KR20150139569A - 혈관형성의 유도 및 조절을 위한 조성물 및 방법 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법 - Google Patents

혈관형성의 유도 및 조절을 위한 조성물 및 방법 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법 Download PDF

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KR20150139569A
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피터 에스. 맥패트리지
마크 씨. 무어
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유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크.
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Abstract

본 개시는 혈관형성(angiogenesis)의 유도 및/또는 조절을 위한 방법 및 태반 추출물을 포함하는, 혈관형성의 유도 및/또는 조절을 위한 조성물; 혈관형성 조절 인자를 확인하는 방법 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 분석법을 제공한다. 또한, 본 개시는 혈관형성을 유도하고/거나 조절할 수 있는 태반 추출물을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.

Description

혈관형성의 유도 및 조절을 위한 조성물 및 방법 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR INDUCTION AND MODULATION OF ANGIOGENESIS AND METHODS AND ASSAYS FOR IDENTIFYING ANGIOGENESIS MODULATORS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 "혈관형성 유도 및 조절을 위한 조성물 및 방법 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법"이란 명칭으로 2013년 4월 2일에 출원된 미국 가출원 제61/807,401호에 우선권을 주장하며, 이는 전문으로 본원에서 참고에 포함된다.
연방 정부 후원 연구 또는 개발에 관한 언급
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여한 보조금 제 HL088207호의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
혈관형성(angiogenesis)은 상처 치유에서 암을 포괄하는 생리학적 및 병리학적 상태에서 혈관을 형성할 수 있다. 혈관형성 조절은 부위 및 자극 의존적이며, 각 경우에 조절 분자의 고유한 조합을 수반할 수 있다.
조작된 기관에서 혈관화하고(vascularize) 경색 부위에서 재혈관화할(revascularize) 수 없다는 사실은 성공적인 재생 의학 요법을 임상에 적용하는 데 있어 주된 걸림돌이 되어왔다. 한정적인 방식으로 혈관형성을 조절하는 능력은 정상 및 병리학적 혈관 생리, 조직/기관의 재생, 상처 치유, 경색 조직 복구 및 암의 억제를 한정하는 것으로부터 광범위한 임상 적용에 있어 상당한 영향을 준다. 직접적인 세포 접종(단일 배양 또는 공동배양), 줄기세포의 사용, 및 인간-유래 조절 인자/성장 인자의 조합을 포함하는 여러 가지 다양한 접근법이 혈관형성을 개시하고 더 큰 혈관 형성을 유도하는데 고려되어 왔다. 지금까지, 전형적으로 비인간 동물 화합물을 이용하는 이러한 시험관 내 접근법은 그들의 개별적인 단백질 구성, 비인간 유래, 종양 유래, 또는 유전자 발현의 조절 방법의 경우 유전적 조절의 결여로 인해 임상으로 전환하는데에 거의 성공을 거두지 못하였다.
시험관 내 혈관형성을 유도하는 현재 방법은 인간-유래 조절 인자의 단순한 조합으로 구성되며, 동물-유래 자극 인자를 사용하거나 평가를 위해 살아있는 동물의 사용에 전적으로 의존하고 있다. 가능성 있는 혈관형성 억제 약물을 시험하기 위하여 인간-유래 및/또는 동물-유래 조절 인자의 단순한 조합으로 이루어진 이러한 현재 시험관 내 모델을 이용하는 것은 다양한 인간 생체 내 분자 상호 작용을 대표하지 못하기 때문에 스크리닝 과정에 제약을 준다. 혈관형성의 조절은 많은 대사 경로의 유도를 요구하기 때문에, 유일하게 선택된 분자 경로의 조절은 또한, 조작된 기관을 전혈관화(prevascularization)하기 위한 시도에 제약을 준다. 또한, 현재, 가장 일반적이고 성공적인 접근법은 엔젤브레스-홀름-스웜(EHS; Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포로부터 유래된 재료인 매트리겔™(Matrigel)을 이용하며, 이것은 인간 요법에는 부적절하다고 생각된다. 따라서, 혈관형성을 유도하고 조절하는 향상된 인간에 기초한 방법은 약제 개발 및 재생 의학 모두의 원동력이 될 수 있다.
요약
간략하게 기재하자면, 본 개시의 실시양태는 인간 태반 추출물 및 인간 태반 추출물의 제조 방법, 혈관형성의 유도 방법, 생체재료의 혈관화(vascularization) 유도 방법, 이식 가능한 조작된 생체재료, 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법을 제공한다.
인간 태반 추출물의 제조 방법을 위한 본 개시의 실시양태는 우선 인간 태반으로부터 시료를 얻는 단계 및 태반 시료로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물을 얻는 단계를 포함한다. 방법은 태반 조추출물을 단백질 가용화제와 혼합하여 조추출물 내의 단백질을 가용화하는 단계, 가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물로부터 고체 물질을 분리하는 단계, 및 가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물을 투석하여 혼합물로부터 단백질 가용화제를 제거하여 인간 태반 추출물을 얻는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시는 또한 인간 태반 시료로부터 얻은 인간 태반 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다. 혈액 및 고체는 추출물로부터 실질적으로 제거되고, 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함하며, 여기서 태반 단백질은 태반 시료에 존재하였다. 실시양태에서, 본 개시는 인간 태반 시료로부터 얻은 시료로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물을 얻는 단계; 태반 조추출물을 단백질 가용화제와 혼합하여 조추출물 내의 단백질을 가용화하는 단계; 가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물로부터 고체 물질을 분리하는 단계; 및 가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물을 투석하여 혼합물로부터 단백질 가용화제를 제거하여 인간 태반 추출물을 얻는 단계에 의해 태반 추출물이 제조되는 것을 포함한다.
본 개시에 따른 시험관 내(예를 들어, 세포 배양물에서) 또는 생체 내에서 혈관형성의 유도 방법의 실시양태는 인간 태반 추출물의 존재하에서 내피세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 태반 추출물은 혈액 및 고체를 제거하기 위해서 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻었으며, 태반 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함한다.
실시양태에서, 본 개시는 또한 생체 내에서 생체재료의 혈관화의 유도 방법을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은 숙주에 생체재료를 이식하는 단계를 포함하며, 여기서 이식 전에, 생체재료를 인간 태반 추출물에서 인큐베이션하고, 인간 태반 추출물은 혈액 및 고체를 제거하기 위해서 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻었으며, 태반 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함한다.
본 개시는 또한 인간 태반 추출물에서 인큐베이션된 인간 유래된 기질 재료를 포함하는 조작된 바이오스캐폴드를 포함하는 이식 가능한 조작된 바이오스캐폴드를 제공한다. 실시양태에서 인간 태반 추출물은 혈액 및 고체를 제거하기 위해서 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻으며, 태반 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함한다.
실시양태에서, 본 개시는 혈관형성 조절 인자의 확인 방법을 제공하며, 발명은 혈액 및 고체를 제거하기 위해서 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻은 인간 태반 추출물의 존재하에서 인간 내피세포 배양물을 배양하는 단계로서, 태반 추출물이 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함하는 것인 단계; 인간 내피세포 배양물을 시험 화합물과 접촉하는 단계; 배양물에서 혈관형성 양을 결정하는 단계; 및 세포 배양물에서 혈관형성 양이 시험 화합물 없이 배양된 배양물에서 혈관형성 양보다 더 많거나 적을 경우 시험 화합물을 혈관형성 조절 인자로서 확인하는 단계를 포함한다.
본 개시의 실시양태는 또한 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법을 포함한다. 실시양태에서, 분석법은 인간 태반 추출물의 존재하에서 배양된 내피세포 배양물을 포함하며, 여기서 태반 추출물은 혈액 및 고체를 제거하기 위해서 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻었으며, 태반 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함한다.
본 개시의 다른 방법, 조성물, 식물, 특징, 및 이점은 하기 도면 및 상세한 설명의 검토 시 당업자에게 명백하거나, 명백할 것이다. 상기의 모든 추가의 조성물, 방법, 특징 및 이점은 본 기재 내에 포함되고, 본 개시의 범위 내에 포함하고자 한다.
본 개시의 추가의 측면은 수반되는 도면이 함께 제공되는 경우 하기에 기재된 그의 여러 가지 실시양태의 상세한 설명을 검토할 때 보다 쉽게 이해될 것이다.
[도 1A-1F]는 인간 태반 추출물(hPE) 상에 형성된 혈관형성 네트워크의 특징을 나타낸다. [도 1A]는 태반 추출물 상에서 1일 후에 혈관형성 발아 과정에서 분지된 세포 사상위족을 나타내는 로다민 팔로이딘("빨강"--회색 분지 경로로 나타냄) 및 DAPI("파랑"--분지 경로 내에 더 옅은 회색 점으로 나타냄)를 나타낸다. [도 1B]는 3일 후 폭이 넓은 세포 코딩(cording)을 가진 성숙 혈관형성 네트워크를 나타내는 로다민 팔로이딘("빨강"--회색 분지 경로로 나타냄) 및 DAPI("파랑"--분지 경로 내에 더 옅은 회색 점으로 나타냄)를 나타낸다. [도 1C]는 태반 추출물 상에서 1일 후 초기 단계 세포 코딩 및 혈관형성 네트워크 형성 과정에서 칼세인("초록"--회색 분지로서 나타냄) 및 DAPI("파랑"-- 분지 내에 더 옅은 회색 점으로 나타냄) 염색된 HUVEC을 나타낸다. [도 1D]는 태반 추출물 상에서 3일 후에 HUVEC의 세포 코딩을 나타내는 DAPI("파랑"―회색 점선 경로로서 나타냄) 염색을 나타낸다. [도 1E]는 4x104 세포/cm2로 조직 배양 플레이트에 접종되어 3일 동안 내피세포 배지에서 배양된 HUVEC을 나타낸다. [도 1F]는 100 ㎕ PE/cm2로 조직 배양 플레이트의 표면에 부착된 태반 추출물 상에 4x104 세포/cm2로 접종된 후 내피세포 배지에서 3일 동안 배양된 HUVEC에 의해 형성된 혈관형성 네트워크를 나타낸다.
[도 2A-2C]는 hPE의 생화학적 분석 및 hPE 상에 접종된 HUVEC의 유전자 분석을 나타낸다. [도 2A]는 샌드위치 기반의 인간 혈관형성 항체 배열을 이용하여 수행된 사이토카인 분석을 나타내는 막대그래프이다; 데이터는 음성 대조군 값(0%)에서 양성 대조군 값(100%) 사이의 규모로 정규화하였다(데이터는 3회 생물학적 반복실험을 대표한다). [도 2B 및 2C]는 LC-MS/MS를 이용하여 측정된 면역 관련 단백질(2B) 및 혈관형성 연관된 BM 관련 단백질(2C)의 정규화된 스펙트럼 존재비 인자를 나타내는 막대그래프이다. 피브리노겐 정규화된 스펙트럼 존재비 인자 값은 FGA와 FGG 값의 합으로 나타내고, 라미닌은 LAMA2, LAMA4, LAMA5, LAMB1, LAMB2, LAMB3, 및 LAMC1 값의 합으로 나타낸다. [도 2D]는 100 ㎕ PE/cm2 상에 80,000 세포/cm2 밀도로 3일 동안 접종된 HUVEC에 수행된 유전자 분석을 나타낸다. VEGFA를 포함한, 용해액에 존재하지 않는 일부 혈관형성 관련 단백질은 hPE 상에 접종되었을 때 HUVEC에 의해 상승조절되었다. 데이터는 4회 생물학적 반복실험을 대표한다. P-값은 대조군과 처리군에서 각 유전자에 대해 반복실험한 2^(- 델타 Ct) 값의 스튜던트 t-검정법을 이용하여 계산하였다.
[도 3A-3B]는 hPE와 매트리겔 코팅된 조직 배양 플라스크 상에 형성된 시험관 내 혈관형성 네트워크를 나타낸다. [도 3A]는 1일, 3일, 및 5일 후에 여러 가지 세포 접종 농도에서 hPE 및 매트리겔 상에 칼세인 염색된 HUVEC을 나타낸다. 혈관형성 네트워크의 성숙 속도는 세포 접종 밀도를 변화시킴으로써 hPE 시료에서 최대 세관 개수/mm2가 조절될 때까지의 시간으로 정의하였다. 정량적인 분석은 40,000 세포/cm2에서 혈관형성 네트워크가 그들의 최대 세관 밀도(세관 개수/mm2)에 도달한 3일까지 일어났으나, 80,000 세포/cm2에서 네트워크는 1일에 그들의 최대 세관 밀도에 도달한다는 것을 보였다(데이터 미제시). 매트리겔 시료에서, 혈관형성의 네트워크는 1일 후에 잘 확인되지 않았다. 기준자, 200 마이크론. [도 3B]는 WPMY-1 근섬유 모세포는 태반 추출물 상에 접종되었을 때 혈관형성을 보이지 않았으나(3B.i) 매트리겔 상에 접종되었을 때 혈관을 형성하였다(3B.ii)는 것을 보여준다.
