MX2008015645A

MX2008015645A - Nicho placentario y uso de este para cultivar celulas primordiales.

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Publication number: MX2008015645A
Application number: MX2008015645A
Authority: MX
Inventors: Mohammad A Heidaran
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2009-02-06
Also published as: CA2654716A1; JP2009539378A; US20080044848A1; WO2007146123A3; KR20090031895A; EP2035552A2; IL195826A0; US20180237744A1; CN101501185A; AU2007258514A1; ZA200810412B; WO2007146123A2

Abstract

La presente invención proporciona los métodos para cultivar, expandir y diferenciar células primordiales, particularmente células primordiales embriónicas, humanas. Los métodos consisten en cultivar las células primordiales durante un periodo de tiempo en una biofábrica de colágeno, particularmente una biofábrica de colágeno obtenida de la membrana amniótica, corión, o ambos, de placenta de mamífero.

Description

NICHO PLACENTARIO Y USO DE ÉSTE PARA CULTIVAR CÉLULAS PRIMORDIALES 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los métodos de cultivo, expansión o diferenciación de células madre, particularmente células madre embriónicas humanas, utilizando una biofábrica de colágeno placentario. La invención tiene aplicación, por ejemplo, en las áreas del cultivo celular, trasplante de tejidos, descubrimiento de fármacos y terapia génica. 2. ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Las células madre embriónicas humanas (HES, por sus siglas en inglés) son células pluripotentes que han sido obtenidas de la masa celular interna (ICM) de los embriones en la etapa blastocisto o la cresta gonadal de los embriones. Las células HES tienen el potencial para desarrollarse en cualquier tipo de células y generar cualquier tipo de tejidos, órganos y partes corporales, incluido todo un organismo. Como tales, se espera que la capacidad para proporcionar · células HES clónales, normales a solicitud y manipular la diferenciación de éstas proporcione una herramienta poderosa con capacidad para impulsar los avances en los campos biomédico, industrial y científico.

No obstante, sigue habiendo obstáculos significativos para la explotación práctica de las células HES . Por ejemplo, para mantener células ES en un estado indiferenciado, normalmente se cultivan células ES en células alimentadoras . No obstante, los problemas potenciales en un sistema de cultivo dependiente de la capa alimentadora pueden ser: (1) los riesgos potenciales de transmisión de patógenos desde las células alimentadoras animales a las células HES y el hecho de que el sistema de propagación actual (cocuitivo humano/animal o humano/humano) haya sido construido como un xenotrasplante, (2) las células alimentadoras vienen principalmente de células primarias, las cuales presentan variaciones significativas de un lote a otro, haciendo difícil el control de calidad; (3) las fuentes limitadas y los números de células alimentadoras dificultan la producción masiva y las aplicaciones de las células HES. Por tanto, sería conveniente el mantenimiento y proliferación de células HES indiferenciadas sin células alimentadoras.

Xu, et al. (Nat. Biotechnol., 19 (10): 971-974, (2001) . WO 03-020920 y U. S. 2003/0017589) fueron los primeros en mantener satisfactoriamente células ES indiferenciadas en un sistema de cultivo libre de alimentadoras . En este sistema, las células ES se cultivan en MATRIGEL™ a partir del sarcoma de Engelbreth Hola Swarm (EHS) o laminina en medio acondicionado por fibroblastos embriónicos de ratón. Sin embargo, tales matrices sintéticas y macromoléculas de matriz definida no son suficientes para imitar las interacciones más complejas célula-matriz que proporcionan las células alimentadoras. Un estudio también ha indicado que este sistema de cultivo es solo apropiado para ciertas lineas de células ES (por ejemplo Hl y H9) , pero no sostenible para otras lineas de células ES (Hovattal et al., Huía. Reprod. 18 (7) : 1404-1409, 2003) . Más aún, recientemente se ña observado que las células de la capa alimentadora pueden ser una fuente de contaminación, por ejemplo, por patógenos o biomoléculas no embriónicas o no humanas, como puede ser el ácido siálico Neu5Gc .

Además, debido al creciente interés en las células madre proveniente de todos los orígenes, por ejemplo, células madre placentarias, existe la necesidad en la técnica de mejores métodos de cultivo de tales células.

Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad en la técnica de un sistema de cultivo mejorado libre de células alimentadoras para las células madre. La presente invención proporciona un sistema de cultivo como este utilizando una biofábrica de colágeno procedente de placenta. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un mejoramiento en el cultivo de células madre, por ejemplo, células madre embriónicas humanas, células madre placentarias, por ejemplo, células madre placentarias CD34~ ó CD34+, que consiste en cultivar las células madre durante un tiempo con una biofábrica de colágeno, particularmente una biofábrica de colágeno obtenida de una membrana amniótica, el corion o ambos, a partir de placenta de mamífero. La biofábrica de colágeno sustituye en algunas modalidades, las capas de células alimentadoras normalmente utilizadas para dar soporte a las células madre en el cultivo. En otras modalidades, la biofábrica de colágeno proporciona un sustrato para la unión y proliferación de la célula madre.

Sin intentar limitarse a alguna teoría, se considera que la biofábrica de colágeno de la presente invención proporciona un sustrato para la unión de las células y, en al menos ciertas modalidades, proporciona factores de crecimiento apropiados que soportan el crecimiento de las células madre durante el cultivo.

En un aspecto, la presente invención proporciona los métodos para cultivar una célula madre que consiste en cultivar la célula madre en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno, en donde la biofábrica de colágeno se obtiene de una placenta. En una modalidad preferida, la célula madre es exógena para la biofábrica de colágeno. La célula madre puede ser cultivada en condiciones, y durante un tiempo, apropiada para la supervivencia de una célula madre de acuerdo con los expertos en la técnica. En las modalidades preferidas, la célula madre es una célula madre embriónica o una célula madre placentaria. En otra modalidad preferida, el cultivo consiste en la expansión de la célula madre o una población de células madre.

En otro aspecto, la presente invención proporciona los métodos para diferenciar una célula madre, que consiste en los pasos de activar una célula madre en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno en presencia de uno o más agentes que faciliten o favorezcan la diferenciación de la célula madre. Tales agentes pueden ser, por ejemplo, un factor de crecimiento, una molécula pequeña, etc., tal y como se describe en la presente. En diversas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene uno o más de estos agentes, el medio de cultivo en el que la célula madre se cultiva contiene uno o más de estos agentes, o la biofábrica de colágeno y el medio de cultivo contienen uno o más de estos agentes.

La célula madre puede ser cultivada en condiciones conocidas para el experto en la técnica para facilitar el crecimiento de las células madre en el cultivo celular. La célula madre, por ejemplo, una célula madre placentaria, por ejemplo, una célula madre placentaria CD34~ ó CD34+ puede proliferarse, o puede diferenciarse en la biofábrica de colágeno hacia, por ejemplo, una célula neural, un adipocito, un condrocito, un osteocito, un hepatocito, una célula pancreática o una célula cardiaca, utilizando los agentes apropiados que faciliten o favorezcan la diferenciación hacia tales células como es bien sabido para el trabajador experto en la técnica.

Cualquier célula madre puede ser cultivada, expandida o diferenciada de acuerdo con los métodos de la invención, que incluye, más no se limita a, una célula madre embriónica, una célula madre placentaria (por ejemplo, una célula madre placentaria CD34" ó CD34'r, una célula madre mesenquimática, una célula madre hematopoyética, una célula madre derivada de la sangre placentaria o dé la sangre del cordón umbilical, una célula madre derivada de la médula ósea, una célula madre somática adulta, una célula progenitora (por ejemplo célula progenitora hematopoyética) o célula que esté comprometida para diferenciarse en un tipo de célula particular. En algunas modalidades, la célula madre es una célula madre embriónica. En modalidades preferidas, la célula madre es una célula madre embriónica humana o una célula madre placentaria. En ciertas modalidades, la invención también proporciona un método de cultivo de una célula madre, en donde la célula madre no es una célula limbal, célula madre limbal o célula madre mesenquimática de médula ósea.

La biofábrica de colágeno que se utiliza en la invención se obtiene de una placenta de mamífero. La biofábrica de colágeno preferida está prácticamente seca, es decir, aproximadamente 20% o menos de agua en peso. En una modalidad específica, la biofábrica de colágeno no está tratada con proteasa. En otra modalidad específica, las proteínas de la biofábrica de colágeno no están reticuladas artificial y químicamente, es decir, la biofabrica de colágeno no está fijada. En otra modalidad específica, la biofábrica de colágeno carece de células placentarias, por ejemplo, está descelularizada. En otra modalidad específica, la biofábrica de colágeno contiene células placentarias, por ejemplo, no está descelularizada.

La biofábrica de colágeno puede contener ácido hialurónico, por ejemplo, una capa de ácido hialurónico. En una modalidad específica, el ácido hialurónico está reticulado. En una modalidad más específica, el ácido hialurónico está reticulado a la biofábrica de colágeno.

La biofábrica de colágeno además puede contener un compuesto bioactivo que no ocurre en la naturaleza en la biofábrica de colágeno, o está presente en una concentración diferente a la de la biofábrica de colágeno a la cual no ha sido adicionado el compuesto bioactivo. En una modalidad más específica, el compuesto bioactivo es una molécula orgánica pequeña, un antibiótico, aminoácido, analgésico, agente anti-inflamatorio, citocina, factor de crecimiento, inhibidor de enzima, inhibidor de cinasa, un agente anti-tumoral, un agente anti-micótico, un agente anti- iral o un agente antiinfeccioso .

En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno puede contener uno o más agentes que faciliten o favorezcan la diferenciación de las células madre. Tales agentes son bien conocidos para los que cuentan con las habilidades en la técnica y están descritos con detalle más adelante. La biofábrica de colágeno puede también tener células endógenas o exógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno. Estas células están descritas en la presente.

Cualquier medio de cultivo adecuado para cultivar, extender o diferenciar células madre, es decir, en el que las células madre proliferen en condiciones de cultivo normales para una célula madre particular, conocidos para los expertos en la técnica puede utilizarse en la presente invención, apropiado para obtener las células/tejidos de la cual se obtiene la célula madre o a la cual se diferenciará la célula madre.

La invención además comprende el uso de una célula madre, una célula progenitora o un tipo de célula especifico, o poblaciones de éstas, en donde la célula o células se cultivan o diferencian de acuerdo con los métodos de la presente invención. En ciertas modalidades, la célula es una célula neural, un adipocito, un condrocito, un osteocito, un hepatocito, una célula pancreática o una célula cardiaca preparada diferenciando una célula madre de acuerdo con los métodos de la presente invención.

En algunas modalidades, la presente invención prevé el trasplante de células madre no diferenciadas o diferenciadas con o sin una biofábrica de colágeno producida de acuerdo con los métodos de la presente invención para tratar o prevenir una enfermedad o estado .

La presente invención además proporciona los métodos para determinar la toxicidad de un compuesto para una célula. En algunas modalidades, los métodos consisten en cultivar una célula con una biofábrica de colágeno en condiciones en las cuales la célula madre sobrevive, por ejemplo, prolifera. La célula entonces se pone en contacto con un compuesto, y se ensaya un cambio de la actividad de la célula, por ejemplo, en un parámetro metabólico de la célula que indique apoptosis, necrosis o muerte celular, o una tendencia hacia la apoptosis, necrosis o muerte celular. Si se detecta un cambio, comparado con una célula cultivada en condiciones equivalentes y no en contacto con el compuesto, el compuesto es identificado como tóxico para la célula. La célula puede ser una célula somática o una célula madre .

En otro aspecto, la presente invención proporciona los métodos para determinar el efecto de un compuesto sobre la diferenciación de una célula madre utilizando el sistema de cultivo celular de la biofábrica de colágeno de la invención. En algunas modalidades, los métodos consisten en cultivar la célula con una biofábrica de colágeno bajo condiciones apropiadas para la diferenciación de la célula. La célula se pone en contacto con un compuesto. Las células se analizan entonces para un marcador de la diferenciación en presencia o ausencia del compuesto candidato. El marcador de la diferenciación puede ser un marcador de superficie celular, la morfología celular o uno o más genes expresados de manera diferencial. Si se identifica un cambio, el compuesto es identificado con un efecto sobre la diferenciación de la célula.

Cuando se utiliza en la presente "biofábrica de colágeno" es un material que contiene colágeno considerablemente plano o tipo lámina derivado u obtenido de una membrana amniótica de mamífero y/o corion. En una modalidad preferida, la biofábrica de colágeno es una membrana amniótica descelularizada, deshidratada (es decir, 20% o menos de agua en peso) , corion, o membrana amniótica y corion que no han sido tratados con proteasa, o tratados con calor por encima de 60°C, considerablemente como se describe en Hariri, Publicación de la Solicitud de Patente US No. 2004/0048796. En ciertas modalidades, la biofábrica de colágeno no retícula por inducción artificial y química, es decir, no ha sido fijada. La biofábrica de colágeno normalmente es rehidratada con, por ejemplo, medio de cultivo antes del cultivo, expansión y/o diferenciación de las células de acuerdo con la presente invención. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa células madre placentarias después del cultivo sobre biofábrica de colágeno (membrana amniótica), colágeno, fibronectina o vidrio. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los métodos de cultivo, expansión o diferenciación de células madre, utilizando una biofábrica de colágeno. 5.1 CÉLULAS MADRE Una célula madre, por ejemplo, célula madre embriónica o células madre adultas, pueden cultivarse con biofábrica de colágeno de acuerdo con los métodos de la presente invención. Cuando se utiliza en la presente, el término "célula madre"' comprende células totipotentes, pluripotentes y multipotentes, células madre somáticas o células progenitoras y similares. Las células madre pueden ser, por ejemplo, células madre placentarias (por ejemplo, células madre placentarias CD34" ó CD34T) , células madre de cordón umbilical, células madre mesenquimáticas, células madre hematopoyéticas, células madre derivadas de sangre placentaria o sangre de cordón umbilical, células madre derivadas de medula ósea o células madre somáticas . Las células madre somáticas pueden ser, por ejemplo, células madre neurales, células madre hepáticas, células madre pancreáticas, células madre endoteliales, células madre cardiacas, células madre de músculo, o células madre epiteliales, células madre de la piel, células madre de cerebro, células madre de piel, células madre endodérmicas, células madre exodérmicas, células madre descritas en los números de patente US 5,486,359, 6,261,549 y 6,387,367 (células madre mesenquimáticas) y el número de Patente US 5,962,325 (células estromales fetales). En ciertas modalidades, la célula madre no es una célula madre timbal .

Las células madre que se utilizan en la presente invención pueden obtenerse de, por ejemplo, placenta, cordón umbilical, médula ósea, embrión, mesenquima, tejido neural, tejido pancreático, tejido muscular (como puede ser el músculo cardiaco) , hígado, piel, intestino, epitelio nasal, hueso, páncreas y similares.

En algunas modalidades, las células madre que se utilizan en la presente invención son células madre de placenta humana. Tales células madre están descritas en, y pueden aislarse de manera rutinaria como se establece en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud US Nos. 2002/0123141, 2003/0032179, 2003/0180269, 2004/0048796, cada una de las cuales se incorpora para referencia en su totalidad.

En algunas modalidades, las células madre que se utilizan en la presente invención son células madre embriónicas . Las células madre embriónicas pueden aislarse habitualmente como se describe en, por ejemplo, los números de Patente US 5,843,780, 6,200,806 y en Thomson et al., 1995, Proc. Nati. Acad. ScL U.S.A. 92:7844. En ciertas modalidades, las células madre que se utilizan en los métodos de la invención son células madre embriónicas humanas . Las células madre embriónicas humanas están descritas, por ejemplo, en Thomson et al., 1998, Science, 282: 1145, y en la Patente U.S. No. 6,200, 806.

La presente invención también prevé el cultivo de una célula madre, donde la célula madre no es una célula madre mesenquimática obtenida de médula ósea o una célula limbal, por ejemplo, una célula madre limbal.

Las células madre que se utilizan en la presente invención pueden obtenerse utilizando los métodos o materiales conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células madre pueden obtenerse de un servicio comercial, por ejemplo, LifeBank USA (Cedar nolls, N. J.), ViaCord (Boston Mass.), Cord Blood Registry (San Bruno, Calif.) y Cryocell (Clearwater, Fia.). Las células madre pueden también ser recolectadas utilizando los procesos o procedimientos conocidos en la técnica. Las células madre primordiales de primate pueden obtenerse, por ejemplo, como se describe en las Patentes U. S. Nos. 6,200,806 y 6,800,480. Las células madre placentarias pueden obtenerse, por ejemplo, como está descrito en la Publicación de la Solicitud U. S. No. 2003/0032179, el contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Las células madre embriónicas humanas pueden obtenerse de fuentes naturales como puede ser de un embrión, un blastocisto ó células de la masa celular interna (ICM) , o de un cultivo previo o establecido de células embriónicas. Las células madre embriónicas humanas pueden prepararse a partir de células del blastocisto humano utilizando las técnicas descritas por Thomson et al, (Patente U. S. No. 5,843,780; Science 282:1 145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol . 38:133 ff., 1998) y Reubinoff et al., 2000, Nature Biotech. 18:399, o la Publicación de la Solicitud U. S. No. 2003/0032179, etc. Las células madre embriónicas humanas también pueden obtenerse de las crestas gonadales de embrión humano, por ejemplo, como se describe en Reubinoff et al., 2000, Nature, 18:399-404, o la Patente ü. S. Nos. 6,090,622 (células germinales embriónicas humanas), y 6,562,619, o de embriones congelados, por ejemplo, como se describe en la Patente U. S. No. 6,921,632, o de placenta humana, como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente U. S. Nos. 2003/0032179, 2002/0123141, 2003/0032179, 2003/0180269, 2004/0048796, el contenido ' de las cuales se incorpora por este medio en su totalidad.

Las células madre que se utilizan en la presente invención pueden ser de cualquier especie conocida para el trabajador experto en la técnica. Células madre como éstas pueden ser, por ejemplo, de peces, aviar, reptilianas o de mamífero. Cualquiera de las células madre de mamífero pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de la presente invención, que incluye más no se limita a células madre de, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cobayo, perro, gato, cerdo, oveja, vaca, caballo, mono, humano, etc. En ciertas modalidades, las células madre son células madre de ratón. En algunas modalidades, las células madre son células madre de primate. En modalidades preferidas, las células madre son células madre humanas. En modalidad particularmente preferida, las células madre son células embriónicas humanas .

Las células madre que se utilizan en la presente invención pueden utilizarse en forma relativamente no purificada, como puede ser en sangre de cordón o sangre placentaria, o en poblaciones de células mononucleares de sangre periférica obtenidas por aféresis. Las células madre útiles en la presente invención pueden estar relativamente aisladas, es decir, considerablemente aisladas de otros tipos de células. Las células madre pueden contener un solo tipo de célula madre, o múltiples tipos de células madre.

Las células madre que se utilizan en la presente invención pueden ser genéticamente manipuladas antes de cultivar o durante el cultivo utilizando la biofábrica de colágeno. Es posible introducir un polinucleótido en las células madre utilizando cualquier técnica conocida para el trabajador experto, por ejemplo, mediante un vector viral, como puede ser un vector adenoviral o retroviral, o por medios biomecánicos como la captación liposomal o química del DNA como se describe en la Publicación de la Solicitud US No. 2004/0028660, el contenido de la cual se g incorpora para referencia en su totalidad. 5.2 CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS Las células madre placentarias, por ejemplo, células madre placentarias CD34", a las que se hace referencia en adelante simplemente como "células madre placentarias", que pueden cultivarse sobre la biofábrica de colágeno, son células madre que pueden obtenerse de una placenta o parte de ésta, que se adhieren a un sustrato de cultivo tisular y tienen la capacidad para diferenciarse en tipos de células no placentarias. Las células madre placentarias pueden ser de origen fetal o materno (es decir, pueden tener el genotipo de la madre o el feto) . Las poblaciones de células madre placentarias, o poblaciones de células que contienen células madre placentarias, pueden tener' células madre placentarias que son solamente de origen fetal o materno o pueden contener una población mixta de células madre placentarias de origen fetal y materno . Las células madre placentarias que pueden utilizarse en los métodos de la presente invención están descritos, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de Estados Unidos Nos. 2005/0019908 y 2003/0180269, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente en sus totalidades. Las células madre placentarias, y las poblaciones de células que contienen las células madre placentarias, pueden ser identificadas y seleccionadas por el marcador morfológico, y las características de cultivo que se describen más adelante. 5.2.1 Características físicas y morfológicas Las células madre placentarias, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato del cultivo tisular, por ejemplo, la superficie del envase del cultivo tisular (por ejemplo, el plástico del cultivo tisular) . Las células madre placentarias en cultivo toman una apariencia estrellada, generalmente fibroblastoide, con un número de procesos citoplásmicos que se extienden desde el cuerpo celular central. No obstante, las células madre placentarias pueden distinguirse morfológicamente de los fibroblastos cultivados bajo las mismas condiciones, en vista de que las células madre placentarias presentan un mayor número de procesos que los fibroblastos. Desde el punto de vista morfológico, las células madre placentarias también se pueden diferenciar de las células madre hematopoyéticas, las cuales generalmente toman una morfología más redondeada, o de adoquín, en cultivo, y las células madre embriónicas o las células germinales embriónicas, las cuales adoptan una morfología redondeada, si se cultivan en una capa alimentadora o sobre un sustrato, por ejemplo, MATRIGEL™.

Por lo regular, en cultivo, las células madre placentarias desarrollan cúmulos o agrupaciones de células, a las que se hace referencia como cuerpos tipo embrioide que se asemejan a los cuerpos embrioides que se desarrollan en cultivos de células madre embriónicas . 5.2.2 Marcadores de la superficie celular, moleculares y genéticos Las células madre placentarias expresan una pluralidad de marcadores que pueden utilizarse para identificar y/o aislar las células madre. Las células madre placentarias incluyen células madre de la placenta entera, o cualquier parte de ésta (por ejemplo el amnion, corion, cotiledones placentarios, cordón umbilical y similares) . Sin embargo, las células madre placentarias no son trofoblastos .

Las células madre placentarias generalmente expresan los marcadores CD73, CD105, CD200, HLA-G, y/o OCT-4, y generalmente no expresan CD34, CD38 ó CD45. Las células madre placentarias pueden también expresar HLA-ABC (MHC-1) y HLA-DR. Estos marcadores pueden utilizarse para identificar las células madre placentarias y para distinguir las células madre placentarias de otros tipos de células madre. Debido a que las células madre placentarias pueden expresar CD73 y CD105, estas pueden tener características tipo célula madre mesenquimática . Sin embargo, debido a que las células madre placentarias pueden expresar CD200 y HLA-G, un marcador específico fetal, éstas pueden distinguirse de las células madre mesenquimáticas, por ejemplo, células madre mesenquimáticas derivadas de médula ósea, las cuales no expresan CD200 ni HLA-G. En la misma forma, la ausencia de expresión de CD34, CD38 y/o CD45 identifica las células madre placentarias como células madre no hematopoyéticas . En ciertas modalidades, las células madre placentarias son negativas para SSEA3 y/o SSEA4. En ciertas modalidades, las células madre placentarias son positivas para SSEA3 y/o SSEA .

Asi pues, en una modalidad, una célula madre placentaria es CD200+ o HLA-G+. En una modalidad especifica, la célula madre es CD200+ y HLA-G+. En otra modalidad especifica, la célula madre es CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38", CD45", CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, la célula madre CD200+ o HLA-G+ facilita la formación de cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias que contienen las células madre, en condiciones que periten la formación de cuerpos tipo embrioide.

Una célula madre placentaria puede ser seleccionada de una pluralidad de células placentarias seleccionando una célula placentaria CD200 o HLA-G, con lo cual la célula es una célula madre placentaria. En una modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que sea CD200+ y HLA-G+. En una modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que sea también CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que sea también CD34", CD38" ó CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que sea también CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que sea también CD34", CD38", CD45", CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también facilite la formación de cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias que contenga las células madre, en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide .

En otra modalidad, una célula madre placentaria es CD73+, CD105+ y CD200+. En otra modalidad especifica, la célula madre es s HLA-G+. En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38" ó CD45". En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38" y CD45". En una modalidad más especifica, la célula madre es CD34", CD38", CD45" y HLA-G+. En otra modalidad especifica, la célula madre CD73+, CD105+ y CD200+ aislada facilita la formación de uno o más cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias que contienen la célula madre, cuando la población se cultiva en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide.

Una célula madre placentaria también puede ser seleccionada de una pluralidad de células placentarias al seleccionar una célula placentaria CD73+, CD105+ y CD200+, con lo cual la célula es una célula madre placentaria. En una modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea HLA-G+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38" ó CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38" y CD45-. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38", CD45" y HLA-GT. En otra modalidad especifica, la selección además consiste en seleccionar una célula madre CD73+, CD105+ y CD200+ que facilite la formación de uno o más cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias que contenga la célula - madre, cuando la población se cultiva en condiciones que faciliten la formación de cuerpos tipo embrioide.

En otra modalidad, una célula madre placentaria es CD200+ y 0CT-4+. En una modalidad especifica, la célula madre es CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, la célula madre es HLA-G+. En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38" ó CD45". En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38- y CD45". En una modalidad más especifica, la célula madre es CD34-, CD38", CD45", CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra modalidad especifica, la célula madre facilita la producción de uno o más cuerpos tipo embrioide mediante una población · de células placentarias que contiene la célula madre, cuando la población se cultiva en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide .

Una célula madre placentaria también puede seleccionarse de una pluralidad de células placentarias al seleccionar una célula placentaria CD200+ y 0CT-4+, con lo cual la célula es una célula madre placentaria. En una modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea HLA- G+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38" ó CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38~ y CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38", CD45", CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula madre placentaria que también facilite la producción de uno o más cuerpos tipo embrioide mediante una población de células placentarias que contenga la célula madre, cuando la población se cultiva en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide.

En otra modalidad, una célula madre placentaria es CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38~ ó CD45". En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34~, CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, la célula madre es OCT-4+. En otra modalidad especifica, la célula madre es CD200+. En una modalidad más especifica, la célula madre es CD34", CD38", CD45", OCT-4+ y CD200+. En otra modalidad especifica, la célula madre facilita la formación de cuerpos tipo embrioide en una población de células placenterías que contiene la célula madre, cuando la población se cultiva en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide.

Una célula madre placentaria puede también ser seleccionada a partir de una pluralidad de células placentarias al seleccionar una célula placentaria CD73+, CD105+ y HLA-G+, con lo- cual la célula es una célula madre placentaria. En una modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38" ó CD45-. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38" y CD45~. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea 0CT-4+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD200+. En otra modalidad específica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38", CD45", OCT-4+ y CD200+. En otra modalidad específica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también facilite la formación de uno o más cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias que contenga la célula madre, cuando la población se cultiva en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide.

En otra modalidad, una célula madre placentaria es CD73+ y CD105+ y facilita la formación de uno o más cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias aisladas que contienen la célula madre cuando la población se cultiva en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide. En una modalidad especifica, la célula madre es CD34~, CD38" ó CD45~. En otra modalidad especifica, la célula madre es CD34~, CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, la célula madre es 0CT4+. En una modalidad más especifica, la célula madre es OCT4+, CD34", CD38" y CD45".

