ES2646750T3 - Tratamiento de cánceres relacionados con hueso utilizando células madre placentarias - Google Patents

Tratamiento de cánceres relacionados con hueso utilizando células madre placentarias Download PDF

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Abstract

Células madre placentarias aisladas para su uso en un método para la supresión de la proliferación de células de un cáncer relacionado con hueso en un individuo humano, en donde el método consiste en poner en contacto dichas células de un cáncer relacionado con hueso, con una pluralidad de células madre placentarias, durante un tiempo suficiente para que dichas células madre placentarias supriman la proliferación de dichas células de un cáncer relacionado con hueso, en comparación con una pluralidad de dichas células de un cáncer relacionado con hueso que no se han puesto en contacto con células madre placentarias, en donde dichas células de un cáncer relacionado con hueso son células de condrosarcoma, células de cáncer de hueso, células de neuroblastoma, células de osteosarcoma, células de sarcoma de Ewing, células de cordoma, células de un histiocitoma fibroso maligno de hueso, o células de un fibrosarcoma de hueso, en donde dichas células madre placentarias son adherentes a plástico de cultivo tisular, son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometría de flujo, y no son trofoblastos, citotrofoblastos o células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea.

Description

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DESCRIPCION
Tratamiento de canceres relacionados con hueso utilizando celulas madre placentarias
1. Campo de la invencion
En la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo tisular (denominadas en la presente memoria PDAC) para su uso en metodos para tratar canceres relacionados con hueso, por ejemplo, para suprimir la proliferacion de celulas de canceres relacionados con hueso, p. ej., celulas de condrosarcoma, y para suprimir el crecimiento de canceres relacionados con hueso, por ejemplo, condrosarcoma y otros canceres relacionados con hueso, p. ej., tumores.
2. Antecedentes de la invencion
El mieloma multiple (tambien conocido como MM, mieloma, mieloma de celulas plasmaticas o enfermedad de Kahler) es un tipo de cancer de celulas plasmaticas, que son celulas del sistema inmunitario productoras de anticuerpos. Los smtomas del mieloma multiple incluyen, osteodinia, infeccion, insuficiencia renal, anemia y lesiones oseas. La enfermedad se considera incurable, y solo algunos tratamientos, tales como la lenalidomida (REVLIMID®) estan disponibles y son prometedores. Como tal, existe la necesidad de nuevos tratamientos para el mieloma multiple. Hasta la fecha, nadie ha descrito la capacidad de las celulas madre placentarias, no hematopoyeticas, adherentes a plastico de cultivo tisular para suprimir el crecimiento de canceres relacionados con hueso o para suprimir la proliferacion de celulas de canceres relacionados con hueso.
Por ejemplo, el documento WO 2008/051568 A2 describe metodos para el tratamiento de defectos oseos utilizando celulas madre placentarias, incluyendo defectos oseos causados por cancer. Li Xin et al (2008) describen los resultados de experimentos que examinan el efecto de celulas adherentes derivadas de placenta humana sobre mieloma multiple relacionado con enfermedad osea y proliferacion tumoral utilizando ratones. El documento WO 2009/045360 describe el uso de perfundido placentario que comprende linfocitos citolfticos naturales y linfocitos citolfticos naturales de dicho perfundido placentario en metodos de supresion del crecimiento o proliferacion de celulas tumorales.
3. Compendio de la invencion
En un aspecto de la invencion, se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para la supresion de la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso en un individuo humano, en donde el metodo consiste en poner en contacto dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, con una pluralidad de celulas madre placentarias, durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias supriman la proliferacion de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, en comparacion con una pluralidad de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso que no se han puesto en contacto con celulas madre placentarias, en donde dichas celulas de un cancer relacionado con hueso son celulas de condrosarcoma, celulas de cancer de hueso, celulas de neuroblastoma, celulas de osteosarcoma, celulas de sarcoma de Ewing, celulas de cordoma, celulas de un histiocitoma fibroso maligno de hueso, o celulas de un fibrosarcoma de hueso, y en donde dichas celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo tisular son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+ como puede detectarse por citometna de flujo, y no son trofoblastos, citotrofoblastos o celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion son CD34-, CD45-, CD10+, CD90+, CD105+ y CD200+; o CD34-, CD45-, CD10+, CD80-, CD86-, CD90+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo.
En determinadas realizaciones de las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, dicha puesta en contacto comprende la administracion de al menos 1 x 108 de dichas celulas madre placentarias a dicho individuo humano.
En determinadas realizaciones de las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, dicha puesta en contacto comprende administrar dichas celulas madre placentarias a dicho individuo en una lesion osea, o adyacente, causada por dicho cancer relacionado con hueso.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion suprimen al menos un 50 % la proliferacion de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso en comparacion con la proliferacion de un numero equivalente de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en ausencia de dichas celulas placentarias.
En otro aspecto de la invencion, se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para el tratamiento de un individuo humano que tiene un cancer relacionado con hueso, en donde el metodo consiste en la administracion a dicho individuo de una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias mejoren uno o mas smtomas, o reduzcan la progresion, de dicho cancer relacionado con hueso, en donde dicho cancer relacionado con hueso es
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condrosarcoma, cancer de hueso, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, cordoma, histiocitoma fibroso maligno o de hueso, o fibrosarcoma de hueso, y en donde dichas celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo celular son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+ como puede detectarse por citometna de flujo; y no son trofoblastos, citotrofoblastos o celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, y tienen la capacidad de diferenciarse en celulas osteogenicas o condrogenicas.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion son CD34-, CD45-, CD10+, CD90+, CD105+ y CD200+; o CD34-, CD45-, CD10+, CD80-, CD86-, CD90+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, se administran a dicho individuo humano por via intravenosa, o en una lesion osea, o adyacente, causada por dicho cancer relacionado con hueso.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, comprenden la administracion de al menos 1 x 108 celulas placentarias a dicho individuo humano.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, suprimen al menos un 50 % la proliferacion de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en comparacion con la proliferacion de un numero equivalente de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en ausencia de dichas celulas placentarias.
En lo sucesivo en la presente memoria, la referencia a celulas madre placentarias en el contexto de la invencion y sus realizaciones significa celulas madre placentarias como se ha definido anteriormente.
En un aspecto, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias aisladas de la invencion para su uso en metodos de tratamiento de un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de dichas celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo tisular aisladas, tambien denominadas en la presente memoria PDAC (Placenta Derived Adherent Cells, celulas adherentes derivadas de placenta), de poblaciones aisladas de dichas celulas madre placentarias, o de poblaciones aisladas de celulas que comprenden las celulas madre placentarias.
En una realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo de tratamiento de un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias, en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias mejora, por ejemplo, mejora de manera perceptible, uno o mas smtomas de, o reduce, por ejemplo, reduce de forma perceptible, la progresion de dicho cancer relacionado con hueso. En una realizacion espedfica, dicho cancer relacionado con hueso es condrosarcoma. En otras realizaciones, dicho cancer relacionado con hueso es cancer de hueso, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso, o fibrosarcoma de hueso. El cancer relacionado con hueso no es cancer de prostata. En otras realizaciones, dicho cancer relacionado con hueso comprende un tumor solido. En otra realizacion, dicho individuo es un mairnfero. En otra realizacion, dicho individuo es un ser humano. En otra realizacion, dicha administracion de dichas celulas madre placentarias da como resultado una mejora mayor, por ejemplo, perceptiblemente mayor, de dicho uno o mas smtomas que la administracion de un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea. Por ejemplo, dichas celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea son una o mas de CD34-, CD45-,CD73+ y / o CD105+ .
En determinadas realizaciones, dicho individuo presenta una lesion osea, p.ej., una lesion osea causada por dicho cancer relacionado con hueso, p. ej., una lesion osea visible en un radiograma de rayos X. En otras realizaciones, dicho individuo no presenta una lesion osea, p. ej., una lesion osea causada por dicho cancer relacionado con hueso, p. ej., una lesion osea visible en un radiograma de rayos X. En otras realizaciones, dicha administracion da como resultado un retraso en la aparicion o principio de lesiones oseas, p. ej., lesiones oseas causadas por dicho cancer relacionado con hueso, p. ej., como puede visualizarse en un radiograma de rayos X, o lesiones oseas causadas por tratamiento de un cancer
En determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias se administran a dicho individuo por via intravenosa. En otras realizaciones, el uso de las celulas madre placentarias de la invencion comprende administrar a dicho individuo al menos aproximadamente 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 o 1
x 1011 celulas madre placentarias, en terminos de numero total de celulas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias, han proliferado in vitro durante no mas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 generaciones poblacionales antes de dicha administracion. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias se administran a dicho individuo en una lesion osea, o adyacente a una lesion osea, p. ej., una lesion osea causada por dicho cancer relacionado con hueso. En otra realizacion, el metodo de tratamiento comprende adicionalmente administrar a dicho individuo uno o mas compuestos antineoplasicos. En otra realizacion de cualquiera de las realizaciones de la presente memoria, dichas celulas madre placentarias y/o BM-MSC se han crioconservado y descongelado antes de dicha administracion.
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varias veces antes de dicha administracion, y/o una o varias veces despues de dicha administracion, uno o mas de (1) un numero o grado de lesiones oseas en dicho individuo; (2) un numero de precursores de osteoclastos en dicho individuo; o (3) un numero de celulas de mieloma multiple en dicho individuo, p. ej., al menos una vez antes y al menos una vez despues de dicha administracion. En determinadas realizaciones, dicha cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias reduce, por ejemplo, reduce de manera perceptible, el numero o el grado de gravedad de, o reduce la tasa de aumento en el numero de o grado de gravedad, de dichas lesiones oseas en dicho individuo, p. ej., como se determina mediante densitometna osea o rayos X. En otras realizaciones, dicha cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias reduce, p. ej., reduce de manera perceptible, el numero de precursores de osteoclastos en dicho individuo, p. ej., como se determina utilizando un anticuerpo espedfico para precursores de osteoclastos para detectar precursores de osteoclastos, p. ej., en la sangre periferica o en la medula osea del individuo. En otras realizaciones, dicha cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias reduce el numero de celulas cancerosas relacionadas con hueso en dicho individuo, p. ej., como puede determinarse mediante recuento celular (por ejemplo, por citometna de flujo), o tincion de anticuerpo, de celulas sangumeas nucleadas de dicho individuo utilizando un anticuerpo espedfico para dichas celulas, por ejemplo, celulas de plasma, por ejemplo, un anticuerpo espedfico para marcadores celulares CD28 o CD138, o como puede determinarse mediante la evaluacion del nivel de protemas M en la sangre del individuo. En otras realizaciones, dichas celulas madre placentarias reducen el numero de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en al menos, p. ej., 10%, 15%, 20%, 25% , 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% en comparacion con el numero de dichas celulas antes de la administracion de dichas celulas madre placentarias.
En otra realizacion, el individuo tiene condrosarcoma; por ej., el cancer relacionado con hueso es condrosarcoma. En determinadas realizaciones, el uso de celulas madre placentarias de la invencion comprende determinar, una o varias veces antes de dicha administracion, y/o una o varias veces despues de dicha administracion, una o mas de diversas celulas de condrosarcoma en el individuo o el numero de lesiones oseas (p. ej., masas causadas por condrosarcoma) en el individuo.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para suprimir la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso, que comprende poner en contacto dichas celulas de un cancer relacionado con hueso con una pluralidad de celulas madre placentarias durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias supriman, p. ej., supriman de manera perceptible, la proliferacion de dichas celulas de cancer relacionado con hueso, en comparacion con una pluralidad de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso que no se han puesto en contacto con celulas madre placentarias, p. ej., como puede determinarse mediante una reduccion, por ejemplo, una reduccion perceptible, en el numero de dichas celulas cancerosas relacionadas con hueso, o una reduccion perceptible en el aumento del numero de dichas celulas cancerosas relacionadas con hueso. En otra realizacion del metodo, dichas celulas de un cancer relacionado con hueso son celulas de condrosarcoma. En otras realizaciones, dichas celulas de un cancer relacionado con hueso son celulas de cancer de hueso, celulas de neuroblastoma, celulas de osteosarcoma, celulas de sarcoma de Ewing, celulas de cordoma, celulas de un histiocitoma fibroso maligno de hueso o celulas de un fibrosarcoma de hueso. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de un cancer relacionado con hueso son parte de un tumor solido.
En determinadas realizaciones del metodo, dicha puesta en contacto se realiza in vitro. En otras realizaciones determinadas, dicha puesta en contacto se realiza in vivo. En determinadas realizaciones, dicha puesta en contacto se realiza en un individuo que comprende dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, en un individuo que tiene una enfermedad causada por dichas celulas. En determinadas realizaciones, dicho individuo es un mairnfero, por ejemplo, un ser humano. En otra realizacion espedfica, dicha puesta en contacto comprende la administracion de dichas celulas madre placentarias a dicho individuo por via intravenosa. En otra realizacion espedfica, dicha puesta en contacto comprende la administracion de dichas celulas madre placentarias a dicho individuo en una lesion osea, o adyacente a una lesion osea, en el individuo.
En otra realizacion, el uso de las celulas madre placentarias de la invencion para suprimir la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso, comprende adicionalmente poner en contacto dichas celulas de un cancer relacionado con hueso con uno o mas compuestos antineoplasicos, por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas compuestos antineoplasicos. En otra realizacion, el uso de las celulas madre placentarias de la invencion comprende administrar a dicho individuo al menos aproximadamente 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109 o 1 x 1010 celulas madre placentarias. En determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias se han proliferado in vitro durante no mas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 generaciones poblacionales. En otras realizaciones, dichas celulas madre placentarias de la invencion suprimen la proliferacion de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en al menos, por ejemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, en comparacion con la proliferacion de un numero equivalente de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en ausencia de dichas celulas madre placentarias, por ejemplo, como puede determinarse mediante una reduccion perceptible en el numero de dichas celulas cancerosas relacionadas con hueso, o mediante una reduccion perceptible en el aumento de dichas celulas cancerosas relacionadas con hueso, o como puede determinarse mediante una reduccion perceptible en el numero y/o gravedad de lesiones de hueso en un individuo que tiene dichas celulas cancerosas.
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En otras realizaciones, dichas celulas madre placentarias se han crioconservado y descongelado antes de dicha puesta en contacto. En otra realizacion, el uso de las celulas madre de la invencion comprende determinar que dichas celulas madre placentarias suprimen, p. ej., suprimen de manera perceptible, la proliferacion de una muestra de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso antes de dicha puesta en contacto.
En otra realizacion el uso de las celulas madre placentarias de la invencion reduce la maduracion de precursores de osteoclastos en osteoclastos, cuando dichos precursores de osteoclastos se ponen en contacto con una pluralidad de celulas madre placentarias, en donde dicha pluralidad de celulas madre placentarias es un numero de celulas suficiente para reducir, por ejemplo, reducir de forma perceptible, la maduracion de osteoclastos de dichos precursores de osteoclastos, por ejemplo, como puede determinarse mediante una reduccion perceptible o falta de aumento en el numero de osteoclastos como resultado de dicha puesta en contacto. En otra realizacion, el uso de las celulas madre placentarias de la invencion aumenta la apoptosis de precursores de osteoclastos, cuando dichos precursores de osteoclastos se ponen en contacto con una pluralidad de celulas madre placentarias en donde dicha pluralidad de celulas madre placentarias es un numero de celulas suficiente para aumentar, por ejemplo, aumentar de forma perceptible, la apoptosis de precursores de osteoclastos. Dicho aumento en la apoptosis de precursores de osteoclastos puede detectarse mediante un aumento perceptible en la tincion con anexina V y/o yoduro de propidio de precursores de osteoclastos de dicho individuo. En algunos casaos, los precursores de osteoclastos estan en un individuo, por ejemplo, un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, mieloma multiple, condrosarcoma, o uno de los otros canceres relacionados con hueso descritos en la presente memoria. En ciertos otros casos, el metodo comprende poner en contacto dichos precursores de osteoclastos con lenalidomida, por ejemplo, administrando lenalidomida a un individuo que tiene dichos precursores de osteoclastos.
En determinadas realizaciones de los metodos anteriores, dicha puesta en contacto tiene lugar in vitro. En otras realizaciones, dicha puesta en contacto tiene lugar in vivo. En otra realizacion, dicha puesta en contacto tiene lugar en un ser humano. En otra realizacion, dicha puesta en contacto tiene lugar en un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, un individuo que tiene celulas de un cancer relacionado con hueso, o una enfermedad causada por dichas celulas. En otros casos, dicho individuo es un individuo que tiene mieloma multiple o celulas de mieloma multiple, o en donde dicho individuo tiene al menos un smtoma de mieloma multiple. En otro caso, dicho individuo tiene al menos una lesion osea causada por mieloma multiple.
En determinadas realizaciones de cualquiera de los metodos anteriores, dichas celulas madre placentarias son: adherentes a plastico de cultivo tisular; (2) CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+ como puede detectarse por citometna de flujo; y tienen la capacidad de diferenciarse en celulas osteogenicas o condrogenicas, por ejemplo, in vitro o in vivo, o ambas cosas. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adherentes a plastico de cultivo tisular; CD34, CD10+, CD105+ y CD200+ como puede detectarse por citometna de flujo; y tienen la capacidad de diferenciarse en celulas que tienen una o mas caractensticas de celulas osteogenicas o condrogenicas, por ejemplo, caractensticas de osteocitos o condrocitos, por ejemplo, in vitro o in vivo, o ambas cosas. En otras realizaciones, las celulas madre placentarias tienen adicionalmente la capacidad de diferenciarse en celulas que tienen una o mas caractensticas de celulas neuronales o celulas neurogenicas, por ejemplo, caractensticas de neuronas; una o mas caractensticas de celulas gliales, p. ej., caractensticas de glia o astrocitos; una o mas caractensticas de celulas adipocfticas, p. ej., caractensticas de adipocitos; una o mas caractensticas de las celulas pancreaticas; y/o una o mas caractensticas de las celulas cardfacas. En una realizacion espedfica de cada una de las realizaciones de celulas madre placentarias en esta memoria descriptiva, las celulas madre placentarias son celulas madre placentarias aisladas.
En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, y una o mas de CD44+, CD45-, CD90+, CD166+, KDR- o CD133-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, CD44+, CD45-, CD90+, CD166+, KDR- y CD133-. En otra realizacion, las celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+y CD200+, y uno o mas de HLA ABC+, HLA DR, DQ, DP-, CD80-, CD86-, CD98- o PD-L1+. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, HLA ABC+, HLA DR, DQ, DP-, CD80-, CD86-, CD98- y PD-L1+. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+y CD200+, y uno o mas de CD38-, CD45-, CD80-, CD86-, CD133-, HLA-DR, DP, DQ-, SSEA3-, SSEA4-, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, HLA-A,B,C+, PDL1+, ABC-p+y/u OCT- 4+, como puede detectarse por citometna de flujo y / o RT-PCR. En otra realizacion, las celulas madre placentarias son CD34-, CD45-, CD10+, CD90+, CD105+y cD200+, como puede detectarse por citometna de flujo. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD45-, CD10+, CD80-, CD86-, CD90+, CD105 + y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD45-, CD10+, CD80-, CD86', CD90+, CD105 + y CD200+, y ademas, una o mas de CD29+, CD38-, CD44+ , CD54+, SH3+ o SH4+, como puede detectarse por citometna de flujo. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD38', CD45', CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD73+, CD80', CD86', CD90+, CD105+y CD200+como
puede detectarse por citometna de flujo.
En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+y CD200+son adicionalmente una o mas de CD3-, CD9-, CD117-, CD133-, CD146+, CD166+, KDR-( VEGFR2-), HLA-A, B, C+, HLA-DP, DQ, DR-, o Ligando 1 de Muerte programada (PDL1)+, o cualquier combinacion de los mismos. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias son CD3-, CD9-, CD34-, CD38-, CD45-, CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD73+, CD80-, CD86-, CD90+, CD105+, CD117-, CD133-, CD146+, CD166+, CD200+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A, B, C+, HLA-
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DP, DQ, DR- o Ligando 1 de Muerte programada (PDL1)+, como puede detectarse por citometna de flujo.
En otra realizacion, cualquiera de las celulas madre placentarias proporcionadas en la presente memoria para su uso en la invencion, son adicionalmente ABC-p+, como puede detectarse por citometna de flujo, u OCT- 4+(POU5F1+), por ejemplo, como puede determinarse por RT-PCR, en donde ABC-p es una protema transportadora ABC espedfica de placenta (tambien conocida como protema de resistencia al cancer de mama (BCRP, breast cancer resistance protein) y como protema de resistencia a mitoxantrona (MXR, mitoxantrone resistance protein)). En otra realizacion, cualquiera de las celulas madre placentarias proporcionadas en esta memoria son adicionalmente SSEA3- o SSEA4-, por ejemplo, como puede detectarse por citometna de flujo, en donde SSEA3 es Antfgeno Embrionario Espedfico de Fase 3 y SSEA4 es Antigeno Embrionario Espedfico de Fase
4. En otra realizacion, cualquiera de las celulas madre placentarias proporcionadas en la presente memoria son adicionalmente SSEA3- o SSEA4-.
En otra realizacion cualquiera de las poblaciones de celulas madre placentarias de celulas madre placentarias aisladas descritas para su uso en la invencion, son adicionalmente una o mas de MHC-I + (por ejemplo, HLA-A, B, C+), MHC-II' (p. ej., HLA-DP, DQ, DR-) o HLA-G-. En otra realizacion, cualquiera de las celulas madre placentarias proporcionadas en esta memoria son adicionalmente cada una de MHC-I+(p.e/., HLA-A,B,C+), MHC-II- (p.ej., HLA- DP,DQ,DR') y HLA-G.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias CD34', CD10+, CD105+, CD200+son adicionalmente una o mas de CD3-, CD9-, CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, CD80-, CD86-, CD146+, CD166+, SH3+ o SH4+ . En otra realizacion, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD44+. En otra realizacion, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente uno o mas de CD3-, CD9-, CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+(CD73+), SH4+(CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+(CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4-, CD133-, OCT- 4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR-(VEGFR2-, HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, HLA-G-, o Ligando 1 de Muerte Programada (PDL1)+, o cualquier combinacion de los mismos. En otra realizacion, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+son adicionalmente CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+(CD73+), SH4+(CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+(CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144 VE-cadherinadim , CD146+, CD166+, CD184/CXCR4-, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, HLA-G-y Ligando 1 de Muerte Programada (PDL1)+.
En otras realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion son CD34', CD10+, CD105+y CD200+, adicionalmente dichas celulas madre placentarias aisladas son CD200+y HLA-G-; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+y OCT-4+; CD73+, CD105+y HLA-G'; CD73+y CD105+; u OCT-4+, o cualquier combinacion de los mismos.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, y adicionalmente una o mas de CD29+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, MHC-I+ o ABC-p+, donde ABC-p es una protema transportadora ABC espedfica de placenta (tambien conocida como protema de resistencia al cancer de mama (BCRP) y como protema de resistencia a mitoxantrona (MXR)). En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente CD29+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4- y OCT-4+. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente, CD29+, CD38-, CD45-, CD54+, SH2+, SH3+ y SH4+. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente, CD29+, CD38-,CD45-, CD54+, SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente, CD29+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, MHC-1+, SH2+, SH3+, SH4+. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente OCT-4+y ABC-p+. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4 +. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente OCT-4+, CD34-, SSEA3-y SSEA4-. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias OCT-4+, CD34-, SSEA3-y SSEA4-son adicionalmente CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+y SH4+. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente OCT-4+ y CD34-, y cualquiera de SH3+ o SH4+. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente CD29+, CD44+, CD54+, CD90+ u OCT-4+. En un aspecto espedfico, las celulas madre placentarias para su uso en la invencion son CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+y CD200+, y adicionalmente una o mas de CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM-, CD62-E-, CD62-L-, CD62-P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD106 VCAM+, CD144/VE-cadherinadim, CD184/CXCR4-, p2-microglobulinadim, MHC-ldim, MHC-II-, HLA-Gdim y/o PDL1dim En determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias o poblacion de celulas madre placentarias aisladas, son al adicionalmente al menos CD29+ y CD54- . En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son adicionalmente al menos CD44+ y CD106+. En alternativa, dichas celulas madre placentarias son al menos CD29+.
En determinadas realizaciones de cualquiera de las caractensticas anteriores, la expresion del marcador celular (por ejemplo, grupo de diferenciacion o marcador inmunogenico) se determina por citometna de flujo. En otras realizaciones determinadas, la expresion del marcador celular se determina por rT-PCR.
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CD200+, por ejemplo, las celulas en el agregado, expresan uno o mas genes a un nivel mas alto, por ejemplo, un nivel perceptiblemente mas alto, que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, en donde dicho uno o mas genes son uno o mas, o todos, de ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A, y en donde dichas celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea se han sometido a una serie de pases en cultivo equivalentes al numero de pases al que se han sometido dichas celulas madre placentarias aisladas. En determinadas realizaciones, dicha expresion de dicho uno o mas genes se determina, por ejemplo, por RT-PCR o analisis de micromatrices, por ejemplo, utilizando un micromatriz U133-A (Affymetrix). En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias expresan, p. ej., expresan diferencialmente, dicho uno o mas genes cuando se cultivan durante, por ejemplo, entre aproximadamente 3 a aproximadamente 35 generaciones poblacionales, en un medio que comprende DMEM-LG al 60% (por ejemplo, de Gibco) y MCDB-201 al 40% (por ejemplo, de Sigma); suero bovino fetal al 2% (p. ej., de Hyclone Labs.), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BsA); dexametasona 10-9 M (p. ej., de Sigma); acido 2-fosfato ascorbico 10-4 M (p. ej., de Sigma); factor de crecimiento epidermico 10 ng/ml (por ejemplo, de R & D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) l0 ng/ml (p. ej., de R & D Systems). En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias expresan, por ejemplo, expresan diferencialmente, dicho uno o mas genes cuando se cultivan durante desde aproximadamente 3 a aproximadamente 35 generaciones poblacionales en un medio que comprende DMEM-LG al 60% (por ejemplo, de Gibco) y MCDB-201 al 40% (por ejemplo, de Sigma); suero bovino fetal al 2% (p. ej., de Hyclone Labs.); 1x insulina-transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10-9 M (p. ej., de Sigma); acido 2-fosfato ascorbico 10-4 M (p. ej., de Sigma); factor de crecimiento epidermico 10 ng/ml (por ejemplo, de R & D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (p. ej., de R & D Systems.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias expresan CD200 y ARTS 1 (regulador de aminopeptidasa del factor de necrosis tumoral de tipo 1); ARTS-1 y LRAP (arginina aminopeptidasa derivada de leucocitos); IL6 (interleucina-6) y TGFB2 (factor de crecimiento transformante, beta 2); IL6 y KRT18 (queratina 18); IER3 (respuesta temprana inmediata 3), MEST (homologo del transcrito espedfico del mesodermo) y TGFB2; CD200 e IER3; CD200 e IL6; CD200 y KRT18; CD200 y LRAP; CD200 y MEST; CD200 y NFE2L3 (factor nuclear (derivado de eritroide 2) - similar al 3); o CD200 y TGFB2 a un nivel mas alto, por ejemplo, a un nivel perceptiblemente mas alto, que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea (BM-MSC, bone-marrow-derived mesenchymal stem cells) en donde dichas celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea se han sometido a una serie de pases en cultivo equivalente al numero de pases al que se han sometido dichas celulas madre placentarias. En otras realizaciones, las celulas madre placentarias expresan ARTS-1, CD200, IL6 y LRAP; ARTS-1, IL6, TGFB2, IER3, KRT18 y MEST; CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3 y TGFB2; ARTS-1, CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3 y TGFB2; o IER3, MEST y TGFB2 a un nivel mas alto, por ejemplo, a un nivel perceptiblemente mas alto, que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, BM-MSC, en donde dichas celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea se han sometido a una serie de pases en cultivo equivalente al numero de pases al que se han sometido las celulas madre placentarias.
En varias realizaciones, dichas celulas madre placentarias utiles en los metodos descritos en la presente memoria, estan contenidas en una poblacion de celulas, de las cuales, al menos un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas son dichas celulas madre placentarias. En otras realizaciones determinadas, las celulas madre placentarias en dicha poblacion de celulas carecen sustancialmente de celulas que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas madre placentarias en dicha poblacion tiene un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal. En otras realizaciones determinadas, la poblacion de celulas que comprende dichas celulas madre placentarias carece sustancialmente de celulas que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas en dicha poblacion tienen un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal. En otras realizaciones determinadas , la poblacion de celulas que comprende dichas celulas madre placentarias comprende celulas que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas en dicha poblacion tiene un genotipo materno, es decir, son de origen materno.
En una realizacion de cualquiera de las realizaciones de celulas madre placentarias de la presente memoria, las celulas madre placentarias facilitan la formacion de uno o mas cuerpos similares a embriones en una poblacion de celulas placentarias que comprenden dichas celulas madre placentarias aisladas cuando se cultiva dicha poblacion bajo condiciones que permiten la formacion de un cuerpo similar a un embrion, por ejemplo, un cultivo en condiciones de proliferacion).
En determinadas realizaciones de cualquiera de las celulas madre placentarias para su uso en la invencion, las celulas son celulas de mairnfero, por ejemplo, de ser humano.