[도 4A-4C]는 hPE-기반 혈관형성 스크리닝 분석법을 이용하는 항-항혈관형성 종양 억제 단백질 트롬보스폰딘-1의 스크리닝을 보여준다. [도 4A]는 배양 배지에 첨가된 TSP-1과 함께 hPE, 매트리겔, 및 대조군 배양 플라스크(코팅되지 않음) 상에서 1일 동안 HUVEC을 접종한 후 칼세인 AM을 이용하여 염색한 것을 나타낸다. 기준자 200 μm. [도 4B]의 그래프는 hPE-코팅된 플라스크에서, 평균 총 세관 길이 [mm] 및 평균 분기점 개수 모두 TSP-1 농도가 증가하면서 선형으로 감소하였다는 것을 보여준다. [도 4C]의 그래프는 혈관형성 네트워크 도달 영역의 정규화된 감소율(%)을 비교하여 보여준다; hPE-코팅된 배양 플레이트는 매트리겔 코팅된 배양 플레이트에 비해 TSP-1 농도에 대해 상당히 더 높은 감수성을 보였으며, 이때 R2 값은 각각 0.97 및 0.36이었다,
[도 5A-5C]는 3D 조직 구조물 상에 시험관 내 혈관형성을 나타낸다. [도 5A]는 접종하고 3일간 배양한 후 hPE-적신 (인간 제정맥) 바이오스캐폴드 내에서 시험관 내 혈관형성을 유도하는 태반 유래된 세포, 스캐폴드, 및 사이토카인을 나타내는 개략적인 도면이다. [도 5B]는 hPE로 적시지 않은 HUVEC 접종된 조직 스캐폴드가 혈관형성의 네트워크를 형성하지 않았다는 것을 보여준다. [도 5C]는 배양 3일 후 혈관형성의 발아 및 중첩 기전 두 가지 모두가 일어난 것을 보여주는 hPE-적신 바이오스캐폴드의 대표적인 일련의 이미지를 나타낸다. 20,000 세포/cm2의 HUVEC 세포 접종 밀도에서, 발아 혈관형성이 가장 우세하였다(도 5C.i.-5C.ii). 40,000 세포/cm2의 접종 밀도에서, 발아 및 중첩 혈관형성 두 가지 모두가 발생한 것이 관찰된 반면(도 5C.iii.-5C.iv.), 60,000 세포/cm2의 밀도에서(도 5C.v.-5C.vi.) 혈관형성 세관은 중첩을 통해 형성되었다.
[도 6A-6B]는 hPE-인큐베이션된 바이오스캐폴드에서 생체 내 혈관형성의 실례를 나타낸다. [도 6A]는 근막과 근육 층 사이에서 랫트 모델로 이식 전 2시간 동안 PE, 매트리겔, 또는 인산 완충 식염수(대조군)에서 인큐베이션된 탈세포화된(decelluarized) HUV 스캐폴드를 예시하는 개략도이다. [도 6B]는 이식 후 5일에 분석을 위해 떼어낸 스캐폴드를 나타내는 일련의 이미지를 보여준다. hPE 인큐베이션된 스캐폴드에 비해 대조군 및 매트리겔-인큐베이션된 바이오스캐폴드에서 섬유화 캡슐이 상당히 더 많이 형성되었다(도 6B.i.-6B.iii.). 반투명한 바이오스캐폴드 시트의 관상면을 통해 잡힌 밝은 부분은 대조군, 매트리겔 및 hPE-인큐베이션된 스캐폴드(도 6B.iv.-6B.vi.)와 비교하여 hPE 스캐폴드 내에서 가장 성숙한 모세혈관상을 보이면서 모세혈관 네트워크 형성이 상당히 향상되었음을 나타내며, 이것은 세동맥-모세혈관-세정맥 혈류가 연결된 혈관 구조의 형성을 보여준다(도 6B.vi.(점선으로 된 원형)). 헤마톡실린 및 에오신 염색은 hPE-인큐베이션된 스캐폴드(도 6B.vii.-6B.xi.)가 대조군 및 매트리겔 스캐폴드와 비교하여 스캐폴드 재형성이 가장 많았다는 것을 보여주었다. 대조군 스캐폴드(도 6B.vi.)는 그의 고유의 섬유 방향의 재형성을 거의 보이지 않았으며, 또한 UHV의 바이오폴드 내강 밖(ablumen) 표면으로부터 스캐폴드로의 세포 이동이 가장 적었다(이태릭체 'l'로 나타냄). 매트리겔 인큐베이션된 스캐폴드에서는 hPE-스캐폴드와 비교하여 HUV의 내강 밖으로부터 세포 이동이 약간 더 적었다(도 6B.vii.- 6B.ix.); 대조군과 비교할 때, 매트리겔-인큐베이션된 스캐폴드에서는 또한 새로운 콜라겐 섬유 방향과 더 균일한 세포 분포를 보이는 hPE 인큐베이션된 스캐폴드보다 세포 분포가 덜 균일하고 스캐폴드 재형성은 더 적었다.
[도 7A-7E]는 동적 세포 배양 조건을 이용하여 인간 제정맥 스캐폴드(HUV)에서 혈관형성 네트워크 형성을 위한 실시양태를 예시한다. [도 7A 및 7B]의 개략도에 나타내는 바와 같이, 세관의 HUV 스캐폴드를 세포 접종 전 2시간 동안 태반 추출물에서 인큐베이션하고, 구조물을 표준 세포 배양 조건하에서 이중 관류 생물반응기에서 5일 동안 배양하였다. 세포는 스캐폴드 내강에 남아있고 이동하지 않았다(도 7C). 세포-코딩, 세관형성의 초기 단계는 산발적이었다(도 7D 및 7E).
본 개시를 더 상세하게 개시하기 전에, 본 개시는 기재된 특정 실시양태에 제한되지 않으며, 보통의 그런 변화가 물론 있을 수 있다고 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하기 위한 목적이고, 제한하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이에, 본문에서 달리 명백하게 지시하지 않는다면 하한 단위의 1/10까지 각각의 중간 값, 및 그 범위 내의 기타 언급된 또는 중간 값은 본 개시 내에 포함된다. 상기 더 작은 범위들의 상한 및 하한은 언급된 범위 내에 구체적으로 배제된 한계에 따라 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고 또한 본 개시 내에 포함된다. 언급된 범위가 한쪽 한계 또는 양쪽 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계의 한쪽 또는 양쪽을 제외하는 범위가 또한 본 개시에 포함된다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 기술적 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술의 통상의 기술자에 의해 보편적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재된 것과 유사하거나 등가의 모든 방법 및 재료가 또한 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 지금부터 기재된다.
참고에 포함된 본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 간행물이 인용된것과 관련된 방법 및/또는 재료를 개시하고 기재하는 참고로 본원에서 포함된다. 어떤 간행물은 출원일 이전의 그의 개시에 대해 인용되며, 본 개시가 앞선 개시에 의해 이러한 출판물보다 선행하는 자격이 주어지 않는다고 인정하는 것으로 해석해서는 안 된다. 게다가, 제공된 공개 일자는 실제 공개 일자와 상이할 수 있으므로 개별적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
본 개시를 읽은 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에서 기재되고 예시된 각각의 개별 실시양태는 본 개시의 범위 또는 취지를 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 실시양태의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 개별적인 구성요소 및 특징을 갖는다. 모든 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로, 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 개시의 실시양태는, 달리 명시되지 않는다면, 당업계 내에 있는 의학 기술, 생화학, 분자 생물학, 생물학, 약리학 등을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 명확히 언급된다.
명세서 및 첨부된 실시양태에서 사용되는 단수 형태 "하나의"("a", "an" 및 "the")는 본문에 달리 명확하게 지시되지 않는다면 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "하나의 세포"의 언급은 "복수의 세포"를 포함한다. 뒤에 오는 본 명세서 및 실시양태에서, 많은 용어에 대해 언급할 것이며, 이들은 다른 의도가 명백하지 않은 경우 하기 의미를 갖도록 정의될 것이다.
여러 가지 실시양태를 기재하기에 앞서, 하기 정의가 제공되며, 달리 명시되지 않는다면, 하기 정의가 사용되어야 한다.
정의
개시된 주제를 기재하는데에, 하기 용어는 하기에 개시된 정의에 따라서 사용될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "단백질"은 연속된 배열로 펩티드 결합을 통해 연결된 세 개 이상의 아미노산의 중합체를 나타낸다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체, 올리고펩티드 등을 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 핵산에 의해 코딩(coding)되고, 재조합 기술을 통해 생산된, (새와 같은 적합한 공급원으로부터 단리되고) 또는 합성된 상기에 정의된 폴리펩티드를 의도한다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 화학적으로 변형된 아미노산 또는 표지 리간드에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 아미노산을 포함하는 상기에 정의된 폴리펩티드를 의도한다.
용어 "폴리뉴클레오티드," "올리고뉴클레오티드," 및 "핵산 서열"은 본원에서 호환적으로 사용되며, 코딩 서열(적합한 조절 또는 제어 서열의 제어 하에 놓이는 때 시험관 내 또는 생체 내에서 폴리뉴클레오티드로 전사 및 번역되는 폴리뉴클레오티드(들) 또는 핵산 서열(들)); 제어 서열(예를 들어, 번역 개시 및 종료 코돈, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 전사 인자 결합 부위, 전사 종료 서열, 상류 및 하류 조절 도메인, 인핸서, 침묵 인자(silencer) 등); 및 조절 서열(전사 인자(들)이 결합하고 유전자의 프로모터 활성을 양성(유도)으로 또는 음성(억제)으로 변경하는 DNA 서열)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 기재된 용어에 의해서 길이 또는 합성적 기원에 대해 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자" 또는 "유전자들"은 전체 RNA, 전체 단백질, 또는 이러한 전체 RNA 또는 전체 단백질의 임의의 부분을 합성하기 위한 유전 정보를 코딩하는 핵산 서열(RNA 또는 DNA 두 가지 모두 포함)를 나타낸다. "유전자"는 전형적으로 염색체상 특정 위치를 차지하고 생물체 내에서 특징 또는 기질에 대해 유전적 지시를 포함하는 DNA 서열에 상응하는 유전적인 단위를 나타낸다. 용어 "유전자 산물"은 유전자에 의해 코딩되는 RNA 또는 단백질을 나타낸다.
용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 유익한 또는 바라는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 구체적으로, 유익한 또는 바라는 임상 결과는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화(예를 들어, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 확산의 실질적인 예방, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 검출 또는 미검출 여부의 관해(부분적인 또는 전체적인)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 또한 질환 및/또는 질환에 기인될 수 있는 부작용의 부분적인 또는 완전한 치유의 조건에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "예방적으로 치료하다" 또는 "예방적으로 치료하는"은 숙주에서 질환/병태 또는 그의 하나 이상의 증상을 완전하게, 실질적으로 또는 부분적으로 예방하는 것을 나타낸다. 유사하게, "병태의 개시의 지연"은 "예방적으로 치료하는"에 포함될 수 있으며, 병태에 잘 걸리는 환자에서 병태의 실제 개시 전에 시간을 증가시키는 행위를 나타낸다.
"투여"는 본 개시의 화합물을 피험체에 도입하는 것을 의미한다; 이는 또한 본 개시의 조성물을 피험체에게 제공하는 (예를 들어, 처방에 의해) 행위를 나타낸다.
용어 "생물체," "피험체," 또는 "숙주"는 치료를 필요로 하는 모든 살아있는 존재를 나타내며, 치료를 필요로 하는 인간, 포유동물(예를 들어, 고양이, 개, 말, 마우스, 랫트, 돼지, 수퇘지, 및 그 밖에 소), 새(예를 들어, 닭), 및 기타 모든 생물 종을 포함한다. 특히, 용어 "숙주"는 인간을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 숙주" 또는 "인간 피험체"는 일반적으로 인간 숙주를 나타내는데 사용된다. 본 개시에서 용어 "숙주"는 통상적으로 인간 숙주를 나타내며, 그래서 본 개시에서 단독으로 사용되는 경우, 본문에서 비인간 숙주를 나타내려는 의도를 명백하게 나타내지 않는다면 단어 "숙주"는 인간 숙주를 언급한다. 병태(들)에 "잘 걸리는" 숙주는 상기 하나 이상의 병태의 명백한 증상을 보이지 않지만, 유전적으로, 생리적으로, 또는 그외 하나 이상의 상기 병태로 발전할 위험이 있는 숙주로서 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드를 생산하는 구조 유전자가 겪는 과정을 기재한다. 발현은 전사와 번역의 조합이다. 발현은 일반적으로 폴리뉴클레오티드를 생산하는 핵산의 "발현"을 언급하지만, 또한 일반적으로 폴리뉴클레오티드의 "발현"을 언급하는데 적용될 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드가 해당 핵산의 발현을 통해 생산되고 있다는 것을 나타낸다.
"혈관형성"은 새로운 혈관의 성장을 수반하는 생리학적 과정이다. 혈관형성은 성장 및 발생, 상처 치유, 배아발생 등과 같은 생물학적 과정의 중요한 부분이다. 과도한 혈관형성은 병에 걸린 세포가 천연 혈관형성 억제제의 효과를 압도하는 비정상적인 양의 혈관형성의 성장인자를 생산할 때에 일어날 수 있다. 혈관형성의 성장 인자와 혈관형성 억제제의 생산 사이의 불균형은 혈관의 성장 또는 억제를 부적절하게 조절할 수 있다. 혈관형성-의존적 또는 관련된 질환은 새로운 혈관이 과도하거나 불충분하게 성장할 때 생긴다. 혈관형성 관련 질환은 암, 전암 조직, 종양, 심근 경색, 및 뇌졸중과 같은 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 과도한 혈관형성은 암, 당뇨성 실명, 노년기 황반변성, 류마티스성 관절염, 건선, 및 기타 70가지가 넘는 병태를 포함할 수 있다. 불충분한 혈관형성은 관상동맥 질환, 뇌졸중, 및 상처 치유의 지연을 포함할 수 있고, 또한, 본 개시에 더 상세하게 논의되는 조직 공학에 있어 인자이다.
본원에서 사용되는 용어 "조절하다(modulate)" 및/또는 "조절 인자(modulator)"는 일반적으로 세포/생물체에서 특정 기능 및/또는 특성을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진/활성화/유도/증가시키거나 방해/억제/감소시키는 행위를 나타낸다. 일부 경우에, 조절 인자는 그의 자연 상태에 비해, 또는 일반적으로 기대되는 활성의 평균 수준에 비해 어떤 활성 또는 기능을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 조절은 펩티드의 과발현 또는 발현부족을 일으키는 것을 포함하며(예를 들어, 펩티드의 발현을 상승조절 또는 하향 조절하는 작용을 함으로써), 또는 활성을 증가 및/또는 감소시키는 대상 펩티드와 직접적으로 상호작용할 수 있다. 조절은 또한 특정 생물학적 활성 또는 생물학적 현상을 증가 또는 감소시키는 것, 예를 들어 혈관형성 또는 혈관형성과 관련된 생물학적 현상을 포함한다.
