Transplantation 49(2):251-257 (1990) も参照されたい）若しくはStern et al., 米国特許第５，５５２，２６７号（その開示内容は参照して本明細書に組み込まれる）に述べられている溶液又はその組合せと組み合わせられ得る。

該方法の別の実施形態では、胎盤細胞は灌流時にアポトーシス阻害剤及び酸素運搬パーフルオロカーボン、臓器保存化合物或いはその組合せを含む細胞回収組成物に接触させられる。別の実施形態では、前記細胞は組織破壊プロセス、例えば、酵素消化時に接触させられる。別の実施形態では、胎盤細胞は灌流による回収後又は組織破壊、例えば、酵素消化による回収後に前記細胞回収化合物に接触させられる。

通常、胎盤細胞の回収、集積及び単離時に低酸素及び機械的負荷による細胞ストレスを最小限にし、又は排除することが好ましい。従って、該方法の別の実施形態では、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤幹細胞又は幹細胞集団は、前記保存時に６時間未満、回収、集積又は単離時に低酸素状態に晒され、低酸素状態は通常以下の血中酸素濃度である酸素濃度である。より具体的な実施形態では、前記細胞集団は前記保存時に２時間未満、前記低酸素状態に晒される。より具体的な別の実施形態では、前記細胞集団は回収、集積又は単離時に１時間未満若しくは３０分未満、前記低酸素状態に晒され、又は低酸素状態に晒されない。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は回収、集積又は単離時に剪断応力に晒されない。

胎盤灌流液及び灌流液細胞は小さい容器、例えば、アンプル内の、例えば、凍結保存培地に凍結保存され得る。好適な凍結保存培地には、限定されないが、例えば、増殖培地又は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５，Ｃ２６３９若しくはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ社）を含む培地が含まれる。好ましくは、凍結保存培地は、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）の濃度でのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む。凍結保存培地は更なる作用物質、例えば、メチルセルロース及び／又はグリセロールを含み得る。好ましくは、胎盤細胞は凍結保存時に約１℃／分にて冷却される。好ましい凍結保存温度は約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存細胞は使用のために融解前に液体窒素に移され得る。一部の実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に達すると、アンプルは液体窒素保存領域に移される。好ましくは、凍結保存細胞は約２５℃〜約４０℃の温度に、好ましくは約３７℃の温度まで融解される。

（５．７ 胎盤細胞の使用）
（５．７．１ 胎盤細胞集団）
本明細書で提供されるのは、心臓又は血管疾患、障害若しくは不全を有する患者を処置する方法であり、該方法は、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞及びそのような細胞の他の細胞、例えば、内皮前駆細胞、造血幹細胞若しくは臍帯血との組合せを含む胎盤細胞集団を、前記患者に投与するステップを含む。本明細書で用いられるように、「処置する」は、心臓又は血管疾患、障害、病状若しくは不全又はその任意のパラメータ若しくは症状の治癒、修復、改善、重症度の軽減又は経時変化の低下を包含する。種々の実施形態において、前記疾患、障害、病状又は不全は末梢血管疾患、急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である。

胎盤灌流液細胞及び胎盤灌流液細胞集団或いはそれらから得られる幹細胞は、幹細胞又は幹細胞から分化した細胞を必要とする患者への投与に備え、エクスビボ又はインビボにて特定の細胞型に分化するように誘導され得る。例えば、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、インビボでの臓器新生及び損傷の修復のために損傷臓器に注入され得る。そのような損傷は、例えば、動脈又は静脈閉塞、梗塞、虚血などによって引き起こされ得る。

胎盤灌流液及び灌流液細胞は、幹細胞を分化させる条件下にて培養されずに投与され得る。或いは、灌流液又は灌流液細胞は投与前に、例えば、約１〜２０日間、例えば、血管形成又は血管培地にて培養され得る。一部の実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞は単離されてマトリクス上に播種され、次に、例えば、約１〜２０日間、血管形成又は血管培地にて培養され得る。別の実施形態では、胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば、約１〜２０日間、例えば、血管形成又は血管培地にて培養され、次に、マトリクス上に播種され、次に、例えば、約１〜２０日間、本明細書で述べられる骨形成培地にて培養され得る。

単独での、又は幹細胞若しくは前駆細胞集団、例えば、胎盤幹細胞と組み合わせた胎盤灌流液又は灌流液細胞は、インビトロ又はインビボでの組織又は臓器の作製に用いられ得る。胎盤から得られる細胞、例えば、灌流液、灌流液細胞、胎盤幹細胞又は前駆細胞は、マトリクスに播種し、その後、細胞を分化させてマトリクスに集合させ、又はこれを許容する条件下にて培養するために用いられ得る。本明細書で提供される方法によって得られる組織及び臓器は、研究及び治療目的を含む様々な目的に用いられ得る。

