KR20050000398A - 혈관신생의 조절자의 동정 방법, 그것에 의하여 발견된화합물 및 그 화합물을 이용한 치료방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간세폴르 이용한 혈관신생의 조절자를 동정하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 시험관내 분석체계에 있는 인간의 다능성 줄기세포를 활용하여 인간의 혈관신생을 조절하기 위해서 분석물 및 작은 분자에 적용된다. 본 발명은 또한, 비배아 다능성 줄기세포를 이용하여 시험관내 분석체계에 있는 자발적인 혈관생성을 테스트 화합물이 조절하도록 결정함에 의하여 인간의 혈관신생의 조절자를 밝혀내는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인간의 혈관신생 또는 인간의 혈관생성을 조절하는 화합물을 밝혀내기 위하여 비배아 다능성줄기세포를 이용하는 시험관내 분석 시스템에 관련한다. 본 발명은 또한, 인간의 혈관신생 또는 혈관생성의 억제제로 밝혀진 치료화합물 또는 소분자를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 인간의 혈관신생 또는 혈관생성의 조절을 필요로 하는 치료 방법에 관련한다.

Description

혈관신생의 조절자의 동정 방법, 그것에 의하여 발견된 화합물 및 그 화합물을 이용한 치료방법{METHODS FOR IDENTIFICATION OF MODULATORS OF ANGIOGENESIS, COMPOUNDS DISCOVERED THEREBY, AND METHODS OF TREATMENT USING THE COMPOUNDS}
그동안 인간의 혈관신생을 조절하는 화합물의 규명과 발생에 지대한 관심이 있었다. 인간의 혈관신생 및 혈관생성을 조정하는 화합물을 규명함에 있어서 주요 장애는, 생체조건안에서 발생하는 인간의 혈관신생 및 혈관생성을 제공할 수 있는시험관내 분석체계의 부족이다.
몇몇 질병작용들은 종양침입, 종양전이, 병리학적인 혈관신생, 염증 및 자궁내막증을 포함하여서 병리학의 일부분으로서 내피세포의 침입 또는 이동을 필요로 한다고 증명되었다(Aznavoorian et al의 1993년도 Cancer 71(4)호 1368-1383페이지 참조; Fernandez et al.의 1995년도 Fertil. and Steril. 63(1)호 45-51페이지 참조; Fox et al의 1996년도 J.Pathol.179호 232-237페이지 참조; Lennarz et al.의 1991년도 Biochim. Biophys. Acta 1071호 149-158페이지 참조; Liotta et al.의 1991년도 Cell 64호 327-336페이지 참조; Mareel et al.의 1990년도 Cancer and Metastasis Rev.9호 45-62페이지 참조; Osborn의 1990년도, Cell 62호 3-6페이지 참조). 혈관신생은 또한, 혈관신생에 따라서 관절염과 아테롬성 동맥경화증 플라크, 당뇨병성 망막증, 신생혈관 녹내장, 트라코마 및 각막의 이식 neovascularization, 건선, 경피증, 혈관종 및 비대성자국, 혈관유착 및 혈관섬유종을 포함하는 기타 질환 또는 조건에도 관여한다
혈관신생은 이전에 존재하는 혈관으로부터 새로운 혈관신생의 과정이다. 혈관생성은 내피세포의 단일막으로부터 관상형성의 과정이다. 정상적인 생리학상 조건이라면 인간이나 동물은 매우 특정한 상황에서 혈관신생과 혈관생성을 경험하게되는데, 상처치유, 태아/배아 발생, 신체 leteum의 형성, 자궁내막 및 태반 등이 그 예이다.
내피세포는 모든 혈관을 따라서 혈류와 주변조직 사이의 교환을 조절하는 세포의 단일막을 형성한다. 새로운 혈관은 이러한 내피 세포의 성장에 의하여 존재하는 작은 혈관의 벽으로부터 발달하는데, 배양에서 분리될 때에서조차 속빈 모세관을 형성할 수 있다. 맥관계가 완전하게 발달되면 혈관의 내피세포는 일반적으로 새로운 관을 형성하지 않고 무활동으로 남아 있게 된다. 질환이나 부상이 발생한다면, 새로운 혈관의 형성은 자연적인 상처이유에서와 같이 정상적으로 진행한다.새로운 혈관이 불충분하게 형성되게 된다면 만성피부궤양을 초래하게 된다. 성장의 비조절은 종양형성, 당뇨병성 망막증, 건선 및 염증에서와 같이 혈관밀도에서의 비정상적인 증가로 이어지게 된다. 그러므로 적절하지 않은 혈관신생의 억제 또는 치료되지 못한 상처에서 혈관신생의 증대는 약품발견 프로그램에서 매우 중요한 목표이다. 그러나 이 영역에서의 연구는 생체조건안 혈관의 자연환경을 정확하게 제공할 수 있는 혈관신생의 생체조건밖 모델의 부족으로 인하여 지체되어 왔다.
혈관신생은 성장인자, 세포밖의 세포간직분자, 효소 및 다양한 세포유형의 관범위한 범위를 포함하는 매우 복잡한 작용이다. 그러한 복잡성은 전체 생체조건안 작용을 모형화하는 생체조건밖 분석을 발달시킴에 주요하게 곤란한 점으로 나타난다. 혈관신생은 분아증식, 이주, 분화라는 세가지 시기로 나뉘어진다. 분석은 각 시기를 따로 모형화하며 존재한다. 특히, 단순한 생체내 분석은 세포유형 범위의 분아증식에서 변화를 측정하고 최하부 막단백질에 걸친 이주를 평가한다. 현재의시험관내 분석 시스템은 단백질 세포간질의 제공에 의존하는데, 일반적으로 내피 세포가 혈관을 형성하는 능력을 측정한다. 분화를 측정하는 분석 시스템은 내피세포에 의한 cord-like 구조의 형성을 포함한다. 그러한 모든 시스템은 세포에 외인성의 최하부단백질을 공급함에 달려 있고 세포가 이주하여 세관을 형성한다. 그러나, 이러한 분석의 문제점은 이 모든 것들이 혈관신생에 필요한 모든 단계를 결합하지 않는다는데 있다.
시험관내 모형화 시스템은 쥐를 이용한 대동맥 고리모델이다. 쥐 대동맥 고리모델에서, 쥐 대동맥 고리 외식 배양이 단기 및 장기 유지 조건에서 이용된다. 이 분석 시스템에서 쥐 대동맥 고리 체절은 내피과 근육세포의 순수한 모집단을 얻기 위하여 3-4일동안의 단기 유지조건에서 배양된다. 장기에 걸친 쥐 대동맥 고리 외식 배양은 내피세포와 민무늬 근육 세포를 모두 분아증식시키고 성장시키도록 한다(Diglio외, 1989년도 Laboratory Investigation 60(4), 523-531페이지)
최근에는 혈관신생을 연구하기 위하여 인간의 시험관내 분석을 발생시키고자 하는 또다른 시도가 있었는데, 콜라겐젤에서 11-12일 된 배(embryos)로부터 배아기 대동맥 고리 외식을 이용하였다(Allesandri외, 2001년도 Laboratory Investigation 81(6), 875-885 페이지).
혈관신생의 결합단계를 모형화하는 다른 시험관내 분석은 태어난지 6시간 이내에 얻어진 인간의 태반 조직으로부터 혈관 절편의 이용을 포함하기도 하고(Parish외, 미국특허 제 5,976,782호), 상업적인 불결한 경동맥을 이용하기도 하며(Stiffey-Wilusz, 미국특허출원 제 2001/0046666호), 내피세포와 섬유모세포의이중 배양을 이용하기도 한다(Grant외, WO 99/17116; Grant외 미국출원 제 2001/0005581호). 성인 인간의 피부 섬유모세포에서 인간 탯줄 정맥 내피세포를 세포비 2:1 내지 8:1로 이중 배양시켜서 다세포 모델은 생체내 혈관신생에 가장 유사하다(Grant외, WO 99/17116호; Grant외, 미국특허출원 제 2001/0005581호).
그러나 지금까지 혈관신생 모델은 줄기세포, 혈관조직과 연관된 줄기세포, 그 어떤 줄기세포나 혈관조직부분과 연관된 종양세포를 이용하지 않았었다. 이러한 세포들을 이용하는 혈관신생분석은 이전에 설명된 분석보다 혈관신생과정을 더욱 정확하게 반영한다.
본 출원은 2002년 4월 12일자 출원된 미국의 가출원 제 60/372,127 호에서 비롯한 것으로서 하기에서 인용된다.
1. 개요
본 발명은 혈관세포 또는 비배아 줄기세포를 이용하여 혈관신생의 조절자를 밝혀내는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 시험관내 분석체계에 있는 인간의 다능성 줄기세포를 활용하여 인간의 혈관신생을 조절하기 위해서 분석물 및 작은 분자에 적용된다. 본 발명은 또한, 비배아 다기능성 줄기세포를 이용하여 시험관내 분석체계에 있는 자발적인 혈관생성을 테스트 화합물이 조절하도록 결정함에 의하여 인간의 혈관신생의 조절자를 밝혀내는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인간의 혈관신생 또는 인간의 혈관생성을 조절하는 화합물을 밝혀내기 위하여 비배아 다능성줄기세포를 이용하는 시험관내 분석 시스템에 관련한다. 본 발명은 또한, 인간의 혈관신생 또는 혈관생성의 반응억제제로 밝혀진 치료화합물 또는 소분자를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 인간의 혈관신생 또는 혈관생성의 조절을 필요로 하는 치료 방법에 관련한다.
도 1(A-D)은 6.2부분에서 설명된 탯줄관 고리 분석에 있는 배양된 세포 사진이다. 도 1A는 양성관리이다. 체외이식편이 배지 +EGCF 200㎍/ml에서 배양된다. 체외이식편으로부터 이주한 무수한 세포들이 체외이식편을 둘러싸고 개별세포들은 넓은 범위에 걸친 성장을 나타내었다. 도 1B는 음성관리이다. 체외이식편이 태반조건의 배지 +supplement에서 배양된다. EGCF가 없으므로 세포들이 양성관리(A)에서보다 체외이식편으로부터 이주하지 못한다. 도 1C는 처리군 3이다. 체외이식편은 태반조건의 배지 +EGCF 200㎍/ml +ThalomidTM100㎍/ml 에서 배양되었다. ThalomidTM가100㎍/ml 있으므로, 세포들이 양성관리(A)에서보다 체외이식편으로부터 짧은 거리만큼 이주했다. 도 1D는 처리군 2이다. 체외이식편이 태반조건의 배지 +EGCF 200㎍/ml +ThalomidTM10㎍/ml 에서 배양되었다. ThalomidTM가 10㎍/ml 있으므로, 세포들이 체외이식편으로부터 짧은 거리만큼 이주했고 양성관리(A)에서보다 덜 조밀하게 성장함을 보여주었다.
도 2(A-C)는 6.2부분에서 설명된 바와 같은 탯줄관 고리분석에서 배양된 세포의 사진이다. A는 관리로서, 세포들이 태반 조건의 배지 +ECGF 200㎍/ml +DMSO 1㎍/ml에서 배양되었다. B는 세포들이 태반 조건의 배지 +ECGF 200㎍/ml +DMSO 1㎍/ml +ThalomidTM1㎍/ml 에서 배양되었다. (A)에서보다 세포들이 많이 보이지 않는다. B는 세포들이 태반 조건의 배지 +ECGF 200㎍/ml +DMSO 1㎍/ml +ThalomidTM10㎍/ml 에서 배양되었다. (A)나 (B)에서보다 세포들이 적게 보인다.
도 3(A-B)는 6부분에서 설명된 바와 같은 탯줄관 고리분석에서 배양된 세포의 사진이다. A는 관리로서, 태반 조건의 배지 +DMSO에서 배양되었다. 세포들은 현저하게 비분지형성(예를 들어, 내피) 표현형을 보여준다. B에서 세포들은 태반 조건의 배지 +DMSO +ThalomidTM에서 배양되었다. 보다 많은 세포들이 (A)에서보다 분지형성(예를 들어, 신경세포) 표현형을 보여주고 있다.
도 4는 인간의 혈관신생에서 Thal1, ActimidTM(CC-4047), Fumagillin의 다른 농도 효과를 표시하고 있다.
도 5는 6.3부분에서 설명된 바와 같이 Thal1, ActimidTM(CC-4047), Fumagillin의 농도를 변화시켜서 탯줄관 고리분석에서 배양된 태반 배아유사한 줄기세포의 픽토마이크로그래프이다.
도 6은 탯줄관 고리분석의 그래프이다.
본 발명은 인간의 혈관신생 또는 인간의 혈관생성을 조절하는 화합물을 규명하기 위하여 인간의 다능성 줄기세포를 이용하는 시험관내 분석 시스템에 관한 것이다. 발명의 일실시예에서, 인간의 다능성 줄기세포는 그 기원이 태반이다. 본 발명의 선별 분석은 혈관신생 및/또는 맥관형성을 억제하거나 자극하는 화합물을 규명하는데 이용한다.
본 발명은 혈관신생의 조정자들에 대하여 분석을 선별하는 것에 관련하는데, 혈관신생되도록 하는 조건하에서 혈관의 부분들 즉, 관 고리로 인간의 다능성 줄기 세포를 배양하고, 테스트 화합물이 혈관신생 작용상에서 가지는 효과를 결정하는 단계로 구성된다. 일실시예에서 다능성 줄기세포는 그 기원에서 비배아이다. 일실시예에서 비배아 줄기 세포는 태반에서 파생된 줄기세포이다. 다른 실시예에서 혈관부분들은 그 기원이 인간인데, 바람직하게는 인간의 탯줄을 말한다.
본 발명은 또한 혈관신생의 조정자들에 대하여 분석을 선별하도록 하게 하는데, 혈관신생 되도록 하는 조건하에서 종양세포가 있는 가운데 관 고리 또는 줄기세포를 배양하고, 테스트 화합물이 혈관신생 작용상에서 가지는 효과를 결정하는 단계로 구성된다.
본 발명의 선별 분석은 (1) 적절한 성장 용기안에 내피세포의 최소 증식을 유지시키는데 적합한 배양배지를 제공하고, (2) 성장 용기내에서 24시간 이상 인간의 맥관 샘플을 배양하는데 상기 맥관은 결합조직이 없는 것이며, (3) 정기적인 간격으로 배양 배지를 교환하고, (4) 미세관 성장의 형성을 관찰하는 단계로 구성된다.
본 발명은 혈관신생의 조정자를 규명하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (1) 테스트 화합물이 존재하면서 내피세포의 성장에 적합한 시간과 조건하에서 복수의 줄기세포를 배양하고, (2) 테스트 화합물이 존재하여 맥관성장의 제어량과 비교하여 상기 줄기세포로부터 미세관 성장량을 비교하는 단계로 구성되는데, 상기 미세관 성장이 미세관 성장의 제어레벨 보다 크거나 작을 때, 테스트 화합물이 혈관신생의 조정자라고 밝혀진다. 특정 실시예를 보면, 상기 줄기세포는 맥관단면으로 배양된다. 다른 실시예를 보면, 상기 줄기세포는 복수의 종양세포로 배양된다. 다른 실시예를 보자면, 상기 줄기세포는 히드로코르티손, 표피 성장 인자 또는 소의 뇌추출물이 존재하도록 부차적으로 배양된다. 또다른 실시예를 보면 혈관신생의 상기 조정자는 항혈관신생제로 밝혀진다. 혈관신생의 상기 조정자는 혈관신생제로 밝혀진다. 테스트화합물이 존재하는 복수의 줄기세포의 상기 배양은 적어도 7일 이상이다. 다른 실시예에서는 테스트화합물이 존재하는 상기 복수의 줄기세포 배양은 적어도 14일 이상이다. 상기 줄기세포는 섬유소로 구성된 바탕질상에서 배양된다. 상기 줄기세포는 섬유소로 구성된 생리적젤에서 배양된다. 상기 줄기세포는 비변성 아교질로 구성된 생리적젤에서 배양된다.
다른 실시예를 보면, 혈관신생의 조정자를 규명하는 방법을 제공하는데 상기 방법은 (1) 내피세포와 상기 종양세포의 성장에 적합한 시간과 조건하에서 복수의 종양세포와 테스트화합물이 있어 관부(vessel section)를 배양하고, (2) 테스트 화합물이 존재하여 맥관성장의 제어량과 비교하여 상기 관부로부터 미세맥관 성장량을 비교하는 단계로 구성되는데, 상기 미세관 성장이 미세관 성장의 제어레벨 보다 크거나 작을 때, 테스트 화합물이 혈관신생의 조정자라고 밝혀진다.
본 발명은 또한 상기 분석에서 규명된 화합물을 개인에게 처리하는 방법을 제공한다. 이러한 관점에서 본 발명은 인간의 혈관신생 또는 혈관생성의 억제제로 밝혀진 처리화합물 또는 소분자를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것으로 구성된 인간의 혈관신생 또는 혈관생성의 조정자를 필요로 하는 처리방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 인간의 혈관신생 또는 혈관생성의 자극제로 밝혀진 처리화합물 또는 소분자를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것으로 구성된 인간의 혈관신생 또는 혈관생성의 조정자를 필요로 하는 처리방법에 관한 것이다.
그러므로 일실시예에서 본 발명은 비정상적인 혈관 성장과 관련한 질환이나 조건을 가진 개인에게 처리방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료학적으로 효과적인 양의 TNF-α 억제제를 개인에게 투여하는 것이다. 특정 실시예에서 상기 TNF-α 억제제는 IMiDTM이다. 다른 실시예에서는 상기 IMiDTM는 ActimidTM이거나 RevimidTM이다. 상기 질환이나 조건은 암으로 한다. 상기 암은 전이암이다. 다른 실시예를 보면 상기 암은 유방암이다. 상기 질환이나 조건은 염증, 자궁내막증, 관절염, 죽상경화판, 당뇨성 망막증, 신생혈관 녹내장, 트라코마 및 각막의 이식 neovascularization, 건선, 경피증, 혈관종 및 비대성자국, 혈관유착 및 혈관섬유종으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 모든 관계에 있어서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 그러므로 본 발명은 혈관신생을 억제하는 방법을 제공하는 것인데, 관을 형성할 수 있는 복수의 세포를 TNF-α 억제제로 접촉시키는 것으로 구성된다. 특정 실시예를 보자면, 상기 TNF-α 억제제는 ActimidTM이거나 RevimidTM이다. 다른 실시예에서 상기 복수의 세포는 개개인 내부에 있는 복수의 세포이다. 상기 복수의 세포들은 세포배양에 있는 복수의 세포를 말한다.
본 발명은 또한, 태반에서 파생된 줄기세포 샘플과 인간의 탯줄 샘플로 구성된 혈관신생 분석키트에 관련한다. 다른 실시예에서 상기 분석키트는 human cord blood plasma 샘플로 구성된다.
본 발명의 선별 분석과 관련하여 이용되는 테스트 화합물의 예는 소분자, 유기화합물, 무기화합물, 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 호르몬, 시토킨, 올리고핵산염, 핵산 및 기타 고분자를 포함하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 관련하여 이용되는 소분자 화합물의 다른 예들은 TNF-α 활성도를 억제시키는화합물을 포함하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 화합물의 분자량은 분자당 1000그램 보다 적다. 그러한 화합물은 유사물질 아날로그, 가수분해 산물, 대사물, 탈리도미드의 유도체 및 전구물질, 아미노탈리도미드, 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-yl)-피페리딘-2,6-디온, 아릴 아미드, 대체-2(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3y1) 탈리도미드및 대체 2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3y1)-1-옥소이소인돌 및 이소인돌-이미드 화합물은 물론, 대체스티렌의 시아노 및 카르복시 유도체, 시클릭 이미드, 시클로알킬 아미드 및 시클로알킬 나이트리트, 아릴 아미드, 1-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3y1) 이소인돌린 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3y1) 이소인돌린, 테트라 대체 2-(2,6-디옥소피페르딘-3-yl)-1-옥소이소인돌린, 이미드/아미드 에테르 및 알콜, 숙신이미드 및 말레이미드, 1-옥소 및 1,3 디옥소-2-(2,6-디옥소피페르딘-3-yl) 이소인돌린, 비-폴리펩타이드 시크릭 아미드, 이미도 및 아미도 대체 알키노하이드로사믹산, 대체 페네틸술폰, 탈리도미드, 아미노탈리도미드, 3-4(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-yl)-피페리딘-2,6-디온을 포함하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 일실시예에서 바람직한 화합물은 유사물질, 가수분해 산물, 대사물, 탈리도미드의 유도체 및 전구물질은 물론, 탈리도미드를 말한다.
다른 실시예를 보면 화합물은 (미합중국 셀진코포레이션의) ActimidTM이거나 RevimidTM또는 SeICIDsTM를 포함하며(이에 한정되지는 않으며) IMIDSTM이 된다.
본 발명의 다른 실시예에서 줄기세포 또는 원종세포는 산후 관류된 태반으로부터 파생되지 않고 대신에 cord blood, 골수, 말초혈액 또는 adult blood같은 다른 근원으로부터 분리된다.
3.1 정의
여기에서 "혈관신생" 및 "혈관생성"은 새로운 혈관의 발생을 말한다.
"바이오반응기"란 세포를 증식시키고 생물학적 물질을 만들어내고 발현시키며, 세포조직, 기형, 바이러스, 단백질, 폴리뉴클레오티드 및 미생물을 성장시키거나 배양 “배아 줄기세포”라는 용어는 주머니배(예를 들면, 4 내지 5일 성숙된 인간 배아)의 내부 세포군으로부터 유래되고, 플루리포턴트한 세포를 의미한다.
“배아 유사 줄기세포(embryonic-like stem cell)”라는 용어는 주머니배의 내부 세포군으로부터 유래되지 않은 세포를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “배아 같은 줄기세포”는 또한 “태반 줄기세포”를 의미할 수 있다. 배아같은 줄기세포는 바람직하게 플루리포텐트하다. 그러나, 태반으로부터 얻어질 수 있는 줄기세포는 배아같은 줄기세포, 멀티포턴트 세포 및 수임 전구세포를 포함한다. 본 발명의 방법에 따라서, 일단 잔류 세포들은 제거하기에 충분한 시간동안 실혈되고 관류되어지면 태반으로부터 기인된 배아같은 줄기세포는 분리된 태반으로부터 수집될 수 있다.
"내피"란 중 강(serious cavities)과 림프관 및 혈관을 따라 편평한 상피세포의 얇은 막을 말한다.
태반과 관련되어 사용되는 경우 “방혈된(exsanguinated)” 또는 “방혈(exsanguination)”은 태반으로부터 실질적인 모든 탯줄혈액을 제거 및/또는배출하는 것을 의미한다. 본 발명에 따라서, 태반의 실혈은 예를 들면 배출, 중력 유발 유출, 마사지, 짜내기, 펌핑 등에 의해 이루어질 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 태반의 실혈은 태반을 태반의 실혈에 도움이 되는 항응고제와 같은 약품을 포함하거나 포함하지 않는 플루이드를 이용하여 관류, 린싱 또는 플러싱함으로써 더 이루어질 수 있다.
"관류한다(perfuse)” 또는 “관류(perfusion)”는 플루이드를 기관이나 조직 위로 또는 통과하여 붓거나 또는 통과시키는 조작을 의미하는데, 바람직하게는 어떠한 잔류불, 예를 들면 부착되지 않은 세포를 기관이나 조직으로부터 제저하기 위하여 충분한 힘이나 압력으로 기관 또는 조직을 통하여 플루이드를 통과시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “관류액(perfusate)”은 기관이나 조직을 통하여 통과한 후 수집되는 플루이드를 의미한다. 바람직한 실시예에서, 관류액은 하나 이상의 항응집제를 포함한다.
“내생적 세포(endogeneous cell)"이라는 용어는 ”외래가 아닌 “세포, 즉, 태반으로부터 유래된 자가 또는 자가조직의 세포를 의미한다.
“외생적 세포(exogenous cell)”는 태반 이외의 기관 또는 조직으로부터 기인된 “외래의” 세포, 즉 이종유래의 세포 (즉, 태반 공여자 이외의 다른 근원으로부터 유래된 “비-자가 세포”) 또는 자가조직의 세포(즉, 태반 공여자로부터 유래된 자가세포)를 의미한다.
“오가노이드(organoid)”라는 용어는 표면 외관 또는 포유류 신체, 바람직하게는 인간 신체의 어떤 기관이나 샘처럼 실질적인 구조에서 비슷한 하나 이상의세포 유형의 모임을 의미한다.
“다기능(multipotent) 세포"라는 용어는 포유류 신체의 약 260개 셀 유형의 어떤 작은 집합으로 성장하는 능력을 가진 세포를 의미한다. 플루리포텐트 세포와는 달리, 멀티포텐트 세포는 모두 세포 유형에서 벗어나서 형성되는 능력을 갖지 않는다.
“만능(pluripotent) 세포”라는 용어는 완전한 분화 다양성, 즉 포유류 신체의 약 260개 세포 유형의 어떤 것으로 성장할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 플루리포텐트 세포는 자가재생할 수 있고, 조직 내에 잠재 또는 침묵으로 남을 수 있다. 토티포텐트 세포 (예를 들면 살균된 디플로이드 난세포)와는 달리, 배아줄기세포는 일반적으로 새로운 주머니배를 형성할 수 없다.
“전구세포(progenitor cell)”라는 용어는 특정 유형의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직을 형성하기 위하여 수임된 세포를 의미한다.
“줄기세포”라는 용어는 조직과 기관의 특정화된 세포를 형성하기 위하여 무제한 재생산할 수 있는 마스터 세포를 의미한다. 줄기세포는 발달적으로 플루리포텐트 또는 멀티포텐트 세포이다. 줄기세포는 두개의 딸 줄기세포 또는 하나의 딸 줄기세포와 하나의 전구(통과) 세포를 생산하기 위해 나누질 수 있는데, 그런 다음 조직의 성숙한, 완전히 형성된 세포로 증식한다.
"토티포텐트 세포”라는 용어는 완전한 배아(예를 들면 주머니배)을 형성 할 수 있는 세포를 의미한다.
"혈관생성"은 관 또는 미세관의 발생 또는 형성을 의미한다.
"관고리"는 관의 단면을 말한다. 일반적으로 관의 단면은 고리 모양으로 보이는 가로단면이나 배양가능한 모든 관의 다른 면도 가능하다. 관은 동맥 정맥, 림프관 등 모든 관을 말한다.
