ES2709205T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de defectos óseos con poblaciones de células placentarias - Google Patents

Métodos y composiciones para el tratamiento de defectos óseos con poblaciones de células placentarias Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende células madre placentarias CD200+ adherentes para uso en el tratamiento de un defecto óseo en un sujeto, en donde dicha composición se formula para ser implantable o inyectable.

Description

DESCRIPCION
Metodos y composiciones para el tratamiento de defectos oseos con poblaciones de celulas placentarias
Campo
En la presente memoria se proporcionan generalmente composiciones que comprenden celulas madre placentarias para uso en el tratamiento de defectos oseos, y usos de dicha composicion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un defecto oseo. En la presente memoria tambien se describen celulas placentarias aisladas, p. ej., perfusado placentario, celulas madre placentarias adherentes y no adherentes, poblaciones de celulas madre placentarias, composiciones que comprenden las celulas madre, metodos para obtener las celulas madre, metodos para formular composiciones que comprenden las celulas madre, y metodos para tratar defectos oseos con las celulas madre y composiciones.
1. Antecedentes
Las celulas madre humanas son celulas precursoras totipotenciales o pluripotenciales capaces de generar una variedad de linajes de celulas humanas maduras. Existe evidencia que demuestra que las celulas madre pueden emplearse para repoblar, muchos, si no todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiologica y anatomica.
Se han caracterizado muchos tipos diferentes de celulas madre de mamferos. Vease, p. ej., Caplan et al., Patente U.S. No. 5486359 (celulas madre mesenquimales humanas); Boyse et al., Patente U.S. No. 5004681 (celulas madre y progenitoras hematopoyeticas fetales y neonatales); Boyse et al., U.S. 5 192 553 (lo mismo); Beltrami et al., Cell 114(6):763-766 (2003) (celulas madre cardiacas); Forbes et al, J. Pathol. 197(4):510-518 (2002) (celulas madre hepaticas). La sangre del cordon umbilical, y las celulas nucleadas totales derivadas de la sangre del cordon, se han usado en trasplantes para restaurar, parcialmente o totalmente, la funcion hematopoyetica en pacientes que han sido sometidos a terapia ablativa.
2. Resumen
En un aspecto de la invencion, se proporcionan composiciones que comprenden celulas madre placentarias CD200+ adherentes para uso en el tratamiento de un defecto oseo en un sujeto, en donde dicha composicion se formula para ser implantable o inyectable.
En otro aspecto de la invencion, se proporcionan usos de una composicion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un defecto oseo en un sujeto, en donde dicha composicion comprende celulas madre placentarias CD200+ adherentes, y en donde dicha composicion se formula para ser implantable o inyectable.
En determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias adherentes son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otras realizaciones, dichas celulas madre placentarias adherentes han sido subcultivadas al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces.
En determinadas realizaciones, el defecto oseo es una lesion osteolftica asociada con un cancer, una fractura osea, o una medula espinal necesitada de fusion. En una realizacion particular, dicha lesion osteolftica asociada con cancer es una lesion osteolftica asociada con mieloma multiple, cancer oseo, o cancer metastasico. En otra realizacion particular, dicho cancer es mieloma multiple. En otra realizacion, dicho cancer es cancer oseo. En otra realizacion, dicho cancer es cancer metastasico.
En determinadas realizaciones, dicha composicion se formula para ser inyectable en el sitio de dicho defecto oseo. En otra realizacion, dicha composicion es inyectable y se formula para administracion sistemica. En determinadas realizaciones, dicha composicion comprende al menos 5 x 106 de dichas celulas madre placentarias por mililitro. En otra realizacion, dicha composicion comprende un sustrato o matriz implantable.
De aqrn en adelante, la referencia a composiciones y/o celulas madre placentarias para uso en la invencion significara composiciones que comprenden celulas madre placentarias CD200+ adherentes para uso en el tratamiento de defectos oseos o usadas en la fabricacion de medicamentos para el tratamiento de defectos oseos como se ha definido anteriormente.
En la presente memoria se describen celulas placentarias aisladas, p. ej., perfusado placentario, celulas madre placentarias adherentes o no adherentes, poblaciones de celulas madre placentarias, composiciones que comprenden las celulas, metodos para obtener las celulas placentarias, metodos para formular las composiciones, y metodos para usar las celulas para tratar defectos oseos.
En la presente memoria se describen celulas madre aisladas, y poblaciones de celulas que comprenden dichas celulas madre, en donde las celulas madre estan presentes en, y se pueden aislar de, tejido placentario {p. ej., amnios, corion, cotiledones placentarios, cordon umbilical, etc.), que son utiles en la reparacion de defectos oseos. Las celulas madre placentarias presentan una o mas caractensticas de una celula madre (p. ej., presentan marcadores asociados con celulas madre, se replican al menos 10-20 veces en cultivo en un estado no diferenciado, se diferencian en celulas adultas representativas de las tres capas germinales, etc.), y pueden adherirse a un sustrato de cultivo tisular (p. ej., plastico de cultivo tisular tal como la superficie de una placa de cultivo tisular o placa con multiples pocillos).
En un ejemplo, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria aislada que no es adherente. En determinados casos, la celula madre aislada es CD34+. En determinados casos, la celula madre aislada es CD44-. En determinados casos, la celula madre aislada es CD34+ y CD44-. En determinados casos, la celula madre aislada es CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados casos, la celula madre aislada es CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados casos, la celula madre aislada es CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados casos, la celula madre aislada es CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados casos, la celula madre aislada se ha aislado de una placenta humana por digestion enzimatica. En determinados casos, la celula madre aislada se ha aislado de una placenta humana por perfusion. En determinados casos, la celula madre aislada facilita la formacion de una matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
En otro ejemplo en la presente memoria se describe una poblacion de celulas placentarias aisladas que no son adherentes. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre que son CD34+. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre que son CD44-. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre que son CD34+ y CD44-. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre que son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre que son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre que son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre que son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre, en donde al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados casos, la poblacion comprende celulas madre, en donde al menos aproximadamente el 90 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados casos, la poblacion ha sido expandida. En determinados casos, la poblacion ha sido subcultivada al menos una vez. En determinados casos, la poblacion ha sido subcultivada al menos cinco veces. En determinados casos, la poblacion ha sido subcultivada al menos diez veces. En determinados casos, la poblacion ha sido subcultivada al menos veinte veces. En determinados casos, la poblacion forma, o facilita la formacion de, una matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
En otro ejemplo en la presente memoria se describe una poblacion de celulas madre placentarias aisladas que son CD34+ y CD44- En determinados casos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados casos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados casos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados casos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados casos, al menos aproximadamente el 70 % de las celulas madre son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados casos, al menos aproximadamente el 90 % de las celulas madre son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados casos, la poblacion ha sido expandida. En determinados casos, la poblacion ha sido subcultivada al menos una vez. En determinados casos, la poblacion ha sido subcultivada al menos cinco veces. En determinados casos, la poblacion ha sido subcultivada al menos diez veces. En determinados casos, la poblacion ha sido subcultivada al menos veinte veces. En determinados casos, la poblacion forma, o facilita la formacion de, una matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
En una realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion que comprende una celula madre placentaria aislada que es CD200+ para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento. En una realizacion espedfica, la celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula es CD200+ y HLA-G+. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides a partir de una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre CD200+, HLA-G+. En un ejemplo espedfico, dichas celulas madre son adherentes. En varios casos, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % o mas de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD200+, HLA-G+. En un ejemplo espedfico de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD73+ y CD105+. En otro ejemplo espedfico, dichas celulas madre son CD34-, CD38- o CD45-. En un ejemplo mas espedfico, dichas celulas madre son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otros ejemplos espedficos, dicha poblacion ha sido expandida, p. ej., subcultivada al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces. En otro ejemplo espedfico, dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultivan bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion que comprende una celula madre placentaria aislada que es CD73+, CD105+, y CD200+ para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre facilita el desarrollo de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides a partir de una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, la composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre son adherentes. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En una realizacion espedfica de dichas poblaciones, dichas celulas madre son adicionalmente HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre tambien son CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otras realizaciones espedficas, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, subcultivada al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en cultivo bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En la presente memoria tambien se proporciona una composicion que comprende una celula madre placentaria aislada que es CD200+ y OCT-4+ para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, la celula madre es adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides a partir de una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, la composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas mare placentarias CD200+, OCT-4+. En una realizacion espedfica, las celulas madre son adherentes. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD200+, OCT-4+. En una realizacion espedfica de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre son CD200+, CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otras realizaciones espedficas, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, ha sido subcultivada al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion que comprende una celula madre placentaria aislada que es CD200+, CD73+ y CD105+ y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente OCT4+. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es adicionalmente OCT4+, CD34-, CD38- y CD45-.
Ademas, la composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias CD200+, CD73+, CD105+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre son adherentes. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD200+, CD73+, CD105+. En una realizacion espedfica de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente OCT-4+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente OCT-4+, CD34-, CD38- y CD45-. En otras realizaciones espedficas, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, ha sido subcultivada al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces.
En la presente memoria se proporciona ademas una composicion que comprende una celula madre placentaria adherente que es CD200+, CD73+, CD105+ y HLA-G+ para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD200+. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides a partir de una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias en cultivo bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
Ademas, la composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias CD200+, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En una realizacion espedfica, las celulas madre son adherentes. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD200+. CD73+, CD105+ y HLA-G+. En una realizacion espedfica de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre son CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, ha sido subcultivada al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion forma cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En la presente memoria se proporciona ademas una composicion que comprende una celula madre placentaria aislada que es CD200+ y OCT-4+ para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38-, o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD200+. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, y CD45-.
Tambien la composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias CD200+ y OCT-4+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En una realizacion espedfica, las celulas madre son adherentes. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD200+ y OCT4+. En una realizacion espedfica de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son adicionalmente CD34-, CD38-, o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre son CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, subcultivada al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces.
En la presente memoria se proporciona ademas una poblacion aislada de las celulas madre placentarias adherentes para uso en la invencion que se produce segun un metodo que comprende perfundir una placenta de mairnfero que ha sido drenada de sangre del cordon y perfundida para eliminar la sangre residual; perfundir dicha placenta con una disolucion de perfusion; y recoger dicha disolucion de perfusion, en donde dicha disolucion de perfusion despues de la perfusion comprende una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias; y aislar una pluralidad de dichas celulas madre placentarias de dicha poblacion de celulas. En una realizacion espedfica, la disolucion de perfusion se pasa a traves tanto de la vena umbilical como de las arterias umbilicales y se recoge despues de que exuda de la placenta. En otra realizacion espedfica, la disolucion de perfusion se pasa a traves de la vena umbilical y se recoge de las arterias umbilicales, o se pasa a traves de las arterias umbilicales y se recoge de la vena umbilical.
En la presente memoria se proporciona ademas una celula madre placentaria aislada para uso en la invencion, o poblacion aislada de dichas celulas madre placentarias, que se describe en la presente memoria que se produce segun un metodo que comprende digerir tejido placentario con una enzima disruptora de tejido para obtener una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias, y aislar una pluralidad de celulas madre placentarias del resto de dichas celulas placentarias. En realizaciones espedficas, dicho tejido placentario es una placenta completa, una membrana amniotica, corion, una combinacion de amnios y corion, o una combinacion de cualquiera de los anteriores. En otra realizacion espedfica, la enzima disruptora de tejido es tripsina o colagenasa.
En realizaciones mas espedficas, en la presente memoria se proporciona una composicion que comprende una celula madre placentaria aislada, que es CD200+, para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento, en donde dicha celula madre expresa uno o mas genes a un nivel detectablemente mayor que una celula madre mesenquimal derivada de la medula osea, en donde dicho uno o mas genes son ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1 , FLJ10781 , GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1 , IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y/o ZC3H12A, y en donde dicha celula madre derivada de la medula osea ha sido sometida a un numero de subcultivos en cultivo equivalentes a un numero de subcultivos para dicha celula madre placentaria. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre placentaria expresa ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A a un nivel detectablemente mayor que una celula madre mesenquimal derivada de la medula osea.
En realizaciones mas espedficas, la composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion de celulas madre placentarias aisladas, que comprende celulas madre placentarias CD200+, en donde dicha poblacion de celulas madre expresa uno o mas genes a un nivel detectablemente mayor que una poblacion de celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea, en donde dicho uno o mas genes son ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y/o ZC3H12A, y en donde dicha poblacion de celulas madre derivadas de la medula osea ha sido sometida a un numero de subcultivos en cultivo equivalentes a un numero de subcultivos para dicha celula madre placentaria, y en donde dicha poblacion de celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea tiene un numero de celulas equivalente a dicha poblacion de celulas madre aisladas. En una realizacion mas espedfica, la poblacion de celulas madre aisladas expresa ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A a un nivel detectablemente mayor que dicha poblacion de celulas madre mesenquimales aisladas derivadas de la medula osea aisladas.
En la presente memoria tambien se proporcionan composiciones que comprenden una o mas de las celulas madre placentarias para uso en la invencion, en donde las celulas se han aislado de la placenta. En realizaciones preferidas, dichas composiciones que comprenden dichas celulas placentarias son utiles para la reparacion de defectos oseos. En la presente memoria tambien se describe una composicion que comprende perfusado placentario, o celulas aisladas de perfusado placentario, p. ej., celulas nucleadas totales de perfusado placentario.
En un ejemplo, en la presente memoria se describe una composicion que comprende perfusado placentario o celulas de perfusado placentario, p. ej., celulas nucleadas totales de perfusado placentario.
En la presente memoria se describe ademas una composicion que comprende una celula madre placentaria, en donde dicha celula madre es una celula madre placentaria aislada que no es adherente. En determinados ejemplos, la celula madre es CD34+. En determinados ejemplos, la celula madre es CD44-. En determinados ejemplos, la celula madre es CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, la celula madre es CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, la celula madre es CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, la celula madre es CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, la celula madre es CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, la celula madre se ha aislado de una placenta humana por digestion enzimatica. En determinados ejemplos, la celula madre se ha aislado de una placenta humana por perfusion. En determinadas realizaciones, la celula facilita la formacion de una matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe una composicion que comprende una celula madre placentaria, en donde dicha celula madre es una celula madre aislada que es CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, la celula madre es CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, la celula madre es CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, la celula madre es CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, la celula madre es CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, la celula madre se ha aislado de una placenta humana por digestion enzimatica. En determinados ejemplos, la celula madre se ha aislado de una placenta humana por perfusion. En determinadas realizaciones, la celula facilita la formacion de una matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
En determinadas realizaciones, la composicion para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento para dicho tratamiento comprende una celula madre placentaria CD200+ adherente y un compuesto que induce la diferenciacion de dicha celula madre en una celula osteogenica. En determinadas realizaciones, dicha composicion comprende una celula madre placentaria para uso en la invencion, o una poblacion de dichas celulas madre placentarias, proporcionadas en la presente memoria, y un compuesto que induce la diferenciacion de una pluralidad de celulas madre en dicha poblacion de celulas madre en celulas osteogenicas. En determinadas realizaciones, el compuesto es dexametasona o acido ascorbico.
En determinadas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento para dicho tratamiento que comprende una celula madre placentaria aislada, en donde dicha celula madre es CD200+ y HLA-G+. Dicha celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre tambien es CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre tambien es CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre tambien es CD34-, CD38-y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+, CD200+ y HLA-G+.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento para dicho tratamiento que comprende una celula madre placentaria aislada, en donde dicha celula madre es CD73+, CD105+ y CD200+. Dicha celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre tambien es HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre tambien es CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre tambien es CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre tambien es CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento para dicho tratamiento que comprende una celula madre placentaria aislada, en donde dicha celula madre es CD200+ y OCT-4+. En una realizacion espedfica, la celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+, y HLA-G+.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento para dicho tratamiento que comprende una celula madre placentaria aislada que es CD200+, CD73+ y CD105+, en donde dicha celula madre facilita la formacion de un cuerpo semejante a embrioide en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide. En una realizacion espedfica, la celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es OCT-4+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-.
En otra realizacion mas, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento para dicho tratamiento que comprende una celula madre placentaria aislada que es CD200+, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En una realizacion espedfica, la celula madre es adherente. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es OCT-4+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento para dicho tratamiento que comprende una celula madre placentaria aislada que es CD200+ y OCT-4+, en donde dicha celula madre facilita la formacion de un cuerpo semejante a embrioide en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38-y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-.
En la presente memoria se proporciona ademas una composicion para uso en el tratamiento de un defecto oseo o usada para producir un medicamento para dicho tratamiento que comprende celulas madre placentarias CD200+ que expresan uno o mas genes a un nivel detectablemente mayor que una celula madre mesenquimal derivada de la medula osea, en donde dicho uno o mas genes se seleccionan del grupo que consiste en ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LlPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A, y en donde dicha celula madre derivada de la medula osea ha sido sometida a un numero de subcultivos en cultivo equivalentes a un numero de subcultivos para dicha celula madre placentaria. En una realizacion mas espedfica de la composicion anterior, dichas celulas madre expresan ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDL1M3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A a un nivel detectablemente mayor que una poblacion de celula madre mesenquimal derivada de la medula osea aislada, en donde dicha poblacion de celulas madre y dicha poblacion de celulas mesenquimales derivadas de la medula osea tienen numeros de celulas equivalentes.
En otra realizacion espedfica, cualquiera de las composiciones anteriores para uso en la invencion comprende una matriz. En una realizacion mas espedfica, dicha matriz es un soporte tridimensional. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende colageno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina, o vitronectina. En otra realizacion mas espedfica, la matriz es una membrana amniotica o un biomaterial derivado de membrana amniotica. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende una protema de la membrana extracelular. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto sintetico. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra realizacion mas espedfica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citoquina, anticuerpo, o molecula organica de menos de 5000 daltons. En determinadas realizaciones, la matriz es un polfmero sintetico degradable tal como, por ejemplo, acido polilactico o acido poliglicolico. En determinadas realizaciones, la matriz es un sustrato de soporte implantable. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable se selecciona del grupo que consiste en un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de pfosfato tricalcico-colageno, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno placentario humano mineralizado, un sustrato de acido hialuronico, y un sustrato ceramico. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de colageno. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de fosfato de calcio. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de colageno placentario humano mineralizado.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe una composicion que comprende medio condicionado por cualquiera de las celulas madre anteriores, o cualquiera de las poblaciones de celulas madre anteriores. En un ejemplo espedfico, cualquiera de dichas composiciones comprende una celula madre que no deriva de una placenta. En un ejemplo mas espedfico, dicha celula madre es una celula madre embrionaria. En otro ejemplo mas espedfico, dicha celula madre es una celula madre mesenquimal. En otro ejemplo mas espedfico, dicha celula madre es una celula madre derivada de la medula osea. En otro ejemplo mas espedfico, dicha celula madre es una celula progenitora hematopoyetica. En otro ejemplo mas espedfico, dicha celula madre es una celula madre somatica. En un ejemplo incluso mas espedfico, dicha celula madre somatica es una celula madre neural, una celula madre hepatica, una celula madre pancreatica, una celula madre endotelial, una celula madre cardiaca, o una celula madre muscular.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe una composicion que comprende medio condicionado por una celula madre placentaria o poblacion de celulas madre placentarias proporcionadas en la presente memoria. En determinados ejemplos, la composicion comprende medio condicionado por una poblacion de celulas, p. ej., una poblacion de celulas madre, descritas en la presente memoria.
En la presente memoria tambien se describe un metodo para producir una poblacion de celulas que comprende seleccionar celulas que no se adhieren a un sustrato, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En determinados casos, el metodo comprende ademas seleccionar celulas que expresan CD34 y no expresan CD44 e incrementar la concentracion de, p. ej., aislando dichas celulas de otras celulas, para formar una poblacion de celulas.
En determinados ejemplos, en la presente memoria se describe un metodo para producir una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) no se adhieren a un sustrato, (b) expresan CD34 y no expresan CD44, y (c) facilitan la formacion de matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En determinados casos, el sustrato comprende fibronectina.
En determinados ejemplos, el metodo comprende ademas seleccionar celulas que expresan CD9, CD29, CD54, CD90, CD166, o una combinacion de los anteriores.
En determinados ejemplos, el metodo comprende ademas seleccionar celulas que expresan CD31, CD34, CD117, CD133, CD200, o una combinacion de los anteriores.
En determinados ejemplos, la seleccion se consigue usando un anticuerpo. En determinados ejemplos, la seleccion se consigue usando citometna de flujo. En determinados ejemplos, la seleccion se consigue usando lechos magneticos. En determinados ejemplos, la seleccion se consigue por separacion celular activada por fluorescencia. En determinados casos, la poblacion de celulas se expande.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas madre placentarias no adherentes, en donde dichas celulas se han criopreservado, y en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+ y CD44-. En determinados casos, las celulas se han criopreservado, y en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor, y en donde dichas celulas madre forman una matriz mineralizada cuando se cultivan bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada. En determinados casos, el contenedor es una bolsa adecuada para la administracion intravenosa de un lfquido. En determinados casos, la poblacion comprende 1 x 106 de dichas celulas madre. En determinados casos, la poblacion comprende 5 x 106 de dichas celulas madre. En determinados casos, la poblacion comprende 1 x 107 de dichas celulas madre. En determinados casos, la poblacion comprende 5 x 107 de dichas celulas madre. En determinados casos, la poblacion comprende 1 x 108 de dichas celulas madre. En determinados casos, la poblacion comprende 5 x 108 de dichas celulas madre. En determinados casos, la poblacion comprende 1 x 109 de dichas celulas madre. En determinados casos, la poblacion comprende 5 x 109 de dichas celulas madre. En determinados casos, la poblacion comprende 1 x 1010 de dichas celulas madre. En determinados casos, las celulas madre se han subcultivado no mas de 5 veces. En determinados casos, las celulas madre se han subcultivado no mas de 10 veces. En determinados casos, las celulas madre se han subcultivado no mas de 15 veces. En determinados casos, las celulas madre se han subcultivado no mas de 20 veces. En determinados casos, las celulas madre se han expandido en dicho contenedor. En determinados casos, la poblacion esta contenida en una disolucion de NaCl al 0.9 %.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para producir celulas osteogenicas con la capacidad de mineralizar una matriz, que comprende cultivar una pluralidad de celulas madre descritas en la presente memoria o una poblacion de celulas madre aisladas descritas en la presente memoria, bajo condiciones en las que dichas celulas madre se diferencian en celulas osteogenicas, siendo dicho cultivo durante un tiempo suficiente para que dichas celulas osteogenicas produzcan, o faciliten la produccion de, cantidades detectables de matriz mineralizada rica en calcio y/o fosfato. En determinados ejemplos, las celulas osteogenicas producen hueso.
En la presente memoria tambien se describe un metodo para formular una matriz, que comprende combinar una poblacion de celulas madre proporcionadas en la presente memoria con un sustrato de soporte implantable. En determinados ejemplos, las celulas madre no son adherentes. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD44-. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de las celulas madre son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de las celulas madre son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 106 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 5 x 106 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 107 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 5 x 107 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 108 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 5 x 108 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 109 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 5 x 109 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 1010 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, las celulas madre se han subcultivado al menos, aproximadamente, o no mas de 5 veces. En determinados ejemplos, las celulas madre se han subcultivado al menos, aproximadamente, o no mas de 10 veces. En determinados ejemplos, las celulas madre se han subcultivado al menos, aproximadamente, o no mas de 15 veces. En determinados ejemplos, las celulas madre se han subcultivado al menos, aproximadamente, o no mas de 20 veces. En determinados ejemplos, la poblacion ha sido expandida.
La composicion para uso en la invencion se formula para ser implantable. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable se selecciona del grupo que consiste en un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de pfosfato tricalcico-colageno, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno placentario humano mineralizado, un sustrato de acido hialuronico, y un sustrato ceramico. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de colageno. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de fosfato de calcio. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de colageno placentario humano mineralizado.
La composicion para uso en la invencion se formula como una composicion inyectable, que comprende combinar las celulas madre placentarias para uso en la invencion con acido hialuronico o colageno inyectable. En determinados ejemplos, las celulas madre no son adherentes. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD44'. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD34+ y CD44'. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44'. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44- En determinadas otras realizaciones, las celulas madre placentarias son adherentes. En realizaciones espedficas, las celulas madre placentarias son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD200+, CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD200+, CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide; o CD200+ y OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides; o cualquier combinacion de las mismas. En realizaciones mas espedficas de las celulas madre placentarias adherentes para uso en la invencion, la celula madre CD200+, HLA-G+ aislada es CD34', CD38', CD45', CD73+ y CD105+; la celula madre CD73+, CD105+, y CD200+ aislada es CD34', CD38-, CD45-, y HLA-G+; la celula madre CD200+, OCT-4+ aislada es CD34', CD38', CD45- CD73+, CD105+ y HLA-G+; la celula madre aislada de la reivindicacion 1 , en donde dicha celula madre CD73+, CD105+ y HLA-G+ es CD34', CD45', OCT-4+ y CD200+; la celula madre CD73+ y CD105+ aislada que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es OCT4+, CD34', CD38' y CD45'; y/o la OCT-4+ aislada y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es CD73+, CD105+, CD200+, CD34', CD38', y CD45'. En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias para uso en la invencion han sido expandidas. En determinadas realizaciones, dicha composicion comprende acido hialuronico inyectable. En determinadas realizaciones, la composicion comprende colageno inyectable. En la presente memoria tambien se describen composiciones que comprenden una poblacion de celulas madre no adherentes y acido hialuronico o colageno inyectable.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una composicion que comprende celulas madre placentarias CD200+ adherentes para uso en un metodo para tratar defectos oseos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composicion implantable o inyectable que comprende una poblacion de celulas madre proporcionadas en la presente memoria, tratando de esta manera el defecto oseo en el sujeto. En determinadas realizaciones, el defecto oseo es una lesion osteolftica asociada con un cancer, una fractura osea, o una medula espinal, p. ej., que necesita fusion. En determinadas realizaciones, la lesion osteolftica esta asociada con mieloma multiple, cancer oseo, o cancer metastasico. En determinadas realizaciones, la fractura osea es una fractura no de union. En determinados ejemplos, se administra al sujeto una composicion implantable que comprende una poblacion de celulas madre no adherentes. En determinadas realizaciones, una composicion implantable se implanta quirurgicamente, p. ej., en el sitio del defecto oseo. En determinados ejemplos, se administra al sujeto una composicion inyectable que comprende una poblacion de celulas madre no adherentes. En determinadas realizaciones, una composicion inyectable se administra quirurgicamente en la region del defecto oseo. En determinadas realizaciones, la composicion inyectable se administra sistemicamente.
En determinados ejemplos, las celulas madre no son adherentes. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD44-. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de las celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de las celulas son celulas madre CD34+ y CD44*. En determinados otros ejemplos, las celulas madre placentarias son adherentes. En ejemplos espedficos, las celulas madre placentarias son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide; u OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides; o cualquier combinacion de las mismas. En ejemplos mas espedficos de las celulas madre placentarias no adherentes, la celula madre CD200+, HLA-G+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+; la celula madre CD73+, CD105+, y CD200+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+; la celula madre CD200+, OCT-4+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+; la celula madre aislada de la reivindicacion 1 , en donde dicha celula madre CD73+, CD105+ y HLA-G+ es CD34', CD45', OCT-4+ y CD200+; la celula madre CD73+ y CD105+ aislada que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es OCT4+, CD34- CD38' y CD45'; y/o la OCT-4+ aislada y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es CD73+, CD105+, CD200+, CD34', CD38', y CD45'. En determinados ejemplos, la poblacion ha sido expandida.
En la presente memoria se describe ademas un metodo para producir una poblacion de celulas que comprende seleccionar celulas que a) se adhieren a un sustrato, y b) expresan CD34 y no expresan CD44, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En determinados ejemplos, el metodo comprende ademas aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En determinados ejemplos, el metodo para producir una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan CD34 y no expresan CD44, y (c) facilitan la formacion de matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En determinados ejemplos, dicho sustrato comprende fibronectina. En determinados ejemplos, en la presente memoria se describe un metodo para producir una poblacion de celulas que comprende seleccionar celulas que a) no se adhieren a un sustrato, y b) expresan CD34 y no expresan CD44, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En determinados ejemplos, el metodo comprende ademas aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En determinados ejemplos, el metodo para producir una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas que (a) no se adhieren a un sustrato, (b) expresan CD34 y no expresan CD44, y (c) facilitan la formacion de matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En determinados ejemplos, dicho sustrato comprende fibronectina. En determinados ejemplos, el metodo comprende seleccionar celulas que expresan al menos uno de los siguientes: CD9, CD29, CD54, CD90, CD166, o una combinacion de los anteriores. En determinados ejemplos, el metodo comprende seleccionar celulas que expresan al menos uno de los siguientes: CD31, CD34, CD117, CD133, CD200, o una combinacion de los anteriores.
En determinados casos, la seleccion se consigue usando un anticuerpo. En determinados casos, la seleccion se consigue usando citometna de flujo. En determinados casos, la seleccion se consigue usando lechos magneticos. En determinados casos, la seleccion se consigue por separacion celular activada por fluorescencia. En determinadas realizaciones, la poblacion de celulas se expande.
En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+ y CD44-, en donde las celulas se han criopreservado, y en
donde la poblacion esta contenida en un contenedor. En determinados ejemplos, las celulas se han criopreservado, y en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor, y en donde dichas celulas madre forman una matriz mineralizada cuando se cultivan bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
En determinadas realizaciones, la composicion para uso en la invencion esta contenida en un contenedor, en donde
el contenedor es una bolsa adecuada para la administracion intravenosa de un lfquido. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 1 x 106 de dichas celulas madre adherentes. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 5 x 106 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende
1 x 107 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 5 x 107 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 1 x 108 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 5 x 108 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 1 x 109 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende
5 x 109 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 1 x 1010 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, las celulas madre se han subcultivado no mas de 5 veces. En determinadas realizaciones, las celulas madre se han subcultivado no mas de 10 veces. En determinadas realizaciones, las celulas madre se han subcultivado no mas de 15 veces. En determinadas realizaciones, las celulas madre se han subcultivado
no mas de 20 veces. En determinadas realizaciones, las celulas madre han sido expandidas en dicho contenedor. En determinadas realizaciones, dichas celulas madre estan contenidas en una disolucion de NaCl al 0.9 %.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para producir celulas osteogenicas que comprende cultivar una pluralidad de celulas madre placentarias o una poblacion de celulas madre placentarias aisladas, bajo condiciones en las que dichas celulas madre se diferencian en celulas osteogenicas, siendo dicho cultivo durante un
tiempo suficiente para que dichas celulas osteogenicas produzcan, o faciliten la produccion de, cantidades detectables de calcio mineralizado.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un metodo para formular una matriz, que comprende combinar una poblacion de celulas madre placentarias con un sustrato de soporte implantable. En un ejemplo, dichas celulas madre son CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinadas realizaciones, las celulas madre son adherentes. En realizaciones espedficas, las celulas madre placentarias adherentes son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y
OCT-4+; CD200+, CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD200+, CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide; o CD200+ y
OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides; o cualquier combinacion de las mismas. En realizaciones mas espedficas de las celulas madre placentarias adherentes, la celula madre CD200+, HLA-G+ aislada es CD34-, CD38-,
CD45-, CD73+ y CD105+; la celula madre CD73+, CD105+, y CD200+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-celula madre CD200+, OCT-4+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+; la celula madre aislada de
la reivindicacion 1 , en donde dicha celula madre CD73+, CD105+ y HLA-G+ es CD34-, CD45-, OCT-4+ y CD200+; la celula madre CD73+ y CD105+ aislada que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es OCT4+, CD34-, CD38- y CD45-; y/o la OCT-4+ aislada y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, y CD45-. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 1 x 106 de dichas celulas madre adherentes. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 5 x 106 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 1 x 107 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 5 x 107 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 1 x 108 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 5 x 108 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende
1 x 109 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 5 x 109 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, la composicion comprende 1 x 1010 de dichas celulas madre. En determinadas realizaciones, las celulas madre se han subcultivado no mas de 5 veces. En determinadas realizaciones, las celulas madre se han subcultivado no mas de 10 veces. En determinadas realizaciones, las celulas madre se han subcultivado
no mas de 15 veces. En determinadas realizaciones, las celulas madre se han subcultivado no mas de 20 veces. En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias han sido expandidas.
La composicion para uso en la invencion se formula para ser implantable. En determinadas realizaciones, el sustrato
de soporte implantable se selecciona del grupo que consiste en un sustrato de p-fosfato tricalcico, sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno placentario humano mineralizado, y un sustrato de acido hialuronico. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de colageno. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de fosfato de calcio. En determinadas realizaciones, el sustrato de soporte implantable es un sustrato y/o soporte de colageno placentario humano mineralizado.
La composicion para uso en la invencion se formula como una composicion inyectable, que comprende combinar las celulas madre placentarias para uso en la invencion con acido hialuronico o colageno inyectable. En un ejemplo, dichas celulas madre son CD34+ y CD44'. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44'. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44'. En determinados ejemplos, la poblacion ha sido expandida. En determinadas realizaciones, las celulas madre son celulas madre placentarias CD200+ adherentes. En determinadas realizaciones, la composicion comprende acido hialuronico inyectable. En determinadas realizaciones, la composicion comprende colageno inyectable. En la presente memoria tambien se describen composiciones que comprenden una poblacion de celulas madre no adherentes y acido hialuronico o colageno inyectable.
En otro ejemplo mas, en la presente memoria se describe un metodo para tratar defectos oseos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, una composicion implantable o inyectable que comprende una poblacion de celulas madre, en donde dichas celulas madre son CD34+ y CD44', tratando de esta manera el defecto oseo en el sujeto. En determinadas realizaciones, el defecto oseo es (a) una lesion osteolftica asociada con un cancer, (b) una fractura osea, o (c) una medula espinal que necesita fusion. En determinados ejemplos, la lesion osteolftica esta asociada con mieloma multiple, cancer oseo, o cancer metastasico. En determinados ejemplos, la fractura osea es una fractura no de union. En determinados ejemplos, se administra al sujeto una composicion implantable que comprende una poblacion de celulas madre no adherentes. En determinadas realizaciones, la composicion implantable se implanta quirurgicamente. En determinados ejemplos, se administra al sujeto una composicion inyectable que comprende una poblacion de celulas madre no adherentes. En determinados ejemplos, la composicion inyectable se administra quirurgicamente en la region del defecto oseo. En determinados ejemplos, la composicion inyectable se administra sistemicamente.
En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44- En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44- En determinados ejemplos, la poblacion ha sido expandida.
En otro ejemplo mas, en la presente memoria se describe un metodo para tratar defectos oseos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composicion implantable o inyectable que comprende una poblacion de celulas madre, en donde dichas celulas madre son CD34' y, tratando de esta manera el defecto oseo en el sujeto. En determinados ejemplos, el defecto oseo es (a) una lesion osteolftica asociada con un cancer, (b) una fractura osea, o (c) una medula espinal que necesita fusion. En determinados ejemplos, la lesion osteolftica esta asociada con mieloma multiple, cancer oseo, o cancer metastasico. En determinados ejemplos, la fractura osea es una fractura no de union. En determinados ejemplos, se administra al sujeto una composicion implantable que comprende una poblacion de celulas madre adherentes. En determinados ejemplos, la composicion implantable se implanta quirurgicamente. En determinados ejemplos, se administra al sujeto una composicion inyectable que comprende una poblacion de celulas madre adherentes. En determinados ejemplos, la composicion inyectable se administra quirurgicamente en la region del defecto oseo. En determinados ejemplos, la composicion inyectable se administra sistemicamente.
En determinados ejemplos de las celulas madre placentarias no adherentes, la celula madre CD200+, HLA-G+ aislada es CD34-, CD38-, CD45', CD73+ y CD105+; la celula madre CD73+, CD105+, y CD200+ aislada es CD34', CD38-CD45-, y HLA-G+; la celula madre CD200+, OCT-4+ aislada es CD34', CD38', CD45', CD73+, CD105+ y HLA-G+; la celula madre aislada de la reivindicacion 1, en donde dicha celula madre CD73+, CD105+ y HLA-G+ es CD34', CD45', OCT-4+ y CD200+; la celula madre CD73+ y CD105+ aislada que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es OCT4+, CD34', CD38' y CD45- y/o la OCT-4+ aislada y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es CD73+, CD105+, CD200+, CD34', CD38', y CD45'. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 106 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 5 x 106 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 107 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 5 x 107 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 108 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 5 x 108 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 109 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 5 x 109 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, la poblacion comprende 1 x 1010 de dichas celulas madre. En determinados ejemplos, las celulas madre se han subcultivado no mas de 5 veces. En determinados ejemplos, las celulas madre se han subcultivado no mas de 10 veces. En determinados ejemplos, las celulas madre se han subcultivado no mas de 15 veces. En determinados ejemplos, las celulas madre se han subcultivado no mas de 20 veces. En determinados ejemplos, la poblacion ha sido expandida.