別の実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、マッチ又はミスマッチＨＬＡ型造血細胞移植を含む自己移植及び同種移植に用いられる。胎盤灌流液及び／又は灌流液細胞の同種造血細胞移植としての使用の一実施形態では、宿主はドナー細胞の免疫学的拒絶を低減し、又は免疫寛容を生じさせるために処置される（例えば、米国特許第５，８００，５３９号及び第５，８０６，５２９号を参照されたい）。別の実施形態では、宿主は免疫学的拒絶を低減し、又は免疫寛容を生じさせるために処置されない。

単独での、又は１つ若しくはそれ以上の他の幹細胞集団と組み合わせた胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、粘膜組織、性腺又は毛髪の幹細胞又は前駆細胞を増強し、又は置き換えるために治療移植プロトコルにて用いられ得る。加えて、胎盤灌流液又は灌流液細胞は、典型的には前駆細胞が用いられ得る治療又は研究プロトコルにおいて特定のクラスの前駆細胞（例えば、軟骨細胞、肝細胞、造血細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞、筋肉前駆細胞）の代わりに用いられ得る。

胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば、外傷、代謝障害又は疾患から生じる組織及び臓器への損傷を修復するために用いられ得る。そのような実施形態では、疾患の結果として損傷した組織又は臓器を再生し、又は回復させるために、患者は単独で、又は他の幹細胞若しくは前駆細胞集団と組み合わせられた胎盤灌流液又は灌流液細胞を投与され得る。

（５．７．２ 胎盤灌流液又は灌流液細胞を含む組成物）
本明細書で提供されるのは、胎盤灌流液若しくは灌流液細胞又はこれらに由来する生体分子を含み、或いはこれに由来する組成物である。胎盤灌流液又は灌流液細胞は、例えば、研究又は治療学に用いる任意の生理的に許容可能又は医学的に許容可能な化合物、組成物又はデバイスと組み合わせられ得る。

（５．７．２．１ 凍結保存胎盤灌流液又は灌流液細胞）
本明細書で述べられる胎盤灌流液又は灌流液細胞は保存され、例えば、後の使用のために凍結保存され得る。幹細胞のような細胞の凍結保存の方法は当分野において周知である。胎盤幹細胞集団は患者に容易に投与され得る形態にて調製され得る。例えば、本明細書で提供されるのは、医学的用途に適した容器内に含まれる胎盤幹細胞集団である。そのような容器は、例えば、胎盤幹細胞集団が容易に分配され得る滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、ジャー又は他の容器でよい。例えば、容器は血液バッグ又はレシピエントへの液体の静脈内投与に適した他のプラスチック製の医学的に許容可能なバッグでよい。好ましくは、容器は組み合わせた幹細胞集団の凍結保存を可能にする容器である。

凍結保存胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、単一のドナー又は複数のドナー由来の胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を含み得る。胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、対象レシピエントに対して完全にＨＬＡマッチ又は部分的若しくは完全にＨＬＡミスマッチであり得る。

従って、一実施形態では、本明細書で提供されるのは容器内の胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を含む組成物である。具体的な実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は凍結保存される。別の具体的な実施形態では、容器はバッグ、フラスコ又はジャーである。より具体的な実施形態では、前記バッグは滅菌プラスチックバッグである。より具体的な実施形態では、前記バッグは前記胎盤幹細胞集団の静脈内投与に好適であり、これを可能にし、又は容易にする。該バッグは、投与前又は投与時に胎盤幹細胞と１つ又はそれ以上の他の溶液、例えば、薬剤との混合を可能にするために互いに連結した複数の管腔又はコンパートメントを含み得る。別の具体的な実施形態では、該組成物は、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞の凍結保存を容易にする１つ又はそれ以上の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は生理的に許容可能な水性溶液中に含まれる。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容可能な水性溶液は０．９％ ＮａＣｌ溶液である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞のレシピエントにＨＬＡマッチした胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞のレシピエントに少なくとも部分的にＨＬＡミスマッチした胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は複数のドナーに由来する。

（５．７．２．２ 医薬組成物）
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞はインビボでの使用のために医薬組成物に製剤化され得る。そのような医薬組成物は、インビボ投与のために医薬的に許容可能な担体、例えば、食塩水又は他の許容される生理的に許容可能な溶液中の胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を含む。本明細書で提供される医薬組成物は胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞の任意の実施形態を含み得る。医薬組成物は胎児、母親或いは胎児及び母親胎盤細胞を含み得る。本明細書で提供される医薬組成物は、単一の患者若しくは胎盤又は複数の患者若しくは胎盤から得られる胎盤細胞を更に含み得る。

本明細書で提供される医薬組成物は任意の数の胎盤細胞を含み得る。例えば、胎盤細胞、例えば、灌流液細胞の単一単位用量は、種々の実施形態において、約、少なくとも又はわずか１×１０^５，５×１０^５，１×１０^６，５×１０^６，１×１０^７，５×１０^７，１×１０^８，５×１０^８，１×１０^９，５×１０^９，１×１０^１０，５×１０^１０，１×１０^１１又はそれ以上の胎盤細胞を含み得る。