Una célula madre placentaria también puede seleccionarse a partir de una pluralidad de células placentarias al seleccionar una célula placentaria CD73+ y CD105+ que facilite la formación de uno o más cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias aisladas que contenga la célula madre cuando la población se cultive en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide, con lo cual la célula es una célula madre placentaria. En una modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38~ ó CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34~, CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea 0CT-4+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD200+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38", CD45", 0CT-4+ y CD200+.

En otra modalidad, una célula madre placentaria es 0CT-4+ y facilita la formación de uno o más cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias aisladas que contengan la célula madre cuando se cultive en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide. En una modalidad especifica, la célula madre es CD73+ y CD105+. En una modalidad especifica, la célula madre es CD34", CD38" ó CD45". En otra modalidad especifica, la célula madre es CD200+. En una modalidad más especifica, la célula madre es CD73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38" y CD45".

Una célula madre placentaria también puede seleccionarse de una pluralidad de células placentarias, por ejemplo, al seleccionar una célula placentaria OCT-4+ que facilite la formación de uno o más cuerpos tipo embrioide en una población de células placentarias aisladas que contengan la célula madre cuando la población se cultiva en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide, con lo cual la célula es una célula madre placentaria. En una modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38~ ó CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD34", CD38~ y CD45". En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD20CT. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD200+. En otra modalidad especifica, la selección consiste en seleccionar una célula placentaria que también sea CD73+, CD105+, CD200+, CD34", CD38" y CD45".

En otra modalidad, las células madre placentarias que pueden cultivarse o diferenciarse sobre biofábrica de colágeno son CD10+, CD34~, CD105+ y CD200+. Una población aislada de células madre placentarias puede contener, por ejemplo, al menos alrededor de 70%, al menos cerca de 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos alrededor de 95% o al menos alrededor de 99% de células madre placentarias . En una modalidad especifica de las modalidades anteriores, las células madre son además CD90+ y CD45~. En una modalidad especifica, la célula madre o población de células madre placentarias se aislan de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad especifica, la célula madre o población de células madre placentarias se aislan de las células madre placentarias que no presentan estas características. En otra modalidad específica, la célula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otra modalidad específica, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en la población aislada de células madre placentarias son de origen no materno.

En otra modalidad, las células madre placentarias que pueden cultivarse o diferenciarse sobre biofábrica de colágeno son HLA-A,B,C~, CD45", CD133" y CD34". Una población aislada de células madre placentarias puede contener, por ejemplo, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95% o al menos alrededor de 99% de células madre placentarias que sean HLA-A, B,C~, CD45", CD133" y CD34". En una modalidad especifica, la célula madre o población de células madre placentarias se aislan de las células placentarias que no son células madre . En otra modalidad especifica, la población de células madre placentarias se aisla de las células madre placentarias que no presentan estas características. En otra modalidad específica, la célula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otra modalidad específica, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, o al menos alrededor de 99% de las células de la población aislada de células madre placentarias son de origen no materno . En otra modalidad, las células madre placentarias se aislan de perfundido placentario.

En otra modalidad, las células madre placentarias que pueden cultivarse o diferenciarse sobre biofábrica de colágeno son CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117" y CD133". Una población aislada de células madre placentarias puede contener, por ejemplo, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95% o al menos alrededor de 99% de células madre placentarias que son CD10"1", CD13", CD33+, CD45", CD117- y CD133". En una modalidad específica, la célula madre o población de células madre placentarias se aisla de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad especifica, la célula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otra modalidad especifica, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, o al menos 99% de las células de la población aislada de células madre placentarias son de origen no materno. En otra modalidad especifica, la célula madre o población de células madre placentarias se aisla de las células madre placentarias que no presentan estas características. En otra modalidad, las células madre placentarias se aislan del perfundido placentario.

En otra modalidad, las células madre placentarias que pueden cultivarse o diferenciarse sobre biofábrica de colágeno son CD10", CD33~, CD44+, CD45" y CD117". Una población aislada de células madre placentarias puede contener, por ejemplo, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95% o al menos alrededor de 99% de células madre placentarias que son CD10", CD33", CD44+, CD45" y CD117". En una modalidad específica, la célula madre o población de células madre placentarias se aisla de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad específica, la célula madre placentaria aislada es de origen no materno . En otra modalidad específica, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, o al menos 99% de las células de la población aislada de células madre placentarias son de origen no materno. En otra modalidad específica, la célula madre o población de células madre placentarias se aisla de las células madre placentarias que no presentan estas características. En otra modalidad, las células madre placentarias se aislan del perfundido placentario.

En otra modalidad, las células madre placentarias que pueden cultivarse o diferenciarse sobre biofábrica de colágeno son CD10", CD13", CD33", CD45" y CD117". Una población aislada de estas células madre placentarias puede contener, por ejemplo, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95% o al menos alrededor de 99% de células madre placentarias que sean CD10", CD13~, CD33", CD45" y CD117-. En una modalidad específica, la célula madre o población de células madre placentarias se aisla de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad específica, la célula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otra modalidad específica, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, o al menos 99% de las células de la población aislada de células madre placentarias son de origen no materno. En otra modalidad específica, la célula madre o población de células madre placentarias se aisla de las células madre placentarias que no presentan estas características . En otra modalidad, las células madre placentarias se aislan del perfundido placentario.

En otra modalidad, las células madre placentarias que pueden cultivarse o diferenciarse sobre la biofábrica de colágeno son HLA A,B,C~, CD45", CD34", CD133", positivas para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativas para CD117. En otra modalidad, las células madre, o la población aislada de células madre placentarias que contiene células madre son HLA A,B,C~, CD45", CD34", CD133", y al menos alrededor de 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o aproximadamente 99% de las células madre de la población son positivas para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativas para CD117. En una modalidad específica, la célula madre o población de células madre placentarias se aislan de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad específica, la célula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otra modalidad específica, al menos aproximadamente 90%, al menos alrededor de 95% o al menos alrededor de 99% de las células de la población aislada de células madre placenterías son de origen no materno. En otra modalidad especifica, la célula madre o población de células madre placentarias se aisla de las células madre placentarias que no presentan estas características. En otra modalidad, la invención proporciona un método para obtener una célula madre placentaria que sea HLA A, B,C~, CD45", CD34", CD133" y positiva para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativa para CD117, que consiste en aislar las células del perfundido placentario.

En otra modalidad, las células madre placentarias que pueden cultivarse o diferenciarse sobre biofábrica de colágeno son CD200+ y CD10+, según se determina por la unión al anticuerpo, y CD117", según se determina por la unión al anticuerpo y RT-PCR. En otra modalidad, la célula madre placentaria es CD10+, CD29~, CD54+, CD200+, HLA-G+, HLA clase I" y ß-2-microglobulina" . En otra modalidad, la célula madre placentaria presenta, o las células madre placentarias presentan, expresión de al menos un marcador que sea al menos dos veces mayor que para una célula madre mesenquimática (por ejemplo, una célula madre mesenquimática derivada de médula ósea) . En otra modalidad especifica, la célula madre placentaria es de origen no materno. En otra modalidad especifica, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, o al menos 99% de las células de una población aislada de células madre placentarias son de origen no materno.

En otra modalidad, las células madre placentarias o la población aislada de células madre placentarias contienen células madre placentarias que son positivas para aldehido deshidrogenasa (ALDH) , según se ensaya por un ensayo de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. Estos ensayos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Bostian y Betts, Biochem. J., 173, 787, (1978)). En una modalidad especifica, el ensayo ALDH utiliza ALDEFLUOR® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon) como un marcador de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. En una modalidad especifica, la pluralidad es entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de células de la población de células . En otra modalidad, la invención propone una población de células madre de cordón umbilical, en donde una pluralidad de células madre de cordón umbilical son positivas para aldehido deshidrogenasa, según se ensaya por un ensayo de la actividad de la aldehido deshidrogenasa que utiliza ALDEFLUOR® como indicador de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. En una modalidad especifica, la pluralidad es entre aproximadamente 3% y aproximadamente 5% de células en la población de células. En otra modalidad, la población de células madre placentarias o células madre de cordón umbilical muestra al menos tres veces, o al menos cinco veces, mayor actividad ALDH que una población de células madre mesenquimáticas obtenidas de médula ósea que tenga el mismo número de células y cultivadas en las mismas condiciones.

En diversas modalidades de cualquiera de las células madre placentarias anteriores o poblaciones de células madre placentarias, la célula madre o población de células madre placentarias ha sido pasada al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 veces o más, o extendida para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ó 40 dobleces de población o más .

En otras modalidades, la célula madre placentaria o células madre antes descritas expresan uno o más genes a un nivel detectablemente mayor que una célula madre mesenquimática obtenida de médula ósea, en donde uno o más genes son uno o más de ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, ????2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y/o ZC3H12A, y en donde la célula madre derivada de médula ósea ha sido sometida a un número de pasajes de cultivo equivalentes al número de pasajes que la célula madre placentaria ha sido sometida. Las secuencias correspondientes a estos genes se encuentran en los arreglos Affymetrix GE ECHIP®. Estos genes también pueden encontrarse en GenBank Nos. De acceso NM_001615 (ACTG2) , BC065545 (ADARBa) , (NMJL81847 (AMIG02) , AY358590 (ARTS-1) , BC074884 (B4GALT6) , BC008396 (BCHE) , BC020196 (Cllorf9) , BC031103 (CD200), NM_001845 (C0L4A1) , NM_001846 (COL4A2) , BC052289 (CPA4) , BC094758 (DMD) , AF293359 (DSC3) , NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2) , AY336105 (F2RL1) , NM_018215 (FLJ10781) , AY416799 (GATA6) , BC075798 (GPR126) , NM_016235 (GPRC5B) , AF340038 (ICAM1) , BC000844 (IER3) , BC066339 (IGFBP7) , BC013142 (IL1A) , BT019749 (IL6) , BC007461 (IL18) , (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8) , BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP) , BC010444 (MATN2) , BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3) , NM_014840 (NUAK1) , AB006755 (PCDH7) , NM_014476 (PDLIM3) , BC126199 (PKP-2) , BC090862 (RTN1) , BC002538 (SERPINB9) , BC023312 (ST3GAL6) , BC001201 (ST6GALNAC5) , BC126160 ó BC065328 (SLC12A8) , BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2) , BC005046 (VTN), y BC005001 (ZC3H12A) con fecha de diciembre de 2006.

En una modalidad más especifica, una célula madre placentaria o células madre placentarias expresan ACTG2, ADARB1, AMIG02, A TS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4 , DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1 , FLJ10781, GAT 6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7 , PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A a un nivel detectablemente mayor que una célula madre mesenquimática obtenida de médula ósea.

En general, las células madre placentarias se obtienen de placenta de mamífero utilizando una solución fisiológica aceptable, por ejemplo, una composición para recolección de células madre. Una composición para recolección de células madre está descrita con detalle en la solicitud de patente U. S. No. 11/648,812, relacionada, titulada, "Medio mejorado para recolectar células madre placentarias y preservar órganos", presentada el 28 de diciembre de 2006.

Una composición para la recolección de células madre placentarias puede consistir en cualquier solución fisiológica aceptable adecuada para la recolección y/o cultivo de células madre, por ejemplo, una solución salina (por ejemplo, salina amortiguada con fosfatos, solución de reb, solución de Kreb modificada, solución de Eagle, solución de NaCl al 0.9%, etc.), un medio de cultivo (por ejemplo, DMEM, H.DMEM, etc.), y similares.

Una composición para recolección de células madre placentarias puede contener uno o más componentes que tienden a preservar las células madre placentarias, es decir, a evitar que las células madre placentarias mueran, o retardar la muerte de las células madre placentarias, reducen el número de células madre placentarias en una población de células que muere, o similares, desde el momento de la recolección hasta el momento del cultivo. Tales componentes pueden ser, por ejemplo, un inhibidor de la apoptosis (p. ej . , un inhibidor de caspasa ó inhibidor de J K) ; un vasodilatador (p. ej . , sulfato de magnesio, un medicamento antihipertensivo, péptido natriurético atrial (ANP) , adrenocorticotropina, hormona liberadora de corticotropina, nitroprusiato de sodio, hidralazina, trifosfato de adenosina, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc.); un inhibidor de necrosis (p. ej . , 2- (lH-Indol-3-il) -3-pentilamino-maleimida, pirrolidina ditiocarbamato, o clonazepam) ; un inhibidor de TNF-cx; y/o un perfluorocarburo portador de oxigeno (p. ej . , bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc. ) .

Una composición para la recolección de células madre placentarias puede contener una o más enzimas degradadotas de tejido, por ejemplo, metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutra, una RNasa, o una DNasa, o similares. Tales enzimas incluyen, más no se limitan a, colagenasas (p. ej . , colagenasa I, II, III ó IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASE, hialuronidasa y similares.

Una composición para la recolección de células madre placentarias puede contener una cantidad bactericida o bacteriostática eficaz de un antibiótico. En ciertas modalidades no limitativas, el antibiótico es un macrólido (p. ej . , tobramicina) , una cefalosporina (p. ej . , cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxil) , una claritromicina, una ertromicina, una penicilina (p. ej . , penicilina V) o una quinolona (p. ej . , ofloxacina, ciprofloxacino ó norfloxacino) , una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En una modalidad particular, el antibiótico es activo contra bacterias Gram(+) y/o Gram(—), p. ej . , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y similares.

Una composición para la recolección de células madre placentarias también puede contener uno o más de los siguientes compuestos: adenosina (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM) ; D-glucosa (aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM) ; iones magnesio (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM) / una macromolécula de peso molecular mayor que 20,000 daltons, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y la viabilidad celular (p. ej . , un coloide sintético o natural, un polisacárido como dextrano o un polietilen glicol presente a aproximadamente 25 g/L a aproximadamente 100 g/L, o aproximadamente 0 g/L a aproximadamente 60 g/L) ; un antioxidante (p. ej . , hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutation, vitamina C ó vitamina E, presentes a aproximadamente 25 uM a aproximadamente 100 uM) ; un agente reductor (p. ej . , N-acetilcisteina presente a aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 5 mM) ; un agente que impida que el calcio entre en las células (p. e . , verapamilo presente en aproximadamente 2 uM a aproximadamente 25 µ?) ; nitroglicerina (p. ej . , aproximadamente 0.05 g/L a aproximadamente 0.2 g/L); un anticoagulante, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para ayudar a prevenir la coagulación de la sangre residual (p. ej . , heparina ó hirudina presentes en una concentración de aproximadamente 1000 unidades/L a aproximadamente 100,000 unidades/L) ; o un compuesto que contenga amilorida (p. ej . , amilorida, etil isopropil amilorida, hexametileno amilorida, dimetil amilorida ó isobutil amilorida presente a aproximadamente 1.0 uM a aproximadamente 5 uM) . 5.2.3 Recolección y manejo de la placenta En general, una placenta humana es recuperada poco después de su expulsión después del nacimiento. En una modalidad, la placenta se recupera de una paciente después del consentimiento informado y después de que se toma un historial médico completo de la paciente y se asocia con la placenta. De preferencia, el historial médico continúa después del parto . Un historial médico como éste puede utilizarse para coordinar el uso ulterior de la placenta o las células madre cosechadas a partir de ésta. Por ejemplo, las células madre placentarias humanas pueden utilizarse, a la luz del historial médico, para medicina personalizada para el recién nacido asociado con la placenta, o para pacientes, los hijos u otros familiares del recién nacido.

Antes de la recuperación de las células madre placentarias, la sangre del cordón umbilical y la sangre placentaria se retira. En ciertas modalidades, después del parto se recupera la sangre del cordón en la placenta. La placenta puede ser sometida a un proceso de recobro de sangre de cordón convencional. Normalmente se utiliza una aguja o cánula con la ayuda de gravedad para exsanguinar la placenta (ver, por ejemplo, Anderson, Patente U. S. No. 5,372,581 ; Hessel et al, Patente U. S. No. 5,415, 665). Normalmente, la aguja o cánula se coloca en la vena umbilical y la placenta puede ser suavemente masajeada para ayudar al drenado de la sangre del cordón a partir de la placenta. La recuperación de la sangre del cordón puede hacerse en forma comercial, por ejemplo, LifeBank Inc., Cedar Knolls, N. J., ViaCord, Cord Blood Registry y Cryocell. Preferentemente, la placenta se drena por gravedad sin manipulación para llevar al mínimo el rompimiento de tejido durante el recobro de la sangre del cordón.

Por lo regular, una , placenta es transportada desde la sala de partos o alumbramiento a otro lugar, por ejemplo, un laboratorio, para recuperar la sangre de cordón y la recolección de las células madre, por ejemplo, por perfusión ó disociación de tejido.

Preferentemente, la placenta es transportada en un dispositivo de transporte estéril, térmicamente aislado (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28°C) , por ejemplo, colocando la placenta, con el cordón umbilical proximal pinzado, en una bolsa de plástico zip-lock estéril, la cual luego se coloca en un envase aislado. En otra modalidad, la placenta es transportada en un kit para recolección de sangre de cordón considerablemente como se describe en la publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos, pendiente, No. 2006/0060494. Preferentemente, la placenta es enviada al laboratorio 4 a 24 horas después del parto. En ciertas modalidades, el cordón umbilical proximal se sujeta con pinza, preferentemente 4-5 cm (centímetros) de la inserción en el disco placentario antes de 1 recuperación de la sangre del cordón. En otras modalidades, el cordón umbilical proximal se sujeta con pinza después de la recuperación de la sangre del cordón pero antes de otro procesamiento de la placenta.

La placenta, antes de la recolección de las células madre, puede ser almacenada en condiciones estériles y a temperatura ambiente o a una temperatura de 5 a 25°C (centígrados) . La placenta puede ser almacenada durante un periodo de más de 48 horas, y preferentemente durante periodo de 4 a 24 horas antes de perfundir la placenta para retirar cualquier sangre de cordón residual. La placenta preferentemente se almacena en una solución anticoagulante a una temperatura de 5 a 25°C (centígrados) . Las soluciones anticoagulantes apropiadas son bien conocidas en la técnica. Por e emplo, puede utilizarse una solución de heparina o warfarina. En una modalidad preferida, la solución anticoagulante consiste en una solución de heparina (por ejemplo 1% p/p en una solución 1:1000). La placenta exsanguinada preferentemente se almacena durante no más de 36 horas antes de que se recolecten las células madre placentarias .

La placenta de mamífero o parte de ésta, una vez recolectada y preparada generalmente como se describe antes, puede ser tratada en cualquier forma conocida en la técnica, por ejemplo, puede ser perfundida o desagregada, por ejemplo, digerida con una o más enzimas rompedoras de tejido, para obtener las células madre. 5.2.4 Rompimiento físico y digestión enzimatica del tejido placentario En una modalidad, las células madre se recolectan de una placenta de mamífero por rompimiento físico, por ejemplo, digestión enzimática, del órgano. Por ejemplo, la placenta, o una parte de ésta, puede ser, por ejemplo, triturada, cortada, picada, cortada en cubos, cortada en trozos, macerada o similares, mientras que está en contacto con la composición para la recolección de células madre de la invención, y el tejido posteriormente puede ser digerido con una o más enzimas. La placenta, o una parte de ésta, puede ser físicamente desagregada y digerida con una o más enzimas, y el material resultante entonces sumergido en, o mezclado en, la composición para recolección de células madre de la invención. Puede utilizarse cualquier método de rompimiento físico, a condición de que el método de rompimiento deje una pluralidad, más preferentemente una mayor parte, y más preferentemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ó 99% de las células del órgano viables, como se determina por, por ejemplo, la exclusión de azul de tripano.

La placenta puede ser disecada en los componentes antes del rompimiento físico y/o digestión enzimática y la recuperación de las células madre. Por ejemplo, las células madre placentarias pueden obtenerse de la membrana amniótica, al corion, el cordón umbilical, cotiledones placentarios o cualquier combinación de éstos. Preferentemente las células madre placentarias se obtienen de tejido de placenta que contiene el amnión y corion. Por lo regular, las células madre placentarias pueden obtenerse por rompimiento de un bloque pequeño de tejido placentario, por e emplo, un pedazo de tejido placentario que sea de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 1000 milímetros cúbicos de volumen.

Una composición para recolección de células madre preferida consiste en una o más enzimas desagregadotas de tejido. La digestión enzimática preferentemente utiliza una combinación de enzimas, por ejemplo, una combinación de una metaloproteasa de matriz y una proteasa neutra, por ejemplo, una combinación de colagenasa y dispasa. En una modalidad, la digestión enzimática del tejido placentario utiliza una combinación de una metaloproteasa de matriz, una proteasa neutra y una enzima mucolítica para la digestión del ácido hialurónico, como puede ser una combinación de colagenasa, dispasa y hialuronidasa o una combinación de LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) e hialuronidasa. Otras enzimas que pueden utilizarse para romper el tejido placentario incluyen papaína, desoxirribonucleasas, serina proteasas, como puede ser tripsina, quimotripsina ó elastasa. Las serina proteasas pueden ser inhibidas por alfa 2 microglobulina en suero, y por tanto, el medio que se utiliza para la digestión normalmente es libre de suero. El EDTA y Dnasa comúnmente se emplean en los procedimientos de digestión enzimática para aumentar la eficiencia de la recuperación celular. El digerido preferentemente se diluye para evitar arrastrar las células madre dentro del digerido viscoso.

Cualquier combinación de enzimas para la digestión de tejido puede utilizarse. Las concentraciones comunes para las enzimas de la digestión de tejido incluyen, por ejemplo, 50-200 U/mL para colagenasa I y colagenasa IV, 1-10 U/mL para dispasa, y 10-100 U/mL para elastasa. Las proteasas pueden utilizarse en combinación, es decir, dos o más proteasas en la misma reacción de digestión, o pueden utilizarse en secuencia para liberar las células madre placentarias . Por ejemplo, en una modalidad, una placenta, o parte de ésta, se digiere primero con una cantidad apropiada de colagenasa I a 2 mg/mL durante 30 minutos, seguido por digestión con tripsina, 0.25%, durante 10 minutos, a 37 °C. Las serina proteasas son preferentemente utilizadas en forma consecutiva luego del uso de otras enzimas.

En otra modalidad, el tejido puede además romperse por la adición de un quemador, por ejemplo, el ácido etilen glicol bis (2-aminoetil éter) -?,?,?'?'-tetraacético (EGTA) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a la composición para la recolección de células madre que contenga las células madre, o a una solución en la cual el tejido se rompa y/o se digiera antes del aislamiento de las células madre con la composición para recolección de células madre .

Se observará que donde una placenta entera, o una parte de una placenta que contenga células fetales y maternas (por ejemplo, donde la porción de la placenta contenga el corion y los cotiledones) , las células madre placentarias recolectadas contendrán una mezcla de células madre placentarias obtenidas de las fuentes fetal y materna. Donde una porción de la placenta que no contiene o contiene una cantidad insignificante de células maternas (por ejemplo, el amnión) , las células madre placentarias recolectadas contendrán casi exclusivamente células madre placentarias fetales . 5.2.5 Perfusión placentaria Las células madre placentarias también pueden obtenerse por perfusión de la placenta de mamífero. Los métodos de perfusión de la placenta de mamífero para obtener células madre están descritos, por ejemplo, en Hariri, Publicación de la Solicitud U. S. No. 2002/0123141, y en la Solicitud Provisional U. S. relacionada No. 60/754,969, titulada "Medio mejorado para recolectar células madre placentarias y preservar órganos" presentada el 29 de diciembre de 2005.

Las células madre placentarias pueden ser recolectadas por perfusión, por ejemplo, a través de la vasculatura placentaria utilizando, por ejemplo, una composición para recolección de células madre como solución de perfusión. En una modalidad, una placenta de mamífero es perfundida por el paso de la solución de perfusión a través de la arteria umbilical o la vena umbilical, o ambas. El flujo de la solución de perfusión a través de la placenta puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, flujo por gravedad hacia la placenta. Preferentemente, la solución de perfusión es dirigida hacia la placenta utilizando una bomba, por ejemplo, una bomba peristáltica. La vena umbilical puede ser, por ejemplo, canulada con una cánula, por ejemplo, una cánula de TEFLON® o plástico, que esté conectada a un aparato de conexión estéril, como puede ser tubería estéril. El aparato de conexión estéril se conecta a un colector de perfusión.

En una preparación para perfusión, la placenta preferentemente es orientada (por ejemplo, suspendida) en tal forma que la arteria umbilical y la vena umbilical estén localizadas en el punto más alto de la placenta. La placenta puede ser prefundida pasando fluido de perfusión, por ejemplo, la composición para recolección de células madre de la invención, a través de la vasculatura placentaria, o a través de la vasculatura placentaria y el tejido circundante. En una modalidad, la arteria umbilical y la vena umbilical se conectan simultáneamente a una pipeta que esté conectada a través de un conector flexible a un depósito de la solución de perfusión. La solución de perfusión se pasa hacia la vena y arteria umbilical. La solución de perfusión exuda de y/o pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos hacia los tejidos circundantes de la placenta y es recolectada en un recipiente abierto apropiado desde la superficie de la placenta que estuvo unida al útero de la madre durante la gestación. La solución de perfusión también puede ser introducida a través de la abertura del cordón umbilical y fluir o percolar de los orificios de la pared de la placenta que formaron la interfaz con la pared uterina materna. En otra modalidad, la solución de perfusión pasa a través de las venas umbilicales y se recolecta de la arteria umbilical, o se pasa a través de la arteria umbilical y se recolecta de las venas umbilicales .

En una modalidad, el cordón umbilical proximal se sujeta con pinza durante la perfusión, y más preferentemente se sujeta dentro de 4-5 cm (centímetros) de la inserción del cordón en el disco placentario.

La primera recolección del fluido de perfusión a partir de una placenta de mamífero durante el proceso de exsanguinación generalmente es colorido con las células sanguíneas rojas residuales de la sangre del cordón y/o de la sangre placentaria. El fluido de perfusión se vuelve más incoloro a medida que procede la perfusión y las células sanguíneas residuales del cordón salen de la placenta. En general, desde 30 hasta 100 mL (mililitros) del fluido de perfusión es adecuado para exsanguinar inicialmente la placenta, pero puede utilizarse más o menos fluido de perfusión dependiendo de los resultados que se observen.

El volumen líquido de perfusión que se utilice para recolectar las células madre placentarias puede variar dependiendo de la cantidad de células madre que se recolecten, el tamaño de la placenta, la cantidad de recoleccione que se hagan de una sola placenta, etc. En diversas modalidades, el volumen del liquido de perfusión puede ser desde 50 mL hasta 5000 mL, 50 mL hasta 4000 mL, 50 mL hasta 3000 mL, 100 mL hasta 2000 mL, 250 mL hasta 2000 mL, 500 mL hasta 2000 mL, ó 750 mL hasta 2000 mL. Por lo regular, la placenta es perfundida con 700-800 mL del liquido de perfusión luego de la exsanguinacion.