5. 본 발명의 상세한 설명
본 발명은 인간 맥관생성 또는 인간 혈관생성을 조절하는 화합물의 동정을 위한 인간의 다능성 줄기 세포를 이용한 인비트로 분석 시스템에 대한 것이다. 본 발명의 선별 분석은 맥관생성 및/또는 혈관생성을 억제 또는 야기하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 혈관생성을 허용하는 조건 하에서 인간의 다능성 줄기 세포 또는 혈관의 일부를 배양하고 혈관생성 과정에 대하여 시험 화합물이 가지는 효과를 결정하는 과정을 포함하는, 혈관생성의 조절자에 대한 선별 분석에 대한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 다능성 줄기 세포는 기원적으로 비 배아이다. 본 발명의 보다 구체적인 바람직한 실시예에서, 비 배아 줄기 세포는 태반으로부터 추출된 줄기 세포이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 혈관의 일부는 인간으로부터 얻어지는데, 바람직하게 인간의 제대로부터 얻어진다. 본 발명의 다른 실시예에서, 줄기 또는 원종 세포는 산후의 관류 태반으로부터 얻어지지 않지만, 코드 혈액, 골수, 주변 혈액 또는 성인 혈액과 같은 다른 소스로부터 격리된다.
본 발명은 인비트로 혈관생성의 조절자를 동정하기 위한 선별 분석을 포함하는데, 이러한 분석은 인간 제대로부터 얻어진 혈관과 인간의 다능성 줄기 세포를 함께 배양하는 것에 의존한다. 바람직한 실시예에서, 인간의 다능성 줄기 세포는태반으로부터 유래된다.
본 발명은 또한 태반으로부터 유래된 줄기 세포의 샘플과 인간 제대의 샘플을 포함하는 혈관생성 분석 키트에 대한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 분석 키트는 인간 코드 혈액의 플라즈마 샘플을 더 포함한다.
본 발명은 또한 인간의 맥관생성 또는 혈관생성 억제자로 동정된 그러한 처리 화합물 또는 저분자들이 필요한 환자들에게 투여하는 과정을 포함하는, 인간의 맥관생성 또는 혈관생성의 조절의 요구를 처리하는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 또한 인간 맥관생성 또는 혈관생성의 촉진자로 동정된 그러한 처리 화합물 또는 저 분자들이 필요한 환자들에게 투여하는 과정을 포함하는, 인간의 맥관생성 또는 혈관생성 조절의 요구를 처리하는 방법에 대한 것이다.
본 발명은 선별 분석과 관련하여 사용될 수 있는 시험 화합물의 예는 저분자에 한하지 않고, 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리펩타이드, 펩타이드, 프로테인, 호르몬, 싸이토카인, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레익산 또는 다른 고분자를 포함한다.
여기에서 기술된 처리 방법에서 이용될 수 있는 저분자 화합물의 예는 TNF-α 의 활동을 억제하는 화합물을 포함하는데, 본 발명이 이에 한하는 것은 아니다. 그러한 화합물은 아미노탈리도미드, 및 3-(4-아미노-l-옥소-1, 3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-피페리진-2, 6-디온, 아릴 아미드, 치환된 2-(2,6-다이옥소피페리진-3-yl) 프탈리미스 및 치환된 2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-1-옥소이소인돌, 및 이소인돌-이미드 화합물의 아날로그(analog), 하이드롤리시스, 메타볼라이트, 탈리도미드의 유도체 및 프리커서 뿐만 아니라, 치환된 스티렌의 시아노 및 카르복시 유도체, 싸이클릭 이미드, 싸이클로알킬 아미드 및 싸이클로알킬 니트라이트, 아릴 아미드, 1-옥소-2-(2,6-다이옥소-3-플루오로피페리딘-3 yl) 이소인돌린 및 1,3-다이옥소-2-(2,6-다이옥소-3-플루오로피페리딘-3-yl) 이소인돌린, 테트라 치환된 2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-1-옥소이소인돌린, 이미드/아미드 에테르 및 알콜, 썩신이미드 및 말레이미드, 1-옥소 및 1,3 다이옥소-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3 yl) 이소인돌린, 넌-폴리펩타이드 싸이클릭 아미드, 이미도 및 아미도 치환된 알카노하이드로자믹 에시드, 치환된 페네틸썰폰, 탈리도미드, 아미노탈리노미드, 3-(4-아미노-1-옥소-1, 3-다이하이드로-이소인돌-2-yl)-피페리딘-2, 6-디온을 포함하는데, 본 발명이 이에 한하는 것은 아니다. 일 실시예에서, 바람직한 화합물은 탈리도미드의 아날로그, 하이드롤리시스 화합물, 메타볼라이트, 유도체 및 프리커서 뿐만 아니라, 탈리도미드이다.
코드 혈액("CB" 세포), 태반 및 다른 소스로부터 분리된 줄기 세포를 포함하는 어떠한 인간 줄기 세포라도 본 발명의 방법과 관련하여 사용될 수 있는데, 본 발명이 이에 한하는 것은 아니다. 상기 줄기 세포는 다능성 세포, 즉 완벽한 분화 다양성을 구비하고 있고 자기 재생이 가능하고 세포 내에서 휴지 또는 무활동 상태에 있을 수 있는 세포이다. 또한 상기 줄기 세포는 다잠재력 세포 또는 수임전구 세포를 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 본 발명은 생육 가능하고 무활동성이 있고 다능성이 있는, 만기 태반 내에 존재하는 줄기 세포를 이용한다. 만기 태반은 성공적인 출산 및 태반 만출 이후에 소생되고, 방혈 및 관류에 의해 다능성 및 다잠재성의 줄기 세포가 소생된다.
5.1 혈관생성의 조절자를 동정하기 위한 선별 분석
본 발명은 혈관생성 또는 맥관형성을 조절하는 시험 화합물의 능력을 선별하는 과정을 포함하는, 혈관생성의 조절자를 동정하기 위한 선별 분석을 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에 대하여, 인간의 다능성 줄기 세포 또는 혈관 링이 배양되고, 시험 화합물과 접촉된다. 그리고, 혈관생성에 대한 영향이 결정된다.
5.1.1 분석 방법
본 발명은 혈관생성 또는 맥관생성의 조절자를 동정하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 혈관은 평판 배양된 줄기 세포로부터 생긴다. 줄기 세포는 평판배양되고, 바람직하게는 24 시간의 배양 이후에, 유착세포는 비유착 세포의 파풀레이션(population)으로부터 분리된다. 유착 세포는 적절한 배양 메디엄에서 배양된다. 어떠한 적절한 배양 메디엄이라도 본 방법에 포함된다. 바람직한 메디엄은 5-20%의 코드 혈액 혈청(CBS) 및 항생제가 공급된 DMEM이다. 바람직하게, 상기 메디엄에는 하이드로코티손, 상피세포 성장인자 및/또는 소의 뇌 추출물이 더 공급된다. 줄기 세포의 배양은 자동적인 혈관생성이라는 결과를 가져왔다. 자동적인 혈관생성은 미소한관의 어셈블리로 특징지워진다. 이 방법에서, 시험 화합물은 이러한 미소관 어셈블리에 대한 조절 능력에 대해 분석된다. 혈관생성의 억제자는 대조군, 예컨대 시험 화합물이 없는 분석 조건과 대비하여 미소관 생성 과정을 방해하거나 감소시키는 능력에 기초하여 동정될 수 있다. 반대로, 혈관생성의 야기자는 대조군, 예컨대 시험 화합물이 없는 분석 조건과 대비하여 미소관 형성 과정을 촉발 또는 증가시키는 능력에 기초하여 동정될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 생물학적 샘플로부터의 비 배아 다능성 줄기 세포를 생리학적 겔, 적절한 영양분, 및 새로운 혈관 세포의 성장을 허용할 수 있는 충분한 시간과 조건 하에서 혈관생성 조절 활동을 가진다고 추측되는 적어도 하나의 물질와 함께 배양하는 단계; 새로운 혈관 세포의 성장에 대하여 절편을 조사하는 단계; 및 대조군의 성장과 절편의 혈관 세포 성장을 비교하는 단계를 포함하는, 혈관생성 조절 활동을 위한 물질을 선별하는 방법을 제공한다. 혈관생성 조절이라는 용어는 혈관 절편의 보통의 혈관생성 활동을 조절 또는 변화시키는 물질의 능력을 지칭한다. 이러한 조절은 혈관생성 활동의 억제, 촉진 및 상승을 포함한다. 상기 방법은 시험 화합물, 또는 혈관생성 억제자, 촉진자 또는 상승자인 물질에 이용될 수 있다. 생물학적 샘플이라는 용어는 종국적으로는 동물 세포로부터 유래된 것이라면 어떠한 샘플에도 해당하며, 물질이 그 특정 세포 및/또는 동물 종에 대하여 혈관생성 조절 활동을 가지는지를 검사하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 인간 세포로부터 유래된다.
본 발명과 관련하여 이용될 수 있는 줄기 세포는, 코드 혈액(CB) 줄기 세포, 태반 줄기 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 유사 배아 줄기 세포, 영양포 줄기 세포, 원종 세포, 및 다능성, 다잠재성 및 전능성 세포를 포함하는데, 본 발명이 이에 한하는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 비 배아 다능성 줄기 세포가 잠재적인 혈관생성 조절 활동을 가지고 있는 시험 화합물과 선별될 대조군 및 배양물(culture)을 위해 동시에 사용된다.
본 발명은 또한 혈관생성 또는 맥관생성의 조절자를 동정하는 단계를 포함하는데, 여기서 혈관은 배양된 혈관 링, 즉 인비트로에서 성장된 혈관의 섹션으로부터 발생된다. 본 발명의 이러한 측면과 관련하여, 혈관 링의 섹션은 바람직하게 제대로부터 얻어지고 혈관 성장을 허용하는 조건 하에서 배양된다. 일 실시예에서, 대략 지름이 1-2mm, 길이가 1-2cm인 혈관이 인간의 제대로부터 절제된다. 바람직하게, 그러한 절제는 출산이 일어난 후 12-24시간 이내에 수행된다. 동맥과 정맥 세포는 채취되어 분리 보관된다. 혈관은 2.5㎍/ml의 훈기존을 함유하는 DMEM과 같은 배양 메디엄에 놓여지고, 1-2mm 길이의 섹션으로 자른다. 혈관 절편은 바람직하게 잔류 응혈을 프리드(freed)하고, 사용하기 전에 배양 메디엄 속에 담궈 놓는다. 혈관의 절개 및 분할은 외과적 마이크로스코우프를 이용하여 수행하는 것이 좋다. 또한, 동맥 또는 정맥으로부터 얻어진 혈관이 사용될 수 있다. 바람직하게, 각 실험을 위해서, 오직 하나의 혈관으로부터의 혈관 절편이 사용된다.
혈관 성장 분석은 페트리 접시 또는 다중 웰 배양 플레이트(Costar, Cambridge, Mass.)에서 수행된다. 바람직하게, 배양 접시는 매트릭스를 형성하기 위해 0.1%의 젤라틴(Sigma, St. Louis, MO) 또는 매트리겔로 프리 코팅하여 준비한다. 코팅에 이어서, 배양 접시는 배양 메디엄으로 코팅된다. 본 발명의 예시적 실시예로서, 플레이트의 코팅에 이어서, 매트릭스 위에 표면 필름을 형성하기 위해 DMEM 50mL에 50㎕의 인간 코드 혈액 플라즈마를 각 접시/웰에 첨가한다. 필름 형성 과정은 37℃에서 90분간 지속되고 그 이후에 필름은 제어됨으로써 각 접시/웰에는 얇은 필름이 남게 된다. 일단 배양 준비가 완료되면, 혈관 링 세그먼트는 배양 접시에 놓여진다.
혈관 링 세그먼트는 일반적으로 12시간 내에 매트릭스 물질에 부착됨으로써, 부력에 의한 혈관 세그먼트의 탈락 없이도 메디엄의 추가가 가능하다. 부착에 이어서, 혈관은 습한 환경에서 7-12일 동안 37℃에서 배양된다. 바람직하게, 메디엄은 예를 들어 72 시간 간격을 주기로 교환된다. 예시적인 배양 조건은 20%의 인간 코드 혈액 플라즈마, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 헤파린이 공급된 DMEM에 배양물을 유지 보존하는 것을 포함한다. 바람직하게, 메디엄에는 하이드로코티손, 상피 성장 인자 및/또는 소 뇌 추출물을 더 공급한다. 바람직한 실시예에서, 혈관 절편은 물질이 투약되기 전에 양호한 혈관생성적 반응을 수립하기에 충분한 시간, 예컨대 투약 전에 14일 동안 배양된다. 그리고 나서 반응의 정도가 수치화되고 기록된다.
혈관생성의 어떠한 조절을 밝히기 위해 배양이 이루어지고 있는 동안 시험 화합물이 투약된다. 시험 화합물은 메디엄의 교체시에 투약될 수도 있고 배양 동안 언제라도 독립적으로 첨가될 수 있다. 바람직하게, 일단 줄기 세포 또는 혈관 세포가 유착되고 7-21일 동안 배양이 계속되고 나서, 시험 화합물이 첨가된다. 하지만, 시험 화합물은 다른 때에 첨가될 수도 있다. 예를 들어, 혈관의 성장은 메디엄에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 일수 동안 허용될 수 있고, 이어서 시험 화합물이 일 회 투여된다. 각 시험 화합물은 용량-반응 분석의 산출을 가능하기 하기 위해 다양한 농도로 계량될 것이다. 포지티브 대조군은 예를 들어, 내피 세포 성장 서플리먼트(ECGS; 200㎍/ml; Collaborative Research, Bedford, MA)에대한 반응(예컨대, 미세혈관 성장)으로 정의할 수 있고, 네거티브 대조군은 예를 들어 메디엄 단독에 대한 반응으로 정의할 수 있다. 혈관의 성장은 하기의 테이블에서 정의되는 바와 같이 포지티브 및 네거티브 대조군에 대한 계량적인 비교로서, 그리고 혈관 링으로부터 혈관 싹 성장의 최대 거리(마이크론) 및 혈관 링(VRA)의 내피 세포 커버리지(ECA)/혈관 링의 면적(VRA)에 의해 형태적으로 수치화될 수 있다.
본 발명의 선별 분석의 또 다른 실시예에서, 제대 동맥으로부터 얻어진 인간의 제대 혈관 링의 작은 섹션이 마트리겔(MATRIGEL)　플러스 휴먼 콜라겐과 같은 용액에 담겨지고, 최적의 메디엄, 바람직하게는 성장 인자를 함유하는 혈청이 없는 메디엄에서 배양된다. 제대 혈관 링은 일 내지 사주일 동안, 또는 링으로부터 미세 혈관이 발생될 때까지 배양된다. 시험 화합물은 미세 혈관의 성장을 억제 또는 상승시키는 능력에 대하여 분석될 수 있다.
상술한 두가지 방법의 조합에 있어서는, 상기와 같이 혈관 링이 얻어지고 플레이티드되고 줄기 세포의 존재 하에 배양된다. 혈관 링과 줄기 세포는 7-21일 동안 함께 배양된다. 이 때, 혈관 성장의 정도가 결정된다. 여기서, 내피 세포의 성장을 허용하는 배양 메디엄이라면 어떠한 것이라도 사용될 수 있다. 줄기 세포의 추가는 혈관의 발생을 용이하게 하는 세포의 유형으로 줄기 세포의 분화를 가져오고, 따라서 다른 분석 방법보다 보다 근접하게 혈관의 자연적 환경을 재현할 것이라는 것이 예측된다. 상술한 바와 같이, 시험 및/또는 대조군 화합물은 배양 초기에 배양 메디엄에 추가될 수도 있고 배양 동안 언제라도 추가될 수 있다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명은 비 배아 다능성 줄기 세포를 혈관 섹션, 생물학적 겔 및 적절한 영양분과 함께 새로운 혈관 세포의 성장을 허용할 정도의 적절한 시간 동안 배양하는 단계; 상기 절편에 물질을 투여하는 단계; 및 상기 절편을 일정 시간 동안 적절한 영양분과 함께 배양하고 새로운 혈관 세포 성장의 방지 및/또는 새로운 혈관 세포의 퇴화가 발생되었는지의 여부를 결정하기 위해 상기 절편을 조사하는 단계를 포함하는, 새로운 혈관 세포 성장의 조절(즉, 방해 또는 유발) 및/또는 새로운 혈관 세포 퇴화의 유발을 하는 물질의 능력을 결정하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 실시예에서, 상기 줄기 세포 또는 혈관 링은 암 세포, 특히 전이성 암에 기원을 가지는 세포와 함께 배양될 수 있다. 많은 전이적 또는 진행적 암들은 혈관생성적 요소(즉, 혈관생성을 야기하는 종양 분비물 인자)를 가지고 있기 때문에, 그러한 공동 배양은 종양의 자연적 환경을 재현한다. 공동 배양에서 사용된 종양 세포는 개인으로부터 직접적으로 얻어진 종양 세포, 개인으로부터 얻어져서 보관된 세포, 또는 본 발명이 속한 기술분야에서 잘 알려진 다수의 영구 보존 처리된 종양 세포 라인의 어느 하나일 수 있다. 그러한 종양 세포 라인은 예를 들어, HTB-104 또는 CRL-1973 세포(고환 종양 세포; American Type Culture Collection으로부터 획득 가능함); 또는 BT483, HS578T, HTB2, BT20 또는 T47D 세포(유방암 세포 라인)을 포함한다. 또한, 본 발명이 속한 기술분야에서 알려진 다른 암 세포 라인이 사용될 수 있다.
혈관 링 및/또는 줄기 또는 종양 세포 상의 매트릭스 기질은 성공적인 혈관생성에 있어서 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시예는 성장 매트릭스를 생성하기 위해 생리학적 겔과 함께 준비된, 플레이트 또는 접시에서 배양될 조직과 세포에 대한 것이다. 바람직하게, 이 성장 매트릭스는 인간의 비 변성(non-denatured) 콜라겐을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 생리학적 겔은 피브린, 콜라겐 또는 마트레겔(MATREGEL: 등록상표임)을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 겔은 피브린이다.
혈관생성 조절 활동을 할 수 있다고 예측되는 것이라면 어떠한 물질 또는 물질의 조합이라도 본 발명의 방법에 의해 선별될 수 있다. 상기 물질은 정제된 화합물의 제제와, 식물이나 동물의 조직 추출물 또는 마이크로유기체로부터의 추출물과 같은 다양한 추출물을 포함한다. 따라서, 그러한 물질은 비 배아 다능성 줄기 세포에 투여하는데 적절한 형태가 되게 해야 한다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 투여에 적합한 형태로 물질을 만들기 위한 다양한 방법이 있음을 잘 알고 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법이 혈관생성 촉진에 대하여 화합물을 시험하기 위하여 사용될 경우, 메디엄은 실질적으로 혈청이 없다. 즉, 메디엄은 어떠한 형청 요소도 없거나, 혈관생성을 위해 필요한 혈청이나 다른 소스로부터의 최소한의 요소만을 가진다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 물질이 투여된 이후에, 비 배아 다능성 줄기 세포는 새로운 혈관 성장의 완전한 방지 및/또는 퇴화를 허용할 수 있을 정도의 충분한 시간 동안, 예컨대 물질이 투여된 후 7-14일 동안 배양된다. 그리고 나서, 새로운 혈관 성장 상태가 기록된 반응 및 바람직하게 대조군과 비교된다.
5.1.2 혈관 생성의 특징
본 발명에 있어서, 혈관성장은 면역염색법과 같은 표준적인 기술을 이용한 세포 표면 마커의 동정에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면과 관련하여, 검지 가능한 혈관 생성 반응(즉, 새로운 혈관 생성)을 나타내는 샘플들이 면역염색법을 이용하여 분석될 수 있다. 사용될 수 있는 항체의 예는, 모노클로널 마우스 항인 인자 Ⅷ 관련 항원(Dako, Denmark), 항인 내피 세포 mAb(Gibco, Grand Island, N.Y.) 및 메디컬 리서치의 존 커튼 학교에서 생산된 CD31-스페시픽 mAb(clone 20G5)를 포함한다. 인자 Ⅷ 관련 항원을 검지하기 위해 신생 혈관생성 샘플의 면역 조직학적 염색이 수행된다. 염색 작용 부위는 성장체가 혈관이라는 것을 분명하게 보여준다. 혈관은 또한 내피 세포에 대해 mAb 스페시픽과 작용하고, mAb에서 CD31까지 작용하고, 항원은 오로지 내피 세포, 혈소판 및 약간의 백혈구 사에서만 발현된다. 전자 현미경을 이용한 혈관생성 샘플의 조사가 내피 조직 형태를 가진 세포를 찾아내기 위해 수행될 수 있다.
7-21 일 동안의 배양에 이어서, 혈관생성이 계량화되고, 대조군의 배양물과 비교된다. 항 혈관생성 물질로 추정되는 경우에 있어서는, 대조군의 배양물과 비교하여 혈관 성장의 감소 정도가 결정된다. 본 발명은 또한 정착된 혈관 생성 반응물(즉, 7-21일 동안의 배양 이후에)에 시험 물질을 첨가하고 7-14일 동안 현미경에 의해 혈관의 다이백(Die-back)을 모니터링함으로써 형성된지 얼마 안된 혈관의 퇴화를 야기하는 시험 물질의 능력에 대한 분석을 포함한다.
일부 실시예에서 분화된 세포들은 차별적으로 발현되는 유전자들(예를 들어 관심있는 비분화된 전구 세포에서 유전자 풀 대 전구세포로부터 유래한 분화된 세포에서 유전자 풀을 규명하는)에 의하여 동정될 수 있다. 예를 들어 PCR과 같은 핵산 증폭방법 또는 전사-기초한 증폭 방법(예를 들어 인 비트로 전사(IVT))가 예를 들어 폴리뉴크레오타이드 마이크로어레이의 사용에 의하여 세포의 여러 군들의 유전자 발현을 프로화일하는데 사용될 수 있다. 그러한 차별적인 유전자 발현을 프로화일하는 방법은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어 Wieland 외, Proc. Natl. Acad: Sci. USA 87: 2720-2724 (1990; Lisitsyn 외, Science 259: 946-951 (1993); Lisitsyn 외, Meth. Enzymology 254: 291-304 (1995); 미국특허 5,436, 142 ; 미국 특허 5,501,964; Lisitsyn 외, Nature Genetics 6: 57-63 (1994); Hubank 및 Schatz, 1994, Nucleic Acids Research 22: 5640-5648 ; Zeng 외, 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385 ; 미국특허 5,525, 471 ; Linsley 외, "RNA 증폭 방법"이란 제목의 미국 특허 6,271,002, 2001년 8월 7일 등록 ; Van Gelder 외, "프로모터를 이용한 유전자 조작 방법"이란 제목의 미국 특허 5,716,785, 1998년 2월 10일 등록; Stoflet 외, 1988, Science 239: 491-494,1988 ; Sarkar 외 Sommer, 1989, Science 244: 331-334; Mullis 외, 미국 특허 4,683, 195; Malek 외, 미국 특허 5,130, 238; Kacian 외 Fultz, 미국 특허 5,399, 491; Burg 외, 미국특허 5,437,990; R. N Van Gelder 외. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,1663 ; D. J. Lockhart 외, 1996, Nature Biotechnol. 14,1675 ; Shannon, 미국 특허6,132,997; Lindemann 외, "감소 교잡화 및 차이 분석 방법"이란 표제의 미국 특허 6,235,503, 2001년 5월 22일 등록).
상업적으로 구입할 수 있는 키트들 예를 들어 유전자 발현을 프로화일하기 위한 젤-기초한 접근에 사용되는 키트들의 디스플레이 PROFILETM 시리즈(Qbiogene, Carlsbad, CA)등이 사용가능하다. 상기 키트들은 진핵세포들에서 유전자 발현을 비교하기 위하여 Restriction Fragment Differential Display-PCR (RFDD-PCR)을 이용한다. 서브트랙티드 라이브러리에서 차별적으로 발현된 클론을 동정하기 위하여 PCR-Select Subtraction 키트(Clontech) 및 PCR-Select Differential Screening 키트(Clontech)도 사용될 수 있다. PCR-Select Subtraction 키트로 차별적으로 발현된 유전자들의 풀을 생성한 후에 PCR-Select Differential Screening 키트가 사용된다. 서브트랙티드 라이브러리는 테스터 및 드라이버 군으로부터 직접 합성된 프로브 서브트랙티드 cDNA에서 제조된 프로브 및 역-서브트랙티드 cDNA(역으로 수행된 2차 서브트랙션)에서 제조된 프로브로 교잡화하였다. 드라이버 프로브가 아니라 테스터와 교잡하는 클론들은 다르게 발현되지만 비-서브트랙티드한 프로브들은 적은 메세지를 검출하기에 충분한 만큼 민감하지 않다. 서브트랙티드 프로브들은 차별적으로 발현되는 cDNA들이 매우 풍부하나 가짜 양성 결과를 줄 수 있다. 제조업자(Clontech) 지시에 따라 양 서브트랙티드 및 비-서브랙티드 프로브들을 모두 사용하여 차별적으로 발현되는 유전자들을 동정한다.
5.2 본 발명의 화합물
혈관 생성의 조절을 할 수 있다고 선별될 수 있는 시험 화합물의 예는, 저분자, 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리펩타이드, 펩타이드, 호르몬, 싸이토카인, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레익 에시드 또는 다른 고분자를 포함하는데, 본 발명은 이에 한하지 않는다.
여기에서 사용된 화합물이라는 용어는, 예컨대 단백질 또는 비 단백질 유기 약제와 같은 어떠한 형태의 분자라도 지칭하는 것이다. 일반적으로 복수의 분석 혼합물은 다양한 농도에 대한 차별적 반응을 얻기 위하여 서로 다른 화합물 농도로 동시적으로 함께 취급된다. 구체적으로, 이러한 농도들 중 하나, 즉 제로 농도 또는 검지 레벨 이하의 농도는 네거티브 대조군으로서 기여한다.