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autologas para un receptor, por ejemplo, para un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, o que tiene un smtoma de un cancer relacionado con hueso. En otras realizaciones determinadas, dichas celulas madre placentarias son alogenicas para un receptor, por ejemplo, para un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, o que tiene un smtoma de un cancer relacionado con hueso.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias de la invencion para su uso en los metodos de tratamiento o metodos de supresion de la proliferacion de celulas cancerosas relacionadas con hueso descritas en la presente memoria, se crioconservan antes de dicha administracion. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias se obtienen de un banco de celulas, por ejemplo, un banco de celulas madre placentarias.
En cualquiera de las realizaciones de celulas madre placentarias para su uso en la invencion, las celulas madre placentarias generalmente no se diferencian durante el cultivo en medio de crecimiento, es decir, medio formulado para promover la proliferacion, por ejemplo, durante la proliferacion en medio de crecimiento. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias no requieren una capa alimentadora para proliferar, por ejemplo, no requieren una capa alimentadora para proliferar cuando se cultivan en medio de crecimiento. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias no se diferencian unicamente en cultivo como resultado del cultivo sin una capa alimentadora de celulas.
Las BM-MSC aisladas en la presente memoria, generalmente no se diferencian durante el cultivo en medio de crecimiento, es decir, medio formulado para promover la proliferacion, por ejemplo, durante la proliferacion en medio de crecimiento. Ademas, dichas BM-MSC aisladas no requieren una capa alimentadora para proliferar, por ejemplo, no requieren una capa alimentadora para proliferar cuando se cultivan en medio de crecimiento. Dichas BM-MSC aisladas no se diferencian en unicamente en cultivo como resultado del cultivo sin una capa alimentadora de celulas.
En determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias para su uso en la invencion se obtienen por perfusion de una placenta posparto cuya sangre se ha extrafdo y perfundido para eliminar la sangre residual; cuya sangre se ha extrafdo pero no se ha perfundido para eliminar la sangre residual; o cuya sangre ni se ha extrafdo ni perfundido para eliminar la sangre residual. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se obtienen por alteracion ffsica y / o enzimatica del tejido placentario. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se obtienen cultivando una porcion de una placenta y permitiendo que las celulas madre placentarias proliferen fuera de dicha porcion de placenta.
Mas adelante, en la Seccion 5.2, se describen con detalle los marcadores de superficie celular, los marcadores moleculares y los marcadores geneticos caractensticos de las celulas madre placentarias utiles en los metodos proporcionados en la presente memoria.
En otra realizacion espedfica de las celulas madre placentarias para su uso en la invencion, una cantidad terapeuticamente eficaz de dichas celulas madre placentarias es una cantidad de celulas que da como resultado la eliminacion de, una mejora perceptible en, la disminucion de la gravedad de, o la disminucion de la velocidad de la progresion de uno o mas smtomas de, un cancer relacionado con hueso. En una realizacion espedfica, dicho smtoma de un cancer relacionado con hueso, es una lesion osea. En otra realizacion espedfica, dicha cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias aumenta, por ejemplo, aumenta de forma perceptible, la densidad mineral osea (BMD, bone mineral density) en al menos un hueso de un individuo que recibe las celulas, por ejemplo, tal y como se mide por densitometna, o contenido mineral oseo (BMC, bone mineral content), por ejemplo, tal como se mide por densitometna. En otra realizacion espedfica, dicha cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias reduce, p. ej., reduce de forma perceptible, una lesion osea, por ejemplo, al menos una lesion osea, causada por dicho cancer relacionado con hueso, por ejemplo, tal como es como visible por rayos X, RM o TAC, o similar.
En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias para su uso en la invencion se administran a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, en, o adyacente a, una lesion osea causada por dicho cancer relacionado con hueso, es decir, por via intralesional. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas se administran mediante inyeccion en embolada. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se administran por infusion intravenosa. En una realizacion espedfica, dicha infusion intravenosa es infusion intravenosa durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 8 horas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se administran por via intracraneal. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas se administran por via intraperitoneal. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se administran por via intraarterial. En otra realizacion espedfica dichas celulas madre placentarias se administran por via intramuscular, intradermica, subcutanea o intraocular.
En otra realizacion dichas celulas madre placentarias para su uso en la invencion, se administran implantando quirurgicamente a dicho individuo una composicion de materia que comprende dichas celulas, por ejemplo, en, o adyacente a, una lesion osea causada por un cancer relacionado con hueso. En una realizacion espedfica, dicha composicion de materia es una matriz o un armazon. En otra realizacion espedfica, dicha matriz o armazon es un hidrogel. En otra realizacion espedfica, dicha matriz o armazon es un tejido descelularizado. En otra realizacion espedfica, dicha matriz o armazon es una composicion sintetica biodegradable. En otra realizacion espedfica, dicha matriz o armazon es una espuma. En otra realizacion espedfica, dicha matriz o armazon es un material ceramico
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fisiologicamente aceptable, por ejemplo, mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri-y tetra fosfato de calcio, hidroxiapatita, una fluoroapatita, un sulfato de calcio, un fluoruro de calcio, un oxido de calcio, un carbonato de calcio, un fosfato de calcio y magnesio, un vidrio biologicamente activo (por ejemplo, BIOGLASS®) o una mezcla de cualquiera de ellos. En otra realizacion espedfica, dicha matriz o armazon es un material ceramico biocompatible poroso (por ejemplo, SURGIBONE®, ENDOBON®, CEROS® o similar) o un producto mineralizado de injerto de colageno oseo (por ejemplo, HEALOS™, VITOSS®, RHAKOSS™ y CORTOSS®, o similares).
En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias para su uso en la invencion, se administran una vez a dicho individuo. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se administran a dicho individuo en dos o mas administraciones distintas. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar entre aproximadamente 1 x 10 4 y 1 x 10 5 celulas madre placentarias, por ejemplo, por kilogramo de dicho individuo. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar entre aproximadamente 1 x 10 5 y 1 x 10 6 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar entre aproximadamente 1 x 10 6 y 1 x 10 7 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar entre aproximadamente 1 x 10 7 y 1 x 10 8 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo. En otras realizaciones espedficas dicha administracion comprende administrar entre aproximadamente 1 x 106 y
aproximadamente 2 x 10 6 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 2 x 106 y aproximadamente 3 x 106 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 3 x 106 y aproximadamente 4 x 106 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 4 x 10 6 y aproximadamente 5 x 10 6 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 5 x 10 6 y aproximadamente 6 x 10 6 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 6 x 106 y aproximadamente 7 x 106 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 7 x 10 6 y aproximadamente 8 x 10 6 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo; entre aproximadamente 8 x 10 6 y aproximadamente 9 x
106 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo; o entre aproximadamente 9 x 106 y
aproximadamente 1 x 107 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar a dicho individuo entre aproximadamente 1 x107y aproximadamente 2 x 107 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar a dicho individuo entre aproximadamente 1,3 x107y aproximadamente 1,5 x 10 7 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar a dicho individuo hasta aproximadamente 3 x 10 7 celulas madre placentarias por kilogramo de dicho individuo. En una realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar a dicho individuo entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 2 x 107 celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar a dicho individuo
aproximadamente 150 x 10 6 celulas madre placentarias en aproximadamente 20 mililitros de solucion.
En una realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar a dicho individuo entre aproximadamente 5 x 10 6 y aproximadamente 2 x 10 7 celulas madre placentarias, en donde dichas celulas estan contenidas en una solucion que comprende dextrano al 10%, por ejemplo, dextrano-40, albumina de suero humano al 5% y opcionalmente un inmunosupresor.
En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar, por via intravenosa, entre aproximadamente 5 x 107y 3 x 109 celulas madre placentarias. En realizaciones espedficas, dicha administracion comprende administrar, por via intravenosa, aproximadamente 9 x 108 celulas madre placentarias o aproximadamente 1,8 x 109 celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar, por via intralesional, entre aproximadamente 5 x 107 y 1 x 108 celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dicha administracion comprende administrar, por via intralesional, aproximadamente 9 x 10 7celulas madre placentarias.
En otra realizacion espedfica del metodo de tratamiento, dichas celulas madre placentarias se administran a dicho individuo a los 21-30 dfas, por ejemplo, a los 21 dfas; a los 7 dfas; a las 48 horas; o a las 24 horas del diagnostico de un cancer relacionado con hueso, como se describe en la presente invencion, o del desarrollo de uno o mas smtomas de un cancer relacionado con hueso.
Las celulas madre placentarias utilizadas en los metodos proporcionados en la presente memoria pueden, en determinadas realizaciones, modificarse mediante ingeniena genetica para producir una o mas protemas que suprimen el crecimiento o la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso, como se describe en la presente invencion. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, dicha una o mas protemas pueden comprender osteoprotegerina, una o mas protemas morfogeneticas oseas (BMP, bone morphogenetic proteins); una o mas conexinas, por ejemplo, conexina 26 (Cx26) y/o conexina 43 (Cx43); osteocontina; o activina A. En otras realizaciones, las celulas madre placentarias se han modificado mediante ingeniena genetica para expresar IFN-p o IL-2 exogenos, por ejemplo, en una cantidad que da como resultado una mayor supresion, p. ej., perceptiblemente mayor, de la proliferacion celular tumoral, cuando dichas celulas tumorales se ponen en contacto con dichas celulas madre placentarias, en comparacion con dichas celulas que no expresan IFN-p o IL-2 exogenos. En la presente memoria tambien se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden dichas celulas madre placentarias modificadas mediante ingeniena genetica, para su uso en la supresion del crecimiento o proliferacion de dichas
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celulas cancerosas relacionadas con hueso, o para tratar a un individuo que tenga dichas celulas cancerosas relacionadas con hueso.
3.1 Definiciones
Segun se usa en esta memoria, el termino "aproximadamente", cuando se refiere a un valor numerico establecido, indica un valor dentro de mas o menos 10% del valor numerico establecido.
Como se usa en la presente memoria, "lesion osea", en el contexto de un cancer relacionado con hueso, significa una anomalfa en el crecimiento o estructura de un hueso, ocasionada por el cancer relacionado con hueso, o que es un smtoma de dicho cancer. En un ejemplo no limitante, el mieloma multiple generalmente causa lesiones oseas lfficas, que son areas socavadas de un hueso causadas por la desmineralizacion del hueso. En otro ejemplo no limitante, el condrosarcoma generalmente causa lesiones caracterizadas por un crecimiento en uno o mas huesos, que generalmente comprende un crecimiento cartilaginoso que puede calcificarse.
Como se usa en esta memoria, las "celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea", tambien denominadas BM-MSC, se refieren a celulas madre mesenquimatosas obtenidas de medula osea, o cultivadas a partir de celulas madre mesenquimatosas obtenidas de medula osea, por ejemplo, las celulas descritas en la Patente de Estados Unidos N° 5.486.359.
Como se usa en esta memoria, el termino "cancer relacionado con hueso" se refiere a un cancer que, en cualquier fase de la enfermedad, afecta o metastatiza a uno o mas huesos en un individuo que tiene el cancer. Por ejemplo, el mieloma multiple es un cancer relacionado con hueso porque el cancer afecta a los huesos; un aspecto del mieloma multiple es el desarrollo de lesiones oseas debidas, al menos en parte, a la regulacion positiva de la actividad osteoclastica resultante de las citocinas secretadas por las celulas de mieloma multiple.
Como se usa en esta memoria, "poner en contacto", en el contexto de poner en contacto las celulas madre placentarias con celulas de un cancer relacionado con hueso, incluye, pero no requiere, poner las celulas proximas entre sf, de tal manera que realmente entren en contacto ffsicamente entre sf, (p. ej., en cocultivo, en una placa multipocillo o similar), y poner las celulas en el mismo espacio, sin contacto ffsico real, pero en el mismo espacio, por ejemplo, en un sistema de cultivo TRANSWELL® o administracion a un individuo, por ejemplo, un ser humano. "Poner en contacto", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye asociar in vitro las celulas madre placentarias y las celulas de cancer relacionado con hueso, por ejemplo, en un solo recipiente (por ejemplo, una placa de cultivo, un matraz, un vial, etc.). "Poner en contacto" tambien incluye asociar in vivo las celulas madre placentarias y las celulas tumorales, por ejemplo, en el mismo individuo (por ejemplo, en un mairnfero, por ejemplo, en un raton, una rata, un perro, un gato, una oveja, una cabra, un caballo, un ser humano, etc.). Por ejemplo, las celulas madre placentarias pueden ponerse en contacto con celulas cancerosas relacionadas con hueso administrando, por via intravenosa a un individuo que tiene dicho cancer relacionado con hueso, las celulas madre placentarias, o mediante inyeccion directa en el lugar de un tumor, por ejemplo, en una lesion osea causada por un cancer relacionado con hueso, o similar. Las celulas madre placentarias pueden ponerse en contacto con celulas cancerosas relacionadas con hueso administrando, por via intravenosa, por ejemplo, a un animal experimental, las celulas madre placentarias y las celulas cancerosas relacionadas con hueso,
Como se usa en esta memoria, el termino "SH2" se refiere a un anticuerpo que se une a un epffopo en el marcador celular CD105. Por lo tanto, las celulas a las que se hace referencia como SH2+ son CD105 +.
Como se usa en esta memoria, los terminos "SH3" y SH4 "se refieren a anticuerpos que se unen a epftopos presentes en el marcador celular CD73. Por lo tanto, las celulas a las que se hace referencia como SH3+ y/o SH4+ son CD73+.
Una placenta tiene el genotipo del feto que se desarrolla en su interior, pero tambien esta en estrecho contacto ffsico con los tejidos maternos durante la gestacion. Como tal, como se usa en la presente memoria, la expresion “genotipo fetal" significa el genotipo del feto, por ejemplo, el genotipo del feto asociado a la placenta a partir de la cual se obtienen celulas madre placentarias aisladas particulares, como se describe en esta memoria, a diferencia del genotipo de la madre que gestaba el feto. Tal como se usa en esta memoria, la expresion "genotipo materno" significa el genotipo de la madre que gestaba el feto, por ejemplo, el feto asociado a la placenta a partir de la cual se obtienen celulas madre placentarias aisladas particulares, como se describe en la presente memoria.
Como se usa en esta memoria, las celulas madre, p. ej., las celulas madre placentarias, se "afslan" si al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o al menos el 99% de las otras celulas con las que las celulas madre se asocian de manera natural, se elimina de las celulas madre, por ejemplo, durante la recogida y/o cultivo de las celulas madre.
Como se usa en esta memoria, "multipotente", cuando se refiere a una celula, significa que la celula tiene la capacidad de diferenciarse en algunos, pero no necesariamente en todos, tipos de celulas del cuerpo, o en celulas que tienen caracteffsticas de algunos, pero no de todos, los tipos de celulas del cuerpo, o en celulas de una o mas de las tres capas germinales. En determinadas realizaciones, por ejemplo, las celulas madre placentarias (PDAC, Placenta Derived Adherent Cells, celulas adherentes derivadas de placenta) aisladas, como se describe mas
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adelante en la Seccion 5.2, que tienen la capacidad de diferenciarse en celulas que tienen caractensticas de celulas neurogenicas, condrogenicas y/u osteogenicas son celulas multipotentes.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "poblacion de celulas aislada" significa una poblacion de celulas que esta sustancialmente separada de otras celulas del tejido, por ejemplo, placenta, de la que se obtiene o afsla la poblacion de celulas. En determinadas realizaciones, la poblacion de celulas se separa de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de otras celulas del tejido, por ejemplo, placenta, de la que se obtiene o afsla la poblacion de celulas.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "celula madre placentaria" se refiere a una celula madre o celula progenitora que procede de una placenta mamaria, por ejemplo, como se describe a continuacion, ya sea como un aislado primario o como una celula cultivada independientemente de si la celula es una celula primaria, parte de un cultivo celular primario, o de si procede de la realizacion de pases despues de un cultivo primario. Una celula, por ejemplo, una "celula madre placentaria", se considera una "celula madre" si la celula muestra uno, dos o los tres marcadores o perfiles de expresion genica asociados a uno o mas tipos de celulas madre; la capacidad de replicarse al menos 10-40 veces en cultivo; y la capacidad de diferenciarse en celulas que muestran caractensticas de celulas diferenciadas de una o mas de las tres capas germinales. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, el termino "placentario(a)" incluye el cordon umbilical. En determinadas realizaciones, las celulas placentarias aisladas, p. ej, celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, se diferencian en in vitro (en condiciones diferenciadoras), se diferencian in vivo o ambas cosas.
Como se usa en la presente memoria, una celula o poblacion de celulas es "positiva" para un marcador particular, cuando este marcador puede detectarse por encima del fondo, por ejemplo, a traves de deteccion mediada por anticuerpos o mediada por acidos nucleicos. La deteccion de un marcador particular puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando anticuerpos, o sondas de oligonucleotidos o cebadores basados en la secuencia del gen o ARNm que codifica el marcador. Por ejemplo, una celula madre placentaria es positiva, por ejemplo, para CD73 porque CD73 es perceptible en celulas madre placentarias en una cantidad mayor, por ejemplo, perceptiblemente mayor, que el fondo (en comparacion, por ejemplo, con un control de isotipo de anticuerpo). Una celula tambien es positiva para un marcador cuando ese marcador puede utilizarse para distinguir la celula de al menos otro tipo de celula, o cuando puede utilizarse para seleccionar o aislar la celula cuando esta presente o lo expresa la celula. En el contexto, por ejemplo, de deteccion "positiva", mediada por anticuerpo, como indicativo de que esta presente un marcador de superficie celular particular, significa que el marcador es perceptible utilizando un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo marcado con fluorescencia, espedfico para ese marcador; "positiva" tambien se refiere a una celula que presenta el marcador en una cantidad que produce una senal, por ejemplo, en un citometro, que esta por encima, por ejemplo, de forma perceptible, por encima del fondo. Por ejemplo, una celula es "CD200+ cuando la celula esta marcada, por ejemplo, esta marcada de manera perceptible, con un anticuerpo espedfico para CD200, y la senal del anticuerpo es mas alta, por ejemplo, perceptiblemente mas alta, que la de un control (por ejemplo, un control de fondo o un control de isotipo). Se puede determinar que una celula o poblacion de celulas es oCT-4 + si la cantidad de ARN de OCT-4 detectada en el ARN de la celula o poblacion de celulas, es perceptiblemente mayor que el fondo, como se determina, por ejemplo, mediante un metodo de deteccion de ARN, tal como RT-PCr, transferencias por ranura, etc. En ciertas realizaciones, se determina que OCT-4 esta presente, y una celula es "OCT-4 +" si oCT-4 es perceptible utilizando RT-PCR. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, utilizando anticuerpos, se detectan marcadores de grupos de diferenciacion ("GD"). Con respecto a HLA-G, una poblacion de celulas madre placentarias es, en determinadas realizaciones, positiva para HLA-G, si mas del 5% de las celulas en la poblacion son positivas para HLA-G, p. ej., se tinen de forma perceptible con un anticuerpo contra HLA-G.
Como se usa en esta memoria para todos los marcadores excepto para HLA-G, una celula madre placentaria es "negativa" para un marcador celular particular, si el marcador celular no es perceptible, por ejemplo, utilizando un anticuerpo espedfico para ese marcador en comparacion con un control (por ej., un control de fondo o de isotipo), o no es perceptible utilizando un metodo de deteccion basado en acidos nucleicos, p. ej., RT-PCR. Por ejemplo, una celula es "CD34-'" cuando la celula no se marca perceptiblemente, de manera reproducible, con un anticuerpo espedfico contra CD34 en un grado mayor que un control (p. ej., un control de fondo o de isotipo). Los marcadores, p. ej., marcadores no detectados, o no perceptibles, utilizando anticuerpos, pueden determinarse para ser positivos o negativos de una manera similar, utilizando un control apropiado, utilizando otros metodos de deteccion, por ejemplo, mediados por acidos nucleicos. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, los marcadores de grupos de diferenciacion ("GD") se detectan utilizando anticuerpos. Con respecto a HLA-G, una poblacion de celulas madre placentarias es, en determinadas realizaciones, negativa para HLA-G si el 5% o menos de las celulas en la poblacion son positivas para HLA-G, p. ej., se tinen perceptiblemente con un anticuerpo contra HLA-G.
Como se usa en esta memoria, la designacion "baja 'o "dim.", cuando se hace referencia a la expresion de un marcador perceptible en la citometna de flujo, significa que el marcador se expresa en un porcentaje menor de 10% de las celulas ensayadas, o que la fluorescencia atribuible al marcador, por ejemplo, en la citometna de flujo, es menor que 1 log por encima del fondo.
Como se usa en esta memoria, "tratar” incluye la curacion, la remediacion, la mejona, la disminucion de la gravedad,
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o la reduccion de la evolucion, de una enfermedad, un trastorno o una afeccion, o de cualquier parametro o smtoma de los mismos.
4. Breve descripcion de las figuras
FIG 1: Las celulas madre placentarias mejoran la reparacion de defectos oseos en ratas experimentales. Eje Y: grado de cierre del defecto oseo del craneo, segun lo evaluado por area. Eje X - condiciones:
HEALOS® solo; HEALOS® en combinacion con protema morfogenetica osea-2 (BMP-2); HEALOS® y celulas madre placentarias; HEALOS® y celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea (BM-MSC); o sin reparacion (vado). El asterisco indica una mejora significativa (p <0,05) en la reparacion del defecto en HEALOS® en combinacion con la protema morfogenetica osea-2 (BMP-2); HEALOS® en combinacion con celulas madre placentarias; y HEALOS® en combinacion con BM-MSC, en comparacion con controles.
FIG 2: Las celulas madre placentarias suprimen la diferenciacion de precursores de osteoclastos. Eje X: osteoclastos (OC); precursores de osteoclastos no cultivados conjuntamente con celulas madre placentarias, o celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea (BM-MSC). Eje Y: numeros de osteoclastos maduros.
FIG 3: Las celulas madre placentarias reducen el crecimiento de las celulas tumorales de diferentes individuos. Se transfectaron celulas de mieloma multiple (lmeas celulares BN, JB, ARP1, U266, Dn y Hale) con un gen que codificaba la luciferasa y se cultivaron conjuntamente con celulas madre mesenquimatosas fetales (FB-MSC) (de izquierda a derecha en cada condicion), con celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea de un paciente (Pt-MSC) o con celulas madre placentarias. Despues de varias semanas, la reduccion del crecimiento celular del mieloma multiple se expreso como el valor en veces de la expresion de la luciferasa en celulas de mieloma multiple cultivadas conjuntamente con celulas madre placentarias o Pt-MSC en comparacion con la expresion de la luciferasa por celulas de mieloma multiple cultivadas conjuntamente con FB-MSC.
FIG 4: Diagrama de un experimento TRANSWELL®, en donde celulas madre placentarias o celulas madre mesenquimatosas se cultivan en la parte inferior de una membrana, y celulas de mieloma multiple se cultivan en la parte superior de la membrana.
FIG. 5: Supresion de celulas de mieloma multiple de seis pacientes diferentes (eje X) por celulas madre placentarias (PDAC) y celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea fetal (MSC fetal). Eje Y: porcentaje de viabilidad en comparacion con celulas de mieloma cultivadas en ausencia de celulas madre placentarias.
FIG 6: Las celulas madre placentarias reducen el crecimiento de las celulas de mieloma multiple en ratones SCID- rab / SCID-hu. El numero de celulas de mieloma multiple se evaluo mediante el titulo de anticuerpo humano presente en sueros de ratones, evaluado mediante ensayo ELISA. Pre-Rx: titulo de anticuerpo humano antes de la administracion de celulas de mieloma. 2WK, 4WK: titulo de anticuerpo humano dos semanas y cuatro semanas despues de la administracion de celulas de mieloma multiple, ya sea solo (control) o con celulas madre placentarias.
FIG 7: Cambio en la densidad de masa osea, valuado mediante rayos X, de implantes oseos en ratones SCID-rab / SCID-hu. BMD (bone mineral density, densidad mineral osea).
FIGs 8-9: los efectos de las celulas madre placentarias sobre la enfermedad osea de mieloma y el crecimiento tumoral dependen de la dosis y son comparables a los de las MSC fetales. Ratones SCID-rab injertados con celulas de mieloma de 2 pacientes. (A-C) Tras el establecimiento de una carga tumoral alta, los hospedadores recibieron inyeccion, por via intralesional, de vetticulo con 0,1, 0,5 y 1 x 10 6 celulas madre placentarias, o un injerto, por via subcutanea, de 5 x 10 6 celulas madre placentarias, utilizando un transportador de hidrogel HyStem-C (para mas detalles vease el apartado Metodos) (6-7 ratones / grupo).
FIG 8: Cambios en la inmunoglobulina humana (Ig) antes del tratamiento (Pre-Rx), 2 y 4 semanas despues del tratamiento con celulas madre placentarias. IL = administracion intralesional de 0,1, 0,5 o 1 x106 celulas. SC = administracion subcutanea de celulas. CONT = control (sin celulas).
FIG 9: Cambios en la densidad mineral osea a partir de niveles de pretratamiento del hueso mielomatoso implantado. IL = administracion intralesional de 0,1, 0,5 o 1 x 106 celulas. SC = administracion subcutanea de celulas. CONT = control (sin celulas).
FIG 10: Los hospedadores recibieron una inyeccion intralesional de vetticulo, o de 1 x 106 celulas madre placentarias o MSC. La Figura 10 muestra los cambios en la densidad mineral osea a partir de los niveles de pretratamiento del hueso mielomatoso implantado. Condicion a la izquierda: control (sin celulas); condicion central: celulas madre placentarias; condicion a la derecha: celulas madre mesenquimatosas derivadas de la medula osea.
FIG 11: Los hospedadores recibieron una inyeccion intralesional de vetticulo, o de 1 x 106 celulas madre placentarias o MSC. La Figura 11 muestra los cambios en la Ig humana antes del tratamiento (Pre-Rx) y al final del experimento. Condicion a la izquierda: control (sin celulas); condicion central: celulas madre placentarias; condicion a la derecha: celulas madre mesenquimatosas derivadas de la medula osea.
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FIG 12: Comparacion del numero promedio (n = 3) de celulas de lmea celular de mieloma multiple (U-266, RPMI- 8226, L363 y OMP-2) por pocillo con o sin celulas madre placentarias el dfa 5 del cultivo o cocultivo. Se proporcionan valores de P para condiciones de control y experimentales para cada lmea celular de mieloma multiple.
FIGs 13A-13C: Reduccion de la fosforilacion de la protema del retinoblastoma (Rb) en Serina 780 (S780), o en las serinas 807 y 811 (S807/S811) para las lmeas celulares de mieloma multiple H929 (Figura 13A), OPM-2 (Fig. 13B) y LP1 (Fig. 13C). D2: Dfa 2 de cocultivo. D4: Dfa 4 de cocultivo. GM: media geometrica de aumento/disminucion en la fosforilacion de Rb. A: cambio en la media geometrica.
FIG 14: Numero de osteoclastos formados cuando se cultivaron en presencia de lenalidomida 1 pM. La lmea horizontal gruesa representa el numero de osteoclastos formados en los pocillos de control.
FIG 15: Numero de osteoclastos formados cuando se cocultivaron solo con celulas madre placentarias (PDAC), con celulas madre mesenquimatosas derivadas de la medula osea (BM-MCS) o con la combinacion de celulas madre placentarias (PDAC) y lenalidomida.
5. Descripcion detallada
5.1 CELULAS MADRE PLACENTARIAS PARA SU USO EN METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE CANCER RELACIONADO CON HUESO
En un aspecto de la invencion, se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para la supresion de la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso en un individuo humano, en donde el metodo consiste en poner en contacto dichas celulas de un cancer relacionado con hueso con una pluralidad de celulas madre placentarias durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias supriman la proliferacion de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, en comparacion con una pluralidad de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso que no se han puesto en contacto con celulas madre placentarias, en donde dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, son celulas de condrosarcoma, celulas de cancer de hueso, celulas de neuroblastoma, celulas de osteosarcoma, celulas de sarcoma de Ewing, celulas de cordoma, celulas de un histiocitoma fibroso maligno de hueso, o celulas de un fibrosarcoma de hueso, y en donde dichas celulas madre placentarias son adherentes a plastico de cultivo tisular, son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo, y no son trofoblastos, citotrofoblastos o celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion son CD34", CD45", CD10+, CD90+, CD105+ y CD200+; o CD34-, CD45-, CD10+, CD80-, CD86-, CD90+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo.
En determinadas realizaciones de las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, dicha puesta en contacto comprende la administracion de al menos 1 x 108 de dichas celulas madre placentarias a dicho individuo humano.
En determinadas realizaciones de las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, dicha puesta en contacto comprende la administracion de dichas celulas madre placentarias a dicho individuo humano en, o adyacente a, una lesion osea causada por dicho cancer relacionado con hueso.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, suprimen al menos un 50 % la proliferacion de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso en comparacion con la proliferacion de un numero equivalente de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en ausencia de dichas celulas placentarias.