細胞は、例えば、生理的に許容可能な溶液、例えば、食塩水、例えば、リン酸緩衝食塩水、０．９％ ＮａＣｌ溶液などにて投与され得る。

本明細書で提供される医薬組成物は、５０％生細胞又はそれ以上（即ち、少なくとも約５０％の集団内の細胞が機能しており、又は生存している）を含む細胞、例えば、胎盤灌流液細胞の集団を含み得る。好ましくは、少なくとも約６０％の集団内の細胞が生存可能である。より好ましくは、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の医薬組成物中の集団内の細胞が生存可能である。

本明細書で提供される医薬組成物は、例えば、生着を促進する１つ又はそれ以上の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）；安定剤、例えば、アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプンなどを含み得る。

本明細書で提供される細胞の集団は外科的に移植され、注入され、送達され（例えば、カテーテル又はシリンジを通じて）、或いは、例えば、修復又は増強を必要とする部位にて患者に直接又は間接的に投与され得る。本明細書で提供される細胞の集団又は組成物、例えば、医薬組成物は、経口、鼻腔、動脈内、非経口、静脈内、眼部、筋肉内、皮下、腹腔内、脳内、心室内、脳室内、くも膜下腔内、嚢内、脊髄内及び／又は脊髄周囲投与され得る。

（５．７．２．３ 胎盤細胞馴化培地）
例えば、付着胎盤幹細胞を伴う胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、ＣＤ３４^＋胎盤細胞又はそれらの組合せは、馴化培地、即ち、灌流液又は細胞によって分泌又は排出される１つ又はそれ以上の生体分子を含む培地を作製するために用いられ得る。種々の実施形態において、馴化培地は胎盤細胞が少なくとも１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４日間又はそれ以上の日数、増殖した培地を含む。他の実施形態では、馴化培地は胎盤細胞が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％コンフルエンス又は最大１００％コンフルエンスまで増殖した培地を含む。そのような馴化培地は、胎盤細胞又は別の種類の細胞、例えば、幹細胞の別個の集団の培養を支持するために用いられ得る。別の実施形態では、馴化培地は胎盤幹細胞が成熟細胞型に分化させられた培地を含む。別の実施形態では、馴化培地は胎盤灌流液細胞及び非胎盤幹細胞が培養された培地を含む。

（５．７．２．４ 胎盤細胞を含むマトリクス）
本明細書で更に提供されるのは、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞を含むマトリクス、ヒドロゲル、足場などである。

胎盤細胞、例えば、灌流液又は灌流液細胞は、天然マトリクス、例えば、羊膜材料のような胎盤生体材料上に播種され得る。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から直接切開された羊膜；固定又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥した（即ち、＜２０％ Ｈ_２Ｏ）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜などであり得る。胎盤細胞が播種され得る好ましい胎盤生体材料は、Hariri, 米国出願公開第２００４／００４８７９６号に述べられている。

胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、例えば、注射に適したヒドロゲル溶液中に懸濁され得る。そのような組成物に好適なヒドロゲルにはＲＡＤ１６のような自己集合性ペプチドが含まれる。一実施形態では、細胞を含むヒドロゲル溶液は、移植のために分散された細胞を有するマトリクスを形成するために、例えば、鋳型において硬化することを許容され得る。また、そのようなマトリクスにおける胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、移植前に細胞が有糸分裂的に増殖されるように培養され得る。ヒドロゲルは、例えば、ゲルを形成するために水分子を補足する三次元開口格子構造を形成するために共有、イオン又は水素結合を介して架橋した有機高分子（天然又は合成）である。ヒドロゲル形成材料には、イオンで架橋した多糖、例えば、アルギナート及びその塩、ペプチド、ポリホスファジン（polyphosphazine）及びポリアクリラート或いは、それぞれ温度又はｐＨによって架橋したポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体のようなブロック重合体が含まれる。一部の実施形態では、ヒドロゲル又はマトリクスは生分解性である。

一部の実施形態では、製剤はｉｎ ｓｉｔｕにて重合可能なゲルを含む（例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号; Anseth et al., J. Control Release, 78(l-3):199-209 (2002); Wang et al, Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003) を参照されたい。

一部の実施形態では、重合体は荷電側基又はその一価イオン性塩を有する水性溶液、例えば、水、緩衝食塩溶液若しくは水性アルコール溶液に少なくとも部分的に可溶性である。陽イオンと反応され得る酸性側基を有する重合体の例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸との共重合体、ポリ（ビニルアセタート）及びスルホン化ポリスチレンのようなスルホン化重合体である。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテル単量体又は重合体との反応によって形成される酸性側基を有する共重合体も用いられ得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノールＯＨ基及び酸性ＯＨ基である。

胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は三次元フレームワーク又は足場上に播種され、インビボにて移植され得る。そのようなフレームワークは、組織形成を刺激し、或いは本明細書で提供される方法の実施を増強又は向上させる任意の１つ又はそれ以上の増殖因子、細胞、薬剤又は他の成分と組み合わせて移植され得る。

本明細書で提供される方法において用いられ得る足場の例には、不織マット、多孔質発泡体又は自己集合性ペプチドが含まれる。不織マットはグリコール酸と乳酸との合成吸収性共重合体から構成される繊維（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ，Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州サマービル（Somerville））を用いて形成され得る。凍結乾燥（freeze-drying）又は凍結乾燥（lyophilization）（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号を参照されたい）のようなプロセスによって形成される、例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）共重合体から構成される発泡体も足場として用いられ得る。

また、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、リン酸一、リン酸二、リン酸三、α−リン酸三、β−リン酸三及びリン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、カルシウムスルファート、カルシウムフルオライド、カルシウムオキシド、カルシウムカーボナート、マグネシウムカルシウムホスファート、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）のような生物活性ガラス及びその混合物を含むがこれらに限定されない、生理的に許容可能なセラミック材料上に播種され、又はこれと接触させられ得る。現在市販されている多孔質生体適合性セラミック材料には、ＳＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ Ｃｏｒｐ．、カナダ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ Ｆｒａｎｃｅ、フランス）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ，ＡＧ、スイスＢｅｔｔｌａｃｈ）及びミネラル化コラーゲン骨移植製品、例えば、ＨＥＡＬＯＳ（商標）（ＤｅＰｕｙ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｒａｙｎｈａｍ）及びＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（商標）並びにＣＯＲＴＯＳＳ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ社、ペンシルベニア州Ｍａｌｖｅｒｎ）が含まれる。フレームワークは天然及び／又は合成材料の混合物（mixture）、混合物（blend）又は合成物でよい。

別の実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、例えば、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ，ＰＬＡ，ＰＣＬ共重合体若しくは混合物（blend）又はヒアルロン酸から作製されるマルチフィラメント糸から構成され得るフェルト上に播種され、又はこれと接触させられ得る。

胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、別の実施形態では、合成構造であり得る発泡体足場上に播種され得る。そのような発泡体足場は、修復、置換又は増強される身体における特定の構造の一部のような有用な形状に成形され得る。一部の実施形態では、フレームワークは細胞付着を増進するため、胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液細胞の接種前に、例えば、０．１Ｍ酢酸で処理され、次に、ポリリジン、ＰＢＳ及び／又はコラーゲン中でインキュベートされる。マトリクスの外面は、例えば、マトリクスのプラズマコーティング或いは１つ又はそれ以上の蛋白質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖蛋白質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリンスルファート、コンドロイチン−４−スルファート、コンドロイチン−６−スルファート、デルマタンスルファート、ケラチンスルファートなど）、細胞マトリクス及び／又は他の材料、例えば、限定されないが、ゼラチン、アルギナート、寒天、アガロース及び植物ゴムなどの付加により、細胞の付着若しくは増殖及び組織の分化を向上させるために改変され得る。

一部の実施形態では、足場は非血栓形成性にさせる材料を含み、又はこれで処理される。また、これらの処理及び材料は内皮増殖、移動及び細胞外マトリクス沈着を促進し、維持し得る。これらの処理及び材料の例には、限定されないが、天然材料、例えば、基底膜蛋白質、例えば、ラミニン及びＩＶ型コラーゲン、合成材料、例えば、ＥＰＴＦＥ及びセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、ＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バークレー）が含まれる。足場はヘパリンのような抗血栓剤も含み得る。また、足場は胎盤灌流液又は灌流液細胞による播種前に表面電荷を変えるために処置され得る（例えば、プラズマによるコーティング）。

一実施形態では、胎盤幹細胞は約０．５×１０^６〜約８×１０^６細胞／ｍＬにて好適な足場上に播種され、又はこれと接触させられる。

（５．７．３ 不死化胎盤細胞株）
哺乳動物胎盤細胞は、増殖促進蛋白質の生成及び／又は活性が外部因子によって調節可能であるように、増殖促進遺伝子、即ち、適切な条件下でトランスフェクトされた細胞の増殖を促進する蛋白質をコードする遺伝子を含む、任意の好適なベクターによるトランスフェクションによって条件的に不死化され得る。好ましい実施形態では、増殖促進遺伝子は、限定されないが、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ポリオーマラージＴ抗原、Ｅ１ａアデノウイルス又はヒトパピローマウイルスのＥ７蛋白質のような癌遺伝子である。