En la presente memoria tambien se describen metodos para producir poblaciones de celulas madre derivadas de placenta de mairnfero. En un ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para producir una poblacion de celulas que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD200 y HLA-G; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para producir una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD73, CD 105, y CD200; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para producir una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato y (b) expresan CD200 y OCT-4; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro ejemplo mas, en la presente memoria se describe un metodo para producir una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan CD73 y CD105, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultivan con una poblacion de celulas placentarias bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para producir una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD73, CD105 y HLA-G; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En la presente memoria tambien se describe un metodo para producir una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan OCT-4, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultivan con una poblacion de celulas placentarias bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En un ejemplo espedfico de cualquiera de los metodos anteriores, dicho sustrato comprende fibronectina. En otro ejemplo espedfico, los metodos comprenden seleccionar celulas que expresan ABC-p. En otro ejemplo espedfico, los metodos comprenden seleccionar celulas que presentan al menos una caractenstica espedfica de una celula madre mesenquimal. En otro ejemplo, dicha caractenstica espedfica de una celula madre mesenquimal es la expresion de CD29, la expresion de CD44, la expresion de CD90, o la expresion de una combinacion de los anteriores. En otro ejemplo de los metodos, dicha seleccion se consigue usando un anticuerpo. En otro ejemplo, dicha seleccion se consigue usando citometna de flujo. En otro ejemplo, dicha seleccion se consigue usando lechos magneticos. En otro ejemplo, dicha seleccion se consigue por separacion celular activada por fluorescencia. En otro ejemplo de los metodos anteriores, dicha poblacion de celulas se expande.
En la presente memoria tambien se describe un metodo para producir una lmea de celulas madre, que comprende transformar una celula madre con una secuencia de ADN que codifica una protema que estimula el crecimiento; y exponer dicha celula madre a condiciones que estimulen la produccion de dicha protema que estimula el crecimiento. En un ejemplo espedfico, dicha protema que estimula el crecimiento es v-myc, N-myc, c-myc, p53, antfgeno T grande de SV40, antfgeno T grande de polioma, protema E1a de adenovirus o E7 de papilomavirus humano. En un ejemplo mas espedfico, dicha secuencia de ADN se puede regular. En un ejemplo mas espedfico, dicha secuencia de ADN se puede regular por tetraciclina. En otro ejemplo, dicha protema que estimula el crecimiento tiene una actividad que se puede regular. En otro ejemplo, dicha protema que estimula el crecimiento es un mutante sensible a la temperatura.
En la presente memoria tambien se describen poblaciones de celulas madre criopreservadas. Por ejemplo, la composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion de celulas madre placentarias adherentes CD200+, HLA-G+ para uso en la invencion, en donde dichas celulas se han criopreservado, y en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor. En la presente memoria tambien se proporciona dicha composicion que comprende una poblacion de celulas madre placentarias adherentes CD73+, CD105+, CD200+ para uso en la invencion, en donde dichas celulas madre se han criopreservado, y en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor. En la presente memoria tambien se proporciona dicha composicion que comprende una poblacion de celulas madre placentarias adherentes CD200+, OCT-4+ para uso en la invencion, en donde dichas celulas madre se han criopreservado, y en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor. En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas madre CD73+, CD105+, en donde dichas celulas se han criopreservado, y en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor, y en donde dichas celulas madre facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultivan con una poblacion de celulas placentarias bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En la presente memoria se describe ademas una poblacion de celulas madre CD73+, CD105+, HLA-G+, en donde dichas celulas se han criopreservado, y en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor. En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas madre OCT-4+, en donde dichas celulas se han criopreservado, en donde dicha poblacion esta contenida en un contenedor, y en donde dichas celulas madre facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultivan con una poblacion de celulas placentarias bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En una realizacion espedfica de cualquiera de las poblaciones criopreservadas anteriores para uso en la invencion, dicho contenedor es una bolsa. En varias realizaciones espedficas, dicha poblacion comprende aproximadamente, al menos, o como maximo 1 x 106 de dichas celulas madre, 5 x 106 de dichas celulas madre, 1 x 107 de dichas celulas madre, 5 x 107 de dichas celulas madre, 1 x 108 de dichas celulas madre, 5 x 108 de dichas celulas madre, 1 x 109 de dichas celulas madre, 5 x 109 de dichas celulas madre, o 1 x 1010 de dichas celulas madre. En otras realizaciones espedficas de cualquiera de las poblaciones criopreservadas anteriores para uso en la invencion, dichas celulas madre se han subcultivado aproximadamente, al menos, o no mas de 5 veces, no mas de 10 veces, no mas de 15 veces, o no mas de 20 veces. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las poblaciones criopreservadas anteriores para uso en la invencion, dichas celulas madre han sido expandidas en dicho contenedor.
En la presente memoria se describe ademas un metodo para preparar una matriz de colageno mineralizado, que comprende mineralizar el colageno y entrecruzar la matriz de colageno mineralizado. En determinados ejemplos, el colageno es colageno placentario. En determinados ejemplos, el colageno se mineraliza con fosfato de calcio. En determinados ejemplos, el colageno se entrecruza con eter diglicidil butano diol. En determinados ejemplos, la relacion de fosfato de calcio a colageno en la reaccion de mineralizacion es 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, o 95:5.
2.1. Definiciones
Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "SH2" se refiere a un anticuerpo que se une a un epftopo en el marcador CD105. Asf, las celulas que se refieren como SH2+ son CD105+.
Tal y como se usa en la presente memoria, los terminos "SH3" y SH4" se refieren a anticuerpos que se unen a epftopos presentes en el marcador CD73. Asf, las celulas que se refieren como SH3+ y/o SH4+ son CD73+.
Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "celula madre aislada" significa una celula madre que se separa sustancialmente de otras celulas no madre del tejido, p. ej., placenta, del que deriva la celula madre. Una celula madre esta "aislada" si al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o al menos el 99 % de las celulas no madre con las que la celula madre esta asociada naturalmente se eliminan de la celula madre, p. ej., durante la recogida y/o cultivo de la celula madre.
Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "poblacion de celulas aisladas" significa una poblacion de celulas que se separa sustancialmente de otras celulas del tejido, p. ej., placenta, del que deriva la poblacion de las celulas. Una celula madre esta "aislada" si al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o al menos el 99 % de las celulas con las que la poblacion de celulas, o celulas de las que deriva la poblacion de celulas, esta asociada naturalmente se elimina de la celula madre, p. ej., durante la recogida y/o cultivo de la celula madre.
Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "celula madre placentaria" se refiere a una celula madre o celula progenitora que deriva de una placenta de marnffero, independientemente de la morfologfa, marcadores de la superficie celular, o el numero de subcultivos despues de un cultivo primario. El termino "celula madre placentaria" tal y como se usa en la presente memoria no se refiere, sin embargo, a un trofoblasto. Una celula se considera una "celula madre" si la celula retiene al menos un atributo de una celula madre, p. ej., un marcador o perfil de expresion genica asociado con uno o mas tipos de celulas madre; la capacidad de replicarse al menos 10-40 veces en cultivo, la capacidad de diferenciarse en celulas de las tres capas germinales; la ausencia de caractensticas de celulas adultas (es decir, diferenciadas), o semejantes. Los terminos "celula madre placentaria" y "celula madre derivada de placenta" pueden usarse indistintamente.
Tal y como se usa en la presente memoria, "perfusado placentario" significa disolucion de perfusion que se ha pasado a traves de al menos parte de una placenta, p. ej., una placenta humana, p. ej., a traves de la vasculatura placentaria, incluyendo una pluralidad de celulas recogidas por la disolucion de perfusion durante el paso a traves de la placenta.
Tal y como se usa en la presente memoria, "celulas de perfusado placentario" significa celulas nucleadas, p. ej., celulas nucleadas totales, aisladas de, o que se pueden aislar de, el perfusado placentario.
Tal y como se usa en la presente memoria, una celula madre es "positiva" para un marcador particular cuando ese marcador es detectable. Por ejemplo, una celula madre placentaria es positiva para, p. ej., CD73 porque CD73 es detectable en celulas madre placentarias en una cantidad detectablemente mayor que el fondo (en comparacion con, p. ej., un control de isotipo). Una celula tambien es positiva para un marcador cuando ese marcador puede usarse para distinguir la celula de al menos otro tipo de celula, o puede usarse para seleccionar o aislar la celula cuanto esta presente o se expresa por la celula.
Tal y como se usa en la presente memoria, una "celula osteogenica" es una celula que es capaz bien de depositar hidroxiapatito, el componente principal del hueso, o diferenciarse en una celula que es capaz de depositar hidroxiapatito. Una "celula osteogenica" se contempla espedficamente como que engloba una celula referida de forma ordinaria como un osteoblasto o un osteocito.
Tal y como se usa en la presente memoria, una "matriz" se refiere a una sustancia tridimensional que se caracteriza por lacunae dispersadas a lo largo de la sustancia. Las lacunae son adecuadas, por ejemplo, para el crecimiento de celulas, p. ej., celulas madre, celulas madre adherentes derivadas de placenta, y/o celulas osteogenicas, en la matriz. Las matrices ejemplares incluyen, pero no estan limitadas a, un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno placentario humano mineralizado, un sustrato de acido hialuronico, y un sustrato ceramico. Preferiblemente, la matriz puede mineralizarse por una celula osteogenica presente en las lacunae de la matriz.
3. Descripcion breve de las figuras
FIG. 1: Viabilidad de las celulas madre placentarias de perfusion (A), amnios (B), corion (C), placa amnios-corion (D) o cordon umbilical (E). Los numeros en el eje de las X designan la placenta de la que se obtuvieron las celulas madre. FIG. 2: Porcentaje de celulas HLA ABCYCD45VCD34VCD133+ de perfusion (A), amnios (B), corion (C), placa amnioscorion (D) o cordon umbilical (E) segun se determina por FACSCalibur. Los numeros en el eje de las X designan la placenta de la que se obtuvieron las celulas madre.
FIG. 3: Porcentaje de celulas HLA ABCYCD45VCD34VCD133+ de perfusion (A), amnios (B), corion (C), placa amnioscorion (D) o cordon umbilical (E), segun se determina por FACS Aria. Los numeros en el eje de las X designan la placenta de la que se obtuvieron las celulas madre.
FIG. 4: Expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, en madre derivadas de perfusado placentario.
FIG. 5: Expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, en madre derivadas de amnios.
FIG. 6: Expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, en madre derivadas de corion.
FIG. 7: Expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, en madre derivadas de placa amnios-corion.
FIG. 8: Expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 en madre derivadas de cordon umbilical.
FIG. 9: Expresion promedio de la expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 en celulas madre derivadas de perfusion (A), amnios (B), corion (C), placa amnios-corion (D) o cordon umbilical (E).
FIG. 10: Evolucion temporal de cultivos para amnios/corion (AC), cordon umbilical (UC), celula madre derivada de la medula osea (BM-MSC) y lmeas celulares de fibroblastos dermicos humanos (NHDF) usadas en este estudio. Todos los cultivos se crecieron y propagaron usando las mismas densidades de siembra y subcultivo. Los drculos indican que cultivos se usaron para el aislamiento del ARN. Los cultivos tardfos se recogieron justo antes de la senescencia. Dos cultivos de UC se recogieron a las 38 duplicaciones (UC-38) para comparar el efecto de la tripsinizacion en la expresion genica. Todos los demas cultivos se lisaron directamente en sus matraces de cultivo antes del aislamiento del ARN.
FIG. 11: Grafica de lmeas de los niveles de expresion relativa de 8215 genes en amnios/corion (AC), cordon umbilical (UC), celula madre derivada de la medula osea (BM-MSC) y celulas fibroblastos dermicos (DF) humanos. El numero asociado con la designacion de cada lmea celular en el eje de las X indica el numero de dfas que se cultivo la lmea celular antes de la evaluacion de los niveles de expresion genica. La grafica se genero a partir de los datos de expresion del ARN analizados por el software GeneSpring. Se uso AC-03 como la condicion seleccionada.
FIG. 12: Subconjunto de la lista de todos los genes que muestra los genes sobreexpresados > 6 veces en AC-03 para amnios/corion (AC), cordon umbilical (UC), celula madre derivada de la medula osea (BM-MSC) y celulas de fibroblastos dermicos (DF) humanos. El numero asociado con la designacion de cada lmea celular en el eje de las X indica el numero de d^as que se cultivo la lmea celular antes de la evaluacion de los niveles de expresion genica. La grafica se genero a partir de los datos de expresion del ARN analizados por el software GeneSpring. Se uso AC-03 como la condicion seleccionada.
FIG. 13: Genes espedficos de celula madre placentaria o espedficos de celula madre del cordon umbilical encontrados por filtracion de las veces de cambio para amnios/corion (AC), cordon umbilical (UC), celula madre derivada de la medula osea (BM-MSC) y celulas de fibroblastos dermicos (DF) humanos. El numero asociado con la designacion de cada lmea celular en el eje de las X indica el numero de dfas que se cultivo la lmea celular antes de la evaluacion de los niveles de expresion genica. La grafica se genero a partir de los datos de expresion del ARN analizados por el software GeneSpring. Se uso AC-03 como la condicion seleccionada.
FIG 14: Actividad de fosfatasa alcalina tanto de celulas madre placentarias (FIG 14A) como de celulas madre mesenquimales (FIG 14B) cultivadas en dos formulaciones de medio diferentes.
FIG 15: Mineralizacion de las celulas madre placentarias (FIG 15A) cultivadas en dos formulaciones de medio diferentes.
FIG 16: Depositos de minerales por celulas madre placentarias inducidas en medio OS, pero no en medio AnthrolB.
FIG 17: Evolucion temporal del crecimiento de las celulas madre placentarias y celulas madre mesenquimales crecidas en dos soportes diferentes.
FIG 18: Micrograffas electronicas de barrido (20x) de las celulas madre placentarias y celulas madre mesenquimales crecidas en medio OS y Anthro1 B en un sustrato de p-fosfato tricalcico.
FIG 19: Micrograffas electronicas de barrido (5000x) de las celulas madre placentarias y celulas madre mesenquimales crecidas en medio OS y Anthro1B en un sustrato de p-fosfato tricalcico.
FIG 20: Tincion con rojo de Alizarina de celulas madre mesenquimales y celulas madre obtenidas de celulas de placenta humana perfundida que muestra mineralizacion de calcio despues de cultivo en medio OS, pero no en DMEM.
FIG 21: Actividad AP de celulas madre mesenquimales y celulas madre despues de 10 dfas de cultivo en medio OS en presencia de un sustrato de p-fosfato tricalcico.
FIG 22: Electromicrograffas que muestran fibrillas de colageno (panel A) y fibrillas de colageno mineralizado (panel B).
FIG 23: Diagrama que muestra que la relacion mineral/colageno final del colageno mineralizado entrecruzado estaba cerca de la relacion mineral/colageno de entrada.
FIG. 24: Seccion histologica de defecto craneal 3 semanas despues del implante. Puede observarse una deposicion masiva de hueso en el defecto en el explante de celulas madre placentarias-HEALOS™.
FIGS. 25A-25C: Analisis por rayos X de los defectos craneales a las 7 semanas despues del implante. FIG. 25A: la flecha indica el explante usado como control positivo BMP-2 HEALOS™. FIG. 25B: la flecha indica explante de celulas madre placentarias HEALOS™ que muestra deposicion de hueso. FIG. 25C: Controles negativos HEALOS™ solo y defecto craneal sin explante.
FIG. 26: Cuantificacion de la formacion de hueso por densitometna. La escala en gris creciente (eje de las Y) indica densidad/deposicion de hueso creciente. Eje de las X: Clase de tratamiento.
4. Descripcion detallada
4.1 Celulas madre placentarias y poblaciones de celulas madre placentarias
Las celulas madre placentarias son celulas madre, que se pueden obtener de una placenta o parte de la misma, que se adhieren a un sustrato de cultivo tisular y tienen la capacidad de diferenciarse en tipos celulares no placentarios. Las celulas madre placentarias pueden tener un origen bien fetal o materno (esto es, pueden tener el genotipo bien de la madre o del feto). Las poblaciones de celulas madre placentarias, o poblaciones de celulas que comprenden celulas madre placentarias, pueden comprender celulas madre placentarias que tienen un origen solamente fetal o materno, o pueden comprender una poblacion mixta de celulas madre placentarias tanto de origen fetal como materno. Las celulas madre placentarias, y poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias, pueden identificarse y seleccionarse por la caractenstica morfologica, de marcador, y de cultivo discutida mas adelante.
En un aspecto de la invencion, se proporcionan composiciones que comprenden celulas madre placentarias CD200+ adherentes para uso en el tratamiento de un defecto oseo en un sujeto, en donde dicha composicion se formula para ser implantable o inyectable.
En otro aspecto de la invencion, se proporcionan usos de una composicion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un defecto oseo en un sujeto, en donde dicha composicion comprende celulas madre placentarias CD200+ adherentes, y en donde dicha composicion se formula para ser implantable o inyectable.
En determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias adherentes son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otras realizaciones, dichas celulas madre placentarias adherentes han sido subcultivadas al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces.
En determinadas realizaciones, el defecto oseo es una lesion osteolftica asociada con un cancer, una fractura osea, o una medula espinal necesitada de fusion. En una realizacion particular, dicha lesion osteolftica asociada con cancer es una lesion osteolftica asociada con mieloma multiple, cancer oseo, o cancer metastasico. En otra realizacion particular, dicho cancer es mieloma multiple. En otra realizacion, dicho cancer es cancer oseo. En otra realizacion, dicho cancer es cancer metastasico.
En determinadas realizaciones, dicha composicion se formula para ser inyectable en el sitio de dicho defecto oseo. En otra realizacion, dicha composicion es inyectable y se formula para administracion sistemica. En determinadas realizaciones, dicha composicion comprende al menos 5 x 106 de dichas celulas madre placentarias por mililitro. En otra realizacion, dicha composicion comprende un sustrato o matriz implantable.
4.1.1 Caractensticas ffsicas y morfologicas
Las celulas madre CD34+ no adherentes descritas en la presente memoria, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, no se adhieren tipicamente al sustrato del cultivo tisular. Las celulas madre no adherentes en cultivo aparecen tipicamente redondeadas, similares a las celulas madre CD34+ de la medula osea o sangre periferica.
Las celulas madre placentarias adherentes para uso en la invencion, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato de cultivo tisular, p. ej., superficie del contenedor de cultivo tisular (p. ej., plastico de cultivo tisular). Las celulas madre placentarias en cultivo asumen una apariencia generalmente fibroblastoide, estrellada, con un numero de procesos citoplasmicos que se extienden desde el cuerpo celular central. Las celulas madre placentarias son, sin embargo, morfologicamente diferenciables de los fibroblastos cultivados bajo las mismas condiciones, ya que las celulas madre placentarias presentan un numero mayor de dichos procesos que los fibroblastos. Morfologicamente, las celulas madre placentarias tambien son diferenciables de las celulas madre hematopoyeticas, que generalmente asumen una morfologfa mas redondeada, o de empedrado, en cultivo.
4.1.2 Marcadores de la superficie celular, moleculares y geneticos
Celulas madre placentarias no adherentes: En un ejemplo, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria aislada que no es adherente. En determinados ejemplos, la celula madre aislada es CD34+. En determinados ejemplos, la celula madre aislada es CD44-. En determinados ejemplos, la celula madre aislada es CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, la celula madre aislada es CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, la celula madre aislada es CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, la celula madre aislada es CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, la celula madre aislada es CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, la celula madre aislada se ha aislado de una placenta humana por perfusion, o por disrupcion ffsica o bioqmmica de tejido placentario, p. ej., digestion enzimatica. En determinados ejemplos, la celula madre aislada se ha aislado de una placenta humana por perfusion. En determinados ejemplos, la celula madre aislada facilita la formacion de una matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas placentarias aisladas que no son adherentes. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre que son CD34+. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre no adherentes que son CD44-. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre que son CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre que son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre que son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre que son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre que son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre, en donde al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, la poblacion comprende celulas madre, en donde al menos aproximadamente el 90 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas madre placentarias aisladas que son CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de las celulas madre son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de las celulas madre son celulas madre CD34+ y CD44-.
Celulas madre placentarias adherentes: Las celulas madre placentarias adherentes para uso en la invencion y las poblaciones de celulas madre placentarias, expresan una pluralidad de marcadores que pueden usarse para identificar y/o aislar las celulas madre, o poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre. Las celulas madre placentarias adherentes para uso en la invencion, y las poblaciones de celulas madre proporcionadas en la presente memoria (esto es, dos o mas celulas madre placentarias) incluyen celulas madre y poblaciones de celulas que contienen celulas madre obtenidas directamente de la placenta, o cualquier parte de la misma (p. ej., amnios, corion, cotiledones placentarios, cordon umbilical, y semejantes). Las poblaciones de celulas madre placentarias tambien incluyen poblaciones de (esto es, dos o mas) celulas madre placentarias adherentes en cultivo, y una poblacion en un contenedor, p. ej., una bolsa. Las celulas madre placentarias no son, sin embargo, trofoblastos.
Las celulas madre placentarias adherentes descritas en la presente memoria expresan generalmente los marcadores CD73, CD105, CD200, HLA-G, y/o OCT-4, y no expresan CD34, CD38, o CD45. Las celulas madre placentarias tambien pueden expresar HLA-ABC (MHC-1) y HLA-DR. Estos marcadores pueden usarse para identificar a las celulas madre placentarias, y para distinguir las celulas madre placentarias de otros tipos de celulas madre. Como las celulas madre placentarias pueden expresar CD73 y CD105, pueden tener caractensticas semejantes a las celulas madre mesenquimales. Sin embargo, como las celulas madre placentarias pueden expresar CD200 y HLA-G, un marcador espedfico fetal, pueden distinguirse de las celulas madre mesenquimales, p. ej., celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea, que no expresan CD200 ni HLA-G. De la misma manera, la ausencia de expresion de CD34, CD38 y/o CD45 identifica a las celulas madre placentarias como celulas madre no hematopoyeticas. Sin embargo, determinados subconjuntos de celulas madre placentarias pueden expresar, por ejemplo, CD34, y todavfa ser consideradas como celulas madre placentarias como se proporciona en la presente memoria.
Asf, en una realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en la invencion que comprende una celula madre placentaria adherente aislada que es CD200+. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es una celula madre placentaria. En una realizacion espedfica, la celula madre es CD200+ y HLA-G+. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34', CD38' o CD45'. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34', CD38' y CD45- En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34', CD38', CD45', CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre CD200+ facilita la formacion de cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende las celulas madre, bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria tambien se proporciona un metodo para seleccionar una celula madre placentaria para uso en la invencion a partir de una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una celula placentaria CD200, mediante lo cual dicha celula es una celula madre placentaria. En una realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tanto CD200+ como HLA-G+. En una realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34', CD38' o CD45'. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34', CD38' y CD45- En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34', CD38', CD45', CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien facilita la formacion de cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende las celulas madre, bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una poblacion aislada de celulas que comprende celulas madre placentarias CD200+, HLA-G+ adherentes aisladas para uso en la invencion. En una realizacion espedfica, dicha poblacion es una poblacion de celulas placentarias. En otra realizacion espedfica, la poblacion es una poblacion celulas madre placentarias CD200+, HLA-G+ adherentes aisladas. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, HLA-G+. Preferiblemente, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, HLA-G+. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente el 90 %, 95 %, o 99 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, HLA-G+. En una realizacion espedfica de las poblaciones aisladas, dichas celulas madre tambien son CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre tambien son CD34-, CD38- o CD45-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre tambien son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion, dicha poblacion aislada produce uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo para seleccionar una poblacion de celulas madre placentarias para uso en la invencion a partir de una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias en donde al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, HLA-G+. En una realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que tambien son CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que tambien son CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que tambien son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion tambien comprende seleccionar una poblacion de celulas madre placentarias que forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en la invencion que comprende una celula madre aislada que es CD73+, CD105+, y CD200+. En una realizacion espedfica, dicha celula madre aislada es una celula madre placentaria adherente aislada. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, la celula madre CD73+, CD105+, y CD200+ aislada facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre, cuando la poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo para seleccionar una celula madre placentaria adherente para uso en la invencion a partir de una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una celula placentaria CD73+, CD105+, y CD200+, mediante lo cual dicha celula es una celula madre placentaria. En una realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende adicionalmente seleccionar una celula madre CD73+, CD105+, y CD200+ que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre, cuando la poblacion se cultiva bajo condiciones que facilitan la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, la composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion aislada de celulas que comprende celulas madre placentarias adherentes CD73+, CD105+, CD200+. En un ejemplo espedfico, dichas celulas madre son celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, la poblacion es una poblacion de celulas madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 % de dichas celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 90 %, 95 % o 99 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+. En una realizacion espedfica de dichas poblaciones, dichas celulas madre tambien son HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre son CD34-, CD38- o CD45-. En otro ejemplo espedfico, dichas celulas madre son CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre son CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas produce uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo para seleccionar una celula madre placentaria para uso en la invencion a partir de una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias en donde al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas son celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En una realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que tambien son HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que tambien son CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que tambien son CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que tambien son CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende adicionalmente seleccionar una poblacion de celulas placentarias que produce uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando la poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En la presente memoria tambien se proporciona una composicion para uso en la invencion que comprende una celula madre placentaria adherente que es CD200+ y OCT-4+. En una realizacion espedfica, la celula madre es adicionalmente CD73+ y CD105+. En una realizacion espedfica, la celula madre es una celula madre placentaria. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, la celula madre facilita la produccion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides por una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre, cuando la poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo para seleccionar una celula madre placentaria para uso en la invencion a partir de una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una celula placentaria CD200+ y OCT-4+, mediante lo cual dicha celula es una celula madre placentaria. En una realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula madre placentaria que tambien facilita la produccion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides por una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre, cuando la poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
La composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion aislada de celulas que comprende celulas madre placentarias adherentes CD200+, OCT-4+ para uso en la invencion. Dichas celulas madre son celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion es una poblacion de celulas madre placentarias adherentes CD200+, OCT-4+. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, OCT-4+. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son dichas celulas madre CD200+, OCT-4+. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 90 %, 95 %, o 99 % de dichas celulas son dichas celulas madre CD200+, OCT-4+. En una realizacion espedfica de las poblaciones aisladas, dichas celulas madre son tambien CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre tambien son HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre tambien son CD34-, CD38- y CD45-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre tambien son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion produce uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo para seleccionar una poblacion de celulas madre placentarias para uso en la invencion a partir de una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias en donde al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas son celulas madre placentarias adherentes CD200+, OCT-4+. En una realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre placentarias que tambien son CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre placentarias que tambien son HLA-G+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre placentarias que tambien son CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre tambien son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+.
En la presente memoria se proporciona ademas una composicion para uso en la invencion que comprende celulas madre placentarias adherentes que son CD200+, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En una realizacion espedfica, la celula madre es una celula madre placentaria. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es adicionalmente OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es CD200+. En una realizacion mas espedfica, dicha celula madre es CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre facilita la formacion de cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre, cuando la poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En otra realizacion, en la presente memoria tambien se proporciona un metodo para seleccionar una celula madre placentaria para uso en la invencion a partir de una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una celula placentaria adherente CD73+, CD105+ y HLA-G+, mediante lo cual dicha celula es una celula madre placentaria. En una realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula madre placentaria que tambien es CD34-, CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula madre placentaria que tambien es CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula madre placentaria que tambien es OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula madre placentaria que es CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula madre placentaria que tambien es CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre, cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion aislada de celulas que comprende celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En un ejemplo espedfico, dichas celulas madre son celulas madre placentarias. En otro ejemplo, dicha poblacion es una poblacion de celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En varios ejemplos, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 % de dichas celulas son celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro ejemplo, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro ejemplo, al menos aproximadamente el 90 %, 95 % o 99 % de dichas celulas son celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En un ejemplo espedfico de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD34-, CD38- o CD45-. En otro ejemplo espedfico, dichas celulas madre son CD34-, CD38- y CD45-. En otro ejemplo espedfico, dichas celulas madre son OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias adherentes para uso en la invencion son CD200+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre son CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para seleccionar una poblacion de celulas madre placentarias a partir de una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias en donde una mayona de dichas celulas son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En un ejemplo espedfico, dicha mayona de celulas tambien son CD34-, CD38-o CD45-. En otro ejemplo espedfico, dicha mayona de celulas tambien son CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dicha mayona de celulas son CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha mayona de celulas tambien son CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe una celula madre aislada que es CD73+ y CD105+ y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En un ejemplo espedfico, dicha celula madre es CD34-, CD38- o CD45-. En otro ejemplo espedfico, dicha celula madre es CD34-, CD38- y CD45-. En otro ejemplo espedfico, dicha celula madre es OCT4+. En un ejemplo mas espedfico, dicha celula madre es OCT4+, CD34-, CD38- y CD45-.
En la presente memoria se describe ademas una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre CD73+, CD105+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En un ejemplo espedfico, dicha celula madre es una celula madre placentaria. En otro ejemplo espedfico, dicha poblacion es una poblacion de celulas madre placentarias que son celulas madre CD73+, CD105+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En varios ejemplos, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD73+, CD105+. En un ejemplo espedfico de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD34-, CD38- o CD45-. En otro ejemplo espedfico, dichas celulas madre son CD34-, CD38- y CD45-. En otro ejemplo espedfico, dichas celulas madre son OCT-4+. En un ejemplo mas espedfico, dichas celulas madre son OCT-4+, CD34-, CD38- y CD45-. En otros ejemplos espedficos, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, ha sido subcultivada al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces.
En la presente memoria se describe ademas una celula madre aislada que es OCT-4+ y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En un ejemplo espedfico, dicha celula madre es CD73+ y CD105+. En otro ejemplo espedfico, dicha celula madre es CD34-, CD38-, o CD45-. En otro ejemplo espedfico, dicha celula madre es CD200+. En un ejemplo mas espedfico, dicha celula madre es CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, y CD45-.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre OCT-4+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En un ejemplo espedfico, las celulas madre son celulas madre placentarias. En otro ejemplo espedfico, dicha poblacion es una poblacion de celulas madre placentarias que son celulas madre OCT-4+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos semejantes a embrioides cuando se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides. En varios ejemplos, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre OCT4+. En un ejemplo espedfico de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD73+ y CD105+. En otro ejemplo espedfico, dichas celulas madre son CD34', CD38', o CD45'. En otro ejemplo espedfico, dichas celulas madre son CD200+. En un ejemplo mas espedfico, dichas celulas madre son CD73+, CD105+, CD200+, CD34', CD38', y CD45'. En otro ejemplo espedfico, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, subcultivada al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces.
En la presente memoria se proporcionan ademas celulas madre placentarias para uso en la invencion que se obtienen por digestion enzimatica (vease la Seccion 5.2.3) o perfusion (vease la Seccion 5.2.4). Por ejemplo, en la presente memoria se proporciona una poblacion aislada de celulas madre placentarias para uso en la invencion que se produce segun un metodo que comprende perfundir una placenta de marnffero que ha sido drenada de sangre del cordon y perfundida para eliminar la sangre residual; perfundir dicha placenta con una disolucion de perfusion; y recoger dicha disolucion de perfusion, en donde dicha disolucion de perfusion despues de la perfusion comprende una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias; y aislar una pluralidad de dichas celulas madre placentarias de dicha poblacion de celulas. En una realizacion espedfica, la disolucion de perfusion se pasa a traves tanto de la vena umbilical como de las arterias umbilicales y se recoge despues de que exuda de la placenta. Las poblaciones de celulas madre placentarias producidas por este metodo comprenden tfpicamente una mezcla de celulas fetales y maternas. En otra realizacion espedfica, la disolucion de perfusion se pasa a traves de la vena umbilical y se recoge de las arterias umbilicales, o se pasa a traves de las arterias umbilicales y se recoge de la vena umbilical. Las poblaciones de celulas madre placentarias producidas por este metodo tfpicamente tienen un origen sustancialmente exclusivamente fetal; esto es, p. ej., mas del 90 %, 95 %, 99 %, o 99.5 % de las celulas madre placentarias en la poblacion tienen un origen fetal.
En varias realizaciones, las celulas madre placentarias para uso en la invencion, contenidas en una poblacion de celulas obtenida a partir de la perfusion de una placenta, son al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o al menos el 99.5 % de dicha poblacion de las celulas placentarias. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias recogidas por perfusion comprenden celulas fetales y maternas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias recogidas por perfusion son al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o al menos el 99.5 % celulas fetales.
En otra realizacion espedfica, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en la invencion que comprende celulas madre placentarias adherentes CD200+ recogidas por perfusion, en donde dicha composicion comprende al menos una parte de la disolucion de perfusion usada para recoger las celulas madre placentarias.
La composicion para uso en la invencion puede comprender una poblacion aislada de las celulas madre placentarias para uso en la invencion que se produce segun un metodo que comprende digerir tejido placentario con una enzima disruptora de tejido para obtener una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias, y aislar una pluralidad de celulas madre placentarias del resto de dichas celulas placentarias. El total, o cualquier parte de, la placenta puede digerirse para obtener celulas madre placentarias. En realizaciones espedficas, por ejemplo, dicho tejido placentario es una placenta completa, una membrana amniotica, corion, una combinacion de amnios y corion, o una combinacion de cualquiera de los anteriores. En otra realizacion espedfica, la enzima disruptora de tejido es tripsina o colagenasa. En varias realizaciones, las celulas madre placentarias, contenidas en una poblacion de celulas obtenida de la digestion de una placenta, son al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o al menos el 99.5 % de dicha poblacion de celulas placentarias.
El perfilado genetico confirma que las celulas madre placentarias adherentes aisladas, y las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas, se pueden distinguir de otras celulas, p. ej., celulas madre mesenquimales, p. ej., celulas madre derivadas de la medula osea. Las celulas madre placentarias adherentes descritas en la presente memoria, pueden distinguirse de las celulas madre mesenquimales sobre la base de la expresion de uno o mas genes, cuya expresion es espedfica de las celulas madre placentarias o celulas madre del cordon umbilical en comparacion con celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea. En particular, las celulas madre placentarias adherentes pueden distinguirse de las celulas madre mesenquimales sobre la base de la expresion de uno o mas genes, cuya expresion es significativamente mayor (esto es, al menos dos veces mayor) en celulas madre placentarias que en celulas madre mesenquimales, en donde el uno o mas gene(s) (son) ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, o una combinacion de cualquiera de los anteriores, en donde la expresion de estos genes es mayor en celulas madre placentarias o celulas madre del cordon umbilical que en celulas madre derivadas de la medula osea, cuando las celulas madre se crecen en condiciones equivalentes. En una realizacion espedfica, el gen espedfico de la celula madre placentaria o espedfico de la celula madre del cordon umbilical es CD200.
El nivel de expresion de estos genes puede usarse para confirmar la identidad de una poblacion de celulas placentarias, para identificar una poblacion de celulas como que comprende al menos una pluralidad de celulas madre placentarias, o semejantes. La poblacion de las celulas madre placentarias, cuya identidad se confirma, puede ser clonal, p. ej., una poblacion de celulas madre placentarias expandidas a partir de una unica celula madre placentaria, o una poblacion mixta de las celulas madre, p. ej., una poblacion de celulas que comprende solamente celulas madre placentarias que se expanden a partir de multiples celulas madre placentarias, o una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias y al menos otro tipo de celula.
El nivel de expresion de estos genes puede usarse para seleccionar poblaciones de celulas madre placentarias adherentes. Por ejemplo, una poblacion de celulas, p. ej., celulas expandidas clonalmente, se selecciona si la expresion de uno o mas de estos genes es significativamente mayor en una muestra de la poblacion de las celulas que en una poblacion equivalente de celulas madre mesenquimales. Dicha seleccion puede ser de una poblacion de una pluralidad de poblaciones de celulas madre placentarias, de una pluralidad de poblaciones de celulas, cuya identidad no se conoce, etc.
Las celulas madre placentarias adherentes pueden seleccionarse sobre la base del nivel de expresion de uno o mas de dichos genes comparado con el nivel de expresion de dicho uno o mas genes en una celula madre mesenquimal control. En una realizacion, el nivel de expresion de dicho uno o mas genes en una muestra que comprende un numero equivalente de celulas madre mesenquimales se usa como un control. En otra realizacion, el control, para las celulas madre placentarias ensayadas bajo determinadas condiciones, es un valor numerico que representa el nivel de expresion de dicho uno o mas genes en celulas madre mesenquimales bajo dichas condiciones.
Las poblaciones aisladas de celulas madre placentarias adherentes o no adherentes descritas anteriormente, y las poblaciones de celulas madre placentarias generalmente, pueden comprender aproximadamente, al menos, o no mas de, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o mas celulas madre placentarias.
4.1.3 Crecimiento en cultivo
El crecimiento de las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, como para cualquier celula de marnffero, depende, en parte, del medio particular seleccionado para el crecimiento. Bajo condiciones optimas, las celulas madre placentarias tfpicamente duplican su numero en 3-5 dfas. Durante el cultivo, las celulas madre placentarias proporcionadas en la presente memoria se adhieren a un sustrato en cultivo, p. ej., la superficie de un contenedor de cultivo tisular (p. ej., plastico de la placa de cultivo tisular, plastico recubierto con fibronectina, y semejantes) y forman una monocapa.