본원에서 사용되는 "상승조절하다"는 단백질 또는 다른 유전자 산물의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 행위를 나타낸다. "하향조절"은 단백질 또는 다른 유전자 산물의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된 세포 또는 세포군"은 조직으로부터 절개되거나 조직 배양 기술에 의해 시험관 내에서 배양된 단리된 세포 또는 다수의 세포를 나타낸다. 용어 "세포 또는 세포군"은 상기에 기재된 단리된 세포를 나타낼 수 있거나 또한 동물 또는 인간 조직에서의 생체 내 세포를 나타낼 수 있다.
용어 "조직"은 일반적으로 생물학적 기능을 협력하여 수행하고/거나 생물학적 목적을 위해 역할을 하기 위해, 예를 들어 생물체 내에 조직의 전체 또는 부분을 형성하도록 조직된 세포군을 나타낸다(예를 들어, 결합조직, 내피조직). "조직"은 일반적으로 유사한 세포군, 또는 모두 동일한 유형의 세포군을 포함하지만, 조직은 또한 세포군이 대개 공통적인 목적을 위해 역할을 하는 경우 한 가지보다 많은 유형의 세포를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생체접합성"은 생물학적 물질 또는 시스템에 과도한 스트레스, 독성, 또는 부작용을 주지 않으면서 살아있는 생물학적 물질 및/또는 생물학적 시스템(예를 들어, 세포, 세포 구성요소, 살아있는 조직, 기관 등)과 공존할 수 있는 능력을 나타낸다.
용어 "바이오스캐폴드"는 살아있는 생물학적 물질(예를 들어 살아있는 세포)의 성장을 지원하는 충분히 구조적으로 안정된 임의의 생체적합성 기질(자연 유래, 또는 합성)을 나타낸다. 본 개시의 실시양태에서, 생체적합성 스캐폴드 재료는 자연 유래된 기질(예를 들어, 살아있는 생물체로부터 획득되지만(procured), 추가의 공정 및 처리를 받을 수 있고; 또는 자연 공급처로부터 유래된 재료로부터 생산됨), 예를 들어 탈세포화된 인간 제정맥 스캐폴드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 실시양태에서, 본 개시의 바이오스캐폴드는 살아있는 세포의 3차원 성장을 지원하기 위해서 3차원 구조(평면의 2차원 구조보다는)를 가진다.
본원에서 사용되는 용어 "생분해성"은 자연환경(예를 들어, 살아있는 생물체 또는 살아있는 배양물 내에)에서 시간이 흐르면서 용해되고, 약화되거나, 그 외 그의 구조 완전성을 분해하거나 잃고 그의 본래 구조 형태로 존재하기를 중단하는 재료를 나타낸다. 본 개시의 실시양태에서, 생분해성 재료는 숙주 생물체 내에서 시간이 흐르면서 용해되고 분해된다.
본원에서 사용되는 용어 "조작된"은 조작되는 대상이 인간에 의해 생성되고/거나 변경된다는 것을 나타낸다. 조작된 대상은 자연 유래 물질을 포함할 수 있지만 대상 그 자체는 인간의 개입 및 디자인에 의해 인간에 의해 어떤 방식으로 변경된다.
본원에서 사용되는 용어 "시험 화합물"은 살아있는 세포 또는 생물체에 영향을 줄 수 있는 펩티드, 펩티드모방체, 소분자, 핵산 서열 또는 기타 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "시험 화합물"은 생물학적 활성, 기능 또는 또 다른 화합물에 대한 반응에 대해 조절 효과를 갖는 것으로 의심되는 화학물질 또는 펩티드와 같은 화합물일 수 있다. 예를 들어, 본 개시에서, "시험 화합물"은 혈관형성 활성을 증가시키고, 혈관형성 활동을 감소시키고/거나, 상이한 혈관형성 조절 인자의 효과를 조절하는 것과 같이 혈관형성에 조절 효과를 가지는 것으로 의심되는 화합물일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "제거된" 또는 "실질적으로 제거된"은 물질 또는 화합물의 양이 또 다른 조성물과 분리된 것을 나타내지만, 잔여 조성물로부터 제거된 물질 모두가 완전히 없어 제거된 물질이 완전히 검출되지 않는 것을 요구하지 않는다. 예를 들어, 혈액이 조성물로부터 "제거된," 또는 "실질적으로 제거된 경우, 이것은 조성물 내에 혈액의 실질적인 비율이 제거되었지만 일부 혈액 또는 혈액 구성요소가 엄격한 스크리닝 과정에서 여전히 소량으로 검출될 수 있다는 것을 나타낸다(예를 들어, "실질적으로 제거된"은 조성물이 "제거된" 구성요소가 100% 없는 상태를 요구하지 않는다; 대신에 조성물 또는 물질은 "제거된" 구성요소의 약 99%, 약 95%, 또는 약 90% 없는 상태 또는 상기에 나타낸 대표적인 퍼센트 내에 어떤 퍼센트 또는 범위가 될 수 있다).
고찰
본 개시의 실시양태는 혈관형성을 유도하기 위한 방법 및 조성물 및 혈관형성을 조절하기 위한 방법 및 조성물, 및 혈관형성을 조성하기 위한 조성물의 제조 방법을 포함한다. 본 개시는 또한 혈관형성 조절 인자의 확인 방법 및 혈관형성 조절인자를 확인하기 위한 분석법을 포함한다. 본 개시의 실시양태는 혈관형성을 조절하기 위한 조성물을 전달하기 위한 방법 및 조성물을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 본 개시는 조직 구조물 및/또는 자연 조직에서 시험관 내 및/또는 생체 내 혈관 형성을 유도하고/거나 조절하는데 사용될 수 있는 태반 추출물 및 조직 구조물 및/또는 자연 조직 내 세포에 태반추출물의 전달하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 또한, 본 개시는 혈관형성을 조절하는 화합물을 확인하는 분석법에 사용될 수 있는 태반 추출물을 포함한다. 게다가, 본 개시는 혈관형성을 유도하는 생체 내 또는 시험관 내 세포군으로 추출물의 방출을 제어하기 위한 태반 추출물이 로딩된 전달 비히클의 조성물을 포함한다.
혈관형성은 위치 및 자극 두 가지 모두에 의존적인 복합적인 과정으로, 각 경우에 조절 분자의 복합적인 조합이 관련되어 상기 과정을 조절할 수 있다1 , 2. 혈관형성의 제어는 다양한 형성 기전으로 더 복합적이며, 그 중 가장 잘 이해되는 두 가지 기전은 중첩 및 발아이다3 , 4. 중첩은 기존 혈관의 내강으로 간질 세포 열이 삽입된 것을 특징으로 하며5 발아는 이전에 미세혈관이 없는 조직에서 혈관형성 자극에 대해 내피세포가 발아한 것을 특징으로 한다6. 많은 분자가 혈관형성을 조절하는 것으로 확인되었으며, 이들은 좀 더 연구되어야 할 것으로 보인다7. 이러한 혈관형성 유도 인자의 다양성으로 인해 혈관 발생의 연구, 약물 스크리닝 및 재생 의학 요법에 사용하기 위한 혈관형성 조절 인자를 지속적으로 연구 개발해왔다8.
혈관형성을 연구하기 위한 통상적인 모델은 동물 유래된 자극인자를 이용하거나 평가를 위한 살아있는 동물의 사용에 전적으로 의존하고 있다9. 생체 내 동물 연구는 인간 혈관의 형성과정에서 일어나는 생체분자 경로 및 기전의 복합성을 비교하기 위한 더 정확한 모델을 제공한다. 표준 생체 내 혈관형성 모델은 토끼 각막 신혈관화 분석, 생체 내/시험관 내 병아리 융모 요막 분석, 및 랫트 장간막 창 분석을 포함한다10. 가능한 경우, 시험관 내 혈관형성 모델은 복합적인 생물학적 현상을 더 잘 제어하기 위해 선택된다. 그러나 이것은 대개 제한된 수의 분자 종, 예를 들어 VEGF에 대한 연구에 제한된다. 더 복합적이거나 다인성 "혼합"이 충분한 혈관화를 촉진하기 위해 요구될 수 있는 경우, 상기 복합적인 케스케이드를 위한 단일 분자(또는 여러 개)를 이용하는 결과는 아마도 그 자체가 제한적일 수 있다.
시험관 내 혈관형성 모델의 경우, 마우스 유래된 기저막 기질(BMM: basement membrane matrix) 또는 '매트리겔' 분석이 바람직한 모델이 되어 왔는데, 그 이유는 생체 내의 복합적인 수준을 시험관 내 모델로 적용하고 결과가 생체 내 결과에 더 비슷한 것으로 보이기 때문이다. 그러나 이 모델이 엔젤브레스-홀름-스웜 마우스 육종 세포로부터 유래되었고, 많은 수의 동물의 희생을 요구되기 때문에 임상 용도에 적합하지 않다11. 다수의 시험관 내 인간-유래 조절 인자가 혈관형성 모델을 만드는데 사용되어 왔다. 지금까지 이들은 단일 조절 인자(FGF, TGF-β, VEGF)를 기초로 하며 천연 생체 내에 존재하는 다양한 사이토카인과 화학적 구배가 없어 왔다12. 동물 유래된 모델과 연관된 종간 차이13 , 14와 인간 재조합 단백질로부터 복합적인 단백질 제제를 유도하는 복합성이 주어지는 경우, 확실한 인간 유래된 접근법(근접한 생리학적 비율로 다수의 단백질을 더 복합적으로 혼합하는 것을 포함하여)은 기계적 연구, 혈관형성 약물의 스크리닝, 및 재생 의학 요법의 임상적 전환을 향상시킬 가능성에 큰 영향을 줄 것이다. 또한, 다양한 기전 및 형성 단계를 대표하는 혈관형성 과정을 조절할 수 있게 됨으로써 혈관화 과정에서 중요한 분자 및 분자 경로를 특성화하는 향상된 플랫폼을 제공하게 될 것이다.
본 개시는 시험관 내 및 생체 내에서 혈관형성을 유도하고 조절하는 방법을 제공한다. 시험관 내 및 생체 내 혈관형성을 유도하는 것 이외에도, 이 모델은 미세혈관 네트워크의 성숙 속도의 조절뿐 아니라 발아 및 중첩 혈관형성의 선택적인 모델링을 가능하게 한다. 생체 내에서 인간 태반 추출물(PE)은 투여된 콜라겐 기재의 바이오스캐폴드를 이용하여 섬유화를 제거하면서 모세혈관 형성을 크게 향상시킨다는 것을 보여 주었다.
본 개시는 복합적인 종류의, 인간 태반에서 유래된, 조정 가능한, 완전한-인간 생체분자를 이용하여 시험관 내 및 생체 내에서 혈관형성을 유도하고 조절하는 방법을 기재한다. 접근법은 인간 태반으로부터 단리된 활성의 인간 생체분자의 복합체를 얻기 위해 지정된 분별법 및 분리 기술을 이용한다. 시험관 내 혈관형성 및 생체 내 형관형성을 유도하고 조절하는 것 이외에도, 본 개시의 방법 및 조성물은 미세혈관 네트워크 성숙 속도의 조절뿐만 아니라 발아 및 중첩 혈관형성의 선택적인 모델링을 가능하게 한다. 실시양태에서, 본 개시의 방법 및 화합물은 또한 중합체 및 생체 외 유래된 조직 스캐폴드 두 가지 모두에서 혈관형성을 유도하고 조절한다. 이들 방법은 미세혈관 네트워크 성숙 속도를 조절할 수 있다. 생체 내에서, 본 개시의 인간 태반 추출물은 투여된 콜라겐 기재 바이오스캐폴드를 이용하여 섬유화를 제거하면서 모세혈관 형성을 크게 향상시킨다는 것을 보여 주었다.
혈관형성에 영향을 주는 성장 인자의 전달을 지연시키는 것이 또한 조직 공학 접근법을 위해 혈관화를 촉진하는 혈관형성을 성공적으로 조절하기 위한 과제이다. 본 개시는 또한 시험관 내 및 생체 내 두 가지 모두에서 혈관형성을 조절하기 위한 조성물의 제어 방출을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
인간 태반 추출물
본 개시는 인간 태반 추출물(placental extract(PE)를 포함하는, 혈관형성의 유도 및/또는 조절을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시의 실시양태에서, PE는 인간 태반으로부터 시료를 얻는 단계, 태반 시료로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물(조 PE)을 얻는 단계, 태반 조추출물을 요소 또는 다른 단백질 가용화제와 혼합하여 추출물 내에 존재하는 단백질을 가용화하는 단계, 조추출물로부터 잔여 고체를 제거하는 단계; 및 요소-태반 추출물 혼합물을 투석하여 혼합물로부터 실질적인 양의 요소를 제거하여 인간 태반 추출물을 얻는 단계에 의해 제조된다.
실시양태에서, 인간 PE의 제조과정은 약 -86℃와 약 5℃ 사이의 온도에서 수행된다. 실시양태에서, 인간 태반 추출물은 약 4℃ 이하에서 제조된다.
실시양태에서, 태반 시료로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물을 제조하는 과정은 인간 태반 시료를 완충액으로 균질화하는 단계, 균질화된 시료를 원심분리하는 단계 및 혈액을 포함하는 상층액을 버리는 단계를 포함한다. 상기 과정은 혈액의 실질적으로 전부가 시료로부터 제거될 때까지(예를 들어, 시료에 혈액의 약 99%가 없는, 혈액의 약 95%가 없는, 혈액의 약 90%가 없는 등) 여러 번(예를 들어, 2, 3, 또는 그 이상) 반복하여 조 PE를 얻을 수 있다. 한 실시양태에서, 완충액은 염화나트륨 용액(NaCl)이다.