En otro aspecto de la invencion, se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para el tratamiento de un individuo humano que tiene un cancer relacionado con hueso, en donde el metodo consiste en la administracion a dicho individuo de una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias mejoren uno o mas smtomas de, o reduzcan la progresion de, dicho cancer relacionado con hueso, en donde dicho cancer relacionado con hueso es condrosarcoma, cancer de hueso, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso, o fibrosarcoma de hueso, y en donde dichas celulas madre placentarias son adherentes a plastico de cultivo tisular, son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo, y no son trofoblastos, citotrofoblastos o celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, y tienen la capacidad de diferenciarse en celulas osteogenicas o condrogenicas.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion son CD34", CD45", CD10+, CD90+, CD105+ y CD200+; o CD34-, CD45-, CD10+, CD80-, CD86-, CD90+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, se administran a dicho individuo humano por via intravenosa, o en, o adyacente a, una lesion osea causada por dicho cancer
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relacionado con hueso.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, comprenden la administracion de al menos 1 x 108 celulas placentarias a dicho individuo humano.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, suprimen al menos un 50 % la proliferacion de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en comparacion con la proliferacion de un numero equivalente de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en ausencia de dichas celulas placentarias.
En la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en metodos de tratamiento de un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias aisladas, en particular, las celulas madre placentarias aisladas de la invencion y descritas con detalle en la Seccion 5.2, mas adelante, tambien denominadas en esta memoria PDAC (celulas adherentes derivadas de placenta), por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz de dichas celulas. Los canceres relacionados con hueso incluyen, sin limitacion, mieloma multiple, cancer de hueso, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso, fibrosarcoma de hueso, cancer de prostata y cualquier forma de cancer metastasico caracterizado por metastasis oseas. En el contexto de la invencion, el cancer relacionado con hueso no incluye cancer de prostata ni mieloma multiple. En determinadas realizaciones, la administracion de celulas madre placentarias aisladas es terapeuticamente eficaz para reducir, mejorar o invertir uno o mas smtomas asociados al cancer relacionado con hueso, por ejemplo, un smtoma causado por, asociado o relacionado con, un efecto del cancer en uno o mas huesos en el individuo, por ejemplo, un defecto oseo atribuible al cancer relacionado con hueso. La administracion de celulas madre placentarias, como se proporciona en esta memoria, a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, puede producirse antes de, despues de, o de manera simultanea con, una segunda terapia contra el cancer, como se analiza a continuacion. Por consiguiente, en una realizacion, los defectos oseos, que son un smtoma de un cancer relacionado con hueso, se tratan antes de que el cancer se trate con una segunda terapia antineoplasica. En otra realizacion, los defectos oseos que son un smtoma de un cancer relacionado con hueso, se tratan al mismo tiempo, o casi al mismo tiempo, que el cancer que se trata con una segunda terapia antineoplasica. En otra realizacion, los defectos oseos, que son un smtoma de un cancer relacionado con hueso, se tratan despues de que el cancer se trate con una segunda terapia antineoplasica.
En un aspecto, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en metodos para tratar a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias. En una realizacion, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias mejoren, por ejemplo, mejoren perceptiblemente, uno o mas smtomas de dicho cancer relacionado con hueso, o reduzcan, por ejemplo, reduzcan perceptiblemente, su progresion. En una realizacion espedfica, dicho cancer relacionado con hueso no es mieloma multiple. En otra realizacion espedfica, el cancer relacionado con hueso es sarcoma. En otras realizaciones espedficas, dicho cancer relacionado con hueso es cancer de hueso, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso o fibrosarcoma de hueso. En otra realizacion espedfica, dicho cancer relacionado con hueso comprende un tumor solido. En otra realizacion espedfica, dicho cancer relacionado con hueso no es cancer de prostata.
Como se usa en esta memoria, "administrar durante un tiempo suficiente", y similar, incluye, por ejemplo, la administracion de celulas, por ejemplo, una unidad de celulas, seguido de la evaluacion de uno o mas smtomas de cancer relacionado con hueso, durante un tiempo suficiente para determinar cualquier cambio en uno o mas smtomas, por ejemplo, en el transcurso de 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 horas o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dfas, o de 1, 2, 3 o 4 semanas, o similar. Si no se detecta ningun cambio, puede tener lugar una o mas administraciones posteriores de celulas.
En determinadas realizaciones de la invencion, el tratamiento de canceres relacionados con hueso comprende administrar a un individuo que tenga celulas de cancer relacionado con hueso, una cantidad, por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz, de celulas madre placentarias aisladas, en donde al menos algunas de dichas celulas madre placentarias se ponen directamente en contacto con al menos algunas de las celulas de cancer relacionadas con hueso, por ejemplo, hay contacto directo celula-celula entre al menos algunas de dichas celulas madre placentarias y al menos algunas de dichas celulas de cancer relacionado con hueso. En otras realizaciones determinadas, el tratamiento de canceres relacionados con hueso comprende administrar a un individuo que tiene celulas de cancer relacionado con hueso, una cantidad, por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz, de celulas madre placentarias, en donde ninguna, o sustancialmente ninguna, de dichas celulas madre placentarias, se ponen directamente en contacto con dichas celulas de cancer relacionado con hueso, por ejemplo, no hay, o no hay sustancialmente, contacto directo celula-celula entre gran parte, o ninguna, de dichas celulas madre placentarias y dichas celulas relacionadas con cancer de hueso.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias para su uso en la invencion, se administran por via intralesional, por ejemplo, directamente en, o adyacente a (por ejemplo, en aproximadamente 1 -5 cm de) una o mas
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lesiones oseas causadas por el cancer relacionado con hueso. En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias se administran en combinacion con una matriz, por ejemplo, una matriz inyectable. En otras realizaciones determinadas, las celulas madre placentarias se administran a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, en combinacion con alginato, o con plasma rico en plaquetas. En otras realizaciones determinadas, las celulas madre placentarias se administran a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, en combinacion con una matriz solida, por ejemplo, un sustituto oseo, una matriz o sustituto oseo descritos mas adelante en la Seccion 5.7.4.
En otras realizaciones determinadas, las celulas madre placentarias se administran por via intravenosa al individuo. Las celulas madre placentarias pueden administrarse a un individuo desde cualquier envase, y por cualquier sistema de suministro, medicamente adecuado para el suministro de lfquidos, por ejemplo, lfquidos que comprenden celulas. Dichos envases pueden ser, por ejemplo, una bolsa de plastico esteril, un matraz, un frasco, u otro recipiente a partir de cual se puedan dispensar facilmente las celulas madre placentarias. Por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de sangre u otra bolsa de plastico, aceptable desde el punto de vista medico, adecuada para la administracion intravenosa de un lfquido a un receptor.
La administracion intralesional o intravenosa puede comprender, por ejemplo, aproximadamente, al menos, mas de, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1
1011, o mas, celulas madre placentarias aisladas en una sola dosis.
o no
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En una realizacion, la administracion intralesional o intravenosa puede comprender aproximadamente 2 x 108 celulas madre placentarias en una sola dosis. En otra realizacion, la administracion intralesional o intravenosa puede comprender aproximadamente 8 x 108 celulas madre placentarias en una sola dosis. Las celulas madre placentarias aisladas pueden administrarse una vez, o mas de una vez, durante el transcurso de una terapia. Preferiblemente, las celulas madre placentarias administradas comprenden al menos el 50% de celulas viables o mas (es decir, al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas madre placentarias en una poblacion de celulas madre placentarias que son funcionales o viven). Preferiblemente, al menos aproximadamente el 60% de las celulas en la poblacion son viables. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente el 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las celulas en la poblacion en la composicion farmaceutica son viables.
La administracion de celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, ademas de tratar smtomas de canceres relacionados con hueso, tales como lesiones oseas, puede suprimir la proliferacion o el crecimiento de celulas del cancer relacionado con hueso. La supresion de la proliferacion puede incluir, por ejemplo, la reduccion del crecimiento o de la tasa de proliferacion de las celulas tumorales, o la muerte de algunas o de todas las celulas tumorales. Por lo tanto, en otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para suprimir la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso, que comprende poner en contacto dichas celulas de cancer relacionado con hueso con una pluralidad de celulas madre placentarias durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias supriman, por ejemplo, supriman de manera perceptible, la proliferacion de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, en comparacion con una pluralidad de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso que no se pone en contacto con celulas madre placentarias, por ejemplo, como puede determinarse mediante una reduccion perceptible en el numero de dichas celulas despues del tratamiento, una reduccion perceptible en el aumento en el numero de dichas celulas despues del tratamiento, o similar. En realizaciones espedficas, dichas celulas de un cancer relacionado con hueso son celulas de cancer de hueso, celulas de neuroblastoma, celulas de osteosarcoma, celulas de sarcoma de Ewing, celulas de condrosarcoma, celulas de cordoma, celulas de histiocitoma fibroso maligno de hueso, celulas de un cancer que metastatiza en el hueso o celulas de un fibrosarcoma de hueso. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de un cancer relacionado con hueso son celulas de un tumor solido o que estan en su interior. En otra realizacion espedfica, dichas celulas de un cancer relacionado con hueso no son celulas de cancer de prostata.
En otra realizacion espedfica, dicha puesta en contacto se realiza in vitro. En otra realizacion espedfica, dicha puesta en contacto se realiza in vivo, por ejemplo, mediante la administracion de las celulas a un individuo que tiene celulas de un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, condrosarcoma. En otra realizacion espedfica, dicho individuo es un mairnfero. En otra realizacion espedfica, dicho individuo es un ser humano. En otra realizacion espedfica, dicho contacto comprende administrar dichas celulas madre placentarias a dicho individuo por via intravenosa. En otra realizacion espedfica, dicho contacto comprende administrar dichas celulas madre placentarias a dicho individuo en, o adyacente a, una lesion osea causada por dicho cancer relacionado con hueso, por ejemplo, por via intralesional o intraosea.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para suprimir la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso, al poner en contacto dichas celulas de un cancer relacionado con hueso con celulas madre placentarias, comprende ademas poner en contacto dichas celulas de un cancer relacionado con hueso con uno o mas compuestos antineoplasicos, por ejemplo, uno o mas de los compuestos antineoplasicos indicados en la Seccion 5.1.3, por ejemplo, administrando a dicho individuo uno o mas de dichos compuestos antineoplasicos.
En otra realizacion, la invencion comprende administrar al menos 1 x 10 7 celulas madre placentarias a dicho individuo, con respecto al numero total de celulas. En otra realizacion espedfica la invencion comprende administrar
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al menos 1 x 108 celulas madre placentarias a dicho individuo, con respecto al numero total de celulas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias han proliferado in vitro antes de la administracion durante no mas de 30 generaciones poblacionales. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias han proliferado in vitro antes de la administracion durante no mas de 10 generaciones poblacionales. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se han crioconservado y descongelado antes de dicha puesta en contacto.
En otra realizacion espedfica de la invencion, dichas celulas madre placentarias suprimen la proliferacion de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, por ejemplo, en comparacion con la proliferacion de un numero equivalente de celulas de un cancer relacionado con hueso en ausencia de dichas celulas madre placentarias. En determinadas realizaciones, el porcentaje de reduccion en la proliferacion puede evaluarse, por ejemplo, comparando una cantidad de celulas cancerosas relacionadas con el hueso en una muestra tisular (por ejemplo, sangre) de un individuo que tiene el cancer relacionado con hueso antes y despues de la administracion de celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, la invencion comprende determinar, antes de dicha puesta en contacto, que dichas celulas madre placentarias suprimen, por ejemplo, suprimen de manera perceptible, la proliferacion de una muestra de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso. En una realizacion de este tipo, por ejemplo, las celulas madre placentarias podnan determinarse para suprimir la proliferacion de una muestra de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, tomando una muestra de una poblacion de celulas madre placentarias (por ejemplo, una muestra de una unidad o lote de un banco de celulas madre, o similar).
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, por ejemplo, metodos de tratamiento, metodos para suprimir el crecimiento tumoral o metodos para suprimir la maduracion de osteoclastos, descritos en la presente memoria, las celulas madre placentarias, por ejemplo, las PDAC o las BM-MSC, pueden utilizarse en solitario, o las celulas madre placentarias y las BM-MSC pueden utilizarse en combinacion. Cuando se usan en combinacion, las celulas pueden combinarse para poder administrarse al mismo tiempo, por ejemplo, en la misma unidad de celulas; o pueden administrarse por separado, por ejemplo, mantenidas en unidades celulares distintas, por ejemplo, en bolsas distintas del tipo de bolsas para sangre. Cuando se utilizan en combinacion, la administracion de las celulas madre placentarias y de las BM-MSC puede llevarse a cabo conjuntamente, al mismo tiempo, o puede llevarse a cabo en distintos momentos.
Ademas, en la presente memoria se proporciona el uso de celulas madre placentarias de la invencion en la reduccion de la maduracion de precursores de osteoclastos en osteoclastos, que comprende poner en contacto dichos precursores de osteoclastos con una pluralidad de celulas madre placentarias aisladas, en donde dicha pluralidad de celulas madre placentarias es un numero de celulas madre placentarias suficiente para reducir, p. ej., reducir de forma perceptible, la maduracion de osteoclastos a partir de dichos precursores de osteoclastos. En una realizacion espedfica, dicha puesta en contacto se produce in vitro. En otra realizacion espedfica, dicha puesta en contacto se produce in vivo. En otra realizacion espedfica, dicha puesta en contacto se produce en un mairnfero, por ejemplo, en un ser humano.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona el uso de celulas madre placentarias de la invencion en el aumento de la apoptosis de precursores de osteoclastos, que comprende poner en contacto dichos precursores de osteoclastos con una pluralidad de celulas madre placentaria, en donde dicha pluralidad de celulas madre placentarias es una cantidad de celulas madre placentarias suficiente para aumentar, p. ej., aumentar de manera perceptible, la apoptosis de precursores de osteoclastos. En una realizacion espedfica, dicho contacto se produce in vitro. En otra realizacion espedfica, dicho contacto se produce in vivo. En otra realizacion espedfica, dicho contacto se produce en un ser humano. En otra realizacion espedfica, dicho aumento en la apoptosis de precursores de osteoclastos se detecta mediante un aumento perceptible en la tincion con anexina V y con yoduro de propidio de precursores de osteoclastos de dicho individuo.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, las celulas madre placentarias pueden ser celulas madre placentarias modificadas mediante ingeniena genetica, por ejemplo, las celulas modificadas mediante ingeniena genetica descritas mas adelante en la Seccion 5.7.2.
En cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, dicho individuo es un ser humano.
En cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, las BM-MSC pueden ser celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea aisladas, por ejemplo, BM-MSC que se han cultivado o adquirido en una fuente comercial, o pueden ser BM-MSC contenidas en la medula osea, p. ej., un aspirado de medula osea, medula osea ordinaria, o similar.
5.1.1 Tratamiento de mieloma multiple
En la presente memoria se describen metodos para el tratamiento de un individuo que tiene mieloma multiple, que comprenden administrar a dicho individuo celulas madre placentarias y/o BM-MSC, en donde dichas celulas madre placentarias aisladas tienen cualquier combinacion de las caractensticas descritas mas adelante en la Seccion 5.2., o cualquier combinacion de todas ellas.
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El mieloma multiple es un cancer de celulas plasmaticas, que son celulas del sistema inmunitario productoras de anticuerpos. La enfermedad tipicamente presenta tres caractensticas principales: lesiones oseas, cuyo desarrollo puede provocar osteodinia y elevacion del calcio en la sangre; anemia; e insuficiencia renal.
En la presente memoria se describen metodos para tratar individuos que tienen una o mas enfermedades o afecciones relacionadas con mieloma multiple, o smtomas de los mismos. Dichas enfermedades o afecciones relacionadas con mieloma multiple son gammapatfa monoclonal de significado incierto (MGUS, monoclonal gammopathy of unknown significance), mieloma latente (por ejemplo, mieloma multiple latente), plasmacitoma solitario, gammapatia monoclonal benigna, gammapatfa monoclonal asintomatica, gammapatfa monoclonal no mielomatosa, gammapatfa monoclonal discreta, gammapatfa monoclonal criptogenica, gammapatia monoclonal lantanica, gammapatia monoclonal rudimentaria, disinmunoglobulinemia, parainmunoglobulinemia asintomatica o paraproteinemia idiopatica. En algunos casos, una persona que tiene mieloma latente presenta paraprotema en sangre, pero no presenta otros smtomas de mieloma multiple.
Por ejemplo, los smtomas son los siguientes.
Lesiones oseas y osteodinia (dolor en los huesos): las celulas de mieloma secretan factor activador de osteoclastos, que es una citocina que activa los osteoclastos para descomponer el hueso, creando lesiones oseas dolorosas. Estas lesiones oseas, visibles, por ejemplo, en las radiograffas de rayos X, son de naturaleza lttica y tfpicamente aparecen como una o mas regiones en las que parece faltar hueso o estar "perforado". La osteodinia de mieloma generalmente involucra a la columna vertebral y a las costillas, y empeora con la actividad. Puede haber dolor localizado persistente y puede indicar una fractura osea patologica. La implicacion de las vertebras puede conducir a una compresion de la medula espinal. La descomposicion del hueso tambien conduce a la liberacion de calcio en la sangre, lo que conduce a hipercalcemia y a sus smtomas asociados.
Anemia - La anemia que se encuentra en el mieloma suele ser normocftica y normocromica, y se produce por el reemplazo de medula osea normal por celulas tumorales infiltrantes e inhibicion de la produccion de globulos rojos (hematopoyesis) normales por citocinas.
Insuficiencia renal - El mieloma multiple tambien tiende a producir insuficiencia renal, que puede desarrollarse de manera aguda y cronica. La insuficiencia renal en el mieloma multiple es atribuible en gran parte a la hipercalcemia, que se desarrolla a medida que los osteoclastos deshacen el hueso existente. La insuficiencia renal tambien esta causada por dano tubular por la excrecion de cadenas ligeras, tambien denominadas protemas de Bence Jones, que puede manifestarse como el smdrome de Fanconi (acidosis tubular renal tipo II). Otras causas incluyen la deposicion glomerular de amiloide, hiperuricemia, infecciones recurrentes (p. ej., pielonefritis) e infiltracion local de celulas tumorales. La insuficiencia renal puede asociarse a niveles elevados de creatinina serica.
El mieloma multiple tambien puede presentarse con otros smtomas, como los indicados a continuacion
Infeccion - Otro smtoma comun del mieloma multiple es la infeccion, ya que el sistema inmunitario esta alterado. El aumento del riesgo de infeccion se debe a la inmunodeficiencia resultante de hipogammaglobulinemia difusa, que se debe a la disminucion de la produccion y al aumento de la destruccion de anticuerpos normales. Las infecciones mas comunes son neumomas y pielonefritis. Los patogenos comunes de neumoma que causan enfermedades en pacientes con mieloma multiple incluyen Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae, mientras que los patogenos comunes que causan pielonefritis incluyen Escherichia coli. Tfpicamente, la infeccion se produce en los primeros meses despues del inicio de la quimioterapia.
Smtomas neurologicos - Los smtomas del mieloma multiple incluyen un espectro de afecciones neurologicas, que incluyen debilidad, confusion y fatiga debido a hipercalcemia, cefalea, cambios visuales y retinopatfa, que pueden ser el resultado de hiperviscosidad de la sangre dependiendo de las propiedades de la paraprotema (ver mas adelante). Otros smtomas neurologicos incluyen dolor radicular, perdida del control intestinal o vesical (por ejemplo, debido a la implicacion de la medula espinal que conduce a la compresion medular) y smdrome del tunel carpiano y otras neuropatfas (por ejemplo, debido a la infiltracion de los nervios perifericos por el amiloide). El mieloma multiple puede dar lugar a paraplejia en los casos de presentacion tardfa.
Presencia de paraprotema - Un smtoma diagnostico de mieloma multiple es la presencia en la sangre y/o en la orina de paraprotema, que es una protema monoclonal (protema M), por ejemplo, una cadena ligera de inmunoglobulina que se produce por la proliferacion clonal de celulas plasmaticas, o fragmentos de inmunoglobulina. La presencia de paraprotema puede determinarse analizando la protema de la orina y/o del suero de un individuo mediante electroforesis en gel de agarosa, o mediante inmunofijacion utilizando uno o mas anticuerpos contra una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina.
En determinadas realizaciones, el mieloma multiple sintomatico, se diagnostica cuando se presentan los siguientes smtomas o signos: celulas plasmaticas clonales que constituyen mas del 10% de las celulas en una biopsia de medula osea o, en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos (por ejemplo, plasmacitoma); paraprotema en suero u orina; manifestacion de lesion organica terminal (relacionada con disfuncion organica o tisular); por ejemplo, hipercalcemia (por ejemplo, calcio corregido mayor de aproximadamente 12 mg por decilitro de sangre, o mayor de aproximadamente 2,75 mmol en la sangre), insuficiencia renal atribuible a mieloma, anemia definida como
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hemoglobina < 10 g/dl en sangre, lesiones oseas (por ejemplo, lesiones l^ticas u osteoporosis con fracturas por compresion, infecciones graves frecuentes (> 2 al ano); amiloidosis (deposicion de protema amiloide) de otros organos y smdrome de hiperviscosidad (aumento de la viscosidad de la sangre), por ejemplo, una viscosidad de la sangre por encima de 1,8 centipoise, por ejemplo, una viscosidad de la sangre de al menos 2, 3, 4 o 5 centipoise.
Las personas que tienen mieloma multiple, se encuentran en uno de los siguientes grupos. El individuo que tiene mieloma multiple nunca ha sido tratado para la enfermedad. El individuo tiene mieloma sensible; es decir, mieloma multiple que responde al tratamiento. Dicho individuo presenta una disminucion de protema M (paraprotema) de al menos 50% como resultado del tratamiento. Como alternativa, el individuo presenta una disminucion de protema M de entre el 25% y el 50% como resultado del tratamiento. El individuo tiene mieloma multiple estable, que se refiere al mieloma que no ha respondido al tratamiento (por ejemplo, la disminucion de la protema M no ha alcanzado el 50%), pero no ha progresado o empeorado. El individuo tiene mieloma multiple progresivo, que se refiere al mieloma activo que esta empeorando (por ejemplo, aumento de la protema M y empeoramiento de la disfuncion organica o tisular o dano organico terminal). El individuo ha recidivado el mieloma multiple, que se refiere a la enfermedad del mieloma que inicialmente respondio a la terapia pero que luego comenzo a progresar nuevamente. En casos espedficos, el individuo ha recafdo despues de la terapia inicial o ha recafdo despues de la terapia posterior. En otro En realizaciones espedficas, el individuo ha recafdo despues de la terapia inicial o ha recafdo despues de la terapia posterior. En otro En realizaciones espedficas, el individuo ha recafdo despues de terapia inicial o ha recafdo despues de terapia posterior. El individuo tiene mieloma multiple refractario. En un ejemplo espedfico, el mieloma multiple refractario es mieloma multiple que no ha respondido a terapia inicial. En otro ejemplo espedfico, el mieloma multiple refractario es mieloma multiple recidivante que no ha respondido a tratamiento posterior. En otro ejemplo espedfico, el mieloma multiple refractario es enfermedad refractaria progresiva que no responde, que se refiere a la enfermedad refractaria que esta progresando. En otro ejemplo espedfico, el mieloma multiple refractario es enfermedad refractaria no progresiva que no responde, que se refiere a enfermedad refractaria que no empeora.
Por lo tanto, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo celulas madre aisladas placentarias aisladas y/o BM-MSC (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en la medula osea), en donde dicha administracion da como resultado la reduccion perceptible de la progresion, la disminucion perceptible del empeoramiento y / o una mejora perceptible, de uno o mas smtomas de mieloma multiple, por ejemplo, uno o mas de los smtomas de mieloma multiple descritos en la presente memoria, sin limitacion. Por ejemplo, dicho uno o mas smtomas comprenden sangre o calcio en orina elevados, en comparacion con lo normal, la presencia de lesiones oseas, anemia o insuficiencia renal. En otros ejemplos, dichos uno o mas smtomas comprenden celulas plasmaticas, por ejemplo, celulas plasmaticas clonales que constituyen mas del 10% de celulas en una biopsia de medula osea o, en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos (p. ej., Plasmacitoma); paraprotema en suero u orina; y/o evidencia de dano organico terminal. En otro ejemplo, dicho uno o mas smtomas es una concentracion de calcio en la sangre de mas de aproximadamente 2,75 mmol/l, insuficiencia renal, menos de aproximadamente 10 g de hemoglobina por decilitro de sangre, la presencia de lesiones oseas o amiloidosis de uno o mas organos distintos de la medula osea.
En otro ejemplo, dicho smtoma es infeccion, por ejemplo, infeccion causada por hipergammaglobulinemia. En determinados casos, la infeccion es neumoma o pielonefritis. En determinados casos, dicha infeccion se produce al cabo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses despues del inicio de la quimioterapia, por ejemplo, quimioterapia para tratar dicho mieloma multiple.
En otro ejemplo smtoma es un smtoma neurologico. En otros ejemplos, dichos smtomas neurologicos son debilidad, confusion, fatiga, cefalea, cambios visuales, retinopatfa, dolor radicular, perdida del control intestinal o vesical, smdrome del tunel carpiano y / o paraplejia.
Adicionalmente, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias y/o BM-MSC (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en medula osea), en donde dicha administracion da como resultado la reduccion perceptible en el numero de celulas de mieloma multiple, por ejemplo, celulas de mieloma multiple clonal, en uno o mas organos o tejidos del individuo.
Ademas, en la presente memoria tambien se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias y/o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM- MSC aisladas o BM-MSC en medula osea), en donde dicha administracion da como resultado el aumento perceptible en la hemoglobina en la sangre del individuo, por ejemplo, un aumento dentro de los lfmites normales. Los niveles normales de hemoglobina vanan segun la edad y el sexo del individuo, como se muestra en la Tabla 1A, a continuacion:
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Tabla 1A
Recien nacidos
17-22 gm/dl
Una (1) semana de vida
15-20 gm/dl
Un (1) mes de vida
11-15 gm/dl
Ninos
11-13 gm/dl
Hombres adultos
14-18 gm/dl
Mujeres adultas
12-16 gm/dl
Hombres despues de mediana edad
12,4-14,9 gm/dl
Mujeres despues de mediana edad
11,7-13,8 gm/dl
Por lo tanto, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo, celulas madre placentarias aisladas y/o BM-MSc (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en medula osea), en donde dicha administracion da como resultado el aumento de los niveles de hemoglobina en sangre en dicho individuo a entre 11 g/dl en sangre y 20 g/dl en sangre. Dicha administracion puede dar como resultado el aumento de los niveles de hemoglobina en sangre en dicho individuo a entre 11 g/dl en sangre y 13 g/dl en sangre. Dicha administracion puede dar como resultado el aumento de los niveles de hemoglobina en sangre en dicho individuo a entre 12 g/dl en sangre y 16 g/dl en sangre. Como alternativa, dicha administracion da como resultado el aumento de los niveles de hemoglobina en sangre en dicho individuo a entre 14 g/dl en sangre y 18 g/dl en sangre. Adicionalmente, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene anemia, por ejemplo, que tiene menos de aproximadamente 10 g de hemoglobina por decilitro de sangre, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias, en donde dicha anemia es causada por mieloma multiple y en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad suficiente para provocar un aumento de la hemoglobina en sangre del individuo hasta aproximadamente 10 gramos por decilitro o mas.
En la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias aisladas, una poblacion de celulas madre placentarias aisladas o una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias aisladas, en donde dicha administracion da como resultado una reduccion perceptible en el nivel de paraprotema en sangre u orina de dicho individuo. En algunos casos, dicha administracion da como resultado la reduccion de paraprotema en sangre u orina de dicho individuo a un nivel no perceptible. En otro caso, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene paraprotema en la sangre del individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y/o BM-MSC, en donde la presencia de paraprotema esta causada por mieloma multiple, y en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad suficiente para causar una reduccion perceptible en paraprotema en la sangre del individuo.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene una cantidad de celulas plasmaticas clonales mayor del 10%, de todas las celulas nucleadas, en una biopsia de medula osea o muestra de sangre de dicho individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y / o BM-MSC, en donde dicho numero de celulas plasmaticas clonales es causado por mieloma multiple, y en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad suficiente para causar una reduccion perceptible en dicho numero de celulas plasmaticas clonales en una biopsia de medula osea o muestra de sangre por debajo del 10%.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene hipercalcemia, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y/o BM- MSC, en donde dicha hipercalcemia esta causada por mieloma multiple, y en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad suficiente para causar una reduccion perceptible de calcio en la sangre del individuo. En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene altos niveles de calcio en la sangre (p. ej., calcio corregido mayor que aproximadamente 12 mg por decilitro de sangre, o mayor que aproximadamente 2,75 mmol), que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y/o BM-MSC, en donde los niveles altos de calcio en la sangre son causados por mieloma multiple, y en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad suficiente para causar una reduccion perceptible en dichos niveles de calcio en la sangre, p. ej., una reduccion en dichos niveles de calcio en la sangre por debajo de aproximadamente 12 mg por litro de sangre, o por debajo de aproximadamente 2,75 mmol.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene anemia, en donde dicha anemia es causada por mieloma multiple, en donde dicha anemia se define como hemoglobina en
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sangre de menos de 10 g/dl de sangre, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y/o BM-MSC, en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad suficiente para causar un aumento perceptible en la hemoglobina en sangre del individuo. Por ejemplo, dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad que da como resultado un aumento de la hemoglobina en sangre desde el individuo hasta 10 g/dl o mayor.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene smdrome de hiperviscosidad sangumea, en donde dicha sangre tiene una viscosidad superior a 1,8 centipoise, en donde dicho smdrome de hiperviscosidad sangumea esta causado por mieloma multiple, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y / o BM-MSC, en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad suficiente para causar una disminucion perceptible en la viscosidad de la sangre del individuo. En realizaciones espedficas, dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad que da como resultado una disminucion de la viscosidad de la sangre en el individuo por debajo de 5, 4, 3, 2 o 1,8 centipoise.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene un porcentaje de celulas plasmaticas por encima de, por ejemplo, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% o 20%, en la medula osea de dicho individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y / o BM-MSC, en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad suficiente para causar una disminucion perceptible en el porcentaje de celulas plasmaticas en la medula osea del individuo .