후보 화합물들은 전형적으로는 유기 분자들일지라도 복수의 화학종을 포함하는데, 바람직하게는 50 이상의 분자량을 가지고 약 2500 달톤(dalton)보다 작은 저분자 유기 화합물이다. 후보 화합물은 단백질, 특히 수소 본딩과 구조적 상호 작용을 위해 필요한 작용기를 포함하고, 구체적으로는 적어도 아민, 카르보닐, 하이드록실 또는 카르보닐 기를 포함하고, 바람직하게는 적어도 2개의 화학 작용기를 포함한다. 경우에 따라서, 후보 화합물은 이종 환식(heterocyclic) 구조 상의 환식 탄소 및/또는 상기 작용기 중의 하나 이상으로 치환된 방향(aromatic) 또는 다방향(polyaromatic) 구조를 포함한다. 후보 화합물은 또한 펩타이드, 삭카라이드, 패티 에시드, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 이들의 유도체, 유사체 또는 조합체를 포함하는 유생분자 가운데서도 발견된다.
후보 조절 화합물은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 다양한 소스로부터 얻어진다. 예를 들어, 복수의 수단이 랜더마이즈드된 올리고뉴클레오타드 및 올리고펩티드의 발현을 포함하는 다양한 유기 화합물과 유생분자의 무작위 또는 의도된 합성을 위해 이용된다. 대안적으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물의 형태의 천연 화합물 라이브러리가 이용된다. 부가적으로, 천연 또는 합성적으로 생산된 라이브러리와 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 변형되어 조합적인 라이브러리를 생산하는데 이용될 수 있다. 알려진 약리적 에이전트가 구조적인 유사체를 생산하기 위해 에시레이션, 알킬레이션, 에스테리피케이션, 아미디피케이션 등과 같은 의도된 또는 무작위적인 화학적 변형을 위해 작용할 수 있다. 또한 새로운 잠재적인 치료학상의 에이전트가 합리적인 약제 디자인 또는 컴퓨터 모델링과 같은 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 선별은 약리적 활성 화합물과 이들의 화학적 유사체에 대해, 또는 합리적인 약제 디자인을 통해 생성된 것과 같은 알려지지 않은 성질을 가진 새로운 화합물에 대해 이루어질 수 있다.
5.2.1 TNF - α 억제자
여기에 개시된 분석 방법을 이용함으로써, 하나의 종에 속하는 화합물의 집단이 맥관생성 및/또는 혈관생성을 조절하는 것으로 동정되었다. 구체적으로, 이 화합물은 항-혈관생성 화합물이다. 보다 구체적으로, 이 화합물은 IMiDs™(셀진 코포레이션)을 포함한다. 별다른 지시가 없는 한 여기에 사용된 항-혈관생성 화합물 또는 IMiDs™는 현저하게 TNF-α 를 억제하고 항-혈관생성 활동을 가지는 저 유기 분자를 포함한다. 즉 이들은 새로운 혈관형성을 억제한다. 구체적으로, 본 발명의 항-혈관생성 화합물은 TNF-α mRNA의 분해를 촉진한다. 이 화합물 종은 라세믹, 입체이성질체 적으로(stereomerically) 농축되거나 정제되고 약학적으로 수용 가능한솔트, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오이소머, 크라쓰레이트 및 이들 항-혈관생성 화합물의 프로드러그를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 화합물은 약 1000g/mol 보다 작은 분자량을 가진 저 유기 분자이고, 프로테인, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 올리고삭카라이드 또는 다른 고분자는 아니다. 본 발명의 보다 구체적인 화합물은 이하에서 기술한다. 이 화합물은 셀진(Warren, NJ)사로부터 상업적으로 획득가능하거나, 여기에서 나열되는 특허 또는 공보에 기술되어 있는 방법에 의해 준비될 수 있다.
본 발명의 항-혈관생성 화합물의 구체적인 예는, 미국특허 제5,929,117호에 개시되어 있는 것과 같은 치환된 스티렌의 시아노 및 카르복시 유도체; 미국특허 제5,874,448호에 개시되어 있는 것과 같은 1-옥소-2-(2,6-다이옥소-3-플루오로피페리딘-3yl) 이소인돌린 및 1,3-다이옥소-2-(2,6-다이옥소-3-플루오로피페리딘-3yl) 이소인돌린; 미국특허 제5,798,368호에 개시되어 있는 것과 같은 테트라 치환된 2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-1-옥소이소인돌린; 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니지만, 미국특허 제5,635,517호에 개시되어 있는 것과 같은 1-옥소 및 1,3-다이옥소-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)이소인돌린(예컨대, 탈리도미드 및 EM-12의 4-메틸 유도체); 및 미국특허 제3,698,579호 및 제5,877,299호에 개시되어 있는 것과 같은 비-폴리펩티드 싸이클릭 아미드의 종(class)을 포함한다. 여기에서 언급되는 미국 특허의 전체 내용은 참조에 의해 여기에 병합된다. 본 발명의 항-혈관생성 화합물은 탈리도미드를 포함하지 않는다.
본 발명의 다른 구체적인 항-혈관생성 화합물은 참조로서 여기에 병합되는미국특허 제5,635,517호에 개시되어 있는 바와 같이 벤조링에서 아미노로 치환된 1-옥소-및 1,3 다이옥소-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)이소인돌린을 포함하는데, 본 발명이 이에 한하는 것은 아니다. 이 화합물은 다음의 화학식 Ⅰ을 가진다.
여기서, X 와 Y 의 한쪽은 C=O 이고, 다른 쪽은 C=O 또는 CH2이고, R2는 수소 또는 저 아킬, 특히 메틸이다. 구체적인 항-혈관생성 화합물은 다음을 포함하는데 본 발명이 이에 한하는 것은 아니다.
1-옥소-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-4-아미노이소인돌린;
1-옥소-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-5-아미노이소인돌린;
1-옥소-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-6-아미노이소인돌린;
1-옥소-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-7-아미노이소인돌린; 및
1,3-다이옥소-2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-5-아미노이소인돌린.
본 발명의 다른 구체적인 항-혈관생성 화합물은 참조에 의해 전체로서 여기에 병합되는 미국특허 제6,281,230호, 제6,316,471호, 제6,335,349호, 및 제6,476,052호, 및 국제특허출원 PCT/US97/13375(국제공개 번호 WO98/03502)에 개시되어 있는 바와 같이 치환된 2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl) 프랄리미드 및 치환된 2-(2,6-다이옥소피페리딘-3-yl)-1-옥소이소인돌의 종(class)에 속한다. 이 종을대표하는 화합물의 화학식은 다음과 같다.
여기에서, R1은 수소 또는 메틸이다. 별도의 실시예에서, 본 발명은 이들 화합물의 거울상이성질체 적으로(enantiomerically) 정제된 형태, 예컨대 광학 이성질체적으로 정제된 (R) 또는 (S) 거울상이성질체(enantiomers))를 포함한다.
나아가, 본 발명의 다른 구체적인 항-혈관생성 화합물은 참조에 의해 여기에 완전하게 병합되는 미국 특허출원 10/032286, 09/972487 및 국제출원 PCT/US01/50401(국제공개번호 WO02/059106)에 개시된 바와 같이 이소인돌-아미드의 종(class)에 속한다. 이 화합물은 화학식 Ⅱ와 같고,
약제적으로 수용 가능한 솔트, 하이드레이트, 이난시오머, 디아스테레오머,라세메이트 및 이들 스테레오이소머의 혼합물이고,
여기서, X 및 Y의 한쪽은 C=O이고 다른 쪽은 CH2또는 C=O이고;
R1은 H, (CI-C8)알킬, (C3-C7)싸이클로알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)아르키닐, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로싸이클로알킬, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, C(O)R3, C(S)R3, C(O)OR4, (C1-C8)알킬-N(R6)2, (C1-C8)알킬-OR5, (C1-C8)알킬-C(O)OR5, C(O)NHR3, C(S)NHR3, C(O)NR3R3, C(S)NR3R3'또는 (C1-C8)알킬-O(CO)R5이고;
R2는 H, F, 벤질, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐 또는 (C2-C8)아르키닐이고;
R3및 R3'는 독립적으로 (C1-C8)알킬, (C3-C7)싸이클로알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)아르키닐, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로싸이클로알킬, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, (C0-C8)알킬-N(R6)2, (C1-C8)알킬-OR5, (C1-C8)알킬-C(O)OR5, (C1-C8)알킬-O(CO)R5또는 C(O)OR5이고;
R4는 (C1-C8)알킬, (C2-C8)아르케닐, (C2-C8)아르키닐, (C1-C4)아킬-OR5, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(CI-C6)헤테로싸이클로알킬 또는 (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴이고;
R5는 (CI-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)아르키닐, 벤질, 아릴 또는 (C2-C5)헤테로아릴이고;
R6의 각각의 어커런스(occurrence)는 독립적으로 H, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)아르키닐, 벤질, 아릴, (C2-C5)헤테로아릴, 또는 (C0-C8)알킬-C(O)O-R5이고, R6기는 헤테로싸이클로알킬기를 형성하기 위해서 결합할 수 있고;
N은 0 또는 1이고;
*는 키랄(chiral)-탄소 중심을 나타낸다.
화학식 Ⅱ의 구체적인 화합물에 있어서, n 이 0 이면, R1은 (C3-C7)싸이클로알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)아르키닐, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로싸이클로알킬, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, C(O)R3, C(O)OR4, (C1-C8) 알킬-N(R6)2, (C1-C8)알킬-OR5, (C1-C8)알킬-C(O)OR5, C(S)NHR3, 또는 (C1-C8)알킬-O(CO) R5이고;
R2는 H 또는 (C1-C8)알킬이고;
R3는 (C1-C8)알킬, (C3-C7)싸이클로알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8) 아르키닐,벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로싸이클로알킬, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, (C5-C8)알킬-N(R6)2, (C0-C8)알킬-NH-C(O)O-R5, (CI-C8)알킬-OR5, (C1-C8)알킬-C(O)OR5, (C1-C8)알킬-O(CO)R5, 또는 C(O)OR5이고;
다른 변수는 같은 정의를 가진다.
화학식 Ⅱ의 다른 구체적인 화합물에 있어서, R2는 H 또는 (C1-C4)알킬이다.
화학식 Ⅱ의 다른 구체적인 화합물에 있어서, R1은 (C1-C8)알킬 또는 벤질이다.
화학식 Ⅱ의 다른 구체적인 화합물에 있어서, R1은 H, (C1-C4)알킬, 벤질, CH2OCH3, CH2CH2OCH3, 또는이다.
화학식 Ⅱ의 또 다른 실시예에 있어서, R1은이고, 여기에서 Q는 O 또는 S, 그리고 R7의 각 어커런스(occurrence)는 독립적으로 H, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, (C1-C8)알킬, 아릴 또는 (C0-C4)알킬-OR5이다.
화학식 Ⅱ의 다른 구체적인 화합물에 있어서, 헤테로아릴은 피리딜, 푸릴 또는 티에닐이다.
화학식 Ⅱ의 다른 구체적인 화합물에 있어서, R1은 C(O)OR4이다.
화학식 Ⅱ의 다른 구체적인 화합물에 있어서, C(O)NHC(O)의 H는 (C1-C4)알킬, 아릴 또는 벤질로 치환될 수 있다.
나아가, 본 발명의 다른 구체적인 항-혈관생성 화합물은 참조에 의해 여기에 병합되는 미국출원 09/781179, 국제특허공보 WO98/54170 및 미국특허 제6,395,754호에 기재되어 있는 바와 같은 이소인돌-이미드의 종(class)에 속한다. 이 화합물은 그 대표적인 화학식 Ⅲ이 다음과 같고,
약제적으로 수용 가능한 솔트, 하이드레이트, 솔베이트, 클라쓰레이트, 이난시오머, 디아스테레오머, 라세메이트, 및 이들의 스테레오이소머 혼합물이고,
여기서, X 및 Y 의 한쪽은 C=O 이고, 다른 쪽은 CH2또는 C=O 이고,
R 은 H 또는 CH2OCOR' 이고;
(i) R1, R2, R3또는 R4각각은 다른 것과는 독립적으로 1 내지 4 탄소 원자의 할로, 알킬, 또는 1 내지 4 탄소 원자의 알콕시, 또는 (ii) R1, R2, R3또는 R4의 하나는 니트로 또는 -NHR3, 그리고 R1, R2, R3, 또는 R4의 나머지는 수소이고;
R5는 수소 또는 1 내지 8 탄소 원자의 알킬이고;
R6는 수소, 1 내지 8 탄소 원자의 알킬, 벤조, 클로로 또는 플루오로이고;
R' 은 R7-CHR10-N(R8R9)이고;
R7 은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌, 또는 -(CnH2n)(n은 0 내지 4)이고;
R8및 R9의 각각은 서로 독립적으로 수소 또는 1 내지 8 탄소 원자의 알킬, 또는 R8및 R9는 모두 테트라에틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 또는 -CH2CH2[X]X1CH2CH2(여기서, [X]X1은 -O-, -S-, 또는 -NH-임)이고;
R10은 수소, 8 탄소 원자의 알킬 또는 페닐이고;
* 는 키랄(chiral)-탄소 중심을 나타낸다.
본 발명의 가장 바람직한 항-혈관생성 화합물은 4-(아미노)-2-(2,6-다이옥소(3-피페리딜)-이소인돌린-1,3-디온 및 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-피페리딘-2,6-디온 이다. 이 화합물은 표준적인 합성 방법에 의해 획득될 수 있다(예컨대, 참조로서 여기에 병합되는 미국특허제5,635,517호 참조). 탈리도미드와 같은 이 화합물의 어떤 것은 상업적으로 입수 가능하다(예컨대, 탈로미드™, 악티미드™, 및 레비미드™(셀진, Inc., Warren, New Jersey)). 4-(아미노)-2-(2,6-다이옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온(악티미드™)는 다음과 같은 화학적 구조를 가진다.
3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-피페리딘-2,6-디온(레비미드™)는 다음과 같은 화학적 구조를 가진다.
상기 화합물의 다른 것들은 참조에 의해 전체로서 여기에 병합되는 전술한 특허에 개시되어 있는 바를 포함하는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
명확하게, 본 발명의 가장 바람직한 화합물은 탈리도미드, 아미노탈리도미드, 및 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-피페리딘-2,6-디온이다.
본 발명의 화합물은 공지된 방법, 예컨대 2003. 3. 6.자에 공개되고 참조에 의해 전체로서 여기에 병합되는 "이소인돌-이미드 화합물, 조성물, 및 이들의 용도"라는 제하의 미국출원 공개공보 US2003045552(Robarge et al.)에 개시된 분석법을 이용하여 TNF-α의 생산 조절능력에 대한 분석이 이루어질 수 있다.
별다른 지시가 없는 한, 여기에서 사용되는 "입체이성질체 적으로 정제된"이라는 용어는 하나의 입체이성질체 화합물을 포함하여 실질적으로 다른 입체이성질체 화합물이 없는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 하나의 키랄 중심을 가지는 입체이성질체 적으로 정제된 화합물의 조성물은 실질적으로 그 화합물과 반대의 거울상이성질체가 없다. 두개의 키랄 중심을 가지는 화합물의 입체이성질체 적으로 정제된 화합물의 조성물은 그 화합물에 대한 다른 부분 입체이성질체가 실질적으로 없다. 별다른 지시가 없는 한, 여기에서 사용되는 "거울상이성질체 적으로 정제된"이라는 용어는 하나의 키랄 중심을 가지는 화합물의 입체이성질체 적으로 정제된 조성물을 의미한다. 별다른 지시가 없는 한, 여기에서 사용되는 "입체이성질체 적으로 응축된 "이라는 용어는 화합물에 대하여 60중량% 이상, 바람직하게는 70중량% 이상, 더욱 바람직하게는 80중량% 이상의 입체이성질체를 포함하는 조성물을 의미한다. 여기서 사용된 바와 같이, "거울상이성질체 적으로 정제된"이라는 용어는 하나의 키랄 중심을 가진 입체이성질체 적으로 정제된 화합물의 조성물을 의미한다. 유사하게, "거울상이성질체 적으로 응축된"이라는 용어는 하나의 키랄 중심을 가지는 입체이성질체 적으로 응축된 화합물의 조성물을 의미한다.
5.2.2 PDE IV 억제제
항혈관신생 활성(anti-angiogenic activity)을 가진다고 생각되는 다른 종류의 화합물은 PDE IV 억제제로 지칭된다. IMiDs와 같은 PDE IV 억제제는 TNF-α저해 활성을 가진다. 본 발명에 사용되는 바람직한 화합물로서 셀젠사의 SelectiveCytokine Inhibitory Drugs(SelCIDsTM)가 알려져 있다.
달리 언급하지 않았다면, 본 발명에서 사용된 "SelCIDsTM"이라는 용어는 저분자량의 약제, 예를 들어 펩타이드, 프로테인, 핵산, 올리고사카라이드 또는 다른 거대분자가 아닌 작은 유기 분자를 포함한다. 바람직한 화합물은 TNF-α생산을 억제한다. 더욱이, 화합물은 IL1β 및 IL12를 유도하는 LPS에 대한 적절한 억제 효과를 또한 갖는다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 유력한 PDE IV 억제제이다. PDE IV는 인간의 골수 및 림프계 선형세포(lineage cell)에서 발견되는 주된 포스포디에스테라아제 동종효소의 하나이다. 상기 효소는 편재하는 2차 메센저인 cAMP를 저하시키고 낮은 세포내 레벨에서 이를 유지함으로써 세포 활성을 조절하는 중대한 역할을 한다.
선택적인 사이토카인 억제 제제의 특정 예로서 미국 특허 제5,605,914호에 공개된 환상 이미드; 미국 특허 제5,728,844호 및 제5,728,845호의 사이클로알킬 니트릴; 미국 특허 제5,801,195 및 제5,736,570호의 아릴 아미드(예를 들어 N-벤조일-3-아미노-3-(3',4'-디메톡시페닐)-프로판아미드의 구현체); 미국 특허 제5,703,098호에 공개된 이미드/아미드 에테르 및 알코올(예를 들어, 3-프탈이미도-3-(3',4'-디메톡시페릴)프로판-1-올); 미국 특허 제5,658,940호에 공개된 숙신이미드 및 말레이미드(예를 들어 메틸 3-3',4',5',6'-페트라하이드로프탈이미도)-3-(3",4"-디메톡시페닐)프로피오네이트); WO 99/06041에 개시된 이미도 및아미도 치환된 알카노하이드록사믹 에시드 및 미국 특허 제6,020,358호에 개시된 치환 페네틸술폰(phenethylsulfones); 및 미국 특허 제6,046,221호에 개시된 N-벤조일-3-아미노-3-(3',4',디메톡시페닐)프로판아미드와 같은 아릴 아미드를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 여기에 언급한 특허 및 특허출원 내용이 모두 레퍼런스로서 통합된다.
부가적인 선택적 사이토카인 억제 약제가 합성 화학 화합물의 패밀리에 포함된다. 대표적인 예로서, 3-(1,3-디옥소벤조-[f]이소인돌-2-yl)-3-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)프로피온아미드 및 3-(1,3-디옥소-4-아자이소인돌-2-yl)-3-(3,4-디메톡시페닐)-프로피온아미드를 포함한다.
다른 특별한 선택적 사이토카인 억제 약제는 미국 특허 제5,698,579호 및 5,877,200호에 개시된 비펩타이드인 환상 아미드의 클래스에 속하며, 이들 특허는 모두 본 명세서에 통합된다. 대표적인 환상 아미드는 다음 화학식의 화합물을 포함한다;
여기서, n은 1, 2 또는 3이고;
R5는 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아크릴아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 독립적인 1 내지 4의 치환체로 치환 또는 비치환된 o-페닐렌이고;
R7는 i) 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬, 탄소수 1 내지 10인 알콕시 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 독립적인 하나 이상의 치환체로 치환된 페닐 또는 비치환 페닐이고, (ii) 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬, 탄소수 1 내지 10인 알콕시 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 독립적인 1 내지 3의 치환체로 치환 또는 비치환된 벤질이고, (iii) 나프닐 또는 (iv) 벤질옥시이고;
R12는 -OH, 탄소수가 1 내지 12인 알콜시 또는 ()이고,
R8은 수소 또는 탄소수가 1 내지 10인 알킬이고;
R9는 수소 또는 탄소수가 1 내지 10인 알킬, -COR10, 또는 -SO2R10으로서 R10은 수소, 탄소수가 1 내지 10인 알킬 또는 페닐이다.
이 클래스의 특정한 화합물은 다음 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
3-페닐-2-(1-옥소이소인돌린-2-yl)프로피온산;
3-페닐-2-(1-옥소이소인돌린-2-yl)프로피온아미드;
3-페닐-3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)프로피온산;
3-페닐-3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)프로피온아미드;
3-(4-메톡시페닐)-3-(1-옥스이소인돌린-yl)프로피온산;
3-(4-메톡시페닐)-3-(1-옥스이소인돌린-yl)프로피온아미드;
3-(3,4-디메톡시페닐)-3-(1-옥스이소인돌린-2-yl)프로피온산;
3-(3,4-디메톡시-페닐)-3-(1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-yl)-프로피온아미드;
3-(3,4-디메톡시페닐)-3-(1-옥스이소인돌린-2-yl)프로피온아미드;
3-(3,4-디에톡시페닐)-3-(1-옥소이소인돌린-yl)프로피온산;
메틸 3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)프로피오네이트;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)프로피온산;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-프로폭시-4-메톡시페닐)프로피온산;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-부톡시-4-메톡시페닐)프로피온산;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-프로폭시-4-메톡시페닐)프로피온아미드;
3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-부톡시-4-메톡시페닐)프로피온아미드;
메틸 3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-부톡시-4-메톡시페닐)프로피오네이트; 및
메틸 3-(1-옥소이소인돌린-2-yl)-3-(3-프로폭시-4-메톡시페닐)프로피오네이트.
다른 특정한 선택적 사이토카인 억제 약제는 WO/ 99/06041에 개시된 이미도 및 아미도 치환 알카노하이드록스아믹산을 포함하며, 이는 본 명세서에 통합된다. 이러한 화합물은 다음의 화합물을 포함하나 이에 한정하지 않는다;
여기서, R1및 R2는 각각 서로 독립적일 때 수소 또는 낮은 탄소수의 알킬이고, 또는 R1및 R2각각이 묘사된 탄소 원자에 서로 결합되어 있을 때 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 아크릴아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬, 탄소수 1 내지 10인 알콕시 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 독립적인 1 내지 4의 치환체로 치환 또는 비치환된 o-페닐렌, o-나프틸렌 또는 사이클로헥센-1,2-diyl이고;
R3는 니트로, 시아노, 트리플루오로메틸, 카르브에톡시, 카르보메톡시, 카르보프로폭시, 아세틸, 카르바모일, 아세톡시, 카르복시, 하이드록시, 아미노, 탄소수 1 내지 10인 알킬, 탄소수 1 내지 10인 알콕시, 탄소수 1 내지 10인알킬티오(alkylthio), 벤질옥시, 탄소수 3 내지 6인 사이클로알콕시, C4-C6-사이클로알킬리덴메틸, C3-C10-알킬리덴메틸, 인다닐옥시(indanyloxy) 및 할로겐 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환체로 치환된 페닐이고;
R4는 수소, 탄소수가 1 내지 6인 알킬, 페닐 또는 벤질이고,
R4'는 수소, 탄소수가 1 내지 6인 알킬이고,
R5는 -CH2-, -CH2-CO-, -SO2-, -S- 또는 -NHCO-이고;
n은 0, 1 또는 2이고; 및
상기 화합물의 산 부가 염은 프로토네이트될 수 있는 질소 원자를 함유한다.
본 발명에 사용되는 부가적이고 특이적인 선택적 사이토카인 억제 약제는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-메톡시-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
N-벤질옥시-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-프탈이미도프로피온아미드;
N-벤질옥시-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-(3-니트로프탈이미도)프로피온아미드;
N-벤질옥시-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-프탈이미도프로피온아미드;
N-하이드록시-3-(3,4-디메톡시페닐)-3-프탈이미도프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(3-니트로프탈이미도)프로피온아미드;
N-하이드록시-3-(3,4-디메톡시페닐)-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(4-메틸-프탈이미도)프로피온아미드;
3-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-프탈이미도프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(1,3-디옥소-2,3-디하이드로-1H-벤조[f]이소인돌-2-yl)프로피온아미드;
N-하이드록시-3-{3-(2-프로폭시)-4-메톡시페닐}-3-프탈이미도프로피온아미드;
3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-(3,6-디플루오로프탈이미도)-N-하이드록시프로피온아미드;
3-(4-아미노프탈이미도)-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시프로피온아미드;
3-(3-아미노프탈이미도)-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시프로피온아미드;
N-하이드록시-3-{3,4-디메톡시페닐)-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드;
3-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-N-하이드록시-3-(1-옥소이소인돌리닐)프로피온아미드; 및
N-벤질옥시-3-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-3-(3-니트로프탈이미도)프로피온아미드.
본 발명에 사용되는 부가적인 선택적 사이토카인 억제 약제는 페닐 그룹 위에 옥소이소인딘 그룹으로 치환된 펜에틸술폰(phenethylsulfones)을 포함한다. 이러한 화합물은 미국 특허 제6,020,358호에 개시된 다음과 같은 화합물들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
여기서, *로 표시된 탄소원자는 키랄리티(chirality)의 중심을 구성한다;
Y는 C=O, CH2, SO2, 또는 -CH2C=O이고; R1, R2, R3및 R4는 각각 서로 독립적으로 수소, 할로겐 원소, 탄소수가 1 내지 4인 알킬, 탄소수가 1 내지 4인 알콕시, 니트로, 시아노, 하이드록시 또는 -NR8R9이거나; 묘사된 페닐렌 고리의 인접한 탄소 원자 위의 R1, R2, R3및 R4중의 어떤 2개는 나프탈렌이고;
R5및 R6은 각각 서로 독립적으로 수소, 탄소수가 1 내지 4인 알킬, 탄소수가 1 내지 4인 알콕시, 니트로, 시아노 또는 탄소수가 18까지인 사이클로알콕시이고;
R7는 하이드록시, 탄소수가 1 내지 8인 알킬, 페닐, 벤질 또는 NR8'R9'이고;
R8및 R9은 각각 서로 독립적일때 수소, 탄소수가 1 내지 8인 알킬, 페닐 또는 벤질이고, R8및 R9중의 하나가 수소이고 다른 하나는 COR10또는 -SO2R10이거나, 또는 R8및 R9가 모두 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH2CH2X1CH2CH2-(X1은 -O-, -S- 또는 -NH-임)이고;
R8'및 R9'은 각각 서로 독립적일때 수소, 탄소수가 1 내지 8인 알킬, 페닐 또는 벤질이거나, R8'및 R9'중의 하나가 수소이고 다른 하나는 COR10'또는 -SO2R10'이거나, 또는 R8'및 R9'가 모두 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH2CH2X2CH2CH2-(X2는 -O-, -S- 또는 -NH-임)이다.