실시양태에서, 태반 조추출물을 단백질 가용화제와 혼합하여 태반 조추출물 내의 단백질을 가용화한다. 실시양태에서, 단백질 가용화제는 단백질을 영구적으로 파괴하거나 그외 영구적으로 불활성화하지 않으면서 가용화(예를 들어, 변성)할 수 있는 임의의 화합물 또는 화합물의 혼합물일 수 있다(예를 들어, 가용화는 단백질을 가역적으로 변성하여, 예를 들어 단백질 가용화제가 제거될 경우 단백질은 다시 폴딩할 수 있다). 실시양태에서, 단백질 가용화제는 요소, 구아니딘-HCl, 또는 기타 유사한 화합물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 실시양태에서, 단백질 가용화제는 요소이고, 조추출물은 조추출물을 요소와 균질화함으로써 요소 조성물과 혼합된다. 실시양태에서, 요소는 약 12 내지 약 36시간 동안 조추출물과 혼합된다. 실시양태에서, 요소는 조출물과 약 24시간 동안 혼합된다. 실시양태에서, 요소 용액은 농도가 약 0.5M 이상인 요소 완충액이다. 실시양태에서, 요소는 농도가 약 2M 이상, 약 4M 이상, 최대 약 15M이 될 수 있다. 실시양태에서, 요소 용액은 농도가 약 0.5M 내지 약 15M이 될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단백질 가용화제는 농도가 약 0.5M 내지 약 15M인 구아니딘-HCl이다. 실시양태에서, 구아니딘-HCL은 농도가 약 6M이다. 하기에 기재된 방법 및 조성물은 가용화제로서 요소를 이용하여 기재되지만, 다른 적합한 가용화제, 예를 들어 상기에 논의된 것(그러나 이에 제한되지는 않음)은 요소를 대체할 수 있는 것으로 이해해야 한다.
실시양태에서, 요소, 또는 다른 단백질 가용화제와 혼합한 후, 고체는 가용화된 단백질-조추출물 혼합물(예를 들어, 요소-조추출물 혼합물)로부터 제거된다. 실시양태에서, 고체는 PE 혼합물을 원심분리하고 펠렛(고체 포함)을 버림으로써 제거된다. 이 단계는 여러 번 반복될 수 있다. 고체를 제거한 후, PE 혼합물(예를 들어, 상층액)은 투석하여 태반 추출물로부터 요소, 또는 다른 단백질 가용화제를 제거한다. 실시양태에서, 투석액은 TBS이다. 실시양태에서, 투석액은 기간(예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간 등)에 따라 교환하고 투석은 여러 번(예를 들어, 2, 3, 4회 등) 반복하여 PE로부터 실질적으로 모든 요소를 제거한다(예를 들어, 태반 추출물에 요소가 약 99% 없는, 요소가 약 95% 없는 등). 실시양태에서, PE를 다시 원심분리하여 잔여 고체를 제거한다(예를 들어, 중합된 단백질 등). 실시양태에서, 잔여 PE는 투명 내지 분홍색을 띠는 점성 물질이다. 본 개시의 태반 추출물을 제조하는 본 개시의 방법의 실시양태에 대한 추가의 상세 내용은 하기 실시예에서 찾아볼 수 있다.
따라서, 본 개시의 실시양태는 또한 본 개시의 방법에 의해 제조된 PE를 포함한다. 실시양태에서, 본 개시는 인간 태반으로부터 얻은 시료로부터 혈액을 제거하는 단계; 태반 조추출물을 단백질 가용화제(예를 들어 요소, 구아니딘-HCl 등 포함하나 이에 제한되지 않음)와 혼합하여 조추출물 내에 단백질을 가용화하는 단계; 가용화된 단백질- PE 혼합물로부터 고체 물질을 분리하는 단계; 및 PE 혼합물을 투석하여 혼합물로부터 단백질 가용화제(예를 들어, 요소)를 제거하여 인간 PE를 얻는 단계에 의해 제조된 PE를 포함한다.
따라서, 본 개시는 혈액 및 고체가 실질적으로 제거되고 태반 시료에 존재했던 태반 단백질(일부 또는 전부)을 함유하는 인간 태반으로부터 (예를 들어, 인간 태반 시료로부터) 얻은 추출물을 포함하는 인간 태반 추출물을 포함한다. 실시양태에서, 태반 단백질은 사이토카인 및 성장 인자를 포함한다.
본 개시의 PE의 분석은 PE가 많은 사이토카인 및 성장 인자를 포함한 많은 단백질을 포함한다는 것을 보여준다. 본 개시의 태반 추출물의 실시양태에서, 추출물은 20가지 이상의 상이한 사이토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 최대 40가지 상이한 사이토카인을 포함한다. 다른 실시양태는 50가지 이상의 사이토카인을 포함한다. 본 개시의 PE에 존재할 수 있는 사이토카인의 일부는 하기 실시예에 열거된 것들을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 PE에 존재할 수 있는 사이토카인의 일부는 안지오제닌, Acrp30Ag, IGFBP-1, NAP-2, 및 Fas/TNFGSF6, 및 RANTES, 및 MIF를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 태반 추출물에 존재하는 사이토카인 및 성장 인자 및 기타 태반 화합물은 내피세포 배양물, 조직, 조직 구조물, 조작된 바이오스캐폴드, 등에서 혈관형성을 유도할 수 있다. 본 개시의 태반 추출물은 시험관 내 및 생체 내에서 혈관형성을 유도할 수 있다. 본 개시의 태반 추출물은 내피세포의 성장을 촉진할 수 있다. 실시양태에서, 본 개시의 인간 PE는 혈관형성을 조절할 수 있다. 혈관형성을 유도하기 위해 사용되는 다른 통상의 화합물, 예를 들어 BMM(단일 정제된 혈관형성 조절 인자(예를 들어 정제된 VEGF-알파 또는 SDF-1) 및 정제된 피브린을 포함하는 화합물)과 비교하여, 본 개시의 PE는 BMM에 비해 내피세포의 혈관형성의 성장(예를 들어, 세관 및 네트워크 형성)의 증가 및 근섬유 모세포의 혈관형성-유형 성장(예를 들어, 세관 형성)의 감소를 촉진한다. 본 개시의 PE는 또한 BMM과 비교하여 다양한 세포주(예를 들어, 줄기세포, 평활근 세포 등)에 대해 상이한 성장 및/또는 분화 양상을 촉진하여, 상기 세포의 성장/분화 양상은 BMM을 이용한 성장과는 구별된다.
본 개시의 PE는 또한 PE가 없이 배양된 내피세포에 비해 내피세포 내 여러 유전자를 상승조절할 수 있다. 일부 상기 유전자는 혈관형성 관련 유전자, 세포 외 기질 재형성 유전자, 및 혈관 발생 유전자를 포함한다. 일부 혈관형성 관련 유전자는 ANGPTL4, CXCL3, 인간 성장 인자(HGF), ANGPT2, PGF, TYMP, VEGFA, HIF1A, 및 FGF1을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 태반 추출물에 의해 유도될 수 있는 일부 세포 외 기질 재형성 유전자는 MMP2, MMP9, COL4A3, 및 LAMA5를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 혈관 발생 유전자는 CDH2, HAND2, LECT1, 및 MDK를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
혈관형성의 조절 방법
본 개시는 또한 세포 배양물 내에서 혈관형성을 유도하는 방법을 포함하며, 여기서 방법은 본 개시의 인간 태반 추출물의 존재하에서 내피세포를 배양하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 세포 배양물은 혈액 및 고체를 제거하기 위해 처리되고, 요소와 혼합되고, 요소를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻은 본 개시의 태반 추출물의 존재하에서 배양되며, 상기에서 태반 추출물은 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함한다. 실시양태에서, 내피세포는 인간 내피세포이다; 또 다른 실시양태에서, 세포는 인간 제정맥 내피세포(HUVEC: human umbilical vein endothelial cell)이다. 세포 배양물에서 혈관형성을 유도하는 방법의 실시양태에서, 세포는 약 40,000 세포/cm2 이상의 밀도로 접종된다. 실시양태에서, 세포는 약 80,000 세포s/cm2 이상의 밀도로 접종된다. 실시양태에서, 세포 배양물은 성장 배지 및 본 개시의 태반 추출물을 포함하는 플레이트 상에서 배양될 수 있다.
본 개시는 또한 생체 내에서 생체재료의 혈관화를 유도하는 방법으로서, 본 개시의 인간 태반 추출물을 포함하는 조성물 중에 생체재료를 인큐베이션하는 단계 및 숙주에 생체재료를 이식하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 실시양태에서, 생체재료는 자연 유래된 재료 및/또는 세포를 포함한다. 실시양태에서, 생체재료는 인간 유래된 기질 재료를 포함하는 조작된 바이오스캐폴드를 포함한다. 실시양태에서, 조작된 바이오스캐폴드는 인간 제정맥 스캐폴드를 포함한다. 실시양태에서, 인간 제정맥 스캐폴드는 탈세포화된다. 일부 실시양태에서, 생체재료는 내피세포, 예를 들어 인간 내피세포(예를 들어, HUVEC)(그러나 이에 제한되지 않음)로 접종된다. 본 개시의 실시양태에서, 생체재료는 HUVEC으로 접종된 인간 제정맥 스캐폴드를 포함하는 조작된 스캐폴딩 재료를 포함한다. 일부 실시양태에서, HUVEC은 약 40,000 세포/cm2 이상의 세포 밀도로 바이오스캐폴드 상에 접종된다. 실시양태에서, HUVEC은 약 80,000 세포/cm2 이상의 세포 밀도로 접종된다. 실시양태에서, 생체재료는 약 2시간 이상 태반 추출물 중에서 인큐베이션된다.
생체재료 및 조작된 바이오스캐폴드의 혈관화
본 개시는 또한 조작된 생체재료, 자연 유래된 생체재료, 및 숙주에 이식되는 기타 생체재료를 포함하는(그러나 이에 제한되지 않는) 생체재료에 혈관화 방법을 포함한다. 생체재료의 혈관화 이외에도, 본 개시의 태반 추출물로 생체재료의 처리는 또한 생체 수용성에 도움을 주며, 염증을 감소시키고, 거부 및 흉터형성을 감소시키기 등을 위해 생체 내에서 사용하기 위한 생체재료를 전처리하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시의 태반 추출물 및 본 개시의 태반 추출물을 포함하는 조성물은 상기 이식의 결과를 향상시키기 위해 많은 생체재료를 "투여"하는데 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 구체적으로, 본 개시의 인간 태반 추출물을 포함하는 조성물 중에 인큐베이션된 인간 유래된 기질 재료를 포함하는 조작된 생체재료, 예를 들어 이식가능한, 조작된 바이오스캐폴드를 포함한다. 본 개시의 바이오스캐폴드는 포유동물, 예를 들어 인간에 이식될 수 있다. 본 개시의 바이오스캐폴드는 숙주에 이식하기에 적합한 임의의 생체재료를 포함할 수 있다. 본 개시에 사용하기 위한 바이오스캐폴드의 예는 조직, 기질 재료, 많은 자연 유래된 생체재료 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 실시양태에서, 바이오스캐폴드는 2D 또는 3D 바이오스캐폴드이다. 실시양태에서, 바이오스캐폴드는 인간 유래된 기질 재료를 포함한다. 실시양태에서, 바이오스캐폴드는 탈세포화된 인간 제정맥 스캐폴드를 포함한다. 실시양태에서, 바이오스캐폴드는 세포로 접종되며, 상기 세포는 인간 세포, 인간 내피세포(예를 들어, 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)), 줄기세포, 기타 다분화능 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 본 개시의 태반 추출물 중에서 인큐베이션된 본 개시의 바이오스캐폴드는 혈관형성 유도 화합물 BMM 또는 대조군 화합물과 인큐베이션된 바이오스캐폴드에 비해 더 많은 혈관화(예를 들어, 혈관형성)과 더 적은 섬유화를 유도한다. 본 개시의 태반 추출물 중에서 인큐베이션된 본 개시의 바이오스캐폴드는 또한 BMM 또는 대조군 중에 인큐베이션된 바이오스캐폴드와 반대로 면역 억제 및 프로-혈관형성 양성 대식세포(예를 들어, CD205(M2)) vs 프로-염증 양성 대식세포, 예를 들어, (CD86(M1))의 더 높은 비율을 보였다.
혈관형성 스크리닝 분석법
본 개시의 태반 추출물은 세포 배양물에서 혈관형성을 유도하기 때문에, 혈관형성 조절 인자를 확인하고 스크리닝하기 좋은 분석법을 제공한다. 따라서, 본 개시는 또한 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법을 포함한다.
실시양태에서, 방법은 본 개시의 인간 태반 추출물을 포함하는 화합물의 존재하에서 인간 내피세포 배양물을 배양하는 단계 및 인간 내피세포 배양물을 시험 화합물과 접촉하는 단계를 포함한다. 태반 추출물은 세포 배양물에서 혈관형성을 유도하기 때문에, 혈관형성이 예상한 것보다 더 적거나 많은 경우, 시험 화합물은 혈관형성 조절 인자로서 확인될 수 있다. 따라서, 방법은 또한 배양물에서 혈관형성 양을 측정하는 단계 및 세포 배양물에서 혈관형성 양이 시험 화합물 없이 배양된 배양물에서의 혈관형성 양보다 더 많거나 더 적을 경우 시험 화합물을 혈관형성 조절 인자로서 확인하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 시험 화합물 없이 배양된 배양물에 비해 혈관형성 양에 있어 증가는 시험 화합물이 혈관형성을 유도한다는 것을 나타낸다. 시험 화합물 없이 배양된 배양물에 비해 혈관형성 양에 있어 감소는 시험 화합물이 혈관형성을 억제한다는 것을 나타낸다. 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 본 개시의 방법에 따라 화합물 트롬보스폰딘-1(TSP-1)을 스크리닝하여 화합물을 혈관형성의 억제제로서 확인하였다. 본 개시는 또한 본 개시의 인간 태반 추출물의 존재하에서 배양된 내피세포 배양물을 포함하는, 혈관형성 조절 인자를 확인하는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법을 제공한다. 본 개시의 분석법은 혈관형성 조절 인자를 확인하는 본 개시의 방법과 함께 이용될 수 있다.