La placenta puede ser prefundida varias veces durante el curso de varias horas o varios dias . Cuando la placenta va a ser prefundida una pluralidad de veces, ésta puede mantenerse o cultivarse en condiciones asépticas en un envase u otro recipiente adecuado, y prefundida con la composición para recolección de células madre, o una solución de perfusión normal (por ejemplo, solución salina normal como puede ser salina amortiguada con fosfatos ("PBS")) con o sin un anticoagulante (p. e . , heparina, warfarina sódica, coumarina, bishidroxicoumarina) , y/o con o sin un agente antimicrobiano (p. e . , y-mercaptoetanol (0.1 mM) ; antibióticos como estreptomicina (p. ej . , a 40-100 µg/mL) , penicilina (p. ej . , a 40U/mL) , anfotericina B (p. ej . , a 0.5 µg/mL) . En una modalidad, una placenta aislada se mantiene o cultiva durante un tiempo sin recolectar el perfundido, de modo que la placenta se mantenga o cultive durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 horas, ó 2 ó 3 o más días antes de la perfusión y recolección del prefundido. La placenta perfundida puede mantenerse durante una o más veces adicionales, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más horas, y perfundida una segunda vez con, por ejemplo, 700-800 mL del fluido de perfusión. La placenta puede ser perfundida 1, 2, 3, 4, 5 o más veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas . En una modalidad preferida, la perfusión de la placenta y la recolección de la solución de perfusión, por ejemplo, la composición para recolección de células madre, se repite hasta que la cantidad de células nucleadas recuperadas cae por debajo de 100 células/mL. Los perfundidos en diferentes puntos de tiempo pueden además ser procesados individualmente para recuperar poblaciones de células dependientes del tiempo, por ejemplo, células madre. Los perfundidos de diferentes puntos de tiempo también pueden ser mezclados.

Sin pretender apegarse a alguna teoría, después de la exsanguinacion y un tiempo suficiente de perfusión de la placenta, se considera que las células madre placentarias migran hacia la microcirculación exsanguinada y perfundida de la placenta donde, de acuerdo con los métodos de la invención, estas son recolectadas, preferentemente lavando hacia un vaso de recolección por perfusión. La perfusión de la placenta aislada no solo sirve para eliminar la sangre de cordón residual sino también proporciona a la placenta los nutrientes apropiados, como el oxigeno. La placenta puede ser cultivada y perfundida con una solución semejante la cual se utilizó para retirar las células sanguíneas de cordón residuales, preferentemente, sin la adición de agentes anticoagulantes .

La perfusión de acuerdo con los métodos de la invención da como resultado la recolección de significativamente más células madre placentarias que el número que puede obtenerse de una placenta de mamífero no perfundida con la solución, y no tratada de otro modo para obtener células madre (por ejemplo, por rompimiento de tejido, por ejemplo, digestión enzimática) . En este contexto, "significativamente más" significa al menos 10% más . La perfusión de acuerdo con los métodos de la invención produce significativamente más células madre placentarias que, por ejemplo, el número de células madre placentarias que puede obtenerse del medio de cultivo en el cual se ha cultivado una placenta o una parte de ésta.

Las células madre pueden ser aisladas de placenta por perfusión con una solución que contenga una o más proteasas u otras enzimas rompedoras de tejido. En una modalidad especifica, una placenta o parte de ésta (por ejemplo, membrana amniótica, amnión y corion, lóbulo placentario o cotiledón, cordón umbilical o una combinación de cualquiera de las anteriores) se lleva a 25-37°C, y se incuba con una o más enzimas rompedoras de tejido en 200 mL de un medio de cultivo durante 30 minutos. Las células del prefundido se recolectan, se llevan a 4°C, y se lavan con una mezcla fría de inhibidores que contenga EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM y beta-mercaptoetanol 2 mM. Las células madre se lavan después de varios minutos con una composición fría (por ejemplo, 4°C) para la recolección de células madre de la invenció .

Se observará que la perfusión que utiliza el método pan, es decir, mediante el cual se recolecta el prefundido después de que ha sido exudado del lado materno de la placenta, da como resultado una mezcla de células fetales y maternas. Como resultado, las células recolectadas por este método contienen una población mixta de células madre placentarias de origen fetal y materno. Por el contrario, la perfusión solamente a través de la vasculatura placentaria, con lo cual el fludio de la perfusión se pasa a través de uno o dos recipientes placentarios y se recolecta solamente a través de los recipientes restantes, da como resultado la recolección de una población de células madre placentarias casi exclusivamente de origen fetal. 5.2.6 Aislamiento, clasificación y_ caracterización de las células madre placentarias Las células madre de placenta de -mamífero, ya sean obtenidas por perfusión o digestión enzimática, inicialmente pueden ser purificadas a partir de (es decir, aisladas de) otras células por centrifugación en gradiente Ficoll . Tal centrifugación puede seguir cualquier protocolo normalizado para la velocidad de centrifugación, etc. En una modalidad, por ejemplo, las células recolectadas de la placenta se recuperan del prefundido por centrifugación a 5000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente, lo cual separa las células de, por ejemplo, desechos contaminantes y plaquetas . En otra modalidad, el prefundido placentario se concentra a aproximadamente 200 mL, se estratifica suavemente sobre Ficoll, y se centrifuga a aproximadamente 1100 x g durante 20 minutos a 22 °C, y la capa interfaz de baja densidad de las células se recolecta para otro procesamiento.

Los sedimentos o paquetes celulares pueden ser resuspendidos en la composición para recolección de células madre fresca o un medio apropiado para el mantenimiento de las células madre, por ejemplo, medio IMDM libre de suero que contenga 2U/mL de heparina y EDTA 2mM (GibcoBRJL, NY) . La fracción total de células mononucleares puede ser aislada, por ejemplo, utilizando LYMPHOPREP™ (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento sugerido por el fabricante.

Cuando se utiliza en la presente, "aislamiento" de células madre placentarias significa separar al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 99% de las células con las cuales las células madre normalmente se asocian en la placenta intacta de mamífero . Una célula madre de un órgano se "aisla" cuando ésta se presenta en una población de células que contiene menos de 50% de las células con las cuales la célula madre normalmente está asociada en el órgano intacto .

Las células madre placentarias obtenidas por perfusión o digestión pueden, por ejemplo, ser además, o inicialmente, aisladas por tripsinización diferencial utilizando, por ejemplo, una solución de tripsina al 0.05% con EDTA al 0.2% (Sigma, St. Louis MO) . La tripsinización diferencial es posible porque las células madre placentarias por lo regular se desprenden de las superficies de plástico en aproximadamente cinco minutos, mientras que otras poblaciones adherentes por lo regular requieren más de 20-30 minutos de incubación. Las células madre placentarias desprendidas pueden ser cosechadas luego de la tripsinización y neutralización con tripsina, utilizando, por ejemplo, Solución Neutralizante de Tripsina (TNS, Cambrex) . En una modalidad del aislamiento de las células adherentes, alícuotas de, por ejemplo, aproximadamente 5-10 x 10° células se colocan en cada uno de los diferentes matraces T-75, preferentemente matraces T75 recubiertos con fibronectina. En una modalidad como ésta, las células pueden ser cultivadas con Medio de Crecimiento de Células Madre Mesenquimáticas (MSCGM) (Cambrex) disponible en el comercio, y colocadas en un incubador de cultivo de tejido (37°C, 5% C02) · Después de 10 a 15 días, las células no adherentes se retiran de los matraces lavando con PBS . El PBS se sustituye entonces por MSCGM. Preferentemente los matraces se examinan diario para revisar la presencia de diferentes tipos de células adherentes, y en particular, para la identificación y expansión de grupos de células fibroblastoides .

La cantidad y tipo de células recolectadas de una placenta de mamífero puede ser verificada, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de la superficie celular utilziando las técnicas de detección celular normalizadas, como puede ser citometría de flujo, clasificación celular, inmunocitoquímica (p. ej . , mediante la tinción con anticuerpos específicos de tejido o específicos del marcador celular), clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , clasificación de células por activación magnética (MACS) , por examen de la morfología de las células utilizando microscopía luminosa o confocal y/o midiendo los cambios en la expresión génica utilizando técnicas bien conocidas en la materia, como puede ser PCR y determinación de la expresión génica. Estas técnicas pueden utilizarse, también, para identificar células que sean positivas para uno o más marcadores específicos. Por ejemplo, utilizando anticuerpos para CD34, es posible determinar, utilizando las técnicas anteriores, si una célula contiene una cantidad detectable de CD34; si es así, la célula es CD34+. Del mismo modo, si una célula produce sifuciente RNA de OCT-4 para ser detectable por RT-PCR, o mucho más RNA de OCT-4 que una célula adulta, la célula es 0CT-4+. Los anticuerpos para los marcadores de la superficie celular (p. ej . , marcadores CD como puede ser CD34) y la secuencia de los genes específicos de la célula madre, como OCT-4, son bien conocidos en la técnica.

Las células placentarias, particularmente las células que han sido aisladas por separación Ficoll, adherencia diferencial, o una combinación de ambas, pueden ser clasificadas utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) . La clasificación o selección de células activadas por fluorescencia (FACS) es un método bien conocido para separar partículas, incluidas las células, con base en las propiedades fluorescentes de las partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). La excitación láser de porciones fluorescentes en las partículas individuales da como resultado una pequeña carga eléctrica que permite la separación electromagnética de partículas positivas y negativas a partir de una mezcla. En una modalidad, los anticuerpos o ligandos específicos del marcador de la superficie celular se etiquetan con distintas etiquetas fluorescentes. Las células se procesan a través del clasificador celular, permitiendo la separación de las células con base en su capacidad para unirse a los anticuerpos que se utilizan. Las partículas clasificadas por FACS pueden ser directamente depositadas en pozos individuales de placas de 96 ó 384 pozos para facilitar la separación y clonación.

En un esquema de clasificación, las células madre de la placenta se clasifican con base en la expresión de los marcadores CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 y/o HLA-G. Esto se puede lograr en relación con ' procedimientos para seleccionar células madre con base en sus propiedades de adherencia en cultivo. Por ejemplo, una selección de adherencia puede lograrse antes o después de la clasificación con base en la expresión del marcador. En una modalidad, por ejemplo, las células se clasifican primero con base en su expresión de CD34; células CD34" son retenidas, y las células que son CD200+HLA-G+, se separan de todas las otras células CD34". En otra modalidad, las células de placenta están basadas en su expresión de marcadores CD200 y/o HLA-G; por ejemplo, las células que presentan cualquiera de estos marcadores se aislan para uso posterior. Las células que expresan, por ejemplo, CD200 y/o HLA-G pueden, en una modalidad específica, ser además clasificadas con base en su expresión de CD73 y/o CD 105, o los epítopes reconocidos por los anticuerpos SH2, SH3 ó SH4, o la falta de expresión de CD34, CD38 ó CD45. Por ejemplo, en una modalidad, las células placentarias se clasifican por la expresión, o falta de, CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 y CD45, y las células placentarias que son CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34", CD38" y CD45" se aislan de otras células placentarias para uso posterior.

En otra modalidad, es posible utilizar perlas magnéticas para separar células. Las células pueden ser clasificadas utilizando una técnica de clasificación de células por activación magnética (MACS) , un método para separar partículas con base en su capacidad para unirse a las perlas magnéticas (de 0.5-100 um de diámetro) . Una variedad de modificaciones útiles puede hacerse en las microesferas magnéticas, incluida la adición covalente de anticuerpos que reconozcan específicamente una molécula de superficie celular particular o hapteno. Las perlas entonces se mezclan con las células para permitir la unión. Luego las células se pasan a través de un campo magnético para separar las células que tengan el marcador de superficie celular específico. En una modalidad, estas células pueden luego ser aisladas y nuevamente mezcladas con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores de superficie celular adicionales . Las células otra vez se pasan a través de un campo magnético, separando las células que se unen a los anticuerpos. Estas células pueden ser entonces diluidas en placas separadas, como pueden ser las placas de microtitulación para aislamiento clonal.

Las células madre placentarias también pueden ser caracterizadas y/o clasificadas con base en la morfología celular y características de crecimiento. Por ejemplo, las células madre placentarias pueden ser caracterizadas teniendo, y/o seleccionadas con base en, por ejemplo, una apariencia fibroblastoide en cultivo. Las células madre placentarias también se pueden caracterizar por tener, y/o ser seleccionadas, con base en su capacidad para formar cuerpos tipo embrioide. En una modalidad, por ejemplo, las células placentarias que son de forma fibroblastoide, expresan CD73 y CD 105, y producen uno o más cuerpos tipo embrioide en cultivo, se aislan de otras células placentarias. En otra modalidad, células placentarias OCT-4+ que producen uno o más cuerpos tipo embrioide en cultivo se aislan de otras células placentarias .

En otra modalidad, las células madre placentarias pueden ser identificadas y caracterizadas por un ensayo de unidades formadoras de colonias. Los ensayos de unidades formadoras de colonias son comúnmente conocidos en la técnica, como puede ser el medio MESENCULT™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia) .

Las células madre placentarias pueden ser ensayadas para la viabilidad, potencial de proliferación y longevidad utilizando las técnicas normalizadas conocidas en la materia, como puede ser el ensayo de exclusión de azul de tripano, el ensayo de captación de diacetato de fluoresceina, el ensayo de captación de yoduro de propidio (para ensayar la viabilidad) ; y el ensayo de captación de timidita, el ensayo de proliferación de células MTT (para ensayar la proliferación) . La longevidad puede determinarse por los métodos bien conocidos en la materia, como puede ser por determinación del número máximo de duplicación de la población en un cultivo extendido .

Las células madre placentarias también pueden ser separadas de otras células placentarias utilizando otras técnicas conocidas en la materia, p. ej . , el crecimiento selectivo de las células deseadas (selección positiva) , destrucción selectiva de células no deseadas (selección negativa) ; separación basada en la aglutinabilidad diferencial de las células en la población mixta como, por ejemplo, con aglutinina de soya; procedimientos de congelación-descongelación; filtración; centrifugación tradicional y zonal; elutriación centrifugal (centrifugación a contracorriente) ; separación por gravedad unitaria; distribución a contracorriente; electroforesis y similares. 5.3 CULTIVO DE CÉLULAS MADRE UTILIZANDO BIOFABRICA DE COLÁGENO La presente invención proporciona los métodos para cultivar una célula madre, en particular, el cultivo de una célula madre embriónica o célula madre placentaria. Los métodos comprenden el paso de cultivar una célula madre en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno. En una modalidad, la célula madre es exógena a la biofábrica de colágeno, es decir, la célula madre no es de una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno .

En algunas modalidades, los métodos consisten en cultivar una célula madre con una biofábrica de colágeno que contiene una pluralidad de células madre placentarias; y cultivar la célula madre en condiciones apropiadas para la supervivencia de la célula madre.

La célula madre puede ser cultivada durante un tiempo de acuerdo con el experto en la técnica. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno durante al menos uno, dos, cinco, diez, quince, veinte o veinticuatro horas o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva durante al menos dos, cinco, siete, diez, catorce, veinte, veinticinco o treinta días o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva desde aproximadamente dos horas a aproximadamente veinticuatro horas, desde aproximadamente dos horas a aproximadamente siete dias, desde aproximadamente dos horas a aproximadamente catorce dias, desde aproximadamente dos horas a aproximadamente treinta dias, desde aproximadamente veinticuatro horas a aproximadamente dos dias, desde aproximadamente veinticuatro horas a aproximadamente siete dias, desde aproximadamente veinticuatro horas a aproximadamente catorce dias ó desde aproximadamente veinticuatro horas a aproximadamente treinta dias .

Las células madre pueden ser cultivadas en condiciones apropiadas para el crecimiento de las células madre, bien conocidas para el experto en la técnica. La temperatura de cultivo de las células madre puede ser, por ejemplo, desde aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40°C, desde aproximadamente 30°C a aproximadamente 50°C, desde aproximadamente 35°C a aproximadamente 40°C, desde aproximadamente 35°C a aproximadamente 50°C, desde aproximadamente 35°C a aproximadamente 40°C, desde aproximadamente 35°C a aproximadamente 45°C, o desde aproximadamente 35°C a aproximadamente 50°C. La temperatura para el cultivo de las células madre puede ser, por ejemplo, alrededor de 35°C, aproximadamente 36°C, aproximadamente 38 °C, aproximadamente 39°C ó aproximadamente 40 °C, preferentemente alrededor de 37 °C. El nivel de C02 en el ambiente de cultivo puede ser, por ejemplo, desde aproximadamente 3% de CO2 a aproximadamente 20% de C02, desde aproximadamente 5% de C02 a aproximadamente 20% de C02, desde aproximadamente 4% de C02 a aproximadamente 10% de CO2, ó alrededor de 5% de C02.

Las técnicas generales para el cultivo de células madre, útiles en la práctica de la invención, se describen en, por ejemplo, las Patentes U. S. Nos. 6,387,367 y 6,200,806; la publicación de la Solicitud de Patente ü. S. No. 2006/0057718; véase también Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds . , Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Propezties and Uses of Embryonic Stem Cells: Prospecte fox Application to Human Biology and Gene Therapy (P. D. Rathjen et al., Reprod. Fértil. Dev. 10:31, 1998) .

En ciertas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene células endógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno. Estas células incluyen, más no se limitan a, células madre placentarias, células progenitoras, células pluripotentes y células multipotentes . En algunas modalidades, las células son células adherentes derivadas de placenta humana .

En ciertas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene células exógenas a una placenta de la cual se obtienen la biofábrica de colágeno . Tales células pueden ser, por ejemplo, células alimentadoras, co-cultivadas con las células madre de la invención. En algunas modalidades, la célula madre cultivada es una célula madre humana y las células alimentadoras son de origen humano. Las células alimentadoras pueden ser cualquier célula alimentadora conocida para los expertos en la técnica, incluido, más no limitado a, fibroblastos embriónicos primarios de ratón (PMEF) , linea celular de fibroblastos embriónicos de ratón (MEF) , fibroblastos fetales murinos (MFF) , fibroblastos embriónicos humanos (HEF) , células musculares fetales humanas (HFM) , células de piel fetal humana (HFS) , células de piel adulta humana, fibroblastos de prepucio humano (HFF) , células epiteliales del tubo de Falopio adulto humano (HAFT) o células estromales de médula humana (hMSCs) , como está descrito, p. ej . , en WO 03/02944, WO 03/014313, Park et al, Biol. Reprod., 69:2007-2017, 2003, ¾mit et al, Biol. Reprod. , 68 ( 6) : 2150-2156, 2003, Hovattal et al, Huía. Reprod. , 18 (7): 1404-1409, 2003, Richards et al., Wat Biotechnol, 20 (9) : 933-936, 2002, James et al, Science, 282 (6): 1145-1147, 1998 y Cheng et al, Stem Cells, 21: 131-142, 2003.

En algunas modalidades, la biofabrica de colágeno consiste en una combinación de células endógenas y exógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno.

En la presente invención, las células madre cultivadas con una biofábrica de colágeno son exógenas a la biofábrica de colágeno. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno es procesada para preparar todas las células endógenas para permitir a las células madre exógenas ser cultivadas. Los métodos para la separación de las células endógenas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células endógenas pueden ser separadas utilizando un detergente suave, por ejemplo, ácido desoxicólico . En otra modalidad, las células endógenas son aniquiladas antes de cultivar una célula madre. Los métodos de aniquilación o muerte de células son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la biofábrica de colágeno puede ser irradiada con radiación electromagnética, rayos UV, rayos X, radiación gama o beta para erradicar todas las células endógenas viables restantes . En una modalidad, la exposición subletal a radiaciones por ejemplo, 500 a 1500 cGy puede utilizarse para preservar la placenta pero erradicar las células no deseadas. El Capitulo 5 de "Efectos biofisicos y biológicos de la radiación ionizante" del Departamento de Defensa de Estados Unidos, por ejemplo, proporciona normas internacionales sobre radiación ionizante letal y no letal.

Las células madre pueden ser plaqueadas sobre la biofábrica de colágeno en una forma de distribución apropiada y en presencia de un medio de cultivo que favorezca la supervivencia y crecimiento celular. Las células madre pueden ser plaqueadas en la biofábrica de colágeno en cualquier momento y en cualquier forma de acuerdo con el juicio del experto en la técnica. Por ejemplo,- la biofábrica de colágeno puede ser depositada a un cultivo de células madre en el momento de pasar las células o como parte de una alimentación normal. De otro modo, las células madre pueden ser plaqueadas sobre la biofábrica de colágeno directamente después de la separación.

El número de células madre o progenitoras plaqueadas sobre la superficie de la biofábrica de colágeno puede variar, pero puede ser al menos 1 x 103, 3 x 103, 1 x 104, 3 x 104, 1 x 105, 3 x 105, 1 x 106, 3 x 106, 1 x 107, 3 x 107, 1 x 108, 3 x 108, 1 x 109, 3 x 109, 1 x 1010, 3 x 1010, 1 x 1011, 3 x 1011 ó 1 x 1012 células madre; o puede ser no más de 1 x 103, 3 x 103, 1 x 104, 3 x 10 1 x 10% 3 x 10s, 1 x 106, 3 x 10s, 1 x 107, 3 x 107, 1 x 108, 3 x 108, 1 x 109, 3 x 109, 1 x 1010, 3 x 1010, 1 x 1011, 3 x 1011 ó 1 x 1012 células madre o progenitoras.

En otra modalidad de cualquiera de las modalidades de cultivo de la presente, las células madre se cultivan sobre un biomaterial basado en colágeno obtenido de cordón umbilical, p. ej . , a partir de la membrana del cordón umbilical. En una modalidad preferida, el biomaterial obtenido de cordón umbilical es descelularizado y procesado considerablemente como se describe en la presente para la preparación de la biofábrica de colágeno. Preferentemente, las células madre se cultivan en hojas considerablemente planas o piezas del biomaterial del cordón umbilical. 5.3.1 Medio de cultivo Una vez aisladas o separadas, las células madre se cultivan en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno. El medio de cultivo puede ser cualquier medio de cultivo apropiado para cultivar células madre, por ejemplo, medio de cultivo apropiado para cultivar células madre en una condición libre de células alimentadoras . Medio de cultivo como éste puede ser, más no se limita a, aquellos descritos en la Patente U. S. No. 6,800,480, la Publicación de la Solicitud U. S. No. 2005/0153445. En una modalidad especifica, el medio de cultivo que puede utilizarse en la presente invención contiene aproximadamente 500 mL de agua destilada; 60 mL de DMEM (Gibco-BRL) ; aproximadamente 40 mL de MCDB201 (Sigma) disuelto en agua, pH 7.2; aproximadamente 2 mL de FCS (Hyclone) ; aproximadamente 1 mL 100x ITS (insulina transíerrina selenio; Sigma) ; pen&strep; aproximadamente 10 ng/mL de LA; albúmina sérica de bovino; aproximadamente 50 nM de dexametasona (Sigma) ; aproximadamente 10 ng/mL de PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas; y aproximadamente 10 ng/mL de EGF (factor de crecimiento epidérmico) .

Los medios utilizados pueden o no contener suero, aunque los expertos en la técnica reconocen que puede ser ventajoso utilizar medios libres de suero de modo que las células no estén expuestas a patógenos portados en el suero .

Los expertos en la técnica se darán cuenta que los medios de cultivo pueden ser suplementados con uno o más factores de expansión para facilitar el cultivo o la expansión, dependiendo del tejido del cual se deriven originalmente las células madre o al tejido para el cual estas serán diferenciadas. Por ejemplo, para células madre embriónicas, los factores de expansión ex vivo pueden incluir uno o más de los siguientes: FGF , Wnt-3a, colágeno, fibronectina y laminina. Para las células madre mesenquimáticas, por ejemplo, factores de expansión ex vivo pueden incluir uno o más de FGF , EGF, PDGF y fibronectina. Los factores de expansión ex vivo pueden ser uno o más de los siguientes: FGF , EGF, PDGF y fibronectina. Para células madre hematopoyéticas, los factores de expansión ex vivo pueden ser uno o más de los siguientes: IL-3, IL-6, SCF, Flt-3/Flk-2, Tpo, Shh, Wnt-3a y irre. Para células madre neurales, los factores de expansión ex vivo pueden ser FGF , EGF, fibronectina y cistatina C.

En algunas modalidades, se utiliza medio acondicionado con biofábrica de colágeno para cultivar células madre. El medio acondicionado cuando se utiliza en la presente se refiere al medio en el que las células alimentadoras han sido cultivadas ya durante un tiempo suficiente.

Los expertos en la técnica comprenderán que los medios de cultivo diferentes pueden utilizarse dependiendo del objetivo de cultivar (cultivo, expansión o diferenciación de una célula madre) , el origen del cual se obtienen las células madre, el tipo de células al cual las células madre pueden ser inducidas a diferenciar, la biofábrica de colágeno que se utilice en el cultivo y la presencia o ausencia de células que no sean células madre . 5.4 EXPANSIÓN DE LAS CÉLUIAS MADRE UTILIZANDO BIOFÁBRICA DE COLÁGENO La presente invención proporciona los métodos para expandir una célula madre o población de células madre que consiste en cultivar una célula madre o población de 'células madre en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno en condiciones que permitan a la célula madre o población de células madre expanderse o reproducirse .

La célula madre o población de células madre pueden cultivarse en condiciones apropiadas y durante un tiempo de acuerdo con los expertos en la técnica. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno durante 24 horas o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva durante 2 días o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva durante 7 días o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva durante 10 días o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva durante 14 días o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva durante 30 días o más.

En algunas modalidades, una sola célula madre, o aproximadamente, o al menos, o no más de 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1 x 103, 5 x 103, 1 x 104 ó 5 x 10" células madre se expanden en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno. En otras modalidades, las células madre se cultivan y expanden de acuerdo con el método de la invención y el número de células madre se aumenta 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1 x 10a, 5 x 103, 1 x 104 ó 5 x 104 veces en comparación con el número de células madre originalmente cultivadas. En otras modalidades, el número de células madre en el cultivo se aumenta a aproximadamente, o al menos, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011, ó 1 x 1012 células madre; o pueden ser no más de 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011, ó 1 x 1012 células madre . 5.5 DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE UTILIZANDO BIOFÁBRICA DE COLÁGENO La invención proporciona los métodos para diferenciar una célula madre, que consisten en cultivar una célula madre en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno durante un tiempo suficiente para la diferenciación de la célula madre. La invención comprende los métodos de la diferenciación de una célula madre en un lina e de células especifico que incluye, más no se limita a, linaje mesenquimático, hematopoyético, adipogénico, hepatogénico, neurogénico, gliogénico, condrogénico, vasogénico, biogénico, pancreagénico, condrogénico u osteogénico.

Los expertos en la técnica comprenderán que el tiempo suficiente para la diferenciación de una célula madre puede variar dependiendo del tipo de célula madre cultivada y el tipo de célula al cual se diferencia la célula madre. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno durante al menos, aproximadamente o no más de uno, dos, cinco, diez, quince, veinte o veinticuatro horas o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva al menos, aproximadamente o no más de dos, cinco, siete, diez, catorce, veinte, veinticinco o treinta días o más. En algunas modalidades, la célula madre se cultiva durante aproximadamente dos horas a aproximadamente veinticuatro horas, desde aproximadamente dos horas a aproximadamente siete días, desde aproximadamente dos horas a aproximadamente catorce días, desde aproximadamente dos horas a aproximadamente treinta días, desde aproximadamente veinticuatro horas a aproximadamente dos días, desde aproximadamente veinticuatro horas a aproximadamente siete días, desde aproximadamente veinticuatro horas a aproximadamente catorce días o desde aproximadamente veinticuatro horas a aproximadamente treinta días .