전술한 화합물들이 펜에틸술폰일 때를 가정한다면, 이들은 R7가 NR8'R9'일때 술폰아미드를 포함한다.
이러한 화합물들의 특정한 그룹들로서 Y가 C=O 또는 CH2인 화합물들이 있다.
이러한 화합물들의 더욱 특정한 그룹들로는 R1, R2, R3및 R4가 각각 서로 독립적으로 수소, 할로겐 원소, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 니트로, 시아노, 하이드록시 또는 -NR8R9인 화합물들이 있으며, 이 때, R8및 R9는 서로 독립적으로 수소 또는 메틸이거나, R8및 R9중의 하나는 수소이고 나머지 하나는 -COCH3이다.
특정한 화합물로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 -NH2이고 R1, R2, R3및 R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 -NHCOCH3이고 R1, R2, R3및 R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 -N(CH3)2이고 R1, R2, R3및 R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
이러한 화합물의 더욱 바람직한 그룹으로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 메틸이고 R1, R2, R3및 R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R1, R2, R3및 R4중의 하나가 플루오로이고 R1, R2, R3및R4의 나머지는 수소인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R5및 R6가 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 사이클로펜톡시 또는 사이클로헥소시인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R5가 메톡시이고, R6는 모노사이클로알콕시, 폴리사이클로알콕시 또는 벤조사이클로알콕시인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R5가 메톡시이고, R6는 에톡시인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R7이 하이드록시, 메틸, 에틸, 페닐, 벤질 또는 NR8'R9'이고, R8'및 R9'은 각각 서로 독립적으로 수소 또는 메틸인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R7이 메틸, 에틸, 페닐, 벤질 또는 NR8'R9'이고, R8'및 R9'은 각각 서로 독립적으로 수소 또는 메틸인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R7이 메틸인 화합물들이 있다.
특정한 화합물로서 R7이 NR8'R9'이고, R8'및 R9'은 각각 서로 독립적으로 수소 또는 메틸인 화합물들이 있다.
다른 특정한 선택적 사이토카인 억제 약제들은 2002년 12월 30일 출원된 뮬러 등의 미국 가출원 제60/436,975호에 기재된, 플루오로알콕시-치환된 1,3-디하이드로-이소인돌일 화합물을 포함하며, 이 문헌 전체가 본 발명의 레퍼런스로서 통합된다. 대표적인 플루오로알콕시-치환된 1,3-디하이드로-이소인돌릴 화합물들은 다음 화합물을 포함한다.
여기서,
Y는 -C(O)-, -CH2,-CH2C(O)-,-C(O)CH2- 또는 SO2;
Z는 -H, -C(O)R3, -(C0-1-알킬)-SO2-(C1-4-알킬), -C1-8-알킬, -CH2OH, CH2(0)(C1-8-알킬) 또는 -CN;
R1및 R2는 각각 서로 독립적으로 -CHF2, -C1-8-알킬, -C3-18-사이클로알킬 또는 -(C1-10-알킬)(C3-18-사이클로알킬)로서 R1및 R2중 적어도 하나는 CHF2이고;
R3는 -NR4R5, -알킬, -OH,-O-알킬, 페닐, 벤질, 치환된 페닐 또는 치환된 벤질이고;
R4및 R5는 각각 서로 독립적으로 -H, -C1-8-알킬, -OH 또는 -OC(O)R6이고,
R6는 -C1-8-알킬, -아미노(C1-8-알킬), -페닐, -벤질, 또는 -아릴이고,
X1, X2, X3및 X4는 각각 서로 독립적으로 -H, -할로겐,-니트로, -NH2, -CF3, -C1-6-알킬, -(C0-4-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C0-4-알킬)-NR7R8, (C0-4-알킬)-N(H)C(O)-(R8), (C0-4-알킬)-N(H)C(O)N(R7R8), (C0-4-알킬)-N(H)C(O)O(R7R8), (C0-4-알킬)-OR8, (C0-4-알킬)-이미다조일, (C0-4-알킬)-피롤릴, (C0-4-알킬)-옥사디아조일 또는 (C0-4-알킬)-트리아조일 또는 X1, X2, X3및 X4중의 2개가 함께 결합하여 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 링을 형성하고(예를 들어, X1과 X2, X2와 X3, X3와 X4, X1과 X3, X2와 X4또는 X1과 X4가 방향족인 3, 4, 5, 6 또는 7 멤버 링을 형성하여, 이소인돌릴 링을 갖는 바이사이클릭 시스템을 형성할 수 있다); 및
R7및 R8는 각각 서로 독립적으로 H, C1-9-알킬, C3-6-사이클로알킬, (C1-6-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C1-6-알킬)-N(R7R8), (C1-6-알킬)-OR8, 페닐, 벤질 또는 아릴;
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그.
바람직한 화합물은 다음 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-프로피온산;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-N,N-디메틸-프로피온아미드;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-프로피온아미드;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온산;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-N-하이드록시-프로피온아미드;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(7-니트로-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(7-니트로-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온산;
3-(3-사이클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)-3-(7-니트로-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-N,N-디메틸-프로피온아미드;
3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-3-(7-니트로-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-(7-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-[7-(사이클로프로판카르보닐-아미노)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl]-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산 메틸 에스테르;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산;
3-[7-(사이클로프로판카르보닐-아미노)-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl]-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산;
사이클로프로판카르복실산{2-[2-카르바모일-1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드;
사이클로프로판카르복실산{2-[1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-2-디메틸카르바모일-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드;
사이클로프로판카르복실산{2-[1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-2-하이드록시카르바모일-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온아미드;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-N,N-디메틸-프로피온아미드;
3-(7-아세틸아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-N-하이드록시-프로피온아미드;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온산;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-프로피온아미드;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-N,N-디메틸-프로피온아미드;
3-(4-아세틸아미노-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-3-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-N-하이드록시-프로피온아미드;
사이클로프로판카르복실산{2-[1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-2-메탄술포닐-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드;
N-{2-[1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-2-메탄술포닐-에틸]-1,3-디옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아세트아미드; 및
사이클로프로판카르복실산{2-[2-카바모일-1-(4-디플루오로메톡시-3-에톡시-페닐)-에틸]-7-chloro-3-옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-yl}-아미드.
다른 선택적인 사이토카인 억제 약제는, 뮬러 등에 의해 2003년 3월 12일 출원되고 본 명세서에 그 전체가 레퍼런스로서 통합되는 미국특허 가출원 제60/454,155호에 있는 7-아미도-치환된 이소인돌일 화합물을 포함한다. 대표적인7-아미도-치환된 이소인돌일 화합물은 다음 구조식의 화합물을 포함한다:
여기서:
Y는 -C(O)-, -CH2, -CH2C(O)- 또는 SO2이고;
X는 H이고,
Z는 (C0-4-알킬)-C(O)R3 ,(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)-OH, (C1-4-알킬)-O(C1-4-알킬), (C1-4-알킬)-SO2(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)-SO(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)-NH2, (C0-4-알킬)-N(C1-8-알킬)2, (C1-4-알킬)-N(H)(OH), CH2NSO2(C1-4-알킬)이고;
R1및 R2는 각각 독립적으로 C1-8-알킬, 사이클로알킬, 또는 (C1-4-알킬)사이클로알킬이고;
R3는 NR4R5, OH, 또는 O-(C1-8-알킬)이고;
R4는 H이고;
R5는 -OH, 또는 -OC(O)R6이고;
R6는 C1-8-알킬, 아미노-(C1-8-알킬), (C1-8-알킬)-(C1-4-알킬C1-4-알킬3-66-사이클로알킬), C3-6-사이클로알킬, 페닐, 벤질 또는 아릴이고;
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그; 또는 다음 화학식:
여기서:
Y는 -C(O)-, -CH2, -CH2C(O)-, 또는 SO2이고;
X는 할로겐, -CN, -NR7R8, -NO2, 또는 -CF3이고,
W는
Z는 (C0-4알킬)-SO2(C1-4-알킬), -(C0-4알킬)-CN, -(C0-4알킬)-C(O)R3, C1-4-알킬, (C0-4-알킬)OH, (C0-4-알킬)O(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)SO(C1-4-알킬), (C0-4-알킬)NH2, (C0-4-알킬)N(C1-8-알킬)2, (C0-4-알킬)N(H)(OH), 또는 (C0-4-알킬)NSO2(C1-4-알킬)이고;
W는 -C3-6-사이클로알킬, -(C1-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬)-NR7R8, (C0-8-알킬)-NR7R8, (C0-4-알킬)-CHR9-(C0-4-알킬)-NR7R8이고,
R1및 R2는, 각각 독립적으로 C1-8-알킬, 사이클로알킬, 또는(C1-4-알킬)사이클로알킬이고;
R3는 C1-8-알킬, NR4R5, OH, 또는 O-(C1-8-알킬)이고;
R4및 R5는 각각 독립적으로 H, C1-8-알킬, (C0-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬),OH, 또는 -OC(O)R6
R6는 C1-8-알킬, (C0-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), 아미노-(C1-8-알킬), 페닐, 벤질 또는 아릴이고;
R7및 R8는 각각 독립적으로 H, C1-8-알킬, (C0-8-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), 페닐, 벤질, 아릴, 또는, 그들을 연결하는 원자들과 함께 결합하여 3 내지 7 멤버의 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴 링을 형성할 수 있고;
R9는 C1-4-알킬, (C0-4-알킬)아릴, (C0-4-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C0-4-알킬)-헤테로사이클;
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그.
또 다른 선택적인 사이토카인 억제 약제는, 뮬러 등에 의해 2003년 3월 12일에 출원되고 본 명세서에 그 전체가 레퍼런스로서 통합되는 미국특허 가출원 제60/454,149호에 있는 N-알킬-하이드록스아민산-이소인돌일 화합물을 포함한다. 대표적인 N-알킬-하이드록스아민산-이소인돌일 화합물은 다음 식의 화합물을 포함한다:
여기서:
Y는 -C(O)-, -CH2, -CH2C(O)- 또는 SO2이고;
R1및 R2는 서로 독립적으로 C1-8-알킬, CF2H, CF3, CH2CHF2, 사이클로알킬, 또는(C1-8-알킬)사이클로알킬이고;
Z1는 H, (C1-6-알킬), -NH2-NR3R4또는 OR5이고;
Z2는 H 또는 C(O)R5이고;
X1, X2, X3및 X4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, NO2, OR3, CF3, C1-6-알킬, (C0-4-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C0-4-알킬)-N-(R8R9), (C0-4-알킬)-NHC(O)-(R8), (C0-4-알킬)－NHC(O)CH(R8)(R9), (C0-4-알킬)-NHC(O) N(R8R9), (C0-4-알킬)-NHC(O)O(R8), (C0-4-알킬)-O-R8, (C0-4-알킬)-이미다조일, (C0-4-알킬)-피롤릴, (C0-4-알킬)-옥사디아조일, (C0-4-알킬)-트리아조일, 또는, (C04-알킬)-헤테로사이클이고;
R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 H, C1-6-알킬, O-C1-6-알킬, 페닐, 벤질 또는 아릴이고;
R6및 R7는 서로 독립적으로 H 또는 C1-6-알킬이고;
R8및 R9는 각각 독립적으로 H, C1-9-알킬, C3-6-사이클로알킬, (C1-6-알킬)-(C3-6-사이클로알킬), (C0-6-알킬)-N(R4R5), (C1-6-알킬)-OR5, 페닐, 벤질, 아릴, 피페리디닐, 피페리지닐, 피롤리디닐, 모드포리노(morpholino), 또는 C3-7-헤테로사이클로알킬; 및
이의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그.
특정의 선택적인 사이토카인 억제 약제는 이하를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다:
2-[1(-3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸-술포닐에틸]이소인돌린-1-one;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-(N,N-디메틸-아미노술포닐)에틸]이소인돌린-1-one;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸-술포닐에틸]이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸-술포닐에틸]-5-니트로-이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸-술포닐에틸]-4-니트로이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-아미노이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-5-메틸이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-5-아세트아미도이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-디메틸아미노이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-5-디메틸아미노이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]벤조[e]이소인돌린-1,3-dione;
2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-메톡시이소인돌린-1,3-dione;
1-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸-아민;
2-[1-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]이소인돌린-1,3-dione; 및
2-[1-(3-사이클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-디메틸아미노이소인돌린-1,3-dione.
추가적인 선택적 사이토카인 억제 약제는, 뮬러 등에 의해 2002년 3월 20일에 출원된 미국특허 가출원 제60/366,515호 및 제60/366,516와 뮬러 등에 의해 2003년 1월 7일에 출원된 미국특허 가출원 제60/438,450호 및 제60/438,448호에 개시되어 있는 에난티오메리컬하게(enantiomerically) 순수한 화합물을 포함한다. 상술한 모든 출원들은 본 명세서에 레퍼런스로서 통합된다. 바람직한 화합물들은 2-[1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-메틸술포닐에틸]-4-아세틸아미노이소인돌린-1,3-dione의 에난티오머 및 3-(3,4-디메틸옥시-페닐)-3-(1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온아미드의 에난티오머를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바람직한 선택적 사이토카인 억제 약제는 3-(3,4-디메톡시-페닐)―3-(1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온아미드 및 사이클로프로판카르복실산 {2-[1-(3-에톡시-4-메톡시-페닐)-2-메탄술포닐-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1 H-이소인돌-4-yl}-아미드인데, 이들은 셀젠사 워렌, NJ에서 입수할 수 있다. 3-(3,4-디메톡시-페닐)―3-(1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-프로피온아미드는 이하의 화학 구조를 가진다:
사이클로프로판카르복실산 {2-[1-(3-에톡시-4-메톡시-페닐)-2-메탄술포닐-에틸]-3-옥소-2,3-디하이드로-1 H-이소인돌-4-yl}-아미드는 이하의 화학 구조를 가진다:
본 발명의 화합물은 또한, cilomast, 테오필린, zardaverine, rolipram, 펜톡시필린, 에녹시몬(enoximone), 이소인돌-이미드, 페네틸술폰, 알카노하이드록스아민산, 비-폴리펩타이드 사이클릭 아미드, 옥소이소인돌, 이소인돌린, 인다졸, 헤테로치환된 피리딘, 디페닐피리딘, 아릴 티오펜, 아릴 푸란, 인덴, 3 치환 페닐, 프탈아지논, 벤젠술폰아미드, 테트라사이클릭 화합물 및 그 염, 솔베이트, 아이소머, 포접 화합물, 프로드러그, 하이드레이트 또는 유도체와 같은 PDE IV 활성을 저해하는 화합물을 비한정적으로 포함한다.
실시예에서, 이 화합물은 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이토카인, 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산이 아니다.
다른 실시예에서, 본 발명의 화합물은 아이소머, 프로드러그 및 약학적으로 허용되는 그 염, 하이드레이트, 솔베이트, 포접화합물을 포함하는 이하의 구조(I)를 가진다:
여기서:
Y는 N 또는 N-옥사이드을 나타내고;
R1및 R2는 H, C1-6알킬 및 할로 C1-6알킬로부터 독립적으로 선택되고:
R3및 R4는 H 및 C1-6알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 같은 탄소원자에 부착되는 R3및 R4는 전체로서 카르보닐 산소 원자를 나타내거나, 또는 임의의 개재되는 원자들과 함께 서로 다른 탄소원자에 부착되는 R3및 R4는 그 탄소원자들과의 조합으로서 포화된 5, 6 또는 7 멤버의 카르보사이클릭 링을 나타내며;
R5및 R6는 H, C1-6알킬, 할로 C1-6알킬 및 CN으로 이루어지는 군으로부터 선택된 멤버를 독립적으로 나타내고;
n는 0 내지 6의 정수를 나타내고;
Ar1은 티에닐, 티아조일, 피리딜, 페닐 및 나프틸로 이루이지는 군으로부터 선택되고; 상기 Ar1은 할로겐 원소, C1-6알콕시,C1-7알킬티오, CN, C1-6알킬, 하이드록시 C1-6알킬, -C(O)C1-6알킬, -CO2H, -CO2C1-6알킬, NH(SO2Me), N(SO2Me)2, SO2Me, SO2NH2, SO2NHC1-6알킬, SO2N(C1-6알킬)2NO2, C2-6알케닐, C1-6알킬 및 NH2로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 내지 3의 멤버로 선택적으로 치환되며;
그리고, Ar1이 2 또는 3의 치환체가 있는 페닐 또는 나프틸기를 나타낼 때, 이러한 두 치환체는 조합으로서 간주되어 5 또는 6 멤버의 퓨즈드 락톤 링을 나타낼 수 있다.
이 구현예는 나아가, 그 전체가 본 명세서에 레퍼런스로서 통합되는 미국특허 제6,316,472호에 있는 것과 같은 화합물들을 포괄한다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(II)를 갖는다.
상기 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 프러드러그 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R1및 R2는 C1-C4의 알킬 또는 C3-C10의 사이클로알킬을 나타내며;
상기 R3및 R4는 독립적으로 C1-4알킬, 사이클로알킬, 하나의 이중결합을 포함하는 C2-C4알킬렌, 하나의 삼중결합을 포함하는 C2-C4알킬린, (CH2)nCO(CH2)mCH3, (CH2)pCN, (CH2)pCO2Me 또는 이들이 질소 원자에 함께 부착됨으로 인해 3-10 개의 멤버로 구성된 고리 구조를 나타내며;
상기 n과 m은 0 내지 3을 나타내고;
상기 p는 1 내지 3을 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 제6,162, 830에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(III)를 갖는다.
상기 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 프러드러그 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R1은 수소, 할로겐, 저급 알콕시, 하이드록시, 저급 알킬, 저급 알킬 머캅도, 저급 알킬술포닐, 저급 알킬아미노, 디-저급 알킬 아미노, 아미노, 니트로, 니트릴, 저급 알킬 카복실레이트, -CO2H 및 술폰아미도로 구성된 그룹으로부터 각각 경우에 독립적으로 선택되어지며;
상기 R2는 수소 및 저급 알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되어지고;
상기 R3는 수소, 저급 알킬, 하이드록시 및 아미노로 구성되는 그룹으로부터 선택되어지며;
상기 R4는 -COM 및 CH2OH로 구성되는 그룹으로부터 선택되어진다. 이때, 상기 M은 하이드록시, 치환된 저급 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디아칼아미노, N-모폴리노, 하이드록시알킬아미노, 폴리하이드록시아미노, 디알킬아미노알킬아미노, 아미노알킬아미노 및 OMe 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 이때, Me는 양이온을 나타내며;
상기 R5는 알킬술포닐을 나타내고;
상기 n은 0 부터 4까지의 정수를 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,177, 471에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(IV)를 갖는다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 프러드러그 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R0는 수소, 할로겐 또는 C1-6알킬을 나타내며;
상기 R1은 수소; 피리딜, 모폴리닐, 피페라지닐, 피롤리디닐 및 피페리디닐로 구성된 그룹으로부터 선택되어지는 5 또는 6개의 인자로 구성된 헤테로사이클릭링, 페닐, C3-6-사이클로알킬, -NRaRb, -CO2Ra, 할로겐 및 페닐로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 C1-6알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되어지며, 하나 또는 둘 이상의 C1-6알킬에 의해 선택적으로 치환되며, C1-6알킬을 경유하여 R1에 부착되어진 질소 원자에 선택적으로 연결되어 있고;
상기 R2는 -ORa, -NR2, Rb, 할로겐, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노 및 니트로로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되는 페닐로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
상기 Ra및 Rb는 이들 화합물의 이성질체, 프러드러그 및 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 C1-6알킬 또는 수소를 독립적으로 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,218,400에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(V)를 갖는다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 프러드러그 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
상기 X는 S 또는 O이고;
상기 Ar1은 -OH, -CO2H, CO2C1-3알킬 또는 CN으로서 선택적으로 치환된 C1-6알킬; C1-6알콕시; -OH로서 선택적으로 치환된 C1-3알킬티오, C1-3알킬술포닐, C1-3플루오로알킬; 할로(halo), -OH, -CO2H 또는 -CO2C1-3알킬;로 이루어진 각 치환기가 독립적이면서 두 개의 치환기까지 선택적으로 치환된 페닐, 피리디닐 또는 퓨릴로부터 선택된 방향족 고리 화합물이며;
상기 R2는 수소 또는 C1-3알킬이고;
상기 R3는 C1-3알킬, C1-3알플루오로알킬, C1-6알콕시, C1-3플루오로알콕시, C1-3알킬티오, 할로(halo) 또는 -OH로 이루어진 각 치환기는 서로 독립적이면서 두 개의 치환기까지 선택적으로 치환된 페닐, 피리디닐, 퀴놀리닐 또는 퓨릴이다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,034, 089 및 미국 특허 No. 6,020,339에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(VI)를 가진다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 프러드러그 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 Y는 할로겐 또는 알킬 또는 -XR2그룹이며;
상기 Z는 -O-, S(O)p- 또는 -N(Rb)-이고, 여기에서 p는 0 또는 정수 1 또는 2이며;
상기 L은 -XR, -C(R11)C(R1)(R2) 또는 -(CHR11)nCH(R1)(R2)이고, 여기서 n은 0 또는 정수 1이고;
상기 Ra및 Rb각각은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 그룹이며;
상기 R은 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 시클로알킬 또는 시클로알케닐 그룹이며;
상기 R1및 R2각각은 수소, 플루오린, -CN, -NO2또는 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알킬닐, 알콕시, 알킬티오, -CO2R8, -CONR9R10또는 -CSNR9R10그룹으로서 서로 같을 수도 있고 다를 수도 있거나, R1및 R2서로가 탄소 원자에 의해 부착되며, 선택적으로 치환된 시클로알킬 또는 시클로알케닐 그룹을 형성하기 위해 연결되어지며;
상기 R3는 수소, 플루오린, 하이드록시 또는 선택적으로 치환된 직선형 또는 가지형의 알킬그룹이며,
상기 R4는 수소, -(CH2)tAr 또는 -(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar1, 여기서 t는 0 또는 정수인 1, 2 또는 3이며;
상기 R5는 -(CH2)tAr 또는 -(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar'이며;
상기 R6는 수소, 플루오린 또는 선택적으로 치환된 알킬그룹이며;
상기 R7는 수소, 플루오린, 선택적으로 치환된 직선형 또는 가지형 알킬그룹, Rc는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 알케닐 그룹인 -ORc또는 포밀, 알콕시알킬, 알카노일, 카복스아미도 또는 티오카복스아미도 그룹이며;
상기 R8, R9및 R10각각은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 아랄킬(aralkyl) 또는 아릴 그룹이며;
상기 R11은 수소, 플루오린 또는 메틸 그룹이다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 5,798,373에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
더 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따르는 화합물은 하기 화학식 구조(VII)를 갖거나 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물, 포접화합물, 거울상이성질체, 광학이성질체, 라세미체 또는 이들 입체이성질체의 혼합물로 이루어질 수 있다.
더 바람직한 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따르는 하기 화학식 구조(VIII)를 갖는 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 염, 포접화합물, 용매화합물, 수화물, 프러드러그 및 약학적으로 수용가능한 염을 포함한다.
상기 화합물의 일정 정도는 뉴저지주의 워런시에 소재하는 셀진 아이엔시(Celgene, Inc.) 사로부터 상업적으로 유용할 수 있다. 상기 다른 화합물은 본원 명세서에서 전체로서 인용되고 있는 특허들에서 개시되어 있는 종래에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 유용한 PDE IV 억제제의 추가적인 실시예는 영국특허 2 063 249 A, 유럽특허 0 607 439 A1, 미국특허 No. 6,333, 354, 미국특허 No. 6,300, 335, 미국특허 No. 6,166, 041, 미국특허 No. 6,069, 156, 미국특허 No.6,011, 060, 미국특허 No. 5,891, 896, 미국특허 No. 5,849, 770, 미국특허 No. 5,710, 170, 미국특허 No. 4,101, 548, 미국특허 No. 4,001, 238, 미국특허 No. 4,001, 237, 미국특허 No. 3,920, 636, 미국특허 No. 4,060, 615, WO 97/03985, 유럽특허 0 607 439 A1, 미국특허 No. 4,101, 548, 미국특허 No. 4,001, 238, 미국특허 No. 4,001, 237, 미국특허 No. 3,920, 636, 미국특허 No. 4,060, 615, WO 97/03985, 유럽특허 0 395 328, 미국특허 No. 4,209, 623, 유럽특허 0 395 328, 미국특허 No. 4,209, 623, 미국특허 No. 5,354, 571, 유럽특허 0 428 268 A2, 미국특허 No. 5,354, 571, 유럽특허 0 428 268 A2,807, 826, 미국특허 No. 3,031, 450, 미국특허 No. 3,322, 755, 미국특허 No. 5,401, 774,807, 826, 미국특허 No. 3,031, 450, 미국특허 No. 3,322, 755, 미국특허 No. 5,401, 774, 미국특허 No. 5,147, 875, PCT WO 93/12095, 미국특허 No 5,147, 875, PCT WO 93/12095, 미국특허 No. 4,885, 301, WO 93/07149, 유럽특허 0 349 239 A2, 유럽특허 0 352 960 A2, 유럽특허 0 526 004 A1, 유럽특허 0 463 756 A1, 미국특허 No. 4,885, 301, WO 93/07149, 유럽특허 0 349 239 A2, 유럽특허 0 352 960 A2, 유럽특허 0 526 004 A1, 유럽특허 0 463 756 A1, 유럽특허 0 607 439 A1, 유럽특허 0 607 439 A1, WO 94/05661, 유럽특허 0 351 058, 미국특허 No. 4,162, 316, 유럽특허 0 347 146, 미국특허 No. 4,047, 404, 미국특허 No. 5,614, 530, 미국특허 No. 5,488, 055, WO 97/03985, WO 97/03675, WO 95/19978, 미국특허 No. 4,880, 810, WO 98/08848, 미국특허 No. 5,439, 895, 미국특허 No. 5,614, 627, PCT US94/01728, WO 98/16521, 유럽특허 0 722 943 A1, 유럽특허 0 722 937 A1, 유럽특허 0 722 944 A1, WO98/17668, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 98/06722, PCT/JP97/03592, WO 98/23597, WO 94/29277, WO 98/14448, WO 97/03070, WO 98/38168, WO 96/32379 및 PCT/GB98/03712에서 개시된 예들을 포함하며, 이들 모두는 본원 명세서에서 인용되어 융합되어진다.