Las poblaciones de celulas placentarias adherentes aisladas que comprenden las celulas madre placentarias para uso en la invencion, cuando se cultivan bajo condiciones apropiadas, forman cuerpos semejantes a embrioides, esto es, agrupaciones tridimensionales de celulas que crecen por encima de la capa de celulas celula madre adherentes. Las celulas en los cuerpos semejantes a embrioides expresan marcadores asociados con celulas madre muy tempranas, p. ej., OCT-4, Nanog, SSEA3 y SSEA4. Las celulas en los cuerpos semejantes a embrioides tfpicamente no son adherentes al sustrato de cultivo, como lo son las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, pero permanecen unidas a las celulas adherentes durante el cultivo. Las celulas de los cuerpos semejantes a embrioides dependen de las celulas madre placentarias adherentes para su viabilidad, ya que los cuerpos semejantes a embrioides no se forman en ausencia de las celulas madre adherentes. Las celulas madre placentarias adherentes facilitan asf el crecimiento de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende las celulas madre placentarias adherentes. Sin pretender la vinculacion por teona, se piensa que las celulas de los cuerpos semejantes a embrioides crecen sobre las celulas madre placentarias adherentes como las celulas madre embrionarias crecen sobre una capa de alimentacion de celulas. Las celulas madre mesenquimales, p. ej., celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea, no desarrollan cuerpos semejantes a embrioides en cultivo.
4.2 Metodos para obtener celulas madre placentarias
4.2.1 Composicion para la recogida de las celulas madre
En la presente memoria se proporcionan ademas metodos para recoger y aislar celulas madre placentarias para uso en la invencion. Generalmente, las celulas madre se obtienen a partir de una placenta de mairnfero usando una disolucion fisiologicamente aceptable, p. ej., una composicion para la recogida de celulas madre. Una composicion para la recogida de celulas madre se describe con detalle en la Solicitud Provisional U.S. relacionada No. 60/754969, titulada "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs", presentada el 29 de diciembre, 2005.
La composicion para la recogida de celulas madre puede comprender cualquier disolucion fisiologicamente aceptable adecuada para la recogida y/o cultivo de las celulas madre, por ejemplo, una disolucion salina (p. ej., disolucion salina tamponada con fosfato, disolucion de Kreb, disolucion de Kreb modificada, disolucion de Eagle, NaCl al 0.9 %. etc.), un medo de cultivo (p. ej., DMEM, H.DMEM, etc.), y semejantes.
La composicion para la recogida de celulas madre puede comprender uno o mas componentes que tienden a preservar las celulas madre placentarias, esto es, previenen que las celulas madre placentarias se sequen, o retrasan la muerte de las celulas madre placentarias, reducen el numero de las celulas madre placentarias en una poblacion de celulas que mueren, o semejantes, desde el momento de la recogida hasta el momento del cultivo. Dichos componentes pueden ser, p. ej., un inhibidor de la apoptosis (p. ej., un inhibidor de caspasa o inhibidor de JNK); un vasodilatador (p. ej., sulfato de magnesio, un farmaco antihipertensor, peptido atrial natriuretico (ANP), adrenocorticotropina, hormona de liberacion de corticotropina, nitroprusido de sodio, hidralazina, adenosina trifosfato, adenosina, sulfato de indometacina o magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc.); un inhibidor de la necrosis (p. ej., 2-(1H-Indol-3-il)-3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina, o clonazepam); un inhibidor de TNF-a; y/o un perfluorocarbono transportador de oxfgeno (p. ej., bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).
La composicion para la recogida de celulas madre puede comprender una o mas enzimas degradantes de tejido, p. ej., una metaloproteasa, una proteasa de serina, una proteasa neutra, una ARNasa, o una ADNasa, o semejantes. Dichas enzimas incluyen, pero no estan limitadas a, colagenasas (p. ej., colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASA, hialuronidasa, y semejantes.
La composicion para la recogida de celulas madre puede comprender una cantidad bacterioddicamente o bacteriostaticamente efectiva de un antibiotico. En determinadas realizaciones no limitantes, el antibiotico es un macrolido (p. ej., tobramicina), una cefalosporina (p. ej., cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxil), una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (p. ej., penicilina V) o una quinolona (p. ej., ofloxacina, ciprofloxacina o norfloxacina), una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En una realizacion particular, el antibiotico es activo frente a bacterias Gram(+) y/o Gram(-), p. ej., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y semejantes.
La composicion para la recogida de celulas madre tambien puede comprender uno o mas de los siguientes compuestos: adenosina (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); D-glucosa (aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM); iones magnesio (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); una macromolecula con un peso molecular mayor de 20 000 daltons, en una realizacion, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y la viabilidad celular (p. ej., un coloide natural o sintetico, un polisacarido tal como dextrano o un polietilen glicol presente a aproximadamente 25 g/l a aproximadamente 100 g/l, o aproximadamente 40 g/l a aproximadamente 60 g/l); un antioxidante (p. ej., hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutation, vitamina C o vitamina E presente a aproximadamente 25 pM a aproximadamente 100 pM); un agente reductor (p. ej., N-acetilcistema presente a aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 5 mM); un agente que previene la entrada de calcio en las celulas (p. ej., verapamil presente a aproximadamente 2 pM a aproximadamente 25 pM); nitroglicerina (p. ej., aproximadamente 0.05 g/L a aproximadamente 0.2 g/L); un anticoagulante, presente en una cantidad suficiente para ayudar a prevenir la coagulacion de la sangre residual (p. ej., heparina o hirudina presente a una concentracion de aproximadamente 1000 unidades/l a aproximadamente 100000 unidades/l); o un compuesto que contiene amilorida (p. ej., amilorida, etil isopropil amilorida, hexametilen amilorida, dimetil amilorida o isobutil amilorida presente a aproximadamente 1.0 pM a aproximadamente 5 pM).
4.2.2 Recogida y manejo de la placenta
Generalmente, una placenta humana se recupera poco despues de su expulsion despues del nacimiento. Preferiblemente, la placenta se recupera de un paciente despues de obtener el consentimiento informado y despues de obtener un historial medico completo del paciente y esta asociado con la placenta. Preferiblemente, el historial medico continua despues del parto. Dicho historial medico puede usarse para coordinar el uso posterior de la placenta o las celulas madre recogidas a partir de la misma. Por ejemplo, las celulas madre placentarias humanas pueden usarse, a la vista del historial medico, para medicina personalizada del recien nacido asociado con la placenta, o para los padres, hermanos u otros familiares del recien nacido.
Antes de la recuperacion de las celulas madre placentarias, se eliminan la sangre del cordon umbilical y la sangre placentaria. En determinados casos, despues del parto, se recupera la sangre del cordon en la placenta. La placenta puede someterse a un proceso convencional de recuperacion de la sangre del cordon. Tfpicamente, se usa una aguja o canula, con la ayuda de la gravedad, para desangrar la placenta (vease, p. ej., Anderson, Patente U.S. No. 5372 581; Hessel et al, Patente U.S. No. 5415 665). La aguja o canula se pone habitualmente en la vena umbilical y la placenta puede masajearse suavemente para ayudar a drenar la sangre del cordon de la placenta. Dicha recuperacion de la sangre del cordon puede realizarse comercialmente, p. ej., LifeBank USA, Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry and Cryocell. Preferiblemente, la placenta se drena por gravedad sin manipulacion adicional, de manera que se minimiza la disrupcion del tejido durante la recuperacion de la sangre del cordon.
Tfpicamente, una placenta se transporta desde la habitacion de parto o nacimiento a otra localizacion, p. ej., un laboratorio, para la recuperacion de la sangre del cordon y recogida de las celulas madre, p. ej., por perfusion o disociacion de tejidos. La placenta se transporta preferiblemente en un dispositivo de transporte esteril con aislamiento termico (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28 °C), por ejemplo, poniendo la placenta, con el cordon umbilical proximal pinzado, en una bolsa de plastico con cierre de zip, que se pone entonces en un contenedor termicamente aislado. En otro ejemplo, la placenta se transporta en un kit de recogida de sangre del cordon sustancialmente como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos en tramitacion no. 11/230 760, presentada el 19 de septiembre, 2005. Preferiblemente, la placenta llega al laboratorio cuatro a veinticuatro horas despues del parto. En determinados ejemplos, el cordon umbilical proximal se pinza, preferiblemente en 4-5 cm (cenffmetros) de la insercion en el disco de la placenta antes de la recuperacion de la sangre del cordon. En otros ejemplos, el cordon umbilical proximal se pinza despues de la recuperacion de la sangre del cordon, pero antes del procesamiento adicional de la placenta.
La placenta, antes de la recogida de las celulas madre, puede almacenarse en condiciones esteriles y bien a temperatura ambiente o a una temperatura de 5 a 25 °C (cenffgrados). La placenta puede almacenarse durante un periodo de mas de cuarenta y ocho horas, y preferiblemente durante un periodo de cuatro a veinticuatro horas antes de perfundir la placenta para eliminar la sangre del cordon residual. La placenta se almacena preferiblemente en una disolucion anticoagulante a una temperatura de 5 a 25 °C (cenffgrados). Las disoluciones de anticoagulante adecuadas son muy conocidas en la tecnica. Por ejemplo, puede usarse una disolucion de heparina o warfarina de sodio. En un ejemplo preferido, la disolucion de anticoagulante comprende una disolucion de heparina (p. ej., 1 % p/p en una disolucion 1:1000). La placenta desangrada se almacena preferiblemente durante no mas de 36 horas antes de recoger las celulas madre placentarias.
La placenta de mairnfero o una parte de la misma, una vez recogida y preparada generalmente como anteriormente, puede tratarse de cualquier manera conocida en la tecnica, p. ej., puede perfundirse o disrumpirse, p. ej., digerirse con una o mas enzimas disruptoras de tejido, para obtener celulas madre.
4.2.3 Disrupcion ffsica y digestion enzimatica del tejido placentario
En una realizacion, las celulas madre placentarias para uso en la invencion se recogen de una placenta de m a i^e ro por disrupcion ffsica, p. ej., digestion enzimatica, del organo. Por ejemplo, la placenta, o una parte de la misma, puede, p. ej., triturarse, recortarse, molerse, trocearse, picarse, macerarse o semejantes, mientras esta en contacto con la composicion para la recogida de las celulas madre proporcionada en la presente memoria, y el tejido puede digerirse posteriormente con una o mas enzimas. La placenta, o una parte de la misma, tambien puede disrumpirse ffsicamente y digerirse con una o mas enzimas, y el material resultante sumergirse en, o mezclarse con, la composicion para la recogida de las celulas madre. Puede usarse cualquier metodo de disrupcion ffsica, siempre que el metodo de disrupcion deje una pluralidad, mas preferiblemente una mayoffa, y mas preferiblemente al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 99 % de las celulas en dicho organo viables, segun se determina, p. ej., por exclusion de azul de tripan.
La placenta puede diseccionarse en componentes antes de la disrupcion ffsica y/o digestion enzimatica y la recuperacion de las celulas madre. Por ejemplo, las celulas madre placentarias pueden obtenerse a partir de la membrana amniotica, corion, cordon umbilical, cotiledones placentarios, o cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, las celulas madre placentarias se obtienen a partir de tejido placentario que comprende amnios y corion. Tfpicamente, las celulas madre placentarias pueden obtenerse por disrupcion de un pequeno bloque de tejido placentario, p. ej., un bloque de tejido placentario que tiene un volumen de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 1000 miffmetros cubicos.
Una composicion para la recogida de celulas madre preferida comprende una o mas enzimas disruptoras de tejido. La digestion enzimatica usa preferiblemente una combinacion de enzimas, p. ej., una combinacion de una metaloproteasa de matriz y una proteasa neutra, por ejemplo, una combinacion de colagenasa y dispasa. En una realizacion, la digestion enzimatica del tejido placentario usa una combinacion de una metaloproteasa de matriz, una proteasa neutra, y una enzima mucolttica para la digestion de acido hialuronico, tal como una combinacion de colagenasa, dispasa, y hialuronidasa o una combinacion de LIBERASA(Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) y hialuronidasa. Otras enzimas que pueden usarse para disrumpir el tejido placentario incluyen papama, desoxirribonucleasas, proteasas de serina, tales como tripsina, quimiotripsina, o elastasa. Las proteasas de serina pueden inhibirse por alfa 2 microglobulina en suero y, por lo tanto, el medio usado para la digestion carece habitualmente de suero. Comunmente, se usan EDTA y ADNasa en los procedimientos de digestion enzimatica para incrementar la eficiencia de la recuperacion celular. El digerido se diluye preferiblemente de manera que se evita el atrapamiento de celulas madre en el digerido viscoso.
Puede usarse cualquier combinacion de enzimas para la digestion de tejidos. Las concentraciones tfpicas para las enzimas para la digestion de tejidos incluyen, p. ej., 50-200 U/mL para colagenasa I y colagenasa IV, 1-10 U/mL para dispasa, y 10-100 U/mL para elastasa. Pueden usarse proteasas en combinacion, esto es, dos o mas proteasas en la misma reaccion de digestion, o pueden usarse secuencialmente con el fin de liberar las celulas madre placentarias. Por ejemplo, una placenta, o parte de la misma, se digiere en primer lugar con una cantidad apropiada de colagenasa I a 2 mg/ml durante 30 minutos, seguido de digestion con tripsina, al 0.25 %, durante 10 minutos, a 37 °C. Las proteasas de serina se usan preferiblemente consecutivamente despues del uso de otras enzimas.
En otra realizacion, el tejido puede disrumpirse ademas por la adicion de un quelante, p. ej., acido etilen glicol bis(2-aminoetil eter)-N,N,N'N'-tetraacetico (EGTA) o acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) a la composicion para la recogida de celulas madre que comprende las celulas madre, o a una disolucion en la que se disrumpe y/o digiere el tejido antes del aislamiento de las celulas madre con la composicion para la recogida de celulas madre.
Se apreciara que cuando una placenta completa, o parte de una placenta que comprende tanto celulas fetales como maternas (por ejemplo, cuando la parte de la placenta comprende el corion o cotiledones), las celulas madre placentarias recogidas comprenderan una mezcla de las celulas madre placentarias derivadas tanto de fuentes fetales como maternas. Cuando una parte de la placenta que no comprende, o comprende un numero despreciable de, celulas maternas (por ejemplo, amnios), las celulas madre placentarias recogidas comprenderan casi exclusivamente celulas madre placentarias fetales.
4.2.4 Perfusion placentaria
Las celulas madre placentarias para uso en la invencion tambien pueden obtenerse por perfusion de la placenta de mairnfero. Los metodos para perfundir placenta de mairnfero para obtener celulas madre se describen, p. ej., en Hariri, Publicacion de Solicitud U.S. No. 2002/0123141, y en la Solicitud Provisional U.S. No. 60/754969 relacionada, titulada "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs", presentada el 29 de diciembre, 2005.
Las celulas madre placentarias pueden recogerse por perfusion, p. ej., a traves de la vasculatura placentaria, usando, p. ej., una composicion para la recogida de celulas madre como una disolucion de perfusion. En una realizacion, una placenta de marnffero se perfunde por el paso de la disolucion de perfusion a traves de cualquiera de o ambas de la arteria umbilical y vena umbilical. El flujo de la disolucion de perfusion a traves de la placenta puede conseguirse usando, p. ej., flujo de gravedad en la placenta. Preferiblemente, la disolucion de perfusion se fuerza a traves de la placenta usando una bomba, p. ej., una bomba peristaltica. La vena umbilical puede, p. ej., canularse con una canula, p. ej., una canula de TEFLON® o plastico, que esta conectada a un aparato de conexion esteril, tal como un tubo esteril. El aparato de conexion esteril esta conectado a un colector de perfusion.
En la preparacion para la perfusion, la placenta se orienta preferiblemente {p. ej., se suspende) de una manera tal que la arteria umbilical y la vena umbilical estan localizadas en el punto mas alto de la placenta. La placenta puede perfundirse por el paso de un fluido de perfusion a traves de la vasculatura placentaria y tejido circundante. La placenta tambien puede perfundirse por el paso de un fluido de perfusion en la vena umbilical y recogida de las arterias umbilicales, o por el paso de un fluido de perfusion en las arterias umbilicales y recogida de la vena umbilical.
En una realizacion, por ejemplo, la arteria umbilical y la vena umbilical estan conectadas simultaneamente, p. ej., a una pipeta que esta conectada mediante un conector flexible a un reservorio de la disolucion de perfusion. La disolucion de perfusion se pasa en la vena y arteria umbilical. La disolucion de perfusion exuda de y/o pasa a traves de las paredes de los vasos sangumeos en los tejidos circundantes de la placenta, y se recoge en un recipiente abierto adecuado desde la superficie de la placenta que estaba unida al utero de la madre durante la gestacion. La disolucion de perfusion tambien puede introducirse a traves de la apertura del cordon umbilical y dejar que fluya o percole fuera de las aperturas en la pared de la placenta que estan en interfase con la pared uterina materna. Las celulas placentarias que se recogen por este metodo, que puede referirse como un metodo "general", son tipicamente una mezcla de celulas fetales y maternas.
En otra realizacion, la disolucion de perfusion se pasa a traves de las venas umbilicales y se recoge de la arteria umbilical, o se pasa a traves de la arteria umbilical y se recoge de las venas umbilicales. Las celulas placentarias recogidas por este metodo, que puede referirse como un metodo de "circuito cerrado", son tipicamente casi exclusivamente fetales.
Se apreciara que la perfusion usando el metodo general, esto es, mediante el cual el perfusado se recoge despues de que haya exudado del lado materno de la placenta, produce una mezcla de celulas fetales y maternas. Como resultado, las celulas recogidas por este metodo comprenden una poblacion mixta de celulas madre placentarias tanto de origen fetal como materno. Por el contrario, la perfusion solamente a traves de la vasculatura placentaria en el metodo del circuito cerrado, mediante el cual el fluido de perfusion se pasa a traves de uno o dos vasos placentarios y se recoge solamente a traves del o de los vasos remanentes. produce la recogida de una poblacion de celulas madre placentarias casi exclusivamente de origen fetal.
El metodo de perfusion de circuito cerrado puede, en una realizacion, realizarse como sigue. Se obtiene una placenta postparto en aproximadamente 48 horas despues del nacimiento. El cordon umbilical se pinza y se corta por encima del pinzamiento. El cordon umbilical puede desecharse, o puede procesarse para recuperar, p. ej., celulas madre del cordon umbilical, y/o para procesar la membrana del cordon umbilical para la produccion de un biomaterial. La membrana amniotica puede retenerse durante la perfusion, o puede separarse del corion, p. ej., usando una diseccion roma con los dedos. Si la membrana amniotica se separa del corion antes de la perfusion, puede, p. ej., desecharse, o procesarse, p. ej., para obtener celulas madre por digestion enzimatica, o para producir, p. ej., un biomaterial de membrana amniotica, p. ej., el biomaterial descrito en la Publicacion de la Solicitud U.S. No. 2004/0048796. Despues de limpiar la placenta de todos los coagulos de sangre visibles y de sangre residual, p. ej., usando una gasa esteril, los vasos del cordon umbilical se exponen, p. ej., cortando parcialmente la membrana del cordon umbilical para exponer una seccion transversal del cordon. Los vasos se identifican, y se abren, p. ej., haciendo avanzar una pinza de cocodrilo cerrada a traves del extremo cortado de cada vaso. El aparato, p. ej., tubo de plastico conectado a un dispositivo de perfusion o bomba peristaltica, se inserta entonces en cada una de las arterias placentarias. La bomba puede ser cualquier bomba adecuada para el proposito, p. ej., una bomba peristaltica. Los tubos de plastico, conectados a un reservorio de recogida esteril, p. ej., una bolsa de sangre tal como una bolsa de recogida de 250 mL, se insertan entonces en la vena placentaria. Alternativamente, los tubos conectados a la bomba se insertan en la vena placentaria, y los tubos a un o unos reservorios de recogida se insertan en una o ambas de las arterias placentarias. La placenta se perfunde entonces con un volumen de disolucion de perfusion, p. ej., aproximadamente 750 ml de disolucion de perfusion. Las celulas en el perfusado se recogen entonces, p. ej., por centrifugacion.
En una realizacion, el cordon umbilical proximal se pinza durante la perfusion, y mas preferiblemente, se pinza en 4-5 cm (centfmetros) de la insercion del cordon en el disco placentario.
La primera recogida del fluido de perfusion de una placenta de mairnfero durante el proceso de desangrado esta generalmente coloreada con celulas sangumeas rojas residuales de la sangre del cordon y/o sangre de la placenta. El fluido de perfusion se vuelve mas incoloro al continuar la perfusion y las celulas sangumeas del cordon residuales se eliminan por lavado de la placenta. Generalmente, de 30 a 100 ml (mililitros) de fluido de perfusion son adecuados para desangrar inicialmente la placenta, pero puede usarse mas o menos fluido de perfusion dependiendo de los resultados observados.
El volumen del lfquido de perfusion usado para recoger celulas madre placentarias puede variar dependiendo del numero de celulas madre que se va a recoger, del tamano de la placenta, del numero de recogidas que se van a hacer a partir de una unica placenta, etc. En varias realizaciones, el volumen del lfquido de perfusion puede ser de 50 mL a 5000 mL, 50 mL a 4000 mL, 50 mL a 3000 mL, 100 mL a 2000 mL, 250 mL a 2000 mL, 500 mL a 2000 mL, o 750 mL a 2000 mL. Tfpicamente, la placenta se perfunde con 700-800 mL de lfquido de perfusion despues del desangrado.
La placenta puede perfundirse una pluralidad de veces durante el curso de varias horas o varios dfas. Cuando la placenta se va a perfundir una pluralidad de veces, puede mantenerse o cultivarse en condiciones asepticas en un contenedor u otro recipiente adecuado, y perfundirse con la composicion para la recogida de celulas madre, o una disolucion de perfusion estandar (p. ej., una disolucion salina normal tal como disolucion salina tamponada con fosfato ("PBS")) con o sin un anticoagulante (p. ej., heparina, warfarina de sodio, cumarina, bishidroxicumarina), y/o con o sin un agente antimicrobiano (p. ej, p-mercaptoetanol (0.1 mM); antibioticos tales como estreptomicina (p. ej., a 40-100 pg/ml), penicilina (p. ej., a 40U/mI), anfotericina B (p. ej., a 0.5 pg/ml). En una realizacion, una placenta aislada se mantiene o cultiva durante un periodo de tiempo sin recoger el perfusado, de manera que la placenta se mantiene o cultiva durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas, o 2 o 3 o mas dfas antes de la perfusion y recogida del perfusado. La placenta perfundida puede mantenerse durante uno o mas tiempos adicionales, p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o mas horas, y perfundirse un segunda vez con, p. ej., 700-800 mL de fluido de perfusion. La placenta puede perfundirse 1, 2, 3, 4, 5 o mas veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En una realizacion preferida, la perfusion de la placenta y la recogida de la disolucion de perfusion, p. ej., composicion para la recogida de celulas madre, se repite hasta que el numero de celulas nucleadas recogidas se encuentra por debajo de 100 celulas/ml. Los perfusados a diferentes puntos de tiempo pueden procesarse adicionalmente individualmente para recuperar poblaciones de celulas dependientes del tiempo, p. ej., celulas madre. Tambien pueden combinarse perfusados de diferentes puntos de tiempo.
Sin pretender la vinculacion por ninguna teona, despues del desangrado y un tiempo suficiente de perfusion de la placenta, se cree que las celulas madre placentarias migran en la microcirculacion desangrada y perfundida de la placenta donde se recogen, preferiblemente mediante lavado en un recipiente de recogida por perfusion. La perfusion de la placenta aislada no solo sirve para eliminar sangre del cordon residual sino tambien para proporcionar a la placenta nutrientes apropiados, incluyendo oxfgeno. La placenta puede cultivarse y perfundirse con una disolucion similar a la que se uso para eliminar las celulas sangumeas del cordon residuales, preferiblemente, sin la adicion de agentes anticoagulantes.
La perfusion segun los metodos proporcionados en la presente memoria produce la recogida de significativamente mas celulas madre placentarias que el numero que se puede obtener a partir de una placenta de mairnfero no perfundida con dicha disolucion, y no tratada de otra forma para obtener celulas madre (p. ej., por disrupcion de tejido, p. ej., digestion enzimatica). En este contexto, "significativamente mas" significa al menos aproximadamente un 10 % mas. La perfusion rinde significativamente mas celulas madre placentarias que, p. ej., el numero de celulas madre placentarias que se puede obtener a partir del medio de cultivo en el que una placenta, o parte de la misma, se ha cultivado.
Las celulas madre pueden aislarse de la placenta por perfusion con una disolucion que comprende una o mas proteasas u otras enzimas disruptoras de tejido. En una realizacion espedfica, una placenta o parte de la misma (p. ej., membrana amniotica, amnios y corion, lobulo o cotiledon placentario, cordon umbilical, o combinacion de cualquiera de los anteriores) se lleva a 25-37 °C, y se incuba con una o mas enzimas disruptoras de tejido en 200 mL de un medio de cultivo durante 30 minutos. Las celulas del perfusado se recogen, se llevan a 4 °C, y se lavan con una mezcla de inhibidores fna que comprende EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM y beta-mercaptoetanol 2 mM. Las celulas madre se lavan despues de varios minutos con una composicion para la recogida de celulas madre fna (p. ej., 4 °C) proporcionada en la presente memoria.
4.2.5 Perfusado placentario y celulas de perfusado placentario
El perfusado placentario, y las celulas de perfusado placentario, p. ej., celulas nucleadas totales aisladas de perfusado placentario, comprenden una coleccion heterogenea de celulas. Tfpicamente, el perfusado placentario, y las celulas de perfusado placentario, se deplecionan de eritrocitos antes de su uso. Dicha deplecion puede llevarse a cabo por metodos conocidos de separacion de las celulas sangumeas rojas de las celulas sangumeas nucleadas. En determinados casos, el perfusado placentario o las celulas del perfusado de criopreservan. En determinados otros casos, el perfusado placentario comprende, o las celulas del perfusado comprenden, solo celulas fetales, o una combinacion de celulas fetales y celulas maternas.
Tfpicamente, el perfusado placentario de una unica perfusion placentaria comprende aproximadamente 100 millones a aproximadamente 500 millones de celulas nucleadas. En determinados ejemplos, el perfusado placentario o las celulas del perfusado comprenden celulas CD34+, p. ej., celulas madre o progenitoras hematopoyeticas. Dichas celulas pueden comprender celulas madre o progenitoras CD34+CD45', celulas madre o progenitoras CD34+CD45+, progenitores mieloides, progenitores linfoides, y/o progenitores eritroides. En otros ejemplos, el perfusado placentario y las celulas de perfusado placentario comprenden celulas madre placentarias adherentes, p. ej., celulas madre CD34' , p. ej., celulas madre placentarias adherentes como se describe en la Seccion 5.1, anteriormente. En otros ejemplos, el perfusado placentario y las celulas de perfusado placentario comprenden, p. ej., celulas progenitoras endoteliales, celulas osteoprogenitoras, y celulas asesinas naturales. En determinados casos, el perfusado placentario segun se recoge de la placenta y deplecionado de eritrocitos, o las celulas del perfusado aisladas de dicho perfusado, comprenden aproximadamente el 6-7 % de celulas asesinas naturales (CD3‘, CD56+); aproximadamente el 21-22 % de celulas T (CD3+); aproximadamente el 6-7 % de celulas B (CD19+); aproximadamente el 1-2 % de celulas progenitoras endoteliales (CD34+, CD31+); aproximadamente el 2-3 % de celulas progenitoras neurales (nestina+); aproximadamente el 2-5 % de celulas progenitoras hematopoyeticas (CD34+); y aproximadamente el 0.5-1.5 % de celulas madre placentarias adherentes (p. ej., CD34- CD117', CD105+ y CD44+), segun se determina, p. ej., por citometna de flujo, p. ej., por analisis FACS.
Las celulas madre o progenitoras CD34+ en el perfusado placentario humano expresan niveles detectablemente mayores de marcadores relacionados con la angiogenesis, p. ej., CD31, VEGF-R y/o CXCR4 de lo que lo hace un numero equivalente de celulas CD34+ aisladas de la sangre del cordon umbilical. En determinados casos, las celulas mononucleares de perfusado placentario humano de una unica perfusion que se cultivan en medio ENDOCULT® con VEGF (para el crecimiento de colonias CFU-HiIl; StemCell Technologies, Inc.) generan hasta aproximadamente 20, p. ej., aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 colonias CFU-HiIl (progenitores de celulas endoteliales). El desarrollo de colonias CFU-HiIl en cultivo lfquido puede demostrarse y evaluarse, p. ej., midiendo la captacion de lipoprotema de baja densidad diacetilada (Dil-acLDL) por las celulas progenitoras endoteliales obtenidas de perfusado placentario humano, p. ej., a los siete dfas de cultivo en medio ENDOCULT®.
Ademas, las celulas CD34+CD45' de perfusado placentario humano tienen una expresion detectablemente mayor de marcadores relacionados con la angiogenesis CD31 y/o VEGFR que las celulas CD34+CD45+.
Tfpicamente, el perfusado placentario y las celulas del perfusado tienen una baja expresion de MHC clase I comparado con las celulas sangumeas del cordon umbilical, y son en gran medida negativas para los marcadores de MHC clase Il.
4.2.6 Aislamiento, separacion y caracterizacion de las celulas madre placentarias
Las celulas madre de la placenta de mairnfero, ya se obtengan por perfusion o digestion enzimatica, pueden purificarse inicialmente a partir de (es decir, pueden aislarse de) otras celulas por centrifugacion en gradiente de Ficoll. Dicha centrifugacion puede seguir cualquier protocolo estandar para velocidad de centrifugacion, etc. En un ejemplo, las celulas recogidas de la placenta se recuperan del perfusado por centrifugacion a 5000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente, lo que separa las celulas de, p. ej., restos celulares y plaquetas contaminantes. En otro ejemplo, el perfusado placentario se concentra hasta aproximadamente 200 ml, se pone en capas suavemente sobre Ficoll, y se centrifuga a aproximadamente 1100 x g durante 20 minutos a 22 °C, y la capa de celulas de la interfase de baja densidad se recoge para procesamiento adicional.
Los sedimentos celulares pueden resuspenderse en composicion para la recogida de celulas madre fresca, o un medio adecuado para el mantenimiento de las celulas madre, p. ej., medio IMDM sin suero que contiene 2U/ml de heparina y EDTA 2mM (GibcoBRL, NY). La fraccion de celulas mononucleares totales puede aislarse, p. ej., usando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) segun el procedimiento recomendado por el fabricante.
Tal y como se usa en la presente memoria, "aislar" celulas madre placentarias significa eliminar al menos aproximadamente el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de las celulas con las que estan asociadas normalmente las celulas madre en la placenta de mamffero intacta. Una celula madre de un organo esta "aislada" cuando esta presente en una poblacion de celulas que comprende menos del 50 % de las celulas con las que esta asociada normalmente la celula madre en el organo intacto.
Las celulas placentarias obtenidas por perfusion o digestion pueden, por ejemplo, aislarse adicionalmente, o inicialmente, por tripsinizacion diferencial usando, p. ej., una disolucion de tripsina al 0.05 % con EDTA al 0.2 % (Sigma, St. Louis MO). La tripsinizacion diferencial es posible porque las celulas madre placentarias tfpicamente se despegan de las superficies de plastico en aproximadamente cinco minutos mientras otras poblaciones adherentes tfpicamente requieren mas de 20-30 minutos de incubacion. Las celulas madre placentarias despegadas pueden recogerse despues de la tripsinizacion y neutralizacion de la tripsina, usando, p. ej., Disolucion Neutralizante de Tripsina (TNS, Cambrex). En una realizacion del aislamiento de las celulas adherentes, se ponen partes alfcuotas de, por ejemplo, aproximadamente 5-10 x 106 celulas en cada uno de varios matraces T-75, preferiblemente matraces T75 recubiertos de fibronectina. En dicha realizacion, las celulas pueden cultivarse con Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (MSCGM) disponible comercialmente (Cambrex), y se pueden poner en un incubador de cultivo tisular (37 °C, 5 % de CO2). Despues de 10 a 15 dfas, las celulas no adherentes se eliminan de los matraces por lavado con PBS. El PBS se reemplaza entonces por MSCGM. Los matraces se examinan preferiblemente diariamente para detectar la presencia de varios tipos de celulas adherentes y en particular, para la identificacion y expansion de agrupaciones de celulas fibroblastoides.
El numero y tipo de las celulas recogidas de una placenta de mamnfero pueden monitorizarse, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfologfa y marcadores de la superficie celular usando tecnicas de deteccion celular estandar tal como citometna de flujo, separacion celular, inmunocitoqmmica (p. ej., tincion con anticuerpos espedficos de tejido o espedficos de marcadores celulares) separacion celular activada por fluorescencia (FACS), separacion celular activada por magnetismo (MACS), por examen de la morfologfa de las celulas usando microscopfa optica o confocal, y/o midiendo los cambios en la expresion genica usando tecnicas muy conocidas en la tecnica, tales como PCR y perfilado de la expresion genica. Estas tecnicas pueden usarse, tambien, para identificar celulas que son positivas para uno o mas marcadores particulares. Por ejemplo, usando anticuerpos frente a CD34, se puede determinar, usando las tecnicas anteriores, si una celula comprende una cantidad detectable de CD34; si lo hace, la celula es CD34+. Asimismo, si una celula produce suficiente ARN de OCT-4 que sea detectable por RT-PCR, o significativamente mas ARN de OCT-4 que una celula adulta, la celula es OCT-4+. Los anticuerpos frente a los marcadores de superficie celular (p. ej., marcadores CD tales como CD34) y la secuencia de los genes espedficos de celulas madre, tales como OCT-4, son muy conocidos en la tecnica.
Las celulas placentarias, particularmente las celulas que se han aislado por separacion con Ficoll, adherencia diferencial, o una combinacion de ambas, pueden separarse usando un separador celular activado por fluorescencia (FACS). La separacion celular activada por fluorescencia (FACS) es un metodo muy conocido para separar partfculas, incluyendo celulas, sobre la base de las propiedades fluorescentes de las partfculas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151: 150-165). La excitacion con laser de los restos fluorescentes en las partfculas individuales produce una pequena carga electrica que permite la separacion electromagnetica de las partfculas positivas y negativas de una mezcla. En una realizacion, se marcan anticuerpos o ligandos espedficos de marcadores de superficie celular con distintos marcadores fluorescentes. Las celulas se procesan a traves del separador celular, permitiendo la separacion de las celulas sobre la base de su capacidad de unirse a los anticuerpos usados. Las partfculas separadas por FACS pueden depositarse directamente en pocillos individuales de placas de 96 pocillos o 384 pocillos para facilitar la separacion y la clonacion.
En un esquema de separacion, las celulas madre de la placenta se separan sobre la base de la expresion de los marcadores CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 y/o HLA-G. Esto puede conseguirse en conexion con procedimientos para seleccionar celulas madre sobre la base de sus propiedades de adherencia en cultivo. Por ejemplo, un principio de seleccion por adherencia puede conseguirse antes o despues de la separacion sobre la base de la expresion de los marcadores. En un ejemplo, las celulas se separan en primer lugar sobre la base de su expresion de CD34; las celulas CD34' se retienen, y las celulas que son CD200+HLA-G+, se separan de todas las demas celulas CD34'. En otro ejemplo, las celulas de la placenta se basan en su expresion los marcadores CD200 y/o HLA-G; por ejemplo, las celulas que presentan cualquiera de estos marcadores se afslan para un uso adicional. Las celulas que expresan, p. ej., CD200 y/o HLA-G pueden, en un ejemplo espedfico, separarse adicionalmente sobre la base de su expresion de CD73 y/o CD105, o epftopos reconocidos por anticuerpos SH2, SH3 o SH4, o ausencia de la expresion de CD34, CD38 o CD45. Por ejemplo, las celulas placentarias se separan por la expresion, o ausencia de la misma, de CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 y CD45, y las celulas placentarias que son CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34', CD38' y CD45' se afslan de las otras celulas placentarias para un uso adicional.
En otro ejemplo, pueden usarse lechos magneticos para separar las celulas. Las celulas pueden separarse usando una tecnica de separacion celular activada por magnetismo (MACS), un metodo para separar partfculas sobre la base de su capacidad de unirse a lechos magneticos (diametro de 0.5-100 pm). Puede realizarse una variedad de modificaciones utiles en las microesferas magneticas, incluyendo la adicion covalente de anticuerpo que reconoce espedficamente una molecula o hapteno particular de la superficie celular. Los lechos se mezclan entonces con las celulas para permitir la union. Las celulas se pasan entonces a traves de un campo magnetico para separar las celulas que tienen el marcador de la superficie celular espedfico. En un ejemplo, estas celulas pueden aislarse entonces y volver a mezclarse con lechos magneticos acoplados con un anticuerpo frente a marcadores de la superficie celular adicionales. Las celulas se pasan de nuevo a traves de un campo magnetico, aislando las celulas que estan unidas a ambos anticuerpos. Dichas celulas pueden diluirse entonces en placas separadas, tales como placas de microtitulacion para el aislamiento clonal.