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias y / o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en medula osea) , en donde dicha administracion da como resultado una reduccion perceptible en la gravedad y / o el numero de lesiones oseas causadas por mieloma multiple en dicho individuo, como puede determinarse, por ejemplo, mediante exploracion osea o radiograffa. En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias y / o BM-MSC aisladas, en donde dicha administracion da como resultado una reduccion perceptible de perdida de masa osea o contenido mineral oseo, cese de perdida de masa osea o contenido mineral oseo, o aumento de la masa osea o de contenido mineral oseo, en dicho individuo.
En otro ejemplo del metodo de tratamiento, dicho uno o mas smtomas de mieloma multiple son osteodinia, lesiones osteodticas (por ejemplo, visibles por rayos X o resonancia magnetica (RM)), osteoporosis, anemia, hipercalcemia o un smtoma debido a hipercalcemia o insuficiencia renal. En algunos casos, dicho individuo nunca ha sido tratado de mieloma multiple; dicho individuo ha sido tratado de mieloma multiple y responde a terapia con celulas madre no placentarias y / o BM-MSC; dicho individuo ha sido tratado de mieloma multiple y no ha respondido a terapia con celulas madre no placentarias y / o BM-MSC, pero el curso del mieloma multiple en dicho individuo no ha progresado; o dicho individuo tiene mieloma multiple progresivo.
En algunos casos, la administracion de las celulas madre placentarias y / o BM-MSC (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en medula osea) son suficientes para causar un aumento perceptible en uno o mas marcadores de formacion osea en dicho individuo. Por ejemplo, la formacion osea se puede evaluar mediante analisis de niveles de fosfatasa alcalina espedfica del hueso (BSAP, bone specific alkaline phosphatase) y/o peptido N-terminal del procolageno intacto (PlNP, intact procollagen N-terminal peptide) de tipo I en suero, por ejemplo, en una muestra de suero de dicho individuo. Un aumento perceptible de BSAP y/o de PINP en suero despues de la administracion de celulas madre placentarias y / o BM-MSc a un individuo que tiene mieloma multiple es un indicativo de un aumento en la formacion osea. Por lo tanto, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias y / o BM-MSC, en donde dicha administracion da como resultado un aumento perceptible de BSAP o PINP en el suero del individuo.
Por ejemplo, la administracion de celulas madre placentarias y / o BM-MSC aisladas es suficiente para causar una disminucion perceptible en uno o mas marcadores de reabsorcion osea. Por ejemplo, la reabsorcion osea puede evaluarse mediante el analisis de los niveles de telopeptido C terminal de la cadena de colageno (CTX) de tipo 1 y/o de la fosfatasa acidorresistente a tartrato isoforma-5b (TRACP-5b) en suero. Una disminucion perceptible en CTX o TRACP-5b despues de la administracion de celulas madre placentarias y / o BM-MSC, a un individuo que tiene mieloma multiple, es un indicativo de una disminucion en la reabsorcion osea. Por lo tanto, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias y / o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en medula osea), en donde dicha administracion da como resultado una disminucion perceptible en CTX o TRACP-5B en el suero del individuo.
Adicionalmente, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple en fase I, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y / o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en la medula osea), en donde dicho mieloma multiple en fase I se caracteriza por: (i) un nivel de hemoglobina de 10 g/dl o mayor; (ii) hueso normal, o solo 1-2 lesiones, como se observa en un radiograma; (iii) menos de 12 mg/dl de calcio en sangre; y niveles perceptibles de paraprotema; en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz de dichas celulas madre placentarias
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y/o BM-MSC es una cantidad suficiente para dar como resultado una mejora de uno o mas de dichos smtomas, y/o una reduccion perceptible en el numero de celulas plasmaticas en sangre del individuo.
Ademas, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple en fase II, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y/o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM -MSC en medula osea), en donde dicho mieloma multiple en fase II se caracteriza por los siguientes smtomas: (i) hemoglobina en sangre por debajo de 8,5 g/dl; (ii) nivel de calcio en sangre por encima de 12 mg/dl; (iii) 3 o mas areas de lesiones oseas como se observa en un radiograma; y (iv) altos niveles de paraprotema; en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz de dichas celulas madre placentarias y/o BM-MSC es una cantidad suficiente para dar como resultado una mejona de uno o mas de dichos smtomas, y/o una reduccion perceptible en el numero de celulas plasmaticas en la sangre del individuo.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple en fase I, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y / o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en medula osea), en donde dicho mieloma multiple en fase I se caracteriza por microglobulina beta-2 en suero inferior a 3,5 mg /l y un nivel de albumina serica de 3,5 g /dl o superior, y en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz de dichas celulas madre placentarias y / o BM-MSC es una cantidad suficiente para reducir, p. ej., reducir perceptiblemente, el nivel de beta-2 microglobulina en suero, o aumentar, p. ej., aumentar de manera perceptible, el nivel de albumina en sangre en dicho individuo.
En otro ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple en fase II, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y/o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSc en medula osea), en donde dicho mieloma multiple en fase II se caracteriza por microglobulina beta-2 en suero de entre aproximadamente 3,3 mg /l y
5.5 mg/l con cualquier nivel de albumina serica, o un nivel de albumina serica por debajo de aproximadamente 3,5 g /dl y microglobulina beta-2 serica inferior a aproximadamente 3,5 g/l, y en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz de dichas celulas madre placentarias y/o BM-MSC es una cantidad suficiente para reducir, por ejemplo, reducir de manera perceptible, el nivel de microglobulina beta-2, por ejemplo, por debajo de aproximadamente 3,3 mg/L, o aumentar, por ejemplo, aumentar de forma perceptible, el nivel de albumina en sangre, en dicho individuo.
Adicionalmente, en la presente memoria se describe un metodo para tratar a un individuo que tiene mieloma multiple en fase III, que comprende administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y / o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM-MSC en medula osea), en donde dicho mieloma multiple en fase III se caracteriza por microglobulina beta-2 en suero mayor de 5,5 mg / l con cualquier nivel de albumina serica, en donde dicha cantidad terapeuticamente eficaz de dichas celulas madre placentarias y / o BM -MSC, es una cantidad suficiente para reducir, por ejemplo, reducir de forma perceptible, la cantidad de microglobulina beta-2 en suero en sangre o suero de dicho individuo, por ejemplo, por debajo de aproximadamente
5.5 mg/l, o por debajo de aproximadamente 3,5 mg/l.
En determinados casos, el individuo que tiene mieloma multiple es reacio a una o mas terapias de mieloma multiple acelular, por ejemplo, melfalan (con o sin prednisolona), ciclofosfamida (con o sin prednisolona) agentes alquilantes, VAD (vincristina, adriamicina y dosis altas de dexametasona), ABCM (vincristina, adriamicina, prednisolona y carmustina), dosis altas de dexametasona, talidomida, bifosfonatos, etc.
En otros casos, en la presente memoria se describe un metodo para suprimir la proliferacion de celulas de mieloma multiple, que comprende poner en contacto dichas celulas de mieloma multiple con celulas madre placentarias aisladas, por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas descritas mas adelante en la Seccion 5.2, una poblacion de dichas celulas madre placentarias aisladas o una poblacion de celulas que comprende las celulas madre placentarias aisladas y BM-MSc aisladas o en medula osea que comprenden BM-MSC, de tal manera que la proliferacion de dichas celulas de mieloma multiple se suprime, por ejemplo, se suprime de manera perceptible. Adicionalmente, en la presente memoria se describe un metodo para suprimir la proliferacion de celulas de mieloma multiple in vivo, que comprende administrar a un individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y/o BM-MSC, que comprende celulas de mieloma multiple, en donde dicha administracion reduce, por ejemplo, reduce de forma perceptible, la proliferacion de dichas celulas de mieloma multiple. Por ejemplo, dicha administracion reduce, por ejemplo, reduce perceptiblemente (por ejemplo, mejora), uno o mas smtomas o signos de mieloma multiple, o disminuye el empeoramiento de dicho uno o mas smtomas o signos de mieloma multiple. Se puede evaluar una reduccion en la proliferacion de celulas de mieloma multiple despues de la administracion de celulas madre placentarias y / o BM-MSC, por ejemplo, detectando una reduccion en el numero de celulas plasmaticas de sangre o medula osea de un individuo que tiene mieloma multiple, por ejemplo, utilizando uno o mas anticuerpos espedficos contra celulas plasmaticas o celulas de mieloma multiple, por ejemplo, anticuerpos contra cD28 o CD138.
Adicionalmente, en la presente memoria se describe un metodo para reducir una cantidad de celulas de mieloma multiple, por ejemplo, en un individuo que tiene mieloma multiple, que comprende poner en contacto dichas celulas de mieloma multiple con celulas madre placentarias y/o BM-MSC aisladas (por ejemplo, BM-MSC aisladas o BM- MSC en medula osea), de tal manera que el numero de celulas de mieloma multiple en dicho individuo se suprime,
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p. ej., se suprime de forma perceptible, despues de dicha puesta en contacto. Por ejemplo, dicho contacto se realiza mediante la administracion de dichas celulas madre placentarias y/o BM-MSC, a dicho individuo. En otro ejemplo, dicha administracion reduce, por ejemplo, reduce perceptiblemente (por ejemplo, mejora), uno o mas smtomas o signos de mieloma multiple, o disminuye el empeoramiento de dicho uno o mas smtomas o signos de mieloma multiple. Una reduccion en el numero de celulas de mieloma multiple despues de la administracion de celulas madre placentarias y/o BM-MSC, en comparacion con antes de la administracion, puede evaluarse, por ej., por deteccion de una reduccion en el numero de celulas plasmaticas de sangre o medula osea de un individuo que tiene mieloma multiple, por ej., utilizando uno o mas anticuerpos espedficos contra celulas plasmaticas o celulas de mieloma multiple, por ejemplo, anticuerpos contra CD28 o CD138.
Tfpicamente, un individuo que presenta uno o mas smtomas de mieloma multiple se evalua con respecto a mieloma multiple al menos una vez antes de un diagnostico final de mieloma multiple, por ejemplo, como parte de las pruebas realizadas para llegar al diagnostico de mieloma multiple. Ademas, por lo general, un individuo diagnosticado con mieloma multiple se evalua al menos una vez, generalmente mas de una vez, despues de un diagnostico de mieloma multiple, para detectar smtomas de mieloma multiple para medir el progreso de la enfermedad. Dicha evaluacion puede comprender una determinacion de la extension y / o el numero de lesiones oseas utilizando, por ejemplo, analisis de rayos X, resonancia magnetica (RM), exploracion por tomograffa computarizada (TC), exploracion por tomograffa por emision de positrones (PET) o similar; una determinacion del nivel de calcio en la sangre; una determinacion del nivel de protemas M (anticuerpos o fragmentos de anticuerpos) en la sangre u orina, y similares. La eficacia del tratamiento del mieloma multiple, p. ej., la eficacia de la administracion de celulas madre placentarias y / o BM-MSC, puede evaluarse por cualquiera de uno o mas de dichos smtomas de mieloma multiple, por ejemplo, mediante la mejora en uno o mas, de dichos smtomas de mieloma multiple. La eficacia tambien se puede evaluar determinando el numero de celulas de mieloma multiple en la sangre o medula osea de dicho individuo, antes y despues de la administracion de dichas celulas madre placentarias y / o BM-MSC.
Por lo tanto, por ejemplo, cualquiera de los metodos anteriores comprende determinar, una o varias veces antes de dicha administracion, y, opcionalmente, una o mas veces despues de dicha administracion, uno o mas de (1) un numero o grado de lesiones oseas en dicho individuo; (2) un nivel de protemas M (paraprotema) en sangre u orina del individuo; (3) un nivel de calcio en la sangre del individuo; y / o (4) una serie de celulas de mieloma multiple en la sangre o medula osea del individuo. Si el nivel de calcio en la sangre del individuo, o el nivel de protemas M en la sangre o la orina del individuo, disminuye, por ejemplo, disminuye de manera perceptible, despues de la administracion de celulas madre placentarias y/o BM-MSC aisladas, en comparacion con el nivel antes de la administracion, las celulas madre placentarias y / o BM-MSC, son terapeuticamente eficaces. De manera similar, en determinados casos, la administracion de las celulas madre placentarias y/o BM-MSC es terapeuticamente eficaz si el numero de lesiones oseas, o el grado de gravedad de las lesiones oseas, en el individuo, disminuye despues de dicha administracion en relacion con el numero de lesiones oseas, o el grado de gravedad de las lesiones oseas antes de dicha administracion. En otros casos determinados, la administracion de las celulas madre placentarias y/o BM-MSC tambien es terapeuticamente eficaz, por ejemplo, si la administracion de las celulas madre placentarias y/o BM-MSC da como resultado una disminucion de un aumento en el nivel de protema M en la sangre u orina del individuo, o la disminucion en un aumento en el nivel de calcio en la sangre del individuo, o una disminucion en un aumento en el numero o gravedad de las lesiones oseas en el individuo. En determinados ejemplos, si no hay cambios perceptibles en el numero o la gravedad de las lesiones oseas en el individuo, en el nivel de protema M en la sangre o la orina del individuo, o en el nivel de calcio en la sangre en el individuo, despues de la administracion de dichas celulas madre placentarias y / o BM-MSC, la administracion de celulas madre placentarias, BM-MSC o ambas se repite.
La eficacia de la administracion de celulas madre placentarias y / o BM-MSC aisladas tambien se puede evaluar determinando que una cantidad, por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz de las celulas madre placentarias y / o BM-MSC reduce, por ejemplo, reduce de manera perceptible, el numero de precursores de osteoclastos o celulas de mieloma multiple en el individuo despues de la administracion. La reduccion del numero de precursores de osteoclastos en dicho individuo puede determinarse mediante cualquier metodo medicamente aceptable. Por ejemplo, el numero de precursores de osteoclastos puede determinarse utilizando un anticuerpo espedfico para precursores de osteoclastos para detectar precursores de osteoclastos, por ejemplo, en una muestra de sangre periferica o medula osea del individuo; el numero de celulas marcadas se puede evaluar, por ejemplo, mediante histologia, realizando un recuento de celulas con un microscopio, clasificando celulas marcadas por citometffa de flujo, o similar. En otro ejemplo, dicha cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias y/o BM-MSC reduce el numero de celulas de mieloma multiple en dicho individuo, por ejemplo, como puede determinarse mediante recuento celular (por ejemplo, mediante citometffa de flujo) o tincion de anticuerpos, de celulas sangumeas nucleadas de dicho individuo utilizando un anticuerpo espedfico para celulas de mieloma multiple o celulas plasmaticas, por ejemplo, un anticuerpo espedfico para marcadores celulares CD28 o CD138.
En cualquiera de los metodos de tratamiento de mieloma multiple, el tratamiento de un smtoma de mieloma multiple o la supresion de la proliferacion de celulas de mieloma multiple, como se describe en esta memoria, las celulas de mieloma multiple exhiben una translocacion de material genetico del cromosoma 4 al cromosoma 14 (p. ej. , una translocacion t(4: 14)). En otros casos, las celulas de mieloma multiple exhiben una translocacion t(14: 16), una translocacion t(11: 14) y / o una reorganizacion ilegffima de IgH con una pareja cromosomica desconocida. En otros casos determinados, las celulas de mieloma multiple no secretan cantidades perceptibles de inmunoglobulina. En
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otros casos determinados , las celulas de mieloma multiple secretan solo, o sustancialmente solo, inmunoglobulina de cadena ligera, por ejemplo, cadena ligera k (kappa), cadena ligera A (lambda), o ambas. En otros casos determinados, las celulas de mieloma multiple secretan inmunoglobulina que comprende una cadena pesada y una cadena ligera. En otros casos, las celulas de mieloma multiple producen inmunoglobulina IgG, inmunoglobulina, IgA o ambas.
En cualquiera de los ejemplos anteriores, las celulas madre placentarias aisladas pueden ser, por ejemplo, las celulas madre placentarias modificadas mediante ingeniena genetica descritas a continuacion. En cualquiera de los ejemplos anteriores, las BM-MSC pueden ser BM-MSC modificadas mediante ingeniena genetica. Las BM-MSC pueden modificarse mediante ingeniena genetica de cualquier manera, como se describe en la ingeniena genetica de celulas madre placentarias, y como se describe mas adelante en la Seccion 5.7.2.
En determinados casos, el individuo que tiene mieloma multiple se trata adicionalmente con un compuesto quimioterapeutico, por ejemplo, un compuesto antineoplasico descrito en la Seccion 5.1.3, a continuacion, por ejemplo, uno o mas de los compuestos antineoplasicos asf como con celulas madre placentarias y / o BM-MSC. Se pueden administrar celulas madre placentarias y / o BM-MSC a dicho individuo para tratar el mieloma multiple, por ejemplo, al mismo tiempo que, o al cabo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses despues del inicio de la quimioterapia, p. ej., quimioterapia para tratar dicho mieloma multiple. En otros casos, el compuesto antineoplasico se administra al cabo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses despues de la administracion de dichas celulas madre placentarias y / o BM-MSC.
5.1.2 Tratamiento del condrosarcoma
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para tratar a un individuo que tiene un condrosarcoma, que comprende administrar a dicho individuo celulas madre placentarias. Como en cualquier otro lugar de la presente memoria, dichas celulas madre placentarias aisladas, son como se definen en relacion con la invencion y ademas pueden tener cualquier combinacion de, o todas, las caractensticas descritas mas adelante en la Seccion 5.2.
Por lo tanto, en una realizacion, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para tratar a un individuo que tiene un condrosarcoma, que comprende administrar al individuo las celulas madre placentarias aisladas, en donde dicha administracion da como resultado la reduccion perceptible de la progresion, la disminucion perceptible del empeoramiento y / o la mejora perceptible de uno o mas smtomas de condrosarcoma. En realizaciones espedficas, dichos smtomas incluyen, pero sin limitacion, osteodinia, una o mas lesiones oseas visibles, por ejemplo, en una radiograffa, inflamacion del hueso, por ejemplo, en el sitio del tumor, o agrandamiento de uno o mas huesos.
En una realizacion espedfica, el condrosarcoma es un condrosarcoma de celulas claras. En otra realizacion espedfica, el condrosarcoma es un condrosarcoma benigno (encondroma). En otra realizacion espedfica, el condrosarcoma es un condrosarcoma maligno de grado bajo (condrosarcoma de grado I, caracterizado por tumores que se asemejan al cartflago normal; los tumores pueden rodear areas de hueso laminar y / o mostrar celulas atfpicas, incluidas las celulas binucleadas). En otra realizacion espedfica, el condrosarcoma es un condrosarcoma maligno de grado intermedio (condrosarcoma de grado II, caracterizado por celularidad significativa con muchas celulas atfpicas, muchas de las cuales tienen hipercromasia (una abundancia de ADN de tincion oscura en el nucleo) y tamano nuclear aumentado, en comparacion al grado I). En otra realizacion espedfica, el condrosarcoma es un condrosarcoma maligno de grado alto (condrosarcoma de grado III, caracterizado por areas marcadas de pleomorfismo, celulas grandes con hipercromasia significativa, celulas gigantes ocasionales y abundante necrosis). En otra realizacion espedfica, el condrosarcoma es un condrosarcoma desdiferenciado (un condrosarcoma que comprende un tumor de cartflago bien diferenciado (encondroma o condrosarcoma de grado II o II) adyacente a un sarcoma no cartilaginoso de grado alto). En otra realizacion espedfica, el condrosarcoma es un condrosarcoma mesenquimal.
En determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias se administran al individuo sin ningun tratamiento adicional del condrosarcoma. En otras realizaciones determinadas, dichas celulas madre placentarias se administran al individuo despues de cirugfa para extirpar parte o todo el tumor de condrosarcoma, o para extirpar parte o todo un hueso afectado por condrosarcoma. En otras realizaciones determinadas, dichas celulas madre placentarias se administran al individuo antes de la cirugfa, o en el momento de la misma, para extirpar parte o todo el tumor de condrosarcoma, o para extirpar parte o todo un hueso afectado por condrosarcoma. En otras realizaciones determinadas, las celulas madre placentarias se administran al individuo de manera sistemica, por ejemplo, en un sitio o a traves de una via distinta al sitio del condrosarcoma en el individuo; por ejemplo, por via intravenosa, intraarterial, peritoneal o similar. En otras realizaciones determinadas, las celulas madre placentarias se administran en el sitio del condrosarcoma o adyacente al mismo (si el tumor no se ha extirpado), por ejemplo, en el sitio del condrosarcoma en el individuo, o en el sitio en el cual se extirpo el condrosarcoma, si se hubiera realizado extirpacion quirurgica.
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5.1.3 Terapias de combinacion
Las celulas madre placentarias aisladas para su uso en el tratamiento de un cancer relacionado con hueso, p. ej., condrosarcoma, o de uno de los otros canceres relacionados con hueso mencionados en la presente memoria, pueden comprender la administracion, al individuo que tiene el cancer, de celulas madre placentarias en combinacion con una segunda terapia. En diversas realizaciones, la segunda terapia se administra al mismo tiempo que dichas celulas madre placentarias en el mismo ciclo de tratamiento que dichas celulas placentarias, despues de que dichas celulas madre placentarias se hayan administrado (por ej., despues de finalizar un ciclo de tratamiento que comprende administrar celulas madre placentarias), o antes de la administracion de celulas madre placentarias (por ejemplo, antes del inicio de un ciclo de tratamiento que comprende administrar celulas madre placentarias). En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias y la segunda terapia, se formulan conjuntamente para administrarse, por ejemplo, desde el mismo envase o recipiente. En otras realizaciones determinadas, cada una de las celulas madre placentarias y la segunda terapia, se formulan para administracion individual.
Por lo tanto, en otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para tratar a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, condrosarcoma, o uno de los otros canceres relacionados con hueso enumerados en relacion con la invencion, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias aisladas en combinacion con una o mas terapias antineoplasicas, por ejemplo, una o mas quimioterapias o compuestos quimioterapeuticos. Dichas otras terapias antineoplasicas pueden administrarse al individuo al mismo tiempo que dicha administracion de celulas madre placentarias, durante el mismo ciclo de tratamiento que dicha administracion de celulas madre placentarias, o de manera individual a dicha administracion de dichas celulas. En una realizacion espedfica, la una o mas terapias antineoplasicas se administran secuencialmente con la administracion de dichas celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dicha otra terapia antineoplasica o terapias antineoplasicas se administran a dicho individuo antes de la administracion de dichas celulas madre placentarias, por ejemplo, al individuo se le administra un ciclo de dichas otras terapias antineoplasicas, y se completa, antes de la administracion al individuo de celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se administran al individuo antes de la administracion de dichas otras terapias antineoplasicas; por ejemplo, a dicho individuo se le se administra un ciclo de celulas madre placentarias antes de la administracion de dichas otras terapias antineoplasicas, y finaliza, antes de la administracion al individuo de dicha otra terapia antineoplasica o terapias antineoplasicas.
Como se usa en esta memoria, un "agente antineoplasico " o una "terapia antineoplasica "es un agente o una terapia que se ha identificado, por, ej., en estudios clmicos, preclmicos o cientificos (incluyendo estudios esporadicos) que tienen un efecto tumoristatico o tumoricida sobre uno o mas tipos de celulas tumorales o neoplasicas.
En una realizacion espedfica, el agente antineoplasico es melfalan (tambien conocido como mostaza de L- fenilalanina o L-PAM, nombre comercial Albertan). Por lo tanto, en un ejemplo, un metodo de tratamiento de un individuo que tiene mieloma multiple comprende administrar a dicho individuo melfalan, por ejemplo, una dosis o dosis terapeuticamente eficaces de melfalan (por ejemplo, ALKERAN®). La administracion es tfpicamente oral o intravenosa. En otra realizacion espedfica, el agente antineoplasico es talidomida. En otra realizacion espedfica, el agente antineoplasico es un analogo de talidomida sustituido con amino o un imidazol sustituido con amino. En otra realizacion espedfica, el agente antineoplasico es pomalidomida (comercializada con el nombre comercial ACTIMID®); lenalidomida (comercializada con el nombre comercial REVLIMID®); o lenalidomida en combinacion con dexametasona. En otra realizacion espedfica, el tratamiento antineoplasico es bortezomib (p. ej., VELCADE®). En otra realizacion espedfica, el agente antineoplasico comprende una combinacion de melfalan, prednisona y talidomida (administrados individual o conjuntamente). En otra realizacion espedfica, el agente antineoplasico es la combinacion de bortezomib, melfalan y prednisona (administrados individual o conjuntamente). En otras realizaciones espedficas, el agente antineoplasico es uno o mas de ciclofosfamida (por ejemplo, CYTOXAN®), vincristina (p. ej., ONCOVIN®, VINCASAR PFS®), doxorrubicina (por ejemplo, ADRIAMYCIN RDF®, ADRIAMYCIN PFS®) o doxorrubicina liposomica (por ejemplo, DOXIL®).
En la tecnica se conocen bien otros agentes antineoplasicos. Por lo tanto, en otras realizaciones espedficas, los agentes antineoplasicos incluyen, pero sin limitacion: acivicina; aclarrubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlin; azacitidina; azetepa; azotomicina; batismat, benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sodico; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimero; carboplatino; carmustina; clorhidato de carubicina; carzelesina; cedefingol; celecoxib (inhibidor de COX-2); clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflomitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirrubicina; erbulozol; clorhidrato de esorrubicina; estramustina; estramustina fosfato de sodio; etanidazol; etoposido; etoposido fosfato; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fludarabina fosfato; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sodica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; iproplatino; irinotecan; clorhidrato de irinotecan; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sodico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de
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megestrol; acetato de melengestrol; melfalan; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sodico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; acido micofenolico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; peplomicina sulfato; perfosfamida; pipobromano; piposulfan; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porffmero sodico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sodico; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan sodico; taxotere; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfin; teniposido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; trimetrexato glucuronato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorrelbina; sulfato de vinrrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; y clorhidrato de zorrubicina.
Otros farmacos antineoplasicos incluyen, pero sin limitacion: 20-epi-1, 25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarrubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; acido aminolevulmico; amrrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de angiogenesis; antagonista D; antagonista G; antarrelix; protema morfogenetica antidorsalizante 1; antiandrogeno, carcinoma prostatico; antiestrogeno; antineoplaston; oligonucleotidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores del gen de la apoptosis; reguladores de la apoptosis; acido apurmico; ara-CDP- DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzofl estaurosporina; derivados de betalactama; beta-aletina; betaclamicina B; acido betulmico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitan; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de carfflago; carzelesina; inhibidores de casema quinasa (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; cloruros; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; analogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; analogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolffico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorespermine; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9- dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; doxorrubicina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemene; emitefur; epirrubicina; epristerida; analogo de estramustina; agonistas de estrogenos; antagonistas de estrogenos; etanidazol; etoposido fosfato; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorrunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotomustina; texafirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutation; hepsulfam; herregulina; hexametilen bisacetamida; hipericina; acido ibandronico; idarrubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imatinib (por ejemplo, GLEEVEC®), imiquimod; peptidos inmunoestimuladores; inhibidor del receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina; agonistas de interferon; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorrubicina; ipomeanol, 4-iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetron; jasplaquinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarin-N; lanreotida; Ieinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolestatina; letrozol; factor inhibidor de leucemia; interferon alfa de leucocitos; leuprolida + estrogeno + progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; analogo de poliamina lineal; peptido disacarido lipofilo; compuestos lipofilos de platino; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina: lometrexol; lonidamina; losoxantrone; loxoribina; lurtotecan; lutecio texafirina; lisofilina; peptidos lfficos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelin; metioninasa; metoclopramida; Inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; mitoguazona; niitolactol; analogos de mitomicina; mitonafida; factor de crecimiento de fibroblastos de mitotoxina-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; Erbitux, gonadotropina corionica humana; monofosforil lfpido A + pared celular de micobacterias sk; mopidamol; agente antineoplasico de mostaza; micaperoxido B; extracto de pared celular micobacteriana; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona + pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorrubicina; acido neridronico; nilutamida; nisamicina; moduladores de oxido mtrico; nitroxido antioxidante; nitrulilina; oblimersen (p. ej., GENASENSE®); 06-bencilguanina; octreotido; okicenona; oligonucleotidos; onapristona; ondansetron; oracina; inductor de citocina oral; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; analogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina;palmitoilrizoxina; acido pamidronico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazelliptina; pegaspargasa; pelesina; pentosan polisulfato sodico; pentostatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida; alcohol perifflico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarrubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor del activador de plasminogeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porffmero de sodio; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores del proteasoma; inmunomodulador basado en protema A; inhibidor de protema quinasa C; inhibidores de protema quinasa C, microalgas; inhibidores de protema tirosina fosfatasa; inhibidores de purina nucleosido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado piroxilado de hemoglobina polioxietileno; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetron;
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inhibidores de la protema ras farnesil transferasa; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; robitucina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcophytol A; sargramostim; mimeticos Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de senescencia; oligonucleotidos en sentido; inhibidores de la transduccion de senales; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato sodico; fenilacetato sodico; Solverol; protema de union a somatomedina; sonermina; acido esparfosico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista del peptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; tallimustina; tamoxifeno metiodida; tauromustina; tazaroteno; tecogalan sodico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfina; teniposido; tetraclorodecaoxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimetido de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinan; hormona estimulante del tiroides; estanoetil etiopurpurina; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; inhibidores de la traduccion; tretinoma; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetron; turosterida; inhibidores de tirosina quinasa; tirfostinas; Inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado de seno urogenital; antagonistas del receptor de uroquinasa; vapreotida; variolina B; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y zinostatina estimalamer.