본원 발명으로부터 예상할 수 있는 대부분의 화합물은 종래 기술로서 알려져 있는 표준 분석 또는 비대칭적 합성을 이용함으로서 전술한 특정한 화합물의 광학적 활성을 갖는 거울상이성질체 내에 풍부하게 존재할 수 있다. 참조의 예로서, 실리 등, Chem. Indus. 1030 (1965); 및 카시니 등, 파르마코 ED. Sci. 19: 563 (1964)를 들 수 있다.
또한, 본원 발명은 이들 화합물의 생리학적으로 수용가능한 비독성 산 첨가염에 관련되어 있다. 이러한 염들은 종래에 알려져 있는 유기 및 무기 산 또는 염기로부터 유도되는 것들을 포함한다. 이러한 산의 예로서, 염산, 브롬산(취화수소산), 인산, 황산, 메탄술폰산, 초산, 타르타르산(주석산), 락트산(유산), 숙신산(호박산), 시트릭산(구연산), 말산(사과산), 말레산, 소르빈산, 아코닛트산, 살리실산, 프탈산, 엠볼릭산, 에난트산 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 자연계에서는 산성이며, 다양한 약학적으로 수용가능한 염기와 염을 형성할 수 있다. 본 발명에 따른 산성 화합물에 약학적으로 수용가능한 염기를 준비하기 위해 사용될 수 있는 염은 예를 들어, 이들에 한정하지 않는 약리학적으로 수용가능한 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염, 특히 칼슘, 마그네슘, 나트륨 또는 칼륨 염 등과 같은 비독성 염기 첨가 염을 형성하기 위한 것들이다. 적합한 유기 염기는 N,N-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올라민, 에틸렌디아민, 메글루마인(N-메틸글루카민), 리신 및 프로카인에 한정하지 않는 것들을 포함하고 있다.
본 발명에 따른 화합물은 종래에 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어 미국특허 No. 6,316,472; 미국특허 No. ,204,275; 피더스톤 R.L. 등(2000) "래트 폐장의 체온 하강의 보존을 위해서 사용되는 성 토마스 병원 심장 마비성의 용액에 더해지는 차이가 나는 아이소자임 선택 작용의 포스포디에스테레이즈 억제제의 비교",Am J. Respir crit. Care Med.162：850-6; 및 브래킨 M. F. 등(1995) "cAMP에 특이성을 갖는 포스포디에스터레이즈의 유력한 억제제로서의 4-(3-부톡시-4-메톡시벤질) 이미다졸리딘-2-온(Ro 20-1724)의 구조를 적합하게 하는 아날로그의 설계 및 합성",J. Med. CHEM. 38: 4848-54.를 들 수 있으며, 이들 전부는 본원 명세서 인용되어 융합되어진다.
본 발명에 따른 화합물은 셀진사(뉴저지주의 워런시)로부터 상업적으로 구입할 수 있거나 본원 명세서 내에 개시된 특허들이나 특허공보에 개시된 방법에 따라 준비되어질 수 있다. 광학적으로 더욱 순수한 성분은 비대칭적으로 합성되거나 유기화학기술의 표준합성과 마찬가지로 잘 알려져 있는 분해제 또는 키랄 컬럼을 이용하여 분해되어질 수 있다.
5.3 줄기세포 모집단
본 발명은 인간 혈관형성(Angiogenesis)을 조절할 수 있는 화합물을 규명하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법의 범주에는 탯줄 혈액 세포(CB cell)로부터분리된 줄기세포, 말초혈액, 성체 혈액, 골수, 태좌, 중간엽줄기세포 및 다른 소스로부터 분리되는 줄기세포를 포함하지만 반드시 이들에 한정되지 않으며, 어떠한 종류의 인간 줄기 세포도 사용될 수 있다. 바람직하지 않은 실시예로서의 줄기세포는 태반 이외의 소스로부터 분리된 배아줄기세포이다.
중간엽 줄기세포의 소스는 골수, 태생기 난황낭, 태좌, 탯줄, 태아 및 성년의 가죽 및 혈액을 포함한다. 골수 세포는 장골의 정상, 대퇴골, 경골, 척추, 늑골 또는 다른 연수의 공간으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용되는 줄기세포는 다능성의 세포, 예들 들어 자기갱신 및 조직 내에서 정지하거나 휴지를 유지할 수 있는 완전하게 분화될 수 있는 능력을 갖는 세포이다. 또한, 줄기 세포는 다중능 세포이며, 결정된 원구 세포이며, 파이브로블래스토이드(fibroblastoid) 세포이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 만기의 사혈 관류된 태반으로부터 분리된 생존가능하며, 정지한 다능성의 줄기세포를 이용한다.
줄기세포 모집단은, 예컨대 라이프뱅크 USA(켄다 크놀, NJ) 비아코드(보스턴·매사추세츠주), 코드 블러드 레지스트리(산브루노, 캘리포니아주) 및 크라이오셀(클리어워터, 플로리다주) 등의 상업적 서비스를 통하여 확보된 태반 줄기세포로 완성될 수 있다.
줄기세포 모집단은 2002년 9월 5일 "태반 줄기 세포를 모으는 방법"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2002/0123141 및 2003년 2월 13일 "산후 포유동물 태반, 그 사용과 이로부터 얻어지는 태반 줄기 세포"의 제목으로 발표된 미국특허출원 No. US 2003/0032179에 개시된 방법에 따라 모아진 태반 줄기 세포로부터 완성될 수 있으며, 이들 양자 모두 전체로서 참조되어 본원 명세서에 융합되어진다.
본 발명에 따라 사용되는 바람직한 세포는 사혈 관류 태반으로부터 기원하는 배아와 유사한 줄기 세포 또는 배아와 유사한 태반의 줄기 세포에서 유래하는 세포이다. 본 발명에 따른 배아 유사 줄기세포는 모폴로지에서의 변화를 측정함으로서 특성을 나타내며, 세포 표면의 표지는 흐름세포측정 및 면역세포화학과 같은 기술을 사용하며, PCR과 같은 기술을 이용하여 유전 발현의 변화를 측정한다. 본 발명의 일 실시예에서, 배아 유사 줄기 세포는 다음의 세포 표면 표지, CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2, Sh3, SH4, OCT-4 및 ABC-p의 존재로서, 또는 다음의 세포 표면 표지, CD34, CD38, CD45, SSEA3 및 SSEA4의 부존재에 의해서 그 특성을 나타낼 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 배아 유사 줄기 세포는 OCT-4+ 및 APC-p+와 같은 세포 표면 표지의 존재에 의해 특성을 타나낼 수 있다. 세포 표면 표지는 종래에 알려진 기술, 예를 들어 항 세포 표면 표지 항체로서 워싱과 스테이닝을 처리하는 흐름세포측정에 의한 방법에 따라 일상적인 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들면, CD-34 또는 CD-38의 존재를 결정하기 위해서 세포는 PBS 내에서 워싱되어진 후, 안티-CD-34 피코에리트와 안티-CD38 플루오레세인 이소티오시안산염으로 두번 염색한다(벡턴 틱킨슨, 마운틴 뷰, CA).
태반으로부터 유래하는 배아 유사 줄기 세포는 배아줄기세포의 특징을 보유하나, 배아로부터 파생하지는 않는다. 다시 말하면, 본 발명은 미분화된 줄기 세포가 산후 관류 태반으로부터 분리되어진 미분화된 줄기 세포에 OCT-4+ 및 ABC-p+ 세포를 사용하는 것을 포함하고 있다. 이러한 세포는 인간 배아 줄기 세포로서 다능(다재능)하다. 상기 언급한 바와 같이, 관류 태반으로부터 분리된 서로 다른 다재능 또는 다중능의 줄기 세포는 서로 다른 시간 위치, 예컨대 CD-34+/CD38+. CD34+, /CD38- 및 CD-34/CD-38 조혈성 세포이다. 본 발명에 따르면, 인간 태반은 분만 후에 사용될 것이며, 배아 유사의 줄기세포의 소스로서 산후에 사용되어진다.
예를 들면, 자궁으로부터의 방출이 있은 후에, 태반은 세포자멸을 방지하거나 최소화하기 위하여 가능한 한 신속하게 사혈된다. 태반의 사혈된 후 가능한 빠르게 혈액, 잔여 세포, 단백질, 요인 및 다른 어떠한 기관 내에 존재하는 물질을 제거하기 위해 관류되어진다. 또한, 물질들의 파편들이 태반으로부터 제거되어질 수 있다. 관류는 적어도 2시간 많게는 24시간 이상 동안 적절하게 관류가 지속되어지는 것이 일반적이다. 일부 추가적인 실시예에서, 태반은 적어도 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22시간 동안 관류되어졌다. 부연하면, 본 발명에서는 적어도 충분한 시간 동안 사혈과 관류가 진행됨으로써 활성화될 수 있는 산후 태반의 세포를 발견이 기초하고 있다는 것이다. 따라서, 태반은 배아 유사 줄기세포의 풍족하고 충분한 소스로서 쉽게 사용될 수 있으며, 이러한 세포는 연구를 위해, 의약 발견을 위해, 질병에 대한 치료와 예방을 위해, 특히 외과 이식 또는 요법 및 확정된 세포, 조직 및 기관의 생성을 위해 이용될 수 있다. 2002년 9월 5일 "태반줄기세포 모으는 방법"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2002/0123141 및 2003년 2월 13일 "산후 포유동물 태반, 그 사용과 이로부터 얻어지는 태반 줄기 세포"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2003/0032179에 개시된 방법을 참조하며, 이들 양자 모두 전체로서 참조되어 본원 명세서에 융합되어진다.
배아 유사 줄기 세포는 배꼽동백과 배꼽정맥 중 둘 중의 하나를 이용하는 관류 기술에 의해 배출된 태반으로부터 추출되어진다. 바람직하게 태반은 사혈과 잔류 혈액(예를 들어, 잔여 탯줄 혈액)의 수집에 의해 배출되어진다. 이후, 배출된 태반은 실질기관 및 혈관외 공간 내에 보충되는 배아 유사 줄기 세포가 탑재된 자연적인 바이오반응기 환경으로서 생체외에서 취급하기 위한 방법으로 확정되어진다. 배아 유사 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따라 배출되고 비어있는 미세순환속으로 이동하며, 이들이 수집되며, 관류에 의해 수집 용기 내로 워싱을 해주면 바람직하다.
5.4 줄기 세포 배양 방법
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 배아 줄기 세포, 배아 유사 줄기 세포, 전구 세포, 다능성(pluripotent) 세포, 전능세포, 다능성(multipatent) 세포, 산후 관류 태반에 내재적(endogenous)인 세포, 탯줄 혈액 세포, 말초혈액 또는 성인 혈액으로부터 유래한 줄기 또는 전구 세포, 또는 골수 세포를 포함하되, 이에 한정되지 않는 줄기 또는 전구 세포들이 본 발명에 따른 생체내(in vitro) 스크리닝 분석에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 줄기 또는 전구 세포는 산후 관류 태반으로부터 유래되지 않는 대신에, 탯줄 혈액, 골수, 말초혈액 또는 성인 혈액과 갖는 다른 소스로부터 분리되며, 본 발명의 화합물에 노출되어지며, 혈관형성을 위해 분석된다.
다른 실시예에 따르면, 배양된 줄기 세포, 예컨대 줄기세포는 인비트로 또는산후 관류 태반 내에서 배양되며, 배양을 증식시키기 위해 예를들어 적혈구생성인자, 시토카인, 림포킨, 인터페론, 집락자극인자(CSF's), 인터페론, 케모킨, 인터루킨, 리간드를 포함하는 재조합된 인간 조혈형성인자, 줄기 세포 인자, 트롬보포이틴(Tpo), 인터루킨 및 과립구집락자극인자(G-CSF) 또는 다른 성장 인자에 의해 자극되어질 수 있다.
5.4.1 생체내(In Vitro)에서의 줄기 세포 배양
생체 내에서의 줄기 또는 전구 세포를 배양하는 방법은 종래에 잘 알려져 있다. 참고문헌으로는 톰슨 등, 1998, 사이언스(Science) 282:1145-47(배아 줄기 세포); 히라시마 등, 1999, 블러드(Blood) 93(4):1253-63, 및 하초폴로스(Hatzopoulos) 등(1998) 디벨롭프먼트(Development) 125：1457-1468(혈관내 가죽 세포 원종); 슬래거(Slager) 등, 1993, Dev. Genet. 14 (3):212-24(뉴런 또는 줄기 원종); 젠바흐체프(Genbachev) 등, 1995, 리프로드 톡시콜(Reprod. Toxicol.) 9 (3): 245-55(세포 영양아층, 즉 태반의 표피 세포 원종); 나드카르니(Nardni) 등 1984(투루모리 Tumori 70)：503-505, 멜크너(Melchner) 등, 1985, Blood 66(6)：1469-1472, PCT 국제공개번호 WO 00/27999(2000. 5. 18), Himori 등, 1984, Intl. J. 셀 클로닝 2: 254-262 및 도우아이(Douay) 등(1995), 골수이식(Bone Marrow Transplantation) 15 : 769-775(조혈성 시원 세포); Shamblott 등, 1998, Acad. Sci. USA 95：13726-31(원시 생식 세포); 얀(Yan) 등,2001, Devel. Biol. 235: 422-432(영양아층간세포)을 들 수 있다.
5.4.2 산후 관류된 태반 내에서의 줄기 세포의 배양
본 발명에 따른 방법은 태반으로부터 유도된 다능한 줄기 세포를 사용하는 것을 포함하고 있다. 이러한 세포를 획득하고 배양하는 방법은, 하기에 기술한 바와 같이, 2002년 9월 5일 "태반줄기세포 모으는 방법"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2002/0123141 및 2003년 2월 13일 "산후 포유동물 태반, 그 사용과 이로부터 얻어지는 태반 줄기 세포"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2003/0032179에 상세하게 설명되어 있으며, 이들 양자 모두 전체로서 참조되어 본원 명세서에 융합되어진다.
5.4.2.1 태반의 전처리
본 발명의 방법에 따르면, 인간 태반은 출산후 자체적인 압박 방출 후 짧은 시간 내에 회수가 이루어지며, 어떤 실시예에서는 태반 내의 탯줄 혈액도 회수되고 있다. 어떤 실시예에서는 태반은 상습적으로 탯줄 혈액을 회수하는 과정에 의존하기도 한다. 중력에 의해서 태반으로부터 탯줄혈액을 배출(즉, 사혈)시키기 위해 통상 바늘이나 캐뉼라가 사용되고 있다(보이즈 등, 미국특허 No. 5,192,553, 1999. 3. 9일 특허허여; 보이즈 등, 미국특허 No. 5,004,681, 1991.4.2일 특허허여; 앤더슨, 미국특허 No. 5372,581, 1994.12,13일 특허허여; 헤셀 등, 미국특허 No. 5,415,665, 탯줄 클램핑, 컷팅 및 혈액수집 도구 및 방법, 1995. 5. 16일 특허허여). 이러한 탯줄 혈액의 회수는, 예를 들어 라이프뱅크 USA(켄다 크놀, NJ) 비아코드(보스턴·매사추세츠주), 코드 블러드 레지스트리(산브루노, 캘리포니아주) 및크라이오셀(클리어워터, 플로리다주) 등의 상업적 방법에 의해 이루어질 수 있다. 탯줄 혈액은 캐반의 압박 방출 후에 순간적으로 배출될 수 있다.
산후 태반은 탯줄 혈액이 배출되어진다. 태반은 상온하에서나 온도 5 내지 25℃(섭씨)의 무균 용기 내에서 보관되어진다. 태반은 48시간 이상의 기간 동안 보관될 수 있으며, 태반 관류하기에 앞서 존재할 수 있는 잔류 탯줄 혈액을 제거하기 위하여 4 내지 24시간 동안은 보관되어야 바람직하다.
태반은 무균 상태하에서 압박 방출 후에 회수되고, 5 내지 25℃(섭씨)의 항응고성용액 내에서 보관하는 것이 바람직하다. 적합한 항응고성 용액은 종래에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 헤파린 또는 와파린 소디움 용액, 예컨대 헤파린 용액(1% w/w in 1:1000 용액)이 사용될 수 있다. 배출된 태반은 배아 유사 줄기 세포가 수집되기 전 36시간 정도 보관하는 것이 바람직하다. 잔여 세포를 제거하기 위하여 태반을 관류시키기 위해 사용되는 용액은 줄기 세포의 회수를 위해 태반을 관류하고 배양하기 위해 사용하는 용액과 같을 수 있다. 임의의 관류액은 배아 유사 줄기 세포의 소스로서 사용되고 수집되어질 수 있다.
또한 태반은 승낙, 임신전, 도중 및 임신 후에 관한 환자의 완전한 의료적 기록 및 태반의 취급에 관련한 모든 내용을 확인함으로써 환자로부터도 회수될 수도 있다. 이러한 의료적 기록은 그 후에 태반의 이용이나 이들로부터 수득된 줄기 세포의 이용을 조화시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간 태반 줄기 세포는 문제의 소아, 부모, 형제 또는 다른 친척들을 위한 직접적이고 개별적인 의약을 쉽게 찾는 것에 손쉽게 이용될 수 있다. 실제로, 인간 태반 줄기 세포는 탯줄혈액보다도 더 다용하다. 그러나, 인간 태반 줄기 세포에 부가하여 사혈시킴에 의해, 관류 및/또는 배양된 태반, 탯줄 혈액, 같거나 다른 태반과 탯줄로부터 사혈시킴에 의해 생성된 인간 태반 줄기 세포의 부가적인 것들은 모두 본 발명에 포함된다. 그 결과로서, 탯줄 혈액에 대한 관심과 모집단의 증가를 가져올 것이며, 인간 줄기 세포와 및 이들로부터 이식, 예컨대 골수 이식술을 위해 더욱 유용하다.
5.4.2.2 태반의 사혈과 잔여 세포의 제거
본 발명에 관한 어떤 실시예를 따르면, 줄기 또는 전구 세포는 사혈되어지는, 즉 출산후 남아있는 탯줄 혈액을 완전하게 배출시킴으로써 회수될 수 있는 배아 유사 줄기 세포 및/또는 정형화된 탯줄 혁액의 회수 순서에도 한정되지 아니한다.
5.4.2.3 태반의 배양과 그 내부의 줄기 세포
사혈이 있고, 태반의 관류를 위한 충분한 시간이 경과하면; 상기 배아 유사 줄기 세포는 태반으로부터 사혈되고 관류된 미세순환내로 이동하는 것이 관찰되며, 이때 본 발명의 방법에 따라 이들을 수집하고, 관류에 의해 수집 용기 내로 워싱을 해주는 것이 바람직하다. 관류는 분리된 태반을 잔여 탯줄 혈액을 제거할뿐만 아니라 태반 내로 산소를 포함한 적절한 영양소를 공급시킨다. 태반은 잔여 탯줄 혈액 세포를 제거하기 위해 사용된 용액과 유사한 용액으로 배양되고 관류될 수 있으며, 항응고제가 첨가되지 않은 용액을 사용하면 바람직하다.
본 발명에 따른 실시예에서, 배출되고 사혈된 태반은 바이오리액터, 즉 전파 세포 또는 생물학적 물질의 생성을 위한 생체외 시스템에서 배양되었다. 주기적으로 균일하게 성장하거나 배양 배지의 일부분을 지속적으로 제거하거나 관류체가 태반 바이오리액터 내로 주입되도록 하여 태반 바이오리액터 내에서 전파된 세포의 수 또는 생성된 생물학적 물질의 정도를 정상상태가 유지되도록 하였으며, 상기 전파된 세포나 생성된 생물학적 물질이 회수되었다. 신선한 배지 또는 관류체는 같은 비율 또는 같은 양으로 주입시켰다.
전파된 셀의 수와 유형은, 모폴로지 내의 변화와 흐름세포측정, 셀소팅, 면역세포화학(예컨대, 조직 특이성 또는 세포 마커 특이성을 갖는 항체로 염색), 형광표지세포분리기(FACS), 자기표지세포분리(MACS), 광학 또는 동일초점현미경을 이용한 세포의 모폴로지를 시험하는 방법, 또는 종래에 잘 알려져 있는 PCR 및 유전자 발현 프로파일링과 같은 기술을 이용하여 유전자 발현의 변화를 측정하는 등의 표준화된 세포 검출 기술을 이용하여, 모폴로지의 변화와 세포 표면 마커를 측정함으로써 쉽게 모니터될 수 있다.
관류 용액 내로 투입된 성장 요인은 미분화된 배아 유사 줄기 세포, 확정된 전구 세포 또는 분화된 세포(예컨대, 분화된 조혈세포)의 전파를 자극시킬 수 있다. 생장 요인들은, 이뮤노글로블린, 호르몬, 효소 또는 앞서 언급하였던 각종 성장 요소에 한정되는 것이 생활성분자들과 생물학적 물질의 생성을 자극시킬 수 있다. 배양된 태반은 소비된 배지를 주기적으로 제거하고 신선한 배지를 추가하여 증식억제를 해제된 세포로서 "비육(fed)"되어진다. 배양된 태반은 무균 조건하에서 저장되어 가능한 한 오염을 최소화하며, 태반의 세포에 영양소를 충분하게 공급하고 유지시키기 위한 조건을 만들기 위하여 간헐적이고 주기적인 기압증대법이 유지되도록 하였다. 태반의 관류와 배양은 양자 모두 자동화될 수 있으며, 효율과 성능을 개선을 위해 컴퓨터화될 수 있다.
다른 실시예에서, 태반은 모든 내인성 증식세포, 예컨대 배아 유사 줄기 세포를 제거하기 위해 진행되며, 외래(즉, 외인성) 세포는 관류된 태반의 환경 내로 도입시키고 전파시켰다. 본 발명은 자신의 태반 바이오리액터 내에서 배양될 수 있는, 배아 유사 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 간질세포, 내피세포, 간세포, 각질 합성 세포 및 특정형의 줄기 또는 전구 세포, 조직 또는 기관, 조직 또는 뉴런, 미에린, 근육, 혈액, 골수, 표피, 심장, 결합 조직, 폐장, 신장, 간장 및 이자(예컨대, 이자섬 세포)을 포함하지만 이것에 한정하지 않는, 조직 또는 기관을 위한 줄기 또는 원구 세포를 포함하지만 이에 한정하지 않는 매우 다양한 줄기 또는 전구 세포를 고려할 수 있다.
5.5 분석-식별된 화합물을 이용한 치료방법
작업 실시예(섹션 6. 아래 참조)에서 알 수 있는 바와 같이, 분석은 항혈관형성 활성을 갖는 화합물을 분류 식별하는 것이다. 이러한 화합물은 섹션 5.2 위에서 서술된 화합물의 분류의 구성을 대표하는 것이다. 특히, 대표적인 화합물이 악티미드TM, 레비미드TM및 탈리도미드들이다. 다른 화합물은 실시예 및 본원 명세서 내에서 설명하고 있는 것과 같은 방법의 분석에 의해 식별될 수 있다. 이러한 화합물들은 혈관형성 또는 바소제네시스(vasogenesis)에 대해 희망하는 조절 효과를 얻기 위한 임의의 화합물일 수 있으며, 단백질, 펩타이드 유사체, 핵산 또는 핵산 유사체, 카르복실레이트, 지질, 방향성 무기 물질 등이 이에 해당할 것이다.
항혈관형성성을 갖는 것으로 식별된 화합물은 혈관형성 인자를 갖는 임의의 질병이나 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 예컨대 유방암과 같이 암에 대한 공격성을 갖는 하나의 표지는 혈관형성제로서 작용하여 암종양이 증대되는 것이며, 종양의 내부와 주변에서 혈관신생을 증대시키며 종양의 성장과 전이를 위한 변화의 증가를 유도한다. 이러한 혈관형성력의 억제는 종양의 성장과 전이를 억제하는 데에 도움이 도리 것이다. 이와 같이, 본 발명에 따른 항혈관형성 화합물은 암전이를 포함한 암치료에 사용될 수 있다. 이러한 치료는 다른 암치료요법과 병행되면 바람직하다. 본 발명의 스크리닝법에 따라 식별되는 화합물로서 염증, 자궁 내막증, 관절염, 죽상경화판, 당뇨병 환자 망막증, 신생혈관녹내장, 트라코마(trachoma), 각막이식편 혈관신행, 마른 버짐, 강피증, 혈관종 및 비대성 흉터형성, 혈관협착 및 혈관 섬유종 등의 다른 질병들이 치료될 수 있다.
일 실시예에서와 같이, 본 발명은 개인을 치료하는 방법을 제공하고 있으며, 상기 개인은 혈관형성 또는 바소제네시스(vasogenesis)와 관련성 있는 상태 또는 질병을 갖는 개인을 의미하며, 상기 혈관형성 또는 바소제네시스를 유효하게 감소시킬 수 있을 정도의 충분한 약제의 양을 상기 개인에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 약제는 항혈관형성 또는 항바소제네시스 활성도를 가지면서 본원 명세서에서 기술하고 있는 분석법에 의해 식별되는 것이다. 특별한 실시예에 따르면, 상기 약제는 TNF-α의 활성도를 억제하는 화합물이다. 다른 특별한 실시예에 따르면, 상기약제는 탈리도마이드, 악티미드TM또는 레비미드TM으로 이루어진 군으로부터 선택되어진다. 다른 실시례에서 본 발명은 개인을 치료하는 방법을 제공하고 있으며, 상기 개인은 혈관형성 또는 바소제네시스와 관련성 있는 조건 또는 질병을 갖는 개인을 의미하며, 상기 약제는 TNF-α의 활성도를 억제할 수 있는 충분한 양의 화합물을 상기 개인에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 화합물의 양은 상기 항혈관형성 또는 항바소제네시스를 유효하게 감소시킬 수 있는 정도이다. 다른 특별한 실시예에 따르면, 상기 화합물은 탈리도마이드, 악티미드TM또는 레비미드TM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물이다.