Las celulas madre placentarias tambien pueden caracterizarse y/o separarse sobre la base de caractensticas de morfologfa y crecimiento celular. Por ejemplo, las celulas madre placentarias pueden caracterizarse como que tienen, y/o seleccionarse sobre la base, p. ej., de una apariencia fibroblastoide en cultivo. Las celulas madre placentarias tambien pueden caracterizarse como que tienen, y/o pueden seleccionarse, sobre la base de su capacidad para formar cuerpos semejantes a embrioides. En un ejemplo, las celulas placentarias que tienen una forma fibroblastoide, expresan CD73 y CD105, y producen uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en cultivo se afslan de otras celulas placentarias. En otro ejemplo, las celulas placentarias OCT-4+ que producen uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en cultivo se afslan de otras celulas placentarias.
En otro ejemplo, las celulas madre placentarias pueden identificarse y caracterizarse por un ensayo de unidades formadoras de colonias. Los ensayos de unidades formadoras de colonias son conocidos comunmente en la tecnica, tales como medio MESEN CULT™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver Columbia Britanica).
Las celulas madre placentarias pueden evaluarse para determinar su viabilidad, potencial de proliferacion, y longevidad usando tecnicas estandar conocidas en la tecnica, tales como ensayo de exclusion de azul de tripan, ensayo de captacion de diacetato de fluorescema, ensayo de captacion de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad); y ensayo de captacion de timidina, ensayo de proliferacion celular basado en MTT (para evaluar la proliferacion). La longevidad puede determinarse por metodos muy conocidos en la tecnica, tales como por la determinacion del numero maximo de duplicacion de la poblacion en un cultivo prolongado.
Las celulas madre placentarias tambien pueden separarse de otras celulas placentarias usando otras tecnicas conocidas en la tecnica, p. ej., crecimiento selectivo de las celulas deseadas (seleccion positiva), destruccion selectiva de las celulas no deseadas (seleccion negativa); separacion basada en la capacidad de aglutinacion celular diferencial en la poblacion mixta como, por ejemplo, con aglutinina de soja; procedimientos de congelacion-descongelacion; filtracion; centrifugacion convencional y zonal; elutriacion centnfuga (centrifugacion contracorriente); separacion por gravedad unitaria; distribucion contracorriente; electroforesis; y semejantes.
4.3 Cultivo de las celulas madre placentarias
4.3.1 Medios de cultivo
Las celulas madre placentarias aisladas, o poblacion de celulas madre placentarias, o celulas o tejido placentario a partir del que se crecen las celulas madre placentarias, pueden usarse para iniciar, o sembrar, cultivos celulares. Las celulas se transfieren generalmente a recipientes de cultivo tisular esteriles bien no recubiertos o recubiertos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (p. ej., nativo o desnaturalizado), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina, y protema de la membrana extracelular {p. ej., MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)).
Las celulas madre placentarias pueden cultivarse en cualquier medio, y bajo cualesquiera condiciones, reconocidas en la tecnica como aceptables para el cultivo de las celulas madre. Preferiblemente, el medio de cultivo comprende suero. Las celulas madre placentarias pueden cultivarse, por ejemplo, en DMEM-LG (Medio Esencial Modificado por Dulbecco, con bajo contenido en glucosa)/MCDB 201 (medio basal de fibroblastos de pollo) que contiene ITS (insulinatransferrina-selenio), LA+BSA (acido linoleico-albumina de suero bovino), dextrosa, acido L-ascorbico, PDGF, EGF, IGF-1, y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (alto contenido en glucosa) que comprende 10 % de suero fetal bovino (FBS); DMEM-HG que comprende 15 % de FBS; IMDM (medio de Dulbecco modificado por Iscove) que comprende 10 % de FBS, 10 % de suero de caballo, e hidrocortisona; M199 que comprende 10 % de FBS, EGF, y heparina; a-MEM (medio mmimo esencial) que comprende 10 % de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que comprende 10 % de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina, etc. Un medio preferido es DMEM-LG/MCDB-201 que comprende 2 % de FBS, ITS, LA+BSA, dextrosa, acido L-ascorbico, PDGF, EGF, y penicilina/estreptomicina.
Otros medios que pueden usarse para cultivar celulas madre placentarias incluyen DMEM (con contenido alto o bajo de glucosa), medio basal de Eagle, medio de Ham F10 (F10), medio de Ham F-12 (F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove, Medio para el Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (MSCGM), medio de Liebovitz L-15, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), y CELL-GRO FREE.
El medio de cultivo puede suplementarse con uno o mas componentes incluyendo, por ejemplo, suero (p. ej., suero bovino fetal (FBS), preferiblemente aproximadamente al 2-15 % (v/v); suero equino (de caballo) (ES); suero humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferiblemente aproximadamente al 0.001 % (v/v); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento semejante a insulina 1 (IGF-1), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), y eritropoyetina (EPO); aminoacidos, incluyendo L-valina; y uno o mas antibioticos y/o agentes antimicoticos para controlar la contaminacion microbiana, tales como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina, y nistatina, bien solos o en combinacion.
Las celulas madre placentarias pueden cultivarse en condiciones de cultivo tisular estandar, p. ej., en placas de cultivo tisular o en placas de multiples pocillos. Las celulas madre placentarias tambien pueden cultivarse usando un metodo de gota colgante. En este metodo, las celulas madre placentarias se suspenden a aproximadamente 1 x 104 celulas por mL en aproximadamente 5 mL de medio, y se ponen una o mas gotas del medio en el interior de la tapa de un contenedor de cultivo tisular, p. ej., una placa Petri de 100 mL. Las gotas pueden ser, p. ej., gotas unicas, o multiples gotas de, p. ej., un pipeteador con multiples canales. La tapa se invierte cuidadosamente y se pone en la parte superior de la parte inferior de la placa, que contiene un volumen de lfquido, p. ej., PBS esteril suficiente para mantener el contenido de humedad en la atmosfera de la placa, y las celulas madre se cultivan.
4.3.2 Expansion y proliferacion de las celulas madre placentarias
Una vez una celula madre placentaria aislada, o poblacion aislada de celulas madre (p. ej., una celula madre o poblacion de celulas madre separada de al menos aproximadamente el 50 % de las celulas placentarias con las que la celula madre o poblacion de celulas madre esta asociada normalmente in vivo), la celula madre o poblacion de celulas madre puede proliferarse y expandirse in vitro. Por ejemplo, una poblacion de celulas madre placentarias puede cultivarse en contenedores de cultivo tisular, p. ej., placas, matraces, placas con multiples pocillos, o semejantes, durante un tiempo suficiente para que las celulas madre proliferen hasta un 70- 90 % de confluencia, esto es, hasta que las celulas madre y su progenie ocupen el 70-90 % del area superficial del cultivo del contenedor de cultivo tisular.
Las celulas madre placentarias para uso en la invencion pueden sembrarse en recipientes de cultivo a una densidad que permita el crecimiento celular. Por ejemplo, las celulas pueden sembrarse a una densidad baja (p. ej., aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 celulas/cm2) a una densidad alta (p. ej., aproximadamente 50 000 o mas celulas/cm2). En una realizacion preferida, las celulas se cultivan a aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2 en aire. En algunas realizaciones preferidas, las celulas se cultivan a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en aire, preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de O2 en aire. Las celulas preferiblemente se cultivan a aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, preferiblemente 37 °C. Las celulas se cultivan preferiblemente en un incubador. El medio de cultivo puede estar estatico o agitado, por ejemplo, usando un biorreactor. Las celulas madre placentarias preferiblemente se crecen bajo estres oxidativo bajo (p. ej., con la adicion de glutation, acido ascorbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcistema, o semejantes).
Una vez se obtiene un 70 %-90 % de confluencia, las celulas pueden subcultivarse. Por ejemplo, las celulas pueden tratarse enzimaticamente, p. ej., tripsinizarse, usando tecnicas muy conocidas en la tecnica, para separarlas de la superficie del cultivo tisular. Despues de retirar las celulas pipeteando y contando las celulas, se subcultivan aproximadamente 20 000-100 000 celulas madre, preferiblemente aproximadamente 50 000 celulas madre, en un nuevo contenedor de cultivo que contiene medio de cultivo fresco. Tfpicamente, el nuevo medio es el mismo tipo de medio del que se retiraron las celulas madre. En la presente memoria se proporcionan poblaciones de celulas madre placentarias para uso en la invencion que se han subcultivado al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 veces, o mas.
4.3.3 Poblaciones de celulas madre placentarias
Ademas, las composiciones para uso en la invencion pueden comprender poblaciones de celulas madre placentarias par uso en la invencion. La poblacion de celulas madre placentarias para uso en la invencion puede aislarse directamente de una o mas placentas; esto es, la poblacion de celulas madre placentarias para uso en la invencion puede ser una poblacion de celulas placentarias, que comprende celulas madre placentarias, obtenidas a partir de, o contenidas en, perfusado, u obtenidas a partir de, o contenidas en, digerido (esto es, la coleccion de celulas obtenida por digestion enzimatica de una placenta o parte de la misma). Las celulas madre placentarias aisladas para uso en la invencion tambien pueden cultivarse y expandirse para producir poblaciones de celulas madre placentarias. Las poblaciones de celulas placentarias que comprenden celulas madre placentarias tambien pueden cultivarse y expandirse para producir poblaciones de celulas madre placentarias.
Las poblaciones de celulas madre placentarias proporcionadas en la presente memoria comprenden celulas madre placentarias para uso en la invencion. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de las celulas en una poblacion de celulas madre placentarias aisladas son celulas madre placentarias. Esto es, una poblacion de celulas madre placentarias puede comprender, p. ej., tanto como el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % de celulas que no son celulas madre.
En la presente memoria se proporcionan metodos para producir una poblacion de celulas madre placentarias aisladas para uso en la invencion, p. ej., seleccionando celulas madre placentarias, ya deriven de digestion enzimatica o perfusion, que expresan marcadores particulares y/o caractensticas particulares de cultivo o morfologicas. En una realizacion, por ejemplo, en la presente memoria se proporciona un metodo para producir una poblacion de celulas que comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD200 y HLA-G; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otra realizacion, el metodo para producir una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD73, CD105, y CD200; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otra realizacion, el metodo para producir una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato y (b) expresan CD200 y OCT-4; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro ejemplo, el metodo para producir una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan CD73 y CD105, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro ejemplo, el metodo para producir una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD73, CD105 y HLA-G; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro ejemplo, el metodo para producir una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan OCT-4, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En cualquiera de los ejemplos anteriores, el metodo puede comprender adicionalmente seleccionar celulas placentarias que expresan ABC-p (una protema transportadora ABC espedfica de la placenta; vease, p. ej., Allikmets et al., Cancer Res. 58(23):5337-9 (1998)). El metodo tambien puede comprender seleccionar celulas que presentan al menos una caractenstica espedfica, p. ej., de una celula madre mesenquimal, por ejemplo, la expresion de CD29, la expresion de CD44, la expresion de CD90, o la expresion de una combinacion de los anteriores.
En las realizaciones anteriores, el sustrato puede ser cualquier superficie en la que puede conseguirse el cultivo y/o seleccion de las celulas, p. ej., celulas madre placentarias. Tfpicamente, el sustrato es un plastico, p. ej., plastico de placa de cultivo tisular o placa con multiples pocillos. El plastico de cultivo tisular puede estar recubierto con una biomolecula, p. ej., laminina o fibronectina.
Las celulas, p. ej., celulas madre placentarias, pueden seleccionarse para una poblacion de celulas madre placentarias por cualquier medio conocido en la tecnica de la seleccion celular. Por ejemplo, las celulas pueden seleccionarse usando un anticuerpo o anticuerpos frente a uno o mas marcadores de la superficie celular, por ejemplo, en citometna de flujo o FACS. La seleccion puede conseguirse usando anticuerpos conjuntamente con lechos magneticos. Los anticuerpos que son espedficos para determinados marcadores relacionados con celulas madre son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos frente a OCT-4 (Abeam, Cambridge, MA), CD200 (Abeam), HLA-G (Abeam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), CD105 (Abeam; BioDesign International, Saco, ME), etc. Tambien estan disponibles comercialmente anticuerpos frente a otros marcadores, p. ej., CD34, CD38 y CD45 estan disponibles, p. ej., en StemCell Technologies o BioDesign International.
La poblacion de celulas madre placentarias aislada puede comprender celulas placentarias que no son celulas madre, 0 celulas que no son celulas placentarias.
Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas pueden combinarse con una o mas poblaciones de celulas que no son celulas madre o celulas que no son placentarias. Por ejemplo, una poblacion aislada de celulas madre placentarias puede combinarse con sangre (p. ej., sangre placentaria o sangre del cordon umbilical), celulas madre derivadas de la sangre (p. ej., celulas madre derivadas de sangre placentaria o sangre del cordon umbilical), poblaciones de celulas nucleadas derivadas de la sangre, celulas mesenquimales derivadas de la medula osea, poblaciones de celulas madre derivadas del hueso, medula osea cruda, celulas madre adultas (somaticas), poblaciones de celulas madre contenidas en tejido, celulas madre cultivadas, poblaciones de celulas completamente diferenciadas (p. ej., condrocitos, fibroblastos, celulas amnioticas, osteoblastos, celulas musculares, celulas cardiacas, etc.) y semejantes. Las celulas en una poblacion de celulas madre placentarias aislada pueden combinarse con una pluralidad de celulas de otro tipo en relaciones de aproximadamente 100 000 000:1, 50 000 000:1, 20 000 000:1, 10 000 000:1, 5 000 000:1, 2 000 000:1, 1 000 000:1, 500 000:1, 200 000:1, 100 000:1, 50 000:1, 20 000:1, 10 000:1, 5000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1000; 1:2000; 1:5000; 1:10 000; 1:20 000; 1:50 000; 1:100 000; 1:500 000; 1:1 000 000; 1:2 000 000; 1:5 000 000; 1:10000 000; 1:20 000 000; 1:50 000 000; o aproximadamente 1:100 000 000, numeros comparativos de celulas nucleadas totales en cada poblacion. Las celulas en una poblacion de celulas madre placentarias aislada tambien pueden combinarse con una pluralidad de celulas de una pluralidad de tipos celulares.
En una, una poblacion aislada de celulas madre placentarias se combina con una pluralidad de celulas madre hematopoyeticas. Dichas celulas madre hematopoyeticas pueden estar, por ejemplo, contenidas en la placenta no procesada, sangre del cordon umbilical o sangre periferica; en celulas nucleadas totales de sangre placentaria, sangre del cordon umbilical o sangre periferica; en una poblacion aislada de celulas CD34+ de sangre placentaria, sangre del cordon umbilical o sangre periferica; en medula osea no procesada; en celulas nucleadas totales de medula osea; en una poblacion aislada de celulas CD34+ de la medula osea, o semejantes.
4.4 Combinaciones de las celulas madre placentarias y perfusado placentario o celulas de perfusado placentario
En la presente memoria se describen combinaciones de perfusado placentario con celulas de perfusado placentario aisladas y/o celulas madre placentarias proporcionadas. En la presente memoria, las celulas madre placentarias pueden ser celulas madre placentarias CD34+, celulas madre placentarias CD34-, o una combinacion de las mismas. En un ejemplo, en la presente memoria se describe un volumen de perfusado placentario suplementado con una pluralidad de celulas de perfusado placentario y/o una pluralidad de celulas madre placentarias. En ejemplos espedficos, por ejemplo, cada mililitro de perfusado placentario se suplementa con aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106 o mas celulas de perfusado placentario o celulas madre placentarias. En otro ejemplo, una pluralidad de celulas de perfusado placentario se suplementa con perfusado placentario y/o celulas madre placentarias. En otro ejemplo, una pluralidad de celulas madre placentarias se suplementa con perfusado placentario y/o una pluralidad de celulas de perfusado placentario. En determinados ejemplos, cuando se usa perfusado para suplementacion, el volumen de perfusado es aproximadamente, mayor de aproximadamente, o menor de aproximadamente, el 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 8 %, 6 %, 4 %, 2 % o 1 % del volumen total de las celulas (en disolucion) mas el perfusado. Cuando se usan las celulas de perfusado placentario para suplementar una pluralidad de celulas madre placentarias, las celulas de perfusado placentario generalmente comprenden aproximadamente, mas de aproximadamente, o menos de aproximadamente, el 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 8 %, 6 %, 4 %, 2 % o 1 % del numero total de las celulas de perfusado placentario mas las celulas madre placentarias. De forma similar, cuando se usan las celulas madre placentarias para suplementar una pluralidad de celulas de perfusado placentario, las celulas madre placentarias generalmente comprenden aproximadamente, mas de aproximadamente, o menos de aproximadamente, el 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %,
25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 8 %, 6 %, 4 %, 2 % o 1 % del numero total de las celulas de perfusado placentario mas las celulas madre placentarias. Cuando se usan las celulas madre placentarias o celulas de perfusado placentario para suplementar el perfusado placentario, el volumen de disolucion (p. ej., disolucion salina, medio de cultivo o semejantes) en el que las celulas se suspenden comprende aproximadamente, mas de aproximadamente, o menos de aproximadamente, el 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 8 %, 6 %, 4 %, 2 % o 1 % del volumen total de perfusado mas celulas, donde las celulas madre placentarias se suspenden a aproximadamente 1 x 104,
5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o ma suplementacion.
En la presente memoria se describe ademas perfusado placentario combinado que se obtiene a partir de dos o mas fuentes, p. ej., dos o mas placentas, y se combinan, p. ej., se juntan. Dicho perfusado combinado puede comprender aproximadamente volumenes iguales de perfusado de cada fuente, o puede comprender diferentes volumenes de cada fuente. Los volumenes relativos de cada fuente pueden seleccionarse aleatoriamente, o pueden estar basados, p. ej., en una concentracion o cantidad de uno o mas factores celulares, p. ej., citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, o semejantes; el numero de las celulas placentarias en el perfusado de cada fuente; u otras caractensticas del perfusado de cada fuente. El perfusado de multiples perfusiones de la misma placenta puede combinarse de forma similar.
De forma similar, en la presente memoria se describen celulas de perfusado placentario, y celulas madre placentarias, que se obtienen a partir de dos o mas fuentes, p. ej., dos o mas placentas, y se combinan. Dichas celulas combinadas pueden comprender numeros aproximadamente iguales de las celulas de las dos o mas fuentes, o numeros diferentes de las celulas de una o mas de las fuentes combinadas. Los numeros relativos de las celulas de cada fuente pueden seleccionarse sobre la base, p. ej., del numero de uno o mas tipos celulares espedficos en las celulas que se van a combinar, p. ej., el numero de celulas madre CD34-, etc.
Los combinados pueden comprender, p. ej., perfusado placentario suplementado con celulas de perfusado placentario; perfusado placentario suplementado con celulas madre placentarias; perfusado placentario suplementado tanto con celulas de perfusado placentario como con celulas madre placentarias; celulas de perfusado placentario suplementadas con perfusado placentario; celulas de perfusado placentario suplementadas con celulas madre placentarias; celulas de perfusado placentario suplementadas tanto con perfusado placentario como con celulas madre placentarias; celulas madre placentarias suplementadas con perfusado placentario; celulas madre placentarias suplementadas con celulas de perfusado placentario; o celulas madre placentarias suplementadas tanto con celulas de perfusado placentario como con perfusado placentario.
En determinados ejemplos, el perfusado placentario, celulas de perfusado placentario, y celulas madre placentarias se proporcionan como unidades administrables de grado farmaceutico. Dichas unidades pueden proporcionarse en volumenes discretos, p. ej., 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 500 mL, o semejantes. Dichas unidades pueden proporcionarse de manera que contengan un numero especificado, p. ej., de celulas de perfusado placentario, celulas asesinas naturales intermedias derivadas de perfusado placentario, o ambas, p. ej.,
1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o mas celulas por mililitro, o 1 x 104,
5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o mas celulas por unidad. Dichas unidades pueden proporcionarse de manera que contengan numeros especificados de dos cualquiera, o los tres, de perfusado placentario, celulas de perfusado placentario, y/o celulas madre placentarias.
En las combinaciones anteriores de perfusado placentario, celulas de perfusado placentario y/o celulas madre placentarias, uno cualquiera, dos cualquiera, o los tres del perfusado placentario, celulas de perfusado placentario y/o celulas madre placentarias pueden ser autologos para un receptor (esto es, se obtiene del receptor), u homologos para un receptor (esto es, se obtiene de al menos otro individuo distinto de dicho receptor).
En la presente memoria tambien se proporcionan composiciones para uso en la invencion que comprenden celulas madre placentarias adherentes CD200+ en combinacion con celulas de perfusado placentario y/o perfusado placentario. Asf, en otro aspecto, en la presente memoria se proporciona dicha composicion que comprende dichas celulas madre placentarias, en donde dichas celulas madre se afslan de perfusado placentario, y en donde dichas celulas madre placentarias comprenden al menos el 50 % de las celulas en la composicion. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias comprenden al menos el 80 % de las celulas en la composicion. En otra realizacion espedfica, la composicion comprende perfusado placentario aislado. En una realizacion mas espedfica, dicho perfusado placentario es del mismo individuo que dichas celulas madre placentarias. En otra realizacion mas espedfica, dicho perfusado placentario comprende perfusado placentario de un individuo diferente que dichas celulas
madre placentarias. En otra realizacion espedfica, la composicion comprende celulas de perfusado placentario. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas de perfusado placentario son del mismo individuo que dichas celulas madre placentarias. En otra realizacion mas espedfica, dichas celulas de perfusado placentario son de un individuo diferente que dichas celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, la composicion comprende adicionalmente perfusado placentario aislado y celulas de perfusado placentario aislado, en donde dicho perfusado aislado y dichas celulas de perfusado placentario aislado son de diferentes individuos. En otra realizacion mas espedfica de cualquiera de las realizaciones anteriores que comprenden perfusado placentario, dicho perfusado placentario comprende perfusado placentario de al menos dos individuos. En otra realizacion mas espedfica de cualquiera de las realizaciones anteriores que comprenden celulas de perfusado placentario, dichas celulas de perfusado placentario aislado son de al menos dos individuos.
4.5 Produccion de un banco de celulas madre placentarias
Las celulas madre de placentas postparto pueden cultivarse de varias maneras diferentes para producir un conjunto de lotes, p. ej., un conjunto de dosis administrables individualmente, de las celulas madre placentarias. Dichos lotes pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de celulas madre de perfusado placentario o de tejido placentario digerido con enzimas. Los conjuntos de lotes de las celulas madre placentarias, obtenidos de una pluralidad de placentas, pueden organizarse en un banco de celulas madre placentarias, p. ej., para almacenamiento a largo plazo. Generalmente, las celulas madre adherentes se obtienen a partir de un cultivo inicial de material placentario para formar un cultivo de siembra, que se expande en condiciones controladas para formar poblaciones de celulas con numeros aproximadamente equivalentes de duplicaciones. Los lotes derivan preferiblemente del tejido de una unica placenta, pero pueden derivar del tejido de una pluralidad de placentas.
En un ejemplo, los lotes de celulas madre se obtienen como sigue. El tejido placentario se disrumpe en primer lugar, p. ej., por troceado, se digiere con una enzima adecuada, p. ej., colagenasa (vease la Seccion 5.2.3, anteriormente). El tejido placentario comprende preferiblemente, p. ej., el amnios completo, corion completo, o ambos, de una unica placenta, pero puede comprender solo una parte bien del amnios o corion. El tejido digerido se cultiva, p. ej., durante aproximadamente 1-3 semanas, preferiblemente aproximadamente 2 semanas. Despues de la eliminacion de las celulas no adherentes, las colonias de alta densidad que se forman se recogen, p. ej., por tripsinizacion. Estas celulas se recogen y resuspenden en un volumen conveniente de medio de cultivo, y se definen como celulas de Subcultivo 0.
Las celulas de Subcultivo 0 se usan entonces para sembrar los cultivos de expansion. Los cultivos de expansion pueden ser cualquier organizacion de aparatos de cultivo celular separados, p. ej., una Cell Factory por NUNC™. Las celulas en el cultivo de Subcultivo 0 pueden subdividirse en cualquier grado de manera que se siembran cultivos de expansion con, p. ej., 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, o 10 x 104 celulas madre. Preferiblemente, se usan de aproximadamente 2 x 104 a aproximadamente 3 x 104 celulas de Subcultivo 0 para sembrar cada cultivo de expansion. El numero de los cultivos de expansion puede depender del numero de celulas de Subcultivo 0, y puede ser mayor o menor en numero dependiendo de la o las placentas particulares a partir de las que se obtienen las celulas madre.
Los cultivos de expansion se crecen hasta que la densidad de las celulas en el cultivo alcanza un determinado valor, p. ej., aproximadamente 1 x 105 celulas/cm2 Las celulas pueden bien recogerse y criopreservarse en este punto, o subcultivarse en nuevos cultivos de expansion como se ha descrito anteriormente. Las celulas pueden subcultivarse, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces antes de su uso. Preferiblemente, se mantiene un registro del numero acumulativo de duplicaciones de las poblaciones durante el o los cultivos de expansion. Las celulas de un cultivo de Subcultivo 0 pueden expandirse durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones, o hasta 60 duplicaciones. Preferiblemente, sin embargo, el numero de duplicaciones de las poblaciones, antes de dividir la poblacion de las celulas en dosis individuales, es entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30, preferiblemente aproximadamente 20 duplicaciones. Las celulas pueden cultivarse continuamente a lo largo del proceso de expansion, o pueden congelarse en uno o mas puntos durante la expansion.
Las celulas que se van a usar para dosis individuales pueden congelarse, p. ej., criopreservarse para un uso posterior. Las dosis individuales pueden comprender, p. ej., aproximadamente 1 millon a aproximadamente 100 millones de celulas por ml, y pueden comprender entre aproximadamente 106 y aproximadamente 109 celulas en total.
En un ejemplo espedfico del metodo, las celulas del Subcultivo 0 se cultivan durante aproximadamente 4 duplicaciones, despues se congelan en un primer banco de celulas. Las celulas del primer banco de celulas se congelan y se usan para sembrar un segundo banco de celulas, cuyas celulas se expanden durante aproximadamente otras ocho duplicaciones. Las celulas en este estadio se recogen y se congelan y se usan para sembrar nuevos cultivos de expansion que se dejan continuar durante aproximadamente ocho duplicaciones adicionales, llevando el numero de acumulativo de duplicaciones celulares hasta aproximadamente 20. Las celulas en los puntos intermedios en el subcultivo pueden congelarse en unidades de aproximadamente 100000 a aproximadamente 10 millones de celulas por ml, preferiblemente aproximadamente 1 millon de celulas por ml para su uso en cultivos de expansion posteriores. Las celulas a aproximadamente 20 duplicaciones pueden congelarse en dosis individuales de entre aproximadamente 1 millon a aproximadamente 100 millones de celulas por ml para administracion o uso en la preparacion de una composicion que contiene celulas madre.
Preferiblemente, el donante del que se obtiene la placenta (p. ej., la madre) se ensaya para al menos un patogeno. Si los ensayos de la madre son positivos para un patogeno ensayado, se desecha el lote completo de la placenta. Dicho ensayo puede realizarse en cualquier momento durante la produccion de los lotes de las celulas madre placentarias, incluyendo antes o despues del establecimiento de las celulas de Subcultivo 0, o durante el cultivo de expansion. Los patogenos cuya presencia se ensaya pueden incluir, sin limitacion, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, virus de la inmunodeficiencia humana (tipos I y II), citomegalovirus, herpesvirus, y semejantes.
4.6 Diferenciacion de celulas madre placentarias adherentes
4.6.1 Induccion de la diferenciacion en celulas neuronales o neurogenicas
La diferenciacion neuronal de las celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, poniendo las celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en neuronas. En un metodo de ejemplo, un medio neurogenico comprende DMEM/20 % de FBS y beta-mercaptoetanol 1 mM; dicho medio puede remplazarse despues del cultivo durante aproximadamente 24 horas con medio que consiste en DMEM y betamercaptoetanol 1-10 mM. En otro ejemplo, las celulas se ponen en contacto con DMEM/2 % de DMSO/hidroxianisol butilado 200 pM. En un ejemplo espedfico, el medio de diferenciacion comprende DMEM F-12 sin suero, hidroxianisol butilado, cloruro de potasio, insulina, forskolina, acido valproico, e hidrocortisona. En otro ejemplo, la diferenciacion neuronal se consigue sembrando en placas las celulas madre placentarias en placas recubiertas con laminina en medio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad CA) que contiene suplemento B27 y L-glutamina, suplementado opcionalmente con bFGF y/o EGF. Las celulas madre placentarias tambien pueden inducirse para la diferenciacion neural por cocultivo con celulas neurales, o cultivo en medio condicionado de neuronas.
La diferenciacion neuronal puede evaluarse, p. ej., por la deteccion de morfologfa semejante a neurona (p. ej., celulas bipolares que comprenden procesos extendidos) deteccion de la expresion p. ej., de receptor del factor de crecimiento nervioso y genes de cadena pesada de neurofilamentos por RT/PCR; o deteccion de actividad electrica, p. ej., por registro zonal.
4.6.2 Induccion de la diferenciacion en celulas adipogenicas
La diferenciacion adipogenica de las celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, poniendo las celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en adipocitos. Un medio adipogenico preferido comprende MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con 15 % de suero de sangre del cordon. En un ejemplo, las celulas madre placentarias se alimentan con Medio de Induccion de la Adipogenesis (Cambrex) y se cultivan durante 3 dfas (a 37 °C, 5 % de CO2), seguido de 1-3 dfas de cultivo en Medio de Mantenimiento de la Adipogenesis (Cambrex). Despues de 3 ciclos completos de induccion/mantenimiento, las celulas se cultivan durante 7 dfas adicionales en medio de mantenimiento de la adipogenesis, reemplazando el medio cada 2-3 dfas.
En otro ejemplo, las celulas madre placentarias se cultivan en medio que comprende dexametasona 1 pM, indometacina 0.2 mM, 0.01 mg/ml de insulina, IBMX 0.5 mM, DMEM con alto contenido en glucosa, FBS, y antibioticos. Las celulas madre placentarias tambien pueden inducirse hacia la adipogenesis por cultivo en medio que comprende uno o mas glucocorticoides (p. ej., dexametasona, indometasona, hidrocortisona, cortisona), insulina, un compuesto que eleva los niveles intracelulares de AMPc (p. ej., dibutiril-AMPc; 8-CPT-AMPc (8-(4)clorofeniltio)-adenosina, 3', 5' monofosfato dclico); 8-bromo-AMPc; dioctanoil-AMPc; forskolina) y/o un compuesto que inhibe la degradacion de AMPc (p. ej., un inhibidor de fosfodiesterasa tal como isobutilmetilxantina (IBMX), metil isobutilxantina, teofilina, cafema, indometacina).
Una caractenstica distintiva de la adipogenesis es el desarrollo de multiples vesfculas lipfdicas intracitoplasmicas que pueden observarse facilmente usando la tincion lipofflica aceite rojo O. La expresion de genes de lipasa y/o de protema de union a acidos grasos se confirma por RT/PCR en las celulas madre placentarias que han empezado a diferenciarse en adipocitos.
4.6.3 Induccion de la diferenciacion en celulas condrocfticas
La diferenciacion condrogenica de las celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, poniendo las celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en condrocitos. Un medio condrodtico preferido comprende MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con 15 % de suero de sangre del cordon. Por ejemplo, las celulas madre placentarias se dividen en partes alteuotas en un tubo de polipropileno esteril, se centrifugan (p. ej., a 150 x g durante 5 minutos), y se lavan dos veces en Medio de Condrogenesis Incomplete (Cambrex). Las celulas se resuspenden en Medio de Condrogenesis Complete (Cambrex) que contiene 0.01 pg/ml de TGF-beta-3 a una concentracion de aproximadamente 1-20 x 105 celulas/ml. En otros ejemplos, las celulas madre placentarias se ponen en contacto con factores de crecimiento exogenos, p. ej., GDF-5 o factor de crecimiento transformante beta3 (TGF-beta3), con o sin ascorbato. El medio condrogenico puede suplementarse con aminoacidos incluyendo prolina y glutamina, piruvato de sodio, dexametasona, acido ascorbico, e insulina/transferrina/selenio. El medio condrogenico puede suplementarse con hidroxido de sodio y/o colageno. Las celulas madre placentarias pueden cultivarse a una densidad alta o baja. Las celulas se cultivan preferiblemente en ausencia de suero.
La condrogenesis puede evaluarse, p. ej., por observacion de la produccion de sustancia de fondo eosinofflico, tincion con safranina-O para la expresion de glicosaminoglicano; tincion con hematoxilina/eosina, evaluacion de la morfologfa celular, y/o confirmacion por RT/PCR de la expresion genica de colageno 2 y colageno 9. La condrogenesis tambien puede observarse creciendo las celulas madre en un sedimento, formado, p. ej., centrifugando suavemente las celulas madre en suspension (p. ej., a aproximadamente 800g durante aproximadamente 5 minutos). Despues de aproximadamente 1-28 dfas, el sedimento de las celulas madre empieza a formar una matriz firme y demuestra una integridad estructural no encontrada en lmeas celulares no inducidas, o no condrogenicas, cuyos sedimentos tienden a separarse cuando se pulsan. La condrogenesis tambien puede demostrarse, p. ej., en dichos sedimentos celulares, tinendo con una tincion que tine el colageno, p. ej., Rojo Sirio, y/o una tincion que tine glicosaminoglicanos (GAG), tales como, p. ej., Azul Alcian.
4.6.4 Induccion de la diferenciacion en celulas osteogenicas
La diferenciacion osteogenica de las celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, poniendo las celulas madre placentarias para uso en la invencion en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en celulas osteogenicas. Un medio osteodtico preferido comprende MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con 15 % de suero de sangre del cordon, seguido de Medio de Induccion Osteogenica (Cambrex) que contiene dexametasona 0.1 pM, acido ascorbico-2-fosfato 0.05 mM, beta glicerofosfato 10 mM. En otra realizacion, las celulas madre placentarias se cultivan en medio (p. ej., DMEM con bajo contenido en glucosa) que contiene dexametasona a aproximadamente 10'7 a aproximadamente 10'9 M, sal fosfato de ascorbato aproximadamente 10- 50 pM (p. ej., ascorbato-2-fosfato) y p-glicerofosfato aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 mM. El medio osteogenico tambien puede incluir suero, uno o mas agentes antibioticos/antimicoticos, factor de crecimiento transformante-beta (p. ej., TGF-p1) y/o protema morfogenica osea (p. ej., BMP-2, BMP-4, o una combinacion de las mismas).
La diferenciacion puede ensayarse usando una tincion espedfica de calcio, p. ej., tincion de von Kossa, y deteccion por RT/PCR, p. ej., de la expresion genica de la fosfatasa alcalina, osteocalcina, sialoprotema osea y/o osteopontina.
4.6.5 Induccion de la diferenciacion en celulas pancreaticas
La diferenciacion de las celulas madre placentarias en celulas pancreaticas productoras de insulina puede conseguirse, por ejemplo, poniendo las celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en celulas pancreaticas.
Un ejemplo de medio pancreagenico comprende DMEM/20 % de CBS, suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos basico, 10 ng/ml; y factor de crecimiento transformante beta-1,2 ng/ml. Este medio se combina con medio condicionado de cultivos de celulas neuronales positivas para nestina a 50/50 v/v. Puede usarse Reemplazo de Suero KnockOut en lugar de CBS. Las celulas se cultivan durante 14-28 dfas, con realimentacion cada 3-4 dfas.
La diferenciacion puede confirmarse ensayando, p. ej., la produccion de la protema insulina, o la expresion genica de la insulina por RT/PCR.
4.6.6 Induccion de la diferenciacion en celulas cardiacas
La diferenciacion miogenica (cardiogenica) de las celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, poniendo las celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en cardiomiocitos. Un medio cardiomiodtico preferido comprende DMEM/20 % de CBS suplementado con acido retinoico, 1 pM; factor de crecimiento de fibroblastos basico, 10 ng/ml; y factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/ml; y factor de crecimiento epidermico, 100 ng/ml. Puede usarse Reemplazo de Suero KnockOut (Invitrogen, Carlsbad, California) en lugar de CBS. Alternativamente, las celulas madre placentarias se cultivan en DMEM/20 % de CBS suplementado con 50 ng/ml de Cardiotropina-1 durante 24 horas. En otro ejemplo, las celulas madre placentarias pueden cultivarse 10-14 dfas en medio sin protemas durante 5-7 dfas, despues estimularse con extracto de miocardio humano, p. ej., producido por homogeneizacion de miocardio humano en tampon 1 % de HEPES suplementado con 1 % de suero de sangre del cordon.
La diferenciacion puede confirmarse por la demostracion de la expresion genica de la actina cardiaca, p. ej., por RT/PCR.
4.7 Preservacion de las celulas madre placentarias
Las celulas madre placentarias para uso en la invencion pueden preservarse, esto es, ponerse bajo condiciones que permiten el almacenamiento a largo plazo, o condiciones que inhiben la muerte celular, p. ej., apoptosis o necrosis.