En otras realizaciones, la terapia de combinacion comprende la administracion de celulas madre placentarias a un individuo en combinacion con un inhibidor de osteoclastos, por ejemplo, un inhibidor de la formacion de osteoclastos o de la diferenciacion de precursores de osteoclastos en osteoclastos. En una realizacion espedfica, el inhibidor de osteoclastos es un inhibidor de RANKL, por ejemplo, Denosumab. En otra realizacion espedfica, el inhibidor de osteoclastos es un inhibidor de integrina o catepsina K.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias para su uso en la invencion que comprenden la terapia de combinacion comprenden la administracion de celulas madre placentarias en combinacion con bifosfonatos. En realizaciones espedficas, los bifosfonatos son aledronato (p. ej., a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg al dfa, o de aproximadamente 35 mg a aproximadamente 70 mg una vez a la semana; con o sin vitamina D complementaria), ibandronato, risedronato, clodronato y/o pamidronato. En otra realizacion, la terapia de combinacion comprende la administracion de celulas madre placentarias en combinacion con una o mas de calcitonina, estrogeno, hormona paratiroidea (p. ej., teriparatida, por ejemplo, FORTEO®) o raloxifeno.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias asiladas para su uso en un metodo para tratar a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, condrosarcoma, o uno de los otros canceres relacionados con hueso enumerados en relacion con la invencion, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias aisladas en combinacion con un compuesto que tiene actividad antagonista de antagonista de activina o de receptor de activina RIIa (ActRIIa), por ejemplo, un antagonista de ActRIIa. En una realizacion espedfica, dicho antagonista de ActRIIa es una protema de fusion IgC-Fc del receptor de activina soluble de tipo IIA (p. ej., ACE-01 1®). Vease, por ejemplo, la Publicacion de la Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2009/0142333.
En otra realizacion, en la presente memoria se proporcionan celulas madre placentarias para su uso un metodo para tratar a un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, condrosarcoma o uno de los otros canceres relacionados con hueso enumerados en relacion con la invencion, que comprende administrar al individuo celulas madre placentarias aisladas en combinacion con radioterapia. En determinadas realizaciones, la radioterapia comprende administrar rayos X a un organo o tejido en el individuo que tiene el cancer relacionado con hueso, que se ve afectado por el cancer relacionado con hueso. En realizaciones espedficas, por ejemplo, dicha radioterapia, por ejemplo, rayos X, se administra a una lesion osea causada por condrosarcoma. En otras realizaciones espedficas, dicha radioterapia, por ejemplo, rayos X, se administra a la mitad del cuerpo del individuo que se ve afectado por dicho cancer relacionado con hueso. En otras realizaciones espedficas, dicha radioterapia, por ejemplo, rayos X, se administra a todo el cuerpo del individuo afectado. En otras realizaciones, dicha radioterapia comprende administrar un haz de protones o un haz de electrones a un organo o tejido en el individuo que tiene el cancer relacionado con hueso, que se ve afectado por el cancer relacionado con hueso. En otras realizaciones determinadas, dicha radioterapia se administra en preparacion para la terapia de reemplazo de celulas madre hematopoyeticas (por ejemplo, radioterapia para destruir el sistema hematopoyetico existente en el individuo).
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas para su uso en la invencion, se combinan con un sustituto oseo, por ejemplo, para tratar una lesion osea asociada a un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, mediante administracion en, o adyacente a, una lesion osea causada por un cancer relacionado con hueso. En una realizacion espedfica, dicho sustituto oseo es un material ceramico fisiologicamente aceptable, por ejemplo, fosfato de mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri- y tetra-calcio, hidroxiapatita, una fluoroapatita, un sulfato de calcio, un fluoruro de calcio, un oxido de calcio, un carbonato de calcio, un fosfato de calcio - magnesio, un vidrio biologicamente activo (por ejemplo, BIOGLASS®), o una mezcla de cualquiera de los mismos. En otra realizacion espedfica, dicho sustituto oseo es un material ceramico biocompatible poroso (por ejemplo, SURGIBONE®, ENDOBON®, CEROS® o similares), o un producto de injerto oseo de colageno mineralizado (por ejemplo, HEALOS™, VITOSS®, RHAKOSS™ y CORTOSS®, o similares)
5.2 CELULAS MADRE PLACENTARIAS
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Las celulas madre placentarias aisladas, utiles en el tratamiento de individuos que tienen un cancer relacionado con hueso, o que tienen celulas de un cancer relacionado con hueso, son celulas que pueden obtenerse de una placenta o de una parte de la misma, que se adhieren a un sustrato de cultivo tisular (por ejemplo, plastico de cultivo tisular no recubierto), y que tienen caractensticas de celulas madre o celulas multipotentes. En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos descritos en la presente memoria, tienen la capacidad de diferenciarse en uno o mas tipos de celulas no placentarias. Las celulas madre placentarias son utiles en los metodos descritos en la presente memoria y que se describen en la presente memoria y, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 7.486.276 y en la Publicacion de la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2007/0275362. Las celulas madre placentarias no son trofoblastos, citotrofoblastos, celulas germinales embrionarias o celulas madre embrionarias, celulas conocidas por los expertos en la materia.
Las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos descritos en la presente memoria, pueden ser de origen fetal o materno (es decir, pueden tener el genotipo del feto o de la madre, respectivamente). Preferiblemente, las celulas madre placentarias aisladas y las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas son de origen fetal. Las celulas madre placentarias aisladas o las poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias aisladas pueden comprender celulas madre placentarias aisladas que son unicamente de origen fetal o materno o pueden comprender una poblacion mixta de celulas madre placentarias aisladas de origen tanto fetal como materno. En determinadas realizaciones de cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria, dichas celulas madre placentarias aisladas son de origen no materno. En otras realizaciones determinadas, dichas celulas madre placentarias carecen sustancialmente de celulas maternas; p. ej, al menos aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 90 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de dichas celulas, son de origen no materno.
Las celulas madre placentarias aisladas, y las poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias aisladas, pueden identificarse y seleccionarse por caractensticas morfologicas, de marcaje y de cultivo analizadas a continuacion. En determinadas realizaciones, cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria, son autologas para un receptor, por ejemplo, para un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso o celulas de un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, condrosarcoma o celulas de condrosarcoma u otro cancer relacionado con hueso o celulas de otro cancer relacionado con hueso. En otras realizaciones determinadas, cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria, son heterologas para un receptor, por ejemplo, para un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, o celulas de un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, condrosarcoma o celulas de condrosarcoma, u otro cancer relacionado con hueso o celulas de otro cancer relacionado con hueso.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias utiles en los metodos de la invencion, por ejemplo, las celulas madre placentarias descritas en esta memoria, se obtienen de una placenta a termino, es decir, de una placenta posparto de mairnfero, por ejemplo, de ser humano. En otras realizaciones determinadas, las celulas madre placentarias utiles en los metodos de la invencion, por ejemplo, las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, se obtienen de una placenta de mam^era pretermino, por ejemplo, de ser humano.
5.2.1 Caractensticas fisicas y morfologicas
Cuando las celulas madre placentarias (PDAC) aisladas descritas en la presente memoria, se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato de cultivo tisular, por ejemplo, a la superficie del recipiente de cultivo tisular (por ejemplo, plastico de cultivo tisular), o a una superficie de cultivo tisular recubierta con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (por ejemplo, nativo o desnaturalizado), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina y proterna de membrana extracelular (por ejemplo, MATRIGEL® (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)). Las celulas madre placentarias aisladas en cultivo asumen un aspecto estrellado generalmente fibroblastoide, con una serie de procesos citoplasmaticos que se extienden desde el cuerpo de la celula central. Sin embargo, las celulas, se distinguen morfologicamente de los fibroblastos cultivados en las mismas condiciones, ya que las celulas madre placentarias aisladas exhiben un mayor numero de procesos de este tipo que los fibroblastos. Morfologicamente, las celulas madre placentarias aisladas tambien se distinguen de las celulas madre hematopoyeticas, que generalmente asumen una morfologfa mas redondeada o adoquinada en cultivo, y no se adhieren al plastico de cultivo tisular. Morfologicamente, las celulas madre placentarias tambien se distinguen de los trofoblastos o citotrofoblastos, que tienden a aparecer redondeados o epiteloides y, en el caso de los citotrofoblastos, multinucleados en comparacion con las celulas madre placentarias uninucleadas. Las celulas madre placentarias son unicelulares y permanecen unicelulares durante el cultivo y durante multiples pases y no forman, por ejemplo, celulas multinucleares en cultivo, por ejemplo, en cultivo en medio de crecimiento en aire, o en cultivo en medio de crecimiento con aire 95% / CO2 5%.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos de la invencion, por ejemplo, los metodos de tratamiento o metodos para suprimir el crecimiento de celulas cancerosas relacionadas con hueso o suprimir la diferenciacion de los precursores de osteoclastos en osteoclastos, cuando se cultivan en un medio de crecimiento, desarrollan cuerpos similares a embriones. Los cuerpos similares a embriones son bien conocidos en la tecnica y son grupos no contiguos de celulas que pueden crecer en la parte superior de una capa de proliferacion adherente de celulas madre placentarias aisladas. La expresion "similar a un embrion" se utiliza porque los grupos de celulas se asemejan a cuerpos embrionarios, grupos de celulas que crecen de cultivos de celulas
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madre embrionarias. El medio de crecimiento en donde pueden desarrollarse cuerpos similares a embriones que pueden desarrollarse en un cultivo en proliferacion de celulas madre placentarias aisladas incluye medio que comprende, por ejemplo, DMEM-LG (por ejemplo, de Gibco); suero bovino fetal al 2% (p. ej., De Hyclone Labs.); 1x insulina-transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10"9M (p. ej., de Sigma); acido 2-fosfato ascorbico 10-4 M (p. ej., de Sigma); factor de crecimiento epidermico 10 ng/ml (por ejemplo, de R & D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (por ejemplo, de R & D Systems).
5.2.2 Marcadores de superficie celular, moleculares y geneticos
Las celulas madre placentarias aisladas son celulas madre placentarias humanas adherentes a plastico de cultivo tisular que tienen caractensticas de celulas multipotentes o celulas madre, y expresan una pluralidad de marcadores que se pueden utilizar para identificar y / o aislar las celulas, o poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre. Las celulas madre placentarias aisladas incluyen celulas y poblaciones de celulas que contienen celulas madre placentarias obtenidas directamente de la placenta, o de una parte de la misma. Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas tambien incluyen poblaciones (es decir, dos o mas) de celulas madre placentarias aisladas en cultivo, y una poblacion en un recipiente, por ejemplo, una bolsa. Las celulas madre placentarias aisladas en la presente memoria descritas no son celulas mesenquimatosas derivadas de medula osea, celulas madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo o celulas mesenquimatosas obtenidas de sangre de cordon umbilical, sangre placentaria o sangre periferica. Las celulas madre placentarias utiles en los metodos y composiciones descritos en esta memoria se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 7,31 1, 904; 7,31 1,905; y 7,468,276; y en la Publicacion de la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2007/0275362. En una realizacion espedfica de cualquiera de las realizaciones de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria, las celulas son celulas de mairnfero, por ejemplo, de ser humano.
Segun la invencion, las celulas madre placentarias aisladas son celulas madre placentarias aisladas. Espedficamente, las celulas placentarias aisladas son celulas multipotentes placentarias aisladas. Segun la invencion, las celulas madre placentarias aisladas son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo. Tal como se usa en esta memoria, la frase "como puede detectarse por", "como puede determinarse por" y frases similares, no indica que la expresion de los marcadores indicados de las celulas tenga que evaluarse para que las celulas se "afslen", ni que las celulas deban aislarse utilizando los marcadores. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+tienen el potencial de diferenciarse en celulas de un fenotipo neuronal, celulas de un fenotipo osteogenico y / o celulas de un fenotipo condrogenico, por ejemplo, in vitro o in vivo, o ambas cosas. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas de CD34-, CD10+, CD105 + son adicionalmente CD200+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+y CD200+ aisladas son adicionalmente CD45-o CD90+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+y CD200+ aisladas son adicionalmente CD45-y CD90+, como puede detectarse mediante citometna de flujo. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias cD34-, CD10+, CD105+y CD200+ aisladas son adicionalmente CD90 + o CD45-, como puede detectarse por citometna de flujo. En una realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+y CD200+ son adicionalmente una o mas de CD44+, CD45-, CD90+, CD166+, KDR+oCD133-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+ aisladas son adicionalmente CD44 +, CD45-, CD90 +, CD166 +, KdR + y CD133-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+ aisladas son adicionalmente CD90 + y CD45-, como puede detectarse mediante citometna de flujo, es decir, las celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD45-, CD90+, CD105+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD45-, CD90+, CD105+, CD200 + son ademas, CD44 +, CD80- y / o CD86-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD44+, CD45-, CD90+, CD105+, CD200 + son adicionalmente una o mas de CD80-, CD86-, CD117-, CD133-, citoqueratina +, KDR +, HLA-A, B, C +, HLA-DR, DP, DQ-y HLA-G-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105 +, CD200+ son, ademas, una o mas de SSEA1-, SSEA3- y/o SSEA4-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10 +, CD105+, CD200+ son adicionalmente SSEA1-, SSEA3- y SSEA4-.
En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, y una o mas de CD44+, CD45-, CD90+, CD166+, KDR- o CD133-. En una realizacion mas espedfica, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, CD44+, CD45-, CD90+, CD166+, KDR' y CD133-. En otra realizacion, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, y una o mas de HLA ABC+, HLA DR, DQ, DP-, CD80-, CD86-, Cd98- o PD-L1+. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, HLA ABC+, HLA DR, DQ, DP-, CD80-, CD86-, CD98-, y PD-L1+. En
determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, y una o mas de CD3-, CD9-, CD38-, CD45-, CD80-, CD86-, CD133-, HLA-DR,DP,DQ-, SSEA3-, SSEA4-, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, HLA-A,B,C+, PDL1+, ABC-p+, y/u OCT-4+, como puede detectarse mediante citometna de flujo. En otras realizaciones, cualquiera de las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ descritas anteriormente, son adicionalmente una o mas de CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, SH3+ o SH4+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias son adicionalmente CD44+. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas anteriores, las celulas son adicionalmente una o mas de CD117-, CD133-, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, o Ligando 1 de muerte programada
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(PDL1)+, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son adicionalmente una o mas de CD3", CD9", CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+
(CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-caderinabaja,
CD146+, CD166+, CD184/CXCR4", CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDR" (VEGFR2" ), HLA-
A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G-, o Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realizacion, las celulas madre placentarias CD3-, CD9^ CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ son adicionalmente CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+
(CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE- caderinabaja, CD146+, CD166+, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR' (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-
DP,DQ,DR-, HLA-G-, y Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+.
En otra realizacion espedfica, cualquiera de las celulas madre placentarias aisladas descritas en esta memoria son ABC-p +, como puede detectarse por citometna de flujo y/u OCT-4 + (POU5F1+), como puede determinarse mediante RT-PCR, en donde ABC-p es una protema transportadora ABC espedfica de placenta (tambien conocida como protema de resistencia al cancer de mama (BCRP) y como protema de resistencia a mitoxantrona (MXR)), y OCT-4 es la protema Octamer-4 (POU5F1). En otra realizacion espedfica, cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria son adicionalmente SSEA3- o SSEA4-, como puede detectarse por citometna de flujo, en donde SSEA3 es el antfgeno 3 espedfico de fase embrionaria, y SSEA4 es el antfgeno 4 espedfico de fase embrionaria. En otra realizacion espedfica, cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria son, ademas, SSEA3- y SSEA4-.
En otra realizacion espedfica, cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria son una o mas de MHC-I+ (por ejemplo, HLA-A, B, C +), MHC-ir (por ejemplo, HLA-DP, DQ, DR-) o HLA-G-. En otra realizacion espedfica, cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria son una o mas de MHC-I + (por ejemplo, HLA-A, B, C +) MHC-ir (por ejemplo, HLA-DP, DQ, DR- y HLA-G-.
En la presente memoria tambien se proporcionan poblaciones de celulas que comprenden, por ejemplo, que estan enriquecidas con, las celulas madre placentarias aisladas, que son utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria. Las poblaciones preferidas de celulas comprenden las celulas madre placentarias aisladas, en donde al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD10+, CD105+ y CD34- aisladas. En una realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son adicionalmente CD200+.En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son adicionalmente CD90+ o CD45-, como puede detectarse por citometna de flujo. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son adicionalmente CD90+ y CD45-, como puede detectarse por citometna de flujo. En otra realizacion espedfica, cualquiera de las celulas madre placentarias CD34- CD10+, CD105+, CD200+ aisladas, descritas anteriormente, son adicionalmente una o mas de CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, SH3+ o SH4+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son adicionalmente CD44+. En una realizacion espedfica de cualquiera de las poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias CD34- , CD10+, CD105+ y CD200+ aisladas anteriores, las celulas madre placentarias son adicionalmente una o mas de CD13+, CD29+ , CD33+ , CD38- , CD44+, CD45-, CD54+, CD62E-, CD62L-, CD62P- SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+),
CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-caderinabaja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR, HLA-G-, o Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realizacion espedfica, las celulas CD34-, CD10+, CD105+ CD200+ son adicionalmente CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-,
CD144/VE-caderinabaja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G-, y Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, y una o mas, o todas de CD29+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+, en donde dichas celulas madre placentarias aisladas se obtienen por alteracion ffsica y/o enzimatica del tejido placentario. En una realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+ y ABC-p+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+ y CD34-, en donde dichas celulas madre placentarias aisladas tienen al menos CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, y una, o todas, las siguientes caractensticas: CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3- y SSEA4-. En otra realizacion espedfica las celulas madre placentarias aisladas son OCT-4+, CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3-, y SSEA4-. En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+, CD34-, SSEA3-, y SSEA4-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+ y CD34-, y son SH2+ o SH3+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+, CD34-, SH2+ y SH3+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+, CD34-, SSEA3- y SSEA4-, y cualquiera de SH2+ o SH3+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+ y CD34-, y
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cualquiera de SH2+ o SH3+, y es al menos una de CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SSEA3-, o SSEA4-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+, CD34-, CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+ CD90+, SSEA3- y SSEA4-, y cualquiera de SH2+ o SH3+.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los modos y composiciones descritos en la presente memoria son CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, y adicionalmente SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son CD10+ CD34-, CD105+, CD200+, y adicionalmente CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, CD34- , CD45-, SSEA3- o SSEA4- . En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3- y SSEA4-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3- y SSEA4- Cd1o+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, OCT-4+, CD34- o CD45-.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la memoria son CD10+, CD34-, CD105+, CD200+, y adicionalmente CD29+ CD34-, CD44+ CD45-, CD54+, CD90+. SH2+, SH3+, y SH4+; en donde dichas celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente una o mas de OCT-4+, SSEA3- o SSEA4-.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son adicionalmente HLA-G-. En una realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son CD200+ y HLA-G". En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente CD34- CD38-y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas CD200+ y HLA-G- facilitan la formacion de cuerpos similares a embriones en una poblacion de celulas placentarias que comprenden las celulas madre placentarias aisladas en condiciones que permiten la formacion de cuerpos similares a embriones. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas se afslan de celulas placentarias que no son celulas madre o multipotentes. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias se afslan de celulas placentarias que no presentan a estos marcadores.
En otra realizacion, una poblacion de celulas util en los metodos y composiciones descritos en el presente documento es una poblacion de celulas que comprende, por ejemplo, que esta enriquecida con celulas madre placentarias CD200+, HLA-G-. En una realizacion espedfica, dicha poblacion es una poblacion de celulas placentarias. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 % de celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD200+, HLA-G- aisladas. En determinadas realizaciones, al menos aproximadamente el 70 % de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD200+, HLA-G-aisladas. En otras realizaciones determinadas, al menos aproximadamente el 90 %, 95 %, o 99 % de dichas celulas son celulas madre placentarias CD200+, HLA- G- aisladas. En una realizacion espedfica de las poblaciones de celulas, dichas celulas madre placentarias CD200+, HLA-G- aisladas tambien son CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, HLA-G- aisladas tambien son CD34- y adicionalmente CD38- o CD45\ En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, HLA-G- aisladas tambien son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, HLA-G- aisladas se afslan de celulas placentarias que no presentan estos marcadores.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en el presente documento son CD73+, CD105+, y CD200+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente HLA-G-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son CD34- y adicionalmente CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son CD34--, CD38- y CD45- En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son CD34-, CD38- CD45-, y HLA-G-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no son las celulas madre placentarias aisladas. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas se afslan de celulas placentarias que no presentan estos marcadores.
En otra realizacion, una poblacion de celulas util en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria es una poblacion de celulas que comprende, por ejemplo, que es rica en celulas madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 % de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 90 %, 95 % o 99 % de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En una realizacion espedfica de dichas poblaciones, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente HLA-G-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente CD34- y adicionalmente CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, las
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celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente CD34", CD38" y CD45". En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente CD34", CD38", CD45" y HLA-GL". En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas madre placentarias esta aislada de celulas placentarias que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas madre placentarias esta aislada de celulas placentarias que no presentan estas caractensticas.
En otras realizaciones determinadas, las celulas madre placentarias son CD34", CD10+, CD105+, CD200+, y una o mas de CD29+, CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4" , OCT-4+, HLA-G" o
ABC-p+ aisladas. En una realizacion espedfica, las celulas madre placentarias son CD10+, CD34", CD105+, CD200+, y una o mas de CD29+, CD38" CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4" , y OCT-4+ aisladas. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias son CD10+, CD34", CD105+, CD200+, y una o mas de CD29+, CD38", CD45", CD54+, SH2+, SH3+, y SH4+ aisladas. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son CD10+, CD34", CD105+, CD200+, y una o mas de CD29+, CD38" CD45", CD54+, SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son CD10+ CD34", CD105+, CD200+, y una o mas de CD29+, CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, HLA-G", SH2+, SH3+, SH4+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias son adicionalmente OCT-4+ y ABC-p+ aisladas. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias son adicionalmente SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente OCT-4+, CD34-, SSEA3-, y SSEA4- aisladas. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias OCT-4+, CD34-, SSEA3-, y sSeA4- aisladas son adicionalmente CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, y SH4+. En otra realizacion, las
celulas madre placentarias adicionalmente OCT-4+ y CD34- y cualquiera de SH3+ o SH4+. En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas son CD34-, CD10+, CD105+. CD200+ y cualquiera de CD29+, CD44+, CD54+, CD90+ u OCT-4+.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles de los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD200+ y OCT-4+. En una realizacion espedfica, las celulas madre placentarias son CD73+ y CD105+ aisladas En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente HLA- G-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son CD34- y adicionalmente CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT- 4+ aisladas son CD34-, CD38- CD45- CD73+, CD105+ y HLA-G- En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas estan aisladas lejos de celulas de la placenta que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas, estan aisladas de celulas placentarias que no presentan estas caractensticas.
En otra realizacion, una poblacion de celulas util en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria es una poblacion de celulas que comprende, por ejemplo, que esta enriquecida con, celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 % de celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 70 % de dichas celulas son celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de las celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas. En una realizacion espedfica de las poblaciones aisladas, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son adicionalmente CD73+ y CD105+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son adicionalmente HLA-G- En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son adicionalmente CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G-. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas esta aislada de celulas placentarias que no son celulas madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas esta aislada de celulas placentarias que no presentan estos marcadores.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD73+, CD105+ y HLA-G-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD73+, CD105+ y HLA-G- aisladas son CD34+ y adicionalmente CD38- o CD45-. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas son adicionalmente CD34-, CD38- y CD45- En otra realizacion espedfica, celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas son adicionalmente OCT-4+. En otra realizacion espedfica, celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas son CD200+. En otra realizacion espedfica, celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas son CD34- CD200+, y adicionalmente CD38- , CD45-, OCT-4+ En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas estan aisladas de celulas madre placentarias que no son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no presentan estos marcadores.
En otra realizacion, una poblacion de celulas util en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria es una poblacion de celulas que comprende, por ejemplo, que es rica en celulas madre placentarias CD73+, CD105+ y HLA-G- aisladas. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el
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20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 % de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 70% de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas. En otra realizacion, al menos aproximadamente el 90 %, 95 % o 99 % de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas. En una realizacion espedfica de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas tambien son CD34" y adicionalmente CD38" o CD45". En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas son adicionalmente CD34-, CD38- y CD45-. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas son adicionalmente OCT-4+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas tambien son CD200+. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas tambien son CD34- CD10+, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas esta aislada de celulas placentarias que no son celulas madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G-. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas esta aislada de celulas placentarias que no presentan estos marcadores.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son celulas madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, HlA-A,B,C+, CD45- y CD133- aisladas. En otra realizacion, una poblacion de celulas util en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria es una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 99 % de las celulas en dicha poblacion de celulas aisladas son celulas madre placentarias Cd34-, CD10+, CD105+, CD200+, HLA-A,B,C+ , Cd45-, CD133- y CD34- aisladas. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias o poblacion de celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no son celulas madre placentarias HLA-A,B,C+, CD45-, CD133- y CD34-. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, dichas celulas madre placentarias no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias carece sustancialmente de componentes maternos, por ejemplo, al menos aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 90 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas placentarias no son de origen materno.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son celulas madre placentarias CD10+ CD34-, CD105+, CD200+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- y CD133- aisladas. En otra realizacion, una poblacion de celulas util en los medios y composiciones descritas en el presente documento es una poblacion de celulas que comprende dichas celulas madre placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 99 % de celulas en dicha poblacion de celulas son dichas celulas madre placentarias CD10+ CD34-, CD105+, CD200+, CD13+ , CD33+, CD45-, CD117- y CD133- aisladas. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas o poblacion de celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no son dichas celulas placentarias aisladas. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias CD10+ .CD34-, CD105+, CD200+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- y CD133- aisladas no son de origen materno, es decir, tienen el genotipo fetal. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 90 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas madre placentarias aisladas, no son de origen materno. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas o poblacion de celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no presentan estas caractensticas.
En algunos casos, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son celulas madre placentarias CD10- , CD33- , CD44+, CD45- y CD117- aisladas. En otro caso, una poblacion de celulas util en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria es una poblacion de celulas que comprende, por ejemplo, esta enriquecida con, dichas celulas madre placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 99 % de celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias CD10-, CD33-, CD44+, CD45-, y CD117- aisladas. En un ejemplo, dichas celulas madre placentarias aisladas o poblacion de celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no son dichas celulas madre placentarias. En otro ejemplo, dichas celulas madre placentarias aisladas no son de origen materno. En otro ejemplo al menos aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 90 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de dichas celulas madre placentarias en dicha poblacion de celulas son de origen no materno. En otro ejemplo dichas celulas madre placentarias aisladas o poblacion de celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no presentan estos marcadores.
En otro caso, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son celulas madre placentarias CD10-, CD13-, CD33-, CD45- y CD117- aisladas. En un ejemplo, una poblacion de celulas util para los metodos y composiciones descritos en la presente memoria es una poblacion de celulas que comprende, por ejemplo, esta enriquecida con celulas madre placentarias CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117- aisladas, en donde al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 99 % de las celulas
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en dicha poblacion son celulas madre placentarias CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117-. Un ejemplo espedfico, dichas celulas madre placentarias aisladas o poblacion de celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no son celulas madre placentarias. En otro ejemplo, dichas celulas madre placentarias aisladas no son de origen materno. En otro ejemplo, al menos aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 90 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son de origen no materno. En otro ejemplo, dichas celulas madre placentarias aisladas o poblacion de celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no presentan estas caractensticas.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son HLA A,B,C+, CD45-, CD34-, CD133-, CD10+, CD13+, CD38+, CD44+, CD90+, CD105+, CD200+ y adicionalmente HLA-G-, y/o negativas para CD117. En otra realizacion, una poblacion de celulas util en los metodos descritos en el presente documento es una poblacion de celulas que comprende dichas celulas madre placentarias aisladas, en donde al menos aproximada mente el 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98% o aproximadamente el 99 % de las celulas en dicha poblacion son celulas madre placentarias aisladas que son HLA A,B,C- , CD45- , CD34- , CD133- , y que son positivas para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200, y/o negativas para CD117 y/o HLA-G. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas o poblacion de celulas madre placentarias aisladas son aisladas de celulas placentarias que no son dichas celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas son de origen no materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 90 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son de origen no materno. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas o poblacion de celulas madre placentarias aisladas estan aisladas de celulas placentarias que no presentan estos marcadores.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD200+ y CD10+, como puede determinarse mediante union a anticuerpos y CD117-, como puede determinarse mediante union a anticuerpos y RT-PCR. En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD10+, CD29-, CD54+, CD200+, HLA-G-, MHC de clase I+ y U-2- microglobulina+. En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son celulas placentarias en donde la expresion de al menos un marcador celular es al menos dos veces mayor que para una celula madre mesenquimatosa (por ejemplo, una celula madre mesenquimatosa derivada de medula osea). En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias son de origen no materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 90 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son de origen no materno.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, y una o mas de CD29+ , CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, CD80', CD86', CD103-, CD104-, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinabaja, CD184/CXCR4- ,132 microglobulinabaja, MHC-Ibaja, MHC-II-, HLA-Gbaja, y/o PDLlbaja. En una realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente al menos CD29+ y CD54+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente al menos CD44+ y CD106+. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas son adicionalmente al menos CD29+.