En ciertas modalidades, los métodos además comprenden poner en contacto la célula madre con uno o más agentes que faciliten la diferenciación deseada. Por ejemplo, el agente puede inducir o facilitar un cambio en el fenotipo, favorecer el crecimiento de las células con un fenotipo particular o hacer lento el crecimiento de otras, o actuar en concierto con otros agentes a través de un mecanismo desconocido. Tales agentes pueden ser moléculas pequeñas o citocinas, como pueden ser aquellas descritas en la publicación de la Solicitud US No. 2003/0235909, 2004/0028660 (moléculas pequeñas), la Patente U. S. No. 6,335,195 (células madre hematopoyéticas y mesenquimáticas en presencia de angiotensinógeno y angiotensina) , Patente U. S. No. 6,022,743 (cultivo tridimensional de células del parénquima pancreático), Patente ü. S. No. 6,613,568 (linaje hematopoyético) .

Las células madre pueden ser diferenciadas en cualquier medio de cultivo o condiciones apropiadas para la diferenciación de la célula madre, como puede ser lo que está descrito en la publicación de la Solicitud U. S. Nos. 2005/015344 y 2005/0158855 (general), los números de Patente U. S. 6,833,269 y 6,887,706 y la Publicación de la Solicitud U. S. No. 2005/0095706 (células neurales) , la Publicación de la Solicitud U. S. No. 2005/0170502 (lina e hepático) , Kehat, 2003, Methods in Enzymology 365:465-473, Publicación de Solicitud U. S. Nos. 2005/0191744 y 2005/0214939 (células cardiacas), y Assady et al, 2001, Diabetes, 50:1691-97 (células pancreáticas).

La evaluación del estado de diferenciación de las células madre obtenidas de acuerdo con los métodos de la invención puede identificarse por la presencia o ausencia de ciertos marcadores de la superficie celular. Las células madre placentarias, por ejemplo, pueden ser identificadas por los marcadores OCT-4 y ABC-p, o los equivalentes de éstos en diferentes especies de mamífero. Las células madre placentarias también pueden ser identificadas por la presencia de los marcadores CD73 ó CD 105, y/o la ausencia de los marcadores CD34, CD38 ó CD45, o los equivalentes de éstos en diferentes especies de mamífero. En ciertas modalidades, las células madre placentarias son positivas para SSEA3 y/o SSEA4. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias son negativas para SSEA3 y/o SSEA4. La presencia o ausencia de tales marcadores de la superficie celular puede determinarse de manera rutinaria de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por citometria de flujo. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD34 ó CD38, las células pueden ser lavadas en PBS y luego se hace una doble tinción con anti-CD34 ficoeritrina y anti-CD38 isotioacianato de fluoresceina (Becton Dickinson, Mountain View, California) .

En otra modalidad, las células madre diferenciadas se identifican y caracterizan por un ensayo de unidades formadoras de colonias, el cual es conocido en la técnica, como puede ser el medio MESENCULT™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia) .

La determinación que una célula madre se ha diferenciado en un tipo de célula particular se puede llevar a cabo por los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de la superficie celular utilizando técnicas como citometria de flujo e inmunocitoquímica (por ejemplo, la tinción de células con anticuerpos específicos del tejido o específicos del marcador celular) , por examen de la morfología de las células utilizando microscopía luminosa o confocal o midiendo los cambios en la expresión génica utilizando las técnicas bien conocidas en la materia, como puede ser PCR y el perfil de la expresión génica.

En ciertas modalidades, las células diferenciadas pueden ser identificadas caracterizando los genes que se expresan diferencialmente, por ejemplo, comparando el nivel de expresión de una pluralidad de genes a partir de una célula madre o progenitora indiferenciada que interese al nivel de la expresión de la pluralidad de genes en una célula diferenciada derivada de este tipo de célula progenitora. Por ejemplo, los métodos de amplificación de ácidos nucleicos, como puede ser la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o los métodos de amplificación basados en la transcripción (por ejemplo, transcripción in vitro (IVT) ) pueden utilizarse para determinar la expresión génica en diferentes poblaciones de células, por ejemplo, mediante el uso de microarreglo de polinucleótidos . Tales métodos para determinar la expresión génica diferencial son bien conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Wieland et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2720-2724; Lisitsyn et al, 1993, Science 259: 946-951; Lisitsyn et al, 1995, Meth. Enzymol. 254:291- 304; Patente U. S. No. 5,436,142; Patente U. S. No. 5,501,964; Lisitsyn et al, 1994, Nature Genetics 6:57-63; Hubank and Schatz, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 5640-5648; Zeng et al, 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385; Patente U. S. No . 5,525,471; Linsley et al., Patente U. S. No . 6,271,002; Van Gelder et al., Patente U. S. No. 5,716,785; Stoflet et al, 1988, Science 239:491-494; Sarkar and Sommer, 1989, Science 244:331-334; Mullís et al, Patente U. S. No. 4,683,195; Malek et al, Patente U. S. No. 5,130,238; Kacian and Fultz, Patente U. S. No. 5,399,491; Burg et al, Patente U. S. No. 5,437,990; van Gelder et al, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1663; Lockhart et al, 1996, Nature Biotechnol 14:1675; Shannon, Patente U. S. No. 6,132,997; Lindemann et al, Patente U. S. No. 6,235,503. 5.5.1 Diferenciación en una célula neural En un aspecto, la presente invención comprende un método para la diferenciación de una célula madre en una célula neural que consiste en cultivar la célula madre sobre la biofábrica de colágeno en condiciones que favorezcan la diferenciación de la célula madre en una célula neural. En ciertas modalidades, el método comprende el paso de poner en contacto la célula madre con uno o más agentes que faciliten la diferenciación de una célula madre en una célula neural. Los agentes ejemplares pueden ser, más no se limitan a, betamercaptoetanol (Woodbury et al., J. Neurosci. Res., 61: 364-370) ó hidroxianisol butilado. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene uno o más agentes. Cualquier medio de cultivo adecuado para la diferenciación neural conocido en la técnica puede utilizarse en el cultivo celular. Por ejemplo, la diferenciación puede ser inducida cultivando una célula madre en medio DMEM que contenga 2% de DMSO e hidroxianisol butilado 200 µ? hasta que se observe la diferenciación.

La evaluación y determinación que una célula madre se ha diferenciado en un tipo de célula neural puede llevarse a cabo por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse RT/PCR para evaluar la expresión de, por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento del nervio y genes de cadena pesada del neurofilamento . En algunas modalidades, la célula neural presenta producción del receptor del factor de crecimiento del nervio; expresión de un gen que codifique el factor de crecimiento del nervio; la producción de la cadena pesada del neurofilamento; o la expresión de un gen que codifica la cadena pesada del neurofilamento . 5.5.2 Diferenciación en una célula adipocito En otro aspecto, la presente invención comprende los métodos de diferenciación de una célula madre en un adipocito, que consiste en cultivar la célula madre en la biofábrica de colágeno en condiciones que favorezcan la diferenciación de la célula madre en una célula adipocito. En algunas modalidades, la célula adipocito presenta producción de vesículas de lípidos intracitoplásmicos detectables por una tinción lipofílica; la expresión de un gen que codifica lipasa; o la producción de lipasa. En ciertas modalidades, la diferenciación consiste en poner en contacto la célula madre con la biofábrica de colágeno y uno o más agentes que faciliten la diferenciación de una célula madre en un adipocito. Los agentes ejemplares son dexametasona, indometacina, insulina y 3-isobutil-l-metilxantina. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene el uno o más agentes .

Cualquier medio de cultivo apropiado para la diferenciación del adipocito conocidos en la técnica pueden utilizarse en el cultivo celular. Por ejemplo, para inducir la diferenciación puede utilizarse el Medio de Mantenimiento de la Adipogenesis (Bio Whittaker) que contiene dexametasona 1 uM, indometacina 0.2 mM, 0.01 mg/mL de insulina, IBMX 0.5 mM, glucosa alta en DMEM, FBS, y antibióticos.

La determinación que una célula madre se ha diferenciado en un tipo de célula adipocito puede llevarse a cabo por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la adipogénesis puede evaluarse por el desarrollo de múltiples vesículas de lípidos intracitoplásmicos que pueden observarse fácilmente utilizando la tinción lipofílica aceite rojo 0. La diferenciación también se puede establecer detectando la expresión de lipasa y genes de proteínas de unión a ácidos grasos utilizando, por ejemplo, RT-PCR. 5.5.3 Diferenciación en una célula condrocito En otro aspecto, la presente invención comprende los métodos de diferenciación de una célula madre en un condrocito, que consiste en cultivar la célula madre sobre la biofábrica de colágeno en condiciones que favorezcan la diferenciación de la célula madre en un condrocito. En algunas modalidades, el condrocito presenta morfología celular característica de un condrocito; la producción de colágeno 2; la expresión de un gen que codifica colágeno 2; la producción de colágeno 9; o la expresión de un gen que codifica colágeno 9. En ciertas modalidades, la diferenciación consiste en poner en contacto la célula madre con la biofábrica de colágeno sola y uno o más agentes que faciliten la diferenciación de una célula madre en una célula condrocito. Los agentes ejemplares son factor de crecimiento transformante beta-3. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene uno o más agentes .

En el cultivo celular es posible utilizar cualquier medio de cultivo apropiado para la diferenciación del condrocito, conocidos en la técnica. Por ejemplo, para inducir la diferenciación es posible utilizar el Medio de Condrogénesis Completo (Bio Whittaker) que contiene 0.01 µg/mL de TGF-beta-3.

La determinación que una célula madre se ha diferenciado en un tipo de célula condrocito puede llevarse a cabo por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la condrogénesis puede establecerse por, por ejemplo, la observación de la producción de la sustancia eosinófila, el desarrollo de la morfología de la célula condrocito y/o la detección de la expresión génica del colágeno 2 y colágeno 9 utilizando, · por ejemplo, RT-PCR. 5.5.4 Diferenciación en un osteocito En otro aspecto, la presente invención comprende los métodos de diferenciación de una célula madre en una célula osteocito que consiste en cultivar la célula madre en la biofábrica de colágeno en condiciones que favorezcan la diferenciación de la célula madre en un osteocito. En algunas modalidades, la célula osteocito exhibe niveles de calcio característicos de un osteocito; la producción de fosfatasa alcalina; la expresión de un gen que codifica fosfatasa alcalina; la producción de osteopontina; o la expresión de un gen que codifica osteopontina. En ciertas modalidades, la diferenciación consiste en poner en contacto la célula madre con la biofábrica de colágeno y uno o más agentes que faciliten la diferenciación de una célula madre en un osteocito, conocidos en la técnica. Los agentes ejemplares son dexametasona, ácido ascórbico-2-fosfato y glicerofosfato . En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene uno o más agentes .

Cualquier medio de cultivo apropiado para la diferenciación de osteocito, conocido en la técnica, puede utilizarse en el cultivo celular. Por ejemplo, para inducir la diferenciación es posible utilizar el Medio de Inducción Osteogénica (Bio Whittaker) que contiene dexametasona 0.1 uM, ácido ascórbico-2-fosfato 0.05 mM, beta glicerofosfato 10 mM.

La determinación que una célula madre se ha diferenciado en un osteocito se puede llevar a cabo por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la diferenciación se puede evidenciar utilizando tinción especifica de calcio y detección de fosfatasa alcalina y/o la expresión del gen de osteopontina utilizando, por ejemplo, RT-PCR. 5.5.5 Diferenciación en una célula hepatocito En otro aspecto, la presente invención comprende los métodos para diferenciar una célula madre en una célula hepatocito, que consiste en cultivar la célula madre en una biofábrica de colágeno en condiciones que favorezcan la diferenciación de la célula madre en un hepatocito . En algunas modalidades, el hepatocito presenta expresión de un gen especifico del hepatocito o la producción de una proteina especifica del hepatocito. Tales genes y proteínas son conocidos en la materia y pueden ser albúmina, pre-albúmina, glucosa-6-fosfatasa, al-antitripsina, etc., como se ha descrito en la publicación de la solicitud U. S. No. 2005/0170502.

La diferenciación puede consistir en poner en contacto la célula madre con la biofábrica de colágeno y uno o más agentes que faciliten la diferenciación de una célula madre en un hepatocito. Por ejemplo, factor de crecimiento de hepatocito y/o factor de crecimiento epidérmico. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene uno o más agentes . En el cultivo celular es posible utilizar cualquier medio de cultivo apropiado para la diferenciación del hepatocito, conocido en la técnica. Por ejemplo, para inducir la diferenciación es posible utilizar medio DMEM con 20% de CBS suplementado con el factor de crecimiento del hepatocito, 20 ng/mL; y factor de crecimiento epidérmico, 100 ng/mL. En lugar de FBS es posible utilizar KnockOut Serum Replacement.

La diferenciación en un hepatocito se puede evidenciar por la detección de la producción de albúmina, prealbúmina, glucosa-6-fosfatasa, ?-antitripsina o la expresión de un gen que codifica la misma. 5.5.6 Diferenciación en una célula pancreática En otro aspecto, la presente invención comprende los métodos de diferenciación de una célula madre en una célula pancreática, que consiste en cultivar la célula madre en la biofábrica de colágeno en condiciones que favorezcan la diferenciación de la célula madre en una célula pancreática. En algunas modalidades, la célula pancreática presenta producción de insulina o expresión de un gen que codifica insulina.

La diferenciación puede consistir en poner en contacto la célula madre con la biofábrica de colágeno y uno o más agentes que faciliten la diferenciación de una célula madre en una célula pancreática, conocidos en la técnica. Los agentes ejemplares son el factor de crecimiento de fibroblastos básico, el factor de crecimiento transformante beta-1 y medio acondicionado por células neuronales positivas para nestina. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene el uno o más agentes. En el cultivo celular es posible utilizar cualquier medio de cultivo apropiado para la diferenciación de las células pancreáticas, conocido en la técnica. Por ejemplo, puede utilizare medio acondicionado a partir de cultivos celulares neuronales positivos para nestina mezclados con medio DMEM.

La determinación que una célula madre se ha diferenciado en una célula pancreática se puede llevar a cabo por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la diferenciación puede evidenciarse por la detección de la producción de insulina, o de la expresión de un gen de insulina, utilizando, por ejemplo, RT-PCR. 5.5.7 Diferenciación en una célula cardiaca En otro aspecto, la presente invención comprende los métodos de diferenciación de una célula madre en una célula cardiaca, que consiste en cultivar la célula madre en la biofábrica de colágeno en condiciones que favorezcan la diferenciación de la célula madre en una célula cardiaca. En algunas modalidades, la célula cardiaca presenta latido; la producción de actina; o la expresión de un gen que codifica actina cardiaca.

La diferenciación puede consistir en poner en contacto la célula madre con uno o más agentes que faciliten la diferenciación de una célula madre en una célula cardiaca. Los agentes ejemplares pueden ser ácido retinóico, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento transformante ó cardiotropina . En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene uno o más agentes .

En el cultivo celular es posible utilizar cualquier medio de cultivo adecuado para la diferenciación de la célula cardiaca, conocido en la técnica. Por ejemplo, en el cultivo es posible utilizar medio DMEM con 20% de CBS, suplementado con ácido retinóico, 1 uM; factor de crecimiento de fibroblastos básico, 10 ng/mL; y el factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/mL; y el factor de crecimiento epidérmico, 100 ng/mL. En lugar de CBS es posible utilizar KnockOut Serum Replacement (Invitrogen, Carlsbad, California) . En otra versión, es posible utilizar medio DMEM con 20% de CBS suplementado con 50 ng/mL de cardiotropina-1. Además, las células madre pueden mantenerse en medio libre de proteina durante 5-7 días, luego pueden ser estimuladas con extracto de miocardio humano (análisis escalando la dosis) . El extracto de miocardio se produce homogeneizando 1 g de miocardio humano en búfer HEPES al 1% suplementado con suero de sangre de cordón al 1%. La suspensión se incuba durante 60 minutos, luego se centrifuga y se recolecta el sobrenadante .

La determinación que una célula madre se ha diferenciado en un tipo de célula cardiaca se puede llevar a cabo por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la diferenciación se evidencia, por ejemplo, el latido, la producción de actina cardiaca o la expresión de un gen que codifica actina cardiaca. 5.6 BIOFÁBRICA DE COLÁGENO La presente invención proporciona los métodos de cultivo, expansión o diferenciación de una célula madre utilizando una biofábrica de colágeno. Aunque no se pretende limitarse por ninguna teoría, se considera que la biofábrica de colágeno proporciona el sustrato para la unión de la célula y los factores de crecimiento apropiados para el crecimiento de la célula madre en cultivo .

La biofábrica de colágeno puede utilizarse en forma seca o nativa (es decir, desecada a partir de una placenta) y/o en forma descelularizada o no descelularizada .

En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene células endógenas a una placenta a partir de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno. En otras modalidades, la biofábrica de colágeno contiene células exógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene células exógenas y células endógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno. 5.6.1 Descripción La biofábrica de colágeno que se utiliza en la presente invención puede obtenerse de la membrana amniótica, membrana coriónica o ambas de cualquier mamífero, por ejemplo equino, bovino, porcino o monocatarrino, pero preferentemente deriva de placenta humana. En una modalidad preferida, la biofábrica de colágeno está considerablemente seca, es decir, tiene 20% o menos de agua en peso. En otra modalidad preferida, la biofábrica de colágeno no ha sido tratada con proteasa. En otra modalidad preferida, la biofábrica de colágeno no contiene colágeno ni otras proteínas estructurales que hayan sido artificialmente reticuladas, por ejemplo, químicamente reticuladas, es decir, la biofábrica de colágeno preferida no está fijada. Una biofábrica de colágeno preferida es el material membrana amniótica secada, no fijada, no tratada con proteasa descrita en Hariri, Publicación de la Solicitud U. S. 2004/0048796, la cual se incorpora por este medio en su totalidad, y que se produce por los métodos que se describen en aquella y la presente (ver los Ejemplos 1, 2) . Sin embargo, los métodos de la presente invención pueden utilizar cualquier material colágeno placentario preparado por cualquier procedimiento.

En una modalidad preferida, la biofábrica de colágeno es translúcida. En otras modalidades, la biofábrica de colágeno es opaca o es coloreada o teñida, por ejemplo, coloreada o teñida permanentemente, utilizando un agente colorante aceptado para uso médico; tal agente puede ser adsorbido sobre la biofábrica de colágeno, o la biofábrica de colágeno puede ser impregnada o recubierta con un agente como éste. En esta modalidad, es posible utilizar cualquier agente o colorante no tóxico, no irritante, conocido.

Cuando la biofábrica de colágeno es considerablemente seca, ésta tiene aproximadamente 0.1 g/cm2 a aproximadamente 0.6 g/cm2. En una modalidad especifica, una sola capa de biofábrica de colágeno es al menos de 2 micrones de espesor. En otra modalidad especifica, una sola capa de biofábrica de colágeno utilizada para reparar una membrana timpánica es de aproximadamente 10-40 micrones de espesor, pero puede ser de aproximadamente 2-150, 2-100 micrones, 5-75 micrones o 7-60 micrones de espesor en el estado seco.

En una modalidad, la biofábrica de colágeno está principalmente compuesta de colágeno (los tipos I, III y IV; aproximadamente 90% de la matriz de la biofábrica) , fibrina, fibronectina, elastina, y además contiene glucosaminoglucanos y proteoglucanos . En otras modalidades, los componentes no-estructurales de la biofábrica pueden ser, por ejemplo, factores de crecimiento, por ejemplo, factores de crecimiento derivados de plaquetas (los PDGF) , el factor de crecimiento vascular-endotelial (VEGF) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento transformante-ß? . La composición de la biofábrica de colágeno de este modo es idealmente adecuada para estimular la migración de los fibroblastos y macrofagos, y de este modo favorece la curación de heridas .

La biofábrica de colágeno puede utilizarse en un formato uniestratificado, por ejemplo como una lámina unicapa o una membrana un-laminated. De otro modo, la biofábrica de colágeno puede utilizarse en un formato de doble capa o multicapa, por ejemplo, la biofábrica de colágeno puede ser laminada. La laminación puede proporcionar mayor rigidez y durabilidad durante el proceso de curación. La biofábrica de colágeno puede ser, por ejemplo, laminada como se describe más adelante.

La biofábrica de colágeno además puede contener colágeno de una fuente no placentaria. Por ejemplo, una o más capas de la biofábrica de colágeno pueden estar recubiertas o impregnadas con, o estratificadas con, colágeno extraído, purificado. Tal colágeno puede obtenerse, por ejemplo, de fuentes comerciales, o puede producirse de acuerdo con los métodos conocidos, como los descritos en las Patentes 4,420,339, 5,814,328, y 5,436,135.

La biofábrica de colágeno puede tener células endógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno. La biofábrica de colágeno también puede tener células exógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno puede tener células exógenas y células endógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno.

La biofábrica de colágeno puede tener uno o más compuestos o sustancias que no están presentes en el material placentario del cual se obtiene la biofábrica de colágeno. Por ejemplo, la biofábrica de colágeno puede estar impregnada con un compuesto bioactivo. Tales compuestos bioactivos pueden ser, más no se limitan a, moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, medicamentos) , antibióticos (como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina) , hormonas, factores de crecimiento, agentes anti-tumorales, agentes anti-micóticos, agentes anti-virales, medicamentos contra el dolor, anti-histaminas, agentes anti-inflamatorios, anti-infecciosos como pueden ser, más no se limitan a plata (como puede ser las sales de plata, que incluye, más no se limita a, nitrato de plata y plata sulfadiazina) , plata elemental, antibióticos, enzimas bactericidas (como lisozima) , agentes curadores de heridas (como nicotinas que. incluye, más no se limita a, PDGF, TGF; timosina) , ácido hialurónico como un agente curador de heridas, selladores de heridas (como fibrina con o sin trombina) , atrayentes celulares y reactivos de andamiaje (como fibronectina adicionada ) y similares . En un ejemplo especifico, la biofábrica de colágeno puede estar impregnada con al menos un factor de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etc. La biofábrica también puede estar impregnada con moléculas orgánicas pequeñas como los inhibidores específicos de procesos bioquímicos particulares, por ejemplo, inhibidores de los receptores de membrana, inhibidores de cinasa, inhibidores del crecimiento, medicamentos anticáncer, antibióticos, etc . La. impregnación de la biofábrica de colágeno con un compuesto bioactivo puede llevarse a cabo, por ejemplo, sumergiendo la biofábrxca de colágeno en una solución del compuesto bioactivo de la concentración deseada durante un tiempo suficiente para permitir que la biofábrica de colágeno absorba y se equilibre con la solución; rociando la solución sobre la biofábrica; humedeciendo la biofábrica con la solución, etcétera.

En otras modalidades, la biofábrica de colágeno puede estar combinada' con un hidrogel . Cualquier composición de hidrogel conocida para un experto en la técnica está comprendida dentro de la invención, por ejemplo, cualquiera de las composiciones hidrogel descritas en las siguientes referencias: Graham, 1998, Med. Devicé Technol . 9(1) : 18-22; Peppas et al, 2000, Eur. J, Pharm. Biopharm. 50(1) : 27- 46; Nguyen et al, 2002, Biomaterials, 23(22) : 4307-14; Henincl et al, 2002, Adv. Dr g Deliv. Rev. 54(1) : 13-36; Skelhorne et al. , 2002, Med. Device. Technol. 13(9) : 19-23; Schmedlen et al, 2002, Biomaterials 23: 4325-32; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. En una modalidad especifica/ la composición hidrogel se aplica sobre la biofábrica de colágeno, es decir., se deposita sobre la superficie de la biofábrica de colágeno. La composición hidrogel, por ejemplo, puede ser rociada sobre la biofábrica de colágeno o recubierta sobre la superficie de la biofábrica de colágeno, o la biofábrica puede ser remojada, bañada o saturada con la composición hidrogel . En otra modalidad especifica, el hidrogel es intercalado entre dos o más capas de la biofábrica de colágeno. En una modalidad aún más especifica, el hidrogel se intercala entre dos o más capas de biofábrica de colágeno, en donde los bordes de las dos capas de la biofábrica se sellan para contener considerable o completamente el hidrogel.

Los hidrogeles útiles en los métodos y composiciones de la invención pueden prepararse a partir de cualquier polímero interactivo con el agua o soluble en agua conocido en la técnica, que incluye, más no se limita a, alcohol polivinilico (PVA) , polihidroxietil metacrilato, polietilen glicol, polivinil pirrolidona, ácido hialuronico, alginato, colágeno, gelatina, dextrano ó derivados y análogos de éstos .

En una modalidad, especifica, la biofábrica de colágeno contiene ácido hialuronico . El ácido hialuronico puede ser, por ej emplo, aplicado o adicionado a la biofábrica de colágeno como una solución, por ejemplo, una solución de 10 mg/mL en, por ejemplo, agua o un solución amortiguadora fisiológica aceptable o medio de cultivo. El ácido hialurónico preferentemente se reticula suficientemente para reducir o evitar la solubilidad del ácido hialurónico en un ambiente liquido. En modalidades preferidas,. el ácido hialurónico se reticula a la biofábrica de colágeno. El agente reticular, para reticular el ácido hialurónico. o para reticular el ácido hialurónico a la biofábrica de colágeno, puede ser cualquier agente reticulador, pero puede ser, por ejemplo, 1, 4-butandiol diglicidil éter (BDDE) , clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDCI), divinal sulfona, epiclorhidrina, gluta aldehido, diciclohexilcarbodiimida (DCC) , o similares. La combinación de la biofábrica de colágeno y ácido hialurónico puede, como una opción, ser secado, por ejemplo, secado en aire, liofilizado o similares. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno se coloca en un bastidor o soporte que, por ejemplo, sostenga la biofábrica de colágeno en los bordes, antes y durante la adición del ácido hialurónico.

La invención también proporciona un método de fabricación de una biofábrica de colágeno que contiene ácido hialurónico, por ejemplo, para ser utilizado para el cultivo de una célula madre o población de células madre, por ejemplo, células madre placentarias adherentes, CD34-, que consiste en poner en contacto al menos una parte de una biofábrica de colágeno con una solución de ácido hialurónico, la reticulación del ácido hialurónico a la biofábrica de colágeno y el secado de la biofábrica de colágeno resultante. En una modalidad del método, la biofábrica de colágeno está considerablemente seca, por ejemplo, contiene 20% o menos de agua, en el momento del contacto con la solución de ácido hialurónico. En otra modalidad especifica del método, la biofábrica de colágeno es descelularizada antes del contacto con la solución de ácido hialurónico. En otra modalidad, la biofábrica de colágeno tiene una apariencia tipo hoja. En otra modalidad especifica del método, la biofábrica de colágeno no es descelularizada antes del contacto con la solución de ácido hialurónico. Preferentemente, la biofábrica de colágeno, en el momento del contacto con la solución de ácido hialurónico, se sostiene sobre uno o más lados, por ejemplo, en un bastidor, para reducir la cantidad de, o evitar, el rizado de la biofábrica de colágeno durante el contacto. En una modalidad particular, la biofábrica de colágeno es una hoja cuadrada o rectangular, y se mantiene en un bastidor de cuatro lados que hace contacto con todos los cuatro bordes de la biofábrica de colágeno durante el contacto con una solución de ácido hialurónico.