본 개시의 시험 및 방법과 관련한 추가의 상세 내용은 하기 실시예에 제공된다. 하기의 구체적인 실시예는 단지 예시이며, 어떤 경우에서든 개시의 나머지 부분을 제한하는 것이 아닌 것으로 해석해야 한다. 추가의 노력 없이도, 당업자는 본원의 기재를 기본으로 하여 본 개시를 최대한으로 이용할 수 있을 것으로 생각된다. 본원에서 인용된 모든 간행물은 이로써 그 전문으로 참고에 포함된다.
본 개시의 실시양태, 특히 임의의 "바람직한" 실시양태는 단지 개시의 원리를 명백하게 이해하기 위해 개시된, 단지 실행되기 가능한 예라는 것이 강조되어야 한다. 본 개시의 취지 및 원리를 실질적으로 벗어나지 않으면서 상기에 기재된 본 개시의 실시양태(들)은 많은 변이 및 변형이 만들어질 수 있다. 상기 모든 변형 및 변이는 본원에서 본 개시의 범위 내에 포함하고, 하기 실시양태에 의해 보호하고자 한다.
하기 실시예는 당업자에게 본 방법을 수행하고 본원에 개시된 조성물 및 화합물을 이용하는 방법에 대해 완전하게 개시 및 기재하고자 제시한다. 수와 관련하여(예를 들어, 양, 온도 등) 정확도를 보장하기 위해 노력하였으나, 약간의 오차 및 편차에 대해 설명해야 한다. 달리 명시되지 않는다면, 부는 중량부이고, 온도는 ℃이고, 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다. 표준 온도 및 압력은 20℃, 1 기압으로 정의된다.
비율, 농도, 양, 및 기타 숫자 데이터는 본원에서 범위 형식으로 표현될 수 있다는 것에 주의해야 한다. 이러한 범위 형식은 편의상 간결하게 하기 위해 사용되며, 따라서, 범위의 한계로서 명확하게 나열된 수치를 포함할 뿐 아니라, 모든 개별 수치 또는 그 범위 내에 포함된 부분(sub) 범위가 마치 수치 및 부분 범위가 명확하게 열거된 것처럼 포함되도록 융통성 있게 해석해야 하는 것으로 이해해야 한다. 예시로서, "약 0.1% 내지 약 5%"의 농도 범위는 약 0.1 wt% 내지 약 5 wt%의 명확하게 열거된 농도뿐 아니라, 지시된 범위 내의 각각의 농도(예를 들어, 1%, 2%, 3%, 및 4%) 및 부분 범위(예를 들어, 0.5%, 1.1%, 2.2%, 3.3%, 및 4.4%)를 포함하는 것으로 해석해야 한다. 실시양태에서, 용어 "약"은 수치의 유효 숫자에 따라 전통적인 반올림을 포함할 수 있다.
실시예
이제까지 본 개시의 실시양태를 일반적으로 기재하였으며, 하기 실시예는 본 개시의 일부 추가적인 실시양태를 기재한다. 본 개시의 실시양태는 하기 실시예 및 해당 본문 및 도면과 관련하여 기재되지만, 이러한 기재는 본 개시의 실시양태를 제한하려는 의도는 아니다. 반면, 본 개시의 실시양태의 취지 및 범위 내에 포함되는 모든 대체물, 변형 및 등가물을 포함하고자 한다.
실시예 1
태반 유래된 추출물을 이용하여 생체 외 유래된 바이오스캐폴드에서 혈관형성의 유도 및 조절
도입
본 실시예는 복합적인 인간 태반 추출물(PE)을 이용한 혈관화의 유도 방법을 기재한다. PE는 인간 태반에서 유래되며 2D 및 3D 시험관 내 모델에서뿐 아니라 생체조작된 조직 이식체 내의 생체 내에서 혈관형성을 유도할 수 있다. 본 실시예는 또한 태반 추출물을 이용하여 현재 시험관 내 모델에 비해 감수성이 증가된 혈관형성 억제 단백질로서 트롬보스폰딘-1을 효과적으로 스크리닝하는 것을 기재한다. 특히, 본 모델은 혈관 형성의 속도 및 유형(중첩 vs. 발아)에 대한 조절을 가능하게 하며 통상의 접근법에 비해 많은 이점뿐 아니라 재생 의학 및 약학 분야에 폭넓은 적용을 제시한다.
조직 내에서 물질 전달의 한계는 효과적인 생체재료를 제조하는데 하나의 장애가 된다. 인간 바이오스캐폴드 내에서 세포 이동을 향상시켜 이러한 장애를 일시적으로 극복할 수 있다 하더라도, 효과적인 혈관 구조의 생성은 두껍고, 세포 밀집된 재료에 영양을 장기간 전달하는 중요한 목표가 여전히 남아 있다. 성인에서, 새로운 혈관은 궁극적으로 영양이 풍부한 혈관 네트워크를 형성하는 혈관형성의 생리학적 과정을 통해 주로 생성된다47. 본 실시예는 혈관형성이 인간 제정맥(HUV) 혈관 이식체에서 유도될 수 있으며 장기간 영양 전달 시스템을 가져올 수 있다는 것을 증명하였다.
혈관형성 조절 인자를 통하여 조작된 기관의 성공적인 혈관화 및 경색 조직의 생체 내 복구는 성공적인 제생 의학 요법을 임상으로 전달하는 주된 장애가 되어 왔다. 직접적인 세포 접종(단일 및 공동배양), 줄기세포, 및 인간-유래 조절 인자/성장 인자의 조합을 포함하는 여러 가지 다양한 접근법이 혈관형성을 개시하고 더 큰 혈관 형성을 유도하는데 동원되었다. 지금까지, 전형적으로 비인간 동물 화합물을 이용하는 시험관 내 접근법을 임상으로 전환하는 데 거의 성공을 거두지 못하였다.
본 분야의 중요한 쟁점은 가장 보편적/성공적인 접근법(매트리겔 또는 기저막 기질)이 엔젤브레스-홀름-스웜 육종 세포로부터 유래되며, 이로써 인간 요법에 부적절하다는 것이다. 따라서, 시험관 내 및 생체 내 시스템 두 가지 모두에서 혈관 형성을 활발하게 촉진하는 인간 기반 재료를 이용하는 접근법 또는 기전은 상당한 영향력을 가질 것이다. 본 실시예는 2D 및 3D 시험관 내 모델에서뿐 아니라 생체조작된 조직 이식체 내에서 혈관형성을 유도할 수 있는 인간 태반 추출물(hPE)을 제공한다. PE는 활성의 인간 생체분자의 복합체이며, 본 실시예는 생체 외 유래된 인간 제정맥 혈관 이식체에서 생체 내 및 시험관 내 혈관형성을 유도하는 것 이외에, 이 모델이 혈관형성의 속도 및 단계를 조절할 수 있다는 것을 증명한다. 본 실시예는 또한 PE가 투여된 콜라겐 기재 바이오스캐폴드를 이용하여 섬유화를 감소시키면서 모세혈관 형성을 향상시킨다는 것을 증명한다.
방법
태반 추출물 유도. 만삭 태반을 플로리다 대학병원(UF Health Shands Hospital (Gainesville, FL))에서 출산 12시간 내에 수집하였다. 제대 및 태아막을 제거하고 태반을 2 cm 큐브로 절개하여 냉동하였다. -1℃/분의 속도로 -86℃까지 점진적으로 동결하고 12시간 후에, 태반 큐브를 4℃로 유지된 냉각실로 옮겨 나머지 과정을 완료하였다. 4℃에서, 조직 100 g을 150 mL 3.4 M NaCl 냉각 완충액(1 L 증류수 중에 198.5 g NaCl, 12.5 ml 2M 트리스, 1.5 g EDTA, 및 0.25 g NEM)과 혼합하였다. NaCl 완충액/조직 혼합물을 티슈텍 호모게나이저(Tissuetek Homogenizer)를 이용하여 3200 RPM에서 페이스트로 균질화한 후, 7000 RPM에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상기 NaCl 세척 과정을 추가 2회 반복하고, 매번 상층액을 버려 혈액을 제거하였다.
다음, 펠렛을 100 mL의 4M 요소 완충액(1 L 증류수 중에 240 g 요소, 6 g 트리스 염기, 및 9 g NaCl)에서 균질화하고, 자석 교반기에서 24시간 동안 교반한 후, 14000 RPM에서 20분간 원심분리하였다(Sorvall RC6+ Centrifuge, Thermo Scientific, NC, USA). 상층액을 제거하고 멸균을 위한 2.5 ml 클로로포름 및 1L의 TBS(1L 증류수 중에 6g 트리스 염기 및 9g NaCl) 내에 놓인 8000 MW 투석관(Spectrum Laboratories, Inc., CA, USA)을 이용하여 투석하였다. 완충액을 2시간 간격으로 신선한 TBS로 4회 이상 교체하였다. 최종적으로, 투석관의 내용물을 3000 RPM에서 15분간 원심분리(Allegra X-12R Centrifuge, Beckman Coulter, Inc., CA, USA)하여 중합된 단백질을 제거하고, 상층액(분홍빛 점성 용해액)을 수집하고 사용할 때까지 -86℃에서 보관하였다.
생체분자 조성물 분석. 레이바이오테크, 인코포레이티드(Ray Biotech, Inc)(Human Cytokine Antibody Array C Series 1000, Inc, GA, USA)의 샌드위치 면역분석 배열을 이용하여 상대적인 사이토카인 수준을 측정하였다. 화학발광은 포토/애널리스트 루미나리fx 워크스테이션(Foto/Analyst Luminaryfx Workstation)(Fotodyne Incorporated, WI, USA)를 이용하여 검출하였고 신호 세기는 토탈랩(TotalLab) 100 소프트웨어(Nonlinear Dynamics, Ltd, UK)를 이용하여 측정하였다. 기저막 생체분자의 상대 존재비는 오비트랩 벨로스 프로(Orbitrap Velos Pro) (ThermoFisher, Waltham, MA)에 접속된 워터스 나노어퀴티 HPEC(NanoAcquity HPEC) (Waters, Milford, MA) 시스템이 구비된 나노 LC/MS/MS를 이용하는 MS바이오웍스(MSBioworks) (Ann Arbor, MI)로 수행하였다. 단백질은 마스코트(Mascot) 데이터베이스 검색 엔진(Boston, MA)를 이용하여 1차 서열 데이터 베이스로부터 확인하였다.
hPL -유도된 혈관형성의 네트워크로부터 세포의 RT- PCR 분석. 상대적인 혈관형성의 유전자 발현은 384-웰의 RT2 인간 혈관형성 RT2 프로파일러 PCR 어레이(RT2 Human Angiogenesis RT2 Profiler PCR Arrays)(PAHS-024A, Quiagen, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. EC를 아큐타아제(Accutase)(Innovative Cell Technologies, San Diego, CA)를 이용하여 배양 플레이트로부터 떼어내고 100㎕의 RNA레이터(RNAlater)에 즉시 보관하였다. RNA를 RN이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)(Qiagen, CA, USA)를 이용하여 추출하고, 게놈 DNA를 RN아제-프리 DN아제 키트(RNase-Free DNase kit)(Quiagen, CA, USA)를 이용하여 절단하였다. 정제된 RNA를 42℃에서 15분간 인큐베이션 후 반응을 정지시키기 위해 95℃에서 5분간 인큐베이션하는 RT2퍼스트 스트랜드 키트(RT2First Strand Kit)(SA Biosciences, TX, USA)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 다음, cDNA를 RT2 SYBR 그린 마스터믹스(RT2 SYBR Green Mastermix)(SA Biosciences, TX, USA)와 혼합하고 384-웰 인간 혈관형성 PCR 어레이에 로딩하였다. 바이로 라드(Bio Rad) CFX384 리얼-타임 시스템(Real-Time System)(Bio-Rad, CA, USA)을 이용하여, 로딩된 배열 플레이트를 95℃에서 10분 동안 변성화 사이클, 60℃에서 30초 어닐링/신장 사이클을 40회 거치고, 최종적으로 용융 곡선을 초당 ℃ 속도로 60℃에서 95℃로 기울기를 만들어 얻었다. 데이터를 ΔΔCt 방법 및 RT2 프로파일러 PCR 어레이 데이터 어낼리시스 템플리트(RT2 Profiler PCR Array Data Analysis Template) v4.0 소프트웨어 패키지(Quiagen, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
인간 제정맥 내피세포 단리 및 근섬유 모세포 세포 배양. 내피세포는 인산 완충 식염수 내의 소 I형 콜라게나아제 1 mg/ml 용액(Gibco, Invitrogen, NY, USA)을 이용하여 혈관 벽으로부터 떼어낸 인간 제정맥(플로리다 대학병원에서 수집)에서 유래되었다. 1차 유래된 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)를 모든 실험에 1 내지 3회 계대 사이에서 사용하였다. 증식을 위해, 세포를 완전 바스큐라이프 기본 배지(VascuLife VEGF Medium Complete Kit, Lifeline, MD, USA)를 이용하여 배양하였다. 혈관형성 실험을 위해, 내피세포 배지를 500 mL에 25 ml 글루타민, 0.5 ml 히드로코르티손, 0.5 ml 아스코르브산, 10 ml FBS, 및 1.25 ㎕ bFGF를 포함한 바스큐리아프 기본 배지(VascuLife VEGF Medium Complete Kit, Lifeline, MD, USA)를 이용하여 제조하였다. 인간 근섬유 모세포(CRL 2854)는 5 내지 10회 계대 사이에서 사용하였으며(ATCC, Manasses, VA) 10% FBS 보충된 낮은 글루코스 DMEM을 사용하여 배양하였다.