増殖促進蛋白質の外部調節は、増殖促進遺伝子を外部調節可能なプロモーター、例えば、その活性が、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度又は細胞と接触する培地の組成を改変することによって制御され得るプロモーターの制御下に置くことによって達成され得る。一実施形態では、テトラサイクリン（ｔｅｔ）制御遺伝子発現系が用いられ得る（Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1518-1523, 1996を参照されたい）。ｔｅｔの非存在下、このベクター内のｔｅｔ制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）は、ｔｅｔオペレーター配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるｐｈ_{ＣＭＶ＊−１}からの転写を強く活性化する。ｔＴＡは、大腸菌（Escherichia coli）のトランスポゾン１０由来ｔｅｔ抵抗性オペロンのリプレッサー（ｔｅｔＲ）の融合蛋白質及び単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６の酸性ドメインである。ｔｅｔの低非毒性濃度（例えば、０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）はｔＴＡによるトランス活性化をほぼ完全に消失させる。

一実施形態では、ベクターは選択可能なマーカー、例えば、薬剤耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝子を更に含む。細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ^Ｒ）は、本発明の方法の範囲内に用いられ得るそのようなマーカーの１つである。ｎｅｏ^Ｒを保持する細胞は、例えば、１００〜２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８の増殖培地への付加のような当業者には公知の手段によって選択され得る。

トランスフェクションは、レトロウイルス感染を含むがこれに限定されない、当業者には公知の任意の様々な手段によって達成され得る。一般的に、細胞培養物は、ベクターの産生細胞株から回収される馴化培地とＮ２補充を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２との混合物によるインキュベーションによってトランスフェクトされ得る。例えば、上述のように調製された胎盤細胞培養物は１容積の馴化培地及び２容積のＮ２補充を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２において約２０時間のインキュベーションにより、例えば、５日間後にインビトロにて感染され得る。次に、選択可能なマーカーを保持するトランスフェクトされた細胞が上述のように選択され得る。

トランスフェクション後、培養物は増殖を可能にし、例えば、細胞の少なくとも約３０％が２４時間にて倍加することを可能にする表面上に継代される。好ましくは、基質は、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）及び／又はラミニン（１０μｇ／ｍＬ）をコーティングされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基質、ポリリジン／ラミニン基質或いはフィブロネクチンで処理された表面である。次に、培養物は、１つ又はそれ以上の増殖増強因子を補充され得、又は補充され得ない増殖培地を３〜４日毎に付与される。培養物が５０％未満コンフルエンスである場合、増殖増強因子が増殖培地に加えられ得る。

条件的に不死化された胎盤幹細胞株は、８０〜９５％コンフルエントの場合、例えば、トリプシン処理による標準的な技法を用いて継代され得る。一部の実施形態では、最大で約第２０継代まで選択を維持することは有益である（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞に対するＧ４１８の付加により）。細胞は長期保存のために液体窒素において凍結されてもよい。

上述のように調製された、条件的に不死化されたヒト胎盤幹細胞株からクローン細胞株が単離され得る。一般的に、そのようなクローン細胞株は、例えば、限界希釈法による標準的な技法を用いて、又はクローニングリング（cloning ring）を用いて単離され、拡大され得る。一般的に、クローン細胞株は上述のように供給及び継代され得る。

一般的に、クローンであってよく、しかしクローンである必要はない条件的に不死化されたヒト胎盤幹細胞株は、分化を促進する培養条件下にて増殖促進蛋白質の生成及び／又は活性を抑制することによって分化するように誘導され得る。例えば、増殖促進蛋白質をコードする遺伝子が外部調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば、温度又は培地の組成は増殖促進遺伝子の転写を抑制するように変更され得る。上述のテトラサイクリン制御遺伝子発現系では、分化は増殖促進遺伝子の転写を抑制するためにテトラサイクリンの付加によって達成され得る。一般的に、分化を開始するために４〜５日間の１μｇ／ｍＬテトラサイクリンで十分である。更なる分化を促進するため、増殖培地に更なる作用物質が含まれ得る。

（５．７．４ アッセイ）
胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は、幹細胞増殖、拡大及び／又は分化に対する培養条件、環境要因、分子（例えば、生体分子、無機低分子等）などの影響を、そのような条件に晒されない胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞と比べて判定するために、アッセイにて用いられ得る。

好ましい実施形態では、胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞は分子との接触時の増殖、拡大又は分化の変化についてアッセイされる。例えば、アルカリホスファターゼ活性及び／又はカルシウムミネラル化をモニタリングすることによって骨形成分化がアッセイされ得る。

一実施形態では、例えば、本明細書で提供されるのは胎盤灌流液細胞の増殖を調節する化合物を同定する方法であり、該方法は増殖を可能にする条件下にて前記灌流液細胞を前記化合物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない複数の前記細胞と比べて前記細胞の増殖の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤灌流液細胞の増殖を調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物は増殖のインヒビターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は増殖のエンハンサーとして同定される。

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは複数の胎盤細胞の拡大を調節する化合物を同定する方法であり、該方法は拡大を可能にする条件下にて胎盤灌流液細胞を前記化合物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない複数の細胞と比べて前記細胞の拡大の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤細胞の拡大を調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物は拡大のインヒビターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は拡大のエンハンサーとして同定される。