En otra realizacion, una poblacion de celulas util en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria comprenden celulas madre placentarias aisladas en donde al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %. 95 %, 98 % o 99 % de las celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre placentarias aisladas que son CD34-, CD10+, CD105+, CD200+, y una o mas de CD29+, CD44+, CD45', CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, CD80', CD86' CD103-, CD104-, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinadim, CD184/CXCR4-, l32-microglobulinadim, HLA-Idim, HLA-ii"-, HLA-Gdim, y/o PDLldim. En otra realizacion espedfica, al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de celulas en dicha poblacion son CD10+ CD34', CD105+, CD200+, CD29+, CD44+, CD45', CD54/ICAM+, CD62-E', CD62-L-, CD62-P-, CD80', CD86', CD103' CD104-, CD106/VCAM+, CD144/VE-caderinadim, CD184/CXCR4-, 32- microglobulinadim, MHC-Idim, MHC-IT, HLA-Gdim, y PDLIdim.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritas en la presente memoria son CD34-. CD10+. CD105+. CD200+. y una o mas, o todas de CD29+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3- SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+, en donde ABC-p es una protema transportadora ABC espedfica de placenta (tambien conocida como protema de resistencia al cancer de mama (BCRP) y como protema de resistencia a mitoxantrona (MXR)), en donde dichas celulas madre placentarias aisladas se obtienen por perfusion de una placenta de mairnfero, por ejemplo, una placenta humana, cuya sangre umbilical se ha drenado y perfundido para eliminar sangre residual.
En otra realizacion espedfica de cualquiera de las realizaciones de celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, las celulas son negativas para la expresion del gen de la telomerasa, negativas para la actividad telomerasa o ambas cosas. La expresion del gen de la telomerasa puede detectarse utilizando, por ejemplo, deteccion de ARN telomerasa utilizando, por ejemplo, transferencias puntuales o transferencias en ranura; o un ensayo de protocolo de amplificacion de repeticiones telomericas (ensayo TRAP) (por ejemplo, kits de ensayo
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TRAPEZE® ELISA, fluorometricos o basados en gel de MiMipore).
En otra realizacion espedfica de cualquiera de las realizaciones de celulas madre placentarias descritas en esta memoria, las celulas madre placentarias son positivas para vimentina, por ejemplo, al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%., 95% o el 98% de dichas celulas madre placentarias expresan vimentina. La vimentina se puede detectar, por ejemplo, mediante citometna de flujo utilizando uno o mas anticuerpos contra vimentina, por ejemplo, los anticuerpos disponibles en Abcam; mediante tincion con fluorescencia in situ, o tecnicas similares.
En otra realizacion espedfica de cualquiera de las realizaciones de celulas madre placentarias descritas en esta memoria, las celulas madre placentarias no secretan cantidades perceptibles de gonadotropina corionica humana (hCG), que puede detectarse, por ejemplo, mediante ensayo ELISA o de inmunofluorescencia utilizando, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal HCG1 contra hCG (Abeam) o los anticuerpos policlonales anti-hCG (Abcam, Novus Biologicals).
En otra realizacion de cualquiera de las celulas madre placentarias aisladas descritas en esta memoria, una poblacion de celulas madre placentarias aisladas comprende celulas placentarias CD56+ adherentes a plastico de cultivo tisular que no son linfocitos citolfticos naturales. En una realizacion espedfica, la poblacion comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 30% de dichas celulas placentarias CD56 + en dicha poblacion de celulas madre placentarias aisladas, como puede determinarse mediante citometna de flujo utilizando CD56 marcado con FITC (isotiocianato de fluorescema). En otra realizacion espedfica, la poblacion comprende de aproximadamente 16% a aproximadamente 62% de dichas celulas placentarias CD56 + en dicha poblacion de celulas madre placentarias aisladas, como puede determinarse mediante citometna de flujo utilizando CD56 marcado con APC (aloficocianina).
En otra realizacion espedfica de cualquiera de las caractensticas anteriores, la expresion del marcador celular (por ejemplo, grupo de diferenciacion o marcador inmunogenico) puede determinarse mediante citometna de flujo; en otra realizacion espedfica, la expresion del marcador puede determinarse mediante RT-PCR.
El perfil genetico confirma que las celulas madre placentarias aisladas se pueden distinguir de otras celulas, por ejemplo, de celulas madre mesenquimatosas, por ejemplo, de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea. Las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria se pueden distinguir, por ejemplo, de celulas madre mesenquimatosas basandose en la expresion de uno o mas genes, cuya expresion es significativamente mayor en las celulas madre placentarias aisladas, o en determinadas celulas madre de cordon umbilical aisladas, en comparacion con las celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea. En particular, las celulas madre placentarias aisladas, utiles en los metodos de tratamiento proporcionados en esta memoria, se pueden distinguir de las celulas madre mesenquimatosas, por ejemplo, de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, basandose en la expresion de uno o mas genes, cuya expresion es significativamente mayor (es decir, al menos dos veces mayor) en las celulas madre placentarias aisladas que en un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, en donde el uno o mas genes son ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1 , B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3 , PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, o una combinacion de cualquiera de los anteriores, cuando las celulas se cultivan en condiciones equivalentes. Vease, por ejemplo, la Publicacion de la Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2007/0275362. En determinadas realizaciones espedficas, dicha expresion de dicho uno o mas genes mas se determina, por ejemplo, mediante RT-PCR o analisis de micromatrices, por ejemplo, utilizando una micromatriz U133-A (Affymetrix). En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas expresan dicho uno o mas genes cuando se cultivan durante un numero de generaciones poblacionales, por ejemplo, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 35 generaciones poblacionales, en un medio que comprende DMEM-LG (por ejemplo, de Gibco); suero bovino fetal al 2% (p. ej., De Hyclone Labs.); 1x insulina- transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 109M (p. ej., de Sigma); acido ascorbico 2-fosfato 10-4 M (por ejemplo, de Sigma); factor de crecimiento epidermico 10 ng/ml (por ejemplo, de R & D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (por ejemplo, de R & D Systems). En otra realizacion espedfica, el gen espedfico de celula madre placentaria aislada es CD200. Debe entenderse que, en general, la expresion de un gen particular, por ejemplo, cualquiera de los genes enumerados en esta memoria, se evalua mediante el analisis de la expresion agregada del gen en una poblacion de celulas madre placentarias.
Se pueden encontrar secuencias espedficas para estos genes en GenBank, por ejemplo, con los numeros de referencia NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIGO2), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (C11orf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (ILIA), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG) BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199
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(PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 o BC065328 (SLC12A8). BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN) y BC005001 (ZC3H12A) desde marzo de 2008.
En determinadas realizaciones espedficas, cada una de dichas celulas madre placentarias aisladas expresa ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, ILI A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST. NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A a un nivel superior, por ejemplo, a un nivel perceptiblemente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, cuando las celulas se cultivan en condiciones equivalentes.
En realizaciones espedficas, las celulas madre placentarias expresan CD200 y ARTS1 (regulador de aminopeptidasa del factor de necrosis tumoral de tipo 1); CD200 y NUAK1, aRtS-1 y LRAP (arginina aminopeptidasa derivada de leucocitos); IL6 (interleuquina-6) y TGFB2 (factor de crecimiento transformante, beta 2); IL6 y KRT18 (queratina 18); IER3 (respuesta temprana inmediata 3), MEST (homologo del transcrito espedfico del mesodermo) y TGFB2; CD200 e IER3; CD200 e IL6; CD200 y KRT18; CD200 y LRAP; CD200 y MEST; CD200 y NFE2L3 (factor nuclear (derivado de eritroide 2) - similar al 3); o CD200 y TGFB2 a un nivel superior, por ejemplo, a un nivel perceptiblemente mas alto, que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea (BM-MSC) en donde que dichas celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea han experimentado una serie de pases en cultivo equivalente al numero de pases que han experimentado dichas celulas madre placentarias aisladas. En otras realizaciones espedficas, las celulas madre placentarias expresan ARTS-1, CD200, IL6 y LRAP; ARTS-1, IL6, TGFB2, IER3, KRT18 y MEST; CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3 y TGFB2; ARTS-1, CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3 y TGFB2; o IER3, MEST y TGFB2 a un nivel superior, por ejemplo, a un nivel perceptiblemente mas alto, que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea BM-MSC, en donde dichas celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea han experimentado una serie de pases en cultivo equivalente al numero de pases que han experimentado las celulas madre placentarias aisladas.
La expresion, por ejemplo, la expresion diferencial comparada con la de las celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, de los genes referenciados anteriormente se puede evaluar mediante tecnicas convencionales. Por ejemplo, mediante tecnicas convencionales pueden seleccionarse y construirse individualmente sondas basadas en la secuencia del(los) gen(es). La expresion de los genes se puede evaluar, por ejemplo, en una micromatriz que comprende sondas para uno o mas de los genes, por ejemplo, una matriz GENECHIP® Human Genome U133A 2.0 de Affymetrix, o una matriz GENECHIP® Human Genome U133 Plus 2.0 de Affymetrix (Santa Clara, California). La expresion de estos genes se puede evaluar incluso si se modifica la secuencia de un numero de registro de GenBank en particular, ya que utilizando tecnicas convencionales bien conocidas pueden generarse facilmente sondas espedficas para la secuencia modificada.
El nivel de expresion de estos genes puede utilizarse para confirmar la identidad de una poblacion de celulas madre placentarias aisladas, para identificar una poblacion de celulas que comprende al menos una pluralidad de celulas madre placentarias aisladas, o similar. Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas, cuya identidad se confirma, pueden ser clonales, por ejemplo, poblaciones de celulas madre placentarias aisladas expandidas a partir de una sola celula madre placentaria aislada, o una poblacion mixta de celulas madre, por ejemplo, una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias aisladas que se expanden desde multiples celulas madre placentarias aisladas, o una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias aisladas, como se describe en esta memoria, y al menos otro tipo de celulas.
El nivel de expresion de estos genes se puede utilizar para seleccionar poblaciones de celulas madre placentarias aisladas. Por ejemplo, una poblacion de celulas madre placentarias, por ejemplo, celulas madre placentarias expandidas clonalmente, puede seleccionarse si la expresion de uno o mas de los genes enumerados anteriormente es significativamente mayor en una muestra de la poblacion de celulas madre placentarias que en una poblacion equivalente de celulas madre mesenquimatosas, por ejemplo, celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea.
Las celulas madre placentarias aisladas se pueden seleccionar basandose en el nivel de expresion de uno o mas de dichos genes en comparacion con el nivel de expresion en dichos uno o mas genes, por ejemplo, en un control de celulas madre mesenquimatosas, por ejemplo, el nivel de expresion en dichos uno o mas genes en un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea. En una realizacion, como control, se utiliza el nivel de expresion de dichos uno o mas genes en una muestra que comprende un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas. En otra realizacion, el control, para celulas madre placentarias aisladas ensayadas en determinadas condiciones, es un valor numerico que representa el nivel de expresion de dichos uno o mas genes en celulas madre mesenquimatosas en dichas condiciones.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria muestran las caractensticas anteriores (por ejemplo, combinaciones de marcadores de superficie celular y/o perfiles de expresion genica) en cultivo primario, o durante la proliferacion en medio que comprende, por ejemplo, DMEM-LG
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(Gibco), suero bovino fetal al 2% (p. ej., De Hyclone Labs.); 1x insulina-transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico- albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10"9 M (p. ej., de Sigma); acido ascorbico 2-fosfato 10"4M (por ejemplo, de Sigma); factor de crecimiento epidermico (EGF) 10 ng/ml (R & D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (R & D Systems) y penicilina l0o U / Estreptomicina 1000 U.
En determinadas realizaciones de cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria, las celulas son humanas. En determinadas realizaciones de cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en esta memoria, las caractensticas del marcador celular o las caractensticas de expresion genica son marcadores humanos o genes humanos.
En otra realizacion espedfica de dichas celulas madre placentarias aisladas o poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias aisladas, dichas celulas madre placentarias o poblaciones se han expandido, por ejemplo, se han realizado pases al menos, aproximadamente, o no mas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces, o han proliferado durante al menos, aproximadamente, o no mas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 generaciones poblacionales. En otra realizacion espedfica de dichas celulas madre placentarias aisladas o poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias aisladas, dichas celulas o poblaciones son aislados primarios. En otra realizacion espedfica de las celulas madre placentarias aisladas, o poblaciones de celulas que comprenden celulas madre placentarias aisladas, descritas en esta memoria, dichas celulas madre placentarias aisladas son de origen fetal (es decir, tienen el genotipo fetal).
En determinadas realizaciones, dichas celulas madre placentarias aisladas no se diferencian durante el cultivo en medio de crecimiento, es decir, medio formulado para promover la proliferacion, por ejemplo, durante la proliferacion en medio de crecimiento. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas no requieren una capa alimentadora para proliferar. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas no se diferencian en cultivo en ausencia de una capa alimentadora, unicamente debido a la falta de una capa alimentadora de celulas.
En otra realizacion, las celulas utiles en los metodos y composiciones descritos en esta memoria, son celulas madre placentarias aisladas, en donde una pluralidad de dichas celulas madre placentarias aisladas son positivas para la aldehfdo deshidrogenasa (ALDH), segun se evalua mediante un analisis de actividad de aldehfdo deshidrogenasa. Dichos ensayos son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Bostian y Betts, Biochem. J., 173, 787, (1978)). En una realizacion espedfica, dicho ensayo ALDH utiliza ALDEFLUOR® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon) como un marcador de actividad aldehfdo deshidrogenasa. En una realizacion espedfica, dicha pluralidad es entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de celulas en dicha poblacion de celulas. En otra realizacion, en la presente memoria se proporciona una poblacion de celulas de cordon umbilical aisladas, por ejemplo, celulas de cordon umbilical aisladas multipotentes, en donde una pluralidad de dichas celulas de cordon umbilical aisladas son positivas para la aldehfdo deshidrogenasa, segun se evalua mediante un analisis de actividad de aldehfdo deshidrogenasa que utiliza ALDEFLUOR® como un indicador de actividad aldehfdo deshidrogenasa. En una realizacion espedfica, dicha pluralidad es entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de celulas en dicha poblacion de celulas. En otra realizacion, dicha poblacion de celulas madre placentarias aisladas o celulas madre de cordon umbilical aisladas, muestran al menos tres veces, o al menos cinco veces, mayor actividad ALDH si se compara con una poblacion de celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea que tiene aproximadamente el mismo numero de celulas y se cultivan en las mismas condiciones.
En una realizacion espedfica de cualquiera de las realizaciones anteriores de las celulas madre placentarias utiles en los metodos proporcionados en la presente memoria, las celulas madre placentarias expresan uno cualquiera, o cualquier combinacion de, los marcadores de citometna de flujo y/o marcadores de expresion genica descritos en esta memoria. En determinadas realizaciones, al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o el 98% de las celulas madre placentarias en una poblacion aislada de las celulas madre placentarias aislada descritas en la presente memoria, expresan uno cualquiera, o cualquier combinacion de, los marcadores de citometna de flujo y/o marcadores de expresion genica descritos en esta memoria.
En determinadas realizaciones de cualquiera de las poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria, las celulas madre placentarias en dichas poblaciones de celulas, carecen sustancialmente de celulas que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o el 99% de las celulas madre placentarias en dicha poblacion tienen un genotipo fetal. En otras realizaciones determinadas de cualquiera de las poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria, las poblaciones de celulas que comprenden dichas celulas madre placentarias carecen sustancialmente de celulas que tienen un genotipo materno; por ejemplo, al menos el 40%, 45%. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o el 99% de las celulas en dicha poblacion tienen un genotipo fetal.
En una realizacion espedfica de cualquiera de las celulas madre placentarias aisladas o poblaciones celulares de celulas madre placentarias aisladas anteriores, el cariotipo de las celulas, o al menos aproximadamente el 95% o aproximadamente el 99% de las celulas en dicha poblacion, es normal. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las celulas madre placentarias anteriores, las celulas madre placentarias, o las celulas en la poblacion de celulas,
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son de origen no materno.
Las diferentes poblaciones de celulas madre placentarias aisladas que llevan cualquiera de las combinaciones de marcadores anteriores, pueden combinarse en cualquier proporcion. Se pueden combinar dos o mas poblaciones de las celulas madre placentarias aisladas anteriores para formar una poblacion de celulas madre placentarias aisladas. Por ejemplo, una poblacion de celulas madre placentarias aisladas puede comprender una primera poblacion de celulas madre placentarias aisladas, definida por una de las combinaciones de marcadores descritas anteriormente, y una segunda poblacion de celulas madre placentarias aisladas, definida por otra de las combinaciones de marcadores descritas anteriormente, en donde dichas primera y segunda poblaciones se combinan en una proporcion de aproximadamente 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, o aproximadamente, 99: 1. De manera similar, puede combinarse cualquiera de tres, cuatro, cinco o mas poblaciones de las celulas madre placentarias aisladas descritas anteriormente.
Se pueden obtener celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria, por ejemplo, por alteracion del tejido placentario, con o sin digestion enzimatica (vease la Seccion 5.3.3) o perfusion (vease la Seccion 5.3.4). Por ejemplo, pueden producirse poblaciones de celulas placentarias aisladas, a partir de las cuales se pueden aislar celulas madre placentarias, segun un metodo que comprende perfundir una placenta de mairnfero cuya sangre de cordon umbilical se ha drenado y perfundido para eliminar la sangre residual; perfundir dicha placenta con una solucion de perfusion; y recoger dicha solucion de perfusion, en donde despues de la perfusion dicha solucion de perfusion comprende una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias aisladas; y aislar una pluralidad de dichas celulas placentarias aisladas de dicha poblacion de celulas. En una realizacion espedfica, la solucion de perfusion se hace pasar a traves de la vena umbilical y las arterias umbilicales y se recoge despues de exudarse de la placenta. En otra realizacion espedfica, la solucion de perfusion se hace pasar a traves de la vena umbilical y se recoge de las arterias umbilicales, o se hace pasar a traves de las arterias umbilicales y se recoge de la vena umbilical
En diversas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas, contenidas en una poblacion de celulas obtenida de la perfusion de una placenta, son al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos el 99,5% de dicha poblacion de celulas placentarias. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas recogidas por perfusion comprenden celulas fetales y maternas. En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas recogidas por perfusion son al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos el 99,5% de celulas fetales.
Otra realizacion espedfica, proporcionada en la presente memoria, es una composicion que comprende una poblacion de celulas madre placentarias aisladas, tal como se describe en la presente memoria, recogida por perfusion, en donde dicha composicion comprende al menos una porcion de la solucion de perfusion utilizada para recoger las celulas madre placentarias aisladas.
Las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria tambien pueden aislarse por digestion del tejido placentario con una o mas enzimas que alteran el tejido, para obtener una poblacion de celulas placentarias que comprende las celulas madre placentarias y aislar, o aislar sustancialmente, las celulas madre placentarias del resto de dichas celulas placentarias. Toda la placenta, o parte de la misma, puede digerirse para obtener las celulas madre placentarias aisladas que se describen en la presente memoria. En otra realizacion espedfica, la enzima que altera el tejido es tripsina o colagenasa. En diversas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas, contenidas en una poblacion de celulas obtenida de la digestion de una placenta, son al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos el 99,5% de dicha poblacion de celulas placentarias.
Las poblaciones de las celulas madre placentarias aisladas descritas anteriormente pueden comprender aproximadamente, al menos, o no mas de, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109,
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5 x 10, 1 x 10 , 5 x 10 , 1 x 10 o mas de las celulas madre placentarias aisladas. Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas utiles en los metodos de tratamiento descritos en esta memoria comprenden al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de celulas madre placentarias aisladas viables, por ejemplo, como puede determinarse, por ejemplo, por exclusion con azul de tripano.
Las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, utiles en los metodos proporcionados en la presente memoria, muestran las caractensticas anteriores (p. ej., combinaciones de marcadores de superficie celular y/o perfiles de expresion genica) en cultivo primario, o durante la proliferacion en medio que comprende DMEM- LG al 60% (Gibco), 40% de MCDB-201 (Sigma), suero bovino fetal al 2% (FCS) (Hyclone Laboratorios), 1x insulina- transferrina-selenio (ITS), 1x acido linolenico-albumina de suero bovino (LA-BSA), dexametasona 10-9 M (Sigma), acido 2-fosfato ascorbico 10"4 M (Sigma), factor de crecimiento epidermico (EGF) 10 ng/ml (R & D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (R & D Systems) y penicilina 100 u/estreptomicina 1000 U.
5.2.3 Crecimiento en cultivo
En determinadas realizaciones, el crecimiento de las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente
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memoria en la Seccion 5.2.2, depende en parte del medio particular seleccionado para el crecimiento. En condiciones optimas, las celulas madre placentarias aisladas tipicamente duplican su numero en aproximadamente 1-3 d^as. Durante el cultivo, las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria se adhieren a un sustrato en cultivo, por ejemplo, a la superficie de un recipiente de cultivo tisular (por ejemplo, plastico de placa de cultivo tisular, plastico recubierto de fibronectina, y similar) y forman una monocapa. En realizaciones espedficas, dichas celulas madre placentarias duplicadas en cultivo cuando se cultivan a 37 °C en aire al 95%/CO2 al 5% en medio que comprende DMEM-LG al 60% (Gibco) y MCDB-201 al 40% (Sigma) complementado con suero bovino fetal (FCS) al 2% (Hyclone Labs.); 1x insulina-transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 109 M (Sigma); acido ascorbico 2- fosfato 10-4 M (Sigma); factor de crecimiento epidermico (EGF) l0 ng/ml (R & D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (R & D Systems) y penicilina 100 U/estreptomicina 1000 U; o en medio que comprende DMEM-LG (Gibco) complementado con suero bovino fetal (FCS) al 2%-10% (Hyclone Labs.); 1x ITS; 1x (LA-BSA); dexametasona 10-9 M (Sigma); acido ascorbico 2- fosfato 10-4 M (Sigma); factor de crecimiento epidermico (EGF) 10 ng/ml (R & D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (R & D Systems) y penicilina 100 U/ estreptomicina 1000 U.
5.3 METODOS DE OBTENCION DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS AISLADAS
5.3.1 Composicion para la recogida de celulas
Las celulas madre placentarias se obtienen de una placenta de mamffero utilizando una solucion fisiologicamente aceptable, por ejemplo, en la Publicacion de Solicitud de Patente de EE. UU. 2007/0190042 se describe con detalle una composicion para la recogida de celulas.
La composicion para la recogida de celulas puede comprender cualquier solucion fisiologicamente aceptable, adecuada para la recogida y/o el cultivo de celulas, por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria, por ejemplo, una solucion salina (por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Kreb, una solucion de Kreb modificada, una solucion de Eagle, NaCl al 0,9%, etc.), un medio de cultivo (p. ej., DMEM, H.DMEM, etc.), y similares.
La composicion para la recogida de celulas puede comprender uno o mas componentes que tienden a conservar las celulas madre placentarias aisladas, es decir, a impedir que las celulas madre placentarias aisladas se mueran, o a retrasar la muerte de las celulas madre placentarias aisladas, a reducir el numero de celulas madre placentarias aisladas en una poblacion de celulas que se muere, o similares, desde el momento de la recogida hasta el cultivo. Dichos componentes pueden ser, por ejemplo, un inhibidor de la apoptosis (p. ej., un inhibidor de caspasa o un inhibidor de jNk); un vasodilatador (p. ej., sulfato de magnesio, un farmaco antihipertensivo, un peptido natriuretico auricular (ANP), una hormona liberadora de corticotropina, adrenocorticotropica, nitroprusiato sodico, hidralazina, trifosfato de adenosina, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc.); un inhibidor de la necrosis (por ejemplo, 2- (1H-Indol-3-il) -3-pentilamino-maleimida, pirrolidin ditiocarbamato o clonazepam); un inhibidor de TNF-a; y/o un perfluorocarbono transportador de oxfgeno (p. ej., bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).
La composicion para la recogida de celulas puede comprender una o mas enzimas degradadoras de tejido, por ejemplo, una metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutra, una RNasa o una DNasa o similares. Dichas enzimas incluyen, pero sin limitacion, colagenasas (p. ej., colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, liberasa, hialuronidasa y similares.
La composicion para la recogida de celulas puede comprender una cantidad bactericida o bacteriostaticamente eficaz de un antibiotico. En determinadas realizaciones no limitantes, el antibiotico es un macrolido (p. ej., tobramicina), una cefalosporina (p. ej., cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxilo), una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (por ejemplo, penicilina V) o una quinolona (p. ej., ofloxacina, ciprofloxacina o norfloxacina), una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En una realizacion particular, el antibiotico es activo contra bacterias Gram (+) y / o Gram (-), por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y similares. En una realizacion, el antibiotico es gentamicina, por ejemplo, de aproximadamente 0,005 % a aproximadamente 0,01 % (p / v) en medio de cultivo
La composicion para la recogida de celulas tambien puede comprender uno o mas de los siguientes compuestos: adenosina (de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); D-glucosa (de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM); iones de magnesio (de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); una macromolecula de peso molecular mayor de 20,000 daltons, en una realizacion, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y la viabilidad celular (p. ej., un coloide sintetico o de origen natural, un polisacarido tal como dextrano o un polietilenglicol presente de aproximadamente 25 g/l a aproximadamente 100 g/l, o de aproximadamente 40 g/l a aproximadamente 60 g/l); un antioxidante (p. ej., hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutation, vitamina C o vitamina E presente de aproximadamente 25 |jM a aproximadamente 100 |jM); un agente reductor (por ejemplo, N-acetilcistema presente de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM); un agente que impide la entrada de calcio en las celulas (p. ej., verapamilo presente de aproximadamente 2 jM a aproximadamente 25 jM); nitroglicerina (por ejemplo, de aproximadamente 0,05 g/l a aproximadamente 0,2 g/l); un anticoagulante, en una realizacion, presente en una cantidad suficiente para ayudar a impedir la coagulacion de
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sangre residual (por ejemplo, heparina o hirudina presente a una concentracion de aproximadamente 1000 unidades/l a aproximadamente 100.000 unidades/l); o un compuesto que contiene amilorida (por ejemplo, amilorida, etil isopropil amilorida, hexametilen amilorida, dimetil amilorida o isobutil amilorida presente de a aproximadamente 1,0 |jM a aproximadamente 5 jM).
5.3.2 Recogida y manipulacion de la placenta
En general, una placenta humana se recupera poco despues de su expulsion despues del nacimiento. En una realizacion preferida, la placenta se recupera de un paciente despues de dar su consentimiento informado y despues de realizar un historial medico completo del paciente y que se asocia a la placenta. Preferiblemente, el historial medico continua despues del parto. Dicho historial medico se puede utilizar para coordinar el uso posterior de la placenta o de las celulas madre placentarias aisladas recogidas de la misma. Por ejemplo, a la luz del historial clmico, se pueden utilizar celulas madre placentarias humanas aisladas, para medicamentos personalizados para el bebe asociado a la placenta, o para los padres, hermanos u otros parientes del bebe.
Antes de la recuperacion de las celulas madre placentarias aisladas, la sangre del cordon umbilical y de la placenta se eliminan preferiblemente. En determinadas realizaciones, despues del parto, se recupera la sangre del cordon umbilical en la placenta. La placenta puede someterse a un proceso de recuperacion de sangre de cordon convencional. Tfpicamente, se utiliza una aguja o una canula, con la ayuda de la gravedad, para extraer sangre de la placenta (vease, por ejemplo, Anderson, Patente de Estados Unidos N° 5.372.581; Hessel et al., Patente de Estados Unidos N° 5.415.665). La aguja o canula se coloca generalmente en la vena umbilical y la placenta se puede masajear suavemente para ayudar a drenar la sangre del cordon umbilical de la placenta. Dicha recuperacion de sangre del cordon umbilical se puede realizar comercialmente, por ejemplo, LifeBank USA, Cedar Knolls, NJ. Preferiblemente, la placenta se drena por gravedad sin mas manipulacion para minimizar la alteracion del tejido durante la recuperacion de la sangre del cordon umbilical.
Tfpicamente, una placenta se transporta desde la sala de parto o nacimiento a otro lugar, p. ej., a un laboratorio, para la recuperacion de la sangre de cordon umbilical y la recogida de celulas madre placentarias, p. ej., por perfusion o disociacion tisular. La placenta se transporta preferiblemente en un dispositivo de transporte esteril, termicamente aislado (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28 °C), por ejemplo, colocando la placenta con el cordon umbilical proximal sujeto, en una bolsa de plastico esteril con cierre de cremallera, que despues se coloca en un envase aislado. En otra realizacion, la placenta se transporta en un kit de recogida de sangre de cordon sustancialmente como se describe en la patente en tramite de Estados Unidos N° 7, 147.626. Preferiblemente, la placenta se envfa al laboratorio a las cuatro a veinticuatro horas despues del parto. En determinadas realizaciones, el cordon umbilical proximal se sujeta, preferiblemente dentro de 4-5 cm (cenffmetros) de la insercion en el disco placentario antes de la recuperacion de la sangre del cordon umbilical. En otras realizaciones, el cordon umbilical proximal se sujeta despues de la recuperacion de la sangre del cordon umbilical, pero antes del procesamiento posterior de la placenta.