상기와 동일한 식별방법은 바소제네시스 또는 혈관형성을 증가시키는 화합물을 식별하기 위하여 이용될 수 있다. 이러한 화합물은, 예컨대 , 혈관형성성 화합물, 이러한 약제는 혈관신생 부족 또는 혈관의 손상과 관련한 질병이나 상태를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 화합물은 외과수술, 특히 혈관 또는 심장 외과수술 치료를 받게되는 개인에게 또는 혈관 복원율을 높이기 위하여 투여될 수 있다. 두번째의 예에서, 이러한 화합물들은 불충분한 말초혈류를 가진 개인의 치료를 위해 이용될 수 있으며, 악성육아종 상처나 레이노드 질병을 가진 개인의 치료를 위해 이용될 수 있다. 다른 실시예에서와 같이, 본 발명은 개인을 치료하기 위한 방법으로 제공되며, 상기 개인은 불충분한 혈관형성 또는 바소제네시스와 관련이 있는 질병 또는 상태를 갖고 있으며, 혈관형성 또는 바소제네시스를 유효할 정도로 증가시킬 수 있는 약제의 양을 상기 개인에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 약제는 혈관형성 또는 바소제네시스를 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.
혈관형성 및/또는 바소제네시스의 조절은 하기 섹션 5.6 내에 개시된 방법에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(II)를 갖는다.
상기 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R1및 R2는 C1-C4의 알킬 또는 C3-C10의 사이클로알킬을 나타내며;
상기 R3및 R4는 독립적으로 C1-4알킬, 사이클로알킬, 하나의 이중결합을 포함하는 C2-C4알킬렌, 하나의 삼중결합을 포함하는 C2-C4알킬린, (CH2)nCO(CH2)mCH3, (CH2)pCN, (CH2)pCO2Me 또는 이들이 질소 원자에 함께 부착됨으로 인해 3-10 개의 인자로 구성된 고리 구조를 나타내며;
상기 n과 m은 0 내지 3을 나타내고;
상기 p는 1 내지 3을 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 제6,162, 830에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(III)를 갖는다.
상기 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R1은 수소, 할로겐, 저급 알콕시, 하이드록시, 저급 알킬, 저급 알킬 머캅도, 저급 알킬술포닐, 저급 알킬아미노, 디-저급 알킬 아미노, 아미노, 니트로, 니트릴, 저급 알킬 카복실레이트, -CO2H 및 술폰아미도로 구성된 그룹으로부터 각각 경우에 독립적으로 선택되어지며;
상기 R2는 수소 및 저급 알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되어지고;
상기 R3는 수소, 저급 알킬, 하이드록시 및 아미노로 구성되는 그룹으로부터 선택되어지며;
상기 R4는 -COM 및 CH2OH로 구성되는 그룹으로부터 선택되어진다. 이때, 상기 M은 하이드록시, 치환된 저급 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디아칼아미노, N-모폴리노, 하이드록시알킬아미노, 폴리하이드록시아미노, 디알킬아미노알킬아미노, 아미노알킬아미노 및 OMe 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 이때, Me는 양이온을 나타내며;
상기 R5는 알킬술포닐을 나타내고;
상기 n은 0 부터 4까지의 정수를 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,177, 471에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(IV)를 갖는다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 R0는 수소, 할로겐 또는 C1-6알킬을 나타내며;
상기 R1은 수소; 피리딜, 모폴리닐, 피페라지닐, 피롤리디닐 및 피페리디닐로 구성된 그룹으로부터 선택되어지는 5 또는 6개의 인자로 구성된 헤테로사이클릭링, 페닐, C3-6-사이클로알킬, -NRaRb, -CO2Ra, 할로겐 및 페닐로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 C1-6알킬로 구성된 그룹으로부터 선택되어지며, 하나 또는 둘 이상의 C1-6알킬에 의해 선택적으로 치환되며, C1-6알킬을 경유하여 R1에 부착되어진 질소 원자에 선택적으로 연결되어 있고;
상기 R2는 -ORa, -NR2, Rb, 할로겐, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노 및 니트로로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되는 페닐로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
상기 Ra및 Rb는 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 C1-6알킬 또는 수소를 독립적으로 나타낸다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,218,400에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(V)를 갖는다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
상기 X는 S 또는 O이고;
상기 Ar1은 -OH, -CO2H, CO2C1-3알킬 또는 CN으로서 선택적으로 치환된 C1-6알킬; C1-6알콕시; -OH로서 선택적으로 치환된 C1-3알킬티오, C1-3알킬술포닐, C1-3플루오로알킬; 할로(halo), -OH, -CO2H 또는 -CO2C1-3알킬;로 이루어진 각 치환기가 독립적이면서 두 개의 치환기까지 선택적으로 치환된 페닐, 피리디닐 또는 퓨릴로부터 선택된 방향족 고리 화합물이며;
상기 R2는 수소 또는 C1-3알킬이고;
상기 R3는 C1-3알킬, C1-3알플루오로알킬, C1-6알콕시, C1-3플루오로알콕시, C1-3알킬티오, 할로(halo) 또는 -OH로 이루어진 각 치환기는 서로 독립적이면서 두 개의 치환기까지 선택적으로 치환된 페닐, 피리디닐, 퀴놀리닐 또는 퓨릴이다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 6,034, 089 및 미국 특허 No. 6,020,339에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 구조(VI)를 가진다.
상기 화합물은, 이들 화합물의 이성질체, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물 및 포접화합물을 포함한다.
이때, 상기 Y는 할로겐 또는 알킬 또는 -XR2그룹이며;
상기 Z는 -O-, S(O)p- 또는 -N(Rb)-이고, 여기에서 p는 0 또는 정수 1 또는 2이며;
상기 L은 -XR, -C(R11)C(R1)(R2) 또는 -(CHR11)nCH(R1)(R2)이고, 여기서 n은 0 또는 정수 1이고;
상기 Ra및 Rb각각은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 그룹이며;
상기 R은 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 시클로알킬 또는 시클로알케닐 그룹이며;
상기 R1및 R2각각은 수소, 플루오린, -CN, -NO2또는 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알킬닐, 알콕시, 알킬티오, -CO2R8, -CONR9R10또는 -CSNR9R10그룹으로서 서로 같을 수도 있고 다를 수도 있거나, R1및 R2서로가 탄소 원자에 의해 부착되며, 선택적으로 치환된 시클로알킬 또는 시클로알케닐 그룹을 형성하기 위해 연결되어지며;
상기 R3는 수소, 플루오린, 하이드록시 또는 선택적으로 치환된 직선형 또는 가지형의 알킬그룹이며,
상기 R4는 수소, -(CH2)tAr 또는 -(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar1, 여기서 t는 0 또는 정수인 1, 2 또는 3이며;
상기 R5는 -(CH2)tAr 또는 -(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar'이며;
상기 R6는 수소, 플루오린 또는 선택적으로 치환된 알킬그룹이며;
상기 R7는 수소, 플루오린, 선택적으로 치환된 직선형 또는 가지형의 알킬그룹, Rc는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 알케닐 그룹인 -ORc또는 포밀, 알콕시알킬, 알카노일, 카복스아미도 또는 티오카복스아미도 그룹이며;
상기 R8, R9및 R10각각은 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 아랄킬(aralkyl) 또는 아릴 그룹이며;
상기 R11은 수소, 플루오린 또는 메틸 그룹이다.
상기 실시예는 본원 명세서에서 전체로서 인용되는 미국 특허 No. 5,798,373에서 개시되고 있는 화합물들을 더 포함할 수 있다.
더 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따르는 화합물은 하기 화학식 구조(VII)를 갖거나 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 수화물, 용매화합물, 포접화합물, 거울상이성질체, 광학이성질체, 라세미체 또는 이들 입체이성질체의 혼합물로 이루어질 수 있다.
더 바람직한 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따르는 하기 화학식 구조(VIII)를 갖는 화합물은 이들 화합물의 이성질체, 염, 포접화합물, 용매화합물, 수화물, 전구약물 및 약학적으로 수용가능한 염을 포함한다.
상기 화합물의 일정 정도는 뉴저지주의 워런시에 소재하는 셀진 아이엔시(Celgene, Inc.) 사로부터 상업적으로 유용할 수 있다. 상기 다른 화합물은 본원 명세서에서 전체로서 인용되고 있는 특허들에서 개시되어 있는 종래에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 유용한 PDE IV 저해제의 추가적인 실시예는 영국특허 2 063 249 A, 유럽특허 0 607 439 A1, 미국특허 No. 6,333, 354, 미국특허 No. 6,300, 335, 미국특허 No. 6,166, 041, 미국특허 No. 6,069, 156, 미국특허 No. 6,011, 060, 미국특허 No. 5,891, 896, 미국특허 No. 5,849, 770, 미국특허 No. 5,710, 170, 미국특허 No. 4,101, 548, 미국특허 No. 4,001, 238, 미국특허 No. 4,001, 237, 미국특허 No. 3,920, 636, 미국특허 No. 4,060, 615, WO 97/03985, 유럽특허 0 607 439 A1, 미국특허 No. 4,101, 548, 미국특허 No. 4,001, 238, 미국특허 No. 4,001, 237, 미국특허 No. 3,920, 636, 미국특허 No. 4,060, 615, WO 97/03985, 유럽특허 0 395 328, 미국특허 No. 4,209, 623, 유럽특허 0 395 328, 미국특허 No. 4,209, 623, 미국특허 No. 5,354, 571, 유럽특허 0 428 268 A2, 미국특허 No. 5,354, 571, 유럽특허 0 428 268 A2,807, 826, 미국특허 No. 3,031, 450, 미국특허 No. 3,322, 755, 미국특허 No. 5,401, 774,807, 826, 미국특허 No. 3,031, 450, 미국특허 No. 3,322, 755, 미국특허 No. 5,401, 774, 미국특허 No. 5,147, 875, PCT WO 93/12095, 미국특허 No 5,147, 875, PCT WO 93/12095, 미국특허 No. 4,885, 301, WO 93/07149, 유럽특허 0 349 239 A2, 유럽특허 0 352 960 A2, 유럽특허 0 526 004 A1, 유럽특허 0 463 756 A1, 미국특허 No. 4,885, 301, WO 93/07149, 유럽특허 0 349 239 A2, 유럽특허 0 352 960 A2, 유럽특허 0 526 004 A1, 유럽특허 0 463 756 A1, 유럽특허 0 607 439 A1, 유럽특허 0 607 439 A1, WO 94/05661, 유럽특허 0 351 058, 미국특허 No. 4,162, 316, 유럽특허 0 347 146, 미국특허 No. 4,047, 404, 미국특허 No. 5,614, 530, 미국특허 No. 5,488, 055, WO 97/03985, WO 97/03675, WO 95/19978, 미국특허 No. 4,880, 810, WO 98/08848, 미국특허 No. 5,439, 895, 미국특허 No. 5,614, 627, PCT US94/01728, WO 98/16521, 유럽특허 0 722 943 A1, 유럽특허 0 722 937 A1, 유럽특허 0 722 944 A1, WO 98/17668, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 97/24334, WO 98/06722, PCT/JP97/03592, WO 98/23597, WO 94/29277, WO 98/14448, WO 97/03070, WO 98/38168, WO 96/32379 및 PCT/GB98/03712에서 개시된 예들을 포함하며, 이들 모두는 본원 명세서에서 인용되어 융합되어진다.
본원 발명으로부터 예상할 수 있는 대부분의 화합물은 종래 기술로서 알려져 있는 표준 분석 또는 비대칭적 합성을 이용함으로서 전술한 특정한 화합물의 광학적 활성을 갖는 거울상이성질체 내에 풍부하게 존재할 수 있다. 참조의 예로서, 실리 등, Chem. Indus. 1030 (1965); 및 카시니 등, 파르마코 ED. Sci. 19: 563 (1964)를 들 수 있다.
또한, 본원 발명은 이들 화합물의 생리학적으로 수용가능한 비독성 산 첨가염에 관련되어 있다. 이러한 염들은 종래에 알려져 있는 유기 및 무기 산 또는 염기로부터 유도되는 것들을 포함한다. 이러한 산의 예로서, 염산, 브롬산(취화수소산), 인산, 황산, 메탄술폰산, 초산, 타르타르산(주석산), 락트산(유산), 숙신산(호박산), 시트릭산(구연산), 말산(사과산), 말레산, 소르빈산, 아코닛트산, 살리실산, 프탈산, 엠볼릭산, 에난트산 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 자연계에서는 산성이며, 다양한 약학적으로 수용가능한 염기와 염을 형성할 수 있다. 본 발명에 따른 산성 화합물에 약학적으로 수용가능한 염기를 준비하기 위해 사용될 수 있는 염은 예를 들어, 이들에 한정하지 않는 약리학적으로 수용가능한 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염, 특히 칼슘, 마그네슘, 나트륨 또는 칼륨 염 등과 같은 비독성 염기 첨가 염을 형성하기 위한 것들이다. 적합한 유기 염기는 N,N-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올라민, 에틸렌디아민, 메글루마인(N-메틸글루카민), 리신 및 프로카인에 한정하지 않는 것들을 포함하고 있다.
본 발명에 따른 화합물은 종래에 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어 미국특허 No. 6,316,472; 미국특허 No. ,204,275; 피더스톤 R.L. 등(2000) "래트 폐장의 체온 하강의 보존을 위해서 사용되는 성 토마스 병원 심장 마비성의 용액에 더해지는 차이가 나는 아이소자임 선택 작용의 포스포디에스테레이즈 저해제의 비교",Am J. Respir crit. Care Med.162：850-6; 및 브래킨 M. F. 등(1995) "cAMP에 특이성을 갖는 포스포디에스터레이즈의 유력한 저해제로서의 4-(3-부톡시-4-메톡시벤질) 이미다졸리딘-2-온(Ro 20-1724)의 구조를 적합하게 하는 아날로그의 설계 및 합성",J. Med. CHEM. 38: 4848-54.를 들 수 있으며, 이들 전부는 본원 명세서 인용되어 융합되어진다.
본 발명에 따른 화합물은 셀진사(뉴저지주의 워런시)로부터 상업적으로 구입할 수 있거나 본원 명세서 내에 개시된 특허들이나 특허공보에 개시된 방법에 따라 준비되어질 수 있다. 광학적으로 더욱 순수한 성분은 비대칭적으로 합성되거나 유기화학기술의 표준합성과 마찬가지로 잘 알려져 있는 분해제 또는 키랄 컬럼을 이용하여 분해되어질 수 있다.
5.3 줄기세포 모집단
본 발명은 인간 혈관형성(Angiogenesis)을 조절할 수 있는 화합물을 규명하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법의 범주에는 탯줄혈액(CB cell)으로부터 분리된 줄기세포, 말초혈액, 성체 혈액, 골수, 태좌, 중간엽줄기세포 및 다른 소스로부터 분리되는 줄기세포를 포함하지만 반드시 이들에 한정되지 않으며, 어떠한 종류의 인간 줄기세포도 사용될 수 있다. 바람직하지 않은 실시예로서의 줄기세포는 태반 이외의 소스로부터 분리된 배아줄기세포이다.
중간엽 줄기세포의 소스는 골수, 태생기 난황낭, 태좌, 탯줄, 태아 및 성년의 가죽 및 혈액을 포함한다. 골수 세포는 장골의 정상, 대퇴골, 경골, 척추, 늑골 또는 다른 연수의 공간으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용되는 줄기세포는 다능성의 세포, 예들 들어 자기갱신 및 조직 내에서 정지하거나 휴지를 유지할 수 있는 완전하게 분화될 수 있는 능력을 갖는 세포이다. 또한, 줄기 세포는 다중능 세포이며, 결정된 원종세포이며, 파이브로블래스토이드(fibroblastoid) 세포이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 만기의 사혈 관류된 태반으로부터 분리된 생존가능하며, 정지한 다능성의 줄기세포를 이용한다.
줄기세포 모집단은, 예컨대 라이프뱅크 USA(켄다 크놀, NJ) 비아코드(보스턴·매사추세츠주), 코드 블러드 레지스트리(산브루노, 캘리포니아주) 및 크라이오셀(클리어워터, 플로리다주) 등의 상업적 서비스를 통하여 확보된 태반 줄기세포로 완성될 수 있다.
줄기세포 모집단은 2002년 9월 5일 "태반 줄기 세포를 모으는 방법"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2002/0123141 및 2003년 2월 13일 "산후 포유동물 태반, 그 사용과 이로부터 얻어지는 태반 줄기 세포"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2003/0032179에 개시된 방법에 따라 모아진 태반 줄기 세포로부터 완성될 수 있으며, 이들 양자 모두 전체로서 참조되어 본원 명세서에 융합되어진다.
본 발명에 따라 사용되는 바람직한 세포는 사혈 관류 태반으로부터 기원하는 배아와 유사한 줄기 세포 또는 배아와 유사한 태반의 줄기 세포에서 유래하는 세포이다. 본 발명에 따른 배아 유사 줄기세포는 모폴로지에서의 변화를 측정함으로서 특성을 나타내며, 세포 표면의 표지는 흐름세포측정 및 면역세포화학과 같은 기술을 사용하며, PCR과 같은 기술을 이용하여 유전 발현의 변화를 측정한다. 본 발명의 일 실시예에서, 배아 유사 줄기 세포는 다음의 세포 표면 표지, CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2, Sh3, SH4, OCT-4 및 ABC-p의 존재로서, 또는 다음의 세포 표면 표지, CD34, CD38, CD45, SSEA3 및 SSEA4의 부존재에 의해서 그 특성을 나타낼 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 배아 유사 줄기 세포는 OCT-4+ 및 APC-p+와 같은 세포 표면 표지의 존재에 의해 특성을 타나낼 수 있다. 세포 표면 표지는 종래에 알려진 기술, 예를 들어 항 세포 표면 표지 항체로서 워싱과 스테이닝을 처리하는 흐름세포측정에 의한 방법에 따라 일상적인 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들면, CD-34 또는 CD-38의 존재를 결정하기 위해서 세포는 PBS 내에서 워싱되어진후, 안티-CD-34 피코에리트와 안티-CD38 플루오레세인 이소티오시안산염으로 두번 염색한다(벡턴 틱킨슨, 마운틴 뷰, CA).
태반으로부터 유래하는 배아 유사 줄기 세포는 배아줄기세포의 특징을 보유하나, 배아로부터 파생하지는 않는다. 다시 말하면, 본 발명은 미분화된 줄기 세포가 산후 관류 태반으로부터 분리되어진 미분화된 줄기 세포에 OCT-4+ 및 ABC-p+ 세포를 사용하는 것을 포함하고 있다. 이러한 세포는 인간 배아 줄기 세포로서 다능(다재능)하다. 상기 언급한 바와 같이, 관류 태반으로부터 분리된 서로 다른 다재능 또는 다중능의 줄기 세포는 서로 다른 시간 위치, 예컨대 CD-34+/CD38+. CD34+, /CD38- 및 CD-34/CD-38 조혈성 세포이다. 본 발명에 따르면, 인간 태반은 분만 후에 사용될 것이며, 배아 유사의 줄기세포의 소스로서 산후에 사용되어진다.
예를 들면, 자궁으로부터의 방출이 있은 후에, 태반은 세포자멸을 방지하거나 최소화하기 위하여 가능한 한 신속하게 사혈된다. 태반의 사혈된 후 가능한 빠르게 혈액, 잔여 세포, 단백질, 요인 및 다른 어떠한 기관 내에 존재하는 물질을 제거하기 위해 관류되어진다. 또한, 물질들의 파편들이 태반으로부터 제거되어질 수 있다. 관류는 적어도 2시간 많게는 24시간 이상 동안 적절하게 관류가 지속되어지는 것이 일반적이다. 일부 추가적인 실시예에서, 태반은 적어도 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22시간 동안 관류되어졌다. 부연하면, 본 발명에서는 적어도 충분한 시간 동안 사혈과 관류가 진행됨으로써 활성화될 수 있는 산후 태반의 세포를 발견이 기초하고 있다는 것이다. 따라서, 태반은 배아 유사 줄기세포의 풍족하고 충분한 소스로서 쉽게 사용될 수 있으며, 이러한 세포는 연구를 위해, 의약발견을 위해, 질병에 대한 치료와 예방을 위해, 특히 외과 이식 또는 요법 및 확정된 세포, 조직 및 기관의 생성을 위해 이용될 수 있다. 2002년 9월 5일 "태반줄기세포 모으는 방법"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2002/0123141 및 2003년 2월 13일 "산후 포유동물 태반, 그 사용과 이로부터 얻어지는 태반 줄기 세포"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2003/0032179에 개시된 방법을 참조하며, 이들 양자 모두 전체로서 참조되어 본원 명세서에 융합되어진다.
배아 유사 줄기 세포는 배꼽동백과 배꼽정맥 중 둘 중의 하나를 이용하는 관류 기술에 의해 배출된 태반으로부터 추출되어진다. 바람직하게 태반은 사혈과 잔류 혈액(예를 들어, 잔여 탯줄 혈액)의 수집에 의해 배출되어진다. 이후, 배출된 태반은 실질기관 및 혈관외 공간 내에 보충되는 배아 유사 줄기 세포가 탑재된 자연적인 바이오반응기 환경으로서 생체외에서 취급하기 위한 방법으로 확정되어진다. 배아 유사 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따라 배출되고 비어있는 미세순환속으로 이동하며, 이들이 수집되며, 관류에 의해 수집 용기 내로 워싱을 해주면 바람직하다.
5.4 줄기 세포 배양 방법
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 배아 줄기 세포, 배아 유사 줄기 세포, 전구 세포, 다능성(pluripotent) 세포, 전능세포, 다능성(multipatent) 세포, 산후 관류 태반에 내재적(endogenous)인 세포, 탯줄 혈액 세포, 말초혈액 또는 성인 혈액으로부터 유래한 줄기 또는 전구 세포, 또는 골수 세포를 포함하되, 이에 한정되지 않는 줄기 또는 전구 세포들이 본 발명에 따른 생체내(in vitro) 스크리닝 분석에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 줄기 또는 전구 세포는 산후 관류 태반으로부터 유래되지 않는 대신에, 탯줄 혈액, 골수, 말초혈액 또는 성인 혈액과 갖는 다른 소스로부터 분리되며, 본 발명의 화합물에 노출되어지며, 혈관형성을 위해 분석된다.
다른 실시예에 따르면, 배양된 줄기 세포, 예컨대 줄기세포는 인비트로 또는산후 관류 태반 내에서 배양되며, 배양을 증식시키기 위해 예를들어 적혈구생성인자, 시토카인, 림포킨, 인터페론, 집락자극인자(CSF's), 인터페론, 케모킨, 인터루킨, 리간드를 포함하는 재조합된 인간 조혈형성인자, 줄기 세포 인자, 트롬보포이틴(Tpo), 인터루킨 및 과립구집락자극인자(G-CSF) 또는 다른 성장 인자에 의해 자극되어질 수 있다.
5.4.1 생체내(In Vitro)에서의 줄기 세포 배양
생체 내에서의 줄기 또는 전구 세포를 배양하는 방법은 종래에 잘 알려져 있다. 참고문헌으로는 톰슨 등, 1998, 사이언스(Science) 282:1145-47(배아 줄기 세포); 히라시마 등, 1999, 블러드(Blood) 93(4):1253-63, 및 하초폴로스(Hatzopoulos) 등(1998) 디벨롭프먼트(Development) 125：1457-1468(혈관내 가죽 세포 원종); 슬래거(Slager) 등, 1993, Dev. Genet. 14 (3):212-24(뉴런 또는 줄기 원종); 젠바흐체프(Genbachev) 등, 1995, 리프로드 톡시콜(Reprod. Toxicol.) 9 (3): 245-55(세포 영양아층, 즉 태반의 표피 세포 원종); 나드카르니(Nardni) 등 1984(투루모리 Tumori 70)：503-505, 멜크너(Melchner) 등,1985, Blood 66(6)：1469-1472, PCT 국제공개번호 WO 00/27999(2000. 5. 18), Himori 등, 1984, Intl. J. 셀 클로닝 2: 254-262 및 도우아이(Douay) 등(1995), 골수이식(Bone Marrow Transplantation) 15 : 769-775(조혈성 시원 세포); Shamblott 등, 1998, Acad. Sci. USA 95：13726-31(원시 생식 세포); 얀(Yan) 등, 2001, Devel. Biol. 235: 422-432(영양아층간세포)을 들 수 있다.
5.4.2 산후 관류된 태반 내에서의 줄기 세포의 배양
본 발명에 따른 방법은 태반으로부터 유도된 다능한 줄기 세포를 사용하는 것을 포함하고 있다. 이러한 세포를 획득하고 배양하는 방법은, 하기에 기술한 바와 같이, 2002년 9월 5일 "태반줄기세포 모으는 방법"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2002/0123141 및 2003년 2월 13일 "산후 포유동물 태반, 그 사용과 이로부터 얻어지는 태반 줄기 세포"의 제목으로 발표된 미국 특허출원 No. US 2003/0032179에 상세하게 설명되어 있으며, 이들 양자 모두 전체로서 참조되어 본원 명세서에 융합되어진다.
5.4.2.1 태반의 전처리
본 발명의 방법에 따르면, 인간 태반은 출산후 자체적인 압박 방출 후 짧은 시간 내에 회수가 이루어지며, 어떤 실시예에서는 태반 내의 탯줄 혈액도 회수되고 있다. 어떤 실시예에서는 태반은 상습적으로 탯줄 혈액을 회수하는 과정에 의존하기도 한다. 중력에 의해서 태반으로부터 탯줄혈액을 배출(즉, 사혈)시키기 위해 통상 바늘이나 캐뉼라가 사용되고 있다(보이즈 등, 미국특허 No. 5,192,553, 1999. 3. 9일 특허허여; 보이즈 등, 미국특허 No. 5,004,681, 1991.4.2일 특허허여; 앤더슨, 미국특허 No. 5372,581, 1994.12,13일 특허허여; 헤셀 등, 미국특허 No. 5,415,665, 탯줄 클램핑, 컷팅 및 혈액수집 도구 및 방법, 1995. 5. 16일 특허허여). 이러한 탯줄 혈액의 회수는, 예를 들어 라이프뱅크 USA(켄다 크놀, NJ) 비아코드(보스턴·매사추세츠주), 코드 블러드 레지스트리(산브루노, 캘리포니아주) 및 크라이오셀(클리어워터, 플로리다주) 등의 상업적 방법에 의해 이루어질 수 있다. 탯줄 혈액은 캐반의 압박 방출 후에 순간적으로 배출될 수 있다.