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液細胞の分化を調節する化合物を同定する方法であり、該方法は分化を可能にする条件下にて前記細胞を前記化合物に接触させるステップを含み、前記化合物が前記化合物に接触されない細胞と比べて前記幹細胞の分化の検出可能な変化を引き起こす場合、前記化合物は胎盤細胞の増殖を調節する化合物として同定される。具体的な実施形態では、前記化合物は分化のインヒビターとして同定される。別の具体的な実施形態では、前記化合物は分化のエンハンサーとして同定される。

（６ 実施例）
以下の実施例は例示のために示されるものであって、決して限定するものであると理解してはならない。特許文献、非特許文献又はその他の文献であろうと、本明細書で引用されるすべての文献はあらゆることを目的として参照して本明細書により組み込まれる。

（６．１ 胎盤灌流液細胞からの血管形成細胞の生成）
「５．２ 胎盤灌流液及び灌流液細胞を得る方法」に上述されたように得られた胎盤灌流液から赤血球を消失させ、様々な単核細胞型のパーセントを求めるために分析した。表１は同定された細胞型を詳述している。

別の実験では、ヒト胎盤灌流液由来のＣＤ３４^＋胎盤細胞がＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻細胞の亜集団を含み、当該亜集団は、一定数の有核細胞において、臍帯血より高いパーセントで存在することが明らかとなった。図１を参照されたい。

別の実験では、血管形成関連マーカーＣＤ３１、ＣＸＣＲ４及びＶＥＧＦＲを発現する細胞のパーセントを求めるため、ヒト胎盤灌流液由来のＣＤ３４^＋細胞をフローサイトメトリーにより分析した。臍帯血由来ＣＤ３４^＋細胞より高いパーセントのＨＰＰ由来ＣＤ３４^＋細胞が、これらのマーカーを発現した。図２を参照されたい。

別の実験では、胎盤ＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻細胞における遺伝子発現を分析するために定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いた。ＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻及びＣＤ３４^＋，ＣＤ４５^＋細胞集団をＦＡＣＳ ＡＲＩＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により同じヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）から単離し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＦＡＳＴ ７９００ＨＴ機器及びプライマー／プローブを用いてＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ３１及びＶＥＧＦＲ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析のためのＲＮＡ調製に供した。図３に示すように、ＣＤ３１及びＶＥＧＦＲ発現はＣＤ３４^＋ＣＤ４５^＋細胞よりＨＰＰ ＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞のほうが高い。これらのデータは、ＨＰＰ ＣＤ３４^＋細胞が血管形成的であり、加えて、血管形成活性がＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻集団においてより高いということを示唆した。

内皮細胞の前駆体を同定するＣＦＵ−Ｈｉｌｌコロニーアッセイを用いて、ＨＰＰ細胞の血管形成活性を求めた。上記実施例６．３に従って回収したヒト胎盤灌流液由来の単核細胞を約２週間、ＥＮＤＯＣＵＬＴ（登録商標）培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にて培養した。次に、ＣＦＵ−Ｈｉｌｌコロニーを明らかにするためにギル改変（Gill’s Modified）ヘマトキシリン染色法で細胞培養物を染色した。アッセイにおいて５体の別個のドナー由来の１０^６個の灌流液細胞当たり、それぞれ０，１９，７，１１及び６つのＣＦＵ−Ｈｉｌｌコロニーを確認した。図４を参照されたい。別のアッセイにより、ＥＮＤＯＣＵＬＴ（登録商標）培地における培養の第７日目にヒト胎盤灌流液由来の内皮前駆細胞によるＤｉｌ−ａｃＬＤＬ（ジアセチル低比重リポ蛋白）の取込みを確認した。

ヒト胎盤灌流液細胞も培養液中で血管を発達させることが示された。細胞がＴＧＦ−β、ＦＧＦ、プラスミノーゲン、ｔＰＡ及びマトリクスメタロプロテアーゼの存在下にて培養されるＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社 カタログ番号ＥＣＭ６２５）を用いて、９６ウェルプレートの１ウェル当たり約１０^６個の細胞にてＥＣＭＡＴＲＩＸ（商標）上で上記実施例６．３に従って得られたヒト胎盤灌流液細胞を１８〜２４時間培養した。細胞は２４時間後に視認可能な血管構造を形成した。図５を参照されたい。本質的に同じ条件下にて臍帯血細胞培養物において有意な管形成を認めなかった。

（６．２ 胎盤灌流液細胞を用いたインビボ血管形成）
本実施例は、骨組織の形成に示されるように、ヒト胎盤灌流液細胞が齧歯類モデルに投与されると、血管系の形成を引き起こすことを実証する。