태반 추출물- 유래된 혈관형성 분석법의 준비. 달리 언급되지 않는다면, 32㎕ 태반 추출물을 해동시켜 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅 하였다. 오비탈 쉐이커를 이용하여 30 RPM에서 1분 동안 추출물을 각 웰의 바닥 위에 고르게 코팅하였다. 이어서, 코팅된 플레이트를 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 그리고 나서, HUVEC을 20000 세포/cm2, 40000 세포/cm2, 또는 80000 세포/cm2로 직접 피펫팅하여 플레이팅하였다. 1일, 3일, 및 5일을 포함하여 여러 시점을 각 농도에서 조사하였다. 트롬보스폰딘-1을 내피세포 배지로 희석된 최종 농도 0, 5, 10, 20, 및 35 μg/㎕를 이용하여 혈관형성 억제 약물로서 시험하였다.
혈관형성 네트워크의 형태 특성화. 내피세포 배양 배지로 2 μg/mL 칼세인 AM(Invitrogen-Life Technologies, NY, USA)의 농도로 염색한 후 네트워크 형성을 분석하였다. 암실에서, 염색된 세포를 37℃, 5% CO2에서 30분간 인큐베이션한 후 차이스 액시오버트 200(Zeiss Axiovert 200) 도립 형광 현미경(Zeiss, Thornwood, NY)을 이용하여 이미지를 얻었다. 이미지J(ImageJ) 1.45s(NIH, Bethesda, MD)를 이용하여 이미지를 분석하여 세관 길이, 세관 너비, 분기점, 및 다른 섬유주 특성화를 결정하였다. 분기점을 분지가 만나거나 세관이 발아하는 모든 결절이 있는 자리에 수동 지정하고, 세관 길이를 분기점에서 연결된 분기점까지의 곡선 길이를 측정하여 평가하였다. 세관 너비는 세관당 다른 세 구역, 시작과 끝으로부터 각각 10μm의 두 구역 및 곡선 길이의 중앙에 한 구역에서 측정하였다. 도달 영역 퍼센트는 이미지J 함수 "binary>>convert to mask"를 이용하여 이미지를 처리한 후 "평균"을 측정하여 결정하였다. TSP-1 실험에서, 최종 값은 투여하지 않은 시료에 정규화하고 픽셀 값의 전체 계수에 상대적으로 "1" 값의 비율로서 계산하고 "도달 영역 %"으로 나타내었다.
인간 제정맥 스캐폴드 유도 및 태반 추출물 인큐베이션 . 태반을 플로리다 대학 병원에서 수집하고 HUV를 이전에 기재된 바와 같이32 자동화된 방법을 이용하여 절개하였다. 절개된 HUV 시료를 용매/조직 질량 20:1(w:v)로 1% SDS(Thermo Scientific, Rockford, IL) 용액 중에서 탈세포화하였다. 시료를 오비탈 쉐이커 플레이트 상에 100 rpm에서 24시간 동안 탈세포화한 후 PBS로 세척한 후 37℃에서 PBS 중의 70 U/mL DN아제 I 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 중에서 밤새 인큐베이션하였다. 시료를 0.2% 과산화아세트산/4% 에탄올(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 용액을 이용하여 2시간 동안 최종 멸균하고 마지막으로 PBS를 이용하여 pH 평형을 맞추었다(7.4). 탈세포화 후에, 스캐폴드를 1.5 cm x 1.5 cm x 0.075 cm 시트로 절단하여 - 85℃로 미리 동결시킨 후 밀락 벤치 탑 매니폴드 동결 건조기(Millrock bench top manifold freeze dryer)(Kingston, NY)를 이용하여 10 mT 진공 하에 -85℃에서 24시간 동안 동결건조하였다. 스캐폴드를 세포 접종 바로 직전 2시간 동안 hPE, 매트리겔, 또는 PBS(대조군)에 적셔 접종하였다.
동물 이식 재혈관화 연구. 수컷 스프라그-돌리(Male Sprague-Dawley) 랫트(6개월령, 200 g)을 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)(Wilmington, MA, USA)에서 구입하고, 모든 과정은 플로리다 대학 IACUC(UF#201207728)에 의해 허가받았다. 생물학적 후드에서, 최종 멸균된 HUV 스캐폴드를 5 mL의 hPE, 매트리겔, 또는 PBS(대조군)에서 각각 2시간 동안 인큐베이션하였다. 동물은 이소플루란 흡입을 이용해 마취하고, 가위로 무디게 잘라 등의 왼쪽과 오른쪽에 피하 주머니를 만들었다. 한 스캐폴드를 각각 피하 주머니에 삽입하고, 피부를 4-0 봉합(Coviden, Mansfield, MA)을 이용하여 봉합하였다. 이식 5일 후, 동물을 안락사시키고, 분석을 위해 시료를 떼어냈다.
모세혈관 네트워크 형성을 분석하기 위해, 동물로부터 제거 후 즉시, 섬유화 캡슐을 메스로 절개하고 HUV 시료를 유리 슬라이드 위에 놓았다. 액시오캠(Axiocam) HRm 디지털 카메라(Zeiss, Oberkochen, Germany)가 장착된 이미저(Imager) M2 광학 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 반투명 스캐폴드 시트의 하향식 이미지를 가져왔다. 세포 이동 및 스캐폴드 재형성을 정량하기 위하여, 조직 시료를 Neg-50 동결된 절편 매질에 매립하여 7μm 절편으로 만들어(Microm HM550 cryostat, Thermo Scientific, Waltham, MA), 표준 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(Richard-Alan Scientific, Kalamazoo, MI)을 이용하여 염색하였다.
통계. 결과는 평균 ± 표준 편차로 보고한다. 선형 회귀는 SPSS(IBM, Somers, NY)를 이용하여 수행하였다. Rt-PCR 데이터는 RT2 프로파일러 PCR 어레이 데이터 어낼리시스 소프트웨어 v3.2(SABiosciences, Valencia, CA)를 이용하여 분석하였다.
관류 생물 반응기 배양 및 HUV 바이오스캐폴드에서 혈관형성 유도. 세포 접종된 세관 구조물을 이중 관류 생물 반응기(도 7)에서 5일 동안 60 펄스/분에서 내강 유속 4 mL/분으로 배양하였다. 혈관 벽에 전단 응력은 배지 흐름이 정상 상태이며 층류 및 혈관은 비탄력적이고, 원통형이며 일직선이라는 가정하에서 하겐-포아즈(Haagen-Poisseuille) 방정식을 이용하여 계산하였다.134
Figure pct00001
상기 식에서, Q 는 체적 유속이고, μ는 37℃에서 물의 유동성 점도(0.000692 kg/(m*s))이다134. 전단 응력은 각 펄스 동안 0 dynes/cm2 내지 0.04 dynes/cm2 주기를 이룬다. 환경은 37℃ 및 5% CO2의 표준 세포 배양 조건으로 유지하였다. 시스템 내의 압력은 내강 밖과 내강 흐름 순환 두 가지 모두에서 무시할 수준(<2 mmHg)으로 유지되어 스캐폴드에 압력 기울기가 존재하지 않았다. 생물 반응기 내에서 배양 배지는 2일에 한번 보충하였다. 관류 배양 5일 후에, 10 cm 길이의 세관 스캐폴드를 조직학적 분석을 위해 작은 고리 안으로 절개하였다.
결과
인간 태반 추출물의 유도 및 특성화
초기 기계적 균질화 및 원심분리 후, 유도 기술은 요소 단계를 이용하여 분자를 선형화하고 가용화하였다. 이어서 투석 분리하여 요소를 제거하고 생체분자가 원래 입체형태로 재폴딩하도록 하였다. 유도의 모든 단계는 4℃ 냉각실에서 수행하였다. PE의 최종 용액은 반투명하고, 점성이 높았으며 8 kD 내지 868 kD 사이의 생체분자로 이루어졌다.
인간 태반 추출물(hPE)의 혈관형성 가능성은 hPE로 코팅된 조직 배양 플레이트(TCP: tissue culture plate) 위에 1차 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)를 접종하여 처음으로 특성화하였다. 초기 단계의 세포 코딩(cording) 및 발아는 세포 접종 후 1시간 내에 뚜렷하였으며(데이터 미제시), 혈관형성의 네트워크는 3일째 실험 종료 때까지 계속하여 성숙하였다(도 1A-B). 개별 세포 코드(cord)(다중 세포)의 길이는 접종 후 1일(도 1C) 3일(도 1D) 사이에 상당히 증가하였다. 배양 3일 후에, 세포는 대조군 시료에 비해 광범위한 혈관형성 네트워크를 형성하였다(도 1E, 1F).
태반 추출물의 생체분자 특성화
평가된 120가지 사이토카인 중에서, 54가지 혈관형성 관련 사이토카인이 태반 용해액에서 검출되었다(도 2A). 가장 일반적인 혈관형성 관련 케모카인은 새로운 혈관 형성의 강력한 자극제인 안지오제닌이었다16. 간세포 성장 인자(HGF), 섬유모세포 성장 인자-4(FGF4), 렙틴(LEP), ICAM-1, ICAM-2 및 TIMP-2을 포함하는(그러나 이에 제한되지 않음) 중요한 프로-혈관형성 케모카인이 검출되었다. LC-MS/MS는 아넥신(ANXA1, ANXA2, ANXA4, 및 ANXA5), 호중구 디펜신(DEFA1), 인터류킨-인핸서 결합 인자(ILF2 및 ILF3), IL27, ITBG1, 및 MRC1을 포함한 면역 관련 단백질이 존재함을 보여주었다. 라미닌(LAMA2, LAMA4, LAMA5, LAMB1, LAMB2, LAMB3, 및 LAMC1), 피브로넥틴(FN1), 황산 헤파린(HSPG2) 및 4형 콜라겐(COL4A1, COL4A2, 및 COL4A3)을 포함하는 혈관형성 관련 기저막(BM) 단백질을 또한 lc-ms/ms를 이용하여 검출하였으며, 이들 각각은 혈관형성에 있어 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다17 -20.
hPE -유도된 혈관형성의 네트워크 내에서 내피세포 유전자 발현
케모카인 분석과 함께, HUVEC 유전자 분석으로 태반 추출물의 혈관형성 특성을 추가로 확인하였다. RT-PCR 분석은 3일 동안 hPE에서 접종된 내피세포가 간세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 및 태반 성장 인자를 포함하는 광범위한 필수 프로-혈관형성 유전자를 발현하였다는 것을 보였다(도 2B). 상승 조절된 추가의 유전자는 MMP2 및 MMP9를 포함하며, 이들은 내피세포뿐 아니라 ECM 재형성과 연관된 다른 세포의 이동을 촉진하기 위하여 주변 세포 외 기질의 분해를 돕는 단백질 분해 효소이다21. 미세혈관 시스템을 성숙시키는데 있어 기저막의 형성과 연관된 IV형 콜라겐 역시 상승조절되었다.22
시험관 내에서 모세혈관 발생 및 형태의 조절
지금까지, 시험관 내 분석법은 혈관형성의 속도 및 단계를 거의 또는 전혀 조절하지 못하고 있다9. 본 데이터는 시험관 내 hPE-기반한 혈관형성 분석법이 초기 세포 접종 밀도를 변화시켜 혈관형성 네트워크 형성의 성숙 및 형태를 제어하도록 조절될 수 있다는 것을 보여준다. 1일 후에, 40,000 세포/cm2 의 밀도로 접종된 HUVEC은 80,000 세포/cm2의 밀도로 접종한 것에 비해 더 분명하게 세관을 형성하였으나, 5일까지 두 밀도로 접종된 세포 두 가지 모두 세관을 분명히 잘 나타냈다(도 3A). 이러한 결과는 세포 접종 밀도에 변화를 주어 배양물을 hPE에 노출시킬 경우 네트워크 형성의 성숙 단계를 제어할 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, 높은 세포 접종 밀도는 혈관형성 네트워크를 더 느리게 성숙시켜 네트워크 형성이 확장되면서 혈관 형성 진행을 분석하기 더욱 좋게 해줄 것이다. 반면에 더 낮은 세포 밀도는 혈관형성 네트워크를 더 빠르게 성숙시켜 더 신속한 스크리닝 접근법, 예를 들어 암 약물에 의한 혈관형성 방지제의 효과를 시험하는 것을 허용한다.
시험관 내 혈관형성 분석을 위한 현재 최적 표준으로서 매트리겔-유도된 혈관형성 네트워크를 hPE-유도된 네트워크와 비교하였다(도 3A). 우선 세포 배양물을 매트리겔 또는 hPE에 노출시켜 칼세인 AM을 이용하여 내피세포 모세혈관 네트워크의 형태를 분석하여 생존능 및 네트워크 구조를 결정하였다. 접종 후 1일, 매트리겔 코팅된 플레이트는 HUVEC이 분명한 혈관형성 세관 네트워크를 형성하였으나, 3일 후 네트워크 구조는 사멸 세포의 구형 덩이로 무너진 것을 보였다. 일부 세포 사멸이 hPE 유도된 네트워크에서 보였지만 기간을 5일로 연장한 경우에 세포 사멸 덩이가 발견되지 않았다.