Las celulas madre placentarias para uso en la invencion pueden preservarse usando, p. ej., una composicion que comprende un inhibidor de la apoptosis, inhibidor de la necrosis y/o un perfluorocarbono que porta oxfgeno, como se describe en la Solicitud Provisional U.S. relacionada No. 60/754 969, titulada "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs", presentada el 25 de diciembre, 2005. En una realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo para preservar una poblacion de celulas madre placentarias para uso en la invencion que comprende poner en contacto dicha poblacion de las celulas madre con una composicion para la recogida de celulas madre que comprende un inhibidor de la apoptosis y un perfluorocarbono que porta oxfgeno, en donde dicho inhibidor de la apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o prevenir la apoptosis en la poblacion de las celulas madre, comparado con una poblacion de celulas madre que no se ha puesto en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una realizacion espedfica, dicho inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otra realizacion espedfica, dicho inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de JNK. En una realizacion mas espedfica, dicho inhibidor de JNK no modula la diferenciacion o proliferacion de dichas celulas madre. En otra realizacion, dicha composicion para la recogida de las celulas madre comprende dicho inhibidor de la apoptosis y dicho un perfluorocarbono que porta oxfgeno en fases separadas. En otra realizacion, dicha composicion para la recogida de las celulas madre comprende dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono que porta oxfgeno en una emulsion. En otra realizacion, la composicion para la recogida de las celulas madre comprende adicionalmente un emulsionante, p. ej., lecitina. En otra realizacion, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono estan entre aproximadamente 0 °C y aproximadamente 25 °C en el momento en el que se ponen en contacto con las celulas madre. En otra realizacion mas espedfica, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono estan entre aproximadamente 2 °C y 10 °C, o entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 5 °C, en el momento en el que se ponen en contacto con las celulas madre. En otra realizacion mas espedfica, dicha puesta de contacto se realiza durante el transporte de dicha poblacion de las celulas madre. En otra realizacion mas espedfica, dicha puesta de contacto se realiza durante la congelacion y descongelacion de dicha poblacion de las celulas madre.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo para preservar una poblacion de celulas madre placentarias para uso en la invencion que comprende poner en contacto dicha poblacion de las celulas madre con un inhibidor de la apoptosis y un compuesto conservante de organos, en donde dicho inhibidor de la apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o prevenir la apoptosis en la poblacion de las celulas madre, comparado con una poblacion de celulas madre que no se ha puesto en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una realizacion espedfica, el compuesto conservante de organos es disolucion UW (descrita en la Patente U.S. No. 4 798 824; tambien conocida como ViaSpan; vease tambien, Southard et al., Transplantation 49(2):251 -257 (1990)) o una disolucion descrita en Stern et al., Patente U.S. No. 5552267. En otra realizacion, dicho compuesto conservante de organos es hidroxietil almidon, acido lactobionico, rafinosa, o una combinacion de los mismos. En otra realizacion, la composicion para la recogida de las celulas madre comprende adicionalmente un perfluorocarbono que porta oxfgeno, bien en dos fases o como una emulsion.
En otra realizacion del metodo, las celulas madre placentarias para uso en la invencion se ponen en contacto con una composicion para la recogida de las celulas madre que comprende un inhibidor de la apoptosis y perfluorocarbono que porta oxfgeno, compuesto conservante de organos, o una combinacion de los mismos, durante la perfusion. En otra realizacion, dichas celulas madre se ponen en contacto durante un proceso de disrupcion tisular, p. ej., digestion enzimatica. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias se ponen en contacto con dicho compuesto para la recogida de las celulas madre despues de la recogida por perfusion, o despues de la recogida por disrupcion tisular, p. ej., digestion enzimatica.
Tfpicamente, durante la recogida, enriquecimiento y aislamiento de las celulas placentarias, es preferible minimizar o eliminar el estres celular debido a hipoxia y estres mecanico. En otra realizacion del metodo, por lo tanto, una celula madre, o poblacion de las celulas madre, se expone a una condicion hipoxica durante la recogida, enriquecimiento o aislamiento durante menos de seis horas durante dicha preservacion, en donde una condicion hipoxica es una concentracion de oxfgeno que es menor de la concentracion normal de oxfgeno en la sangre. En una realizacion mas espedfica, dicha poblacion de las celulas madre se expone a dicha condicion hipoxica durante menos de dos horas durante dicha preservacion. En otra realizacion mas espedfica, dicha poblacion de las celulas madre se expone a dicha condicion hipoxica durante menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no se expone a una condicion hipoxica, durante la recogida, enriquecimiento o aislamiento. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de las celulas madre no se expone a tension de cizalla stress durante la recogida, enriquecimiento o aislamiento.
Las celulas madre placentarias proporcionadas en la presente memoria pueden criopreservarse, p. ej., en medio de criopreservacion en contenedores pequenos, p. ej., ampollas. El medio de criopreservacion adecuado incluye, pero no esta limitado a, medio de cultivo incluyendo, p. ej., medio de crecimiento, o medio de congelacion de celulas, por ejemplo, medio de congelacion de celulas disponible comercialmente, p. ej., C2695, C2639 o C6039 (Sigma). El medio de criopreservacion comprende preferiblemente DMSO (dimetilsulfoxido), a una concentracion, p. ej., de aproximadamente el 10 % (v/v). El medio de criopreservacion puede comprender agentes adicionales, por ejemplo, metilcelulosa y/o glicerol. Las celulas madre placentarias se enfnan preferiblemente a aproximadamente 1 °C/min durante la criopreservacion. Una temperatura de criopreservacion preferida es aproximadamente -80 °C a aproximadamente -180 °C, preferiblemente aproximadamente -125 °C a aproximadamente -140 °C. Las celulas criopreservadas pueden transferirse a nitrogeno lfquido antes de la descongelacion para el uso. En algunas realizaciones, por ejemplo, una vez las ampollas han alcanzado aproximadamente -90 °C, se transfieren a un area de almacenamiento con nitrogeno lfquido. Las celulas criopreservadas se descongelan preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37 °C.
4.8 Usos de las celulas madre placentarias
4.8.1 Perfusado placentario, celulas madre y poblaciones de celulas madre
Las poblaciones de celulas madre placentarias pueden usarse para tratar cualquier enfermedad, trastorno o afeccion que es susceptible de tratamiento por la administracion de una poblacion de celulas madre. Tal y como se usa en la presente memoria, "tratar" engloba la cura de, remedio de, mejora de, disminucion de la gravedad de, o reduccion de la evolucion temporal de, una enfermedad, trastorno o afeccion, o cualquier parametro o smtoma de los mismos.
Las celulas madre placentarias, y poblaciones de celulas madre placentarias, pueden inducirse para que se diferencien en un tipo celular particular, bien ex vivo o in vivo, en la preparacion para la administracion a un individuo que necesita las celulas madre, o celulas diferenciadas a partir de celulas madre. Por ejemplo, las celulas madre placentarias pueden inyectarse en un organo danado, y para la neogenesis de organos y reparacion de dano in vivo. Dicho dano puede deberse a dichas afecciones y trastornos incluyendo, pero no limitado a, defectos oseos incluyendo lesiones que se producen por cancer, fracturas, y afecciones de la medula espinal tratables, p. ej., con fusion espinal. Las celulas madre placentarias pueden inyectarse en el hueso danado solas o pueden introducirse con un sustrato implantable como se describe en la presente memoria. Las poblaciones aisladas de celulas madre placentarias pueden usarse, en realizaciones espedficas, para tratar enfermedades o afecciones espedficas, incluyendo, pero no limitado a mieloma multiple, canceres incluyendo cancer oseo, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, cordoma, histiocitoma fibroso maligno del hueso, fibrosarcoma del hueso, cancer metastasico, mieloma multiple, y cualquier forma de cancer metastasico caracterizada por metastasis oseas. Como reconocera un experto en la tecnica, el tratamiento de defectos oseos causados por cancer no abatira necesariamente el cancer en sf mismo. El tratamiento de defectos oseos segun se proporciona en la presente memoria puede ocurrir antes, despues o concurrentemente con terapias adicionales para el cancer. De acuerdo con esto, en una realizacion, los defectos oseos se tratan antes de que se trate el cancer con una terapia anticancerosa. En otra realizacion, los defectos oseos se tratan en el mismo momento o cerca del mismo en el que el cancer se trata con una terapia anticancerosa. En otra realizacion, los defectos oseos se tratan despues de que el cancer se trata con una terapia anticancerosa.
Tambien pueden usarse el perfusado placentario aislado, celulas de perfusado placentario, y/o poblaciones aisladas de celulas madre placentarias para tratar fracturas oseas, p. ej., fracturas oseas no de union. Las poblaciones aisladas de celulas madre placentarias tambien pueden usarse para fusionar vertebras entre sf con el fin de, p. ej., completar una fusion espinal en un sujeto que lo necesita. Las poblaciones aisladas de celulas madre placentarias, en combinacion con poblaciones de celulas madre o progenitoras, tambien pueden usarse para tratar lo anterior.
En determinados ejemplos de los metodos anteriores para tratar defectos oseos, pueden administrarse perfusado placentario, celulas de perfusado placentario y/o celulas madre placentarias, p. ej., celulas madre placentarias adherentes o no adherentes, a un individuo que tiene un defecto oseo. Puede administrarse a dicho individuo, p. ej., perfusado placentario segun se obtiene de una placenta; perfusado placentario que se ha tratado para eliminar uno o mas tipos celulares, p. ej., eritrocitos; celulas de perfusado placentario aisladas de perfusado placentario, o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Dichas combinaciones tambien pueden comprender celulas madre placentarias adherentes aisladas y/o celulas madre placentarias no adherentes aisladas, como se describe en otro lugar en la presente memoria. Las combinaciones de perfusado placentario, celulas de perfusado placentario aisladas y/o celulas madre placentarias utiles para tratar un defecto oseo, o a un individuo que tiene un defecto oseo, se describen en la Seccion 5.4, anteriormente.
En ejemplos espedficos del metodo de tratamiento, las celulas placentarias estan contenidas en perfusado placentario completo (no procesado). En otro ejemplo espedfico, las celulas placentarias son celulas de perfusado placentario. En otro ejemplo espedfico, las celulas placentarias son celulas madre placentarias. En determinados ejemplos mas espedficos, las celulas madre no son adherentes. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD44-. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados otros ejemplos del metodo, las celulas madre placentarias son adherentes. En ejemplos espedficos, las celulas madre placentarias adherentes son CD200+y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide; u OCT-4+ y facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides; o cualquier combinacion de los mismos. En ejemplos mas espedficos de las celulas madre placentarias no adherentes, la celula madre CD200+, HLA-G+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+; la celula madre CD73+, CD105+, y CD200+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+; la celula madre CD200+, OCT-4+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+; la celula madre aislada de la reivindicacion 1, en donde dicha celula madre CD73+, CD105+ y HLA-G+ es CD34-, CD45-, OCT-4+ y CD200+; la celula madre CD73+ y CD105+ aislada que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es OCT4+, CD34-, CD38- y CD45-; y/o la OCT-4+ aislada y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, y CD45-. En determinados ejemplos, la poblacion de las celulas madre placentarias ha sido expandida.
Cuando el perfusado placentario, celulas de perfusado placentario, o celulas madre placentarias se administran como una suspension o lfquido inyectable, las celulas pueden administrarse intravenosamente, o, preferiblemente, en el sitio del defecto oseo, p. ej., rotura.
En la presente memoria tambien se proporciona una composicion para uso en la invencion para uso en un metodo para tratar defectos oseos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composicion implantable o inyectable que comprende una celulas madre placentarias CD200+ adherentes proporcionadas en la presente memoria, tratando de esta manera el defecto oseo en el sujeto. En determinadas realizaciones, el defecto oseo es una lesion osteolttica asociada con un cancer, una fractura osea, o una medula espinal, p. ej., que necesita fusion. En determinadas realizaciones, la lesion osteolftica esta asociada con mieloma multiple, cancer oseo, o cancer metastasico. En determinadas realizaciones, la fractura osea es una fractura no de union. En determinadas realizaciones, se administra al sujeto una composicion implantable que comprende una poblacion de celulas madre no adherentes. En determinadas realizaciones, se implanta quirurgicamente una composicion implantable, p. ej., en el sitio del defecto oseo. En determinadas realizaciones, se administra al sujeto una composicion inyectable que comprende una poblacion de celulas madre no adherentes. En determinadas realizaciones, se administra quirurgicamente una composicion inyectable en la region del defecto oseo. En determinadas realizaciones, la composicion inyectable se administra sistemicamente.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un metodo para formular una composicion inyectable, que comprende combinar una poblacion de celulas placentarias con acido hialuronico o colageno inyectable. En un ejemplo espedfico, las celulas placentarias estan contenidas en perfusado placentario completo (no procesado). En otro ejemplo espedfico, las celulas placentarias son celulas de perfusado placentario. En otro ejemplo espedfico, las celulas placentarias son celulas madre placentarias. En determinados ejemplos mas espedficos, las celulas madre no son adherentes. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD34+. En determinados ejemplos, las celulas madre son CD44-. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, o CD166+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD9+, CD54+, CD90+, y CD166+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, o CD200+. En determinados ejemplos, dichas celulas madre son CD31+, CD117+, CD133+, y CD200+. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % de dichas celulas son celulas madre CD34+ y CD44-. En determinados otros ejemplos del metodo, las celulas madre placentarias son adherentes. En realizaciones espedficas, las celulas madre placentarias adherentes son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD200+, CD73+, CD105+ y HLA-G+; y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo semejante a embrioide; o CD200+ y OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva bajo condiciones que permiten la formacion de cuerpos semejantes a embrioides; o cualquier combinacion de los mismos. En ejemplos mas espedficos de las celulas madre placentarias no adherentes, la celula madre CD200+, HLA-G+ aislada es CD34-, CD38- CD45-, CD73+ y CD105+; la celula madre CD73+, CD105+, y CD200+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+; la celula madre CD200+, OCT-4+ aislada es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+; la celula madre aislada de la reivindicacion 1 , en donde dicha celula madre CD73+, CD105+ y
HLA-G+ es CD34-, CD45-, OCT-4+ y CD200+; la celula madre CD73+ y CD105+ aislada que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es OCT4+, CD34- CD38' y CD45'; y/o la OCT-4+ aislada y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos semejantes a embrioides es CD73+, CD105+, CD200+, CD34', CD38', y CD45'. En determinadas realizaciones, la poblacion de las celulas madre placentarias ha sido expandida. En determinadas realizaciones, dicha composicion comprende acido hialuronico inyectable. En determinadas realizaciones, la composicion comprende colageno inyectable. En la presente memoria tambien se describen composiciones que comprenden una poblacion de celulas madre no adherentes y acido hialuronico o colageno inyectable.
Las celulas madre placentarias pueden administrarse sin haber sido cultivadas en condiciones que causan la diferenciacion de las celulas madre. Alternativamente, las celulas madre pueden cultivarse, p. ej., en medio osteogenico, p. ej., durante aproximadamente 1-20 dfas, antes de la administracion. Alternativamente, las celulas madre placentarias pueden aislarse y sembrarse en una matriz, despues cultivarse en medio osteogenico, p. ej., durante aproximadamente 1 -20 dfas. En otra realizacion, las celulas madre placentarias pueden cultivarse, p. ej., en medio osteogenico, p. ej., durante aproximadamente 1-20 dfas, despues sembrarse en una matriz, despues cultivarse en medio osteogenico como se describe en la presente memoria, p. ej., durante aproximadamente 1-20 dfas.
En otros ejemplos, las poblaciones aisladas de celulas madre placentarias pueden usarse en terapias o protocolos de regeneracion o reemplazo de tejido autologo o heterologo, incluyendo, pero no limitado al tratamiento de defectos en el epitelio corneo, reparacion de cartflago, dermoabrasion facial, membranas mucosales, membranas timpanicas, revestimientos intestinales, estructuras neurologicas (p. ej., retina, neuronas auditivas en la membrana basilar, neuronas olfativas en el epitelio olfativo), reparacion de quemaduras y heridas para lesiones traumaticas de la piel, o para la reconstruccion de otros organos o tejidos danados o enfermos.
En determinados casos, una poblacion aislada de celulas madre placentarias se usa en la reconstitucion hematopoyetica en un individuo que ha padecido una perdida parcial o total de celulas madre hematopoyeticas, p. ej., individuos expuestos a dosis letales o subletales de radiacion (ya sea industrial, medica o militar); individuos que han sido sometidos a mieloablacion como parte, p. ej., de terapia para el cancer, y semejantes. Las poblaciones aisladas de celulas madre derivadas de placenta pueden usarse en lugar de, o para suplementar, la medula osea o poblaciones de las celulas madre derivadas de la medula osea. Tfpicamente, aproximadamente 1 x 108 a 2 x 108 celulas mononucleares de medula osea por kilogramo del peso del paciente se infunden para injerto en un trasplante de medula osea (es decir, aproximadamente 70 ml de medula para un donante de 70 kg). Para obtener 70 ml se requiere una donacion intensiva y la perdida significativa de sangre del donante en el proceso de donacion. Una poblacion aislada de celulas madre placentarias para reconstitucion hematopoyetica puede comprender, en varias realizaciones, aproximadamente, al menos, o no mas de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o mas celulas madre placentarias.
Las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, solas o en combinacion con otras poblaciones de celulas madre o celulas progenitoras, pueden usarse en la fabricacion de un tejido u organo in vivo. Los metodos descritos en la presente memoria engloban el uso de celulas obtenidas de la placenta, p. ej., celulas madre o celulas progenitoras, para sembrar una matriz y cultivarlas bajo condiciones apropiadas para permitir que las celulas se diferencien y pueblen la matriz. Los tejidos y organos obtenidos por los metodos descritos en la presente memoria pueden usarse para una variedad de propositos, incluyendo propositos de investigacion y terapeuticos
Preferiblemente, las celulas madre placentarias adherentes como se proporcionan en la presente memoria, y las poblaciones de dichas celulas madre, pueden usarse para trasplantes autologos y alogenicos, incluyendo trasplantes hematopoyeticos con tipo de HLA concordante y no concordante. En un ejemplo del uso de las celulas madre placentarias como trasplantes hematopoyeticos alogenicos, el huesped se trata para reducir el rechazo inmunologico de las celulas del donante, o para crear inmunotolerancia (veanse, p. ej., las Patentes U.S. Nos. 5800 539 y 5806 529). En otro ejemplo, el huesped no se trata para reducir el rechazo inmunologico o para crear inmunotolerancia.
Las celulas madre placentarias, bien solas o en combinacion con una o mas otras poblaciones de celulas madre, pueden usarse en protocolos de trasplante terapeutico, p. ej., para aumentar o reemplazar celulas madre o progenitoras del tngado, pancreas, rinon, pulmon, sistema nervioso, sistema muscular, hueso, medula osea, timo, bazo, tejido mucosal, gonadas, o pelo. Adicionalmente, las celulas madre placentarias pueden usarse en lugar de clases espedficas de celulas progenitoras (p. ej., condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas, celulas parenquimales pancreaticas, neuroblastos, celulas progenitoras musculares, etc.) en protocolos terapeuticos o de investigacion en los que se usanan tfpicamente celulas progenitoras.
Las celulas madre placentarias como se describen en la presente memoria, y las poblaciones de las mismas, pueden usarse para el aumento, reparacion o reemplazo de cartflago, tendon, o ligamentos. Por ejemplo, las protesis (p. ej., protesis de cadera) pueden recubrirse con construcciones de tejido de caidlago de reemplazo crecidas a partir de celulas madre placentarias descritas en la presente memoria. En otros ejemplos, las articulaciones (p. ej., rodilla) pueden reconstruirse con construcciones de tejido de cartflago crecidas a partir de celulas madre placentarias. Las construcciones de tejido de cartflago tambien pueden emplearse en cirugfa reconstructiva mayor para diferentes tipos de articulaciones (vease, p. ej., Resnick y Niwayama, eds., 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2a ed., W. B. Saunders Co.).
Las celulas madre placentarias adherentes descritas en la presente memoria pueden usarse para reparar el dano en tejidos y organos producido por, p. ej., trauma, trastornos metabolicos, o enfermedad. En dicha realizacion, pueden administrarse a un paciente celulas madre placentarias, solas o combinadas con otras poblaciones de celulas madre o progenitoras, para regenerar o restaurar tejidos u organos que han sido danados como consecuencia de una enfermedad.
4.8.2 Composiciones que comprenden celulas madre placentarias
En la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden celulas madre placentarias CD200+ adherentes, o biomoleculas de ellas, para uso en el tratamiento de defectos oseos o para uso en la fabricacion de medicamentos para dichos tratamientos. Las celulas madre placentarias adherentes proporcionadas en la presente memoria pueden combinarse con cualquier compuesto, composicion o dispositivo fisiologicamente aceptable o medicamente aceptable, para uso, p. ej., en investigacion o terapia.
4.8.2.1 Celulas madre placentarias criopreservadas
Las poblaciones de celulas madre placentarias para uso en la invencion pueden preservarse, por ejemplo, criopreservarse para un uso posterior. Los metodos para la criopreservacion de celulas, tales como celulas madre, son muy conocidos en la tecnica. Las poblaciones de celulas madre placentarias para uso en la invencion pueden prepararse en una forma que es facilmente administrable a un individuo. Por ejemplo, en la presente memoria se proporciona una poblacion de celulas madre placentarias para uso en la invencion que esta contenida en un contenedor que es adecuado para el uso medico. Dicho contenedor puede ser, por ejemplo, una bolsa de plastico esteril, matraz, frasco, u otro contenedor a partir del que pueda dispensarse facilmente la poblacion de celulas madre placentarias. Por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de sangre u otro plastico, bolsa medicamente aceptable adecuada para la administracion intravenosa de un lfquido a un receptor. El contenedor es preferiblemente uno que permite la criopreservacion de la poblacion de celulas madre combinada.
La poblacion de celulas madre placentarias criopreservadas puede comprender celulas madre placentarias derivadas de un unico donante, o de multiples donantes. La poblacion de celulas madre placentarias puede ser completamente concordante en HLA con un receptor pretendido, o parcialmente o completamente no concordante en HLA.
Asf, en una realizacion, en la presente memoria se proporciona una composicion para uso en la invencion que comprende una poblacion de celulas madre CD200+ adherentes en un contenedor. En una realizacion espedfica, la poblacion de celulas madre se criopreserva. En otra realizacion espedfica, el contenedor es una bolsa, matraz, o frasco. En una realizacion mas espedfica, dicha bolsa en una bolsa de plastico esteril. En una realizacion mas espedfica, dicha bolsa es adecuada para, permite o facilita la administracion intravenosa de dicha poblacion de celulas madre placentarias. La bolsa puede comprender multiples lumenes o compartimentos que estan interconectados para permitir el mezclado de las celulas madre placentarias y una o mas otras disoluciones, p. ej., un farmaco, antes de, o durante, la administracion. En otra realizacion espedfica, la composicion comprende uno o mas compuestos que facilitan la criopreservacion de la poblacion de celulas madre combinada. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas madre placentarias esta contenida en una disolucion acuosa fisiologicamente aceptable. En una realizacion mas espedfica, dicha disolucion acuosa fisiologicamente aceptable es una disolucion de NaCl al 0.9 %. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas madre placentarias comprende celulas placentarias que son concordantes en HLA con un receptor de dicha poblacion de celulas madre. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas madre combinada comprende celulas placentarias que son al menos parcialmente no concordantes en HLA con un receptor de dicha poblacion de celulas madre. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias derivan de una pluralidad de donantes.
4.8.2.2 Composiciones farmaceuticas
Las poblaciones de celulas madre placentarias para uso en la invencion, o poblaciones de celulas que comprenden celulas madre placentarias, pueden formularse en composiciones farmaceuticas para uso in vivo. Dichas composiciones farmaceuticas comprenden una poblacion de celulas madre placentarias, o una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias, en un vehfculo farmaceuticamente aceptable, p. ej., una disolucion salina u otra disolucion fisiologicamente aceptable aceptada para la administracion in vivo. Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender las poblaciones de celulas madre placentarias para uso en la invencion, o tipos de celulas madre placentarias, descritos en otro lugar en la presente memoria. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender celulas madre placentarias fetales, maternas, otanto fetales como maternas. Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender ademas celulas madre placentarias para uso en la invencion obtenidas de un unico individuo o placenta, o de una pluralidad de individuos o placentas.
Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender cualquier numero de celulas madre placentarias para uso en la invencion. Por ejemplo, una dosis unitaria de dichas celulas madre placentarias puede comprender, en varias realizaciones, aproximadamente, al menos, o no mas de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o mas celulas madre placentarias.
Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender poblaciones de celulas que comprenden un 50 % de celulas viables o mas (esto es, al menos aproximadamente el 50 % de las celulas en la poblacion son funcionales o estan vivas). Preferiblemente, al menos aproximadamente el 60 % de las celulas en la poblacion son viables. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente el 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de las celulas en la poblacion en la composicion farmaceutica son viables.
Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender uno o mas compuestos que, p. ej., facilitan el injerto (p. ej., anticuerpos antireceptor de celulas T, un inmunosupresor, o semejantes); estabilizantes tales como albumina, dextrano 40, gelatina, hidroxietil almidon, y semejantes.
4.8.2.3 Medio condicionado de celulas madre placentarias
Las celulas madre placentarias para uso en la invencion pueden usarse para producir medio condicionado, esto es, medio que comprende una o mas biomoleculas secretadas o excretadas por las celulas madre. En varias realizaciones, el medio condicionado comprende medio en el que dichas celulas madre placentarias han crecido durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o mas dfas. En otras realizaciones, el medio condicionado comprende medio en el que dichas celulas madre placentarias han crecido hasta al menos aproximadamente el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % de confluencia, o hasta el 100 % de confluencia. Dicho medio condicionado puede usarse para apoyar el cultivo de una poblacion separada de celulas madre placentarias, o celulas madre de otra clase. En otro ejemplo, el medio condicionado comprende medio en el que las celulas madre placentarias se han diferenciado en un tipo celular adulto. En otro ejemplo, el medio condicionado descrito en la presente memoria comprende medio en el que se han cultivado las celulas madre placentarias y celulas madre no placentarias.
4.8.2.4 Matrices que comprenden celulas madre placentarias
En la presente memoria se proporcionan ademas matrices, hidrogeles, soportes, y semejantes que comprenden celulas madre placentarias CD200+ adherentes, o una poblacion de dichas celulas madre placentarias. En determinadas realizaciones, la matriz puede ser cualquier sustrato conocido que un experto en la tecnica sabe que es util para tratar defectos oseos. Por ejemplo, la matriz puede ser un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de pfosfato tricalcico-colageno, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno mineralizado, y un sustrato de acido hialuronico. En algunas realizaciones, el colageno en la matriz puede ser colageno placentario. Los metodos y composiciones para aislar y preparar colageno placentario estan descritos extensamente, por ejemplo, en la Solicitud de Patente U.S. No. 11/450934, presentada el 9 de junio, 2006.
Dichas celulas madre placentarias pueden sembrarse en la matriz para tratar hueso antes de o despues de una etapa de diferenciacion. Por ejemplo, las celulas madre placentarias pueden cultivarse, p. ej., en medio osteogenico durante, p. ej., aproximadamente 1-20 dfas, despues sembrarse en la matriz. Alternativamente, las celulas madre placentarias pueden aislarse y sembrarse en la matriz, despues cultivarse en medio osteogenico como se describe en la presente memoria durante, p. ej., aproximadamente 1-20 dfas. En otra realizacion, las celulas madre placentarias se cultivan, p. ej., en medio osteogenico durante, p. ej., aproximadamente 1-20 dfas, despues se siembran en la matriz, despues se cultivan en medio osteogenico como se describe en la presente memoria durante, p. ej., aproximadamente 1-20 dfas.
Dichas celulas madre placentarias pueden sembrarse en una matriz natural, p. ej., un biomaterial placentario tal como un material de membrana amniotica. Dicho material de membrana amniotica puede ser, p. ej., membrana amniotica diseccionada directamente de una placenta de mairnfero; membrana amniotica fijada o tratada con calor, membrana amniotica sustancialmente seca {es decir, <20 % de H2O), membrana corionica, membrana corionica sustancialmente seca, membrana amniotica y corionica sustancialmente seca, y semejantes. Los biomateriales placentarios preferidos sobre los que pueden sembrarse las celulas madre placentarias se describen en Hariri, Publicacion de Solicitud U.S. No. 2004/0048796.
Dichas celulas madre placentarias pueden suspenderse en una disolucion de hidrogel adecuada, p. ej., para inyeccion. Los hidrogeles adecuados para dichas composiciones incluyen peptidos con auto-ensamblaje, tales como RAD16. En una realizacion, puede dejarse que una disolucion de hidrogel que comprende las celulas se endurezca, por ejemplo, en un molde, para formar una matriz que tiene celulas dispersadas en ella para implante. Las celulas madre placentarias en dicha matriz tambien pueden cultivarse de manera que las celulas se expanden mitoticamente antes del implante. El hidrogel es, p. ej., un polfmero organico (natural o sintetico) que esta entrecruzado mediante enlaces covalentes, ionicos o de hidrogeno para crear una estructura de red abierta tridimensional que atrapa las moleculas de agua para formar un gel. Los materiales formadores de hidrogeles incluyen polisacaridos tales como alginato y sales del mismo, peptidos, polifosfazinas, y poliacrilatos, que se entrecruzan ionicamente, o polfmeros en bloque tales como copolfmeros en bloque de oxido de polietileno-polipropilen glicol que se entrecruzan por temperatura o pH, respectivamente. En algunas realizaciones, el hidrogel o matriz es biodegradable.
En algunas realizaciones, la formulacion comprende un gel polimerizable in situ (vease., p. ej., la Publicacion de Solicitud de Patente U.S. 2002/0022676; Anseth et al, J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang et al, Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003).
En algunas realizaciones, los polfmeros son al menos parcialmente solubles en disoluciones acuosas, tales como agua, disoluciones salinas tamponadas, o disoluciones alcoholicas acuosas, que tienen grupos laterales polares, o una sal ionica monovalente de las mismas. Los ejemplos de polfmeros que tienen grupos laterales acidos que pueden reaccionar con cationes son poli(fosfazenos), poli(acidos acnlicos), poli(acidos metacnlicos), copolfmeros de acido acnlico y acido metacnlico, poli(acetato de vinilo), y polfmeros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado. Tambien pueden usarse los copolfmeros que tienen grupos laterales acidos formados por la reaccion de acido acnlico o metacnlico y monomeros o polfmeros de eter de vinilo. Los ejemplos de grupos acidos son grupos acido carboxflico, grupos acido sulfonico, grupos alcoholes halogenados (preferiblemente, fluorados), grupos OH fenolicos, y grupos OH acidos.
Dichas celulas madre placentarias o cocultivos de las mismas pueden sembrarse en un marco o soporte tridimensional e implantarse in vivo. Dicho marco puede implantarse en combinacion con uno cualquiera o mas factores de crecimiento, celulas, farmacos u otros componentes que estimulan la formacion de tejido o aumentan o mejoran de otra forma la reparacion de tejidos.
Los ejemplos de soportes que pueden usarse incluyen mallas no tejidas, espumas porosas, o peptidos con autoensamblaje. Las mallas no tejidas pueden formarse usando fibras comprendidas por un copolfmero sintetico absorbible de acidos glicolico y lactico (p. ej., PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N. J.). Las espumas, compuestas por, p. ej., copolfmero poli(£-caprolactona)/poli(acido glicolico) (PCL/PGA), formadas por procesos tales como secado por congelacion, o liofilizacion (vease, p. ej., la Pat. U.S. No. 6355699), tambien pueden usarse como soportes.
Dichas celulas madre placentarias tambien pueden sembrarse en, o ponerse en contacto con, un material ceramico fisiologicamente aceptable incluyendo, pero no limitado a, fosfato de mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri-, y tetra-calcio, hidroxiapatito, fluoroapatitos, sulfatos de calcio, fluoruros de calcio, oxidos de calcio, carbonatos de calcio, fosfatos de magnesio y calcio, vidrios biologicamente activos tales como BIOGLASS®, y mezclas de los mismos. Los materiales ceramicos porosos biocompatibles actualmente disponibles comercialmente incluyen SURGIBONE® (CanMedica Corp., Canada), ENDOBON® (Merck Biomaterial France, Francia), CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Suiza), y productos de injerto de hueso de colageno mineralizado tales como HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) y VITOSS®, RHAKOSS™, y CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). El marco puede ser una mezcla, combinacion o amalgama de materiales naturales y/o sinteticos.
En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias pueden sembrarse en, o ponerse en contacto con, un fieltro, que puede estar compuesto, p. ej., por un hilado multifilamento hecho de un material bioabsorbible tal como copolfmeros o mezclas de PGA, PLA, PCL, o acido hialuronico.
Las celulas madre placentarias para uso en la invencion pueden, en otra realizacion, sembrarse en soportes de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Dichos soportes de espuma pueden moldearse en una forma util, tal como la de una parte de una estructura espedfica en el cuerpo que se va a reparar, reemplazar o aumentar. En algunas realizaciones, el marco se trata, p. ej., con acido acetico 0.1 M seguido de incubacion en polilisina, PBS, y/o colageno, antes de la inoculacion de las celulas madre placentarias con el fin de potenciar la adherencia de las celulas. Las superficies externas de una matriz pueden modificarse para mejorar la adherencia o crecimiento de las celulas y la diferenciacion de tejido, tal como recubriendo con plasma la matriz, o la adicion de una o mas protemas (p. ej., colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glicoprotemas, glicosaminoglicanos (p. ej., heparin sulfato, condroitin-4-sulfato, condroitin-6-sulfato, dermatan sulfato, queratin sulfato, etc.), una matriz celular, y/o otros materiales tales como, pero no limitado a, gelatina, alginatos, agar, agarosa, y gomas de plantas, y semejantes.
En algunas realizaciones, el soporte comprende, o se trata con, materiales que lo hacen no trombogenico. Estos tratamientos y materiales tambien pueden promover y sostener el crecimiento endotelial, la migracion, y deposicion de matriz extracelular. Los ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, pero no estan limitados a, materiales naturales tales como protemas de la membrana de basamento tales como laminina y colageno Tipo IV, materiales sinteticos tales como EPTFE, y siliconas de poliuretanourea segmentada, tales como PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.). El soporte tambien puede comprender agentes antitromboticos tales como heparina; los soportes tambien pueden tratarse para alterar la carga superficial (p. ej., recubrimiento con plasma) antes de sembrarlo con celulas madre placentarias. El soporte puede comprender ademas agentes que estimulan el crecimiento oseo y/o inhiben la resorcion osea. Por ejemplo, el soporte puede comprender protemas morfogenicas oseas, p. ej., BMP-2 y/o BMP-7, inhibidores de WNT, y semejantes.
4.8.3 Lmeas inmortalizadas de celulas madre placentarias
Las celulas placentarias de mairnfero pueden inmortalizarse condicionalmente por transfeccion con cualquier vector adecuado que contenga un gen promotor del crecimiento, esto es, un gen que codifica una protema que, bajo las condiciones apropiadas, promueve el crecimiento de la celula transfectada, de manera que la produccion y/o actividad de la protema promotora del crecimiento se puede regular por un factor externo. Como un ejemplo, el gen promotor del crecimiento es un oncogen tal como, pero no limitado a, v-myc, N-myc, c-myc, p53, antfgeno T grande de SV40, antfgeno T grande de polioma, adenovirus E1a o protema E7 del papilomavirus humano.
La regulacion externa de la protema promotora del crecimiento puede conseguirse poniendo el gen promotor del crecimiento bajo el control de un promotor que se puede regular externamente, p. ej., un promotor cuya actividad puede controlarse, por ejemplo, modificando la temperatura de las celulas transfectadas o la composicion del medio en contacto con las celulas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema de expresion genica controlado por la tetraciclina (tet) (vease Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1518-1523, 1996). En ausencia de tet, un transactivador controlado por tet (tTA) en este vector activa fuertemente la transcripcion a partir de phcMv*-1, un promotor mmimo del citomegalovirus humano fusionado a las secuencias operadoras de tet. tTA es una protema de fusion del represor (tetR) del operon de resistencia de tet derivado del transposon-10 de Escherichia coli y el dominio acido de VP16 del virus del herpes simple. Las concentraciones bajas, no toxicas de tet (p. ej., 0.01-1.0 pg/mL) suprimen casi completamente la transactivacion por tTA.
En un ejemplo, el vector contiene ademas un gen que codifica un marcador seleccionable, p. ej., una protema que confiere resistencia a farmacos. El gen de resistencia a neomicina bacteriano (neoR) es uno de dichos marcadores que puede emplearse como se describe en la presente memoria. Las celulas que portan neoR pueden seleccionarse por medios conocidos para los expertos en la tecnica, tales como la adicion, p. ej., de 100-200 pg/mL de G418 al medio de crecimiento.
La transfeccion puede conseguirse por cualquiera de una variedad de medios conocidos para los expertos en la tecnica incluyendo, pero no limitado a, infeccion retroviral. En general, un cultivo celular puede transfectarse por incubacion con una mezcla de medio condicionado recogido de la lmea celular productora para el vector y DMEM/F12 que contiene suplementos de N2. Por ejemplo, un cultivo de celulas placentarias preparado como se ha descrito anteriormente puede infectarse despues, p. ej., cinco dfas in vitro por incubacion durante aproximadamente 20 horas en un volumen de medio condicionado y dos volumenes de DMEM/F12 que contiene suplementos de N2. Las celulas transfectadas que portan un marcador seleccionable pueden seleccionarse entonces como se ha escrito anteriormente.