骨治癒には血管形成／血管新生が必要である。例えば、Matsumoto et al., Amer. J. Pathology 169: 1440-1457 (2006) (adult human peripheral blood-derived CD34⁺subpopulation has both angiogenic and osteogenic activity) and Matsumoto et al., Bone 2008 pages 1-6を参照されたい。本実験ではヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）の細胞によるインビボ骨形成活性及び血管形成について述べる。

骨形成活性：６週齢無胸腺ラットの頭蓋冠の各側に頭蓋欠損（３ｍｍ×５ｍｍ）を作出した。各左側欠損をＨｅａｌｏｓ（ＤｅＰｕｙ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ Ｉｎｃ．、インディアナ州ワルシャワ（Warsaw））キャリア単独で処置し、一方、各右側欠損を陽性対照（Ｈｅａｌｏｓ＋骨形態形成蛋白質２（ＢＭＰ−２））、陰性対照（空欠損（empty defect））又はＨＰＰ＋Ｈｅａｌｏｓで処置した。八匹のラットを各処置群に割り当てた。移植の４週後にラットを殺処分した。組織学的解析のために頭蓋冠を処理し、表２におけるプロトコルに従って組織切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ染色）で染色した。

４を最大量として０〜４の採点システムにより、欠損部への骨内部成長の量を評価した（^＊Ｈｅａｌｏｓ単独（空欠損（empty defect）））と比べてｐ＜．０５）（図６参照）。

血管形成：足場のみを移植された動物群と比べて、ＨＰＰ播種足場を皮下移植された動物群における外植片において血管新生が示された。

（材料及び方法）
皮下足場移植：６週齢（試験開始時）雄Ｈｓｄ：ＲＨ−Ｆｏｘｎ１^ｒｎｕ無胸腺ラットに足場を移植した。被験群に対して５×１０^６細胞／ｍＬにてＨＰＰを受動的に吸着された円径５ｍｍの足場（Ｖｉｔｏｓｓ Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ，Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ社）をラットに移植した。対照群にはＶｉｔｏｓｓのみを移植した。ラットに麻酔をかけ、群により背部、腹部又は大腿部に移植片を皮下に入れた。手術後第２１日目及び４２日目にＣＯ_２窒息により選択ラットを安楽死処分した。移植片を回収し、１０％標準緩衝ホルマリンに入れた。パラフィンに包埋した後、免疫蛍光染色のために５μｍ切片を処理した。

免疫蛍光染色：ラット組織における移植ヒト細胞を検出するため、１：５０希釈にてヒト特異的ＣＤ３４内皮細胞マーカーマウスモノクローナル抗体（クローンＱＢＥｎｄ／１０）ＩｇＧ１（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社 カタログ番号ＮＣＬ−Ｌ−ＥＮＤ）で免疫組織化学的染色を行った（ｎ＝２）。ヒト及びラット平滑筋細胞を検出するため、１：３０希釈にてＤａｋｏ社 カタログ番号Ｍ０８５１からのα平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）マウスモノクローナル（クローン１Ａ４）を用いた。二次抗体は以下の通りであった：ＣＤ３４にはＶｅｃｔｏｒ Ｍ．Ｏ．Ｍ．免疫検出キットフルオレセイン カタログ番号ＦＭＫ−２２０１、ａＳＭＡにはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５９４結合のヤギ抗マウス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社 Ａ２１１３５）。陽性対照は３４の異なるヒト組織を有するヒト組織マイクロアレイ（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ カタログ番号ＭＮＯ３４１）からなり、陰性対照はＭａｘ Ａｒｒａｙマウス組織マイクロアレイスライド（Ｚｙｍｅｄラボ カタログ番号７５−２０１３）であった。

簡潔に説明すると、スライドを５６℃で３０分間焼成し、キシレンで脱パラフィンし（各々５分の３回の変更）、再水和し（１００％〜７０％エタノールに通す）、−２０℃でメタノール中０．５％過酸化水素にて内因性ペルオキシダーゼに対してブロックした。レンジ加熱された０．０１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）にて抗原回復を行った（２サイクル、各１０分）。アビジン及びビオチンブロックを１５分間行った。Ｍｏｕｓｅ−ｏｎ−Ｍｏｕｓｅ（Ｍ．Ｏ．Ｍ．）キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて製造業者のプロトコルに従ってＣＤ３４染色を行った。第二の一次抗体（ａＳＭＡ）を４℃で一晩インキュベートし、対応する二次抗体（ＡＦ５９４）を室温で２０分間インキュベートした。すべてのステップの間でスライドをＰＢＳで各々３回、５分間洗浄した。核染色のために４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）溶液を５分間適用した。水性封入剤を用いてスライドの上にカバースリップを置いた。

画像解析：適切な落射蛍光フィルタセット及び撮像ソフトウェア（Ｎｉｓ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００を用いてスライドを観察した。血管形成を評価するため、各スライドを５つの異なるフィールドにて２０倍の倍率で評価し、Ｎｉｓ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアによってフィールドにおける発現のパーセントを測定することによりａＳＭＡ発現をアッセイした。