Para la composición y modalidades del método anteriores, la solución de ácido hialurónico puede ser cualquier solución de ácido hialurónico que permita la distribución uniforme del ácido hialurónico sobre la superficie de la parte de la biofábrica de colágeno que hace contacto. Por ejemplo- la solución de ácido hialurónico puede contener al menos, aproximadamente o no más de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 mg de ácido hialurónico por mililitro de solución.

En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno contiene uno o más compuestos bioactivos y se combina con un hidrogel. Por ejemplo, la biofábrica de colágeno puede ser impregnada con uno o más compuestos bioactivos antes de ser combinada con un hidrogel. En otras modalidades, la composición hidrogel además se impregna con uno o más compuestos bioactivos antes, o después, de ser combinada con una biofábrica de colágeno de la invención, por ejemplo, los compuestos bioactivos que se describen en la siguiente secció . 5.6.2 Compuestos bioacti os La biofábrica de colágeno que se utiliza en los métodos de la invención puede contener (por ejemplo, estar impregnada con o recubierta con) uno o más compuestos bioactivos. Cuando se utiliza en la presente, el término compuesto bioactivo" significa cualquier compuesto o molécula que provoca un efecto medible en uno o más sistemas biológicos in vitro ó in vivo. Los ejemplos de compuestos bioactivos pueden ser, sin limitación, moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo medicamentos, antibióticos, agentes anti-virales, agentes anti-microbianos, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-proliferativos, citocinas, inhibidores de enzimas proteínas, anti-histaminas y similares. En diversas modalidades, la biofábrica de colágeno puede estar recubierta o impregnada con antibióticos (como puede ser clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina) , hormonas, factores de crecimiento, agentes anti-tumorales, agentes anti-micotieos, agentes anti-virales, medicamentos contra el dolor (incluida XYLOCAI E®, lidocaína, procaína, novocaína, etc.), antihistaminas (p. e . , difenhidramina, BENADRYL®, etc.), agentes antiinflamatorios, anti-infecciosos que pueden ser, más no se imitan a, (como pueden ser sales de plata, que incluye, más no se limita a, nitrato de plata y plata sulfadiazina) , plata elemental, antibióticos, enzimas bactericidas (como lisozoma [sic] ) , agentes curadores de heridas (como puede ser citocinas, que incluye, más o se limita a, PDGF (p. e . , REGRANEX®) , TGF; timosina) , ácido hialurónico como un agente curador de heridas, sellantes de heridas (como puede ser fibrina con o sin trombina) , atrayentes celulares y reactivos de andamiaje (como fibronectina) , y similares, o combinaciones de cualquiera de los anteriores, o de los antes mencionados y otros compuestos no enlistados. Tal impregnación o recubrimiento puede ser realizado por cualquier medio conocido en la técnica, y una parte o el total de la biofábrica de colágeno puede ser así recubierta o impregnada .

La biofábrica de colágeno, o los compuestos que contienen la biofábrica de colágeno, pueden contener cualquiera de los compuestos enlistados en la presente, sin limitación, en forma individual o en cualquier combinación. Cualquiera de los compuestos con actividad biológica enlistados en la presente, y otros útiles en el contexto de la esclerótica o el ojo, pueden formularse por los métodos conocidos para la liberación inmediata o liberación extendida. Además, la biofábrica de colágeno puede contener dos o más compuestos con actividad biológica en diferentes formas; por ejemplo, la biofábrica puede estar impregnada con un compuesto con actividad biológica y recubierta con otro. En otra modalidad, la biofábrica de colágeno contiene u n compuesto con actividad biológica formulado para liberación extendida, y un segundo compuesto con actividad biológica formulado para liberación inmediata.

La biofábrica de colágeno puede estar impregnada o recubierta con una forma fisiológicamente disponible de uno o más nutrientes necesarios para curar heridas. Preferentemente, el nutriente se formula para liberación extendida .

La biofábrica de colágeno, o el compuesto que contiene la biofábrica de colágeno, puede contener un antibiótico. En ciertas modalidades, el antibiótico es un macrólido (p. ej . , tobramicina (TOBI®) ) , una cefalosporina (p. ej . , cefalexina (KEFLEX®) ) , cefradina (VELOSEF©) ) , cefuroxima (CEFTIN®) , cefprozil (CEFZIL®) , cefaclor (CECLOR®) , cefixima (SUPR¾X®) o cefadroxil (DURICEF®) , una claritromicina (p. ej . , claritromicina (Biaxin) ) , una eritromicina (p. ej . , eritromicina (EMICIN®) ) , una penicilina (p. ej . , penicilina V (V-CILLI K® o PEN VEEK®) ) o una quinolona (p . ej . , ofloxacina (FLOXIN®) , ciprofloxacino (CIPRO®) ornorfloxacino (NOROXIN®) ) , antibióticos aminoglucósidos (p. ej . , apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, d bekacina, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina y espectinomicina) , antibióticos amfenicol (p. ej . , azidamfenicol, cloramfenicol, florfenicol y tiamfenicol) , antibióticos ansamicina (p. ej . , rifamide y rifampina) , carbacefems (p . e . , loracarbef) , carbapenems (p. e . , biapenem e imipenem) , cefalosporinas (p. ej . , cefaclor, cefadroxil, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida y cefpiróme) , cefamicinas (p. ej . , cefbuperazone, cefinetazol, y cefminox) , monobactamas (p. ej . , aztreonam, carumonam y tigemonam) , oxacefems (p. ej - , flomoxef y moxalactam) , penicilinas (p. ej . , amdinocilina, amdinocilina pivoxil, amoxicilina, bacampicilina, ácido benzilpenicilinico, benzilpenicilina sódica, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamcilina, penetamato iohidrato, penicilina o-benetamina, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina, y fencihicilina potasio), lincosamidas (p. ej . , clindamicina y lincomicina) , macrólidos (p. ej . , azitromicina, carbomicina, claritomicina, diritromicina, eritromicina y eritromicina acistrato) , amfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (p. ej . , apiciclina, clortetraciclina, clomociclina y demeclociclina) , 2,4-diaminopirimidinas (p. ej . , brodimoprim) , nitrofuranos (p. ej . , furaltadone y cloruro de furazolio) , quinolonas y análogos de éstas (p. ej . , cinoxacino, ciprofloxacino, clinafloxacino, flumequina y grepagloxacina) , sulfonamidas (p. ej . , acetil sulfametoxipirazina, benzilsulfamida, noprilsulfamida, ftali1sulfacetam da, sulf crisoidina y sulfacitina) , sulfonas (p . ej . , diatimosulfona, glucosulfona sodio y solasulfona) , cicloserina, mupirocina y tuberina.

En ciertas modalidades, la biofábrica de colágeno puede estar recubierta ó impregnada con un agente antimicótico . Los agentes antimicóticos apropiados pueden ser, más no se limitan a, amfotericina B, itraconazol, ketoconazol, fluconazol, intratecal [sic] , flucitosina, miconazol, butoconazol, clotrimazol, nistatina, terconazol, tioconazol, ciclopirox, econazol, haloprogrin, naftifina, terbinafina, undecilenato y griseofuldina.

En algunas otras modalidades, la biofábrica de colágeno, o un compuesto que contiene biofábrica de colágeno, se recubre o impregna con un agente antiinflamatorio. Los agentes anti-inflamatorios útiles pueden ser, más no se limitan a, medicamentos antiinflamatorios no esteroides como el ácido salicilico, ácido acetilsalicilico, metil salicilato, diflunisal, salsalato, olsalazina, sulfasalazina, acetaminofen, indometacina, sulindaco, etodolaco, ácido mefenámico, meclofenamato de sodio, tolmetina, ketorolaco, diclofenaco, ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, ampiroxicam, droxicam, pivoxicam, tenoxicam, nabumetome, fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina, apazona y nimesulida; antagonistas de leucotrienos que incluye, más no se limita a, zileuton, aurotioglucosa, tiomalato de sodio oro y auranofina; y otros agentes anti-inflamatorios que incluyen, más no se limitan a, metotrexato, colchicina, alopurinol, probenecid, sulfinpirazona y benzbromarona.

En ciertas modalidades, la biofábrica de colágeno, o un compuesto que contiene biofábrica de colágeno, está recubierta o impregnada con un agente antiviral. Los agentes antivirales útiles pueden ser, más no se limitan a, análogos de nucleósidos, como puede ser zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina y ribavirina, así como foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir y los alfa-interferones .

La biofábrica de colágeno, o un compuesto que contiene biofábrica de colágeno, también puede ser recubierta o impregnada con un modulador de los receptores de citocinas. Los ejemplos de los moduladores de los receptores de citocinas pueden ser, más no se limitan a, receptores de citocinas solubles (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor de TNF-cx o un fragmento de éste, el dominio extracelular de un receptor IL-10 ó un fragmento de éste, y el dominio extracelular de un receptor de IL-6 o un fragmento de éste) , citocinas o fragmentos de éstas (p. e . , interleucina (IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, TNF-cx, TNF-ß, interferón (IFN)-a, IFN-ß, IFN-?, y GM-CSF) , anticuerpos anti-receptor de citosina (p. ej . , anticuerpos anti-receptor de IF , anticuerpos anti-receptor de IL-2 (p. ej . , Zenapax (Protein Design Labs)), anticuerpos anti-receptor de IL-4, anticuerpos antireceptor de IL-6, anticuerpos anti-receptor de IL-10, y anticuerpos anti-receptor de IL-12), anticuerpos antiertocina (p. ej . , anticuerpos anti-IF , anticuerpos anti-TNF-a, anticuerpos anti-IL-10, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-IL-8 (p. ej . , ABX-IL-8 (Abgenix) ) , y anticuerpos anti-IL-12) . En una modalidad especifica, un modulador de receptor de citocina es IL-4, IL-10, o un fragmento de éstos. En otra modalidad,- un modulador de receptor de citosina es un anticuerpo anti-IL-1, anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo anti-receptor de IL-12, o anticuerpo anti-TNF-a. En otra modalidad, un modulador de receptor de citosina es el dominio extracelular de un receptor de TNF-a o un fragmento de éste. En ciertas modalidades, un modulador de receptor de citocinas no es un antagonista de TNF-a.

En una modalidad preferida, las proteínas, polipéptidos o péptidos (incluidos los anticuerpos) que se utilizan como agentes inmunomoduladores se obtienen de las mismas especies que el receptor de las proteínas, polipéptidos o péptidos para reducir la probabilidad de una respuesta inmune para aquellas proteínas, polipéptidos o péptidos. En otra modalidad preferida, cuando el individuo es un humano, las proteínas, polipéptidos o péptidos que se utilizan como agentes inmunomoduladores son humanos o humanizados.

La biofábrica de colágeno, o un compuesto que contiene biofábrica de colágeno, también puede ser recubierta o impregnada con una citocina. Los ejemplos de las citocinas pueden ser, más no se limitan a, el factor estimulador de colonias 1 (CSF-1) , ínterleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3) , interleucina-4 (IL-4) , interleucina-5 (IL-5) , interleucina-6 (IL-6) , interleucina-7 (IL-7) , interleucina-9 (IL-9) , interleucina-10 (IL-10) , interleucina-12 (IL-12 ) , interleucina-15 (IL-15) , interleucina-18 (IL-18) , factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , eritropoyetina (Epo) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (básico o ácido) , factor estimulador de granulocitos macrofagos (GM-CSF) , factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HEGF) , factor estimulador de colonias de macrofagos (M-CSF) , prolactina e interferón (IFN) , p. ej . , IFN-alfa, e IFN-gama) , factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a) , TGF i, TGF 2, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-OÍ) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , etcétera.

La biofábrica de colágeno también puede ser recubierta o impregnada con una hormona. Los ejemplos de las hormonas pueden ser, más no se limitan a, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) , hormona de crecimiento (GE) , hormona liberadora de la hormona de crecimiento, ACT, somatostatina, somatotropina, somatomedina, hormona paratiroide, factores liberadores hipotalámieos, insulina, glucagon, enkefaliñas, vasopresina, calcitonina, heparina, heparinas de peso molecular bajo, heparinoides, opioides sintéticos y naturales, hormonas estimulantes del tiroides insulina y endorfinas . Los ejemplos de ß-interferones pueden ser, más no se limitan a, interferón ß 1-a e interferón ß 1-b.

La biofábrica de colágeno, o el compuesto que contiene la biofábrica de colágeno, también puede estar recubierto o impregnado con un agente alquilante. Los ejemplos de los agentes alquilantes pueden ser, más no se limitan a, mostazas nitrogenadas, etileniminas, metilmelaminas, alquil sulfonatos, nitrosoureas, triazenos, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, clorambucil, hexametilmelaina [sic] , tiotepa, busulfan, carmustina, estreptozocina, dacarbazina y temozolomida .

La biofábrica de colágeno, o un compuesto que contiene biofábrica de colágeno, también puede estar recubierta o impregnada con un agente inmunomodulador, que puede ser, más no se limita a, metotrexato, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A, antibióticos macrólidos (p. ej . , FK506 (tacrolimus) ) , metilprednisolona (MP) , corticosteroides, esteroides, micofenolato mofetil, rapamicina (sirolimus) , mizoribina, deoxiespergualina, brequinar, malononitriloamindes (p. ej . , leflunamida) , moduladores de los receptores de células T y moduladores de los receptores de citocinas, péptido mimétieos y anticuerpos (p. ej . , humanos, humanizados, quiméricos, monoclonales, policlónales, fragmentos Fvs, ScFvs, Fab ó F(ab)2 ó fragmentos de unión al epitope) , moléculas de ácido nucleico (p . ej . , moléculas de ácido nucleico antisentido y triple hélices) , moléculas pequeñas, compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos . En particular, los agentes inmunomoduladores pueden ser, más no se limitan a, metotrexato, leflunomida, ciclofosfamida, Citoxan, Immuran, ciclosporina A, minociclina, azatioprina, antibióticos (p. ej . , FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP) , corticosteroides, esteroides, micofenolato mofetil, rapamicina (sirolimus) , mizoribina, deoxiespergualina, brequinar, malononitriloamindes (p . ej . , leflunamida), moduladores de los receptores de células T y moduladores de los receptores de citocinas . Los ejemplos de los moduladores de los receptores de células T pueden ser, más no se limitan a, anticuerpos anti-receptor de células T (p. ej . , anticuerpos anti-CD4 (p. ej., CM-T412 (Boehringer) . IDEC-CE9.Is (IDEC y SKB) , mAb 4162W94, Ortoclona y 0KTcdr4a (Janssen-Cilag) ) , anticuerpos anti-CD3 (p. ej . , Nuvion (Product Design Labs) , OKT3 (Johnson & Johnson) , o Rituxan (IDEC) ) , anticuerpos anti-CD5 (p. ej . , un inmunocon ugado ligado a ricina anti-CD5) , anticuerpos anti-CD7 (p. ej . , CHH-380 (Novartis) ) , anticuerpos anti-CD8, anticuerpos monoclonales ligando anti-CD40 (p. ej . , IDEC-131 (IDEC) ) , anticuerpos anti-CD52 (p. ej . , CAMPATH 1H (Ilex) ) , anticuerpos anti-CD2, anticuerpos anti-CDl la (p. ej . , Xanelim (Genentech) ) , y anticuerpos anti-B7 (p. ej . , IDEC-114) (IDEC))) y CTLA4-inmunoglobulina . En una ' modalidad especifica, un modulador de receptores de células T es un antagonista de CD2. En otras modalidades, un modulador de los receptores de células T no es un antagonista de CD2. En otra modalidad especifica, un modulador de los receptores de células T es una molécula de unión a CD2, preferentemente MEDI-507. En otras modalidades, un modulador de los receptores de células T no es una molécula de unión a CD2.

La biofabrica de colágeno, o compuesto que contiene biofabrica de colágeno, también puede estar recubierta o impregnada con una clase de compuestos inmunomoduladores conocidos como los IMIDs®. Cuando se utiliza en la presente y a menos que indique de otro modo, el término "IMID®" e "IMIDs®" (Celgene Corporation) comprende moléculas orgánicas pequeñas que inhiben notablemente TNF-oc, IL-?ß e IL-12 monocito inducido por LPS e inhiben parcialmente la producción de I-L6. Los compuestos inmunomoduladores específicos se describen a continuación.

Los ejemplos específicos de los compuestos inmunomoduladores como éstos incluyen, más no se limitan a, derivados ciano y carboxi de estírenos sustituidos como pueden ser aquellos descritos en la Patente U. S. No. 5,929,117; l-oxo-2- (2, 6-dioxo-3-fluoropiperidin-3il) isoindolinas y 1, 3-dioxo-2- (2, 6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-il) isoindolinas como las descritas en las Patentes U.S. Nos. 5,874,448 y 5,955,476; las 2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -1-oxoisoindolinas tetrasustituidas descritas en la Patente U. S. No. 5,798,368; 1-oxo y 1,3-dioxo-2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) isoindolinas (p. ej . , los derivados 4-metilo de talidomida) , que incluye, más no se limita a, aquellos descritos en las Patentes U. S. Nos. 5, 635,517, 6,476, 052, 6,555,554, y 6,403,613; 1-oxo y 1, 3-dioxoisoindolinas sustituidas en la posición 4- ó 5- del anillo indolina (p. ej . , ácido 4- (4-amino-l, 3-dioxoisoindolin-2-il) -4-carbamoilbutanóico) descrito en la Patente U. S. No. 6,380,239; isoindolin-l-ona e isoindolin-1, 3-diona sustituido en la posición 2- con 2, 6-dioxo-3-hidroxipiperidin-5-il (p. ej . , 2- (2, 6-dioxo-3-hidroxi-5-fluoropiperidin-5-il) -4-aminoisoindolin-l-ona) descrito en la Patente XJ. S. No. 6,458, 810; una clase de amidas cíclicas no polipéptido descritas en las Patentes ü. S. Nos. 5,698,579 y 5,877,200; aminotalidomida, así como los análogos, productos de la hidrólisis, metabolitos, derivados y precursores de aminotalidomida y 2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) ftalimidas sustituidas y 2- (2, 6-dioxopiperidin-3-il) -1-oxoisoindoles sustituidos como los descritos en las Patentes U. S. Nos. 6,281,230 y 6,316,471; y compuestos isoindol-imida como los descritos en la Solicitud de Patente U. S. No. 09/972,487 presentada el 5 de octubre de 2001, la Solicitud de Patente U. S. No. 10/032,286 presentada el 21 de diciembre de 2001 y la Solicitud Internacional No. PCT/US01/50401 (Publicación Internacional No. WO 02/059106). La totalidad de cada una de las Patentes U.S. y publicaciones de solicitud de Patente U. S aquí identificadas se incorpora en la presente para referencia. Los compuestos inmunomoduladores no incluyen talidomida. La cantidad de compuesto bioactivo que recubre o impregna el colágeno puede variar, y preferentemente dependerá del compuesto bioactivo particular que se entregue, y el efecto deseado.

En diversas modalidades, la biofábrica de colágeno puede estar recubierta con, o impregnada con, al menos, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 100, 1250, 1500, 2000, 2500, 300, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000 o al menos 1000000 de nanogramos de un compuesto bioactivo . En otra modalidad, el tapón ocular de la invención puede estar recubierto con, o impregnado con, no más de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 100, 1250, 1500, 2000, 2500, 300, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000 o al menos 1000000 de nanogramos de un compuesto bioactivo. 5.6.3 Conformación de la biofábrica de colágeno La biofábrica de colágeno puede estar formada en cualquier forma o conformación que facilite su uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, la biofábrica de colágeno puede estar formada en cualquier configuración o conformación que facilite el cultivo de células madre. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno está en una placa de cultivo y se configura de acuerdo con la placa de cultivo. En otras modalidades, la biofábrica de colágeno está en un pozo de una placa de micropozos y se configura de acuerdo con el pozo de la placa de micropozos .

La biofábrica de colágeno útil en los métodos de tratamiento de la invención puede ser provista al usuario final seca, o pre-humedecida en un liquido fisiológico compatible, médicamente útil adecuado, como puede ser solución salina. En una modalidad, la solución contiene uno o más compuestos bioactivos, como está descrito en la sección 5.6.2 anterior, sin limitación. 5.6.4 Métodos de preparación de la biofábrica de colágeno La biofábrica de colágeno, preparada a partir de la membrana amniótica, membrana coriónica, o ambas, puede ser producida por cualquier medio que preserve las características bioquímicas y estructurales de los componentes de la membrana —principalmente colágeno, elastina, laminina y fibronectina. Un material preferido es la biofábrica de colágeno descrita en, y producida de acuerdo con los métodos que se describen en la Publicación de la Solicitud de Estados Unidos No. U. S. 2004/0048796 Al, "Biofábrica de colágeno y métodos de preparación y uso para ésta" de Hariri, la cual se incorpora por este medio en la presente en su totalidad.

Preferentemente, la biofábrica de colágeno que se utiliza en el cultivo de células madre es de una placenta humana para uso en individuos humanos, aunque la biofábrica de colágeno puede ser preparada a partir de membrana amniótica de un mamífero no humano. Donde la biofábrica de colágeno va a utilizarse en un animal no humano, se prefiere que la biofábrica de colágeno se obtenga de una placenta de esa especie de animal.

En una modalidad preferida, la placenta para uso en los métodos de la invención se toma tan pronto como sea posible después del parto del recién nacido. La placenta puede utilizarse de inmediato, o puede ser almacenada durante 2-5 dias a partir del momento del parto antes de cualquier otro tratamiento. La placenta normalmente se exsanguina, es decir, se drena de la sangre de cordón que queda después del nacimiento. Preferentemente, la madre es analizada antes del momento del nacimiento, utilizando las técnicas normales conocidas para un experto en la técnica/ para enfermedades transmisibles que pueden ser, más no se limitan a, HIV, HBV, HCV, HTLV, sífilis, CMV y otros patógenos virales conocidos por contaminar el tejido placentario.

Un método ejemplar para preparar una biofábrica de colágeno de la invención consiste en los siguientes pasos : Paso I. Se separa el cordón umbilical del disco placentario; opcionalmente, la membrana amniótica se separa de la membrana coriónica. En una modalidad preferida, la membrana amniótica se separa de la membrana coriónica antes de cortar la membrana placentaria. Luego de la separación de la membrana amniótica de la membrana coriónica y el disco placentario, se corta el tocón del cordón umbilical, por ejemplo, con tijeras, y se desprende del disco placentario. La membrana amniótica luego se almacena en solución salina estéril, preferentemente amortiguada, como puede ser una solución salina estéril al 0.9%, preferentemente, la membrana amniótica se almacena en refrigeración, a una temperatura de al menos 2°C.

Paso II. La membrana amniótica es considerablemente descelularizada; es decir, considerablemente todo el material celular y los desechos celulares (por ejemplo todo el material celular visible y los desechos celulares) se retiran. Cualquier proceso dé descelularización conocido para un experto en la técnica puede utilizarse, no obstante, generalmente el proceso que se utiliza para la descelularización de la membrana amniótica de la invención no rompe la conformación natural de las proteínas que constituyen la biofábrica. La "descelularización considerable" de la membrana amniótica preferentemente separa al menos 90% de las células, más preferentemente, retira al menos 95% de las células y más preferentemente retira al menos 99% de las células (por ejemplo fibroblastos, amniocitos y corionocitos) . Las membranas amnióticas descelularizadas de acuerdo con los métodos de la invención están uniformemente delgadas, con variaciones de espesor inherentes de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 150 micrones en el estado seco, lisas (según se determina por tacto) y de apariencia limpia. La descelularización puede consistir en el raspado físico, por ejemplo, con una rasqueta de células estéril, en combinación con enjuague con una solución estéril. La técnica de descelularización que se emplea no debe dar como resultado rompimiento de la anatomía de la membrana amniótica o la alteración de las propiedades bioquímicas de la membrana amniótica. Preferentemente, la descelularización de la membrana amniótica comprende el uso de una solución que contenga detergente, como pueden ser los detergentes no iónicos, Tritón X-100, detergentes aniónicos, docecil sulfato de sodio, cualquier detergente aniónico suave, es decir, un detergente no cáustico, con un pH de 6 a 8, y baja espuma, puede utilizarse para descelularizar la membrana amniótica. En una modalidad específica, para la descelularización de la membrana amniótica se utiliza 0.01-1% del monohidrato de la sal sodio del ácido desoxicólico .

Durante la preparación de la biofábrica es muy preferible limitar la actividad de la proteasa. Los aditivos para la lisis, soluciones de enjuague y almacenamiento como queladores de iones metálicos/, por ejemplo, 1-10-fenantrolina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , crean un ambiente desfavorable para múltiples enzimas proteoliticas . Cuando se proporcionan las condiciones subóptimas para las proteasas como colagenasa, ayuda a protegerla los componentes de la membrana amniótica como el colágeno contra la degradación durante el paso de lisis celular. Condiciones subóptimas para las proteasas puede lograrse formulando la solución para lisis hipotónica para eliminar o limitar la cantidad de iones calcio y zinc disponibles en la solución. Muchas proteasas son activas en presencia de iones calcio y zinc y pierden mucha de su actividad en ambientes libres de iones calcio y zinc. Preferentemente, la solución para lisis hipotónica será preparada seleccionando las condiciones del pH, disponibilidad reducida de iones calcio y zinc, presencia de queladores iones metálicos y el uso de inhibidores proteoliticos específicos para colagenasa de modo que la solución lise óptimamente las células nativas protegiendo al mismo tiempo la membrana amniótica subyacente contra degradación proteolítica adversa. Por ejemplo, una solución hipotónica para lisis puede consistir en una solución amortiguada de agua, pH 5.5 a 8, preferentemente pH 7 a 8, libre de iones calcio y zinc y que incluya un quelador de iones metálicos como EDTA. Además, el control de los parámetros de temperatura y tiempo durante el tratamiento de la membrana amniótica con la solución hipotónica para lisis también puede emplearse para limitar la actividad de las proteasas.

Se prefiere que el tratamiento de descelularización de la membrana amniótica también limite la generación de nuevos sitos inmuno1ógicos . Puesto que la degradación enzimática del colágeno se considera que da origen a inmunogenicidad aumentada, la invención comprende el tratamiento de la membrana amniótica con enzimas, por ejemplo nucleasas, que son eficaces para inhibir el metabolismo celular, la producción de proteina y la división celular, que minimiza la proteólisis de las composiciones de la membrana amniótica preservando asi la arquitectura subyacente de la membrana amniótica. Los ejemplos de las nucleasas que pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de la invención son aquellas eficaces para la digestión del DMA y R A celular nativo que incluye exonucleasas y endonucleasas . Un ejemplo no limitativo de nucleasas que pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen exonucleasas que inhiben la actividad celular, por ejemplo, DNasa I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) y RNasa A (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) y endonucleasas que inhiben la actividad celular, p. ej . , EcóRl (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) y iJindlII (SIGMA Chemical Company, St . Louis, Mo.) . Es preferible que las nucleasas seleccionadas sean aplicadas en una solución amortiguadora fisiológica que contenga iones, por ejemplo, magnesio, calcio, los cuales son óptimos para la actividad de la nucleasa. Preferentemente, la concentración iónica de la solución amortiguada, la temperatura de tratamiento y la duración del tratamiento se selecciona por el experto en la técnica por experimentación de rutina para garantizar el nivel deseado de actividad de la nucleasa. La solución amortiguadora preferentemente es hipotónica para favorecer el acceso de las nucleasas a los interiores celulares .