Despues de la transfeccion, los cultivos se subcultivan en una superficie que permite la proliferacion, p. ej., que permite que al menos aproximadamente el 30 % de las celulas se duplique en un periodo de 24 horas. Preferiblemente, el sustrato es un sustrato de poliornitina/laminina, que consiste en plastico de cultivo tisular recubierto con poliornitina (10 pg/mL) y/o laminina (10 pg/mL), un sustrato de polilisina/laminina o una superficie tratada con fibronectina. Los cultivos se alimentan entonces cada 3-4 dfas con medio de crecimiento, que puede estar o no suplementado con uno o mas factores que aumentan la proliferacion. Los factores que aumentan la proliferacion pueden anadirse al medio de crecimiento cuando los cultivos tienen una confluencia menor del 50 %.
Las lmeas inmortalizadas condicionalmente de celulas madre placentarias pueden subcultivarse usando tecnicas estandar, tales como por tripsinizacion, cuando tienen una confluencia del 80-95 %. Hasta aproximadamente el vigesimo subcultivo, es beneficioso mantener la seleccion (por ejemplo, por la adicion de G418 para celulas que contienen un gen de resistencia a neomicina). Las celulas tambien pueden congelarse en nitrogeno lfquido para un almacenamiento a largo plazo.
Las lmeas celulares clonales pueden aislarse a partir de una lmea inmortalizada condicionalmente de celulas madre placentarias humanas preparada como se ha descrito anteriormente. En general, dichas lmeas celulares clonales pueden aislarse usando tecnicas estandar, tal como dilucion limitante o usando anillos de clonacion, y expandirse. Las lmeas celulares clonales pueden alimentarse y subcultivarse generalmente como se ha descrito anteriormente.
Las lmeas inmortalizadas condicionalmente de celulas madre placentarias humanas, que pueden ser, pero no es necesario que sean, clonales pueden inducirse generalmente para que se diferencien suprimiendo la produccion y/o actividad de la protema promotora del crecimiento bajo condiciones de cultivo que facilitan la diferenciacion. Por ejemplo, si el gen que codifica la protema promotora del crecimiento esta bajo el control de un promotor que se puede regular externamente, las condiciones, p. ej., temperatura o composicion del medio, pueden modificarse para suprimir la transcripcion del gen promotor del crecimiento. Para el sistema de expresion genica controlado por la tetraciclina discutido anteriormente, la diferenciacion puede conseguirse por la adicion de tetraciclina para suprimir la transcripcion del gen promotor del crecimiento. En general, es suficiente 1 pg/mL de tetraciclina durante 4-5 dfas para iniciar la diferenciacion. Para promover una diferenciacion adicional, pueden incluirse agentes adicionales en el medio de crecimiento.
4.8.4 Ensayos
Las celulas madre placentarias para uso en la invencion pueden usarse en ensayos para determinar la influencia de las condiciones del cultivo, factores ambientales, moleculas (p. ej., biomoleculas, moleculas inorganicas pequenas, etc.) y semejantes sobre la proliferacion, expansion, y/o diferenciacion de las celulas madre, comparado con celulas madre placentarias no expuestas a dichas condiciones.
En una realizacion preferida, las celulas madre placentarias para uso en la invencion se ensayan para detectar cambios en la proliferacion, expansion o diferenciacion despues del contacto con una molecula. Por ejemplo, la diferenciacion osteogenica puede ensayarse monitorizando la actividad fosfatasa alcalina y/o la mineralizacion del calcio.
En un ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para identificar un compuesto que modula la proliferacion de una pluralidad de celulas madre placentarias, que comprende poner en contacto dicha pluralidad de celulas madre con dicho compuesto bajo condiciones que permitan la proliferacion, en donde si dicho compuesto causa un cambio detectable en la proliferacion de dicha pluralidad de celulas madre comparado con una pluralidad de celulas madre que no se han puesto en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la proliferacion de las celulas madre placentarias. En un ejemplo espedfico, dicho compuesto se identifica como un inhibidorde la proliferacion. En otro ejemplo, dicho compuesto se identifica como un potenciador de la proliferacion.
En la presente memoria se describe ademas un metodo para identificar un compuesto que modula la expansion de una pluralidad de celulas madre placentarias, que comprende poner en contacto dicha pluralidad de celulas madre con dicho compuesto bajo condiciones que permitan la expansion, en donde si dicho compuesto causa un cambio detectable en la expansion de dicha pluralidad de celulas madre comparado con una pluralidad de celulas madre que no se han puesto en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la expansion de las celulas madre placentarias. En un ejemplo espedfico, dicho compuesto se identifica como un inhibidor de la expansion. En otro ejemplo, dicho compuesto se identifica como un potenciador de la expansion.
En la presente memoria se describe un metodo para identificar un compuesto que modula la diferenciacion de una celula madre placentaria, que comprende poner en contacto dichas celulas madre con dicho compuesto bajo condiciones que permitan diferenciacion, en donde si dicho compuesto causa un cambio detectable en la diferenciacion de dichas celulas madre comparado con una celula madre que no se ha puesto en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la proliferacion de las celulas madre placentarias. En un ejemplo espedfico, dicho compuesto se identifica como un inhibidor de la diferenciacion. En otro ejemplo, dicho compuesto se identifica como un potenciador de la diferenciacion.
5. Ejemplos
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren las presentes realizaciones y no deben considerarse como limitantes de ninguna forma.
5.1 Ejemplo 1: cultivo de las celulas madre placentarias
Las celulas madre placentarias se obtienen a partir de una placenta de mairnfero despues del parto bien por perfusion o por disrupcion ffsica, p. ej., digestion enzimatica. Las celulas se cultivan en un medio de cultivo que comprende 60 % de DMEM-LG (Gibco), 40 % de MCDB-201 (Sigma), 2 % de suero fetal de ternera (FCS) (Hyclone Laboratories), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 1x acido lenolenico-albumina de suero bovino (LA-BSA), dexametasona 10-9 M (Sigma), acido ascorbico 2-fosfato 10'4 M (Sigma), 10ng/ml de factor de crecimiento epidermico (EGF) (R&D Systems), 10ng/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) (R&D Systems), y 100U de penicilina/1000U de estreptomicina.
El matraz de cultivo en el que se cultivan las celulas se prepara como sigue. Se recubren matraces T75 con fibronectina (FN), mediante la adicion de 5 ml de PBS que contiene 5ng/ml de FN humana (Sigma F0895) al matraz. Los matraces con disolucion de FN se dejan a 37 °C durante 30 min. La disolucion de FN se retira entones antes del cultivo celular. No es necesario secar los matraces despues del tratamiento. Alternativamente, los matraces se dejan en contacto con la disolucion de FN a 4 °C toda la noche o mas; antes del cultivo, los matraces se calientan y se retira la disolucion de FN.
Celulas madre placentarias aisladas por perfusion
Los cultivos de las celulas madre placentarias de perfusado placentario se establecen como sigue. Las celulas de un gradiente de Ficoll se siembran en matraces T75 recubiertos con FN, preparados como anteriormente, a 50- 100x 106 celulas/matraz en 15 ml de medio de cultivo. Tfpicamente, se siembran 5 a 10 matraces. Los matraces se incuban a 37 °C durante 12-18 hr para permitir la adherencia de las celulas adherentes. Se anaden 10 ml de PBS caliente a cada matraz para retirar las celulas en suspension, y se mezcla suavemente. Se retiran entonces 15 mL del medio y se reemplazan con 15 ml de medio de cultivo fresco. Todos el medio se cambia 3-4 dfas despues del inicio del cultivo. Se realizan cambios posteriores del medio de cultivo, durante los cuales el 50 % o 7.5 ml del medio se retira.
Empezando aproximadamente en el dfa 12, el cultivo se chequea en el microscopio para examinar el crecimiento de las colonias de celulas adherentes. Cuando los cultivos celulares tienen una confluencia de aproximadamente el 80 %, tipicamente entre el dfa 13 al dfa 18 despues del inicio del cultivo, se recogen las celulas adherentes por digestion con tripsina. Las celulas recogidas de estos cultivos primarios se designan subcultivo 0 (cero).
Celulas madre placentarias aisladas por disrupcion ffsica y digestion enzimatica
Los cultivos de celulas madre placentarias se establecen a partir de tejido placentario digerido como sigue. La placenta perfundida se pone en una hoja de papel esteril con el lado materno hacia arriba. Aproximadamente 0.5 cm de la capa de la superficie en el lado materno de la placenta se raspa con una cuchilla, y la cuchilla se usa para retirar un bloque de tejido placentario que mide aproximadamente 1 x 2 x 1 cm. Este tejido placentario se trocea entonces en trozos de aproximadamente 1 mm3. Estos trozos se recogen en un tubo Falcon de 50ml y se digieren con colagenasa IA (2mg/ml, Sigma) durante 30 minutos, seguido de tripsina-EDTA (0.25 %, GIBCO BRL) durante 10 minutos, a 37 °C en un bano de agua. La disolucion resultante se centrifuga a 400g durante 10 minutos a temperatura ambiente, y la disolucion de digestion se retira. El sedimento se resuspende a aproximadamente 10 volumenes con PBS (por ejemplo, un sedimento de 5 ml se resuspende con 45 ml de PBS), y los tubos se centrifugan a 400g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento de tejido/celulas se resuspende en 130 mL de medio de cultivo, y las celulas se siembran a 13ml por matraz T-75 recubierto con fibronectina. Las celulas se incuban a 37 °C con una atmosfera humidificada con 5 % de CO2. Las celulas madre placentarias se criopreservan opcionalmente en este estadio.
Subcultivo y expansion de las celulas madre placentarias
Las celulas criopreservadas se descongelan rapidamente en un bano de agua a 37 °C. Las celulas madre placentarias se retiran inmediatamente del criovial con 10ml de medio caliente y se transfieren a un tubo esteril de 15ml. Las celulas se centrifugan a 400g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las celulas se resuspenden suavemente en 10ml de medio de cultivo caliente pipeteando, y los recuentos de celulas viables se determinan por exclusion de azul de Tripan. Las celulas se siembran entonces a aproximadamente 6000-7000 celulas por cm2 en matraces recubiertos con FN, preparados como anteriormente (aproximadamente 5x105 celulas por matraz T-75). Las celulas se incuban a 37 °C, 5 % de CO2 y 90 % de humedad. Cuando las celulas alcanzaron el 75-85 % de confluencia, todo el medio gastado se retira asepticamente de los matraces y se desecha. Se anaden 3ml de disolucion de 0.25 % de tripsina/EDTA (p/v) para cubrir la capa celular, y las celulas se incuban a 37 °C, 5 % de CO2 y 90 % de humedad durante 5 minutos. El matraz se golpea suavemente una vez o dos veces para acelerar el despegue de las celulas. Una vez el >95 % de las celulas son redondas y estan despegadas, se anaden 7ml de medio de cultivo templado a cada matraz T-75, y la disolucion se dispersa pipeteando sobre la superficie de la capa celular varias veces.
Despues de contar las celulas y determinar su viabilidad como anteriormente, las celulas se centrifugan a 1000 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las celulas se subcultivan mediante la resuspension suave del sedimento celular de un matraz T-75 con medio de cultivo, y sembrando las celulas uniformemente en dos matraces T-75 recubiertos con FN.
Usando los metodos anteriores, se identifican poblaciones de celulas madre placentarias adherentes que expresan los marcadores CD105, CD117, CD33, CD73, CD29, CD44, CD10, CD90 y CD133. Esta poblacion de las celulas no expresaba CD34 o CD45. Algunos, pero no todos los cultivos de estas celulas madre placentarias, expresaban HLA-ABC y/o HLA-DR.
5.2 Ejemplo 2: aislamiento de las celulas madre placentarias de estructuras placentarias
5.2.1 Materiales y metodos
5.2.1.1 Aislamiento del fenotipo de interes
Se obtuvieron cinco poblaciones distintas de celulas placentarias a partir de las placentas de embarazos normales, a termino. Todos los donantes proporcionaron un consentimiento escrito completo para el uso de sus placentas para propositos de investigacion. Se examinaron cinco poblaciones de celulas placentarias: (1) perfusado placentario (de la perfusion de la vasculatura placentaria); y digestiones enzimaticas de (2) amnios, (3) corion, (4) placa amnios-corion, y (5) cordon umbilical. Los distintos tejidos placentarios se limpiaron en PBS esteril (Gibco-Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y se pusieron en placas Petri esteriles separadas. Los distintos tejidos se trocearon usando un escalpelo quirurgico esteril y se pusieron en tubos conicos Falcon de 50 mL. Los tejidos troceados se digirieron con 1X Colagenasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 20 minutos en un bano de agua a 37 °C, se centrifugaron, y se digirieron entonces con 0.25 % de Tripsina-EDTA (Gibco-Invitrogen Corp) durante 10 minutos en un bano de agua a 37 °C. Los distintos tejidos se centrifugaron despues de la digestion y se lavaron una vez con PBS esteril (Gibco-Invitrogen Corp). Las celulas reconstituidas se filtraron entonces dos veces, una vez con filtros celulares de 100 pm y una vez con filtros de separacion de 30 pm, para eliminar cualquier matriz extracelular residual o restos celulares.
5.2.1.2 Evaluacion de la viabilidad celular y recuentos celulares
Se empleo el metodo manual de la exclusion de azul de tripan despues de la digestion para calcular los recuentos celulares y evaluar la viabilidad celular. Las celulas se mezclaron con tincion azul de tripan (Sigma-Aldrich) a una relacion de 1:1, y las celulas se leyeron en un hemocitometro.
5.2.1.3 Caracterizacion de los marcadores de la superficie celular
Las celulas que eran HLA ABCVCD45VCD34VCD133+ se seleccionaron para su caracterizacion. Las celulas que teman este fenotipo se identificaron, cuantificaron, y caracterizaron por dos citometros de flujo Becton-Dickinson, el FACSCalibur y el FACS Aria (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). Las distintas celulas placentarias se tineron, a una relacion de aproximadamente 10 pL de anticuerpo por 1 millon de celulas, durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Se usaron los siguientes anticuerpos anti-humano: anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluorescema (FITC) frente a HLA-G (Serotec, Raleigh, NC), CD10 (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA), CD44 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA), y CD 105 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina (PE) frente a CD44, CD200, CD117, y CD13 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5) y Estreptavidina frente a CD117 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7) frente a CD33 y CD10 (BD Biosciences); anticuerpos monoclonales conjugados con aloficocianina (APC) y estreptavidina frente a CD38 (BD Biosciences Pharmingen); y CD90 biotinilada (BD Biosciences Pharmingen). Despues de la incubacion, las celulas se lavaron una vez para eliminar los anticuerpos no unidos y se fijaron toda la noche con 4 % de paraformaldehndo (USB, Cleveland, OH) a 4 °C. Al dfa siguiente, las celulas se lavaron dos veces, se filtraron a traves de un filtro de separacion de 30 pm, y se operaron en el o los citometros de flujo.
Las muestras que se tineron con anticuerpos anti-IgG de raton (BD Biosciences Pharmingen) se usaron como controles negativos y se usaron para ajustar los tubos del fotomultiplicador (PMT). Las muestras que se tineron solo con anticuerpos anti-humano se usaron como controles positivos y se usaron para ajustar las superposiciones/compensaciones espectrales.
5.2.1.4 Separacion y cultivo de las celulas
Un conjunto de las celulas placentarias (de perfusado, amnios, o corion) se tino con 7-Amino-Actinomicina D (7AAD; BD Biosciences Pharmingen) y anticuerpos monoclonales espedficos para el fenotipo de interes. Las celulas se tineron a una relacion de 10 pL de anticuerpo por 1 millon de celulas, y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Estas celulas se separaron entonces positivamente para celulas vivas que expresan el fenotipo de interes en el BD FACS Aria y se sembraron en placas en cultivo. Las poblaciones de celulas placentarias separadas (poblacion de interes) y "Toda" (no separadas) se sembraron en placas para comparaciones. Las celulas se sembraron en una placa de 96 pocillos recubierta con fibronectina (Sigma-Aldrich) a las densidades celulares listadas en la Tabla 1 (celulas/cm2). La densidad celular, y si el tipo celular se sembro en placas en duplicado o triplicado, estuvo determinado y gobernado por el numero de las celulas que expresan el fenotipo de interes.
Tabla 1: Densidades de siembra en placas de las celulas
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Se anadio medio completo (60 % de DMEM-LG (Gibco) y 40 % de MCDB-201 (Sigma); 2 % de suero fetal de ternera (Hyclone Labs.); 1x insulina-transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10'9 M (Sigma); acido ascorbico 2-fosfato 10'4 M (Sigma); 10 ng/mL de factor de crecimiento epidermico (R&D Systems); y 10 ng/mL de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) (R&D Systems)) a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y la placa se puso en un incubador con 5 % de CO2 /37 °C. En el dfa 7, se anadieron 100 pL de medio completo a cada uno de los pocillos. La placa de 96 pocillos se monitorizo durante aproximadamente dos semanas y una evaluacion final del cultivo se completo en el dfa 12.
5.2.1.5 Analisis de los datos
Los datos del FACSCalibur se analizaron en FlowJo (Tree star, Inc) usando tecnicas estandar de seleccion de poblaciones. Los datos del BD FACS Aria se analizaron usando el software FACSDiva (Becton-Dickinson). Los datos del FACS Aria se analizaron usando una seleccion de poblaciones de discriminacion en doblete para minimizar los dobletes, asf como tecnicas estandar de seleccion de poblaciones. Todos los resultados se compilaron en Microsoft Excel y todos los valores, en la presente memoria, se representan como promedio ± desviacion estandar (numero, error estandar de la media).
5.2.2 Resultados
5.2.2.1 Viabilidad celular
La viabilidad despues de la digestion se evaluo usando el metodo manual de exclusion de azul de tripan (FIG 1). La viabilidad promedio de las celulas obtenida de la mayona del tejido digerido (de amnios, corion o placa amnios-corion) fue alrededor del 70 %. El amnios tuvo una viabilidad promedio del 74.35 % ±10.31 % (n=6, SEM=4.21), el corion tuvo una viabilidad promedio del 78.18 % ± 12.65 % (n=4, SEM=6.32), la placa amnios-corion tuvo una viabilidad promedio del 69.05 % ±10.80 % (n=4, SEM=5.40), y el cordon umbilical tuvo una viabilidad promedio del 63.30 % ±20.13 % (n=4, SEM=10.06). Las celulas de la perfusion, que fueron sometidas a digestion, retuvieron la mayor viabilidad promedio, 89.98±6.39 % (n=5, SEM=2.86).
5.2.2.2 Cuantificacion celular
Las cinco poblaciones distintas de celulas derivadas de placenta se analizaron para determinar los numeros de celulas HLA ABCVCD45VCD34YCD133+. A partir del analisis de los datos del BD FACSCalibur, se observo que el amnios, perfusado, y corion conteman el mayor numero total de estas celulas, 30.72 ± 21.80 celulas (n=4, SEM= 10.90), 26.92 ± 22.56 celulas (n=3, SEM=13.02), y 18.39 ± 6.44 celulas (n=2, SEM=4.55), respectivamente (datos no mostrados). La placa amnios-corion y el cordon umbilical conteman el menor numero total de las celulas que expresan el fenotipo de interes, 4.72 ± 4.16 celulas (n=3, SEM=2.40) y 3.94 ± 2.58 celulas (n=3, SEM=1.49), respectivamente (datos no mostrados).
De forma similar, cuando se analizo el porcentaje de celulas totales que expresan el fenotipo de interes, se observo que el amnios y el perfusado placentario conteman los porcentajes mas altos de las celulas que expresan este fenotipo (0.0319 % ± 0.0202 % (n=4, SEM=0.0101) y 0.0269 % ± 0.0226 % (n=3, SEM=0.0130), respectivamente (FIG. 2). Aunque el cordon umbilical contema un pequeno numero de las celulas que expresan el fenotipo de interes (FIG. 2), contema el tercer porcentaje mas alto de las celulas que expresan el fenotipo de interes, 0.020±0.0226 % (n=3, SEM=0.0131) (FIG. 2). El corion y la placa amnios-corion conteman los porcentajes mas bajos de las celulas que expresan el fenotipo de interes, 0.0184±0.0064 % (n=2, SEM=0.0046) y 0.0177±0.0173 % (n=3, SEM=0.010), respectivamente (FIG. 2).
Consistente con los resultados del analisis del BD FACSCalibur, los datos del BD FACS Aria tambien identificaron el amnios, perfusado, y corion como los que proporcionan mayores numeros de celulas HLA ABCVCD45VCD34VCD133+ que las fuentes restantes. El promedio del numero total de las celulas que expresan el fenotipo de interes entre el amnios, perfusado, y corion fue 126.47 ± 55.61 celulas (n=15, SEM=14.36), 81.65 ± 34.64 celulas (n=20, SEM=7.75), y 51.47 ± 32.41 celulas (n=15, SEM=8.37), respectivamente (datos no mostrados). La placa amnios-corion y el cordon umbilical conteman el menor numero total de las celulas que expresan el fenotipo de interes, 44.89 ± 37.43 celulas (n=9, SEM=12.48)y 11.00 ± 4.03 celulas (n=9, SEM=1.34), respectivamente (datos no mostrados).
Los datos del BD FACS Aria revelaron que las fuentes de celulas By A conteman los porcentajes mas altos de celulas HLA ABCVCD45VCD34VCD133+, 0.1523 ± 0.0227 % (n=15, SEM=0.0059) y 0.0929 ± 0.0419 % (n=20, SEM=0.0094), respectivamente (FIG. 3). La fuente de celulas D contema el tercer porcentaje mas alto de las celulas que expresan el fenotipo de interes, 0.0632±0.0333 % (n=9, SEM=0.0111) (FIG. 3). Las fuentes de celulas C y E conteman los porcentajes mas bajos de las celulas que expresan el fenotipo de interes, 0.0623±0.0249 % (n=15, SEM=0.0064) y 0.0457±0.0055 % (n=9, SEM=0.0018), respectivamente (FIG. 3).
Despues de que las celulas HLA ABCVCD45YCD34VCD133+ se identificaron y cuantificaron de cada fuente de celulas, sus celulas se analizaron y caracterizaron adicionalmente para determinar su expresion de marcadores de la superficie celular HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200, y CD105.
5.2.2.3 Celulas derivadas de perfusado placentario
Las celulas derivadas de perfusado fueron positivas de manera consistente para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105, y CD13 (FIG. 4). La expresion promedio de cada marcador para celulas derivadas de perfusado fue la siguiente: 37.15 % ± 38.55 % (n=4, SEM=19.28) de las celulas expresaban HLA-G; 36.37 % ± 21.98 % (n=7, SEM=8.31) de las celulas expresaban CD33; 39.39 % ± 39.91 % (n=4, SEM=19.96) de las celulas expresaban CD117; 54.97 % ± 33.08 % (n=4, SEM=16.54) de las celulas expresaban CD10; 36.79 % ± 11.42 % (n=4, SEM=5.71) de las celulas expresaban CD44; 41.83 % ± 19.42 % (n=3, SEM=11.21) de las celulas expresaban CD200; 74.25 % ± 26.74 % (n=3, SEM=15.44) de las celulas expresaban CD90; 35.10 % ± 23.10 % (n=3, SEM=13.34) de las celulas expresaban CD38; 22.87 % ± 6.87 % (n=3, SEM=3.97) de las celulas expresaban CD105; y 25.49 % ± 9.84 % (n=3, SEM=5.68) de las celulas expresaban CD13.
5.2.2.4 Celulas derivadas de amnios
Las celulas derivadas de amnios fueron positivas de manera consistente para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105, y CD13 (FIG 5). La expresion promedio de cada marcador para las celulas derivadas de amnios fue la siguiente: 57.27 % ± 41.11 % (n=3, SEM=23.73) de las celulas expresaban HLA-G; 16.23 % ± 15.81 % (n=6, SEM=6.46) de las celulas expresaban CD33; 62.32 % ± 37.89 % (n=3, SEM=21.87) de las celulas expresaban CD117; 9.71 % ± 13.73 % (n=3, SEM=7.92) de las celulas expresaban CD10; 27.03 % ± 22.65 % (n=3, SEM=13.08) de las celulas expresaban CD44; 6.42 % ± 0.88 % (n=2, SEM=0.62) de las celulas expresaban CD200; 57.61 % ±22.10 % (n=2, SEM=15.63) de las celulas expresaban CD90; 63.76 % ± 4.40 % (n=2, SEM=3.11) de las celulas expresaban CD38; 20.27 % ± 5.88 % (n=2, SEM=4.16) de las celulas expresaban CD105; y 54.37 % ± 13.29 % (n=2, SEM=9.40) de las celulas expresaban CD13.
5.2.2.5 Celulas derivadas de corion
Las celulas derivadas de corion fueron positivas de manera consistente para HLA-G, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, y CD13, mientras la expresion de CD33, y CD105 vario (FIG. 6). La expresion promedio de cada marcador para celulas del corion fue la siguiente: 53.25 % ± 32.87 % (n=3, SEM=18.98) de las celulas expresaban HLA-G; 15.44 % ± 11.17 % (n=6, SEM=4.56) de las celulas expresaban CD33; 70.76 % ± 11.87 % (n=3, SEM=6.86) de las celulas expresaban CD117; 35.84 % ± 25.96 % (n=3, SEM=14.99) de las celulas expresaban CD10; 28.76 % ± 6.09 % (n=3, SEM=3.52) de las celulas expresaban CD44; 29.20 % ± 9.47 % (n=2, SEM=6.70) de las celulas expresaban CD200; 54.88 % ± 0.17 % (n=2, SEM=0.12) de las celulas expresaban CD90; 68.63 % ± 44.37 % (n=2, SEM=31.37) de las celulas expresaban CD38; 23.81 % ± 33.67 % (n=2, SEM=23.81) de las celulas expresaban CD105; y 53.16 % ± 62.70 % (n=2, SEM=44.34) de las celulas expresaban CD13.
5.2.2.6 Celulas placentarias de la fuente D
Las celulas de la placa amnios-corion fueron positivas de manera consistente para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105, y CD13 (FIG. 7). La expresion promedio de cada marcador para las celulas derivadas de la placa amnios-corion fue la siguiente: 78.52 % ±13.13 % (n=2, SEM=9.29) de las celulas expresaban HLA-G; 38.33 % ± 15.74 % (n=5, SEM=7.04) de las celulas expresaban CD33; 69.56 % ± 26.41 % (n=2, SEM=18.67) de las celulas expresaban CD117; 42.44 % ± 53.12 % (n=2, SEM=37.56) de las celulas expresaban CD10; 32.47 % ± 31.78 % (n=2, SEM=22.47) de las celulas expresaban CD44; 5.56 % (n=1) de las celulas expresaban CD200; 83.33 % (n=1) de las celulas expresaban CD90; 83.52 % (n=1) de las celulas expresaban CD38; 7.25 % (n=1) de las celulas expresaban CD105; y 81.16 % (n=1) de las celulas expresaban CD13.
5.2.2.7 Celulas derivadas del cordon umbilical
Las derivadas del cordon umbilical fueron positivas de manera consistente para HLA-G, CD33, CD90, CD38, CD105, y CD13, mientras la expresion de CD117, CD10, CD44, y CD200 vario (FIG. 8). La expresion promedio de cada marcador para las celulas derivadas del cordon umbilical fue la siguiente: 62.50 % ± 53.03 % (n=2, SEM=37.50) de las celulas expresaban HLA-G; 25.67 % ± 11.28 % (n=5, SEM=5.04) de las celulas expresaban CD33; 44.45 % ± 62.85 % (n=2, SEM=44.45) de las celulas expresaban CD117; 8.33 % ± 11.79 % (n=2, SEM=8.33) de las celulas expresaban CD10; 21.43 % ± 30.30 % (n=2, SEM=21.43) de las celulas expresaban CD44; 0.0 % (n=1) de las celulas expresaban CD200; 81.25 % (n=1) de las celulas expresaban CD90; 64.29 % (n=1) de las celulas expresaban CD38; 6.25 % (n=1) de las celulas expresaban CD105; y 50.0 % (n=1) de las celulas expresaban CD13.
Un resumen de los promedios de la expresion de todos los marcadores se muestra en la FIG. 9.
5.2.2.8 Informe de la separacion de BD FACS Aria
Las tres poblaciones distintas de las celulas placentarias que expresaban los porcentajes mas altos de HLA ABC, CD45, CD34, y CD133 (celulas derivadas de perfusado, amnios y corion) se tineron con 7AAD y los anticuerpos para estos marcadores. Las tres poblaciones se separaron positivamente para celulas vivas que expresan el fenotipo de interes. Los resultados de la separacion del BD FACS Aria se listan en la tabla 2.
Tabla 2:
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Las tres poblaciones distintas de celulas separadas positivamente ("separadas") y sus celulas no separadas correspondientes se sembraron en placas y los resultados del cultivo se evaluaron en el dfa 12 (Tabla 3). Las celulas derivadas de perfusado separadas, sembradas en placas a una densidad celular de 40600/cm2, produjeron celulas pequenas, redondas, no adherentes. Dos de los tres conjuntos de celulas derivadas de perfusado no separadas, cada uno sembrado en placas a una densidad celular de 40600/cm2, produjeron en su mayona celulas pequenas, redondas, no adherentes con varias celulas adherentes localizadas alrededor de la periferia del pocillo. Las celulas derivadas de perfusado no separadas, sembradas en placas a una densidad celular de 93 800/cm2, produjeron en su mayona celulas pequenas, redondas, no adherentes con varias celulas adherentes localizadas alrededor de la periferia del pocillo.
Las celulas derivadas de amnios separadas, sembradas en placas a una densidad celular de 6300/cm2, produjeron celulas pequenas, redondas, no adherentes. Las celulas derivadas de amnios no separadas, sembradas en placas a una densidad celular de 6300/cm2, produjeron celulas pequenas, redondas, no adherentes. Las celulas derivadas de amnios no separadas, sembradas en placas a una densidad celular de 62 500/cm2, produjeron celulas pequenas, redondas, no adherentes.
Las celulas derivadas de corion separadas, sembradas en placas a una densidad celular de 6300/cm2, produjeron celulas pequenas, redondas, no adherentes. Las celulas derivadas de corion no separadas, sembradas en placas a una densidad celular de 6300/cm2, produjeron celulas pequenas, redondas, no adherentes. Las celulas derivadas de corion no separadas, sembradas en placas a una densidad celular de 62 500/cm2, produjeron celulas pequenas, redondas, no adherentes.
Las poblaciones de celulas madre placentarias descritas anteriormente, despues de cultivo en plastico de cultivo tisular, se adhirieron a la superficie y asumieron una forma fibroblastoide caractenstica.
5.3 Ejemplo 3: recogida de las celulas madre placentarias por perfusion en circuito cerrado
Este Ejemplo demuestra un metodo para recoger celulas madre placentarias por perfusion.
Se obtiene una placenta despues del parto en las 24 horas despues del nacimiento. El cordon umbilical se pinza con una pinza de cordon umbilical aproximadamente 0.08 a 0.10 centfmetros (3 a 4 pulgadas) alrededor del disco placentario, y el cordon se corta por encima de la pinza. El cordon umbilical bien se desecha, o se procesa para recuperar, p. ej., celulas madre del cordon umbilical, y/o para procesar la membrana del cordon para la produccion de un biomaterial. La membrana amniotica y corion en exceso se corta de la placenta, dejando aproximadamente 0.64 centimetros (0.25 pulgadas) alrededor del borde de la placenta. El material recortado se desecha.
Empezando a partir del borde de la membrana placentaria, la membrana amniotica se separa del corion usando diseccion roma con los dedos. Cuando la membrana amniotica esta completamente separada del corion, la membrana amniotica se corta alrededor de la base del cordon umbilical con tijeras, y se despega del disco placentario. La membrana amniotica puede desecharse, o puede procesarse, p. ej., para obtener celulas madre por digestion enzimatica, o para producir, p. ej., un biomaterial de membrana amniotica.
El lado fetal del material placentario remanente se limpia de todos los coagulos sangumeos visibles y sangre residual usando una gasa esteril, y despues se esteriliza frotando con una torunda de yodo mejor que una torunda de alcohol. El cordon umbilical se pinza entonces transversalmente con un hemostato esteril por debajo de la pinza del cordon umbilical, y el hemostato se rota, tirando del cordon sobre la pinza para crear un plegamiento. El cordon se corta parcialmente entonces por debajo del hemostato para exponer una seccion transversal del cordon soportado por la pinza. Alternativamente, el cordon se pinza con un hemostato esteril. El cordon se pone entonces en una gasa esteril y se mantiene con el hemostato para proporcionar tension. El cordon se corta entonces al otro lado directamente por debajo del hemostato, y el borde del cordon cerca del vaso se vuelve a pinzar.
Los vasos expuestos como se ha descrito anteriormente, habitualmente una vena y dos arterias, se identifican, y se abren como sigue. Se hace avanzar una pina de cocodrilo cerrada a traves del extremo de corte de cada vaso, teniendo cuidado para que la pinza no perfore a traves de la pared del vaso. La insercion se para cuando la punta de la pinza esta ligeramente por encima de la base del cordon umbilical. La pinza se abre entonces ligeramente, y se retira lentamente del vaso para dilatar el vaso.
El tubo de plastico, conectado a un dispositivo de perfusion o a una bomba peristaltica, se inserta en cada una de las arterias placentarias. El tubo de plastico, conectado a una bolsa se recogida de 250 mL, se inserta en la vena placentaria. El tubo se asegura en su lugar.
Un pequeno volumen de disolucion esteril de grado de inyeccion de NaCl al 0.9 % para comprobar las fugas. Si no esta presente ninguna fuga, la velocidad de la bomba se incrementa, y aproximadamente 750 mL de la disolucion de grado de inyeccion de NaCl al 0.9 % se bombea a traves de la vasculatura placentaria. La perfusion puede ayudarse masajeando suavemente el disco placentario desde los bordes exteriores al cordon. Cuando la bolsa de recogida esta llena, la bolsa se retira del acoplador que conecta el tubo a la bolsa, y se conecta una nueva bolsa al tubo.
Cuando la recogida ha terminado, las bolsas de recogida se pesan y se equilibran para centrifugacion. Despues de la centrifugacion, cada bolsa se pone en el interior de un extractor de plasma sin alterar el sedimento de las celulas. El sobrenadante en las bolsas se retira entonces y se desecha. La bolsa se masajea entonces suavemente para resuspender las celulas en el sobrenadante remanente. Usando una jeringa esteril de 1 mL, se toman aproximadamente 300-500 pL de las celulas de la bolsa de recogida, mediante un acoplador en el sitio de muestreo, y se transfieren a un tubo de centnfuga de 1.5 mL. Se determina el peso y volumen del perfusado remanente, y se anade 1/3 de volumen de hetastarch al perfusado y se mezcla concienzudamente. Se determina el numero de celulas por mL. Las celulas sangumeas rojas se eliminan del perfusado usando un extractor de plasma.
Las celulas placentarias se cultivan inmediatamente para aislar las celulas madre placentarias, o se criopreservan para un uso posterior.
5.4 Ejemplo 4: diferenciacion de las celulas madre placentarias
5.4.1 Induccion de la diferenciacion en neuronas
La diferenciacion neuronal de las celulas madre placentarias tambien puede conseguirse como sigue:
1. Las celulas madre placentarias se crecen durante 24 hr en medio de preinduccion que consiste en DMEM/20 % de FBS y beta-mercaptoetanol 1 mM.
2. El medio de preinduccion se retira y las celulas se lavan con PBS.
3. Se anade a las celulas medio de induccion neuronal que consiste en DMEM y betamercaptoetanol 1-10 mM. Alternativamente, puede usarse medio de induccion que consiste en DMEM/2 % de DMSO/hidroxianisol butilado 200 pM.4
4. En determinadas realizaciones, pueden ocurrir cambios morfologicos y moleculares tan pronto como 60 minutos despues de la exposicion a medio sin suero y betamercaptoetanol. Puede usarse RT/PCR para evaluar la expresion de, p. ej., los genes del receptor del factor de crecimiento nervioso y cadena pesada de neurofilamentos.
5.4.2 Induccion de la diferenciacion en adipocitos
Se indujeron varios cultivos de las celulas madre placentarias derivadas de digestion enzimatica del amnios, a 50­ 70 % de confluencia, en medio que comprendfa (1) DMEM/MCDB-201 con 2 % de FCS, 0.5 % de hidrocortisona, isobutilmetilxantina 0.5 mM, indometacina 60 pM; o (2) DMEM/MCDB-201 con 2 % de FCS y 0.5 % de acido linoleico. Las celulas se examinaron para detectar cambios morfologicos; despues de 3-7 dfas, aparecieron gotitas de aceite.