（結果）
ＨＰＰを投与される動物における内因的血管形成の増進：ａＳＭＡに対する陽性免疫染色及び内皮細胞におけるＣＤ３４の欠如により、レシピエントに対する移植細胞のパラクリン作用による増進した血管形成を確認した。より初期の時点（２１日）（ｎ＝２）において対照群より多くの血管新生を認め、これらの新血管における特異的なヒト内皮細胞マーカーのエビデンスはなかったが、血管に近接する一部の細胞はＣＤ３４に対して染色された（図７）。より後期の時点（４２日）において増進した血管形成を認めたが、２１日時点に対してより低い程度であり、ＨＰＰ群において陽性ＣＤ３４細胞を認めなかった（図８）。

画像解析は対照群（Ｖｉｔｏｓｓ単独）と比べて２１日目におけるＨＰＰ群における統計的に有意により高い血管形成を示し（ｐ＜０．０１）、４２日目における群において統計的に有意な差を認めなかった（図９）。

本発明は、本明細書で述べられる具体的な実施形態に範囲を限定されてはならない。実際、本明細書で述べられることに加えて本発明の様々な改変が前述の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲内にあるものとする。

本明細書で引用されるすべての文献は、個々の公開物、特許又は特許出願が具体的に個々に示されるがごとく、その全体を参照してあらゆることを目的として本明細書により組み込まれる。いずれの公開物の引用も出願日前のその開示に対するものであり、本発明が先行発明のためにそのような公開物に先行する権利がないという承認と理解されるべきではない。

Claims (27)

1. 胎盤灌流液細胞の集団から血管を形成する方法であって、前記細胞の集団を血管の形成を促進する条件に接触させるステップを含む方法。
2. 前記胎盤灌流液細胞の集団が胎盤灌流液由来の全有核細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記接触が、前記細胞をＶＥＧＦ（５０〜２００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−β（１〜５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍＬ）及び１つ又はそれ以上のマトリクスメタロプロテアーゼ（各々１〜３Unit／ｍＬ）に接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記接触がインビトロにて行われる、請求項１に記載の方法。
5. 前記接触がインビボにて行われる、請求項１に記載の方法。
6. 前記胎盤灌流液細胞の集団が、単一の胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記胎盤灌流液細胞がＣＤ３４^＋細胞である、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＣＤ３４^＋細胞がＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞である、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＣＤ３４^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞が、ＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲの少なくとも１つを、臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルで発現する、請求項６又は７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記胎盤灌流液細胞の集団が、前記灌流液から単離されない単離ＣＤ３４^＋細胞を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＣＤ３４^＋細胞が胎盤から単離される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＣＤ３４^＋細胞が、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される、請求項１０に記載の方法。
13. 前記ＣＤ３４^＋細胞が、ＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルで発現する、請求項１０に記載の方法。
14. 前記ＣＤ３４^＋細胞がＣＤ３４^＋，ＣＤ４５⁻細胞である、請求項１０に記載の方法。
15. 心臓又は血管疾患、障害、病状若しくは不全を有する患者を処置する方法であって、前記疾患、障害、病状又は不全を処置するのに十分な量にてヒト胎盤灌流液又はヒト胎盤灌流液細胞を前記患者に投与するステップを含む方法。
16. 前記疾患、障害、病状又は不全が、末梢血管疾患、急性若しくは慢性心筋梗塞、心筋症、鬱血性若しくは慢性心不全、心血管虚血、肺高血圧疾患、末梢動脈疾患又はリウマチ性心疾患である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記胎盤灌流液細胞が胎盤灌流液由来の全有核細胞である、請求項１５に記載の方法。
18. 前記胎盤灌流液細胞の集団が、単一の胎盤の灌流から単離される胎盤灌流液細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
19. 前記胎盤灌流液細胞がＣＤ３４^＋細胞である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ＣＤ３４^＋細胞がＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ＣＤ３４^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻細胞が、ＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲの少なくとも１つを臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルで発現する、請求項１９又は２０に記載の方法。
22. 前記胎盤灌流液細胞の集団が、前記灌流液から単離されない単離ＣＤ３４^＋細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
23. 前記ＣＤ３４^＋細胞が胎盤から単離される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ＣＤ３４^＋細胞が、臍帯血、胎盤血、末梢血又は骨髄から単離される、請求項２２に記載の方法。
25. 前記ＣＤ３４^＋細胞が、ＣＤ３１、ＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲを臍帯血由来の同等数のＣＤ３４^＋細胞より高いレベルで発現する、請求項２２に記載の方法。
26. 前記胎盤灌流液細胞が足場又はマトリクス上にて投与される、請求項１５に記載の方法。
27. 前記胎盤灌流液細胞が静脈内投与される、請求項１５に記載の方法。