산후 태반은 탯줄 혈액이 배출되어진다. 태반은 상온하에서나 온도 5 내지 25℃(섭씨)의 무균 용기 내에서 보관되어진다. 태반은 48시간 이상의 기간 동안 보관될 수 있으며, 태반 관류하기에 앞서 존재할 수 있는 잔류 탯줄 혈액을 제거하기 위하여 4 내지 24시간 동안은 보관되어야 바람직하다.
태반은 무균 상태하에서 압박 방출 후에 회수되고, 5 내지 25℃(섭씨)의 항응고성용액 내에서 보관하는 것이 바람직하다. 적합한 항응고성 용액은 종래에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 헤파린 또는 와파린 소디움 용액, 예컨대 헤파린 용액(1% w/w in 1:1000 용액)이 사용될 수 있다. 배출된 태반은 배아 유사 줄기 세포가 수집되기 전 36시간 정도 보관하는 것이 바람직하다. 잔여 세포를 제거하기 위하여 태반을 관류시키기 위해 사용되는 용액은 줄기 세포의 회수를 위해 태반을 관류하고 배양하기 위해 사용하는 용액과 같을 수 있다. 임의의 관류액은 배아 유사 줄기 세포의 소스로서 사용되고 수집되어질 수 있다.
또한 태반은 승낙, 임신전, 도중 및 임신 후에 관한 환자의 완전한 의료적 기록 및 태반의 취급에 관련한 모든 내용을 확인함으로써 환자로부터도 회수될 수도 있다. 이러한 의료적 기록은 그 후에 태반의 이용이나 이들로부터 수득된 줄기 세포의 이용을 조화시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간 태반 줄기 세포는 문제의 소아, 부모, 형제 또는 다른 친척들을 위한 직접적이고 개별적인 의약을 쉽게 찾는 것에 손쉽게 이용될 수 있다. 실제로, 인간 태반 줄기 세포는 탯줄 혈액보다도 더 다용하다. 그러나, 인간 태반 줄기 세포에 부가하여 사혈시킴에 의해, 관류 및/또는 배양된 태반, 탯줄 혈액, 같거나 다른 태반과 탯줄로부터 사혈시킴에 의해 생성된 인간 태반 줄기 세포의 부가적인 것들은 모두 본 발명에 포함된다. 그 결과로서, 탯줄 혈액에 대한 관심과 모집단의 증가를 가져올 것이며, 인간 줄기 세포와 및 이들로부터 이식, 예컨대 골수 이식술을 위해 더욱 유용하다.
5.4.2.2 태반의 사혈과 잔여 세포의 제거
본 발명에 관한 어떤 실시예를 따르면, 줄기 또는 전구 세포는 사혈되어지는, 즉 출산후 남아있는 탯줄 혈액을 완전하게 배출시킴으로써 회수될 수 있는 배아 유사 줄기 세포 및/또는 정형화된 탯줄 혁액의 회수 순서에도 한정되지 아니한다.
5.4.2.3 태반의 배양과 그 내부의 줄기 세포
사혈이 있고, 태반의 관류를 위한 충분한 시간이 경과하면; 상기 배아 유사 줄기 세포는 태반으로부터 사혈되고 관류된 미세순환내로 이동하는 것이 관찰되며, 이때 본 발명의 방법에 따라 이들을 수집하고, 관류에 의해 수집 용기 내로 워싱을 해주는 것이 바람직하다. 관류는 분리된 태반을 잔여 탯줄 혈액을 제거할뿐만 아니라 태반 내로 산소를 포함한 적절한 영양소를 공급시킨다. 태반은 잔여 탯줄 혈액세포를 제거하기 위해 사용된 용액과 유사한 용액으로 배양되고 관류될 수 있으며, 항응고제가 첨가되지 않은 용액을 사용하면 바람직하다.
본 발명에 따른 실시예에서, 배출되고 사혈된 태반은 바이오리액터, 즉 전파 세포 또는 생물학적 물질의 생성을 위한 생체외 시스템에서 배양되었다. 주기적으로 균일하게 성장하거나 배양 배지의 일부분을 지속적으로 제거하거나 관류체가 태반 바이오리액터 내로 주입되도록 하여 태반 바이오리액터 내에서 전파된 세포의 수 또는 생성된 생물학적 물질의 정도를 정상상태가 유지되도록 하였으며, 상기 전파된 세포나 생성된 생물학적 물질이 회수되었다. 신선한 배지 또는 관류체는 같은 비율 또는 같은 양으로 주입시켰다.
전파된 셀의 수와 유형은, 모폴로지 내의 변화와 흐름세포측정, 셀소팅, 면역세포화학(예컨대, 조직 특이성 또는 세포 마커 특이성을 갖는 항체로 염색), 형광표지세포분리기(FACS), 자기표지세포분리(MACS), 광학 또는 동일초점현미경을 이용한 세포의 모폴로지를 시험하는 방법, 또는 종래에 잘 알려져 있는 PCR 및 유전자 발현 프로파일링과 같은 기술을 이용하여 유전자 발현의 변화를 측정하는 등의 표준화된 세포 검출 기술을 이용하여, 모폴로지의 변화와 세포 표면 마커를 측정함으로써 쉽게 모니터될 수 있다.
관류 용액 내로 투입된 성장 요인은 미분화된 배아 유사 줄기 세포, 확정된 전구 세포 또는 분화된 세포(예컨대, 분화된 조혈세포)의 전파를 자극시킬 수 있다. 생장 요인들은, 이뮤노글로블린, 호르몬, 효소 또는 앞서 언급하였던 각종 성장 요소에 한정되는 것이 생활성분자들과 생물학적 물질의 생성을 자극시킬 수 있다. 배양된 태반은 소비된 배지를 주기적으로 제거하고 신선한 배지를 추가하여 증식억제를 해제된 세포로서 "비육(fed)"되어진다. 배양된 태반은 무균 조건하에서 저장되어 가능한 한 오염을 최소화하며, 태반의 세포에 영양소를 충분하게 공급하고 유지시키기 위한 조건을 만들기 위하여 간헐적이고 주기적인 기압증대법이 유지되도록 하였다. 태반의 관류와 배양은 양자 모두 자동화될 수 있으며, 효율과 성능을 개선을 위해 컴퓨터화될 수 있다.
다른 실시예에서, 태반은 모든 내인성 증식세포, 예컨대 배아 유사 줄기 세포를 제거하기 위해 진행되며, 외래(즉, 외인성) 세포는 관류된 태반의 환경 내로 도입시키고 전파시켰다. 본 발명은 자신의 태반 바이오리액터 내에서 배양될 수 있는, 배아 유사 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 간질세포, 내피세포, 간세포, 각질 합성 세포 및 특정형의 줄기 또는 전구 세포, 조직 또는 기관, 조직 또는 뉴런, 미에린, 근육, 혈액, 골수, 표피, 심장, 결합 조직, 폐장, 신장, 간장 및 이자(예컨대, 이자섬 세포)을 포함하지만 이것에 한정하지 않는, 조직 또는 기관을 위한 줄기 또는 원구 세포를 포함하지만 이에 한정하지 않는 매우 다양한 줄기 또는 전구 세포를 고려할 수 있다.
5.5 분석-식별된 화합물을 이용한 치료방법
작업 실시예(섹션 6. 아래 참조)에서 알 수 있는 바와 같이, 분석은 항혈관형성 활성을 갖는 화합물을 분류 식별하는 것이다. 이러한 화합물은 섹션 5.2 위에서 서술된 화합물의 분류의 구성을 대표하는 것이다. 특히, 대표적인 화합물이 악티미드(상표품), 레비미드(상표품) 및 탈리도미드들이다. 다른 화합물은 실시예 및본원 명세서 내에서 설명하고 있는 것과 같은 방법의 분석에 의해 식별될 수 있다. 이러한 화합물들은 혈관형성 또는 바소제네시스(vasogenesis)에 대해 희망하는 조절 효과를 얻기 위한 임의의 화합물일 수 있으며, 단백질, 펩타이드 유사체, 핵산 또는 핵산 유사체, 카르복실레이트, 지질, 방향성 무기 물질 등이 이에 해당할 것이다.
항혈관형성성을 갖는 것으로 식별된 화합물은 혈관형성 인자를 갖는 임의의 질병이나 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 예컨대 유방암과 같이 암에 대한 공격성을 갖는 하나의 표지는 혈관형성제로서 작용하여 암종양이 증대되는 것이며, 종양의 내부와 주변에서 혈관신생을 증대시키며 종양의 성장과 전이를 위한 변화의 증가를 유도한다. 이러한 혈관형성력의 억제는 종양의 성장과 전이를 억제하는 데에 도움이 도리 것이다. 이와 같이, 본 발명에 따른 항혈관형성 화합물은 암전이를 포함한 암치료에 사용될 수 있다. 이러한 치료는 다른 암치료요법과 병행되면 바람직하다. 본 발명의 스크리닝법에 따라 식별되는 화합물로서 염증, 자궁 내막증, 관절염, 죽상경화판, 당뇨병 환자 망막증, 신생혈관녹내장, 트라코마(trachoma), 각막이식편 혈관신행, 마른 버짐, 강피증, 혈관종 및 비대성 흉터형성, 혈관협착 및 혈관 섬유종 등의 다른 질병들이 치료될 수 있다.
일 실시예에서와 같이, 본 발명은 개인을 치료하는 방법을 제공하고 있으며, 상기 개인은 혈관형성 또는 바소제네시스(vasogenesis)와 관련성 있는 상태 또는 질병을 갖는 개인을 의미하며, 상기 혈관형성 또는 바소제네시스를 유효하게 감소시킬 수 있을 정도의 충분한 약제의 양을 상기 개인에게 투여하는 것을 포함하며,상기 약제는 항혈관형성 또는 항바소제네시스 활성도를 가지면서 본원 명세서에서 기술하고 있는 분석법에 의해 식별되는 것이다. 특별한 실시예에 따르면, 상기 약제는 TNF-α의 활성도를 억제하는 화합물이다. 다른 특별한 실시예에 따르면, 상기 약제는 탈리도마이드, 악티미드(상표품) 또는 레비미드(상표품)으로 이루어진 군으로부터 선택되어진다. 다른 실시례에서 본 발명은 개인을 치료하는 방법을 제공하고 있으며, 상기 개인은 혈관형성 또는 바소제네시스와 관련성 있는 조건 또는 질병을 갖는 개인을 의미하며, 상기 약제는 TNF-α의 활성도를 억제할 수 있는 충분한 양의 화합물을 상기 개인에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 화합물의 양은 상기 항혈관형성 또는 항바소제네시스를 유효하게 감소시킬 수 있는 정도이다. 다른 특별한 실시예에 따르면, 상기 화합물은 탈리도마이드, 악티미드(상표품) 또는 레비미드(상표품)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물이다.
상기와 동일한 식별방법은 바소제네시스 또는 혈관형성을 증가시키는 화합물을 식별하기 위하여 이용될 수 있다. 이러한 화합물은, 예컨대 , 혈관형성성 화합물, 이러한 약제는 혈관신생 부족 또는 혈관의 손상과 관련한 질병이나 상태를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 화합물은 외과수술, 특히 혈관 또는 심장 외과수술 치료를 받게되는 개인에게 또는 혈관 복원율을 높이기 위하여 투여될 수 있다. 두번째의 예에서, 이러한 화합물들은 불충분한 말초혈류를 가진 개인의 치료를 위해 이용될 수 있으며, 악성육아종 상처나 레이노드 질병을 가진 개인의 치료를 위해 이용될 수 있다. 다른 실시예에서와 같이, 본 발명은 개인을 치료하기 위한 방법으로 제공되며, 상기 개인은 불충분한 혈관형성 또는 바소제네시스와 관련이 있는 질병 또는 상태를 갖고 있으며, 혈관형성 또는 바소제네시스를 유효할 정도로 증가시킬 수 있는 약제의 양을 상기 개인에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 약제는 혈관형성 또는 바소제네시스를 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.
혈관형성 및/또는 바소제네시스의 조절은 하기 섹션 5.6 내에 개시된 방법에 의해 투여될 수 있다.
5.6 약학 조성물
본 발명은 본 발명의 방법에 따른 혈관 생성 조절자로 확인된 성분들을 포함하는 약학 조성물을 포괄한다. 본 발명의 약학 조성물은 혈관 생성을 조절하기 위해 처리될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물들은 전신 또는 일부에 투여될 수 있다. 대부분의 포유류에 대한 투여는 본 발명에 따른 화합물의 전신 방출(예, 혈관 내)이다. 투여 방법은 장(腸) 경로 예컨대, 경구투여, 볼, 혀밑 및 좌약과, 국부 투여 예컨대, 경피 및 진피와, 비경구적 투여를 포함한다. 적합한 비경구적 루트는 피하주사바늘 또는 카테터를 통한 주사 예컨대, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 복막내, 동맥내, 심실내, 경막내, 눈속 및 앞방내 주사 및 비주사 루트 즉 질내 창, 또는 코 투여를 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물들은 경구로 투여된다. 일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 조성물을 치료에 필요한 영역에 국부적으로 투여하는 것도 바람직하다. 이것은 예를 들어 수술중 국소 주입에 의해, 국소 기구 즉, 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터를 이용하여, 좌약을 이용하여, 또는 다공, 비다공이 존재하는 임플란트를 이용하여, 또는 실라스틱 멤브레인과 같은 멤브레인을 포함하는 젤라틴 재료, 또는 섬유들로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 전형적인 것은 물론 예를 들어, 리포솜, 미소입자, 마이크로캡슐 등의 캡슐화와 같은 비표준 전달 시스템을 통해서도 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 상기 화합물 및 조성물들은 소포 내, 특히 리포솜에 전달될 수 있다(see Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et AL., in Liposomes in Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds. ), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); LOPEZ-BERESTEIN, ibid., pp. 317-327; see generally ibid.). 다른 일 례에 있어서, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 컨트롤된 방출 시스템 내로 전달될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 펌프가 사용될 수 있다(see Langer, supra ; Sefton, 1987, CRC Crit. REFBIOMED. ENG. 14: 201; Buchwald et AL., 1980, Surgery 88: 507 Saudek et AL., 1989, N. Engl. JMED. 3: 574). 다른 예에 있어서, 중합 재료가 사용될 수 있다(see Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds. ), CRC Press. , Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds. ), Wiley, New York (1984); Ranger ANDPEPPAS, 1983, J. MACROMOL. Sci. Rev. Macromol. CLAIM. 23: 61 ; see also Levy et AL., 1985, Science 228: 190; During et AL., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et AL., 1989, J. Neurosurg 71: 105). 또 다른 예에 있어서, 컨트롤된 방출 시스템은 예들 들어 전신 투여의 일부에만 필요로 하는 간장(see, e. G., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) ) 등과 같이 치료될 목표 영역 근처에 위치될 수 있다. 또한, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533)에서 언급된 또 다른 컨트롤된 방출 시스템이 사용될 수도 있다. 조성물로서 투여되었을 때, 본 발명에 따른 화합물은 포유류에 적합한 투여 형태로 제공되기 위하여 약학적으로 허용되는 캐리어 또는 운반체의 적정량으로 제재될 것이다. 상기 용어 "약학적으로 허용" 된다는 것은 포유류 특히 인간에게 사용할 수 있는 조제로 일반적으로 인정되거나 또는 U.S 조제서에 리스트되어 있거나 또는 주 정부 또는 연방 정부의 통제센터에 의해 승인된 것을 의미한다. 상기 용어 "운반체"는 희석액, 애주번트, 부형제 또는 포유류에 투여하기 위해 제재된 본 발명에 따른 조성물의 캐리어를 말한다. 이러한 약학적 운반체는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오리진(예를 들면 땅콩 기름, 콩기름, 미네랄 기름, 참기름 등)을 포함하는 물 및 기름과 같은 액체일 수 있다. 상기 약학적 운반체는 염류 용액, 아라비아 고무, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드 실리카, 요소 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정제, 농후제, 광택제 및 착색제 등의 약품이 사용될 수 있다. 바람직하게, 포유류에 투여되었을 때, 본 발명에 따른 화합물과 조성물 및 약학적으로 허용되는 운반체, 첨가제 또는 희석재는 멸균상태이다.
본 발명에 따른 조성물이 정맥 내에 투여될 때에는 예를 들어 물, 식염수, 및 액상 포도당 및 글리세린 용액과 같은 수성 운반체가 바람직하다.
상기 화합물과 조성물은 캡슐, 타블릿, 알약, 펠릿, 능형(lozenges), 분말, 과립, 시럽, 엘릭스(elixirs), 용액, 현탁, 에멀젼, 좌약 또는 이들의 지속성 방출 제재, 또는 포유류에 투여하기 적합한 다른 형태를 가질 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 화합물과 조성물은 인체에 경구 또는 정맥 투여에 적합한 약학적 조성으로 루틴 단계에 따라 투여를 위해 제재화된다. 일 실시예에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 운반체는 경캅셀이다. 적합한 약학적 운반체의 예와 이것의 제재를 위한 방법은 레밍턴(Remington)에 기재되어 있다(The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19TH ed. , 1995, Chapters 86,87, 88,91, and 92 참조).
경구 전달을 위해 제재화된 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 바람직하게, 캡슐, 태블릿, 알약, 또는 압축된 약학적 형태를 형성한다. 또한, 태블릿 또는 알약 형태에 있어서, 상기 화합물 및 조성물은 위장 영역 내의 흡수 및 소화를 지연시키기 위해 코팅되기 때문에 그 연장시간 동안 유지력을 제공할 수 있다. 또한, 삼투압적 활성 구동 화합물을 둘러싼 선택 투과성 멤브레인은 경구를 통해 투여되는 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물에 적합하다. 이러한 후자의 플랫폼에 있어서, 캡슐을 둘러싼 환경으로부터의 유체는 구멍을 통해 약제 조성물 또는 상기 약제를 치환하기 위해 부풀어오르는 구동 화합물에 의해 흡수된다. 이러한 전달 플랫폼은 즉각 방출 제재화의 프로파일과 반대되는 제로 오더(order) 전달 프로파일을 필수적으로 제공할 수 있다. 글리세롤 모노스테리에이트 또는 글리세롤 스테리에이트와 같은 시간 지연 재료 또한 사용될 수 있다. 경구 조성물은 표준 운반체, 부형재 및 제재 예컨대 마그네슘 스테리에이트, 소디움 사카린, 셀률로스, 마그네슘 카보네이트, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니토르, 전분, 아라비아 고무, 규산 칼슘, 미결정성의 섬유소, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 시럽 및 메틸 섬유소을 포함할 수 있으며, 상기 제제화는 부가적으로 광택 성분, 즉 활석, 마그네슘 스테리에이트, 미네랄 오일, 웨팅 성분, 유화 및 지연 성분, 메틸- 및 프로필히드록시벤조네이트와 같은 보존 성분을 포함할 수 있다. 이러한 운반체는 약학적 등급이 바람직하다. 경구로 투입되는 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 프럭크토스, 아스파탐 또는 사카린과 같은 감미 성분을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 페파민트, 노루발풀 오일, 또는 체리와 같은 향미 성분, 하나 또는 그 이상의 약학적 풍미를 제공하기 위한 착색 성분을 포함한다.
특정 장애 또는 이상의 치료를 위해 치료학적으로 유효한 투여 요법은 그 특성과 엄격한 규준에 따르며, 의사의 판단에 의한 표준 임상 기술에 의해 결정될 수가 있다. 또한, 생체 밖 또는 생체 내 분석은 최적 투여량을 식별하는데 도움이 될 수 있다. 물론, 치료학적으로 효과적인 투여량으로 구성되는 본 발명에 따른 화합물 또한 상기 투여 루트에 의존한다. 일반적으로, 경구 투여를 위한 적합한 투여 범위는 1일당 킬로그램 체중에 대해 본 발명에 따른 화합물의 약 0.001 ~２０mg 이며, 바람직하게는 약 0.7 ~ 6mg이며, 더욱 바람직하게는 약 1.5 ~ 4.5mg이다. 바람직한 실시예에 있어서, 포유류 바람직하게 인체에는 1일당 본 발명에 따른 화합물의 약 0.01 ~ 1000mg이 경구로 투여되며, 더욱 바람직하게는 일회 또는 분리 투여량에 있어서 약 0.1 ~ 300mg 또는 약 1 ~ 250mg이다. 여기서, 상기 투여량은 총 투여된 양으로 서술된다. 즉 이것은 만약 하나 이상의 상기 화합물이 투여된다면, 바람직한 투여량은 투여된 상기 화합물의 총량과 일치하기 때문이다. 경구 조성물은 바람직하게 10 ~ 95w% 의 상기 화합물을 포함한다. 바람직한 유닛 경구-투여 형태는 알약, 태블릿 및 캡슐을 포함하며, 더욱 바람직하게는 캡슐이다. 일반적으로 이러한 유닛-투여 형태는 약 0.01, 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 250, 500mg의 본 발명에 따른 화합물을 포함하며, 바람직하게는 투여 유닛 당 약 5 ~ 200mg의 화합물을 포함한다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있으며(예, 근육내, 경막내, 정맥내, 및 동맥내 루트), 바람직하게는 정맥내로 투여된다. 일반적으로, 정맥내 투여를 위한 상기 화합물 및 조성물은 물, 살린, 링거액, 또는 덱스트로스 용액 등과 같은 무균 등장 액상 운반체 용액이다. 필요에 따라, 상기 조성물은 또한 솔루빌라이징 제재를 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위한 조성물은 주사 자리의 고통을 완하하기 위한 리그노카세인과 같은 국부 마취제를 선택적으로 포함할 수 있다. 정맥 투여를 위해, 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 무균형태, 동결건조 분말 또는 엠플 또는 사키테(sachette)와 같은 밀봉 실링된 컨테이너 내의 워터-프리 농축물, 활성 제재의 양을 나타내는 컨테이너 형태로 제공될 수 있다. 이러한 분말 또는 농축물은 정맥 투여에 앞서 적정한 액상 매개체로 희석된다. 무균 물, 살린 용액 또는 다른 적합한 액상 매개체의 앰플은 투여에 앞서 희석을 위한 분말 또는 농축물로 제공될 수 있다. 또는 상기 조성물은 투여를 위한 프리믹스된 형태로 제공될 수도 있다. 정맥 내에 주입됨으로 인해 투여되는 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물은 예를 들어 무균 약학적-등급 물, 살린, 또는 다른 적합한 매개체를 담는 주입병으로 조제될 수 있다.
직장(直腸) 투여는 코코아 버터, 수정된 식물성 오일 및 다른 지방 베이스(fatty bases)와 같은 종래의 캐리어로 제재된 좌약의 사용을 통해 효과적일 수 있다. 좌약은 예컨대, (Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ED., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed. , 1995, pp. 1591-1597, 참조)에 잘 알려진 포물레이션을 사용하는 잘 알려진 방법에 의해 조제될 수 있다.
국부적인 투여 형태로 투여 및 제재화하기 위해서는, 잘 알려진 로우션, 크림 및 연고와 같은 경피성 및 내피성 전달 매개체, 및 패치와 같은 경피성 전달 장치가 사용된다(Ghosh, T. K.; Pfister, W. R.; Yum, S. I. TRARASDERMAL AND TOPICAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, INTERPHARM Press, Inc. p. 249-297, 참조). 예를 들어, 저장소 타입의 패치 디자인은 접착제로 코팅된 백킹(backing) 필름 및 본 발명에 따른 화합물 및 조성물을 포함하는 저장소 구획을 구비하는데, 이것은 반투성 멤브레인(예, 미국특허 4,615, 699참조)에 의해 피부로부터 분리된 것이다. 백킹 레이어를 코팅한 상기 접착제는 피부에 집중 실을 제공하며 피부에 인접한 저장소를 홀딩하기 위해 저장소의 경계영역까지 확장된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 조성물로 채워진 하나 또는 그 이상의 컨테이너로 이루어진 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 컨테이너와의 선택적 결합은 제약 또는 바이오 제품의 제조, 사용 또는 판매를 통제하는 정부 부처에 의해 처방되는 형태로 고지될 수 있으며, 상기 고지는 인체 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 부처에 의해 승인된 것을 반영한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 따른 화합물과 다른 생화학적 활성제를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 인체에 사용하기에 앞서 소망하는 치료적 또는 예방적 활동을 위해 바람직하게 생체내 또는 생체 밖에서 분석된다. 예를 들면, 생체내 분석은 본 발명에 따른 특정 화합물의 투여 또는 본 발명에 따른 화합물의 결합이 적합한가 아닌가를 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물과 화합물은 동물 모델 시스템을 사용하여 안전성과 효과성이 증명될 수 있다. 다른 방법들은 숙력된 당업자들에게 알려진 것들로 본 발명의 범위에 포함된다.
6. 실험예
6.1 실험예 1: 인간 혈관생성 분석 전개
다능성 태반 줄기세포로부터의 자발적인 혈관 생성(튜브 형성)
인간 다능성 줄기세포가 분리된 후 배양되어 24시간 후에 비유착 모집단으로부터 유착성 세포가 선택되었다. 이러한 유착성 세포는 10%의 제대혈 혈청(CBS)과 항생제가 첨가된 DMEM 내에서 배양되었다. 미세관 구조의 집합체로 특징되는 자발적 혈관 생성의 시간 경과 프로필이 결정되고, 내피 특성 마커와 합성 생성물을 분석하기 위해 다양한 시간대에서 세포 시료가 수집되었다. 시간 경과에 따라 얻어진 것을 바탕으로, 후보 혈관생성 조절 화합물을 선별하기 위해 처리용량과 시간표가 작성되었다.