La diferenciacion tambien se evaluo por PCR cuantitativa en tiempo real para examinar la expresion de genes espedficos asociados con la adipogenesis, es decir, PPAR-y2, aP-2, lipoprotema lipasa, y osteopontina. Dos cultivos de las celulas madre placentarias mostraron un incremento de 6.5 veces y 24.3 veces en la expresion de genes espedficos de adipocitos, respectivamente. Otros cuatro cultivos mostraron un incremento moderado (1.5- 2.0 veces) en la expresion de PPAR-y2 despues de la induccion de la adipogenesis.
En otro experimento, las celulas madre placentarias obtenidas de perfusado se cultivaron en DMEM/MCDB-201 (medio basal de fibroblastos de pollo) con 2 % de FCS. Las celulas se tripsinizaron y se centrifugaron. Las celulas se resuspendieron en medio de adipo-induccion (AIM) 1 o 2. El AIM1 comprendfa Medio Basal MesenCult para celulas madre mesenquimales humanas (StemCell Technologies) suplementado con Suplementos Adipogenicos de Celulas Madre Mesenquimales (StemCell Technologies). El AIM2 comprendfa DMEM/MCDB-201 con 2 % de FCS y LA-BSA (1 %). Se crecieron aproximadamente, 1.25 x 1045 celulas madre placentarias en 5 mL de AIM1 o AIM2 en matraces T-25. Las celulas se cultivaron en incubadores durante 7-21 dfas. Las celulas desarrollaron vacuolas con gotitas de aceite en el citoplasma, como se confirmo por tincion con rojo aceite, lo que sugiere la diferenciacion de las celulas madre en adipocitos.
La diferenciacion adipogenica de las celulas madre placentarias tambien puede conseguirse como sigue:
1. Las celulas madre placentarias se crecen en MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con 15 % de suero de sangre del cordon.
2. Se usan tres ciclos de induccion/mantenimiento. Cada ciclo consiste en alimentar las celulas madre placentarias con Medio de Induccion de la Adipogenesis (Cambrex) y cultivar las celulas durante 3 dfas (a 37°C, 5 % de CO2), seguido de 1 -3 dfas de cultivo en Medio de Mantenimiento de la Adipogenesis (Cambrex). Un medio de induccion alternativo que puede usarse contiene dexametasona 1 j M, indometacina 0.2 mM, 0.01 mg/ml de insulina, IBMX 0. 5.mM, DMEM con alto contenido en glucosa, FBS, y antibioticos.
3. Despues de 3 ciclos completos de induccion/mantenimiento, las celulas se cultivan durante 7 dfas adicionales en medio de mantenimiento de la adipogenesis, reemplazando el medio cada 2-3 dfas.
4. Una caractenstica distintiva de la adipogenesis es el desarrollo de multiples vesfculas lipfdicas intracitoplasmicas que pueden observarse facilmente usando la tincion lipofflica rojo aceite O. La expresion de los genes de la lipasa y/o protema de union a acidos grasos se confirma por RT/PCR en las celulas madre placentarias que han empezado a diferenciarse en adipocitos.
5.4.3 Induccion de la diferenciacion en celulas osteogenicas
Se preparo medio osteogenico a partir de 185 mL de Medio Basal de Diferenciacion Cambrex-Osteogenico y SingleQuots (uno de cada de dexametasona, L-glutamina, ascorbato, pen/estrep, MCGS, y p-glicerofosfato). Las celulas madre placentarias de perfusado se sembraron en placas, a aproximadamente 3 x 103 celulas por cm2 de area superficial de cultivo tisular en 0.2-0.3 mL de MSCGM por cm2 de area de cultivo tisular. Tfpicamente, todas las celulas se adhirieron a la superficie del cultivo durante 4-24 horas en MSCGM a 37 °C en 5 % de CO2. La diferenciacion osteogenica se indujo reemplazando el medio con medio de Diferenciacion Osteogenica. La morfologfa de las celulas empezo a cambiar de la apariencia tfpica con forma de huso de las celulas madre placentarias adherentes, a una apariencia cuboidal, acompanado por mineralizacion. Algunas celulas se delaminaron de la superficie del cultivo tisular durante la diferenciacion.
La diferenciacion osteogenica tambien puede conseguirse como sigue:
1. Se cultivan cultivos adherentes de las celulas madre placentarias en MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con 15 % de suero de sangre del cordon.
2. Los cultivos se cultivan durante 24 horas en matraces de cultivo tisular.
3. Se induce la diferenciacion osteogenica reemplazando MSCGM con Medio de Induccion Osteogenica (Cambrex) que contiene dexametasona 0.1 j M, acido ascorbico-2-fosfato 0.05 mM, beta glicerofosfato 10 mM.
4. Las celulas se alimentan cada 3-4 dfas durante 2-3 semanas con Medio de Induccion Osteogenica.
5. La diferenciacion se ensaya usando una tincion espedfica de calcio y RT/PCR para la expresion genica de la fosfatasa alcalina y osteopontina.
5.4.4 Induccion de la diferenciacion en celulas pancreaticas
La diferenciacion pancreatica se consigue como sigue:
1. Las celulas madre placentarias se cultivan en DMEM/20 % de CBS, suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos basico, 10 ng/ml; y factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/ml. Puede usarse Reemplazo de Suero KnockOut en lugar de CBS.
2. Se anade medio condicionado de cultivos de celulas neuronales positivas para nestina al medio a una concentracion 50/50.
3. Las celulas se cultivan durante 14-28 dfas, realimentando cada 3-4 dfas.
4. La diferenciacion se caracteriza mediante el ensayo de la protema insulina o la expresion genica de la insulina RT/PCR.
5.4.5 Induccion de la diferenciacion en celulas cardiacas
La diferenciacion miogenica (cardiogenica) se consigue como sigue:
1. Las celulas madre placentarias se cultivan en DMEM/20 % de CBS, suplementado con acido retinoico, 1 pM; factor de crecimiento de fibroblastos basico, 10 ng/ml; y factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/ml; y factor de crecimiento epidermico, 100 ng/ml. Puede usarse Reemplazo de Suero KnockOut (Invitrogen, Carlsbad, California) en lugar de CBS.
2. Alternativamente, las celulas madre placentarias se cultivan en DMEM/20 % de CBS suplementado con 50 ng/ml de Cardiotropina-1 durante 24 horas.
3. Alternativamente, las celulas madre placentarias se mantienen en medio sin protemas durante 5-7 dfas, despues se estimulan con extracto de miocardio humano (analisis de escalada de la dosis). El extracto de miocardio se produce homogeneizando 1 g de miocardio humano en 1 % de tampon HEPES suplementado con 1 % de suero de sangre del cordon. La suspension se incuba durante 60 minutos, despues se centrifuga y se recoge el sobrenadante.
4. Las celulas se cultivan durante 10-14 dfas, con realimentacion cada 3-4 dfas.
5. La diferenciacion se confirma por la demostracion de la expresion genica de la actina cardiaca por RT/PCR. 5.4.6 Induccion de la diferenciacion en condrocitos
5.4.6.1 Metodo general
La diferenciacion condrogenica de las celulas madre placentarias se consigue generalmente como sigue:
1. Las celulas madre placentarias se mantienen en MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con 15 % de suero de sangre del cordon.
2. Las celulas madre placentarias se dividen en partes alfcuotas en un tubo esteril de polipropileno. Las celulas se centrifugan (150 x g durante 5 minutos), y se lavan dos veces en Medio de Condrogenesis Incompleto (Cambrex).
3. Despues del ultimo lavado, las celulas se resuspenden en Medio de Condrogenesis Completo (Cambrex) que contiene 0.01 pg/ml de TGF-beta-3 a una concentracion de 5 x 10(5) celulas/ml.
4. Se dividen en partes alfcuotas 0.5 ml de las celulas en un tubo de cultivo de polipropileno de 15 ml. Las celulas se sedimentan a 150 x g durante 5 minutos. El sedimento se deja intacto en el medio.
5. Se incuban tubos con el tapon flojo a 37 °C, 5 % de CO2 durante 24 horas.
6. Los sedimentos celulares se alimentan cada 2-3 dfas con medio de condrogenesis completo recien preparado. 7. Los sedimentos se mantienen suspendidos en el medio por agitacion diaria usando un vortex a baja velocidad. 8. Los sedimentos de las celulas condrogenicas se recogen despues de 14-28 dfas en cultivo.
9. La condrogenesis se caracteriza, p. ej., por la observacion de la produccion de sustancia de fondo eosinofflico, evaluacion de la morfologfa celular, y/o confirmacion por RT/PCR de la expresion de los genes de colageno 2 y/o colageno 9 y/o la produccion de mucopolisacaridos acidos de la matriz de cartflago, como se confirma por tincion citoqmmica con azul Alcian.
5.4.6.2 Diferenciacion de las celulas madre placentarias y del cordon umbilical en celulas condrogenicas
El Ejemplo demuestra la diferenciacion de las celulas madre placentarias en celulas condrogenicas y el desarrollo de tejido semejante a cartflago a partir de dichas celulas.
El cartflago es un tejido alinfatico avascular que carece de un suministro nervioso. El cartflago tiene una baja densidad de condrocitos (<5 %), sin embargo, estas celulas son sorprendentemente eficientes en el mantenimiento de la matriz extracelular que los rodea. En el cuerpo existen tres tipos principales de carfflago: (1) cartflago articular, que facilita la lubricacion articular en las articulaciones; (2) fibrocartflago, que proporciona una absorcion del choque, p. ej., en el menisco y el disco intervertebral; y (3) cartflago elastico, que proporciona estructura anatomica, p. ej., en la nariz y las orejas. Los tres tipos de cartflago son similares respecto a la estructura bioqmmica.
El dolor articular es una causa principal de discapacidad y proporciona una necesidad no satisfecha de alivio en el area de la ortopedia. La osteoartritis primaria (que puede causar degeneracion articular), y el trauma son dos causas comunes de dolor. Aproximadamente, el 9 % de la poblacion de los EE.UU. tiene osteoartritis de cadera o rodilla, y cada ano se realizan mas de 2 millones de cirugfas de rodilla. Desafortunadamente, los tratamientos actuales estan mas dirigidos hacia el tratamiento de los smtomas en lugar de a la reparacion del cartflago. La reparacion natural se produce cuando las celulas semejantes a fibroblastos invaden el area y la rellenan con tejido fibroso que no es ni tan resiliente ni elastico como el tejido normal, causando, por lo tanto, mas dano. Las opciones de tratamiento han incluido historicamente injertos de tejido, perforacion subcondral, o reemplazo total de la articulacion. Los tratamientos mas recientes incluyen, sin embargo, CARTICEL®, una inyeccion de condrocitos autologos; SYNVISC®y ORTHOVISC®, que son inyecciones de acido hialuronico para el alivio temporal del dolor; y CHONDROGEN™, una inyeccion de celulas madre mesenquimales de adulto para la reparacion del menisco. En general, la tendencia parece estar basada mas en terapias celulares y/o productos tisulares modificados por ingeniena que implican condrocitos o celulas madre.
Materiales y metodos.
Se usaron dos lmeas de celulas madre placentarias, designadas AC61665, P3 (subcultivo 3) y AC63919, P5, y dos lmeas de celulas madre del cordon umbilical, designadas UC67249, P2 y UC67477, P3 en los estudios indicados mas adelante. Las celulas madre mesenquimales (MSC) humanas se usaron como controles positivos, y una lmea celular de osteosarcoma, MC3T3, y fibroblastos dermicos humanos (HDF) se usaron como controles negativos.
Las celulas madre placentarias y del cordon umbilical se aislaron y purificaron a partir de placenta humana a termino por digestion enzimatica. Las celulas MSC humanas y las celulas HDF se adquirieron en Cambrex, y las celulas MC3T3 se adquirieron en la American Type Culture Collection. Todas las lmeas celulares se centrifugaron en sedimentos en tubos de centnfuga de polipropileno a 800 RPM durante 5 minutos y se crecieron tanto en medio de induccion condrogenica (Cambrex) como en medio MSC basal no inductor (Cambrex). Los sedimentos se recogieron y se analizaron histologicamente a los 7, 14, 21 y 28 dfas portincion para glicosaminoglicanos (GAG) con Azul Alcian, y/o para colagenos con Rojo Sirio. El tipo de colageno se evaluo adicionalmente con inmunotincion. El analisis de ARN para los genes espedficos de cartflago se realizo a los 7 y 14 dfas.
Resultados
Experimento 1: los estudios de condrogenesis se disenaron para conseguir tres objetivos principales: (1) demostrar que las celulas madre placentarias y del cordon umbilical pueden diferenciarse y formar tejido de cartflago; (2) demostrar que las celulas madre placentarias y del cordon umbilical pueden diferenciarse funcionalmente en condrocitos; y (3) validar los resultados obtenidos con las celulas madre mediante la evaluacion de lmeas celulares control.
Para el objetivo 1, en un estudio preliminar, una lmea de celulas madre placentarias se cultivo en medio de induccion condrogenica en la forma de sedimentos celulares, bien con o sin protema morfogenica osea (BMP) a una concentracion final de 500 ng/mL. Los sedimentos se evaluaron para detectar evidencia de induccion condrogenica cada semana durante 4 semanas. Los resultados indicaron que el tamano de los sedimentos se incrementaba con el tiempo. Sin embargo, no se observaron diferencias visuales entre las muestras BMP+ y BMP-. Los sedimentos tambien se analizaron histologicamente para GAG, un indicador de tejido de cartflago, por tincion con Azul Alcian. Las celulas BMP+ aparecieron generalmente mas activas metabolicamente con vacuolas claras mientras las celulas BMP- fueron mas pequenas con nucleos tenidos de forma densa y menos citoplasma (refleja baja actividad metabolica). A los 7 dfas, las celulas BMP+ se habfan tenido de azul fuertemente, mientras las BMP- solo se habfan tenido debilmente. Sobre los 28 dfas de induccion, tanto las celulas BMP+ como BMP- se habfan tenido casi de forma equivalente con Azul Alcian. Globalmente, la densidad celular disminuyo con el tiempo, y la matriz la sobrepaso en el sedimento. Por el contrario, la lmea celular negativa MC3T3 no demostro ninguna presencia de GAG cuando se tino con Azul Alcian.
Experimento 2: sobre la base de los resultados del Experimento 1, se diseno un estudio mas detallado para evaluar el potencial de diferenciacion condrogenica de dos lmeas de celulas madre placentarias y dos de celulas madre del cordon umbilical. Ademas de la histologfa con Azul Alcian, las celulas tambien se tineron con Rojo Sirio, que es espedfico para colageno tipo II. Se prepararon multiples sedimentos para cada lmea celular, con y sin medio de induccion.
Las lmeas celulares cultivadas sedimentadas se evaluaron en primer lugar por observacion gruesa para detectar la generacion macroscopica de cartflago. Globalmente, se observo que las lmeas de celulas madre produdan sedimentos tan pronto como el dfa 1. Estos sedimentos crecieron con el tiempo y formaron una matriz firme, apareciendo blancos, brillantes y semejantes a cartflago, y volviendose mecanicamente firmes. Por inspeccion visual, los sedimentos de las celulas madre placentarias o celulas madre del cordon umbilical fueron mucho mayores que los controles MSC. Los sedimentos control en el medio no de induccion empezaron a separarse sobre el Dfa 11, y fueron mucho mas pequenos a los 28 dfas que los sedimentos desarrollados por las celulas cultivadas en medio de induccion condrogenica. Visualmente, no hubo diferencias entre los sedimentos formados por las celulas madre placentarias o del cordon umbilical. Sin embargo, la lmea de celulas madre UC67249, que se inicio en medio sin dexametasona, formo sedimentos mayores. Las celulas MC3T3 de control negativo no formaron sedimentos; sin embargo, las HDF sf formaron sedimentos.
Los sedimentos representativos de todos los grupos de ensayo se sometieron entonces a analisis histologico para determinar GAG y colageno. Generalmente, los sedimentos formados por las celulas madre bajo condiciones inductoras eran mucho mayores y permanecieron intactos mejor que los sedimentos formados bajo condiciones no inductoras. Los sedimentos formados bajo condiciones inductoras mostraron la produccion de GAG y un contenido de colageno creciente con el tiempo, y tan pronto como en siete dfas, mientras los sedimentos formados bajo condiciones no inductoras mostraron una pequena o ninguna produccion de colageno, como se manifiesta por la debil tincion con Azul Alcian. En general, las celulas madre placentarias y las celulas madre del cordon umbilical parecieron, por inspeccion visual, producir sedimentos mas firmes, mayores, y parecieron producir mas colageno con el tiempo, que las hMSC. Ademas, durante el curso del estudio, el colageno parecio engrosarse, y el tipo de colageno parecio cambiar, como se manifiesta por cambios en los colores de las fibras bajo luz polarizada (los colores se correlacionan con el grosor de las fibras lo que puede ser indicativo del tipo de colageno). Las celulas madre placentarias no inducidas produjeron mucho menos colageno tipo II, si es que lo produjeron, comparado con las celulas madre inducidas. Durante el periodo de 28 dfas, la densidad celular disminuyo al incrementarse la produccion de la matriz, una caractenstica del tejido de cartflago.
Estos estudios confirman que las celulas madre placentarias y de cordon umbilical pueden diferenciarse a lo largo de una ruta condrogenica, y pueden inducirse facilmente para formar tejido de cartflago. Las observaciones iniciales indican que dichas celulas madre son preferibles a las MSC para la formacion de tejido de cartflago.
5.5 Ejemplo 5: cultivo de gota colgante de las celulas madre placentarias
Las celulas madre placentarias adherentes en cultivo se tripsinizan a 37 °C durante aproximadamente 5 minutos, y se sueltan de placa de cultivo golpeando suavemente. Se anade 10 % de FBS al cultivo para parar la tripsinizacion. Las celulas se diluyen hasta aproximadamente 1 x 104 celulas por mL en aproximadamente 5 mL de medio. Se ponen gotas (bien una unica gota o gotas de una micropipeta multicanal) en la parte interior de la tapa de una placa Petri de 100 mL. La tapa se invierte cuidadosamente y se pone en la parte superior de la parte inferior de la placa, que contiene aproximadamente 25 ml de PBS esteril para mantener el contenido de humedad en la atmosfera de la placa. Las celulas se crecen durante 6-7 dfas.
5.6 Ejemplo 6: digestion de tejido placentario para obtener celulas madre placentarias
Este Ejemplo demuestra un aislamiento con aumento de escala de las celulas madre placentarias por digestion enzimatica.
Aproximadamente 10 gramos de tejido placentario (amnios y corion) se obtiene, macera, y digiere usando volumenes iguales de colagenasa A (1 mg/ml) (Sigma) y Tripsina-EDTA (0.25 %) (Gibco-BRL) en un volumen total de aproximadamente 30 ml durante aproximadamente 30 minutos a 37°C. Las celulas liberadas por la digestion se lavan 3X con medio de cultivo, se distribuyen en cuatro matraces T-225 y se cultivan como se ha descrito en el Ejemplo 1. El rendimiento de las celulas madre placentarias es entre aproximadamente 4 x 108 y 5 x 108 celulas por 10g de material de partida. Las celulas, caracterizadas en el subcultivo 3, son predominantemente CD10+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34- y CD45-.
5.7 Ejemplo 7: produccion de producto de celulas madre criopreservado y banco de celulas madre
Este Ejemplo demuestra el aislamiento de celulas madre placentarias y la produccion de un producto congelado basado en celulas madre.
Resumen: el tejido placentario se disecciono y digirio, seguido de cultivos primarios y expandidos para conseguir un producto celular expandido que produce muchas dosis celulares. Las celulas se almacenan en un banco celular de dos niveles y se distribuyen como un producto celular congelado. Todas las dosis celulares derivadas de una unica placenta donante se definen como un lote, y un lote de placenta se procesa cada vez usando una tecnica esteril en una habitacion especializada y campana de flujo laminar de Clase 100. El producto celular se define como CD105+, CD200+, CD10+, y CD34-, teniendo un cariotipo normal y ausencia de contenido celular materno.
5.7.1 Obtencion de celulas madre
Diseccion y digestion del tejido: se obtiene una placenta menos de 24 horas despues de la expulsion. Se obtiene tejido placentario a partir del amnios, una combinacion de amnios y corion, o corion. El tejido se trocea en pequenas partes, con un tamano de aproximadamente 1 mm. El tejido troceado se digiere en 1 mg/ml de Colagenasa 1A durante 1 hora a 37 °C seguido de Tripsina-EDTA durante 30 minutos at 37 °C. Despues de tres lavados en 5 % de FBS en PBS, el tejido se resuspende en medio de cultivo.
Cultivo primario: el proposito del cultivo primario es establecer celulas a partir del tejido placentario digerido. El tejido digerido se suspende en medio de cultivo y se pone en matraces T de Corning, que se incuban en una camara humidificada mantenida a 37 °C con 5 % de CO2. La mitad del medio se repone despues de 5 dfas de cultivo. Sobre las 2 semanas de cultivo se forman colonias de celulas de alta densidad. Las colonias se recogen con Tripsina-EDTA, que se para despues con 2 % de FBS en PBS. Las celulas se centrifugan y se resuspenden en medio de cultivo para sembrar los cultivos de expansion. Estas celulas se definen como celulas de Subcultivo 0 que se han duplicado 0 veces.
Cultivo de expansion: las celulas recogidas del cultivo primario, recogidas del cultivo de expansion, o descongeladas del banco celular se usan para sembrar los cultivos de expansion. Se tratan Cell Factories (NUNC™) con 5 % de CO2 en aire a 50 ml/min/bandeja durante 10 min a traves de un filtro esteril y se calientan en un incubador humidificado mantenido a 37°C con 5 % de CO2. Las siembras celulares se cuentan en un hemocitometro con azul de tripan, y se registran el numero, viabilidad, numero de subcultivo, y el numero acumulativo de duplicaciones de las celulas. Las celulas se suspenden en medio de cultivo hasta aproximadamente 2.3 X 104 celulas/ml y se siembran 110 ml/bandeja en las Cell Factories. Despues de 3- 4 dfas y de nuevo a los 5-6 dfas de cultivo, el medio de cultivo se retira y se reemplaza con medio fresco, seguido de otro tratamiento con 5 % de CO2 en aire. Cuando las celulas alcanzan aproximadamente 105 celulas/cm2, las celulas se recogen con Tripsina-EDTA, seguido de parada con 2 % de FBS en PBS. Las celulas se centrifugan entonces y se resuspenden en medio de cultivo.
Criopreservacion: las celulas que se van a congelar se recogen del cultivo con Tripsina-EDTA, se para con 2 % de FBS en PBS, y se cuentan en un hemocitometro. Despues de centrifugar, las celulas se resuspenden con 10 % de DMSO en FBS hasta una concentracion de aproximadamente 1 millon de celulas/ml para las celulas que se van a usar para constituir un banco celular, y 10 millones de celulas/ml para dosis celulares individuales congeladas. La disolucion celular se transfiere a un contenedor de congelacion, que se pone en un bano de alcohol isopropflico en un congelador a -80 °C. Al dfa siguiente, las celulas se transfieren a nitrogeno lfquido.
5.7.2 Diseno de un banco de celulas madre
Un "lote" se define como todas las dosis celulares derivadas de una unica placenta donante. Las celulas mantuvieron un crecimiento, cariotipo, y fenotipo de marcadores de la superficie celular normales durante mas de 8 subcultivos y 30 duplicaciones durante el cultivo de expansion. Dada esta limitacion, las dosis comprenden celulas de 5 subcultivos y aproximadamente 20 duplicaciones. Para generar un suministro de celulas equivalentes, se expande un unico lote en cultivo y se almacena en un banco celular de dos niveles y en dosis congeladas. En particular, las celulas recogidas del cultivo primario, que se definen como celulas de Subcultivo 0 que han experimentado 0 duplicaciones, se usan para iniciar un cultivo de expansion. Despues del primer subcultivo, se producen aproximadamente 4 duplicaciones, y las celulas se congelan en un Banco Celular Maestro (MCB). Los viales del MCB se usan para sembrar cultivos de expansion adicionales. Despues de dos subcultivos adicionales de las celulas descongeladas del MCB, las celulas se congelan en un Banco Celular de Trabajo (WCB), aproximadamente 12 duplicaciones acumulativas. Los viales del WCB se usan para sembrar un cultivo de expansion para otros 2 subcultivos, lo que produce celulas de Subcultivo 5 a aproximadamente 20 duplicaciones que se congelan en dosis individuales.
5.7.3 Descongelacion de las celulas para cultivo
Los contenedores congelados de las celulas se ponen en una bolsa de plastico sellada y se sumergen en un bano de agua a 37 °C. Los contenedores se giran suavemente hasta que todos los contenidos se funden excepto un pequeno trozo de hielo. Los contenedores se retiran de la bolsa de plastico sellada y se anade lentamente a las celulas un volumen 10X de medio de cultivo con mezclado suave. Se cuenta una muestra en el hemocitometro y se siembra en cultivos de expansion.
5.7.4 Descongelacion de las celulas para inyeccion
Los contenedores congelados de las celulas se transfieren al sitio de administracion en un embalaje con nitrogeno seco. Antes de la administracion, los contenedores se ponen en una bolsa de plastico sellada y se sumergen en un bano de agua a 37 °C. Los contenedores se giran suavemente hasta que todos los contenidos se funden excepto un pequeno trozo de hielo. Los contenedores se retiran de la bolsa de plastico sellada y se anade un volumen igual de 2.5 % de HSA/5 % de Dextrano. Las celulas se inyectan sin lavado adicional.
5.7.5 Ensayos y especificaciones
Una muestra de sangre materna acompana a todas las placentas donantes. La muestra se criba para detectar anticuerpo contra el antigeno central y antigeno de superficie de la Hepatitis B, anticuerpos del virus de la Hepatitis C y acido nucleico, y anticuerpo de VIH I y II y acido nucleico. El procesamiento de la placenta y el cultivo primario empieza antes de la repeticion de los resultados de los ensayos, pero continua solo para las placentas asociadas con muestras de sangre materna que hayan dado negativo en los ensayos para todos los virus. Un lote se rechaza si el donante da positivo en los ensayos para cualquier patogeno. Ademas, los ensayos descritos en la Tabla 3 se realizan en el MCB, el WCB, y una muestra del material de la dosis celular derivado de un vial del WCB. Un lote se lanza solo cuando se cumplen todas las especificaciones.
Tabla 3: Ensayos y especificaciones de las celulas
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*Para el producto disenado para ser 40 ml de celulas congeladas/dosis y un maximo de 5 EU/ml, el producto celular esta por debajo del lfmite superior de 5EU/kg/dosis para los receptores con mas de 40kg de peso corporal.
5.7.6 Analisis del fenotipo de los marcadores de superficie
Las celulas se ponen en 1 % de paraformaldefudo (PFA) en PBS durante 20 minutos y se almacenan en una nevera hasta la tincion (hasta una semana). Las celulas se lavan con 2 % de FBS, 0.05 % de azida de sodio en PBS (Tampon de Tincion) y entonces se resuspenden en tampon de tincion. Las celulas se tinen con los siguientes conjugados de anticuerpos: CD105-FITC, CD200-PE, CD34-PECy7, CD10-APC. Las celulas tambien se tinen con controles de isotipo. Despues de una incubacion de 30 minutos, las celulas se lavan y se resuspenden con Tampon de Tincion, seguido de analisis en un citometro de flujo. Las celulas que tienen una fluorescencia incrementada comparado con los controles de isotipo se cuentan como positivas para un marcador.
5.8 Ejemplo 8: identificacion de genes espedficos de celulas madre placentarias
Los patrones de expresion genica de las celulas madre placentarias de amnios-corion (AC) y cordon umbilical (UC) se compararon con los patrones de expresion genica de celulas madre mesenquimales multipotentes derivadas de la medula osea (BM) y fibroblastos dermicos (DF), considerandose estos ultimos con diferenciacion terminal. Las celulas se crecieron durante un unico subcultivo, un numero intermedio de subcultivos, y un gran numero de subcultivos (incluyendo hasta la senescencia). Los resultados indican que el numero de duplicaciones de las poblaciones tiene un gran impacto en la expresion genica. Se identifico un conjunto de genes que estan regulados al alza en AC y UC, y bien regulados a la baja o ausentes en BM y DF, y que se expresan independientemente del numero de subcultivos. Este conjunto de genes espedficos de celulas madre placentarias o celulas madre del cordon umbilical codifica un numero de protemas del citoesqueleto y de adhesion celula a celula asociadas con las celulas epiteliales y una protema de superficie semejante a inmunoglobulina, CD200, implicada en la tolerancia inmune materno-fetal. Las celulas madre placentarias y las celulas madre del cordon umbilical se referiran colectivamente en la presente memoria de aqrn en adelante en este Ejemplo como celulas madre AC/UC.
5.8.1 Metodos y materiales
5.8.1.1 Celulas y cultivo celular
Se adquirieron BM (No. de cat. PT-2501) y DF (No. de cat. CC-2511) en Cambrex. AC y UC se originaron de matraces de cultivo tisular de subcultivo 0. AC y UC en los matraces se obtuvieron por digestion a partir de una placenta donante designada 2063919. Los matraces de cultivo T-75 se sembraron a 6000 celulas/cm2 y las celulas se subcultivaron cuando fueron confluentes. Las duplicaciones de las poblaciones se estimaron a partir de los recuento celulares con azul de tripan. Los cultivos se ensayaron para determinar la expresion genica despues de 3, 11-14, y 24-38 duplicaciones de poblaciones.
5.8.1.2 ARN, micromatrices y analisis
Las celulas se lisaron directamente en sus matraces de cultivo tisular, con la excepcion de un cultivo que se tripsinizo antes de la lisis. El ARN total se aislo con el kit RNeasy de QIAGEN. La integridad y las concentraciones del ARN se determinaron con un Bioanalizador Agilent 2100. Diez microgramos de ARN total de cada cultivo se hibridaron en una plataforma Affymetrix GENECHIP®. El ARN total se convirtio en ARNc marcados y se hibridaron con matrices de oligonucleotidos Human Genome U133A 2.0 segun los metodos del fabricante. Los archivos de imagenes se procesaron con el software Affymetrix MAS 5.0, y se normalizaron y analizaron con el software Agilent GeneSpring 7.3.
5.8.2 Resultados
5.8.2.1 Seleccion de puntos de tiempo en el cultivo de BM-MSC, celula madre AC/UC, y DF para analisis con micromatrices
Para establecer un patron de expresion genica unico para las celulas madre AC/UC, se cultivaron dos lmeas de celulas madre, AC(6) y UC(6), en paralelo con BM-MSC y DF. Para maximizar la identificacion de un perfil de expresion genica atribuible al origen celular y para minimizar las influencias exogenas, todas las celulas se crecieron en el mismo medio, se sembraron, y subcultivaron usando los mismos criterios. Las celulas se recogieron despues de 3 duplicaciones de las poblaciones, 11-14 duplicaciones, o 35 duplicaciones o senescencia, lo que ocurriera antes. Los genes cuya expresion en celulas madre AC/UC esta inalterada por el tiempo en cultivo y esta regulada al alza respecto a BM y DF son candidatos para genes espedficos de celulas madre AC/UC.
La FIG. 10 muestra los perfiles de crecimiento para las cuatro lmeas celulares en el estudio; los drculos indican que cultivos se recogieron para el aislamiento del ARN. En total, se recogieron doce muestras. BM, AC(6), y UC(6) se recogieron despues de tres duplicaciones de las poblaciones; estas muestras se consideraron como que habfan estado en cultivo durante un "corto" periodo de tiempo. Una muestra DF de duracion corta no se recogio. Los cultivos de duracion intermedia, 11 a 14 duplicaciones, se recogieron para todos los tipos celulares. Los cultivos de duracion larga se recogieron de todas las lmeas celulares a aproximadamente 35 duplicaciones de las poblaciones o justo antes de la senescencia, lo que ocurriera antes. La senescencia ocurrio antes de las 15 duplicaciones para BM y a las 25 duplicaciones para DF. Las celulas BM y DF adquiridas se expandieron muchas veces antes del analisis genico, y no pueden considerarse en estadio temprano. Sin embargo, operacionalmente, las BM crecidas durante tres duplicaciones (BM-03) se consideran un cultivo de duracion corta. Asimismo, BM-11 se refiere operacionalmente como un cultivo de duracion intermedia, pero como la senescencia ocurna a las 14 duplicaciones, BM-11 es lo mas probablemente, desde un punto de vista biologico, un cultivo l de duracion larga.
5.8.2.2 La agrupacion jerarquica muestra una relacion entre BM, celulas madre AC/UC, y DF
El analisis por micromatrices identifica patrones de expresion genica, y los intentos de agrupacion jerarquica (HC) para encontrar similitudes en el contexto de dos dimensiones - genes en la primera dimension y diferentes condiciones (diferentes muestras de ARN) en la segunda. Los GeneChips usados en este experimento conteman mas de 22000 conjuntos de sondas (referidas como la "lista de todos los genes"), pero muchos de estos conjuntos interrogan genes que no se expresan en cualquier condicion. Para reducir la lista de todos los genes, los genes no expresados o expresados a niveles bajos (valores brutos por debajo de 250) en todas las muestras se eliminaron para rendir una lista de 8215 genes.
5.8.2.3 Analisis de la expresion genica usando la vista del grafico de lmeas
Los patrones de expresion genica de los 8215 genes se presentaron usando la vista del grafico de lmeas en GeneSpring (FIG. 11). El eje de las x muestra las doce condiciones experimentales y el eje de las y muestra los valores de expresion normalizados del conjunto de sondas en una escala logantmica. El eje de las y abarca un rango de 10 000 veces, y los genes que no se expresan o se expresan a niveles muy bajos se ajustan a un valor de 0.01. Por defecto, el valor normalizado se ajusta a 1. Cada lmea representa un unico gen (realmente, un conjunto de sondas, algunos genes tienen multiples conjuntos de sondas) y discurre en las doce condiciones como un unico color. Los colores representan niveles de expresion relativos, como se describe para los mapas de calor, pero el patron de color se determina seleccionando una condicion. AC-03 es la condicion seleccionada en la FIG. 11. Los genes regulados al alza respecto al valor normalizado se representan por el software como rojos, y aquellos que estan regulados a la baja, se representan como azules. Los picos que apuntan hacia arriba y hacia abajo obvias en AC-03 a UC-11 indican que muchos genes se expresan de manera diferente en estas condiciones. La similitud llamativa en los patrones de color entre AC-03 y UC-03 muestran que muchos de los mismos genes estan regulados al alza o a la baja en estas dos muestras. Los segmentos de lmeas horizontales indican que el nivel de expresion de un gen no se altera a lo largo de varias condiciones. Esto es muy notable comparando UC-36, UC-38, y UC-38-T. No hay picos obvios, pero hay una tendencia sutil en que un numero de lmeas rojas entre UC-36 y UC-38-T estan por debajo del valor normalizado de 1. Esto indica que estos genes, que estan regulados al alza en AC-03 y UC-03, estan regulados a la baja en los cultivos posteriores. El hecho de que los patrones de expresion entre UC-38 y UC-38-T sean tan similares indica que la tripsinizacion de las celulas justo antes del aislamiento del ARN tiene poco efecto en la expresion genica.
Ademas del metodo HC computacionalmente intensivo, por inspeccion visual, las dos muestras de BM son mas similares entre sf que a las demas condiciones. Lo mismo es cierto para los dos cultivos de DF. Y, a pesar del gran numero de genes expresados de forma diferencial presentes en las muestras de BM y DF, la apariencia general sugiere que las dos BM y las dos DF son mas similares entre sf que a las celulas madre AC/UC. Esto se confirma por los resultados de HC descritos anteriormente.
Cuando el proceso anterior se aplica usando AC-11 como la condicion seleccionada, esta claro que AC-11 y UC-11 comparten muchos de los genes expresados de forma diferencial, pero el numero total de genes en comun entre estas dos condiciones parece menor que el numero de genes expresados de forma diferencial compartidos por AC-03 y UC-03. La FIG. 12 muestra genes sobreexpresados de forma diferencial, seis veces o mas respecto a la lmea base, en AC-03. La mayona de los genes regulados al alza en AC-03 tambien estan regulados al alza en UC-03, y mas divergente en BM y DF.
5.8.2.4 Metodos de filtrado usados para identificar genes espedficos de celulas madre AC/UC
Los genes que permanecen constantes a lo largo de todas las muestras de AC/UC, y que estan regulados a la baja en BM y DF, se consideran espedficos de las celulas madre AC/UC. Se combinaron dos metodos de filtrado para crear una lista de 58 genes espedficos de las celulas madre AC/UC (Tabla 4). '
Tabla 4: 58 genes espedficos de celulas madre placentarias o celulas madre del cordon umbilical
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En primer lugar, se identificaron 58 genes seleccionando aquellos genes sobreexpresados > tres veces en al menos siete de ocho condiciones de celulas madre AC/UC respecto a todas las muestras de BM y DF (FIG. 13). El filtrado en ocho de las ocho condiciones de celulas madre AC/UC rindio una lista similar. El segundo metodo de filtrado uso llamadas "ausentes" y "presentes" proporcionadas por el software Affymetrix MAS 5.0. Se creo una lista identificando los genes ausentes en todas las condiciones BM y DF y presentes en AC-03, AC-11, UC-03, y UC-11. Las llamadas de genes en las ultimas condiciones de celulas madre AC/UC no se estipularon.