혈관형성의 후기 단계 과정에서, EC는 모세혈관 네트워크가 성숙하면서 혈관을 안정화하기 위해 평활근 세포(SMC)를 동원한다. 이와 같이, 평활근 세포 형태에 대한 hPE 및 매트리겔의 효과를 평가하였다. 흥미롭게도, HUVEC이 없는 경우, 매트리겔에 접종된 SMC는 1일 후에 세관을 형성하였으나(도 3B.i), hPE 코팅된 플레이트에서는 전형적인 '언덕과 골짜기(hill and valley)' 형성을 유지하였으며(도 3B.ii), 이것으로 세포 유형 사이에서 분자 신호전달 경로에 있어 상당한 차이를 나타낸다. SMC는 미세혈관 형성의 초기 단계에서 세관을 형성하는 것이 알려져 있지 않아서 이러한 결과는 hPE-기반의 혈관형성이 더 정확하게 정상적인 생리를 대표한다는 것을 나타낼 수 있다.
약물 스크리닝 적용을 위한 hPE -유도된 혈관형성의 분석
재생 의학에서의 그의 역할 외에도, 인간 태반 추출물(hPE)에 의해 유도된 혈관형성을 혈관형성 관련 약물을 시험관 내에서 스크리닝할 수 있는지에 대하여 시험하였다. 매트리겔 및 hPE-기반한 혈관형성 분석법을 신혈관화에 대해 강력한 억제 활성을 가진 당단백질인 트롬보스폰딘-1(TSP-1)에 대해 스크리닝하였다. TSP-1은 고형 종양의 항-혈관형성 치료를 위한 모델 약물을 대표한다23. 배양 1일 후, 조직 배양 플레이트에 직접 접종된 대조군 HUVEC은 전형적인 조약돌 형태를 형성하는 세포로 TSP-1에 의해 영향받지 않았다. 반면, hPE 처리된 배양 플레이트에서 배양된 HUVEC은 혈관형성 네트워크 형성을 상당히 감소시켰다(도 4A). 결과는 전체 세관-길이 및 분기점이 TSP-1 농도의 함수에 따라 선형으로 감소하는 것을 보여준다(도 4B). 중요하게도, 이러한 연구는 hPE-기반 분석법이 매트리겔-기반 분석에 비해 약물 농도에 더 민감하다는 것을 나타낸다. 이것은 TSP-1 농도와 각각 0,97 및 0.36의 R2 값으로 혈관형성 네트워크의 도달 면적의 감소율(%) 사이에 더 높은 연관성으로 나타난다(도 4). 추가적으로, hPE는 인간에서 유래되기 때문에, 비인간 시스템을 이용하는 스크리닝으로 인해 생길 수 있는 종간에 기초한 부정확성을 피한다.13 , 14.
3D 바이오스캐폴드 내에서 시험관 내 혈관형성의 네트워크 형성
조작된 기관에서 성공적으로 혈관화하는 과정은 성공적인 재생 의학 요법을 발전시키는데 주된 어려움이 되어왔기 때문에24, hPE가 생체 외 유래된 바이오스캐폴드에서 혈관형성 유도할 가능성을 분석하였다. 이 연구는 조작된(탈세포화된) 인간 제정맥(HUV) 바이오스캐폴드에서 hPE가 혈관형성 네트워크의 형성을 유도하였다는 것을 보여준다(도 5A). 2D 배양 플레이트에서의 분석과 일치하여, 바이오스캐폴드 상에 접종된 내피세포(EC)는 다중 세포 코드로 연결된 길쭉한 형태로 발달하여 서로 복합적으로 연결된 네트워크를 형성하였다.
생체 내 혈관형성은 여러 가지 기전, 가장 흔하게는 발아 또는 중첩에 의해 일어난다. 이 데이터는 발아 vs 중첩 혈관형성이 hPE와 인큐베이션되는 경우 세포 밀도를 변화시켜 시험관 내에서 조절될 수 있다는 것을 보여준다. 더 낮은 세포 밀도(2x104 세포/cm2)에서 hPE-인큐베이션된 스캐폴드에서 네트워크 형태는 발아 혈관형성을 나타내었고(도 5C.i, 5C.ii), 중간 밀도(4x104 세포/cm2)에서 네트워크 형태는 발아와 중첩 혈관형성의 조합을 나타내었고(도 5C.iii, 5C.iv), 더 높은 밀도(6x104 세포/cm2)에서 네트워크 형태는 중첩 혈관형성과 더 근접하게 닮았다(도 5C.v, 5C.vi). 발아가 일반적으로 모세혈관이 없는 낮은 세포 밀도 영역에서 혈관형성의 초기 단계에서 일어나기 때문에, 세포 밀도와 혈관형성의 특이적 기전 사이의 상관관계는 생체 내 모세혈관 및 네트워크 형성에 대해 현재 이해되고 있는 내용을 지지한다. 반면, 중첩은 모세혈관 및 내피세포가 이미 존재하는 더 높은 세포 밀도 영역에서 일어난다25 ,26.
생체 내 혈관형성의 유도
피하 랫트 모델을 이용하여(도 6A), 투여된 스캐폴드(매트리겔 및 hPE)에 대한 혈관형성 반응을 이식 후 5일에 평가하였다. 대조군 및 매트리겔-인큐베이션된 스캐폴드 두 가지 모두는 스캐폴드 주변에 상당한 섬유화를 보인 반면, hPE 투여된 스캐폴드는 이식체 주변에 식별되는 섬유화를 보이지 않았다(도 6B.i-6B.iii.). hPE 시료에서 섬유화 방지는 LC-MS/MS로 검출되는 바와 같이, 면역 관련 분자로 의한 결과라고 생각되며, 여기에는 항염증성 아넥신(ANXA1, ANXA2, ANXA4, 및 ANXA5)27, 항균성 디펜신 펩티드, 예를 들어 DEFA128, 그리고 바이러스 및 세균을 포함한 잠재적인 병원균에 결합하는 것으로 알려진 MRC1을 포함하나 이에 제한되지 않는다,
명시야 현미경에서 나타난 바와 같이, 매트리겔 및 hPE-인큐베이션된 스캐폴드 두 가지 모두 대조군과 비교하여 신혈관화에 상당한 증가를 보였다(도 6B.iv-6B.vi.). 전체 혈관화은 비슷해 보였지만, hPE 처리는 성숙하는 모세혈관상의 형성을 보인 반면, 매트리겔 시료는 성숙 모세혈관상이 형성된 흔적 없이 덜 구조화된 것으로 보인다. H&E 염색된 절편은 세포가 hPE에서 인큐베이션된 스캐폴드로와 이를 통해 이동하였던 반면 매트리겔 인큐베이션된 시료는 세포 침윤이 감소되었고, 대조군 시료 내의 세포는 스캐폴드 주변에 국한되었다는 것을 보여준다(도 6B.vii.-6B.ix.). 매트리겔 및 hPE-인큐베이션된 시료 두 가지 모두에서 향상된 세포 이동은 스캐폴드 구조로 흡착된 화학주성 및 성장 인자 신호의 결과였다. 대조군에 비해 hPE 및 매트리겔 투여된 스캐폴드 두 가지 모두에서 세포 이동이 향상되었지만, 세포 재형성은 시료 그룹 사이에서 편차를 보였다. 매트리겔-인큐베이션된 시료에서 세포 밀집 영역은 거의 완전히 재형성된 것처럼 보이는, 그래서 더 조직화된 섬유 및 세포 구조를 나타내는 hPE-인큐베이션된 스캐폴드와 비교하여 질적으로 더 무정형의 일반적인 구조를 갖는 본래의 HUV 섬유의 잔유물을 보였다(도 6B.vii.-6B.ix.).
고찰
조직 재생, 경색 조직 및 허혈성 상처 복구는 상처 회복 또는 조직 대체를 위한 개선된 전략이 임상적으로 상당한 영향을 주는 3가지 임상 분야이다. 출생 전후기 조직이 상당한 임상적 전망을 보인다는 것을 보여주는 증거가 늘어나면서, 지난 5년간 다양한 적용 분야에서 양막 및 융모막의 사용이 크게 증가하였다29-32.
본원에서 결과는 혈관형성 및 조직 재형성의 인간 유래된 강력한 자극 인자의 생리학적 비율을 집중적으로 다루고 이를 전달하는 신규 접근법을 상세하게 기재한다. 본 데이터는 모세혈관 형성(시험관 내 및 생체 내)의 개시, 성장 또는 성숙 역학을 조절할 수 있는 혈관형성 과정에서의 EC 표현형의 조절 및 생체 내 조직 섬유화의 상당한 감소에 대해 향상된 세포활성을 보여준다.
모세혈관 네트워크 형성의 시험관 내 성숙 속도를 조절하고 발아의 발생 및 중첩 혈관형성의 네트워크 형태를 제어할 수 있음으로써 상처 치유 및 조직 재생 과정에서 조절 경로를 더 많이 이해할 수 있는 유용한 플랫폼을 제공할 수 있다. 매트리겔과의 비교를 근거로 하면, hPE가 세포를 자극하는 기전은 근본적으로 다른 것으로 보인다. 매트리겔과 인큐베이션된 SMC는 모세혈관-유사 형성을 개시하였지만, hPE에 노출된 SMC는 그들의 전형적인 언덕과 계곡 형태를 유지하였으며, 이와 같이 인간 유래된 hPE가 더 복잡한 모델로 생리학적 혈관형성을 보다 대표하는 모델을 제공할 수 있다.
현재의 많은 방법은 단일 또는 개별적인 조합의 혈관형성 조절 인자에 의존하는 인간 유래된(재조합) 조절 인자에 기반한다33. 개별 조합은 변이를 제어하고 다양한 접근법에 내재하는 복합성을 감소시키지만, 이들은 스크리닝 과정에 제약을 주고 항-혈관형성, 종양 억제 약물의 가능성을 시험할 때 중요할 것 같은 광범위한 인간 생체 내 분자 상호관계를 나타내지 못한다.
hPE 기반 모델에 내재하는 복합성은 종양 억제 약물을 위한 더 효과적인 스크리닝 접근법을 제공함으로써 약학 산업에 진보를 가져올 수 있다. 현재 기술에 비해, hPE에 인간 EC의 노출로 더 낮은 검출 한도를 갖는 혈관형성 억제 약물-농도(TSP-1)에 대한 감수성이 증가되었다는 것을 보였다.
hPE-기반 모델은 근접한 생리학적 비율로 광범위한 인간 유래 분자를 이용하여 혈관형성을 유도한다. 생체 내 혈관형성이 다양한 대사 경로의 유도를 요구하기 때문에 선택된 분자 경로만의 조절은 신규 항-혈관형성 약물을 개발하기 위한 시도를 국한시킬 것으로 생각된다34 , 35. 이와 같이, 약물은 이러한 많은 경로와 상호작용을 통해 혈관형성을 조절할 것이지만, 국소 환경이 복합적이지 않을 경우 충분한 혈관형성을 유도하는 효과를 거의 보이지 않을 수 있다. 본 실시예에서 생체 내 분석 결과는 복합적인 PE가 많은 생화학 경로에 영향을 주어 광범위한 효과를 가져 올 수 있다는 근거를 추가로 제시한다. 데이터는 hPE가 혈관형성 특성을 향상시킬 뿐만 아니라 hPE 투여된 바이오스캐폴드에서 섬유화를 감소시킨 것으로 보인 바와 같이 면역 감소 특성을 보이는 것을 나타내었다. 혈관형성과 면역학적 분자 경로 사이에 복합적으로 상호연결되는 경우36, hPE의 분자 조성물은 중요한 면역학적 염증 반응 없이 모세혈관 형성을 유도하는 임상적으로 적용될 수 있는 기술을 개발하기 위한 적절한 기반을 제공한다.
상기 기재된 연구의 긍정적인 결과는 PE 내의 중요한 성장 인자(GF)와 유전자 조절 인자가 존재한다는 것뿐만 아니라 그들이 생리학적 비율로 존재한다는 것과도 연관되는 것으로 보인다. 예를 들어, VEGF는 hPE-유도된 EC에서 상승조절되었지만, hPE 용액은 검출가능한 수준을 포함하지 않았다. 이것은 표준 및 GFR(성장 인자 감소된) 형태 두 가지 모두에서 VEGF의 활성 농도를 포함하는 매트리겔(BMM)과 대조된다. 더 성숙한 모세혈관상 형성을 나타내는 본원의 결과와 함께, VEGF의 존재가 단지 많은 기여 인자 중 하나이고, 다른 조절 인자의 존재가 혈관 발생의 중요한 역할을 할 것 같다. 유사하게, 혈관형성을 개시하는데 사용되는 인간 재조합 단백질과 비교하여, 이들은 매우 농축된(전형적으로) 단일 GF에 의존한다37 -39. 단일의 매우 높은 반응성의 GF가 임상적으로 적용되어 바람직하지 않은 효과를 가져왔다는 문제점이 보고되었다40-42.
hPE 혈관형성 모델은 2D 및 3D 시험관 내 모델뿐 아니라 생체조작된 조직 이식체 내에서 생체 내 입증되었으며 다양한 임상 또는 약학적 용도에 쉽게 적용될 수 있다. 본 모델이 그의 혈관형성 및 면역 감소 특성과 결합된 생리학적으로 건강한 인간 혈관상으로부터 유도되었다는 사실은 현재 혈관형성 모델 중에서 자신을 고유하게 만든다. 여기에 제시된 데이터는 대안적이고, 더 성공적인 접근법에 대한 요구가 임상적으로 우선되는 많은 중요한 임상적 사안에서 hPE가 중심적인 역할을 한다는 것을 보여주었다.