En otra modalidad de los Pasos I y II, anteriores, la placenta, después del procesamiento inicial, se enjuaga brevemente en salina para retirar la sangre de la superficie placentaria. El disco placentario se sumerge entonces en una solución fria de ácido desoxicólico a una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10% y, en una modalidad especifica, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 2.0%. La placenta entonces se incuba en esta solución a una temperatura entre aproximadamente 1°C a aproximadamente 8°C durante aproximadamente 5 días a aproximadamente 6 meses. En modalidades espec ficas, el disco placentario se sumerge, por ejemplo, durante aproximadamente 5 a aproximadamente 15 días; aproximadamente 5 a aproximadamente 30 días, aproximadamente 5 a aproximadamente 60 días ó durante hasta aproximadamente un año . Por lo regular, la solución de ácido desoxicólico se sustituye durante la incubación cada 2-5 días. En otra modalidad especifica, el disco placentario se sumerge en una solución de ácido desoxicólico a una concentración de aproximadamente 1% a una temperatura de 0°C a aproximadamente 8°C durante aproximadamente 5 días a aproximadamente 15 días . Esta incubación tiene dos propósitos. Primero, da tiempo para pruebas serológicas que se han de realizar en el material placentario y la sangre, de modo que las placentas que no cumplan con los criterios serológicos ya no se procesen. Segundo, la incubación prolongada mejora la eliminación de células epiteliales y fibroblastos, lo cual permite una reducción significativa en la cantidad de tiempo consumido en la descelularización del amnión por raspado físico. Por lo regular, el tiempo de raspado se reduce de, por ejemplo, aproximadamente 40 minutos a aproximadamente 20 minutos. La membrana amniótica entonces se seca como se describe más adelante.

Paso III. Luego de la descelularización, la membrana amniótica se lava para garantizar la eliminación de los desechos celulares los cuales pueden incluir proteínas celulares, lípidos celulares y ácidos nucleicos celulares, así como cualquier desecho extracelular, como pueden ser proteínas solubles extracelulares, lípidos y proteoglucanos . La solución de lavado puede ser agua deionizada o una solución amortiguadora hipotónica acuosa. Preferentemente, la membrana amniótica se agita suavemente durante 15-120 minutos en el detergente, por ejemplo, en una plataforma oscilante para ayudar a la descelularización. La membrana amniótica puede, después de la descelularización con detergente, otra vez, ser físicamente descelularizada como se describe antes; los pasos de descelularización física y con detergente pueden repetirse según sea necesario, siempre que la integridad de la membrana amniótica se mantenga, hasta que no quede material celular visible ni desechos celulares.

En ciertas modalidades, la membrana amniótica se seca inmediatamente (es decir, dentro de 30 minutos) después de los pasos de descelularización y lavado. De otro modo, cuando no se hace otro procesamiento inmediatamente, la membrana amniótica puede ser refrigerada, por ejemplo, puede ser almacenada a una temperatura de aproximadamente 1°C a aproximadamente 20°C, preferentemente desde alrededor de 2°C a alrededor de 8°C, durante hasta 28 días antes del secado. Cuando la membrana amniótica descelularizada se almacena durante más de 3 días, pero menos de 28 días, la solución estéril que cubre la membrana amniótica preferentemente se cambia en forma periódica, por ejemplo, cada 1-3 días.

En ciertas modalidades, cuando la membrana amniótica no se refrigera después del lavado, la membrana amniótica se lava al menos tres veces antes de proceder al Paso IV de la preparación. En otras modalidades, cuando la membrana amniótica ha sido refrigerada y la solución estéril ha sido cambiada una vez, la membrana amniótica se lava al menos dos veces antes de proceder al Paso IV de la preparación. En todavía otras modalidades, cuando la membrana amniótica ha sido refrigerada y la solución estéril ha sido cambiada dos veces o más, la membrana amniótica se lava al menos una vez antes de proceder al Paso IV de la preparación.

Antes de proceder al Paso IV, se prefiere que todas las pruebas bacteriológicas y serológicas sean ensayadas para garantizar que todas las pruebas sean negativas.

Paso IV. El paso final de esta modalidad del método de producción de la biofábrica de colágeno comprende el secado de la membrana amniótica descelularizada de la invención para producir la biofábrica de colágeno. Puede utilizarse cualquier método de secado de la membrana amniótica para producir una hoja plana, seca de colágeno. Sin embargo, de preferencia, la membrana amniótica se seca en vacio.

En una modalidad específica, un método ejemplar para secar la membrana amniótica descelularizada de la invención comprende los siguientes pasos: Montaje de la membrana amniótica descelularizada para el secado. La membrana amniótica descelularizada se retira de la solución salina, y el exceso de líquido se exprime suavemente. La membrana amniótica descelularizada entonces se estira suavemente hasta que está plana con el lado fetal hacia abajo, por ejemplo, sobre una bandeja. La membrana amniótica descelularizada entonces se voltea para que el lado fetal esté hacia arriba, y se coloca sobre un bastidor de secado, preferentemente un bastidor de secado de malla de plástico (por ejemplo, QUICK COUNT® Plástic Canvas, Uniek, Inc., Waunakee, WI) . En otras modalidades, el. bastidor secador puede ser cualquier material que se pueda someter a autoclave, que incluye, más no se limita a, una malla de acero inoxidable. En una modalidad más preferida, aproximadamente 0.5 centímetros de la membrana amniótica traslapa los bordes del bastidor secador. En ciertas modalidades, la membrana amniótica traslapante que se extiende más allá del bastidor secador se envuelve sobre la parte superior del bastidor, por ejemplo, utilizando una pinza o un hemostato . Una vez que la membrana amniótica se coloca sobre el bastidor secador, una gasa estéril se coloca sobre la plataforma de secado de un secador por calor (o gel-secador) (p. ej . , el Modelo 583, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) , de modo que un área ligeramente más grande que la membrana amniótica que descansa sobre el bastidor secador de malla de plástico esté cubierta. Preferentemente, el espesor total de la capa de gasa no excede el espesor de una gasa doblada 4x4. Cualquier aparato de secado por calor puede utilizarse, es decir, adecuado para secar material tipo hoja. El bastidor secador se coloca sobre la gasa sobre la plataforma de secado para que los bordes del bastidor de plástico se extiendan por encima de los bordes de la gasa, preferentemente entre 0.1-1.0 cm, más preferentemente 0.5-1.0 cm. En una modalidad más preferida, el bastidor secador que tiene la membrana amniótica se coloca sobre la gasa estéril con el lado fetal de la membrana amniótica hacia arriba. En algunas modalidades, otra malla del bastidor de plástico se coloca sobre la membrana amniótica. En otras modalidades, una hoja de plástico delgado (por ejemplo SW 182, PVC claro, AEP Industries Inc., South Hackensack, NJ) o una silicona biocompatible se coloca sobre la malla cubierta con membrana para que la hoja se extienda más allá de todos los bordes. En esta modalidad, no es necesario el segundo bastidor de malla.

En una modalidad alternativa, la membrana amniótica se coloca [lacuna] una o más hojas estériles de material TYVEK® (p. ej . , una hoja de TYVEK® para envasado médico, DuPont TYVEK®, Wilmington, DE) , como una opción, con una hoja de TYVEK® en la parte superior de la membrana (antes de colocar la película de plástico) . Este proceso alternativo producirá una versión más lisa de la biofábrica (es decir, sin el patrón de las regiones de compresión de las fibras diferenciales a lo largo y perpendiculares al eje del material), lo cual puede ser ventajoso para ciertas aplicaciones, como puede ser por ejemplo para uso como una matriz para la expansión de células .

Secado de la membrana amniótica. En una modalidad preferida, la invención comprende el secado con calor de la membrana amniótica de la invención en vacio. Aunque el secado en vacio puede llevarse a cabo a cualquier temperatura desde aproximadamente 0°C a aproximadamente 60°C, la membrana amniótica preferentemente se seca entre aproximadamente 35°C y 50°C, y más preferentemente a alrededor de 50°C. Debe señalarse que alguna degradación del colágeno ha de esperarse a temperaturas por encima de 50°C. La temperatura de secado preferentemente se ajusta y se verifica utilizando un termómetro digital calibrado utilizando una sonda extendida. Preferentemente, la presión de vacio se establece a aproximadamente —22 pulgadas de Hg. El paso de secado se continúa hasta que la matriz de colágeno de la membrana amniótica está considerablemente seca, es decir, contiene menos de 20% de agua en peso, y preferentemente alrededor de 3-12% de agua en peso, según se determina por ejemplo, por un analizador de humedad. Para lograr esto, la membrana amniótica puede ser secada con calor-vacio, por ejemplo, durante aproximadamente 60 minutos para lograr una membrana amniótica deshidratada. En algunas modalidades, la membrana amniótica se seca durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas, preferentemente alrededor de 60 minutes. Aunque no se pretende apegarse a algún mecanismo de acción, se considera que el ajuste de calor bajo acoplado con presión de vacio permite que la membrana amniótica llegue al estado deshidratado sin desnaturalización del colágeno.

Después de la terminación del proceso de secado de acuerdo con la invención, la membrana amniótica se seca durante aproximadamente 2 minutos con la bomba de vacio funcionando .

Envasado y almacenamiento de la membrana amniótica. Una vez que se seca la membrana amniótica, la membrana se levanta suavemente del bastidor , secador. El "levantamiento" de la membrana puede comprender los siguientes pasos: mientras la bomba está todavía funcionando, la película de plástico se retira suavemente de la membrana amniótica comenzando en la esquina, manteniendo abajo la membrana amniótica; el bastidor con la membrana amniótica se levanta de la plataforma de secado y se coloca sobre el tablero cortante con el lado de la membrana amniótica hacia arriba; se hace una incisión, cortando a lo largo del borde 1-2 mm en la dirección contraria del borde del bastidor; entonces se retira la membrana amniótica del bastidor. Preferentemente, el manejo de la membrana amniótica en esta etapa se hace con guantes estériles.

La membrana amniótica se coloca en un envase estéril, por ejemplo, una bolsa peel pouch y se sella. En otras modalidades, por lo menos una parte de la biofabrica de colágeno se subdivide en piezas apropiadas para la colocación en una caja de cultivo o placa de múltiples pozos. Por ejemplo, una o más piezas circulares de la biofábrica de colágeno pueden estar colocadas en una caja de cultivo o placa de múltiples pozos de modo que la biofábrica de colágeno cubra al menos una parte de la base (por ejemplo, la superficie de cultivo) de la caja de cultivo o placa de múltiples pozos. En una modalidad preferida, toda la superficie de cultivo circular de una caja de petri, o superficie de cultivo circular de uno o más pozos de una placa de múltiples pozos se cubre completamente por la biofábrica de colágeno .

La biofábrica producida de acuerdo con los métodos de la invención, sola o junto con un tipo de caja de cultivo de tejido o placa de múltiples pozos, puede ser guardada a temperatura ambiente durante un tiempo prolongado como se describe antes.

En las modalidades alternativas, la biofábrica de colágeno puede tener una membrana coriónica, o membrana coriónica y una membrana amniótica. Se espera que los métodos antes descritos sean aplicables al método de preparación de una biofábrica que consista en una membrana coriónica, o ambas una membrana coriónica y una membrana amniótica. En una modalidad, la invención comprende el uso de una biofábrica de colágeno preparada proporcionando una placenta que contenga una membrana amniótica y una membrana coriónica; la separación de la membrana amniótica de la membrana coriónica; y la descelularización de la membrana coriónica. En una modalidad especifica, la preparación de la biofábrica además supone el lavado y secado de la membrana coriónica descelularizada. En otra modalidad, la invención comprende el uso de una biofábrica de colágeno preparada proporcionando una placenta que contenga una membrana amniótica y una membrana coriónica, y la descelularización de las membranas amniótica y coriónica. En una modalidad especifica, el método además supone el lavado y secado de las membranas amniótica y coriónica descelularizadas . 5.6.5 Almacenamiento y manejo de la biofábrica de colágeno La biofábrica de colágeno deshidratada puede ser almacenada, por ejemplo, como hojas deshidratadas, a temperatura ambiente (por ejemplo a 25°C) antes de su uso. En ciertas modalidades, la biofábrica de colágeno puede ser almacenada a una temperatura de al menos 10°C, al menos 15°C, al menos 20°C, al menos 25°C o al menos 29°C. Preferentemente, la biofábrica de colágeno, en forma deshidratada, no se refrigera. En algunas modalidades, la biofábrica de colágeno puede ser refrigerada a una temperatura de alrededor de 2°C a aproximadamente 8°C. La biofábrica producida de acuerdo con los métodos de la invención puede ser almacenada a cualquiera de las temperaturas especificadas durante 12 meses o más sin alteración en la integridad bioquímica o estructural (por ejemplo, sin degradación), sin cualquier alteración de las propiedades bioquímicas o biofísicas de la biofábrica de colágeno. La biofábrica puede ser almacenada durante varios años sin alteración de la integridad bioquímica o estructural (por ejemplo, sin degradación) sin alguna alteración de las propiedades bioquímicas o biofísicas de la biofábrica de colágeno. La biofábrica puede ser almacenada en cualquier envase apropiado para el almacenamiento durante largo tiempo.

Preferentemente, la biofabrica de colágeno de la invención se almacena en un envase peel pouch doble estéril .

La biofábrica de colágeno normalmente se hidrata antes del" cultivo, expansión o diferenciación de una célula madre, por ejemplo, una célula madre embriónica. La biofábrica de colágeno puede ser rehidratada utilizando, por ejemplo, una solución amortiguadora fisiológica estéril. En una modalidad especifica, la solución salina estéril es una solución de NaCl al 0.9%. En algunas modalidades, la solución salina estéril es amortiguada. Preferentemente, antes del cultivo, expansión o diferenciación de una célula madre, la biofábrica de colágeno se rehidrata en medio de cultivo, por ejemplo, DMEM, un medio de cultivo de células madre o el medio de cultivo que está descrito en la Sección 4.2.1. En ciertas modalidades, la hidratación de la biofábrica de colágeno de la invención requiere al menos 2 minutos, al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos o al menos 20 minutos. En una modalidad preferida, la hidratación de la biofábrica de colágeno de la invención es completa en 5 minutos . En todavia otra modalidad preferida, la hidratación de la biofábrica de colágeno de la invención es completa en 10 minutos. En todavía otra modalidad, la hidratación de la biofábrica de colágeno de la invención tarda no más de 10 minutos. Una vez hidratada, la biofábrica de colágeno puede mantenerse en solución, por ejemplo, en solución de NaCl al 0.9%, estéril, durante hasta 6 meses, con un cambio de solución, por ejemplo, cada tres dias. 5.6.6 Esterilización La esterilización de la biofábrica puede llevarse a cabo por cualquier medio médico apropiado, preferentemente un medio que no reticule o desnaturalice significativamente las proteínas de la membrana. La esterilización se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando gas, por ejemplo dióxido de etileno. La esterilización puede realizarse utilizando radiación, por ejemplo, radiación gama, y preferentemente se hace por irradiación de haces de electrones utilizando los métodos conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, Gorham, D. Byrom (ed. ) , 1991, Biomaterials . Stockton Press, New York, 55-122. Cualquier dosis de radiación suficiente para matar al menos 99.9% de las bacterias u otros organismos potencialmente contaminantes está dentro del alcance de la invención. En una modalidad preferida, se utiliza una dosis de al menos 18-25 kGy para lograr la esterilización terminal de la biofábrica. 5.6.7 Laminados La invención además estipula el cultivo, expansión o diferenciación de una célula madre, que consiste en cultivar las células en un medio de cultivo con un laminado de una biofábrica de colágeno. Un laminado como éste puede ser considerablemente plano (por ejemplo, apropiado para el cultivo celular) o tridimensional.

La biofábrica de colágeno normalmente se lamina apilando dos o más capas de biofábrica de colágeno una sobre la otra y el sellado o secado. La biofábrica de colágeno puede ser laminada seca o después de la rehidratación . En otra versión, dos o más capas de, por ejemplo, la membrana amniótica, pueden ser laminadas antes del secado inicial después .de la eliminación celular, por ejemplo, a través de un paso de raspado celular (ver los Ejemplos, siguientes) . Si se lamina antes del secado inicial, 2 o más capas de la biofábrica de colágeno pueden ser apiladas una sobre la otra y posteriormente secadas utilizando, por ejemplo, un proceso de secado por congelación, o secado en calor moderado con o sin vacio. El calor que se aplique preferentemente no será tan intenso para provocar el rompimiento o descomposición de los componentes proteinicos, especialmente el colágeno, de la biofábrica de colágeno. Por lo regular, el calor aplicado será no más de aproximadamente 80°C, preferentemente no más de aproximadamente 60°C y, más preferentemente, aproximadamente 50°C. El tiempo de laminación varia con, por ejemplo, el número de capas que se estén laminando, pero por lo regular tardará 1-2 horas a 50°C, para el tamaño de las piezas de la biofábrica de colágeno que se utilicen para reparar la membrana timpánica.

La biofábrica de colágeno también puede ser laminada utilizando un adhesivo aplicado entre dos o más capas de biofábrica de colágeno o membrana amniótica. Un adhesivo como éste preferentemente es apropiado para aplicaciones médicas, y puede comprender un adhesivo biológico natural, por ejemplo, pegamento de fibrina, un adhesivo sintético o una combinación de éstos. Además, el adhesivo puede ser convertido químicamente a partir de precursores durante el proceso de laminación. 5.7 EQUIPOS La biofábrica de colágeno útil para los métodos de la presente invención puede proporcionarse en una envoltura o envase como parte de un equipo o kit para facilitar el cultivo, expansión o diferenciación de las células madre.

En una modalidad, el kit contiene una o más cajas de cultivo o placas de micropozos, en donde las cajas o placas contienen biofábrica de colágeno. En algunas modalidades, cada pieza de la biofábrica de colágeno es proporcionada en una caja de cultivo o en cada pozo de una placa de micropozos. En otra modalidad, el equipo contiene dos o más piezas de biofábrica de colágeno, envueltas o contenidas por separado .

En otra modalidad, el equipo contiene medio adecuado para el cultivo de una célula madre. En otra modalidad, el equipo contiene uno o más compuestos que hacen que una célula madre se diferencie en una célula adulta. 5.8 USO DE CÉLUIAS MADRE CULTIVADAS EN IA BIOFÁBRICA DE COLÁGENO Las células madre cultivadas, expandidas, diferenciadas de acuerdo con la presente invención tienen diversas aplicaciones. Las células madre pueden utilizarse para cualquier propósito conocido para el experto en la técnica, por ejemplo, como se describe en la publicación de la Solicitud US No. 2004/0048796, el contenido de la cual se incorpora para referencia en su totalidad. Por ejemplo, las células madre pueden utilizarse en trasplante y protocolos de tratamiento ex vivo en los cuales un tejido u órgano del cuerpo es aumentado, reparado o sustituido por el inserto, trasplante o infusión de una población de células deseada, como puede ser una célula madre o población de células progenitoras . Estas también pueden utilizarse para sustituir o aumentar tejidos existentes, para introducir tejidos nuevos o alterados o para unir entre si tejidos o estructuras biológicas. El cultivo de células madre con la biofábrica de colágeno también puede utilizarse en procedimientos quirúrgicos, por ejemplo, como un injerto quirúrgico.

Las células madre que se han cultivo en la biofábrica de colágeno pueden utilizarse sin la biofábrica de colágeno. Es decir, las células madre pueden estar separadas de la biofábrica de colágeno por los métodos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, la separación por tripsinización y lavado. Estas células madre pueden entonces utilizarse para otro cultivo de células madre, o para tratar una enfermedad, trastorno o estado que pueda ser tratado utilizando las células madre . En otra modalidad, las células madre pueden utilizarse con la biofábrica de colágeno en cualquier aplicación en la cual la biofábrica de colágeno pueda utilizarse para tratar una enfermedad, trastorno o estado. Ver, por ejemplo, Hariri et al., Publicación de la Solicitud U. S. No. 20040048796, Hariri & Smiell, Solicitud Provisional U. S. No. 60/699,441, presentada el 13 de julio de 2005; Lin & Ray, Solicitud Provisional U.S. Provisional No. 60/699,440, presentada el 13 de julio de 2005; y Sulner et al., Solicitud Provisional U.S. No. 60/696,197, presentada el 30 de junio de 2005. En otra modalidad, las células madre diferenciadas en la biofábrica de colágeno (por ejemplo, células adultas) pueden utilizarse sin la biofábrica de colágeno en aplicaciones apropiadas del tejido (por ejemplo, células madre diferenciadas en células cardiacas pueden utilizarse para reparar el tejido dañado en un infarto cardiaco) . En otra modalidad, las células adre diferenciadas pueden utilizarse con la biofábrica de colágeno sobre la cual éstas fueron diferenciadas en aplicaciones apropiadas del tejido (por ejemplo, células madre diferenciadas para condrocitos pueden utilizarse con la biofábrica de colágeno, por ejemplo, para reparar una articulación dañada) . 5.9 MÉTODOS DE TAMIZAJE DE LOS COMPUESTOS La presente invención proporciona los métodos de tamizaje para compuestos que modulan la expansión o diferenciación de células madre, o modulan la actividad de las células. Los compuestos que han de ser tamizados pueden ser moléculas pequeñas, fármacos, péptidos, polinucleótidos, etc., o bibliotecas de tales compuestos experimentales . La célula puede ser una célula somática o célula madre. La célula puede ser una célula que se encuentra en estado natural o una célula manipulada para expresar un producto génico recombinante . En el contexto de las células madre, puesto que la biofábrica de colágeno puede sustituir las células alimentadoras en cultivo, los métodos tienen la ventaja de no ser complicados por un efecto secundario causado por la perturbación de las células alimentadoras del compuesto experimental .

En un aspecto la presente invención propone un método para determinar la toxicidad de un compuesto para una célula, utilizando el sistema de cultivo celular de la biofábrica de colágeno de la invención. En algunas modalidades, el método consiste en cultivar la célula con una biofábrica de colágeno en condiciones apropiadas para la supervivencia de la célula, poner en contacto la célula con un compuesto y detectar apoptosis, necrosis o muerte celular, o una tendencia hacia apoptosis, necrosis o muerte celular. Si se detecta apoptosis, necrosis, muerte celular o una tendencia hacia la misma, en comparación con una célula que no se puso en contacto con el compuesto, el compuesto es tóxico para tal célula. En una modalidad especifica, la célula es una parte de una pluralidad de las células madre, en donde cada una de las células madre se pone en contacto con uno de una pluralidad de compuestos para identificar una subserie de la pluralidad de compuestos que tiene un efecto sobre la apoptosis o muerte celular.

En .otro aspecto, la presente invención propone los métodos para determinar el efecto de un compuesto sobre la diferenciación de una célula madre, por ejemplo, utilizando el sistema de cultivo celular de la biofábrica de colágeno de la invención. En algunas modalidades, los métodos consisten en cultivar la célula con una biofábrica de colágeno en condiciones apropiadas para la diferenciación de la célula. Luego se analiza en las células un marcador de la diferenciación en presencia o ausencia del compuesto experimental. El marcador de la diferenciación puede ser un marcador de la superficie celular, la morfología celular o uno o más genes expresados diferencialmente . Si se identifica un cambio, el compuesto tiene un efecto sobre la diferenciación de tal célula. En una modalidad específica, la célula es una parte de una pluralidad de células madre, en donde cada una de las células madre se pone en contacto con uno de una pluralidad de compuestos para identificar una subserie de la pluralidad de compuestos que tienen un efecto sobre la diferenciación de las células madre. 6 EJEMPLOS 6.1 EJEMPLO 1: MÉTODO DE PREPARACIÓN DE LA BIOFABRICA DE COLÁGENO MATERIALES Los siguientes materiales fueron utilizados durante la preparación de la biofábrica de colágeno.

Materiales/Equipo • Copia del registro de entrega • Copia del material/Historial de salud de la familia/Consentimiento informado • Etiqueta de código de barras fuente (Número ID del donador) • # de recolección (un número secuencial se asigna al material que ingresa) • Registro de procesamiento del tejido (# ID del Documento ANT-19F) ; se lleva un registro detallado del procesamiento de cada número de lote • Placenta humana (de menos de 48 horas al inicio del procesamiento) • Pinzas quirúrgicas estériles/Hemostatos • Tijeras estériles • Bisturi estéril • Hojas Steri-Wrap estériles • Cell Scraper (rasqueta de células) estéril (Nalgene NU C Int. R0896) • Gasa estéril (PSS 4416 no estéril, esterilizado) • Bandejas de acero inoxidable para enjuague, estériles • Bandejas de acero inoxidable de procesamiento, desinfectadas • Bote de plástico desinfectado • Solución de NaCl al 0.9%, estéril (Baxter 2F7124) • Agua estéril (Milli Q plus 09195 o Baxter 2F7113) • Recipientes para muestra, estériles (VWR 15704-014) • Equipo de protección personal (que incluye guantes estériles y no estériles) • Cuarto limpio certificado • Solución descelularizante previamente preparada (D- cell) ; ácido desoxicólico sodio monohidrato al 0.01- 1 9- • Bote desinfectado • Plataforma oscilante (VWR Modelo 100) • Cronómetro (VWR 21376890) • Malla de bastidor de plástico desinfectada • Película de envoltura de PVC • Bomba de vacío (Schuco-Vac 5711-130) • Secador de gel (es decir, secador de calor; BioRad Modelo 583) • Tablero cortante de acero inoxidable, desinfectado • Bolsas para envasado • Regla de acero inoxidable, estéril (General Tools MFG. Co 1201) • Termómetro digital rastreable (Modelo 61161-364, Control Company) • Sellador automático Accu-Seal (Accu-Seal, Modelo 630-1B6) La madre embarazada fue analizada en el momento del nacimiento por enfermedades transmisibles como HIV, HBV, HCV, HTLV, sífilis, CMV y otros patógenos virales y bacterianos que puedan contaminar los tejidos placentarios que se recolectan. Solo tejidos recolectados de donadores cuyas madres dieron prueba negativa o no reactiva a los patógenos antes mencionados fueron utilizados para producir la biofábrica de colágeno.

Luego del nacimiento normal, la placenta, cordón umbilical y sangre de cordón umbilical fueron expulsados espontáneamente del útero en contracción. La placenta, cordón umbilical y sangre de cordón umbilical recolectados luego del nacimiento. Los materiales fueron transportados al laboratorio donde éstos fueron procesados en condiciones asépticas en un cuarto limpio que tenia sistema de filtración HEPA, que fue encendido al menos una hora antes del procesamiento. En todo momento durante el manejo del producto se utilizaron guantes (estériles o no estériles, según fue adecuado) . Todos los segmentos no utilizados (desechos) del amnion/corion y líquidos contaminados obtenidos durante el procesamiento del tejido fueron desechados tan pronto como fue posible.

PASO I. Se dispuso un campo estéril con hojas Steri-Wrap estériles y los siguientes instrumentos y accesorios para el procesamiento se colocaron sobre éste.