Las dos listas se superpusieron significativamente y se combinaron. La lista combinada se recorto adicionalmente por la eliminacion de (1) varios genes expresados a niveles muy bajos en la mayona o en todas las condiciones de celulas madre AC/UC, y (2) genes portados en el cromosoma Y. Se confirmo que las celulas AC y UC usadas en este estudio eran masculinas por analisis FISH, y la BM y DF derivaban de un donante femenino. La lista resultante de 46 genes espedficos de celulas madre AC/UC se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5. Genes espedficos de AC/UC listados por ontologfa
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Esta lista de 46 genes codifica una coleccion de protemas que presentan un numero de grupos de ontolog â. El grupo mas altamente representado, adhesion celular, contiene ocho genes. Ningun gen codifica protemas implicadas en la replicacion del ADN o la division celular. Tambien se listan dieciseis genes con referencias espedficas a epitelios.
5.8.3 Discusion
Se identifico un patron de expresion espedfico para celulas madre placentarias, y distinguible de las celulas mesenquimales derivadas de la medula osea. A nivel operativo, este patron incluye 46 genes que estan sobreexpresados en todas las muestras de celulas madre placentarias respecto a todas las muestras de BM y DF.
El diseno experimental comparo celulas cultivadas durante periodos de tiempo en cultivo cortos, medios y largos. Para las celulas AC y UC, cada periodo de cultivo tiene un conjunto caractenstico de genes expresados diferencialmente Durante la fase de tiempo corto o temprana (AC-03 y UC-03) doscientos genes regulados al alza retroceden a la media despues de ocho duplicaciones de las poblaciones. Sin estar vinculados por teona, es probable que este patron de expresion genica en estadio temprano se parezca al perfil de expresion de AC y UC, mientras estan en el entorno placentario natural. En la placenta, estas celulas no se estan dividiendo activamente, estan metabolizando nutrientes, con senalizacion entre ellas, y asegurando su localizacion mediante el remodelado del entorno extracelular.
La expresion genica por los cultivos con una duracion intermedia esta definida por la rapida division celular y los genes expresados diferencialmente en este momento son bastante diferentes de los expresados diferencialmente durante la fase temprana. Muchos de los genes regulados al alza en AC-11 y UC-11, junto con BM-03 y DF-14, estan implicados en la replicacion cromosomica y la division celular. Sobre la base de la expresion genica, BM-03 parece biologicamente como un cultivo de duracion media. En este estadio medio, la expresion genica espedfica del tipo celular esta eclipsada por la proliferacion celular. Ademas, casi cada gen sobreexpresado en los cultivos de duracion corta de AC o UC esta regulado a la baja en las condiciones de estadio medio y tardm. 143 genes estaban regulados al alza > cinco veces durante esta fase altamente proliferativa, constituyendo aproximadamente el 1.7 % de los genes expresados.
Los cultivos de larga duracion representan la fase final o senescente. En esta fase, las celulas han agotado su capacidad de dividirse, y, especialmente para AC y UC, el numero absoluto de genes expresados diferencialmente esta reducido de forma importante. Esto puede ser el resultado de que las celulas se han adaptado completamente a su entono de cultivo y una carga consecuentemente reducida para biosintetizar. Sorprendentemente, los cultivos tardfos de BM y DF no presentan este mismo comportamiento; un gran numero de genes se expresan diferencialmente en BM-11 y DF-24 respecto a AC y UC y el valor normalizado de 1. AC y UC son distinguibles de BM y DF, de forma mas notable, en los cultivos de larga duracion.
La lista de genes espedficos de celulas madre placentarias descrita aqu es diversa. COL4A1 y COL4A2 estan regulados de forma coordinada, y KRT18 y KRT8 tambien parecen coexpresarse. Ocho de los genes codifican protemas implicadas en el contacto celula a celula, tres de los cuales (DSC3, DSG2, y PKP2) estan localizados en los desmosomas, puntos de contacto intercelular anclados para protemas del citoesqueleto de filamento intermedio tales como queratina 18 y queratina 8. El contacto celula a celula firme es caractenstico de las celulas epiteliales y endoteliales y no esta asociado tipicamente con los fibroblastos. La Tabla 3 lista 16 genes, del total de 46, caractensticos de las celulas epiteliales. Las celulas madre placentarias se describen generalmente como celulas con forma de huso pequenas semejantes a fibroblastos. Esta morfologfa es tipicamente distinta de BM y DF, especialmente a densidades celulares menores. Tambien se puede indicar el patron de expresion de CD200, que esta presente en las celulas madre AC/UC y ausente en todas las muestras BM y DF. Ademas, se ha mostrado que CD200 esta asociado con la tolerancia inmune en la placenta durante el desarrollo fetal (vease, p. ej., Clark et al, Am. J. Reprod. Immunol. 50(3): 187-195 (2003)).
Este subconjunto de genes de 46 genes constituye un conjunto de biomarcadores moleculares que distingue las celulas madre AC/UC de celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea o fibroblastos.
5.9 Ejemplo 6.9: diferenciacion de celulas madre placentarias adherentes en celulas osteogenicas
Este ejemplo describe los resultados de experimentos que demuestran la capacidad de las celulas madre placentarias de diferenciarse en celulas osteogenicas. Este ejemplo tambien demuestra la capacidad de dichas celulas osteogenicas de mineralizarse, o de contribuir a la mineralizacion, de un soporte apropiado in vitro.
5.9.1 Expresion de marcadores osteogenicos por celulas madre placentarias diferenciadas
Inicialmente, se evaluo la capacidad de las celulas madre placentarias para diferenciarse en precursores osteogenicos mediante la monitorizacion de la actividad fosfatasa alcalina (AP). La actividad AP es un marcador temprano usado comunmente para la formacion osea. Vease, p. ej., Kasten et al, 2005, Biomaterials 26:5879- 89.
5.9.1.1 Reactivos
El DMEM-LG, suplemento de insulina-transferrina-selenio-G (ITS), penicilina-estreptomicina (P/S), ensayo fluorescente de ADNds PicoGreen se adquirieron en Invitrogen (Eugene, OR). MCDB201, acido linoleico, dexametasona, acido L-ascorbico, y factor de crecimiento epidermico se adquirieron en Sigma (St. Louis, MO). El suero fetal bovino (FBS) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas se obtuvieron de Hyclone (Logan, UT) y R&D Systems (Minneapolis, MN), respectivamente. Las celulas madre mesenquimales (MSC) derivadas de medula osea criopreservadas, medio de crecimiento de celulas madre mesenquimales (designado en este Ejemplo como "basal"), y medio de diferenciacion osteogenica (OS) se adquirieron en Cambrex (East Rutherford, NJ). Vease tambien la Seccion 5.5.4, anteriormente.
5.9.1.2 Cultivo celular
Las celulas madre placentarias adherentes se aislaron de la placenta por uno de varios metodos incluyendo disrupcion ffsica de tejido de varios sitios anatomicos diferentes en la placenta. Las celulas madre placentarias adherentes se establecieron y se subcultivaron a 5 x 103 celulas/cm2 en medio Anthro1B (60 % de DMEM-LG, 40 % de MCDB201, 2 % de FBS, 1X P/S, 180 ng/mL de acido linoleico, dexametasona 0.05 |j M, acido L-ascorbico 0.1 mM, 10 ng/mL de factor de crecimiento derivado de plaquetas y 10 ng/mL de factor de crecimiento epidermico). Las MSC de medula osea se subcultivaron en medio basal a 5 x 103 celulas/cm2. Para los estudios expe rim en ta l en poliestireno de cultivo tisular, las celulas madre placentarias y/o las celulas madre mesenquimales se sembraron bien en medio basal o AnthrolB a 5 x 103 celulas/cm2 despues se mantuvieron bien en medio AnthrolB o se indujeron con OS durante hasta 5 semanas; las celulas se alimentaron bisemanalmente con medio fresco. Para los estudios en soportes tridimensionales, las celulas madre placentarias en un volumen de 100 pl de medio AnthrolB se sembraron (2.5 x105 celulas/soporte) en soportes de fosfato de calcio (CaP, BD Biosciences, San Jose CA) o p-fosfato tricalcico (TCP, Therics, Akron, OH; VITOSS®, Orthovita, Inc.; Malvern, PA; HEALOS™II; DePuy Spine, Inc.; Raynham, MA). Despues de 1-2 horas de incubacion a 37 °C, los pocillos que conteman los soportes se suplementaron con 180 pl de medio. Despues de 3-4 dfas, la mitad de las muestras se mantuvo en medio AnthrolB y la otra mitad de las muestras se indujo con medio OS. El medio se cambio bisemanalmente.
5.9.1.3 Ensayo de la fosfatasa alcalina
La actividad fosfatasa alcalina (AP) en los lisados celulares se determino usando un ensayo colorimetrico (Cell Biolabs, San Diego, CA), que mide la formacion del producto p-nitrofenol; la actividad AP se normalizo respeto a los pg de ADN (para tener en cuenta cualquier diferencia en el numero de celulas) usando el ensayo fluorescente ADNds PicoGreen (Invitrogen, Eugene, OR). Para averiguar la actividad AP de las celulas cultivadas en soportes, se lavaron las construcciones celula-soporte con PBS, se sumergieron en tampon de lisis celular, se aplastaron con una punta de pipeta, y se centrifugaron a 12000g. Los sobrenadantes se analizaron entonces para determinar la actividad AP y el contenido de ADN como se ha descrito anteriormente.
5.9.1.4 Resultados y discusion
Las celulas madre placentarias y las celulas madre mesenquimales se sembraron bien en medio basal (Cambrex) o medio Anthro1B, despues se mantuvieron bien en medio basal, OS, o Anthro1B durante 3 semanas (las celulas sembradas en medio basal e inducidas con medio OS se designan como "basal-OS" en la Figura 14). Como se muestra en las Figuras 14A y 14B, las celulas sembradas y mantenidas en medio basal muestran la actividad AP mas baja, como se esperaba, mientras las celulas sembradas en medio basal e inducidas con medio OS muestran niveles comparativamente mas altos de actividad AP. De forma interesante, las celulas sembradas y mantenidas en Anthro1B muestran los niveles mas altos de actividad AP, incluso mas altos que las celulas sembradas en medio Anthrol1B e inducidas con medio OS. Asf, este experimento demostro que las PDAC pueden diferenciarse en celulas precursoras osteogenicas cuando se cultivas en el medio apropiado.
5.9.2 Caracterizacion funcional de la diferenciacion de las PDAC en celulas osteogenicas
Este ejemplo describe los resultados de experimentos para evaluar las capacidades funcionales de las celulas osteogenicas diferenciadas a partir de celulas madre placentarias. Espedficamente, se evaluo la capacidad de las celulas osteogenicas para depositar una matriz mineralizada. Las celulas madre placentarias se prepararon y cultivaron como se describe en el Ejemplo 6.9.1, anteriormente, excepto en que las celulas madre placentarias se sembraron y cultivaron en medio Anthro1B durante 3 dfas, despues se mantuvieron bien en medio Anthro1B o se indujeron con medio OS durante 3 semanas. La mineralizacion se evaluo por tincion de von Kossa, un ensayo de calcio, y visualizacion por electromicrograffa de barrido (SEM).
5.9.2.1 Tincion de von Kossa
Los espedmenes se tineron para mineral por el metodo de von Kossa. En particular, se fijaron capas celulares con 10 % de formalina durante 10 minutos, se incubaron con 5 % de nitrato de plata bajo luz ultravioleta durante 20 minutos, se lavaron con agua desionizada, se incubaron con 5 % de tiosulfato durante 5 minutos, y se lavaron concienzudamente con agua desionizada.
5.9.2.2 Ensayo de calcio
Se lavaron dos veces las monocapas celulares con disolucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se rasparon de la placa en HCl 0.5N. El calcio acumulado se extrajo del componente celular incubando toda la noche a 4 °C en un agitador orbital, seguido de centrifugacion a 2000g durante 10 minutos. El sobrenadante se uso para la determinacion del calcio usando un kit de cuantificacion de calcio de Stanbio Laboratory (Boerne, TX). Los niveles de calcio se normalizaron respecto a la protema celular total para tener en cuenta cualquier diferencia en el numero de celulas.
5.9.2.3 Analisis SEM
Las muestras para SEM se fijaron en 10 % de formalina durante 15 minutos, se lavaron con PBS, y se deshidrataron en una serie gradual de etanol (20, 40, 60, 80, y 100 %). Los soportes se incluyeron en parafina despues de la deshidratacion con etanol para facilitar el seccionamiento. Despues del seccionamiento, las muestras se incubaron en xileno y se deshidrataron en una serie gradual de etanol como se ha descrito anteriormente. Todos los espedmenes se recubrieron entonces por rociado con oro y se analizaron usando SEM de emision de campo JEOL JSM- 6400F (Evans Analytical Group, East Windsor, NJ).
5.9.24 Resultados y discusion
Como se muestra en la Figura 15A, las celulas madre placentarias adherentes inducidas con medio OS muestran evidencia de depositos de calcio por la tincion de von Kossa; estos depositos no se observaron en celulas mantenidas en medio AnthrolB. Para cuantificar estos niveles de matriz mineralizada, se determino el calcio asociado con las monocapas celulares. Como se muestra en la Figura 15B, se recupero tres veces mas de calcio de las capas celulares inducidas con medio OS comparado con las cultivadas en medio AnthrolB. Junto con los datos de la tincion de von Kossa, los resultados de la extraccion de calcio muestran que las celulas madre placentarias inducidas con medio OS forman una matriz mineralizada. Para visualizar la matriz mineralizada con una alta resolucion, las muestras de las celulas madre placentarias bien mantenidas en medio AnthrolB (Figura 16A) o inducidas con medio OS (Figura 16B) se sometieron a analisis por SEM.
Los depositos de matriz mineralizada son claramente evidentes en celulas madre placentarias inducidas con medio OS, mientras no se observan dichas acumulaciones de depositos mineralizados en las celulas madre placentarias cultivadas en medio AnthrolB. El mapeo elemental de los depositos en la Figura 16B por analisis con rayos Xconfirma que estos nodulos estan compuestos por calcio y fosfato.
La ausencia aparente de correlacion entre los resultados en la Figura 14 (actividad AP incrementada en presencia de medio AnthrolB) y las Figuras 15 y 16 (ausencia de mineralizacion en presencia de medio AnthrolB) puede explicarse por el hecho de que AnthrolB no contiene p-glicerofosfato, que se requiere como una fuente de fosfato para la mineralizacion de la matriz. La dexametasona y el acido ascorbico, que estan presentes en el medio AnthrolB, asf como el medio OS, son inductores comunes de la diferenciacion osteogenica en las celulas madre. Vease, p. ej., Sun et al, 2006, Biomaterials 27:5651-7. El p-glicerofosfato se incluye habitualmente en el medio de diferenciacion osteogenica como una fuente de fosfato para permitir la mineralizacion de la matriz mediada por celulas; en general, no se reconoce como un inductor per se de la diferenciacion osteogenica. Los datos de la actividad AP sugieren que las celulas madre placentarias sembradas y mantenidas en Anthro1B tienen el potencial mas alto de diferenciacion osteogenica; es bastante probable que la mineralizacion no se observara en las celulas madre placentarias cultivadas en medio Anthro1B debido a la ausencia de p- glicerofosfato.
5.9.3 Diferenciacion de las PDAC en un soporte tridimensional
Este ejemplo describe la diferenciacion de las celulas madre placentarias en celulas osteogenicas en un sustrato tridimensional. Como los biomateriales basados en fosfato de calcio y apatito se han aplicado clmicamente para el tratamiento de fracturas y defectos oseos, se eligieron dos soportes ceramicos disponibles comercialmente para evaluar la union de las celulas madre placentarias y la funcionalidad osteogenica en soportes tridimensionales (3D). Las celulas madre placentarias y las celulas madre mesenquimales se sembraron en soportes y se evaluo su capacidad de unirse a y permanecer adherentes en los soportes durante el cultivo in vitro de larga duracion. Como se muestra en la Figura 17, las celulas madre placentarias, asf como las celulas madre mesenquimales, se unieron preferentemente a p-fosfato tricalcico (TCaP) comparado con los soportes de fosfato de calcio (CaP), mostrando las celulas madre placentarias y las celulas madre mesenquimales niveles similares de union a los soportes TCaP. Ademas, a lo largo de la duracion del curso de tiempo, hay consistentemente mas celulas (tanto celulas madre placentarias como celulas madre mesenquimales) presentes en el soporte TCaP frente a CaP. Sobre la segunda semana de cultivo, tanto las celulas madre placentarias adherentes como las celulas madre mesenquimales no fueron ya detectables en los soportes CaP. Estos datos estan apoyados por el analisis de consumo de oxfgeno en el medio de cultivo usando placas sensoras de oxfgeno. Conjuntamente, estos resultados sugieren, al menos en determinadas condiciones, que los soportes TCaP son mas preferibles para el mantenimiento de la viabilidad de PDAC que los soportes CaP.
Para evaluar la diferenciacion osteogenica en los soportes, se monitorizo la actividad AP de las celulas cultivadas en los soportes en un ensayo de AP realizado como se ha descrito anteriormente. Las celulas madre placentarias y las celulas madre mesenquimales se sembraron en medio Anthro1B, despues se mantuvieron bien en medio Anthro1B o medio OS durante la duracion del experimento. Como se muestra en la Figura 18, las celulas madre placentarias en soportes TCaP muestran una actividad AP similar ya se cultiven en medio Anthro1B o medio OS, mientras las MSC en soportes TCaP presentaron una mayor actividad AP en medio Anthro que las celulas cultivadas en medio OS. Estos resultados son consistentes con los datos de actividad AP obtenidos en superficies 2D, concretamente que los factores presentes en el medio Anthro1B pueden estar estimulando la actividad AP a niveles similares que el medio OS. Tanto para MSC como PDAC, no se detecto actividad AP en las celulas sembradas en soportes CaP.
Para evaluar funcionalmente la formacion de matriz osea de las celulas madre placentarias en soportes 3D, las celulas madre placentarias adherentes sembradas en soportes y se cultivaron bien en medio Anthro1B u OS durante 3-5 semanas, se sometieron a analisis por SEM. Como se muestra en la Figura 19, la SEM del soporte TCaP que se cultivaron en ausencia de las celulas mostro una superficie altamente porosa (indicado con una flecha) por la presencia de poros abundantes. Los soportes cultivados bien con celulas madre placentarias o celulas madre mesenquimales muestran una falta de porosidad en la superficie, lo que sugiere que las celulas estan formando una monocapa que consiste en una o ambas bicapas celulares o protemas de la matriz extracelular rodeando el soporte.
Para elucidar si se estaba produciendo la formacion de matriz osea mineralizada en el interior de los soportes por las celulas, se analizaron secciones transversales de la construccion de celula-soporte TCaP por SEM a una alta resolucion (5000x). Como se muestra en la FIG. 19, los soportes cultivados en ausencia de las celulas se caracterizaron por bordes afilados del cristal de TCaP que compone el soporte. Sin embargo, los soportes sembrados con celulas madre placentarias o celulas madre mesenquimales carecen de estos bordes afilados y en su lugar estan decorados con estructuras nodulares, que se parecen mucho a las observadas en la FIG. 17, lo que sugiere la formacion de matriz osea mineralizada tanto por las celulas madre placentarias como por las celulas madre mesenquimales en soportes TCaP.
5.10 Ejemplo 10: diferenciacion de las celulas madre placentarias en precursores osteogenicos
Este ejemplo describe los resultados de experimentos que evaluan la diferenciacion de las celulas madre placentarias aisladas por perfusion en celulas precursoras osteogenicas. Las celulas se aislaron a partir de placenta humana por perfusion segun el Ejemplo 6.3.
Despues de la recogida, las celulas de perfusado placentario humano (HPP) se cultivaron en medio DMEM que contema 10 % de FBS u OS durante 10 dfas en VITOSS® (Orthovita, Inc.; Malvern, PA). Las celulas se sedimentaron por centrifugacion a 1200 rpm durante 5 min. Despues de la retirada del fluido remanente de los sedimentos celulares, las celulas se resuspendieron en 20 pl de PBS-2 % de suero bovino fetal a los numeros de celulas designados (25 k, 50 k o 100 k). Los soportes se cortaron entonces en partes de 2x3x5 mm3 y se pusieron en los pocillos de placas de 96 pocillos. Las suspensiones celulares se cargaron directamente en los soportes y se incubaron a 37 °C con la presencia de 5 % de CO2 durante 30 min seguido de dispensacion de 200 pl de medio de Diferenciacion Osteogenica Cambrex (No. de cat. PT-3002) para sumergir las celulas-soportes. Para el ensayo de viabilidad celular, los soportes cargados con celulas se transfirieron al Sistema Biosensor de Oxfgeno BD (BD Biosciences, No. de cat. 353830) y se sumergieron con 200 pl de medio de Diferenciacion Osteogenica Cambrex.
El potencial osteogenico se evaluo entonces tinendo y monitorizando la actividad AP. En particular, las celulas se tineron con rojo de alizarina segun tecnicas convencionales para detectar la presencia de calcio. Como se muestra en la FIG 20, tanto las celulas madre como las MSC depositaron una matriz mineralizada que contema calcio en medio OS, pero no en DMEM.
Los ensayos de AP se realizaron despues de cultivar en OS durante diez dfas. Para hacer esto, las HPP en los soportes se lisaron en 100 pl de PBS que contema 0.2 % de Triton X-100 congelando y descongelando dos veces. Se usaron 5 pl de lisado celular para medir la actividad fosfatasa alcalina usando el kit de Ensayo de Fosfatasa Alcalina QuantiChrom de BioAssay Systems (No. de cat. DALP-250) como se indica por las directrices del vendedor. Los resultados de los ensayos se presentan en la Figura 21, que muestra que tanto las MSC como las HPP presentaron actividad AP despues de 10 dfas de cultivo en medio OS. Asf, estos experimentos demuestran que la fraccion de celulas madre que contiene celulas obtenidas como se ha descrito anteriormente tambien tema la capacidad de diferenciarse en celulas precursores osteogenicas.
5.11 Ejemplo 11: modelos in vivo para la reparacion osea con composiciones que comprenden celulas madre placentarias
Este ejemplo describe experimentos que se realizan con el fin de evaluar el tratamiento de defectos oseos con composiciones que comprenden celulas madre placentarias. Varios modelos de enfermedad osea estan adaptados para evaluar la aplicacion de dichos tratamientos a diferentes enfermedades oseas.
Para modelar el defecto craneal bilateral, se crea quirurgicamente un defecto de 3 mm x 5 mm en cada lado del craneo de ratas macho atimicas. Los defectos se tratan solo con matriz, matriz en combinacion con PDAC, y matriz en combinacion con HPP. Las cantidades de PDAC se vanan para evaluar la dependencia de la dosis de los diferentes tratamientos. Tambien se evaluan diferentes materiales de la matriz con el fin de ensayar los efectos de diferentes combinaciones de matriz y celulas madre.
Se asignan seis ratas a cada grupo de tratamiento y los defectos se rellenan con la combinacion designada de matriz y celulas. A las cuatro semanas, se recoge el suero y las ratas se sacrifican. El suero se ensaya para detectar la reaccion inmunologica a los implantes. Los craneos de las ratas se recogen para microradiograffa y se ponen en 10 % de NBF.
Las bovedas craneales se procesan para inclusion en parafina y seccionamiento. Las secciones histologicas de corona de las bovedas craneales se tinen con tincion de toluidina segun tecnicas convencionales. El crecimiento oseo interno en el defecto y el remanente de vetuculo de matriz se evaluan segun una escala de 0 a 4, siendo cuatro la mayor cantidad de crecimiento interno. Tambien se evaluan la inflamacion y la fibrosis.
El tratamiento de las lesiones oseas que se producen por metastasis de cancer puede evaluarse segun una adaptacion del procedimiento de Bauerle et al., 2005, Int. J. Cancer 115: 177-186. Brevemente, se inducen lesiones osteoltticas espedficas de sitio en ratas desnudas por inyeccion intra-arterial de celulas de cancer de mama humano en un vaso anastomosante entre las arterias femoral e ilfaca. Las metastasis se tratan entonces bien con terapias anticancerosas convencionales (p. ej., quimioterapeutica, radiologica, inmunologica, u otra terapia) o se retiran quirurgicamente. A continuacion, las lesiones remanentes de las metastasis de cancer se rellenan con diferentes combinaciones de matriz como se ha descrito anteriormente. Despues de un periodo de tiempo apropiado, como se determina por monitorizacion radiologica de los animales, los animales se sacrifican. Se evaluan la respuesta inmunologica frente a la matriz, la inflamacion, fibrosis, grado de crecimiento oseo interno, y la cantidad de vetuculo de matriz.
Las referencias adicionales que describen modelos de enfermedad osea que pueden usarse o adaptarse para evaluar la eficacia de las composiciones que comprenden celulas madre placentarias para tratar defectos oseos incluyen Mitsiades et al., 2003, Cancer Res. 63:6689-96; Chakkalakal et al, 2002, Alcohol Alcoholism 37: 13-20; Chiba et al, 2001, J. Vet. Med. Sci. 63:603-8; Garrett et al, 1997, Bone 20:515-520; y Miyakawa et al, 2003, Biochem. Biophys. Res. Comm. 313:258-62.
5.12 Ejemplo 12: produccion de colageno mineralizado a partir de colageno de placenta humana
Una disolucion de colageno placentario humano (HPC) a 4 °C a ~3 mg/ml se combino con un tampon neutralizante (Na2HPO4200 mM, pH 9.2) en una relacion 85:15 para proporcionar una concentracion final de Na2HPO4 de 30 mM y un pH de 7.2. Se consiguieron ajustes ligeros del pH con la adicion de NaOH o HCl 1 N mientras se agitaba. Una vez se ajusto el pH, la agitacion se paro y la reaccion se sometio a una rampa a 1 °C /min hasta 32 °C. La reaccion se mantuvo isoterma durante 20-24 horas y el colageno fibrilar se aislo por centrifugacion. El colageno se resuspendio 3x con disolucion salina tamponada con fosfato (PBS, Na2HPO420 mM, NaCl 130 mM, pH 7.4) y se centrifugo para aislar el colageno. El colageno fibrilar final lavado se resuspendio hasta 10 mg/ml en PBS y se almaceno a 4 °C hasta que se uso. La fibrilacion de HPC reconstituye el colageno soluble como fibrillas cortas y fibras largas como se muestra en la Figura 22a.
5.12.1 Mineralizacion de las fibrillas de colageno
Para mineralizar el colageno, se disperso Ca(OH)2 a 199.9 mmoles/L, mientras se preparaba una disolucion 59.7 mM de H3PO4. El Ca(OH)2 y el H3PO4 se combinaron conjuntamente en una relacion2:1, respectivamente, y el pH se ajusto a 9 en un recipiente de reaccion con camisa de agua. Esto produce una relacion 1.67 de Ca/P. La reaccion se agito vigorosamente mientras la temperatura se mantuvo a 40 °C y el pH se mantuvo a 9 por un bano de agua circulante y una unidad de titulacion automatica, respectivamente. El colageno fibrilar en PBS se anadio lentamente a la mezcla de reaccion y el pH volvio a 9. La relacion final de mineral a colageno fue 80:20. La reaccion se agito vigorosamente durante 18 horas y el colageno mineralizado (MC) se aislo por centrifugacion y se lavo 3 veces con PBS. Durante la reaccion de mineralizacion, se formo un mineral de Ca-P junto con las fibras como se muestra en la electromicrograffa presentada como Figura 22b. El rendimiento final de la reaccion fue alto (>80 %), y la relacion final de mineral/colageno del material estuvo cerca de la relacion de entrada de mineral/colageno como se determina usando TGA (Figura 23).
5.12.2 Entrecruzamiento del material compuesto
El colageno mineralizado (MC) se resuspendio hasta aproximadamente 2.5 mg/ml de colageno en PBS y se puso en un recipiente de reaccion con camisa de agua. El pH se ajusto a 9.5 y se mantuvo constante a lo largo de la reaccion con una unidad de titulacion automatica, mientras la temperatura se mantuvo constante a 25 °C con un bano de agua circulante. Se anadio butano diol digicidil eter (BDDE) a una concentracion final de 50 mM. La reaccion se agito vigorosamente durante 24 horas, momento en el cual el producto se aislo por centrifugacion, se lavo una vez con PBS, y se resuspendio en PBS con glicina 0.5M (pH 10) para apantallar cualesquiera grupos epoxido residuales que no habfan reaccionado. La reaccion se agito vigorosamente a 25 °C durante 24 horas y despues se lavo 3 veces con PBS. Se uso centrifugacion para aislar el colageno mineralizado entrecruzado (CMC). Las formulaciones de CMC se caracterizaron por microscopfa optica y electronica de barrido, Analisis Termo Gravimetrico (TGA), Calorimetna Diferencial de Barrido (DSC) difractometro de rayos X (XRD), y Espectroscopfa de Infrarrojo con Transformada de Fourier (FTIR).
El entrecruzamiento se confirmo por un incremento en la temperatura de desnaturalizacion del colageno de ~50 a ~70 °C como se determina por DSC. El material entrecruzado tema mas integridad mecanica que el material no entrecruzado y aparecio mas fibroso cuando se examino por microscopfa estereo y microscopfa electronica de barrido (SEM). La FTIR indico la presencia de un mineral de fosfato de calcio carbonatado. La XRD confirmo que el mineral es un hidroxiapatito poco cristalizado.
5.13 Ejemplo 13: crecimiento de PDAC en una matriz de colageno planetario humano mineralizado
Este Ejemplo describe los resultados de experimentos que evaluan la capacidad de las celulas madre placentarias adherentes de unirse a y crecer en una matriz de HPC mineralizado. En estos experimentos, los CMC producidos como se ha descrito anteriormente se esterilizaron con reactivos antibioticos y antimicoticos. Las muestras humedas se cargaron en transpocillos para estudios de citotoxicidad no de contacto usando celulas madre placentarias en un ensayo estandar de citotoxicidad de lactosa deshidrogenasa (LDH) segun las instrucciones del fabricante. La LDH liberada en el medio de cultivo se correlaciono con citotoxicidad.
A continuacion, el CMC preparado como se ha descrito anteriormente se uso para estudios de adhesion y proliferacion de PDAC. Las celulas madre placentarias se sembraron en CMC como se ha descrito anteriormente. Los numeros de las celulas PDAC se analizaron usando un ensayo de ADN PicoGreen a 1, 5 y 7 dfas (Molecular Probes; Eugene, Oregon). Las PDAC mostraron una produccion de LDH similar cuando se expusieron a CMC que cuando se expusieron a poliestireno de cultivo tisular (TCPS), lo que indica una baja citotoxicidad de los CMC. Las PDAC tambien se unieron en mayores numeros a CMC que al colageno mineralizado no entrecruzado a todas las densidades de siembra ensayadas. Siete dfas despues de la siembra, esta tendencia continuo, teniendo las celulas madre placentarias los mayores numeros de celulas en CMC.
5.14 Ejemplo 14: reparacion de defectos craneales usando celulas madre placentarias y matriz implantable
La ingeniena tisular usando celulas madre esta surgiendo como una alternativa prometedora al trasplante de tejidos u organos. Las celulas madre nuevas aisladas de placenta postparto (Celulas Adherentes Derivadas de Placenta, PDAC) tienen caractensticas y fenotipo de celulas madre multipotenciales. Las PDAC constituyen una fuente importante y no controvertida de celulas madre/progenitoras que podnan usarse como una opcion terapeutica para la reparacion de tejido danado o enfermo. En el presente estudio, investigamos el comportamiento osteogenico de las PDAC in vitro e in vivo.
Metodos
Estudio in vitro: las celulas madre placentarias se obtuvieron de la placenta por disrupcion ffsica de tejido de diferentes sitios anatomicos, se sembraron en medio basal, y despues se indujeron con medio de diferenciacion osteogenica (OS) como se ha descrito anteriormente. La actividad de osteogenesis in vitro de las PDAC se evaluo por la actividad fosfatasa alcalina (AP) y la mineralizacion de la matriz extracelular se detecto por tincion con Rojo Alizarina. La carga y viabilidad de las celulas madre placentarias en soportes tridimensionales se determino usando un ensayo de ADN y en ensayo luminiscente CELLTITER GLO®, respectivamente.
Estudio in vivo: las celulas madre placentarias se cargaron en soportes (bien VITOSS® Orthovita o HEALOS™ DePuy) y se cultivaron durante hasta 1 hora in vitro para formar construcciones de celulas/soporte para implante. Para el modelo ectopico, las construcciones de VITOSS® cargadas con celulas madre placentarias se implantaron subcutaneamente en 40 ratas atimicas y se recogieron 6 semanas despues del implante. Los explantes se analizaron por inmunohistoqmmica (IHC). Para el modelo de defecto oseo, se crearon defectos craneales bilaterales (3mm x 5mm) en 96 ratas macho atimicas Hsd:RH-Foxnmu (Charles River, Wilmington, Massachusetts), y se usaron para comparar el potencial osteogenico/de reparacion de las celulas madre placentarias HEALOS™, la protema morfogenica osea 2 (BMP-2) HEALOS™ como control positivo, el soporte (HEALOS™) solo como un control negativo, y defectos vados (sin tratamiento). Las ratas teman una edad de aproximadamente 6 semanas en el momento del estudio, y se asignaron dieciseis ratas a cada grupo. Los explantes para las condiciones experimentales se cargaron con 500 pL de una suspension de celulas madre a 5 x 106 celulas por mililitro. El control positivo comprendfa 5 pg de BMP-2 por 25 mg de vehfculo. El control negativo comprendfa HEALOS con 500 pL de medio de cultivo celular. Los explantes se recogieron a las 3 o 7 semanas despues del implante, y se analizaron con microradiograffa, densidad de tejido mineralizado (software de imaginena-ImageJ 1.37v), densitometro de rayos X Lunar PIXI, e histologfa. La histologfa se realizo en tejido oseo escindido usando las tinciones hematoxilina y eosina, azul T y vimentina.
Resultados
El comportamiento osteogenico in vitro de las celulas madre placentarias se demostro por la induccion de la actividad AP y la capacidad de las celulas para formar depositos positivos para Rojo Alizarina. Resultados in vivo: Los explantes subcutaneos de celulas madre placentarias VITOSS® mostraron tincion inmunohistoqmmica positiva para osteocalcina humana, lo que demuestra el potencial osteogenico in vivo de las celulas madre placentarias. En el estudio del defecto craneal, los explantes de 3 semanas de celulas madre placentarias HEALOS™ presentaron una formacion osea considerable en histologfa y una mineralizacion de alta densidad en rayos X y PIXI; estas actividades osteogenicas se incrementaron a las 7 semanas despues del implante. En las FIGS. 24-26 se representan portaobjetos de histolog^a representativos, microradiograffas, y la medicion semicuantitativa de mineralizacion del area del defecto. Estos resultados demuestran la capacidad de las celulas madre placentarias, conjuntamente con un soporte, de aumentar el proceso de reparacion osea.
Conclusiones: las celulas madre placentarias adherentes se diferencian funcionalmente a lo largo de una ruta osteogenica dados los estfmulos apropiados in vitro, y demuestran un aumento significativo de la reparacion osea in vivo comparado con las condiciones sin celulas. Por lo tanto, a partir de estos estudios, concluimos que las celulas madre placentarias pueden usarse como un terapeutico celular en las aplicaciones de ingeniena de tejido oseo con soportes apropiados.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composicion que comprende celulas madre placentarias CD200+ adherentes para uso en el tratamiento de un defecto oseo en un sujeto, en donde dicha composicion se formula para ser implantable o inyectable.
2. Uso de una composicion en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un defecto oseo en un sujeto, en donde dicha composicion comprende celulas madre placentarias CD200+ adherentes, y en donde dicha composicion se formula para ser implantable o inyectable.
3. La composicion para uso de la reivindicacion 1 o el uso de la reivindicacion 2, en donde dichas celulas madre placentarias adherentes son adicionalmente CD73+ y CD105+.
4. La composicion para uso o el uso de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas celulas madre placentarias adherentes se han subcultivado al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces.
5. La composicion para uso o el uso de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho defecto oseo es una lesion osteolftica asociada con un cancer, una fractura osea, o una medula espinal que necesita fusion.
6. La composicion para uso o el uso de la reivindicacion 5, en donde dicha lesion osteolftica asociada con cancer es una lesion osteolftica asociada con mieloma multiple, cancer oseo, o cancer metastasico.
7. La composicion para uso o el uso de la reivindicacion 6, en donde dicho cancer es mieloma multiple.
8. La composicion para uso o el uso de la reivindicacion 6, en donde dicho cancer es cancer oseo.
9. La composicion para uso o el uso de la reivindicacion 6, en donde dicho cancer es cancer metastasico.
10. La composicion para uso o el uso de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha composicion se formula para ser inyectable en el sitio de dicho defecto oseo.
11. La composicion para uso o el uso de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha composicion es inyectable y se formula para administracion sistemica.
12. La composicion para uso o el uso de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha composicion comprende al menos 5 x 106 de dichas celulas madre placentarias por mililitro.
13. La composicion para uso o el uso de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha composicion comprende un sustrato o matriz implantable.
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