제대혈관링 준비
직경 약 1-2 mm, 길이 약 1-2 cm인 혈관이 출생후 12시간 이내에 인간의 탯줄 혈관으로부터 절제되었다. 동맥과 정맥 조직이 배양되어 별도로 유지되었다. 혈관이 2.5μg/ml의 펀자이존(fungizone)을 함유하는 DMEM 내에 놓여 미세 절단 집게와 홍채절개 가위를 사용하여 1-2 mm의 조각으로 절단되었다. 혈관 조각은 잔여 혈병으로부터 유리되어 사용 전에 DMEM 내에 잠기도록 하였다. 외과용 현미경을 이용하여 해부 및 절개가 이루어졌다. 유사한 혈관생성 반응이 정맥 및 동맥 혈관으로부터 얻어졌으며, 각각의 분석을 위해 하나의 혈관으로부터 얻어진 혈관 조각이 사용되었다. 분석된 그래프의 추이는 도 6에 나타나 있다.
분석 준비
분석은 배양 접시(10 내지 25㎠) 또는 6-웰 배양플레이트(Mass, 캠브리지, 코스타)내에서 수행되었으며, 이것은 0.1%의 젤라틴(MO, 세인트루이스, 시그마) 또는 MATRIGEL?(BD 바이오사이언스)로 예비 코팅되어 기질을 형성하도록 준비되었다. 접시의 코팅에 이어서, 5 mL의 DMEM 내에서 50μl의 제대혈 혈장이 각 접시/웰로 가해져 기질 위에 표면막을 형성하도록 하였다. 상기 막은 37℃에서 90분동안 유지되었고 그 후에 제거되었다. 그런 다음 혈관링 조각은 플레이트와 접시의 중앙부에 놓여졌다. 배양 접시를 4등분하여, 혈관링 조각은 각 4등분의 중앙에 놓여졌다. 혈관링 조각은 12시간 내에 코팅된 기질에 유착되었고 부력으로 인한 탈락 우려없이 배지의 추가가 가능하다. 유착 후에, 혈관은 20%의 인간 탯줄 혈액 혈장, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 헤파린이 첨가된 DMEM내에서 37℃, 습한 환경에서 14-21일동안 배양되었다. 배지는 72시간 간격으로 교환되었다.
때때로 섬유모세포도 배양을 수반하는데, 보통 배양 용기의 바닥에 단층으로 나타난다. 왜냐하면 내피 세포와 달리 섬유모세포는 MATRIGEL?을 침입하지 못하기 때문이다. 배양 용기의 플라스틱 베이스와 접촉하지 않고 섬유소 겔에 부유된 혈관조각에서 섬유모세포의 성장은 무시할 만 하다. 혈병 수축과 결과적으로 섬유모세포의 오염을 방지하기 위해 섬유소 억제재, 엡실론-아미노카프로익산(epsilon-aminocaproic acid)가 배양 배지 내에 첨가된다.
테스트 약물 투여와 결과 산출
테스트 약물은 배양 초기에 일단 유착성 줄기 세포가 선택되고 또는 혈관링이 기질에 유착된 것으로 판단되면 투여되었다. 각각의 테스트 약물은 용량 반응 분석을 위해 다양한 농도로 측정되었다.
혈관 생성의 조정은 양성 및 음성 대조와 비교하여 각 분석에서 혈관 생성의 변화로 정의되었다. 양성 대조는 내피 세포 성장 보조(ECGS: 200 μg/ml; 콜래보래티브 리서치, 베드포드, MA)에 대한 반응으로 정의되었다. 음성 대조는 DMSO에 대한 반응으로 정의되었다.
혈관 성장은 다음과 같은 구분으로 양성 및 음성 대조와 대비하여 정량적으로 산출되었다. - 음성; +/- 음성 대조 극소상; + 생성 저단계; ++ 생성 중간 단계; +++ 생성 고단계: ++++ 생성 양성 대조 단계. 또한 혈관 생성은 혈관 링으로부터 미크론단위로 혈관 발아 성장의 최대 거리를 형태학적으로 그리고 총 내피세포 적용범위 면적(ECA)/혈관링 면적(VRA)으로서 산출하였다.
이동 분석
혈관 발아는 발아 시점에서 세포외 기질의 존재와 특성에 대해 민감하기 때문에 생리적 혈관외 환경을 시뮬레이트하기 위해 수정된 방법이 사용되었다. 비변성 인간 콜라겐 기질(안트로매트릭스(Anthromatrix))을 사용하여 제대혈 동맥 조각이 전술한 혈관링 조각과 동일한 조건 하에서 배양되었다. 변형으로서, 이러한 혈관 조각은 기질의 고정된 위치에 놓여진다. 이러한 배열에 의해, 내피 발아는 기질로 성장하고 모든 혈관 조각 '카세트'는 분석을 위해 세포 배양 접시로부터 회수된다. 혈관 생성의 정도가 전술한 바와 같이 산출되었다.
면역 조직 화학 염색
감지가능한 혈관 생성 반응(즉, 혈관 성장)을 알려주는 플레이트가 면역 조직 화학 염색 준비를 위해 4℃, PBS내에서 4% 파라포름알데히드에서 하룻밤 유지되었다. 고정 기질은 파라핀 매질이다. 이러한 기질로부터 3μm 조직 단면이 절개되어 폴리-L-라이신 코팅 현미경 슬라이드 위에 놓여졌다. 절개부는 3분 동안 마이크로파 처리되고 항원을 노출시키기 위해 0.1% CaCl2내에서 0.1% 트립신으로 부분적으로 소화시켰다. 그런 다음, 항체 및 홍당무과산화효소 결합 양혈구 F(ab')2항마우스 Ig (영국, 허츠, 아메르샴, 아메르샴)와 반응된 절개부가 감지 시스템으로서 사용되었다. 절개부는 은 증진제와 함께 다이아미노벤지다인(diaminobenzidine)과 반응하고 헤마토실린(haematoxylin)으로 대조 염색되었다. 사용된 항체는 항원과 연관된 단세포 마우스 항-인간 인자 VIII(덴마크, 다코), 항-인간 내피 세포 mAb(뉴욕, 그랜드아이랜드, 깁코) 및 메디칼 리서치의 존 커틴 학교에서 제조된 CD31-특정 mAb(클론 20G5)을 포함한다.
항원 샘플의 면역 조직 화학 염색은 항원과 연관된 인자 VIII과 혈관 성장을 명시적으로 알려주는 반응을 감지하기 위해 수행되었다. 또한 혈관은 인간 내피 세포용 특정 mAb(깁코)와 반응되었고, CD31에 대한 mAb, 내피 세포, 혈소판 및 약간의 백혈구로 표현되는 항원과 반응되었다.
어떤 경우에는, 고전적인 내피 형태를 가진 세포를 파악하기 위해 전자 현미경에서 혈관 생성 시료를 검사하는 것도 수행될 수 있다.
실험 방법 및 분석
전술한 바와 같이 14-21일 동안의 배양 후에, 혈관 생성이 정량화되고 대조 배양과 비교된다.
다음 물질들은 기준값을 설정하기 위해 테스트되었다.
·헤파린(100 μg/ml)
·저분자량 헤파린 (100 μg/ml)
·수라민 (현관 내피 성장 인자의 효능 억제제)(100 μg/ml & 10 μg/ml)
·3-하이드로코르티손 (10-5M)
·3-하이드로코르티손 (10-5M) 및 헤파린(100 μg/ml)
·산성 섬유모세포 생성 인자(aFGF)용 다세포 중화 항체
·염기성 섬유모세포 생성 인자(bFGF)용 다세포 중화 항체
·aFGF 및 bFGF용 다세포 중화 항체 혼합물
·혈관 내피 성장 인자(VEGF)용 다세포 중화 항체
실험 기준 전개
이 연구는 혈관 생성 조정자로 알려진 시스템을 분석하는데 효과적이라는 것을 입증하기 위해 수행되었다.
헤파린 및 저분자량 헤파린(100 μg/ml)만으로는 통상 혈관 생성을 억제하지 않는다. Folkman & Brem(1992)의 "Angiogenesis and inflammation"(Inflammation, Basic Principles and Clinic Correlates Gallin et al., eds, Raven Press, New York). 그러나 이 두 분자는 분석이 보여주듯이 혈관 생성을 다량 억제하는 것이 아니라 아주 소량 억제하였다. 그러나, 이러한 억제 효과는 다른 분석에서는 일어나지 않을 수도 있다. 반대로, 수라민은 100 μg/ml에서 실질적으로 완전히 혈관 생성을 억제하였으며, 반면 10 μg/ml에서 억제 작용이 상실되었다. 하이드로코르티손만으로는 헤파린과 마찬가지로 항-혈관생성 작용이 거의 없다(Folkman & Brem(1992)). 하이드로코르티손은 DMSO (0.5%) 희석 대조와 대비하여 10-5M의 비교적 높은 농도에서 부분적으로 혈관 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다(인용). 그러나, 여기에서는, 헤파린과 하이드로코르티손의 결합체가 거의 완전히 혈관 생성 반응을 억제하였다. 그러한 결과는 생체 내에서 헤파린이 스테로이드와 함께 상승작용을 일으켜 모세혈관의 생성을 억제하는 것을 보여준다(Folkman & Brem(1992)).
양성 대조
산성 섬유모세포 생성 인자(aFGF)와 염기성 섬유모세포 생성 인자(bFGF)는 가장 효과적인 혈관 생성 억제제로 알려져 있다. 가장 최근에 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관 생성 인자 특히, 배아 생성 및 고형종양에 있어서 중요한 인자로 확인되었다. 잠재적인 양성 대조의 리스트는 표 1에 나타나 있다.
표 1. 혈관 생성의 중화적인 출현 자극제
단백질
·산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF)
·혈관 생성(Angiogenin)
·염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)
·표피 성장 인자
·과립백혈구 집락 자극 인자
·간세포 성장 인자
·인터루킨 8
·태반 성장 인자
·혈소판 부인 내피 성장 인자
·산란 인자
·변형 성장 인자 알파
·종양 괴사 인자 알파
·혈관 내피 성장 인자(VEGF)
소분자
·아데노신
·1-부틸 글리세롤
·니코틴아미드
·프로스타글라딘 E1 및 E2
대조 항체, 다세포 중화 항체와 대비하여 bFGF 및 aFGF는 부분적으로 혈관 생성을 억제하고, 항-bFGF 항체가 그 보다 더 억제력이 있다는 것이 발견되었다. 반면에, VEGF에 대한 중화 항체는 혈관 생성 반응에 대해 영향이 없었다. 이러한 데이터는 VEGF가 아닌 bFGF 및 aFGF가 생체 내에서 혈관 생성 분석에 중요한 역할을 하는 것을 말해준다.
양성 및/또는 최대 반응을 정량화하기 위해, 자발적인 혈관 생성을 줄이고자 배양은 혈청 기아 상태로 하였다. 이러한 단계는 20%의 인간 혈청을 함유하는 배지내에서 처음 24시간 동안 배양을 하고 그 다음에 13-20일동안은 배지를 3-4일마다 교환하면서 혈청이 없는 채로 배양하였다. 혈관 생성 향상제로 의심되는 물질을 표본으로 분리하여 전술한 각각의 용기에 가했다.
혈관 생성 촉진 인자를 위한 용량 반응 데이터 전개
혈청 기아 배양에서 혈관 생성을 향상시키는 능력을 판단하기 위해 서로 다른 농도의 혈관 생성 성장 인자 bFGF, aFGF 및 VEGF가 평가되었다. 표준 용량 반응 분석이 수행되었다. 비록 '혈청 기아' 상태에서 분석이 이루어졌으나, 내피 세포가 생존할 수 있는 최소한의 혈청 구성물이 테스트하는 동안 사용되었다.
음성 대조
혈관 생성 억제 효과로 알려진 인자에 대해서 유사한 용량 반응 분석이 이루어졌다.
6.2 실험예 2: 태반에서 추출된 배아 유사 줄기세포의 증식 및 분화에 대한 Thalomid™, Actimid™ 및 Revimid™의 효과
다음 실험은 Thalomid™, Actimid™ 및 Revimid™가 태반에서 추출된 배아 유사 줄기세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 측정한 것이다. 배양된 배아 유사 줄기세포의 형태학적 분화는 DMSO(조절), EGCF, Thalomid™, Actimid™ 및 Revimid™와 함께 태반 조건 기질의 존재하에서 14일동안 배양된 후 측정되었다. 세포는 실험을 거쳐 형태적인 출현에 대한 평가뿐만 아니라 배양 접시 내에 차지하는 총면적과 분화 및 분기된 양과 같은 다양한 세포 표지자를 사용하여 측정되었다.
6.2.1 재료 및 방법
5.4장에서 전술한 바와 같이 배아 유사 줄기세포는 태반으로 분리된다. 배아 유사 줄기세포는 전술한 바와 같은 배양 조건하에서 배양된다. 세포들은 CD34(초기 조혈 전구세포의 표지자; 및 내피 세포 표지자), CD45(적혈구를 제외한 조혈 전구세포의 표지자), CD105(증식 내피 세포의 표지자), 평활근육 세포(SMC)-특정 미오신 중쇄, 네스틴(혈관 생성 표지자), 아교 세동성 산성 단백질(GFAP)과 같은 표현으로 산출되었다. CD34 세포수/총 세포수(TNC)의 비, CD45 세포수/TNC 및 CD105 세포수/TNC 또한 산출되었다. 또한 세포들은 분기 또는 불할이 있는지 파악하기 위해 광학적 현미경을 사용하여 혈관 총면적 또는 차지 면적을 산출하였다.
6.2.2 결과 및 토의
하기 표 2-4 및 도 1A-1C는 결과를 간략화한 것이다. 표 2에서, 산출값은 다음과 같다.
-:비염색; +/-:<20% 염색; +:20-50% 염색; ++:50-75% 염색; +++:>75% 염색.
표 2의 결과는 Thalomid™, Actimid™ 및 Revimid™의 존재하에 배양된 경우CD34, CD35 및 평활 근육 세포(SMC)-특정 미오신 중쇄값을 표현하는 세포수의 감소와 네스틴 및 아교 세동성 산성 단백질(GFAP)의 증가를 보여준다.
표 2: CD34, CD35, 미오신 중쇄, 네스틴 또는 GFAP로 표현된 DMSO, Thalomid™, Actimid™ 및 Revimid™의 영향
그 결과가 표 3에서 요약되어 있는 또 다른 실험에 있어서, 태반에서 추출된 배아 유사 줄기세포는 앞서 제대혈 혈관링 분석에서 상술한 조건을 사용하여 DMSO, Thalomid™, Actimid™ 및 Revimid™를 가진 태반 조건 기질하에서 배양된다. 14일동안 배양한 후, 세포는 CD34+, CD45+ 및 CD105+를 위해 면역 염색된다.
Thalomid™, Actimid™ 또는 Revimid™ 존재하에서의 배양은 CD34, CD45 및CD105를 표현하는 세포수를 감소시키는데 이것은 도 2A-2C를 참조하라.
표 3: 배양된 태반 줄기세포의 CD34, CD45 및 CD105로 표현된 DMSO, Thalomid™, Actimid™ 및 Revimid™의 영향
표 4에 결과가 요약되어 있는 또 다른 실험예에서, 배아 유사 줄기세포는 EGCF, DMSO, Thalomid™, Actimid™ 또는 Revimid™ 존재하에서 전술한 태반 조건에서 배양된다.
"+"는 가지나 분기가 관찰된 경우이고 "-"는 관찰되지 않은 경우를 나타낸다. 표 4에 있는 결과는 Thalomid™, Actimid™ 또는 Revimid™ 조건에서 배양된 태반 배아 유사 줄기세포는 총혈관면적/세포차지면적을 감소시키고, 또한 세포의 분기 및/또는 분할을 증가시킨다. 이것은 도 3A, 3B를 참조하라.
표 4: 혈관 생성에 대한 ECGF+DMSO, Thalomid™, Actimid™ 또는 Revimid™의 영향
6.3 실험예 3: 생체 내의 혈관 생성 분석에 있어서 탈리도미드(Thalidomide)의 영향
다음 실험예는 인간 혈관 생성의 조정자를 파악하기 위해 본 발명에 따른 생체 내의 분석에 있어서 영향을 입증하기 위한 것이다. 종래 기술 즉, 쥐의 대동맥 혈관 생성 분석과 비교할 때, 본 발명에 따른 생체 분석은 종래의 분석에서는 감지되지 못하였던 혈관 생성 조절자를 파악할 수 있도록 한층 높아진 구체성과 정확성을 보여준다.
6.3.1 쥐 대동맥 혈관 생성 분석
12개의 웰 조직 배양 단계 플레이트가 250μl의 매트리겔(Matrigel)로 도포되어 370C, 5%Co2에서 30-45분 동안 겔화된다. 8 내지 10주된 스프레그 도리(Sprague Dawley) 쥐로부터 가슴 대동맥을 절개하여 섬유지방 조직을 제거한다. 상기 대동맥은 1 mm 길이로 절단되어 EGM-2(클로네틱스사)로 8회 세정한 다음 매트리겔이 코팅된 웰 내에 놓여 250μl로 도포되어 370C에서 30-45분 동안 겔화된다. 링은 2ml의 EGM-2 내에서 24시간 동안 배양된다. 24시간 후에, 재조합 생쥐 엔도스태틴(endostatin)이 EBM내에서 재구성되어 1일에 단일처리로서 가해진다. 탈리도미드가 표 5에 기재된 바와 같이 생쥐 미세소체의 존재하에 또는 없는 상태에서 서로 다른 농도(1μg/ml, 5μg/ml, 10μg/ml, 50μg/ml 및 100μg/ml)로 가해진다. 대동맥 링은 주간에 사진촬영된다.
표 5의 결과는 혈관 생성의 효과적인 억제를 보여주기 위해서 탈리도미드가 추가적인 생쥐 미세소체를 필요로하는 것을 말해준다. 그러나, Actimid™는 혈관 생성 억제를 위해 미세소체를 필요로 하지 않는다.
표 5: 생쥐 대동맥 혈관 생성 분석에 있어서 미세혈관 성장에 대한 탈리도미드의 영향(대조로 표시)
6.3.2 인간 혈관 생성
병원에서 기증자의 완전한 동의하에 신선한 제대혈이 수집되었다. 혈관은 이송되어 3시간 동안 처리되었다. 제대 혈관 내강은 차가운 염기성 영양 배지로 세척되었다. 기계적 수단, 집게 및 소형 외과 가위를 사용하여 무균실에서 혈관으로부터 동맥을 제거하였다. 혈관은 연결 조직을 처리한 후 혈관링이 1 mm 길이로 가로 절단되었다. 링은 EGM-2 배지(클로네틱스사) 내에 놓여져 50ml의 원뿔 바닥 용기에서 4℃로 저장되었다. 6-웰 조직 배양 플레이트가 매트리겔 250ml로 도포되어 5% CO2, 37℃에서 30-45분 동안 유지된다. 혈관링은 EGM-2 배지 내에서 세정되어 매트리겔이 코팅된 웰에 놓여 250μl를 추가하여 도포되고, 37℃에서 30-45분 동안 유지된다(도 6 참조). 혈관은 4ml의 EGM-2 내에서 24시간 동안 배양되어 조직이 새로운 환경에 적응하도록 한다. 24시간 배양 후에, 링은 대조로서 0.1% DMSO 또는 다른 농도의 화합물(탈리도미드 또는 CC-4047)로 처리된다. 배양 배지는 3주 동안 일주일에 두 번 교환하였다.
배양된 혈관링에 대한 화합물의 영향이 혈관링에 대한 DMSO의 결과과 대비되었다. Image-Pro? Plus 소프트웨어(캘리포니아, 칼스배드, 미디어사이버네틱스사)를 사용하여 결과를 분석하였다.
표 6 및 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 탈리도미드 및 Actimid™ 모두가 용량 반응법에서 DMSO 처리 샘플과 비교하여 미세혈관 성장의 형성을 억제하였다. 이러한 실험은 똑같이 반복되었고 동일한 실험에서 두 링의 평균을 산출하였다. 본 실험에서 서로 다른 농도의 퍼마질린(Fumagillin)이 대조로서 사용되었다.
표 6: 인간 혈관생성 분석에 있어서 미세혈관 성장에 대한 탈리도미드와 Actimid의 영향
본 분석에 있어서 인간의 링 결과와 생쥐의 링 결과를 대비해 볼 때, 탈리도미드의 효과에 있어서 인간이나 생쥐 미세소체를 구별할 필요가 없다는 것이 중요하다.
6.4 실시예 4: 혈관 링과 줄기 세포를 이용한 혈관형성 모듈레이터의 분석
적어도 10개 이상을 각각 배양한 혈관 링을 줄기세포와 함께 공동 배양하여, 혈관의 자연적 환경을 효과적으로 재현하였다. 혈관의 절편을 얻어 앞서 실시예 1에서 설명한 바와 같이 평판배양하였다. 태반으로부터 얻은 배아-유사 줄기세포를 혈관 절편과 함께 평판배양한 다음, 혈관 절편과 줄기세포 모두를 부착시켰다. 12시간 배양후, 부착되지 않은 줄기세포는 세척하여 서서히 제거하였다. 공동배양체를 적어도 2개의 그룹으로 나누었다. 공동배양체의 1세트는 대조군으로서 DMSO로 처리하였다. 공동배양체의 2번째 세트는 테스트 화합물로 처리하였다. 다른 공동배양체들은 포지티브 대조군이나 다른 대조군으로 처리하였다. 줄기세포와 혈관 절편의 공동배양체들은 21일동안 더 배양하였다. 21일 경과한 후에, 대조군과 테스트 공동배양체를 조사하였고, 혈관형성의 정도를 이미지 스캐닝하여 평가하였다. 테스트 공동배양체들은 미세혈관이 생성된 평균 면적이 대조군 공동배양체의 혈관 생성 평균면적보다 클 때 테스트 화합물이 혈관형성제인 것임을 증명하며, 만일 생성된 평균 면적이 대조군 공동배양체의 혈관 생성 평균면적보다 작다면 테스트 화합물은 혈관형성 억제제이다.
6.5 실시예 5: 혈관 링과 종양세포를 이용한 혈관형성 모듈레이터의 분석
적어도 10개 이상을 각각 배양한 혈관 링을 종양세포와 함께 공동 배양하여, 종양 내 또는 그 주변에 혈관의 자연적 환경을 효과적으로 재현하였다. 혈관의 절편을 얻어 앞서 실시예 1에서 설명한 바와 같이 평판배양하였다. 종양세포는 종양 샘플이나 또는 종양세포주로부터 얻었다. 종양세포를 혈관 절편과 함께 평판배양하여 공동배양체를 형성하고, 혈관 절편과 줄기세포 모두를 부착시켰다. 공동배양체를 적어도 2개의 그룹으로 나누었다. 공동배양체의 1세트는 대조군으로서 DMSO로 처리하였다. 공동배양체의 2번째 세트는 테스트 화합물로 처리하였다. 다른 공동배양체들은 포지티브 대조군이나 다른 대조군으로 처리하였다. 줄기세포와 혈관 절편의 공동배양체들은 21일동안 더 배양하였다. 21일 경과한 후에, 대조군과 테스트 공동배양체를 조사하였고, 혈관형성의 정도를 이미지 스캐닝하여 평가하였다. 테스트 공동배양체들은 미세혈관이 생성된 평균 면적이 대조군 공동배양체의 혈관 생성 평균면적보다 클 때 테스트 화합물이 혈관형성제인 것임을 증명하며, 만일 생성된 평균 면적이 대조군 공동배양체의 혈관 생성 평균면적보다 작다면 테스트 화합물은 혈관형성 억제제이다.
7. 참고문헌
여기에 언급된 모든 참고문헌 전체가 본 명세서에 통합된다.

Claims (24)

  1. (a)내피세포의 성장에 적합한 조건과 시간에서 테스트 화합물의 존재하에서 복수의 줄기 세포를 배양하고;
    (b) 상기 테스트 화합물의 존재하에서 상기 줄기 세포들로부터 미세혈관 성장(outgrowth)의 양을 미세혈관 성장의 대조군 양과 비교하는 것을 포함하고, 상기 미세혈관 성장이 미세혈관 성장의 상기 대조군 레벨 이상 또는 이하인 경우에 상기 테스트 화합물을 혈관신생의 조절자로 동정하는 혈관신생의 조절자 동정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 혈관 부분(section)과 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 복수의 종양 세포들과 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 종양 세포들은 종양 세포주의 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 하이드로코디존, 상피 성장인자 또는 소 뇌 추출물의 존재하에서 부가적으로 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 혈관신생의 조절자는 항-혈관신생 약제로 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 혈관신생의 조절자는 혈관신생 약제로 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 테스트 화합물의 존재하에서 복수의 줄기 세포의 상기 배양은 적어도 7일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 테스트 화합물의 존재하에서 복수의 줄기 세포의 상기 배양은 적어도 14일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포들은 피브린을 포함하는 매트릭스상에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포들은 피브린을 포함하는 생리적인 젤에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포들은 비-변성 콜라겐을 포함하는 생리적인젤에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. (a)내피 세포들 및 종양 세포들의 성장에 적합한 조건과 시간에서 테스트 화합물 및 복수의 종양세포들의 존재하에서 혈관 부분(section)을 배양하고;
    (b) 상기 테스트 화합물의 존재하에서 상기 혈관 부분들로부터 미세혈관 성장(outgrowth)의 양을 미세혈관 성장의 대조군 양과 비교하는 것을 포함하고, 상기 미세혈관 성장이 미세혈관 성장의 상기 대조군 레벨 이상 또는 이하인 경우에 상기 테스트 화합물을 혈관신생의 조절자로 동정하는 혈관신생의 조절자 동정 방법.
  14. 치료적으로 유효한 양의 TNF-알파 저해제를 각 개체에게 투여하는 것을 포함하는 비정상적인 혈관 성장과 관련된 질병 또는 이상을 갖는 개체를 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 TNF-알파 저해제는 IMiDTM인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 IMiDTM은 ActimidTM또는 RevimidTM인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 질병 또는 이상은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 암은 전이성 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 질병 또는 이상은 염증, 자궁내막증,관절염, 동맥경화성 플라크, 당뇨 망막증, 신생혈관성 녹내장, 트라코마, 각막 이식 신생혈관증, 건선, 경피증, 혈관종 및 튀어나온 흉터, 혈관 접착 및 혈관섬유종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. TNF-알파 저해제로 혈관을 형성할 수 있는 복수의 세포들에 접촉하는 것을 포함하는 혈관신생을 저해하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 TNF-알파 저해제는 ActimidTM또는 RevimidTM인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 각 개체내의 복수의 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 복수의 세포들은 세포 배양내의 복수의 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
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