Paquete de bandejas estéril Cell Scraper estéril Bisturí estéril Bandeja de procesamiento desinfectada El #ID del paquete estéril fue anotado en el Registro de procesamiento.

La placenta fue retirada de envase de transporte y se colocó sobre la bandeja de acero inoxidable desinfectada. Utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas, el cordón umbilical fue cortado aproximadamente 2 pulgadas desde el disco placentario. El cordón umbilical fue colocado en un envase estéril diferente para otro procesamiento. El envase fue etiquetado con el código de barras de la ID del tejido; y se identificó el material y las soluciones de almacenamiento presentes (por ejemplo el tipo de medios) . En algunos casos, el cordón umbilical fue descartado si no era solicitado para otros proyectos.

Comenzando desde el borde de la membrana placentaria, el amnion fue separado del corion utilizando disección roma con los dedos. Esto se hizo antes de cortar la membrana.

Después de que el amnion fue separado de toda la superficie del corion y 1 disco placentario, la membrana amniótica fue cortada alrededor del fragmento del cordón umbilical con tijeras y se desprendió del disco placentario. En algunos casos, si la separación del amnion y corion no fue posible sin rasgar el tejido, el amnion y corion fueron cortados del disco placentario como una pieza y luego se separaron.

El corion fue colocado en un recipiente para muestra diferente para ser utilizado para otros proyectos. El envase fue etiquetado con el Código de Barras ID del tejido, el material y soluciones de almacenamiento presente (por ejemplo, el tipo de medios) fueron identificados, se anotaron las iniciales y la fecha.

Si alguna pieza de amnion todavía estaba unida al disco placentario, esta fue desprendida del disco y cortada alrededor del cordón umbilical con tijeras. La placenta fue colocada otra vez en el envase de transporte para ser utilizada para otros proyectos.

Los datos apropiados fueron anotados en el Registro de procesamiento del tejido.

Se mantuvo la membrana amniótica en la bandeja con solución NaCl al 0.9%, estéril. Preferentemente, la membrana amniótica se almacena en refrigeración durante un máximo de 72 horas durante el tiempo de parto antes del siguiente paso del proceso.

PASO II. La membrana amniótica fue retirada del recipiente para muestras una pieza a la vez y colocada en la bandeja de acero inoxidable desinfectada. Otros pedazos fueron colocados en una bandeja de acero inoxidable, estéril, diferente llenada con agua estéril hasta que estuvieron listos para ser limpiados.

Otros pedazos del amnion de la bandeja de procesamiento fueron retirados y colocados en una bandeja de acero inoxidable para enjuague, diferente, llenada con agua estéril.

La membrana amniótica fue enjuagada con agua estéril si estaba visiblemente contaminada con sangre materna o fluidos/materiales fetales cambiando aunque el agua estéril según fue necesario.

La membrana amniótica fue colocada en la bandeja de procesamiento con el lado materno hacia arriba. Utilizando un Cell Scraper estéril, tanto como fue posible de la contaminación visible y material celular del lado materno del amnion se retiró cuidadosamente. (Nota: debe aplicarse presión mínima para este paso para evitar rasgar la membrana) . Se utilizó agua estéril para ayudar a retirar las células y desechos celulares. La membrana amniótica fue además enjuagada con agua estéril en la bandeja de enjuague de acero inoxidable, estéril, diferente .

La membrana amniótica fue volteada de modo que el lado fetal estuviera hacia arriba y se colocó otra vez sobre la bandeja de procesamiento y se enjuagó con agua estéril. El material celular visible y desechos fueron retirados suavemente utilizando el Cell Scraper (Nota: debe aplicarse presión mínima en este paso para evitar rasgar la membrana) . Se utilizó agua estéril para ayudar a separar las células y desechos celulares.

La membrana amniótica fue enjuagada con agua estéril entre rondas de limpieza en bandejas de enjuague estériles, diferentes. El tejido fue limpiado tantas veces (rondas de limpieza) según fue necesario para retirar la mayor parte, sino todo el material celular visible y los desechos de ambos lados de la membrana. Entre enjuagues se cambió el agua estéril en las bandejas de enjuague.

La bandeja de procesamiento fue enjuagada con agua estéril después de cada ronda de limpieza.

Todas las piezas del amnion fueron procesadas en la misma forma y colocadas en el mismo envase. Se fijó el código de barras de la ID del tejido, el material y las soluciones de almacenamiento presentes (por ejemplo el tipo de medio) fueron identificados, se anotaron las iniciales y la fecha.

La información apropiada y la fecha fueron anotadas en el Registro de procesamiento del tejido.

PASO III. Se retiró la membrana amniótica de la bandeja de enjuague (o del envase de almacenamiento) , el fluido en exceso fue ligeramente exprimido con los dedos y la membrana fue colocada en el envase para muestra, estéril. El envase fue llenado hasta la marca de 150 mL con solución D-cell, cerciorándose que toda la membrana amniótica estuviera cubierta y se cerró el envase .

Se colocó el envase en el bote sobre la plataforma oscilante. Se encendió la plataforma oscilante y la membrana fue agitada en solución D-cell durante un mínimo de 15 minutos y un máximo de 120 minutos en el #6.

Se preparó un nuevo campo estéril con nuevos instrumentos estériles y la bandeja desinfectada en la misma forma que en el Paso I. Se anotó el número de ID del paquete estéril en el Registro de procesamiento.

Después de que la agitación fue completa, la plataforma oscilante fue apagada y se retiró la membrana del envase. La membrana se colocó en una nueva bandeja de procesamiento de acero inoxidable, estéril. Se adicionó solución NaCl al 0.9%, estéril para cubrir la base de a bandej a .

Utilizando un nuevo Cell Scraper estéril, D-cell residual y material celular (si lo había) fue retirado de ambos lados del tejido. Este paso se repitió tantas veces según fue necesario para retirar tanto como fue posible el material celular residual visible de toda la superficie en ambos lados. La membrana fue enjuagada con solución NaCl al 0.9%, estéril, en una bandeja de enjuague separada entre rondas de limpieza. La solución de NaCl al 0.9%, estéril, se cambió en las bandejas de enjuague entre enjuagues.

Después de que se terminó la última ronda de limpieza, la membrana fue enjuagada con solución de NaCl al 0.9%, estéril y se colocó en el nuevo recipiente para muestras, estéril, llenado con solución de NaCl al 0.9%, estéril .

Todas las piezas restantes de la membrana amniótica fueron procesadas exactamente en la misma forma.

Cuando todas las piezas de la membrana amniótica fueron procesadas y se colocaron en el envase con solución de NaCl al 0.9%, estéril, el envase se colocó en el bote sobre la plataforma oscilante para agitar durante un mínimo de 5 minutos en el #6. Después de que la agitación fue completa, la membrana fue retirada del envase para muestras, la solución de NaCl al 0.9%, estéril se cambió en el envase y la membrana fue colocada otra vez en el recipiente para muestra.

El recipiente para muestras fue etiquetado con el Código de barras de la ID del tejido y la etiqueta de cuarentena. El material y las soluciones de almacenamiento presentes (por ejemplo tipo de medio) fueron identificadas, se anotaron las iniciales y la fecha. El recipiente para muestra se colocó en una bolsa zip-lock limpia y se colocó en el refrigerador (2-8 °C) .

Se anotaron todos los datos apropiados en el Registro de procesamiento del tejido.

Cuando se tuvieron disponibles los resultados de la serologia, la etiqueta apropiada (Serologia negativa o Para uso de investigación solamente) fue colocada en la parte alta de la etiqueta de cuarentena y se separaron estos envases de los de cuarentena: PASO IV. Antes de proceder con el Paso IV, la Revisión del estado del tejido fue verificado para cerciorarse que todos los resultados de las pruebas pertinentes fueran negativos.

Se preparó un campo estéril con la hoja Steri-Wrap estéril y todos los instrumentos estériles y desinfectados y los accesorios fueron colocados en la misma forma que en los Pasos II y III.

Se retiró la membrana del refrigerador y se colocó en una nueva bandeja de procesamiento, de acero inoxidable, estéril. La solución de NaCl al 0.9%, estéril, fue adicionada para cubrir la base de la bandeja.

Todo el material celular visible y los desechos (si los había) fueron retirados suavemente utilizando un nuevo Cell Scraper estéril (Nota: debe aplicarse presión mínima para este paso para evitar rasgar la membrana) . Se utilizó solución de NaCl al 0.9%, estéril para ayudar a retirar las células y los desechos.

Se enjuagó la membrana en la bandeja de enjuague, de acero inoxidable, estéril, diferente, llenada con solución de NaCl al 0.9%, estéril. Entre rondas de limpieza se cambió la solución de NaCl al 0.9%. Se colocó la membrana en un nuevo recipiente para muestras, estéril, se llenó el recipiente con solución de NaCl al 0.9%, estéril, reciente y se colocó en la plataforma oscilante para agitación durante un mínimo de 5 minutos en el ajuste #6.

Se repitió tres veces el paso anterior y la solución de NaCl al 0.9%, estéril, se cambió entre cada agitación. Se anexaron los datos apropiados en el Registro de procesamiento del tejido.

La membrana fue retirada del recipiente para muestras una pieza a la vez, el fluido en exceso fue exprimido suavemente con los dedos y la membrana se colocó sobre una bandeja de procesamiento, estéril. La membrana fue suavemente estirada hasta que estuvo plana; cerciorándose de que el lado fetal estuviera abajo .

Se preparó el bastidor cortando la hoja de plástico desinfectada con tijeras estériles. El tamaño del bastidor debe ser aproximadamente 0.5 cm más pequeño en cada dirección que el segmento de la membrana. Se enjuagó el bastidor en la bandeja de enjuague llenada con solución de NaCl al 0.9%, estéril.

Se colocó el bastidor sobre la superficie de la membrana ligeramente estirada y se presionó sobre éste suavemente. Es importante que el lado liso del bastidor de plástico se encuentre frente al tejido.

Utilizando un bisturí, la membrana fue cortada alrededor del bastidor dejando aproximadamente 0.5 cm extendiéndose más allá de los bordes del bastidor. La membrana en exceso fue colocada otra vez en el recipiente para muestras .

Los bordes de la membrana que se extendieron más allá del bastidor fueron envueltos sobre los bordes del bastidor utilizando pinzas y se apartaron sobre la misma bandej a .

La siguiente pieza de membrana fue procesada en la misma forma. Se prefiere que el área total que ha de ser secada no exceda 300 cm2 por secador con calor. Durante la ''preparación del bastidor' de la pieza de membrana, se prefiere que las piezas que no van en el bastidor permanezcan en el recipiente en solución de NaCl al 0.9%, estéril.

Las temperaturas de secado de los secadores fueron establecidas y verificadas utilizando un termómetro digital calibrado con sonda extendida. La temperatura de secado fue establecida a 50°C. Los datos fueron anotados en el Registro de procesamiento del tejido.

Se encendió la bomba de vacio.

Se colocó una gasa estéril sobre la plataforma de secado del secador con calor, cubriendo un área ligeramente más grande que el área de la membrana del bastidor. Es importante cerciorarse que el espesor total de la capa de gasa no exceda el espesor de una gasa doblada 4 x 4.

Una hoja de malla de bastidor, de plástico, se colocó en la parte alta de la gasa. Los bordes de la malla de plástico deben extenderse aproximadamente 0.5-1.0 cm más allá de los bordes de la gasa.

La membrana del bastidor fue ligeramente levantada y colocada sobre la plataforma del secador con calor en la parte alta de la malla de plástico con el lado de la membrana hacia arriba. Esto se repitió hasta que la cantidad máxima de membrana (sin exceder 300 cm2) estuvo sobre la plataforma del secador con calor. (Nota: el lado fetal del amnion está hacia arriba) .

Una pieza de película de envoltura de PVC se cortó bastante grande para cubrir toda la plataforma de secado del secador con calor más un pie extra.

Con la bomba de vacío funcionando, toda la plataforma de secado del secador con calor fue ligeramente cubierta con la película de plástico dejando ½ pie extendiéndose más allá de los bordes de la plataforma de secado en ambos lados. Se prestó atención para que la película quedará herméticamente contra la membrana y la hoja del bastidor (es decir, que fuera "succionada" por el vacío) y que no hubiera fugas de aire y no arrugas sobre el área del tejido) posteriormente se cerró la tapa.

La bomba de vacio fue ajustada a aproximadamente -22 pulgadas de Hg de vacio. El manómetro de la bomba fue registrado después de 2-3 minutos del ciclo de secado. La membrana fue secada en vacio con calor durante aproximadamente 60 minutos. Aproximadamente 15-30 minutos del proceso de secado, la capa de gasa estéril fue sustituida en el secador de calor con una nueva. El espesor total de la capa de gasa no debe exceder el espesor de una gasa doblada 4 4.

Después del cambio, se tuvo cuidado para que la película de plástico quedara herméticamente contra la membrana y la hoja del bastidor y no hubiera fugas ni arrugas sobre el área de la membrana.

La integridad del sello de vacío fue revisada periódicamente verificando el manómetro de presión de la bomba. Después de la terminación del proceso de secado, el secador con calor fue abierto y la membrana fue enfriada durante aproximadamente dos minutos con la bomba funcionando .

Se preparó un nuevo campo estéril con Steri-wrap estéril y el tablero cortante de acero inoxidable desinfectado o rebajo de éste. En este momento se utilizaron guantes estériles. Con la bomba todavía funcionando, la película de plástico fue ligeramente retirada de la hoja de membrana comenzando en la esquina y manteniendo la hoja de membrana abajo con la mano enguantada. El bastidor fue ligeramente levantado con la membrana fuera de la plataforma de secado y colocado sobre el campo estéril sobre la parte alta del tablero cortante de acero inoxidable, desinfectado, con el lado de la membrana hacia arriba. Utilizando un bisturí, la hoja de membrana fue cortada a través haciendo una incisión a lo largo del borde 1-2 mm lejos del borde del bastidor. La membrana se mantuvo en el lugar con una mano enguantada (guante estéril) . Suavemente la hoja de membrana fue levantada del bastidor separándola lentamente y luego fue colocada sobre el campo estéril sobre el tablero cortante.

Utilizando bisturí y tijeras afiladas, la hoja de membrana fue cortada en segmentos de tamaño especificado. Todas las piezas fueron cortadas y aseguradas sobre el campo estéril antes del envasado. Una sola pieza de membrana fue colocada dentro del envase peel pouch internos con una mano (estéril) sosteniendo la bolsa con otra mano (no estéril) . Se tuvo cuidado de no tocar las bolsas con la mano "estéril" [sic] . Después de que todas las piezas estuvieron dentro de las bolsas internas, estas fueron selladas. Se fijó una etiqueta con la información apropiada (por ejemplo, # de parte, # de lote, etc.) en el área designada en el exterior de la bolsa. Todas las piezas de membrana fueron procesadas en la misma forma. Los envases peel pouc etiquetados y sellados fueron colocados en la bolsa zip-lock a prueba de agua para el almacenamiento hasta que éstas estuvieron listas para ser enviadas a la planta de esterilización o el distribuidor. Se anotaron todos los datos apropiados en el Registro de procesamiento de tejido. 6.2 EJEMPLO 2: MÉTODO ALTERNATIVO PARA PREPARAR BIOFÁBRICA DE COLÁGENO Se prepara una placenta prácticamente como se describe en el Paso I del Ejemplo 1, utilizando los materiales de este ejemplo. Una madre embarazada es analizada en el momento del nacimiento para enfermedades transmisibles como HIV, HBV, HCV, HTLV, sífilis, CMV y otros patógenos virales y bacterianos que puedan contaminar los tejidos placentarios que se recolectan. Solo tejidos recolectados de donadores cuyas madres dieron prueba negativa o no reactiva a los patógenos antes mencionados se utilizan para producir la biofábrica de colágeno.

Se prepara un campo estéril con hojas Steri-Wrap estériles y los siguientes instrumentos y accesorios para el procesamiento fueron colocados sobre éste: paquete de bandejas estériles; bandeja de enjuague, copa de acero inoxidable, pinza/hemostatos, pinzas, tijeras, gasa.

La placenta se retira del envase de transporte y se coloca sobre la bandeja de acero inoxidable desinfectada. Utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas, el cordón umbilical es cortado aproximadamente 2 pulgadas desde el disco placentario.

Comenzando desde el borde de la membrana placentaria, el amnion se separa del corion utilizando disección roma con los dedos. Esto se hace antes de cortar la membrana. Después de que el amnión se separa de toda la superficie del corion y el disco placentario, la membrana amniótica se corta alrededor del segmento del cordón umbilical con tijeras y se desprende del disco placentario. En algunos casos, si la separación del amnion y el corion no es posible sin rasgar el tejido, el amnion y el corion se cortan del disco placentario como una pieza y luego se separan.

Los datos apropiados se anotan en el Registro de procesamiento del tejido.

La membrana amniótica se enjuaga con solución de NaCl al 0.9%, estéril, para retirar la sangre y fluido o materiales fetales. La solución salina se sustituye según sea necesario durante este enjuague.

El amnion se coloca entonces en una solución salina al 0.9%, ácido desoxicólico al 1.0% en un recipiente para muestras y se refrigera a 2-8°C durante hasta 15 días, con cambios de la solución cada 3-5 días. Durante o al final de la incubación, las pruebas serológicas antes mencionadas son evaluadas. Si las pruebas indican contaminación con uno o más patógenos, se rechaza el amnion y no se procesa más. El tejido que indica que se obtuvo de un donador CMV positivo, no obstante, todavía es apropiado para la producción de la biofábrica.

Una vez de que se termina el periodo de incubación, el amnion es retirado del recipiente para muestras, se coloca en una bandeja estéril y se enjuaga tres veces con solución de NaCl al 0.9% para reducir el ácido desoxicólico del tejido. Con el amnion colocado con el lado materno hacia arriba, el amnion se raspa suavemente con un cell scraper para retirar tanto material celular como sea posible. Se adiciona más salina según sea necesario para ayudar a retirar las células y desechos celulares. Este paso se repite para el lado fetal del amnion. El raspado es seguido por enjuague, y se repite, ambos lados, tantas veces como sea necesario para retirar células y material celular. El amnion raspado se enjuaga colocando el amnion en solución de NaCl al 0.9% en un envase separado sobre una plataforma oscilante durante 5-120 minutos en el #6. Se reemplaza la solución salina y se repite el enjuague oscilante.

Después de que el enjuague está completo, como una opción, se almacena el amnion en una bolsa zip-lock en un refrigerador.

El amnion raspado se coloca entonces con el lado fetal hacia abajo sobre una bandeja de procesamiento estéril. El amnion se masajea suavemente a mano para retirar el liquido en exceso, y para aplanar la membrana. Una hoja de plástico estéril se corta de modo que sus dimensiones sean aproximadamente 0.5 cm más pequeñas en cada dirección que el amnion plano. Esta hoja de plástico se enjuaga brevemente en solución de NaCl al 0.9%. La hoja de plástico se coloca, con el lado liso hacia abajo, sobre el amnion aplanado, dejando un margen de amnion descubierto. Se utiliza el bisturi para recortar el amnion, dejando aproximadamente 0.5 cm extendiéndose más allá de los bordes de la hoja. Estos bordes de amnion en extensión se envuelven otra vez sobre la hoja de plástico. El área total del tejido para ser secada no excede 300 cm2 para un secador con calor y vacio normal.

Una hoja de gasa estéril se coloca en un secador con calor y vacio. Una malla de plástico delgada se coloca sobre la gasa de modo que aproximadamente 0.5-10.0 cm se extienda más allá de los bordes de la gasa. El amnion y la hoja de plástico se colocan entonces en el secador con calor y vacio sobre la parte alta de la malla, con el lado del tejido hacia arriba, y el amnion está cubierto con la hoja de película de envoltura de PVC. El secador se ajusta a 50°C y se verifica periódicamente la temperatura para cerciorarse de que se mantenga 50 °C + 1°C. Luego la bomba de vacío se enciende y se ajusta a aproximadamente -22 pulgadas de Hg de vacío. Se deja que el secado proceda durante 60 minutos.

El amnion secado se almacena entonces en un envase de plástico sellado para otro uso. 6.3 EJEMPLO 3; LAMINADO DE LA BIOFÁBRICA DE COLÁGENO La biofábrica de colágeno producida por los métodos antes descritos fue laminada como sigue. La biofábrica de colágeno seca fue, en algunos casos, rehidratada en solución de NaCl al 0.9%, estéril, durante una hora, 10 minutos a 1 hora, 30 minutos. La biofábrica de colágeno seca fue producida por todo el procedimiento antes indicado (Ejemplo 1), luego fue laminada; la biofábrica de colágeno húmeda fue preparada hasta el Paso III, luego fue laminada. Después de que los bastidores de montaje fueron cortados, el tejido rehidratado fue montado colocando el lado fetal hacia abajo, colocando el bastidor de montaje en la parte superior del tejido y cortando el tejido, dejando aproximadamente un borde de 1 cm alrededor del bastidor. El borde de 1 cm fue doblado sobre el borde del bastidor utilizando un cell scraper. Estos pasos fueron repetidos para la adición de otras piezas de biofábrica de colágeno húmeda. La biofábrica laminada fue luego colocada en un secador de gel y secada a prácticamente sequedad (<20% del contenido de agua en peso) . Los laminados fueron luego cortados para obtener muestras de 2 x 6 cm.

Diferentes lotes de biofábrica de colágeno laminada fueron evaluados como sigue. Dimensiones de la biofábrica de colágeno laminada seca (DT) y húmeda (WT) fueron determinadas para los laminados que contenían 2, 3, 5 u 8 capas, como se muestra en la Tabla 1: Tabla I Las muestras no presentaron signos de delaminación durante los primeros dos dias después de la laminación, cuando se mantuvieron en condiciones de sequedad a temperatura ambiente. La biofábrica de colágeno laminada además no presentó signos de delaminación cuando se mantuvo en salina al 0.9%, en agitación, temperatura ambiente, durante 10 dias.

Las muestras de biofábrica de colágeno laminada, más grandes, fueron probadas para revisar la durabilidad del laminado y la resistencia a la delaminación. Muestras de 1 x 2 cm de la lista antes mencionada (es decir, DT2, DT3, WT2, WT3, WT5 y WT8) se colocaron en cajas de Petri en 5 mL de salina amortiguada con fosfato. Los ejemplares se dejaron en agitador orbital durante aproximadamente 4 horas a 95 rpm. No se observó delaminación de las muestras, durante la agitación o después durante el manejo sencillo. 6.4 EJEMPLO 4: UN EQUIPO PARA CULTIVAR CÉLULAS MADRE UTILIZANDO BIOFÁBRICA DE COLÁGENO Este ejemplo proporciona un kit o equipo para cultivar, expandir o diferenciar células madre utilizando biofábrica de colágeno.

El kit contiene, en un envase sellado, una pluralidad de placas de micropozos apropiadas para cultivar, expandir, o diferenciar células madre. La placa de micropozos puede tener 6, 12, 24, 96 pozos para el cultivo celular. En cada pozo se proporciona una hoja sencilla de biofábrica de colágeno o un laminado de biofábrica de colágeno. La biofábrica de colágeno y el laminado de la biofábrica de colágeno se producen y prepara como se describe en los Ejemplos 1-3 anteriores.

El kit también contiene una serie de instrucciones para el cultivo, expansión o diferenciación de las células madre. Además, el kit contiene uno o más envases de medio de cultivo adecuados para cultivar, expandir o diferenciar células madre y uno o más agentes que faciliten el crecimiento o diferenciación de las células madre . 6.5 EJEMPLO 5: CULTIVO, EXPANSIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS HUMANAS UTILIZANDO BIOFÁBRICA DE COLÁGENO Este ejemplo permite el cultivo, expansión o diferenciación de células madre placentarias humanas utilizando biofábrica de colágeno.

Las células madre placentarias humanas, como se utilizan en la presente, están descritas en la Publicación de la Solicitud US No. 2003/032179. Células como éstas son OCT-4+ y i¾BC-p+. Las células madre placentarias humanas se obtienen de una placenta luego de la expulsión del útero. En resumen, se exsanguina una placenta y se perfunde con un fluido de perfusión acuoso, apropiado, como puede ser un fluido isotónico acuoso en el cual se disuelve un anticoagulante. Después de la exsanguinación y un tiempo suficiente de perfusión de la placenta, se observa que las células madre placentarias migran hacia la microcirculación exsanguinada y prefundida de la placenta. Después de cultivadas en la placenta durante un tiempo suficiente, las células madre placentarias se recolectan colectando el perfundido efluente en un recipiente de recolección. Las células placentarias recolectadas de la placenta se recuperan del perfundido efluente utilizando técnicas conocidas para el trabajador experto en la técnica, como puede ser, por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad, citometria de flujo, etcétera.

Las células madre placentarias se cultivan entonces con biofábrica de colágeno utilizando el equipo como se proporciona en el Ejemplo 4. Aproximadamente 1~5 x 105 células se plaquean sobre la biofábrica de colágeno en cada pozo de la placa de micropozos del equipo. En cada pozo se adiciona 5 mL de medio de cultivo. El medio de cultivo contiene 60% de DMEM-LG (Gibco) , 40% MCDB-201 (Sigma) , 2% suero bovino fetal (FCS) (Hyclone Laboratories) , Ix de insulina-transferrina-selenio (ITS) , lx ácido linolénico-albúmina sérica de bovino (LA-BSA) , dexametasona 10_9M (Sigma) , ácido ascórbico 2-fosfato 10"4M (Sigma) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) 10 ng/mL (R&D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems), y 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina.

La placa de micropozos se cultiva en un incubador a 37 °C en una atmósfera con humedad, con 5% de C02 para permitir el recobro y la unión de las células . Todo el medio de cultivo se cambia cada dos días .

Las células madre placentarias humanas se inducen a diferenciarse en neuronas como sigue. Las células madre placentarias humanas se cultivan con biofábrica de colágeno utilizando el equipo del Ejemplo 4 durante 24 horas en medio de pre-inducción consistente en DMEM/20% FBS y beta-mercaptoetanol 1 mM. El medio de pre-inducción se retira y las células se lavan con PBS. Se adiciona medio de inducción neuronal consistente en DMEM y betamercaptoetanol 1-10 mM. De otro modo, medio de inducción consistente en DMEM/2% de DMSO/hidroxianisol butilado 200 uM puede utilizarse para mejorar la eficiencia de la diferenciación neuronal. En ciertas modalidades puede ocurrir cambios morfológicos y moleculares tan pronto como a los 60 minutos después de la exposición al medio libre de suero y betamercaptoetanol (Woodbury et al., J. Neurosci. Res., 61 : 364-370). *Se utiliza RT/PCR para detectar la expresión del receptor del factor de crecimiento del nervio y genes de la cadena pesada de neurofilamentos, los cuales son indicativos de la diferenciación neural.

Las células también se examinan para el desarrollo de un fenotipo neural, por ejemplo, el desarrollo de dendritas y/o un axon .