La placenta, antes de la recogida de celulas, se puede conservar en condiciones esteriles y a temperatura ambiente o a una temperatura de 5 °C a 25 °C. La placenta puede conservarse durante un penodo de cuatro a veinticuatro horas, hasta cuarenta y ocho horas, o mas de cuarenta y ocho horas, antes de perfundir la placenta para eliminar cualquier resto de sangre del cordon umbilical. En una realizacion, la placenta se recoge entre aproximadamente las cero horas y aproximadamente dos horas despues de la expulsion. La placenta se conserva preferiblemente en una solucion anticoagulante a una temperatura de 5 °C a 25 °C. Las soluciones anticoagulantes adecuadas son muy conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se puede utilizar una solucion de heparina o warfarina sodica. En una realizacion preferida, la solucion anticoagulante comprende una solucion de heparina (por ejemplo, 1% p/p en solucion 1: 1000). La placenta sin sangre se conserva preferiblemente durante no mas de 36 horas antes de recoger las celulas madre de la placenta.
La placenta mamaria, o una parte de la misma, una vez recogida y preparada en general como se indica anteriormente, se puede tratar de cualquier manera conocida en la tecnica, por ejemplo, se puede perfundir o alterar, por ejemplo, digerir con una o mas enzimas que alteran el tejido, para obtener celulas madre placentarias aisladas.
5.3.3 Alteracion ffsica y digestion enzimatica del tejido placentario
En una realizacion, las celulas madre se recogen de una placenta de mairnfero mediante alteracion ffsica de parte de todo el organo. Por ejemplo, la placenta, o una porcion de la misma, puede, por ejemplo, triturarse, cortarse, picarse, cortarse en cubitos, cortarse en trozos pequenos, macerarse o similar. El tejido puede despues cultivarse para obtener una poblacion de celulas madre placentarias aisladas. Tfpicamente, el tejido placentario se altera utilizando, p. ej., medio de cultivo, una solucion salina o una composicion para la recogida de celulas madre (vease la Seccion 5.5.1, mas adelante).
Tfpicamente, alterando un pequeno bloque de tejido placentario, por ejemplo, un bloque de tejido placentario que tiene un volumen de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o de aproximadamente 1000 miffmetros cubicos, pueden obtenerse celulas madre placentarias aisladas. Se puede utilizar cualquier metodo de alteracion ffsica, siempre que el metodo de alteracion
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deje una pluralidad, mas preferiblemente una mayoffa, y mas preferiblemente al menos el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas en dicho organo viable, como puede determinarse, por ejemplo, mediante exclusion con azul de tripano.
Generalmente, las celulas madre placentarias aisladas pueden recogerse de una placenta, o de una porcion de la misma, en cualquier momento al cabo de aproximadamente los tres primeros dfas despues de la expulsion, pero preferiblemente entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas despues de la expulsion.
En una realizacion espedfica, el tejido alterado se cultiva en medio de cultivo tisular adecuado para la proliferacion de celulas madre placentarias aisladas (vease, por ejemplo, la Seccion 5.6, a continuacion, que describe el cultivo de celulas madre placentarias, por ejemplo, PDAC).
En otra realizacion espedfica, las celulas madre placentarias se afslan, por ejemplo, en parte, por alteracion ffsica del tejido placentario, en donde la alteracion ffsica incluye digestion enzimatica, que puede realizarse utilizando una
0 mas enzimas digestivas de tejido. La placenta, o una parte de la misma, tambien puede alterarse ffsicamente y digerirse con una o mas enzimas, y el material resultante se sumerge despues, o se mezcla, en una composicion para la recogida de celulas.
Una composicion preferida para la recogida de celulas, comprende una o mas enzimas alteradoras de tejido. Como enzimas que pueden utilizarse para alterar el tejido de la placenta se incluyen papama, desoxirribonucleasas, serina proteasas, tales como tripsina, quimotripsina, colagenasa, dispasa o elastasa. Las serina proteasas pueden inhibirse por alfa 2 microglobulina en suero y, por lo tanto, el medio utilizado para la digestion generalmente no contiene suero. El EDTA y la DNasa se usan comunmente en procedimientos de digestion de enzimas para aumentar la eficiencia de la recuperacion celular. El material digerido se diluye preferiblemente para impedir el atrapamiento de celulas dentro del hidrolizado viscoso.
Se puede utilizar cualquier combinacion de enzimas de digestion tisular. Las concentraciones ffpicas para la digestion utilizando tripsina incluyen, de 0,1% a aproximadamente 2% de tripsina, por ejemplo, aproximadamente 0,25% de tripsina. Las proteasas pueden utilizarse en combinacion, es decir, dos o mas proteasas en la misma reaccion de digestion, o se pueden utilizar secuencialmente para liberar las celulas madre placentarias. Por ejemplo, en una realizacion, una placenta, o parte de la misma, se digiere primero con una cantidad apropiada de colagenasa
1 de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg/ml durante, por ejemplo, 30 minutos, seguido de digestion con tripsina, a una concentracion de aproximadamente 0,25%, durante, por ejemplo, 10 minutos, a 37 ° C. Las serina proteasas se utilizan preferiblemente de manera consecutiva despues de utilizar otras enzimas.
En otra realizacion, el tejido puede alterarse ademas anadiendo un quelante, por ejemplo, acido etilenglicol bis(2- aminoetileter)-N,N,N'N'-tetraacetico (EGTA) o acido etilendiaminotetraacetico (EDTa), a la composicion para la recogida de celulas madre, que comprende las celulas madre, o a una solucion en donde el tejido esta alterado y/o se ha digerido antes del aislamiento de las celulas madre placentarias con la composicion para la recogida de celulas madre.
Despues de la digestion, el material digerido se lava, por ejemplo, tres veces, con medio de cultivo, y las celulas lavadas se siembran en matraces de cultivo. Las celulas se afslan despues por adherencia diferencial y se caracterizan, por ejemplo, con respecto a su viabilidad, marcadores de superficie celular, diferenciacion y similares.
Se apreciara que, cuando una placenta entera, o una porcion de una placenta, que comprende celulas tanto fetales como maternas (por ejemplo, donde la porcion de la placenta comprende el corion o los cotiledones), las celulas madre placentarias aisladas pueden comprender una mezcla de celulas madre placentarias derivadas de fuentes tanto fetales como maternas. Cuando una parte de la placenta no comprende, o comprende un numero despreciable, de celulas maternas (por ejemplo, amnios), las celulas madre placentarias aisladas de la misma, comprenderan casi exclusivamente celulas madre placentarias fetales (es decir, celulas madre placentarias que tienen el genotipo del feto)
Las celulas madre placentarias, p. ej., las celulas madre placentarias descritas anteriormente en la Seccion 5.2.2, pueden aislarse de tejido placentario alterado por digestion diferencial con tripsina (vease la Seccion 5.3.5, mas adelante) seguido de cultivo en uno o mas envases de cultivo nuevos en medio de proliferacion reciente, seguido opcionalmente de una segunda etapa de digestion diferencial con tripsina.
5.3.4 Perfusion placentaria
Las celulas madre placentarias, por ejemplo, las celulas madre placentarias descritas en la Seccion 5.2.2, anterior, tambien pueden aislarse, por ejemplo, en parte, por perfusion de la placenta mamaria. Se describen metodos para perfundir la placenta de mairfffero para obtener celulas madre placentarias, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 7.045.148 y 7.255.729, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N°. 2007/0275362 y 2007/0190042.
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Las celulas madre placentarias pueden recogerse, por ejemplo, aislarse, por perfusion, por ejemplo, a traves de la vasculatura placentaria, utilizando, por ejemplo, como solucion de perfusion, una composicion para la recogida de celulas. En una realizacion, una placenta de mairnfero se perfunde haciendo pasar una solucion de perfusion a traves de cualquiera de la arteria umbilical y vena umbilical o a traves de ambas. El flujo de la solucion de perfusion a traves de la placenta puede realizarse utilizando, por ejemplo, flujo de gravedad en la placenta. Preferiblemente, la solucion de perfusion se hace pasar a traves de la placenta utilizando una bomba, por ejemplo, una bomba peristaltica. La vena umbilical puede, por ejemplo, canularse con una canula, por ejemplo, una canula de TEFLON® o de plastico, que esta conectada a un aparato de conexion esteril, como un tubo esteril. El aparato de conexion esteril esta conectado a un colector de perfusion.
En preparacion para la perfusion, la placenta se orienta preferentemente (p. ej., se suspende) de tal manera que la arteria umbilical y la vena umbilical se encuentran en el punto mas alto de la placenta. La placenta se puede perfundir haciendo pasar un lfquido de perfusion a traves de la vasculatura placentaria y el tejido circundante. La placenta tambien puede perfundirse haciendo pasar un Kquido de perfusion a la vena umbilical y recogiendo de las arterias umbilicales, o haciendo pasar un lfquido de perfusion a las arterias umbilicales y recogiendo de la vena umbilical.
En una realizacion, por ejemplo, la arteria umbilical y la vena umbilical estan conectadas simultaneamente, por ejemplo, a una pipeta que esta conectada a traves de un conector flexible a un deposito de la solucion de perfusion. La solucion de perfusion se pasa a la vena y a la arteria umbilical. La solucion de perfusion se exuda desde y/o atraviesa las paredes de los vasos sangumeos al interior de los tejidos circundantes de la placenta, y se recoge en un recipiente abierto adecuado desde la superficie de la placenta que estaba adherida al utero de la madre durante la gestacion. La solucion de perfusion tambien se puede introducir a traves de la abertura del cordon umbilical y se deja que fluya o se filtre fuera de las aberturas en la pared de la placenta que se interconecto con la pared uterina materna. Las celulas madre placentarias que se recogen mediante este metodo, que puede denominarse metodo de "barrido” (pan), son tfpicamente una mezcla celulas fetales y maternas.
En otra realizacion, la solucion de perfusion se hace pasar a traves de las venas umbilicales y se recoge desde la arteria umbilical, o se hace pasar a traves de la arteria umbilical y se recoge desde las venas umbilicales. Las celulas madre placentarias recogidas por este metodo, que se puede denominar metodo de "circuito cerrado", son tfpicamente casi exclusivamente fetales.
Se apreciara que la perfusion utilizando el metodo de barrido, es decir, mediante el cual se recoge el perfundido despues de que haya exudado del lado materno de la placenta, da como resultado una mezcla de celulas fetales y maternas. Como resultado, las celulas recogidas mediante este metodo pueden comprender una poblacion mixta de celulas madre placentarias de origen tanto fetal como materno. Por el contrario, la perfusion unicamente a traves de la vasculatura placentaria en el metodo de circuito cerrado, mediante el cual el lfquido de perfusion se hace pasar a traves de uno o dos vasos placentarios y se recoge unicamente a traves del (los) vaso (s) restante (s), da como resultado la recogida de una poblacion de celulas madre placentarias casi exclusivamente de origen fetal.
En una realizacion, el metodo de perfusion de circuito cerrado puede realizarse de la siguiente manera. Se obtiene una placenta posparto aproximadamente 48 horas despues del nacimiento. El cordon umbilical se pinza y se corta por encima de la pinza. El cordon umbilical puede descartarse, o puede procesarse para recuperar, p. ej., celulas madre de cordon umbilical, y/o procesar la membrana del cordon umbilical para la produccion de un biomaterial. La membrana amniotica se puede retener durante la perfusion o se puede separar del corion, por ejemplo, utilizando una diseccion roma con los dedos, si la membrana amniotica se separa del corion antes de la perfusion, esta se puede, por ejemplo, descartar o procesar, por ejemplo, para obtener celulas madre mediante digestion enzimatica, o para producir, por ejemplo, un biomaterial de membrana amniotica, por ejemplo, el biomaterial descrito en la Publicacion de Solicitud de los Estados Unidos N° 2004/0048796. Despues de retirar de la placenta todos los coagulos de sangre visibles y la sangre residual, utilizando, por ejemplo, una gasa esteril, los vasos del cordon umbilical se exponen, por ejemplo, cortando parcialmente la membrana del cordon umbilical para exponer una seccion transversal del cordon. Los vasos se identifican y se abren, por ejemplo, haciendo avanzar una pinza de cocodrilo cerrada a traves del extremo cortado de cada vaso. El aparato, por ejemplo, un tubo de plastico conectado a un dispositivo de perfusion o bomba peristaltica, se inserta despues en cada una de las arterias placentarias. La bomba puede ser cualquier bomba adecuada para este fin, por ejemplo, una bomba peristaltica. El tubo de plastico, conectado a un deposito de recogida esteril, por ejemplo, una bolsa de sangre, tal como una bolsa de recogida de 250 ml, se inserta despues en la vena placentaria. Alternativamente, el tubo conectado a la bomba se inserta en la vena placentaria y se insertan tubos en uno o mas depositos de recogida en una o ambas arterias placentarias. Despues, la placenta se perfunde con un volumen de solucion de perfusion, por ejemplo, una solucion de perfusion de aproximadamente 750 ml. Despues, las celulas del perfundido se recogen, por ejemplo, por centrifugacion. En determinadas realizaciones, la placenta se perfunde con solucion de perfusion, por ejemplo, con una solucion de perfusion de 100-300 ml, para eliminar la sangre residual antes de la perfusion para recoger las celulas madre placentarias. En otra realizacion, la placenta no se perfunde con solucion de perfusion para eliminar la sangre residual antes de la perfusion para recoger las celulas madre placentarias
En una realizacion, el cordon umbilical proximal se sujeta durante la perfusion, y mas preferiblemente, se sujeta a una distancia de 4-5 cm (centimetros) de la insercion del cordon en el disco placentario.
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La primera recogida de l^quido de perfusion de una placenta de mairnfero durante el proceso de desangrado generalmente se tine con globulos rojos residuales de la sangre del cordon umbilical y/o de la placenta. El Kquido de perfusion se vuelve mas incoloro a medida que avanza la perfusion y los globulos rojos residuales del cordon se retiran por lavado de la placenta. Generalmente para desangrar inicialmente la placenta, es adecuado un lfquido de perfusion de 30 a 100 ml (mililitros), pero dependiendo de los resultados observados puede utilizarse mas o menos ifquido de perfusion.
El volumen del lfquido de perfusion utilizado para aislar celulas madre placentarias puede variar dependiendo del numero de celulas a recoger, del tamano de la placenta, del numero de recogidas a realizar a partir de una sola placenta, etc. En varias realizaciones, el volumen del lfquido de perfusion puede ser de 50 ml a 5000 ml, de 50 ml a 4000 ml, de 50 ml a 3000 ml, de 100 ml a 2000 ml, de 250 ml a 2000 ml, de 500 ml a 2000 ml o de 750 ml a 2000 ml. Tfpicamente, la placenta se perfunde con 700-800 ml de lfquido de perfusion despues del desangrado.
La placenta puede perfundirse varias veces en el transcurso de varias horas o varios dfas. Cuando la placenta se va a perfundir varias veces, se puede mantener o cultivar en condiciones asepticas en un recipiente u otro recipiente adecuado, y se puede perfundir con la composicion de recogida celular, o con una solucion de perfusion convencional (por ejemplo, una solucion salina normal, tal como como solucion salina tamponada con fosfato ("PBS")) con o sin un anticoagulante (p. ej., heparina, warfarina sodica, cumarina, bishidroxicumarina) y/o con o sin un agente antimicrobiano (p. ej., p-mercaptoetanol (0,1 mM); antibioticos como estreptomicina (por ejemplo, a 40100 pg/ml), penicilina (por ejemplo, a 40U/ml), anfotericina B (por ejemplo, a 0,5 pg/ml). En una realizacion, una placenta aislada se conserva o se cultiva durante un penodo de tiempo sin recoger el perfundido, de modo que la placenta se conserva o se cultiva durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 horas, o durante 2 o 3 o mas dfas antes de la perfusion y la recogida del perfundido. La placenta perfundida puede conservarse durante una o mas veces adicionales, por ejemplo, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19> 20, 21, 22, 23, 24 o mas horas, y perfundirse por segunda vez, por ejemplo, con 700-800 ml de lfquido de perfusion. La placenta se puede perfundir 1, 2, 3, 4, 5 o mas veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En una realizacion preferida, la perfusion de la placenta y la recogida de la solucion de perfusion, por ejemplo, la composicion de la recogida de celulas, se repite hasta que el numero de celulas nucleadas recuperadas disminuya por debajo de 100 celulas/ml. Los perfundidos en diferentes momentos pueden procesarse adicionalmente de manera individual para recuperar poblaciones de celulas dependientes del tiempo, por ejemplo, celulas madre. Los perfundidos de diferentes momentos tambien pueden agruparse. En una realizacion preferida, se recogen celulas madre placentarias a la vez o entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas despues de la expulsion.
Las celulas madre placentarias se pueden aislar de la placenta por perfusion con una solucion que comprende una o mas proteasas u otras enzimas que alteran el tejido. En una realizacion espedfica, una placenta, o parte de la misma (p. ej., membrana amniotica, amnios y corion, lobulo placentario o cotiledon, cordon umbilical o combinacion de cualquiera de los anteriores), se lleva a 25-37 °C y se incuba durante 30 minutos con una o mas enzimas que alteran el tejido en 200 ml de un medio de cultivo. Las celulas del perfundido se recogen, se llevan a 4°C y se lavan con una mezcla enfriada de inhibidores que comprende EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM y beta-mercaptoetanol 2 mM. Las celulas madre placentarias se lavan despues de varios minutos con una composicion enfriada (p. ej., a 4 °C) para la recogida de celulas madre.
En determinadas realizaciones, la perfusion (ya sea por el metodo de barrido como por el metodo de circuito cerrado) se realiza, por ejemplo, en una bandeja, bajo una campana esteril abierta. En otras realizaciones determinadas, la perfusion se realiza en un recinto cerrado, por ejemplo, en una bolsa esteril que contiene la placenta. En otras realizaciones determinadas, la placenta se pliega, por ejemplo, se pliega por la mitad, o sustancialmente por la mitad, una o varias veces durante la perfusion. En realizaciones espedficas, el plegamiento se realiza a mano, o mecanicamente.
La perfusion, llevada a cabo como se describe anteriormente, da como resultado la recogida de un perfundido placentario, una solucion que comprende una poblacion heterogenea de diferentes celulas placentarias, cuya poblacion comprende las celulas madre placentarias adhesivas a plastico de cultivo tisular, descritas anteriormente en la Seccion 5.2.2, asf como celulas madre placentarias hematopoyeticas, p. ej., celulas madre placentarias CD34 +, que no son adherentes a plastico de cultivo tisular.
5.3.5 Aislamiento, clasificacion y caracterizacion de celulas madre placentarias
Las celulas madre placentarias aisladas, por ejemplo, las celulas adherentes a plastico de cultivo tisular descritas en la Seccion 5.2.2, anterior, ya sea obtenidas por perfusion o alteracion ffsica, por ejemplo, por digestion enzimatica, pueden purificarse inicialmente (es decir, aislarse de) otras celulas mediante centrifugacion en gradiente Ficoll. Dicha centrifugacion puede seguir cualquier protocolo convencional de velocidad de centrifugacion, etc. En una realizacion, por ejemplo, las celulas recogidas de la placenta se recuperan del perfundido mediante centrifugacion a 5000 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente, que separa las celulas, por ejemplo, de residuos contaminantes y plaquetas. En determinadas realizaciones, el Ficoll se utiliza a una densidad de aproximadamente 1,070 g/ml a aproximadamente 1,090 g/ml, por ejemplo, de aproximadamente 1,073 g/ml, 1,077 g/ ml o de aproximadamente 1,084 g/ml; las celulas madre placentarias se recogeran en la parte superior del gradiente
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a estas densidades. En otra realizacion, el perfundido placentario se concentra a aproximadamente 200 ml, se dispone cuidadosamente en capas sobre Ficoll y se centrifuga a aproximadamente 1100 xg durante 20 minutos a 22 °C, y la capa interfaz de celulas de baja densidad se recoge para su procesamiento posterior.
Los sedimentos celulares pueden volver a suspenderse en la composicion para la recogida de celulas madre recientes, o un medio adecuado para el mantenimiento celular, por ejemplo, para el mantenimiento de celulas madre, por ejemplo, medio aserico IMDM que contiene heparina 2U/ml y EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY) El total de la fraccion de celulas mononucleares se puede aislar, por ejemplo, utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) segun el procedimiento recomendado por el fabricante.
Las celulas madre placentarias obtenidas por perfusion o digestion pueden, por ejemplo, adicional o inicialmente, aislarse mediante tripsinizacion diferencial utilizando, p. ej., una solucion de tripsina al 0,05% con EDTA al 0,2% (Sigma, St. Louis, MO). La tripsinizacion diferencial es posible porque las celulas madre placentarias aisladas, que son adherentes a plastico de cultivo tisular, tfpicamente se desprenden de las superficies de plastico al cabo unos cinco minutos, mientras que otras poblaciones adherentes tfpicamente requieren mas de 20-30 minutos de incubacion. Las celulas madre placentarias desprendidas pueden recogerse despues de tripsinizacion y neutralizacion con tripsina, utilizando, por ejemplo, Solucion Neutralizante de Tripsina (TNS, Cambrex). En una realizacion de aislamiento de celulas adherentes, alfcuotas de, por ejemplo, aproximadamente de 5-10 x 106 celulas, se colocan en cada uno de diversos matraces T75, preferiblemente matraces T75 recubiertos con fibronectina. En una realizacion de este tipo, las celulas se pueden cultivar con medio de crecimiento de celulas madre mesenquimatosas disponible en el comercio (MSCGM) (Cambrex), y colocarse en una incubadora de cultivo tisular (37 °C, CO2 5%). Despues de 10 a 15 dfas, las celulas no adherentes se eliminan de los matraces mediante lavado con PBS. Despues, el PBS se reemplaza por MSCGM.
El numero y tipo de celulas recogidas de una placenta de mairnfero se puede controlar, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfologfa y los marcadores de la superficie celular utilizando tecnicas convencionales de deteccion de celulas tales como citometna de flujo, clasificacion celular, inmunocitoqmmica (por ejemplo, tincion con anticuerpos espedficos de tejido o espedficos de marcador celular), clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS, fluorescence activated cell sorting), clasificacion celular activada por magnetismo (MACS, magnetic activated cell sorting), examinando la morfologfa de las celulas utilizando microscopfa optica o confocal, y/o midiendo cambios en la expresion genica utilizando tecnicas bien conocidas en la materia, tales como PCR y perfil de expresion genica. Estas tecnicas tambien se pueden utilizar para identificar celulas que son positivas para uno o mas marcadores particulares. Por ejemplo, utilizando anticuerpos contra CD73, se puede determinar, utilizando las tecnicas anteriores, si una celula comprende una cantidad perceptible de CD73; y si es asf, la celula es CD73+. Del mismo modo, si una celula produce suficiente ARN OCT-4 para ser perceptible mediante RT-PCR, o significativamente mas ARN oCT-4 que una celula adulta (diferenciada terminalmente) (p. ej., un fibroblasto dermico), la celula es OCT-4+. En una realizacion espedfica, la celula es positiva para un ARNm particular si el ARNm se amplifica por encima del fondo mediante RT-PCR, utilizando un par de cebadores apropiado, en 35 ciclos o menos. Los anticuerpos para marcadores de la superficie celular (por ejemplo, marcadores CD tales como CD34) y la secuencia de genes espedficos de celulas madre, tales como oCT-4, son muy conocidos en la tecnica.
Las celulas madre placentarias, particularmente las celulas que se han aislado mediante separacion con Ficoll, adherencia diferencial, o una combinacion de ambas, se pueden clasificar, por ejemplo, utilizando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS). La clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) es un metodo muy conocido para separar partfculas, incluidas las celulas, en funcion de las propiedades fluorescentes de las partfculas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151: 150-165). En una realizacion, los anticuerpos o ligandos espedficos de marcadores de la superficie celular, se marcan con diferentes marcadores fluorescentes. Las celulas se procesan a traves del clasificador celular, lo que permite su separacion en funcion de su capacidad de unirse a los anticuerpos utilizados. Las partfculas clasificadas por FACS pueden depositarse directamente en pocillos individuales de placas de 96 o 384 pocillos, para facilitar la separacion y la clonacion.
En un esquema de clasificacion, las celulas madre placentarias, por ejemplo, PDAC, se clasifican basandose en la expresion de uno o mas de los marcadores CD34, CD44, CD45, Cd73, cD90, CD105, CD133, CD166, CD200 y / o kDR; es decir, las celulas madre placentarias se clasifican basandose en la expresion de uno o mas de cD44, CD73, CD90, CD105, CD166 o cD200 y/o en la ausencia de expresion de CD34, CD45, CD133 o KDR. Esto se puede realizarse junto con procedimientos para seleccionar dichas celulas en funcion de sus propiedades de adherencia en el cultivo. Por ejemplo, la seleccion de adherencia a plastico de cultivo tisular puede realizarse antes o despues de la clasificacion en funcion de la expresion del marcador. En una realizacion, por ejemplo, las celulas se clasifican primero en funcion de su expresion de CD34; las celulas CD34- se retienen y las celulas CD34- que ademas son una o mas de CD73+, CD90+ o CD200+, se separan de las demas celulas CD34-. En otra realizacion, las celulas de la placenta se clasifican en funcion de su expresion de CD200; por ejemplo, las celulas que muestran CD200 se afslan para su uso posterior. Las celulas que expresan, por ejemplo, CD200 pueden, en una realizacion espedfica, clasificarse adicionalmente en funcion de su expresion de CD73 y / o CD105, o epttopos reconocidos por los anticuerpos SH2, SH3 o SH4, o ausencia de expresion de CD34, CD38 o CD45. Por ejemplo, en otra realizacion, las celulas madre placentarias se clasifican por expresion, o ausencia de ella, de CD200, CD73, CD105, CD34, CD38 y CD45, y celulas madre placentarias que son CD200+, CD73+, CD105+, CD34-, CD38- y CD45- se afslan de otras celulas placentarias para su uso posterior.
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La clasificacion de celulas puede utilizarse para confirmar la identidad de una poblacion de celulas madre placentarias. Por ejemplo, las celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo tisular, por ejemplo, las PDAC, descritas en esta memoria, se pueden cultivar durante uno o mas pases, despues se recogen y una muestra se caracteriza utilizando anticuerpos contra CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105 y / o CD200, para determinar si, por ejemplo, el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de las celulas cultivadas son CD34-, CD44 +, CD45 -, CD73 + , CD90 + , CD105 + y / o CD200+.
En realizaciones espedficas de cualquiera de las realizaciones anteriores de celulas madre placentarias clasificadas, al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las celulas en una poblacion celular que permanece despues de la clasificacion son dichas celulas madre placentarias aisladas. Las celulas madre placentarias pueden clasificarse mediante uno o mas de cualquiera de los marcadores descritos en la Seccion 5.2.2 anterior. En una realizacion espedfica, por ejemplo, las celulas placentarias que son (1) adherentes a plastico de cultivo tisular, y (2) CD10+, CD34- y CD105 + se clasifican de (es decir, se afslan de) otras celulas placentarias. En otra realizacion espedfica, las celulas placentarias que son (1) adherentes a plastico de cultivo tisular, y (2) CD10+, CD34-, CD105 + y CD200 +se clasifican de (es decir, se afslan de) otras celulas placentarias. En otra realizacion espedfica, las celulas placentarias que son (1) adherentes a plastico de cultivo tisular, y (2) CD10+, CD34-, CD45-, CD90+, CD105 + y CD200 + se clasifican de (es decir, se afslan de) otras celulas placentarias. Sin embargo, las celulas madre placentarias no necesitan clasificarse segun un marcador celular particular, o conjunto de marcadores celulares, para "aislarse".
Con respecto a la deteccion y / o analisis basados en secuencias de nucleotidos de celulas madre placentarias, las secuencias para los marcadores enumerados en la presente memoria estan facilmente disponibles en bases de datos disponibles al publico, tales como GenBank o eMbL.
Con respecto a la deteccion y clasificacion mediada por anticuerpos de celulas madre placentarias, por ejemplo, celulas madre placentarias o celulas multipotentes placentarias, se puede utilizar cualquier anticuerpo espedfico para un marcador particular, en combinacion con cualquier fluoroforo u otro marcador adecuado para la deteccion y clasificacion de celulas (p. ej., clasificacion celular activada por fluorescencia). Las combinaciones de anticuerpo/fluoroforo para marcadores espedficos incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluorescema (FITC) contra HLA-G (disponible en Serotec, Raleigh, Carolina del Norte), CD10 (disponible en BD Immunocytometry Systems, San Jose, California), CD44 (disponible en BD Biosciences Pharmingen, San Jose, California) y CD105 (disponible en R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD117 y CD13 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7) contra CD33 y CD10 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados con aloficocianina (APC) y estreptavidina contra CD38 (BD Biosciences Pharmingen); y CD90 marcado con biotina (biotinilado) (Bd Biosciences Pharmingen). Otros anticuerpos que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitacion, CD133-APC (Miltenyi), KDR- Biotina (Cd3o9, Abeam), citoqueratina-Fitc (Sigma o Dako), HLA ABC-Fitc (BD), HLA DR, DQ, DP-PE (BD), p-2- microglobulina-PE (BD), CD80-PE (BD) y CD86-APC (BD). Otras combinaciones de anticuerpo / marcador que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitacion, CD45-PerCP (protema peridinin clorofila); CD44-PE; CDlO-F (fluorescema); HLA-G-F y 7-amino-actinomicina-D (7-AAD); HLA-ABC-F; y similares. Esta lista no es exhaustiva, y en el comercio se tambien se dispone de otros anticuerpos de otros proveedores.