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Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

Claims (42)

  1. 인간 태반 추출물의 제조 방법으로서,
    인간 태반으로부터 시료를 얻는 단계:
    태반 시료로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물을 생성하는 단계;
    태반 조추출물을 단백질 가용화제와 혼합하여 조추출물 내의 단백질을 가용화하는 단계;
    가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물로부터 고체 물질을 분리하는 단계; 및
    가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물을 투석하여 혼합물로부터 단백질 가용화제를 제거함으로써 인간 태반 추출물을 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 태반 시료로부터 혈액을 제거하는 단계는 인간 태반 시료를 완충액으로 균질화하는 것, 균질화된 시료를 원심분리하는 것, 및 혈액을 포함하는 상층액을 버리는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단백질 가용화제가 요소인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 요소가 약 0.5M 내지 약 16M의 농도를 갖는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물을 원심분리하여 고체를 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 투석액이 TBS를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 투석액을 정기적으로 교환하고, 태반 추출물에 단백질 가용화제가 실질적으로 없을 때까지 투석을 반복하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 투석 후 태반 추출물을 원심분리하여 추가의 고체를 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 약 -86℃ 내지 약 5℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 약 4℃ 온도에서 수행되는 것인 방법.
  11. 인간 태반 시료로부터 얻어진 인간 태반 추출물을 포함하는 조성물로서, 혈액과 고체가 추출물로부터 실질적으로 제거되고, 추출물이 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함하며, 태반 단백질이 태반 시료에 존재했던 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 태반 추출물이
    인간 태반 시료로부터 얻어진 시료로부터 혈액을 제거하여 태반 조추출물을 생성하는 단계;
    태반 조추출물을 단백질 가용화제와 혼합하여 조추출물 내의 단백질을 가용화하는 단계;
    가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물로부터 고체 물질을 분리하는 단계; 및
    가용화된 단백질-태반 추출물 혼합물을 투석하여 혼합물로부터 단백질 가용화제를 제거함으로써 인간 태반 추출물을 생성하는 단계
    에 의해 제조되는 것인 인간 태반 추출물.
  13. 제11항에 있어서, 태반 추출물이 20가지 이상의 상이한 사이토카인을 포함하는 것인 인간 태반 추출물.
  14. 제11항에 있어서, 단백질 가용화제가 요소인 인간 태반 추출물.
  15. 제11항에 있어서, 태반 추출물이 내피세포의 성장을 촉진할 수 있는 것인 인간 태반 추출물.
  16. 제11항에 있어서, 태반 추출물이 혈관형성(angiogenesis)을 조절할 수 있는 것인 인간 태반 추출물.
  17. 제11항에 있어서, 태반 추출물이 기저막 기질(BMM: basement membrane matrix)과 비교하여 여러 가지 세포주의 성장, 분화, 또는 두 가지 모두에서 뚜렷이 구별되는 효과를 보이는 것인 인간 태반 추출물.
  18. 제11항에 있어서, 태반 추출물이 BMM과 비교하여 내피세포의 증가된 성장을 촉진하는 것인 인간 태반 추출물.
  19. 제11항에 있어서, 태반 추출물은, 태반 추출물 없이 성장시킨 내피세포에서의 유전자 발현과 비교하여 내피세포에서 하나 이상의 유전자를 상승조절하며, 유전자가 혈관형성 유전자, 세포 외 기질 재형성(remodeling) 유전자, 및 혈관 발생 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 인간 태반 추출물.
  20. 제19항에 있어서, 혈관형성 유전자가 ANGPTL4, CXCL3, 인간 성장 인자(HGF), ANGPT2, PGF, TYMP, VEGFA, HIF1A, 및 FGF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 인간 태반 추출물.
  21. 제19항에 있어서, 세포 외 기질 재형성 유전자가 MMP2, MMP9, COL4A3, 및 LAMA5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 인간 태반 추출물.
  22. 제19항에 있어서, 혈관 발생 유전자가 CDH2, HAND2, LECT1, 및 MDK로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 인간 태반 추출물.
  23. 제12항에 있어서, 추출물은, 완충액으로 균질화 및 혈액을 분리하기 위한 원심분리에 의해 태반 시료로부터 혈액을 제거하는 단계; 요소 용액과 혼합하여 태반 단백질을 가용화하는 단계; 추출물로부터 고체를 분리하고, 투석하여 요소를 제거하고 인간 태반 추출물을 제공하는 단계에 의해 제조되는 것인 인간 태반 추출물.
  24. 세포 배양물에서의 혈관형성의 유도 방법으로서, 혈액 및 고체를 제거하기 위해 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻은 인간 태반 추출물의 존재하에서 내피세포를 성장시키는 단계를 포함하며, 태반 추출물이 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 세포가 40,000 세포/cm2 이상의 밀도로 접종되는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 세포가 80,000 세포/cm2 이상의 밀도로 접종되는 것인 방법.
  27. 숙주에서 생체재료를 이식하는 단계를 포함하는 생체 내에서의 생체재료의 혈관형성의 유도 방법으로서, 이식 전에 생체재료는 인간 태반 추출물에 인큐베이션되고 인간 태반 추출물은, 혈액 및 고체를 제거하기 위해 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻어지며, 태반 추출물이 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 생체재료가 인간 유래된 기질 재료를 포함하는 조작된 바이오스캐폴드인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 바이오스캐폴드가 탈세포화된(decellularized) 인간 제정맥 스캐폴드를 포함하는 것인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 인간 제정맥 스캐폴드가 인간 내피세포로 접종되는 것인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 스캐폴드가 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)로 접종되는 것인 방법.
  32. 제27항에 있어서, 인간 내피세포가 약 40,000 세포/cm2 이상의 밀도로 접종되는 것인 방법.
  33. 제27항에 있어서, 숙주가 포유동물인 방법.
  34. 제27항에 있어서, 숙주가 인간인 방법.
  35. 제27항에 있어서, 이식된 생체재료는 기저막 기질(BMM)에 인큐베이션된 생체재료와 비교하여 섬유화가 감소되는 것인 방법.
  36. 제27항에 있어서, 이식된 생체재료는 태반 추출물에 인큐베이션되지 않은 생체재료와 비교하여 증가된 혈관 성장을 포함하는 것인 방법.
  37. 혈액 및 고체를 제거하기 위해 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻은 인간 태반 추출물에 인큐베이션된 인간 유래된 기질 재료를 포함하는 조작된 바이오스캐폴드를 포함하는 이식 가능한 조작된 바이오스캐폴드로서, 태반 추출물이 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함하는 것인 바이오스캐폴드.
  38. 혈관형성 조절 인자의 확인 방법으로서,
    혈액 및 고체를 제거하기 위해 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻은 인간 태반 추출물의 존재하에서 인간 내피세포 배양물을 성장시키는 단계로서, 태반 추출물이 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함하는 단계;
    인간 내피세포 배양물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    배양물에서 혈관형성 양을 결정하는 단계; 및
    세포 배양물에서 혈관형성 양이 시험 화합물 없이 성장시킨 배양물에서의 혈관형성 양보다 더 많거나 적을 경우 시험 화합물을 혈관형성 조절 인자로서 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 시험 화합물 없이 성장시킨 배양물에 비해 혈관 형성의 양이 증가된 것은 시험 화합물이 혈관형성을 유도한다는 것을 나타내는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 시험 화합물 없이 성장시킨 배양물에 비해 혈관 형성의 양이 감소된 것은 시험 화합물이 혈관형성을 억제한다는 것을 나타내는 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 시험 화합물은 트롬보스폰딘-1(TSP-1)이고, 화합물이 혈관 형성을 억제하는 것인 방법.
  42. 혈관형성 조절 인자를 확인하는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법으로서, 혈액 및 고체를 제거하기 위해 처리되고, 단백질 가용화제와 혼합되고, 단백질 가용화제를 제거하기 위해 투석된 인간 태반 시료로부터 얻은 인간 태반 추출물의 존재하에서 성장시킨 내피세포 배양물을 포함하며, 태반 추출물이 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 태반 단백질을 포함하는 것인 분석법.
KR1020157031446A 2013-04-02 2014-04-02 혈관형성의 유도 및 조절을 위한 조성물 및 방법 및 혈관형성 조절 인자를 확인하기 위한 방법 및 분석법 KR20150139569A (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020036245A1 (ko) * 2018-08-17 2020-02-20 고려대학교 산학협력단 인간 신경줄기세포의 기능강화 및 생산을 위한 태반유래 세포 조건화 배지 및 이의 용도

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2713062T3 (es) 2005-09-27 2019-05-17 Tissuetech Inc Preparaciones de membrana amniótica y composiciones purificadas y métodos de uso
WO2012170905A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Tissuetech, Inc. Methods of processing fetal support tissues, fetal support tissue powder products, and uses thereof
CA2908562A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Peter S. Mcfetridge Compositions and methods for induction and modulation of angiogenesis and methods and assays for identifying angiogenesis modulators
TW201603818A (zh) 2014-06-03 2016-02-01 組織科技股份有限公司 組成物及方法
TW201642914A (zh) 2015-02-23 2016-12-16 組織科技股份有限公司 用於治療眼部疾病及失調的裝置及方法
WO2016187555A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Tissuetech, Inc. Compositions and methods for preventing the proliferation and epithelial-mesenchymal transition of epithelial cells
TW201733600A (zh) 2016-01-29 2017-10-01 帝聖工業公司 胎兒扶持組織物及使用方法
US20210369630A1 (en) * 2018-10-17 2021-12-02 University Of Florida Research Foundation Magnetically responsive composite microparticles for triggered delivery of biologically active agents
AU2020255283A1 (en) 2019-04-04 2021-10-14 THT Biomaterials GmbH A novel human-material-based platform technology for tissue engineering

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4829000A (en) 1985-08-30 1989-05-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reconstituted basement membrane complex with biological activity
JP2770926B2 (ja) * 1985-12-17 1998-07-02 サイナーゲン インコーポレーテッド 毛管内皮細胞プロテアーゼ合成、ｄｎａ合成および遊走を促進することの出来るヒト胎盤血管形成誘導因子
US4994559A (en) 1985-12-17 1991-02-19 Synergen, Inc. Human basic fibroblast growth factor
JPS63152322A (ja) * 1986-09-30 1988-06-24 Ichimaru Pharcos Co Ltd プラセンタ−組織由来フイブロネクチン含有溶液
CA2005600A1 (en) 1988-12-20 1990-06-20 Cal-Henrik Heldin Endothelial cell growth factor
AUPM425294A0 (en) 1994-03-04 1994-03-31 Australian National University, The In-vitro angiogenesis assay
US5770565A (en) 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
JPH0931100A (ja) * 1995-07-24 1997-02-04 Nippon Ham Kk 変性コラーゲン及びその製造方法
CA2375617A1 (en) 1999-06-07 2000-12-14 Edwards Lifesciences Corporation Targeted angiogenesis
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7175840B2 (en) * 2001-01-05 2007-02-13 Viromed Co., Ltd. Compositions for gene therapy of rheumatoid arthritis including a gene encoding an anti-angiogenic protein or parts thereof
JP4554940B2 (ja) * 2002-04-03 2010-09-29 直秀 山下 ヒト胎盤由来の間葉系細胞を含む医薬及び該細胞を用いたｖｅｇｆの製造方法
MXPA04009996A (es) 2002-04-12 2005-07-01 Celgene Corp Metodos para la identificacion de moduladores de la angiogenesis, compuestos descubiertos por los mismos, y metodos de tratamiento usando los compuestos.
US8940292B2 (en) * 2003-01-28 2015-01-27 Wake Forest University Health Sciences Enhancement of angiogenesis to grafts using cells engineered to produce growth factors
WO2005003317A2 (en) * 2003-07-01 2005-01-13 Regents Of The University Of Minnesota Engineered blood vessels
JP2005065661A (ja) * 2003-08-20 2005-03-17 Akihiro Yamaguchi ヒト血管内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性活性化及び血管新生におけるＩｄの役割
US7775965B2 (en) 2004-03-09 2010-08-17 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Decellularized grafts from umbilical cord vessels and process for preparing and using same
ES2713062T3 (es) * 2005-09-27 2019-05-17 Tissuetech Inc Preparaciones de membrana amniótica y composiciones purificadas y métodos de uso
US8187639B2 (en) * 2005-09-27 2012-05-29 Tissue Tech, Inc. Amniotic membrane preparations and purified compositions and anti-angiogenesis treatment
US8003388B2 (en) * 2006-03-24 2011-08-23 Nortis, Inc. Method for creating perfusable microvessel systems
US20080131522A1 (en) 2006-10-03 2008-06-05 Qing Liu Use of placental biomaterial for ocular surgery
KR101645311B1 (ko) 2007-09-26 2016-08-03 안트로제네시스 코포레이션 인간 태반 관류액으로부터의 혈관형성 세포
WO2009100128A1 (en) * 2008-02-04 2009-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Particulate delivery vehicles for embryoid bodies
WO2009116951A2 (en) * 2008-03-17 2009-09-24 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US8685634B2 (en) * 2009-03-06 2014-04-01 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Neural scaffolds
EP2461806A4 (en) * 2009-07-31 2012-12-26 Us Health SMALL ANTI-ANGIOGENIC MOLECULES AND METHODS OF USE
KR101118017B1 (ko) 2009-09-04 2012-02-24 (주)차바이오앤디오스텍 태반 추출물을 제조하는 방법 및 태반 추출물
CN102822521B (zh) * 2010-03-30 2016-01-27 西门子公司 具有间接蒸发的太阳能热发电站和运行这种太阳能热发电站的方法
KR20140071813A (ko) 2012-12-04 2014-06-12 삼성전자주식회사 파이버 상에 형성된 저항성 메모리 소자 및 그 제종 방법
CA2908562A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Peter S. Mcfetridge Compositions and methods for induction and modulation of angiogenesis and methods and assays for identifying angiogenesis modulators

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020036245A1 (ko) * 2018-08-17 2020-02-20 고려대학교 산학협력단 인간 신경줄기세포의 기능강화 및 생산을 위한 태반유래 세포 조건화 배지 및 이의 용도

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