Las células madre placentarias, humanas, se inducen a diferenciarse en adipocitos como sigue. Las células madre placentarias humanas se cultivan con biofábrica de colágeno utilizando el equipo del Ejemplo 4 hasta 50-70% de confluencia se inducen en medio que contiene (1) DMEM/MCDB-201 con 2% de FCS, 0.5% hidrocortisona, isobutilmetilxantina 0.5 mM, indometacina 60 uM; o (2) DMEM/MCDB-201 con 2% de FCS y 0.5% de ácido linoléico. Se examinan las células en cuanto a los cambios morfológicos. Por lo regular aparecen gotas de aceite después de 3-7 dias. Se evalúa la diferenciación por PCR en tiempo real, cuantitativa, para examinar la expresión de los genes específicos asociados con adipogénesis, es decir, PPAR-y2, aP-2, lipoproteína lipasa, y osteopontina.

La diferenciación condrogénica de las células madre placentarias se lleva a cabo como sigue. Las células madre placentarias se cultivan con biofábrica de colágeno utilizando el equipo del Ejemplo 4 en MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con 15% suero de sangre de cordón. Las células madre placentarias se dividen en alícuotas en un tubo de polipropileno estéril. Se centrifugan las células (150 x g durante 5 minutos) , y se lavan dos veces en Incomplete Chondrogenesis Médium (Cambrex) . Después del último lavado, las células se resuspenden en Complete Chondrogenesis Médium (Cambrex) con un contenido de 0.01 µg/mL de TGF-beta-3 a una concentración de 5 x 10(5) células/mL . Alícuotas de 0.5 mL de células se separan en un tubo de cultivo de polipropileno de 15 mL. Las células se sedimentan a 150 x g durante 5 minutos. El sedimento se deja intacto en el medio. Tubos tapados sueltamente se incuban a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 horas. Los sedimentos celulares se alimentan cada 2-3 días con medio para condrogénesis, completo, recién preparado. Los sedimentos se mantienen suspendidos en medio por agitación diaria utilizando un vórtice de velocidad baja. Los sedimentos de las células condrogénicas se cosechan después de 14-28 días en cultivo. La condrogénesis se caracteriza por ejemplo, por observación de la producción de sustancia eosinofílica triturada, la evaluación de la morfología celular y/o la confirmación por RT/PCR de la expresión génica del colágeno 2 y/o colágeno 9, y/o la producción de mucopolisacáridos ácidos de la matriz de cartílago, según se confirmó por la tinción citoquímica con azul Alcian.

La diferenciación osteogénica de las células madre placentarias se logra como sigue. Células madre placentarias se cultivan con biofábrica de colágeno utilizando el equipo del Ejemplo 4 en medio osteogénico. El medio osteogénico se prepara a partir de 185 mL de Cambrex Differentiation Basal Médium - Osteogenic and SingleQuots (uno de cada uno de dexametasona, 1-glutamina, ascorbato, penicilina/estreptomicina, MCGS, y ß-glicerofosfato) . Las células madre placentarias del perfundido se plaquean, a aproximadamente 3 x 103 células por cm2 del área de superficie del cultivo de tejido en 0.2-0.3 mL de MSCGM por cm2 del área de cultivo de tejido. Por lo regular, todas las células se adhieren a la superficie de cultivo durante 4-24 horas en MSCGM a 37 °C en 5% de C02. La diferenciación osteogénica es inducida sustituyendo el medio con Osteogenic Differentiation médium. La morfología celular comienza a cambiar desde la aparición de una forma de uso, común de las células madre placentarias adherentes hasta una apariencia cuboide, llevada a cabo por mineralización. Algunas de las células delaminan de la superficie del cultivo de tejido durante la diferenciación.

La diferenciación pancreática de las células madre placentarias se lleva a cabo como sigue. Las células madre placentarias se cultivan con biofábrica de colágeno utilizando el equipo del Ejemplo 4, en DMEM/20% CBS, suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico, 10 ng/itiL; y el factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/mL. En lugar de CBS puede utilizarse KnockOut Serum Replacement. El medio acondicionado proveniente de los cultivos celulares neuronales positivos para nestina se adiciona al medio a una concentración de 50/50. Las células se cultivan durante 14-28 días, se realimentan cada 3-4 días. La diferenciación se caracteriza por la evaluación para proteína insulina o la expresión del gen de insulina por RT/PCR.

La diferenciación miogénica (cardiogénica) de las células madre placentarias se lleva a cabo como sigue. Células madre placentarias se cultivan con biofábrica de colágeno utilizando el equipo del Ejemplo 4, en DMEM/20% de CBS, suplementado con ácido retinóico, 1 uM; factor de crecimiento de fibroblastos básico, 10 ng/mL; y el factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/mL; y el factor de crecimiento epidérmico, 100 ng/mL. En lugar de CBS puede utilizarse KnockOut Serum Replacement (Invitrogen, Carlsbad, California) . De otro modo, las células madre placentarias se cultivan en DMEM/20% CBS suplementado con 50 ng/mL de cardiotropina-1 durante 24 horas. De otro modo, las células madre placentarias se mantienen en medio libre de proteina durante 5-7 días, luego se estimulan con extracto de miocardio humano (escalando el análisis de la dosis) . El extracto de miocardio se produce homogeneizando 1 g de miocardio humano en 1% búfer HEPES suplementado con 1% de suero de sangre de cordón. La suspensión se incuba durante 60 minutos, luego se centrifuga y se recolecta el sobrenadante. Las células se cultivan durante 10-14 dias, se realimentan cada 3-4 dias. Se confirma la diferenciación por la demostración de la expresión del gen de actina cardiaca por RT/PCR. 6.6 EJEMPLO 6: CULTIVO DE LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS Y FIBROBLASTOS SOBRE MEMBRANA AMNIÓTICA El principal objetivo de la manipulación de tejido es la regeneración de tejidos/órganos vivos para la sustitución de tejido/órganos enfermos o perdidos. La membrana amniótica es un excelente andamio para proporcionar un microentorno natural para la unión y diferenciación de las células.

Preparación de la membrana. La membrana amniótica, preparada como se describe en la presente, fue obtenida de placentas de embarazos a término, normales. El producto membrana amniótica fue descelularizado utilizando una combinación de enjuague con detergente y raspado mecánico . El producto final fue deshidratado a temperatura media y terminalmente esterilizado por radiación.

Ensayos celulares. Fibroblastos dérmicos humanos, normales (Cambrex) o células madre placentarias, obtenidas por digestión enzimática como se describe en otra parte de la presente, fueron cultivados sobre membranas amnióticas, superficies recubiertas con fibronectina (Sigma) o VITROGEN™ (colágeno bovino de cohesión) durante 4 ó 24 horas. Las células cultivadas sobre los sustratos fueron fijadas en formalina y teñidas para F-actina.

Resultados . A las 4 horas después del sembrado, se observaron distintas morfologías en respuesta a las diferentes superficies. Los fibroblastos sobre fibronectina fueron bien dispersados, presentando fibras de estrés de actina, características de un fenotipo celular adherente, mientras que los fibroblastos sobre colágeno no estaban tan dispersados, pero en cambio mostraron numerosas proyecciones filopodiales . Los fibroblastos sobre la membrana amniótica aparecen morfológicamente muy semejantes a las células cultivadas sobre fibronectina . A las 24 horas, diferencias en la morfología celular entre los diferentes sustratos son mucho menos evidentes. Las células madre placentarias se unieron a los sustratos experimentales y mostraron morfologías celulares diferenciales semejantes a las de los fibroblastos. En un experimento diferente, las características del cultivo de las células madre placentarias adherentes sobre la membrana amniótica secada fueron comparadas con las características del cultivo sobre fibronectina, colágeno o vidrio. Las superficies del cubreobjetos fueron adsorbidas con 10 µg/mL de fibronectina o 500 µg/mL de VITROGEN™. La membrana amniótica secada fue asegurada a la base de placas de 24 pozos con anillos de silicona. Las células madre placentarias fueron cultivadas a aproximadamente 1 x 104 células/cm2 sobre fibronectina, VITROGEN™, vidrio o membrana amniótica durante 24 horas. Las células fueron luego fijadas y teñidas para el citoesqueleto de actina. Los resultados mostraron que las células madre placentarias que se dispersaron sobre la membrana amniótica fueron muy semejantes a las observadas sobre las superficies recubiertas de fibronectina. Las células madre placentarias también se dispersaron sobre cubreobjetos tratados con cultivo celular y colágeno, aunque las células madre placentarias parecieron presentar células más delgadas, alargadas en comparación. Ver la Figura Conclusiones . El reordenamiento estructural dinámico del citoesqueleto de actina intracelular es fundamental para múltiples actividades celulares como la adhesión, migración y proliferación, y el medio extracelular en el cual reside desempeña una función para regular estos comportamientos celulares. Los fibroblastos celulares y las células madre placentarias sobre membrana amniótica mostraron dinámicas de dispersión celular semejantes a las células cultivadas sobre fibronectina, una proteina de matriz conocida por ser óptima para la unión y crecimiento celular. Esto sugiere que, aunque la membrana amniótica está compuesta principalmente de colágeno, otros componentes menores también pueden estar influyendo en la adhesión y proliferación celular. Estos resultados también sugieren que las células que se utilizan en este estudio, indifereneradas y terminalmente diferenciadas, encuentran en la membrana amniótica un andamio apropiado para la unión y para la funcionalidad. 6.7 EJEMPLO 7: DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE PIACENTARIAS SOBRE LA MEMBRANA AMNIÓTICA Este ejemplo demuestra la diferenciación osteogénica de las células madre placentarias sobre membrana amniótica secada.

Materiales Medio de diferenciación osteogénica: DMEM bajo en glucosa suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1 x P/S + ácido ascórbico 50uM + Dexametasona 100 nM + Beta glicerol fosfato (BGP) 10 mM.

Medio básico: DMEM bajo en glucosa con 10% FBS y 1 x P/S.

Medio de fuente de carbono alternativo: DMEM bajo en glucosa con 10% FBS y 1 x P/S + BGP 10 mM se utilizó para ver si estas células son inducibles con fuente de fosfato solo.

Métodos La membrana amniótica deshidratada, estéril, cortada a aproximadamente el tamaño de un solo pozo (aproximadamente 1.5 cm de diámetro) a partir de una hoja de 6 x 8 cm. La pieza de la membrana amniótica se mantuvo en el lugar mediante un anillo tórico de silicona cortado al tamaño del pozo (aproximadamente 1.5 cm de diámetro). Las células madre placentarias, las células madre derivadas de médula ósea (las BMSC) , y células fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) fueron sembrados sobre la membrana a aproximadamente 10000 células/cm2 en DMEM con 10% FBS y 1 x P/S. Se dejó que las células crecieran durante 2-3 dias a 37 °C en 5% COa-El medio fue luego cambiado a medio de diferenciación, medio básico o medio básico que contenia beta glicerol fosfato (BGP) . Se dejó que la diferenciación procediera durante 21 dias . Se cambió el medio cada 2-3 dias .

La tinción histológica utilizando la técnica de tinción de Mallory-Heidenhain se utilizó para evaluar la diferenciación osteogénica. Ver James E. Dennis et al., "In Vivo Osteogenesis Assay; a Rapid Method for Quantitative Analysis, " Biomaterials 19:1323-1328 (1998). En resumen, cultivos de células madre fueron fijados en 4% de paraformaldehido, e incrustadas en parafina. Secciones de 5 um de espesor fueron cortadas del bloque de parafina sobre portaobjetos de vidrio.

Preparación de las soluciones para tinción. Fucsina ácida al 0.5%: 0.5 g de fuscina ácida en 100 mL de agua destilada. Solución de azul de anilina: 0.5 g de azul de anilina, 2 g de anaranjado G, 1 g de ácido fosfotúngstico, disuelto en 100 mL de agua destilada. Todos los reactivos fueron de Sigma-Aldrich.

Procedimiento: Las secciones fueron desparafinizadas utilizando xileno y rehidratadas mediante etanol graduado. Las secciones fueron luego, enjuagadas con agua destilada y teñidas . Las secciones fueron primero teñidas con fucsina ácida en solución durante 5 minutos . El colorante en exceso fue limpiado de los portaobjetos, y los portaobjetos fueron sumergidos en solución de azul de anilina durante una hora. Los portaobjetos fueron transferidos a etanol al 95% en varios cambios para quitar el exceso de colorante. Las secciones fueron deshidratadas y montadas con resina sintética. 6.8 EJEMPLO 8: PREPARACIÓN DE BIOFÁBRICA DE COLÁGENO QUE CONTIENE ÁCIDO HIALURÓNICO RETICULADO Este ejemplo demuestra la producción de una biofábrica de colágeno compuesta que contiene un ácido hialurónico reticulado recubriendo para uso en cultivo de células madre, por ejemplo células madre placentarias.

Materiales y métodos La biofábrica de colágeno fue provista como una membrana amniótica descelularizada, deshidratada (menor que o igual a 20% de agua) . Se proporcionó ácido hialurónico (Fluka BioChimika) como una solución de 10 mg/mL en agua ultrapura. Los agentes reticuladores utilizados fueron 1, -butandiol diglicidil éter (BDDE; Sigma Aldrich), clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDCI ; Sigma Aldrich), o divinil sulfona (Fluka) .

Compuestos de ácido hialurónico El ácido hialurónico es un glucosaminoglucano que es fácilmente disponible, no costoso y biocompatible, y el cual tiene buena retención de agua y propiedades reológicas .

Se evaluaron dos diferentes métodos de reticulación del ácido hialurónico. El ácido hialurónico fue reticulado utilizando BDDE o divinil sulfona utilizando reticulación en solución, la cual incluye la combinación del ácido hialurónico con el reticulador respectivo en solución y la agitación durante la noche. El ácido hialurónico también fue reticulado utilizando EDCI por reticulación con inmersión, en la cual el ácido hialurónico fue preparado como una película o espuma sólida, seguido por inmersión de la composición en una solución que contenía el reticulador.

Las soluciones de ácido hialurónico fueron preparadas utilizando agua ultrapura. Inicialmente se determinó que si el pH es demasiado alto, no ocurre la reticulación, pero que la reticulación procedía si problemas en agua ultrapura.

Soluciones de 2 mL de ácido hialurónico (10 mg/mL) fueron preparadas y reticuládas con BDDE (en solución; 2 iL/mg de ácido hialurónico) o EDCI (por la técnica de inmersión; EDCI 15 mM en 80:20 EtOH: agua) . Ambas técnicas fueron satisfactorias para producir películas reticuládas. Visualmente, la película reticulada con BDDE pareció hincharse mucho más que la película reticulada con EDCI, indicando que la película reticulada con EDCI contenía más reticulaciones que la película reticulada con BDDE, una evaluación confirmada por análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) . De acuerdo con el análisis FTIR, prácticamente ningún reticulador permaneció en las películas de ácido hialurónico.

Debido a la gran cantidad de hinchamiento observado con la película reticulada con BDDE, la densidad de reticulación fue aumentada. Las muestras fueron preparadas con 1, 2 ó 4 µ?. de reticulado por miligramo de ácido hialurónico en solución. La reticulación se hizo a pH 5 ó pH 7. En cada caso, las soluciones fueron reticuladas durante la noche y fueron liofilizadas para producir espumas tipo esponja. Las espumas producidas en 4 µL de BDDE por miligramo de ácido hialurónico fueron muy frágiles y ligeras, y cuando se colocaron en agua, estas se desmoronaron en una masa muy blanda. Las otras combinaciones produjeron espumas que tenían estructura aceptable y las cuales se hincharon considerablemente en agua. Ni el pH ni la cantidad de BDDE parecieron hacer una diferencia sobre el contenido de agua en equilibrio (93% a 98%) o sobre la estructura según se determinó por FTIR.

Se intentaron varias estrategias para combinar ácido hialurónico y la membrana amniótica secada. Inicialmente se preparó una solución de ácido hialurónico reticulado, y 1 mL fue colocado sobre una sección de membrana amniótica secada mantenida en un bastidor que evitaba el movimiento de la membrana y fugas de la solución. El compuesto fue secado al aire y se observó buena unión. No obstante, cuando se colocó en agua, la membrana amniótica y el ácido hialurónico se separaron. En una segunda estrategia, 1 mL de solución de ácido hialurónico se colocó sobre la membrana amniótica, y el compuesto fue liofilizado. Luego del secado, el compuesto fue sumergido en una solución de EDCI en 80:20 EtOH:agua. No obstante, cuando se re-liofilizó, el HA se separó de la membrana amniótica. Cuando el secado en aire fue sustituido para la segunda liofilización, una unión estrecha se formó en la membrana amniótica y el ácido hialurónico. Cuando se colocó en agua, el ácido hialurónico se hinchó sin separarse de la membrana.

La biofábrica de colágeno, que contiene ácido hialurónico, puede utilizarse como se describe en la presente para cultivar células madre, por ejemplo, células madre placentarias, por ejemplo células madre placentarias CD34".

Equivalentes : La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades especificas que se describen en la presente. En realidad, diversas modificaciones de la invención además de las descritas serán evidentes para el experto en la técnica a partir de la descripción antes mencionada y las figuras que le acompañan. Tales modificaciones están destinadas para entrar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas .

Algunas publicaciones, patentes y solicitudes de patente se mencionan en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan para referencia en sus totalidades.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de cultivo de una célula madre que consiste en cultivar la célula madre en un medio de cultivo con biofábrica de colágeno, en donde la biofábrica de colágeno es obtenida de una placenta, y la célula madre es exógena para la biofábrica de colágeno.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene una membrana amniótica aislada de una placenta de mamífero.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene un corion aislado de una placenta de mamífero .

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene una membrana amniótica y un corion de una placenta de mamífero.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno está prácticamente seca antes del cultivo .

6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno es descelularizada antes del cultivo.

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno no es descelularizada antes del cultivo .

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene células endógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno.

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene células exógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno.

10. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque la biofábrica de colágeno es irradiada.

11. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque la biofábrica de colágeno es irradiada.

12. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la célula madre es una célula madre embriónica.

13. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la célula madre es una célula madre placentaria.

14. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la célula madre es una célula madre mesenquimática, una célula madre hematopoyética, una célula madre obtenida de sangre de placenta o sangre de cordón umbilical, una célula madre obtenida de médula ósea o una célula madre somática adulta.

15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la célula madre somática adulta es una célula madre neural, una célula madre hepática, una célula madre pancreática, una célula madre endotelial, una célula madre cardiaca o una célula madre de músculo.

16. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la célula madre es cultivada durante 24 horas o más .

17. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la célula madre es cultivada durante 2 días o más.

18. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la célula madre es cultivada durante 7 días o más.

19. Un método para expandir una célula madre, que consiste en cultivar la célula madre en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno de modo que se expanda la célula madre.

20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene una membrana amniótica aislada de una placenta de mamífero.

21. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene un corion aislado de una placenta de mamífero.

22. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene una membrana amniótica y un corion de una placenta de mamífero .

23. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la biofábrica de colágeno está considerablemente seca antes de la expansión.

24. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la biofábrica de colágeno es descelularizada antes de la expansión.

25. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la biofábrica de colágeno no es descelularizada antes de la expansión.

26. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene células endógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno.

27. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene células exógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno.

28. El método de la reivindicación caracterizado porque la biofábrica de colágeno irradiada.

29. El método de la reivindicación caracterizado porque la biofábrica de colágeno irradiada .

30. El método de la reivindicación 19 caracterizado porque la célula madre es una célula madr embriónica .

31. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la célula madre es una célula madre placentaria .

32. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la célula madre es una célula madre mesenquimática, célula madre hematopoyética, célula madre obtenida de sangre placentaria o de sangre de cordón umbilical, célula madre obtenida de médula ósea o célula -madre somática adulta.

33. El método de la reivindicación 32, caracterizado porque la célula madre somática adulta es una célula madre neural, una célula madre hepática, una célula madre pancreática, una célula madre endotelial, una célula madre cardiaca o una célula madre de músculo.

34. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la célula madre es expandida durante al menos 24 horas.

35. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la célula madre se expande durante al menos 2 días .

36. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la célula madre se expande durante al menos una semana.

37. Un método de diferenciación de una célula madre, que consiste en cultivar la célula en un medio de cultivo con una biofábrica de colágeno durante un tiempo suficiente para la diferenciación de la célula.

38. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene una membrana amniótica aislada de una placenta de mamífero .

39. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene un corion aislado de una placenta de mamífero.

40. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene una membrana amniótica y un corion de una placenta de mamífero .

41. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la biofábrica de colágeno es considerablemente seca antes de la diferenciación.

42. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la biofábrica de colágeno es descelularizada antes de la diferenciación.

43. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la biofábrica de colágeno no es descelularizada antes de la diferenciación.

44. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene células endógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno.

45. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene células exógenas a una placenta de la cual se obtiene la biofábrica de colágeno.

46. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque la biofábrica de colágeno es irradiada .

47. El método la reivindicación caracterizado porque biofábrica de colágeno irradiada.

48. El método de la reivindicación 37 además consiste en cultivar una célula somática sobre la biofábrica de colágeno.

49. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula madre es una célula madre embriónica.

50. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula madre es una célula madre placentaria.

51. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula madre es una célula madre mesenquimática, célula madre hematopoyética, célula madre obtenida de sangre placentaria o de sangre de cordón umbilical, célula madre obtenida de médula ósea o célula madre somática adulta.

52. El método de la reivindicación 51, caracterizado porque la célula madre somática adulta es una célula madre neural, una célula madre hepática, una célula madre pancreática, una célula madre endotelial, una célula madre cardiaca o una célula madre de músculo.

53. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula es diferenciada en una célula neural .

54. El método de la reivindicación 53, caracterizado porque la diferenciación consiste en poner en contacto la célula con betamercaptoetanol o hidroxianisol butilado.

55. El método de la reivindicación 54, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene el betamercaptoetanol o hidroxianisol butilado.

56. El método de la reivindicación 53, caracterizado porque la célula neural presenta producción del receptor del factor de crecimiento del nervio; expresión de un gen que codifica el factor de crecimiento del nervio; producción de la cadena pesada del neurofilamento; o expresión de un gen que codifica la cadena pesada del neurofilamento .

57. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula es diferenciada en un adipocito .

58. El método de la reivindicación 57, caracterizado porque la diferenciación consiste en poner en contacto la célula con dexametasona, indometacina, insulina y 3-isobutil-l-metilxantina.

59. El método de la reivindicación 58, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene la dexametasona, indometacina, insulina y 3-isobutil-l-metilxantina .

60. El método de la reivindicación 57, caracterizado porque el adipocito exhibe producción de vesículas lipídicas intracitoplásmicas que pueden detectarse mediante una tinción lipofílica; expresión de un gen que codifica lipasa; o producción de lipasa.

61. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula es diferenciada en un condrocito .

62. El método de la reivindicación 61, caracterizado porque la diferenciación consiste en poner en contacto la célula con el factor del crecimiento transformante beta-3.

63. El método de la reivindicación 52, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene el factor de crecimiento transformante beta-3.

64. El método de la reivindicación 61, caracterizado porque el condrocito exhibe morfología celular característica de un condrocito; producción de colágeno 2; expresión de un gen que codifica colágeno 2, producción de colágeno 9, o expresión de un gen que codifica colágeno 9.

65. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula es diferenciada en un osteocito .

66. El método de la reivindicación 65, caracterizado porque la diferenciación consiste en poner en contacto la célula con dexametasona, ácido ascórbico-2-fosfato y glicerofosfato .

67. El método de la reivindicación 66, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene dexametasona, ácido ascórbico-2-fosfato y glicerofosfato .

68. El método de la reivindicación 65, caracterizado porque el osteocito exhibe niveles de calcio característicos de un osteocito; producción de fosfatasa alcalina; expresión de un gen que codifica fosfatasa alcalina; producción de osteopontina; o expresión de un gen que codifica osteopontina.

69. El método de la reivindicación caracterizado porque la célula es diferenciada hepatocito .

70. El método de la reivindicación 69, caracterizado porque la diferenciación consiste en poner en contacto las células con el factor de crecimiento de hepatocito y el factor de crecimiento epidérmico.

71. El método de la reivindicación 70, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene el factor de crecimiento del hepatocito y el factor de crecimiento epidérmico .

72. El método de la reivindicación 69, caracterizado porque el hepatocito exhibe expresión de un gen específico del hepatocito o producción de una proteína específica de hepatocito.

73. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula es diferenciada en una célula pancreática.

74. El método de la reivindicación 73, caracterizado porque la diferenciación consiste en poner en contacto la célula con factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento transformante beta-1 y medio acondicionado por células neuronales positivas para nestina.

75. El método de la reivindicación 74, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene el factor de crecimiento de fibroblastos básico y el factor de crecimiento transformante beta-1.

76. El método de la reivindicación 73, caracterizado porque la célula pancreática exhibe producción de insulina o expresión de un gen que codifica insulina.

77. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque la célula es diferenciada en una célula cardiaca.

78. El método de la reivindicación 77, caracterizado porque la diferenciación consiste en poner en contacto la célula con ácido retinóico, factor de crecimiento de fibroblastos básico y el factor de crecimiento transformante.

79. El método de la reivindicación 78, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene el ácido retinóico, factor de crecimiento de fibroblastos básico y el factor de crecimiento transformante .

80. El método de la reivindicación 77, caracterizado porque la diferenciación consiste en poner en contacto la célula con cardiotropina.

81. El método de la reivindicación 80, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene la cardiotropina.

82. El método de la reivindicación 77, caracterizado porque la célula cardiaca presenta latido; producción de actina cardiaca; o expresión de un gen que codifica actina cardiaca.

83. Un método para determinar la toxicidad de un compuesto para una célula, que consiste en cultivar la célula con una biofábrica de colágeno en condiciones apropiadas para la supervivencia de la célula; poner en contacto la célula con el compuesto; y la identificación de un cambio en un parámetro metabólico de la célula que indique apoptosis, necrosis o muerte celular, o una tendencia hacia apoptosis, necrosis o muerte celular, en comparación con una célula cultivada en condiciones equivalentes y no en contacto con el compuesto, en donde, si se identifica un cambio, el compuesto es tóxico para la célula.

84. El método de la reivindicación 83, caracterizado porque la célula es una célula somática.

85. El método de la reivindicación 83, caracterizado porque la célula es una célula madre embriónica.

86. El método de la reivindicación 83, caracterizado porque la célula es una célula madre placentaria.

87. El método de la reivindicación 83, caracterizado porque la célula es una célula madre mesenquimática, una célula madre hematopoyética, una célula madre obtenida de sangre placentaria o de sangre de cordón umbilical, una célula madre obtenida de médula ósea o una célula madre somática adulta.

88. El método de la reivindicación 87, caracterizado porque la célula madre somática adulta es una célula madre neural, una célula madre hepática, una célula madre pancreática, una célula madre endotelial, un célula madre cardiaca o una célula madre de músculo.

89. Un método para cultivar una célula madre, que consiste en cultivar la célula madre con una biofábrica de colágeno que contiene una pluralidad de células madre placentarias; y el cultivo de la célula madre en condiciones apropiadas para la supervivencia de la célula madre .

90. El método de la reivindicación 89, caracterizado porque la célula madre es una célula madre embriónica.

91. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene ácido hialurónico .

92. El método de la reivindicación 91, caracterizado porque el ácido hialurónico es reticulado a la biofábrica de colágeno.

93. El método de la reivindicación 89, caracterizado porque la biofábrica de colágeno contiene ácido hialurónico .

94. El método de la reivindicación 93, caracterizado porque el ácido hialurónico es reticulado a la biofábrica de colágeno.