Las celulas madre placentarias aisladas pueden someterse a ensayo para CD117 o CD133 utilizando, por ejemplo, anticuerpos monoclonales conjugados con biotina, estreptavidina y ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5) contra CDl17 o CD133; sin embargo, al utilizar este sistema, las celulas pueden parecer se positivas para CD117 o CD133, respectivamente, debido a un fondo relativamente alto.
Las celulas madre placentarias aisladas se pueden marcar con un anticuerpo para un solo marcador y se pueden detectar y clasificar. Las celulas madre placentarias tambien pueden marcarse simultaneamente con multiples anticuerpos para diferentes marcadores.
En otra realizacion, se pueden utilizar perlas magneticas para separar celulas, por ejemplo, separar celulas madre placentarias de otras celulas placentarias. Las celulas pueden clasificarse utilizando una tecnica de clasificacion celular activada por magnetismo (MACS), un metodo para separar partmulas en funcion de su capacidad para unirse a perlas magneticas (de 0,5-100 pm de diametro). Se pueden realizar diversas modificaciones utiles en las microesferas magneticas, incluida la adicion covalente de un anticuerpo que reconoce espedficamente una molecula o hapteno de superficie celular particular. Despues, las perlas se mezclan con las celulas para permitir la union. Las celulas se hacen pasar a traves de un campo magnetico para separar las celulas que tienen el marcador de superficie celular espedfico. En una realizacion, estas celulas pueden despues aislarse y volverse a mezclar con perlas magneticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores de superficie celular adicionales. Las celulas se hacen pasar nuevamente a traves de un campo magnetico, aislando las celulas que se unen a ambos anticuerpos. Dichas celulas pueden despues diluirse en placas distintas, tales como placas de microtitulacion, para su aislamiento clonal.
Las celulas madre placentarias aisladas tambien se pueden caracterizar y / o clasificar segun caractensticas morfologicas y de crecimiento celular. Por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas se pueden caracterizar
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por tener, y/o se pueden seleccionar, basandose, por ejemplo, en un aspecto fibroblastoide en cultivo. Las celulas madre placentarias aisladas tambien se pueden caracterizar por tener, y/o se pueden seleccionar, basandose en su capacidad para formar cuerpos similares a embriones. En una realizacion, por ejemplo, las celulas madre placentarias que tienen forma de fibroblastoide, expresan CD73 y CD105, y que producen uno o mas cuerpos similares a embriones en cultivo, se afslan de otras celulas placentarias. En otra realizacion, las celulas madre placentarias OCT-4 + que producen uno o mas cuerpos similares a embriones en cultivo se afslan de otras celulas placentarias.
Las celulas madre placentarias aisladas pueden evaluarse en cuanto a su viabilidad, potencial de proliferacion y longevidad, utilizando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica, tales como ensayo de exclusion con azul de tripano, ensayo de absorcion de diacetato de fluorescema, ensayo de absorcion de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad); y ensayo de absorcion de timidina, ensayo de proliferacion celular con MTT (bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (para evaluar la proliferacion). La longevidad puede determinarse por metodos bien conocidos en la tecnica, tales como determinando el numero maximo de generaciones poblacionales en un cultivo prolongado.
Las celulas madre placentarias aisladas, por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas descritas en la Seccion 5.2.2 anterior, tambien pueden separarse de otras celulas placentarias utilizando otras tecnicas conocidas en la materia, por ejemplo, crecimiento selectivo de celulas deseadas (seleccion positiva), destruccion selectiva de celulas no deseadas (seleccion negativa); separacion basada la aglutinabilidad celular diferencial en la poblacion mixta tal como, por ejemplo, con aglutinina de soja; procedimientos de congelacion y
descongelacion; filtracion; centrifugacion convencional y zonal; elutriacion centnfuga (centrifugacion a
contracorriente); separacion unigravitacional; distribucion a contracorriente; electroforesis; y similares.
5.4 CULTIVO DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS AISLADAS
5.4.1 Medios de cultivo
Las celulas placentarias aisladas, o el tejido placentario a partir del cual crecen las celulas madre placentarias, se pueden utilizar para iniciar, o sembrar, cultivos de celulas madre placentarias. Las celulas generalmente se transfieren a recipientes esteriles de cultivo tisular ya sea sin recubrir o recubiertos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (por ejemplo, nativo o desnaturalizado), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina y protema de membrana extracelular (p. ej., MATRIGEL® (BD Descubrimiento Labware, Bedford, Mass.)). Para el cultivo de BM-MSC pueden utilizarse procedimientos similares.
Se pueden cultivar celulas placentarias aisladas, por ejemplo, celulas madre placentarias aisladas, en cualquier medio y en cualquier condicion reconocidos en la tecnica como aceptables para el cultivo de celulas, por ejemplo, celulas madre. Preferiblemente, el medio de cultivo comprende suero, por ejemplo, suero bovino, suero humano, o similar. Las celulas madre placentarias aisladas se pueden cultivar, por ejemplo, en DMEM-LG (medio esencial de Dulbecco modificado con bajo contenido en glucosa) / MCDB 201 (medio basal de fibroblastos de pollo) que contiene ITS (insulina-transferrina-selenio), LA + BSA (acido linoleico - albumina de suero de bovino), acido L- ascorbico y dexametasona, PDGF, EGF, IGF-1 y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (con alto contenido en glucosa) que comprende suero bovino fetal (FBS) al 10%; DMEM-HG que comprende FBS al 15%; IMDM (medio de Dulbecco modificado por Iscove) que comprende FBS al 10%, suero de caballo al 10% e hidrocortisona; M199 que comprende FBS 1% a 20%, EGF y heparina; a-MEM (medio esencial mmimo) que comprende FBS al 10%, GLUTAMAX ™ y gentamicina; DMEM que comprende FBS al 10%, GLUTAMAX ™ y gentamicina, etc.
Otros medios que pueden utilizarse para cultivar celulas madre placentarias incluyen DMEM (con alto o bajo contenido en glucosa), medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio de crecimiento de celulas madre mesenquimatosas (MSCGM), medio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) y CELL-GRO FREE.
El medio de cultivo puede complementarse con uno o mas componentes que incluyen, por ejemplo, suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), preferiblemente aproximadamente 2-15% (v / v); suero equino (de caballo) (ES); suero humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferiblemente aproximadamente 0,001% (v/v); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento insulmico-1 (IGF-1), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y eritropoyetina (EPO); aminoacidos, incluida L-valina; y uno o mas antibioticos y/o agentes antimicoticos para controlar la contaminacion microbiana, tales como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, sola o en combinacion.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias adecuadas para su uso en los metodos descritos en esta memoria pueden cultivarse en un medio que comprende medio DMEM complementado con suero fetal bovino (FBS, por ejemplo, FBS 1,9% v/v), acido linolenico-albumina ( p. ej., 0,01% v/v) (Sigma), insulina-transferrina-selenio (0,97% v/v) (Invitrogen, Carlsbad, CA), gentamicina (p. ej., 48 pg/ml) (Invitrogen), acido L-ascorbico 2 fosfato
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sesquimagnesio (por ejemplo, 97 pM) (Sigma), dexametasona 48 nM (Sigma), PDGF-BB humano recombinante (por ejemplo, 9,7 ng/ml) (Invitrogen) y EGF humano recombinante (por ejemplo, 9,7 ng/ml) (Invitrogen).
Las celulas madre placentarias aisladas pueden cultivarse en condiciones de cultivo tisular convencionales, por ejemplo, en placas de cultivo o placas multipocillo tisular. Las celulas madre placentarias aisladas tambien pueden cultivarse utilizando el metodo de gota colgante. En este metodo, las celulas madre placentarias aisladas se suspenden a aproximadamente 1 x 104 celulas por ml en aproximadamente 5 ml de medio, y se colocan una o mas gotas del medio en el interior de la tapa de un envase de cultivo tisular, por ejemplo, una placa de Petri de 100 ml. Las gotas pueden ser, por ejemplo, gotas simples o multiples gotas, por ejemplo, de una pipeta multicanal. La tapa se invierte cuidadosamente y se coloca en la parte superior del fondo de la placa, que contiene un volumen de liquido, por ejemplo, PBS esteril, suficiente para mantener el contenido de humedad en la atmosfera de la placa, y se cultivan las celulas madre placentarias.
En una realizacion, las celulas madre placentarias aisladas se cultivan en presencia de un compuesto que actua para mantener un fenotipo indiferenciado en las celulas madre placentarias aisladas. En este contexto, "indiferenciado" no requiere una completa indiferenciacion, por ejemplo, incluye un fenotipo relativamente indiferenciado en comparacion con las celulas diferenciadas terminalmente, o las celulas madre placentarias causadas por diferenciacion, tal como expresar una o mas caracteristicas de una celula diferenciada terminalmente. En una realizacion especifica, el compuesto es una 3,4-dihidropiridimol[4,5-d]pirimidina sustituida. En otra realizacion especifica, el compuesto es un compuesto que tiene la siguiente estructura quimica:
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El compuesto se puede poner en contacto con celulas madre placentarias aisladas a una concentracion, por ejemplo, de entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 10 pM.
5.4.2 Expansion y proliferacion de celulas madre placentarias
Una vez aisladas las celulas madre placentarias (p. ej., separadas de al menos el 50% de las celulas placentarias con las cuales las celulas madre placentarias se asocian normalmente in vivo), las celulas o poblacion de celulas pueden proliferar y expandirse in vitro. Por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas pueden cultivarse en recipientes de cultivo tisular, por ejemplo, placas, matraces, placas multipocillo, o similares, durante un tiempo suficiente para que las celulas proliferen hasta una confluencia de 70-90%, es decir, hasta que las celulas y su progenie ocupen el 70-90% del area de superficie de cultivo del recipiente de cultivo tisular.
Las celulas madre placentarias aisladas se pueden sembrar en vasos de cultivo a una densidad que permita el crecimiento celular. Por ejemplo, las celulas pueden sembrarse de baja densidad (por ejemplo, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 5.000 celulas/cm2) a alta densidad (por ejemplo, a aproximadamente 50.000 celulas/cm2 o mas). En una realizacion preferida, las celulas se cultivan en presencia de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2 en el aire. En algunas realizaciones preferidas, las celulas se cultivan de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en el aire, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de O2 en el aire. Las celulas se cultivan preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, preferiblemente a 37 °C. Las celulas se cultivan preferiblemente en una incubadora. El medio de cultivo puede ser estatico o agitado, por ejemplo, utilizando un biorreactor. Las celulas madre placentarias, en determinadas realizaciones, se cultivan con estres oxidativo bajo (por ejemplo, con la adicion de glutation, acido ascorbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcisteina, o similares).
Una vez que se obtiene una confluencia menor de 100%, por ejemplo, de 70% a 90%, las celulas pueden someterse a pases. Por ejemplo, las celulas pueden tratarse enzimaticamente, por ejemplo, con tripsina, utilizando tecnicas bien conocidas en la materia, para separarlas de la superficie del cultivo tisular. Despues de retirar las celulas con una pipeta y de realizar un recuento de las mismas, se realiza un pase de aproximadamente 10.000 a 100.000 celulas/ cm 2 a un nuevo recipiente de cultivo que contiene medio de cultivo reciente. Tipicamente, el nuevo medio es el mismo tipo de medio del que se extrajeron las celulas madre placentarias aisladas. Las celulas madre placentarias aisladas pueden someterse a pases aproximadamente, al menos, o no mas de, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 veces, o mas.
5.4.3 Poblaciones de celulas madre placentarias aisladas
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En la presente memoria tambien se proporcionan poblaciones de celulas madre placentarias aisladas, por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas descritas en la Seccion 5.2.2 anterior, utiles en los metodos y composiciones descritos en esta memoria. Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas se pueden aislar directamente de una o mas placentas; es decir, la poblacion de celulas puede ser una poblacion de celulas placentarias que comprende las celulas placentarias aisladas, en donde las celulas madre placentarias aisladas se obtienen de un perfundido, o estan contenidas en el mismo, o se obtienen de tejido placentario alterado, o estan contenidas en el mismo, por ejemplo, un digerido de tejido placentario (es decir, la recogida de celulas obtenidas por digestion enzimatica de una placenta o de una parte de la misma). Las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria, tambien se pueden cultivar y expandir para producir poblaciones de celulas madre placentarias aisladas. Las poblaciones de celulas placentarias que comprenden las celulas madre placentarias aisladas tambien se pueden cultivar y expandir para producir poblaciones de celulas madre placentarias.
Las poblaciones de celulas madre placentarias utiles en los metodos de tratamiento proporcionados en esta memoria, comprenden las celulas madre placentarias aisladas, por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas como se describe en la Seccion 5.2.2 de este documento. En diversas realizaciones, al menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 99% de las celulas en una poblacion de celulas placentarias son las celulas madre placentarias aisladas. Es decir, una poblacion de las celulas placentarias aisladas puede comprender, por ejemplo, tanto como 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de celulas que no son las celulas madre placentarias aisladas.
Las poblaciones de celulas placentarias aisladas, que comprenden las celulas madre placentarias aisladas, utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden producirse, por ejemplo, seleccionando celulas placentarias aisladas, ya sea obtenidas por digestion o perfusion enzimatica, que expresan marcadores particulares y/o caractensticas morfologicas o de cultivo particulares. En diversas realizaciones, por ejemplo, proporcionadas en la presente memoria, se hace referencia a un metodo para producir una poblacion celular seleccionando celulas placentarias que comprenden celulas madre placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan cualquiera de uno, o cualquier combinacion de, los marcadores de citometna de flujo y/o las caractensticas de expresion genetica descritos en esta memoria, por ejemplo, anteriormente en la Seccion 5.2.
En otro aspecto, pueden producirse poblaciones de celulas madre placentarias, por ejemplo, las celulas madre placentarias descritas anteriormente en la Seccion 5.2, seleccionando tanto las caractensticas de expresion de marcadores como la capacidad de la poblacion de celulas madre placentarias, por ejemplo, de una muestra de la poblacion de celulas madre placentarias, para suprimir, por ejemplo, suprimir de manera perceptible, la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso. En varias realizaciones, las celulas de un cancer relacionado con hueso son celulas de mieloma multiple, celulas de condrosarcoma, celulas de cancer de hueso, celulas de neuroblastoma, celulas de osteosarcoma, celulas de sarcoma de Ewing, celulas de cordoma, celulas de histiocitoma fibroso maligno de hueso, celulas de cancer de prostata o celulas de fibrosarcoma de hueso. Dicha seleccion se puede aplicar, por ejemplo, a diferentes poblaciones de celulas madre placentarias, por ejemplo, tandas o lotes de celulas madre placentarias para identificar poblaciones que cumplan, por ejemplo, determinados criterios predeterminados para lograr eficacia.
La seleccion de poblaciones de celulas que comprenden celulas madre placentarias que tienen cualquiera de las combinaciones de marcadores descritas anteriormente en la Seccion 5.2.2, se puede aislar u obtener de manera similar.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, la seleccion de las poblaciones de celulas aisladas puede comprender adicionalmente seleccionar celulas madre placentarias que expresen ABC-p (una protema transportadora ABC espedfica de la placenta; vease, por ejemplo, Allikmets et al., Cancer Res. 58 (23): 5337-9 (1998)). El metodo tambien puede comprender la seleccion de celulas que muestren al menos una caractenstica espedfica, por ejemplo, de una celula madre mesenquimatosa, por ejemplo, expresion de CD44, la expresion de CD90 o expresion de una combinacion de lo anterior.
En las realizaciones anteriores, el sustrato puede ser cualquier superficie en donde se pueda realizar el cultivo y / o la seleccion de celulas, por ejemplo, celulas madre placentarias aisladas. Tfpicamente, el sustrato es plastico, por ejemplo, un plastico de una placa de cultivo tisular o multipocillo. El plastico de cultivo tisular puede recubrirse con una biomolecula, por ejemplo, laminina o fibronectina.
Las celulas madre placentarias aisladas pueden seleccionarse por cualquier medio conocido en la tecnica de seleccion celular. Por ejemplo, las celulas se pueden seleccionar utilizando uno o mas anticuerpos para uno o mas marcadores de superficie celular, por ejemplo, en citometna de flujo o FACS. La seleccion puede realizarse utilizando anticuerpos junto con perlas magneticas. En la tecnica se conocen anticuerpos que son espedficos para determinados marcadores relacionados con celulas madre. Por ejemplo, anticuerpos para OCT-4 (Abeam, Cambridge, MA), CD200 (Abeam), HLA-G (Abeam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), CD105 (Abeam, BioDesign International, Saco, ME), etc. Los anticuerpos para otros marcadores tambien estan disponibles comercialmente, por ejemplo, CD34, CD38 y CD45 estan disponibles, p. ej., en StemCell Technologies o BioDesign Internacional.
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Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas pueden comprender celulas placentarias que no son celulas madre, o celulas que no son celulas placentarias.
Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas proporcionadas en esta memoria se pueden combinar con una o mas poblaciones de celulas que no son celulas madre o placentarias. Por ejemplo, una poblacion de celulas madre placentarias aisladas puede combinarse con sangre (por ejemplo, sangre de placenta o de cordon umbilical), celulas madre derivadas de sangre (por ejemplo, celulas madre derivadas de sangre de placenta o de cordon umbilical), celulas madre de cordon umbilical, poblaciones de celulas nucleadas derivadas de sangre, celulas mesenquimatosas derivadas de medula osea, poblaciones de celulas madre derivadas de hueso, celulas madre adultas (somaticas) de medula osea ordinaria, poblaciones de celulas madre incluidas en tejido, celulas madre cultivadas, poblaciones de celulas completamente diferenciadas (por ejemplo, condrocitos, fibroblastos, celulas amnioticas, osteoblastos, miocitos, cardiocitos, etc.) y similares. En una realizacion espedfica, una poblacion de celulas util en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria comprende celulas madre placentarias aisladas y celulas madre de cordon umbilical aisladas. En una poblacion de celulas madre placentarias aisladas, las celulas se pueden combinar con una pluralidad de celulas de otro tipo en proporciones de aproximadamente 100.000.000:1; 50.000.000:1; 20.000.000:1; 10.000.000:1; 5.000.000:1; 2.000.000:1; 1.000.000:1; 500.000:1; 200.000:1; 100.000:1; 50.000:1; 20.000:1; 10.000:1; 5.000:1; 2.000:1; 1.000:1; 500:1; 200:1; 100:1; 50:1; 20:1; 10:1; 5:1; 2:1; 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1.000; 1:2.000; 1:5.000; 1:10.000; 1: 20,000; 1:
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En una realizacion, una poblacion de celulas madre placentarias aisladas se combina con una pluralidad de celulas madre hematopoyeticas. Dichas celulas madre hematopoyeticas pueden estar, por ejemplo, incluidas en una placenta, sangre de cordon umbilical o sangre periferica no procesada; en el total de las celulas nucleadas de la sangre placentaria, la sangre de cordon umbilical o la sangre periferica; en una poblacion de celulas CD34 + aisladas de sangre placentaria, sangre de cordon umbilical o sangre periferica; en medula osea no procesada; en el total de celulas nucleadas de la medula osea; en una poblacion de celulas CD34 + aisladas de medula osea, o similar.
En otras realizaciones, una poblacion de las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, por ejemplo, las PDAC descritas en la Seccion 5.2.2 anterior, se combinan con celulas adherentes placentarias osteogenicas (OPAC, osteogenic placental adherent cells), por ejemplo, las OPAC descritas en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2010/0047214. En otras realizaciones, una poblacion de celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, por ejemplo, las PDAC descritas en la Seccion 5.2.2 anterior, se combinan con perfundido placentario y / o linfocitos citoliticos naturales, por ejemplo, linfocitos citoltticos naturales de perfundido placentario, por ejemplo, linfocitos citolfticos naturales intermedios placentarios, por ejemplo, como se describe en la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. N° 2009/0252710.
5.5 CONSERVACION DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
Las celulas madre placentarias aisladas, por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas descritas anteriormente, se pueden conservar, es decir, se pueden poner en condiciones que permitan su conservacion prolongada, o en condiciones que inhiban la muerte celular, por ejemplo, por apoptosis o necrosis.
Las celulas madre placentarias pueden conservarse utilizando, por ejemplo, una composicion que comprenda un inhibidor de la apoptosis, un inhibidor de la necrosis y / o un perfluorocarbono transportador de oxfgeno, como se describe en la Publicacion de Solicitud de Estados Unidos N° 2007/0190042. En una realizacion, un metodo para conservar una poblacion de celulas, por ejemplo, celulas madre placentarias, comprende poner en contacto dicha poblacion de celulas con una composicion para la recogida de celulas que comprende un inhibidor de la apoptosis y un perfluorocarbono transportador de oxfgeno, en donde dicho inhibidor de la apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o impedir que se produzca la apoptosis en la poblacion de celulas, en comparacion con una poblacion de celulas que no se han puesto en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una realizacion espedfica, dicho inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otra realizacion espedfica, dicho inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de JNK. En otra realizacion espedfica, dicho inhibidor de jNk no modula la diferenciacion o proliferacion de dichas celulas. En otra realizacion, dicha composicion para la recogida de celulas comprende dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono transportador de oxfgeno en fases distintas. En otra realizacion, dicha composicion para la recogida de celulas comprende dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono transportador de oxfgeno en una emulsion. En otra realizacion, la composicion para la recogida de celulas comprende adicionalmente un emulsionante, por ejemplo, lecitina. En otra realizacion, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono estan a una temperatura entre aproximadamente 0 °C y aproximadamente 25 °C en el momento de la puesta en contacto de las celulas. En otra realizacion espedfica, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono estan a una temperatura entre aproximadamente 2 °C y 10 °C, o entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 5 °C, en el momento de la puesta en contacto de las celulas. En otra realizacion espedfica, dicha puesta en contacto se realiza durante el transporte de dicha poblacion de celulas. En otra realizacion espedfica, dicha puesta en contacto se realiza durante la congelacion y descongelacion de dicha poblacion de celulas, por ejemplo, celulas madre placentarias.
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Las poblaciones de celulas madre placentarias utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria, pueden conservarse, por ejemplo, mediante un metodo que comprende poner en contacto dicha poblacion de celulas con un inhibidor de la apoptosis y un compuesto conservante de organos, en donde dicho inhibidor de la apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o impedir que se produzca la apoptosis en la poblacion de celulas, en comparacion con una poblacion de celulas que no se ha puesto en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una realizacion espedfica, el compuesto conservante de organos es una solucion de UW (por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.798.824, tambien conocida como ViaSpan; vease tambien Southard et al., Transplantation 49 (2): 251-257 (1990)) o una solucion descrita en Stern et al., Patente de Estados Unidos N° 5.552.267. En otra realizacion, dicho compuesto conservante de organos es hidroxietil almidon, acido lactobionico, rafinosa o una combinacion de los mismos. En otra realizacion, la composicion para la recogida de celulas comprende adicionalmente un perfluorocarbono transportador de oxfgeno, ya sea en dos fases o como una emulsion.
En otra realizacion del metodo, durante la perfusion, las celulas madre placentarias se ponen en contacto con una composicion para la recogida de celulas que comprende un inhibidor de la apoptosis y perfluorocarbono transportador de oxfgeno, un compuesto conservante de organos, o una combinacion de los mismos. En otra realizacion, dichas celulas se ponen en contacto durante un proceso de alteracion tisular, por ejemplo, digestion enzimatica. En otra realizacion, las celulas madre placentarias se ponen en contacto con dicho compuesto para la recogida de celulas despues de la recogida por perfusion, o despues de la recogida por alteracion tisular, por ejemplo, digestion enzimatica.
Tfpicamente, durante la recogida, el enriquecimiento y el aislamiento de las celulas madre placentarias, es preferible minimizar o eliminar el estres celular debido a hipoxia y a estres mecanico. Por lo tanto, en otra realizacion del metodo, una celula, o poblacion de celulas, por ejemplo, celulas madre placentarias, esta expuesta a una condicion hipoxica durante la recogida, enriquecimiento o aislamiento durante menos de seis horas durante dicha conservacion, en donde una condicion hipoxica es una concentracion de oxfgeno que es menor que la concentracion normal de oxfgeno en sangre. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas esta expuesta a dicha condicion hipoxica durante menos de dos horas durante dicha conservacion. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas esta expuesta a dicha condicion hipoxica durante menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no esta expuesta a una condicion hipoxica, durante la recogida, enriquecimiento o aislamiento. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas no esta expuesta a esfuerzo cortante durante la recogida, el enriquecimiento o el aislamiento.
Las celulas madre placentarias se pueden crioconservar, por ejemplo, en medio de crioconservacion, en recipientes pequenos, por ejemplo, en ampollas. El medio de crioconservacion adecuado incluye, pero sin limitacion, medio de cultivo que incluye, p. ej., medio de crecimiento, o medio de congelacion celular, por ejemplo, medio de congelacion celular disponible en el comercio, por ejemplo, C2695, C2639 o C6039 (Sigma). El medio de crioconservacion comprende preferiblemente DMSO (dimetilsulfoxido), a una concentracion de aproximadamente 2% a aproximadamente 15% (v / v), por ejemplo, de aproximadamente 10% (v / v). El medio de crioconservacion puede comprender otros agentes, por ejemplo, metilcelulosa y/o glicerol. Las celulas madre placentarias se enfnan preferiblemente a aproximadamente 1 °C / min durante la crioconservacion. La crioconservacion puede efectuarse llevando las celulas a una temperatura de aproximadamente -80 °C a aproximadamente -180 °C, preferiblemente de aproximadamente -125 °C a aproximadamente -140 °C. Para su uso, las celulas crioconservadas pueden transferirse a nitrogeno lfquido antes de la descongelacion. En algunas realizaciones, por ejemplo, una vez que las ampollas han alcanzado aproximadamente -90 °C, se transfieren a una zona de almacenamiento con nitrogeno lfquido. La crioconservacion tambien puede realizarse utilizando un congelador de velocidad controlada. Las celulas crioconservadas se descongelan, preferiblemente, a una temperatura que vana de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37 °C.
Las celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea tambien pueden conservarse mediante cualquiera de los metodos anteriores.
5.6 COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN CELULAS MADRE PLACENTARIAS AISLADAS
Las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, por ejemplo, en la Seccion 5.2.2, se pueden combinar con cualquier compuesto, composicion o dispositivo fisiologicamente o medicamente aceptable para su uso en los metodos y composiciones descritos en esta memoria. En determinadas realizaciones, la composicion es una composicion farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, una composicion que comprende celulas madre placentarias en un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Cualquiera de las composiciones descritas en la presente memoria puede comprender adicionalmente celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea aisladas, o medula osea que comprende BM-MSC, por ejemplo, las BM-MSC descritas en la Patente de Estados Unidos N° 5.486.359.
En determinadas realizaciones, una composicion que comprende las celulas madre placentarias aisladas comprende adicionalmente una matriz, por ejemplo, una matriz descelularizada o una matriz sintetica. En otra realizacion espedfica, dicha matriz es un armazon tridimensional. En otra realizacion espedfica, dicha matriz comprende colageno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina o vitronectina. En otra realizacion espedfica, la matriz es
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una membrana amniotica o un biomaterial derivado de membrana amniotica. En otra realizacion espedfica, dicha matriz comprende una protema de membrana extracelular. En otra realizacion espedfica, dicha matriz comprende un compuesto sintetico. En otra realizacion espedfica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra realizacion espedfica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, una citocina, un anticuerpo, o una molecula organica inferior a 5.000 dalton.
En otra realizacion, una composicion util en los metodos de tratamiento proporcionados en esta memoria comprende un medio acondicionado para cualquiera de las celulas madre placentarias anteriores, o cualquiera de las poblaciones de celulas madre placentarias anteriores.
5.6.1 Celulas crioconservadas
Las celulas madre placentarias aisladas, utiles en los metodos y composiciones descritos en la presente memoria, pueden conservarse, por ejemplo, crioconservarse para su uso posterior. En la tecnica se conocen bien metodos para la crioconservacion de celulas, tales como celulas madre. Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas se pueden preparar de una forma que sea facilmente administrable a un individuo, por ejemplo, una poblacion de celulas madre placentarias aisladas que este dentro de un recipiente que sea adecuado para uso medico. Un recipiente de este tipo puede ser, por ejemplo, una jeringa, una bolsa de plastico esteril, un matraz, un frasco u otro recipiente a partir del cual se puede dispensar facilmente la poblacion de celulas placentarias aisladas. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre u otra bolsa de plastico, aceptable desde el punto de vista medico, adecuada para la administracion intravenosa de un lfquido a un receptor. El recipiente es preferiblemente uno que permita la crioconservacion de las celulas madre placentarias aisladas.
Las celulas madre placentarias aisladas crioconservadas pueden comprender celulas placentarias aisladas procedentes de un solo donante o de varios donantes. La poblacion de celulas madre placentarias aisladas puede ser completamente compatible, o parcial o completamente incompatible, con el HLA de un receptor destinatario.
Por lo tanto, en una realizacion, las celulas madre placentarias aisladas pueden utilizarse en los metodos descritos en la presente memoria en forma de una composicion que comprende en un recipiente, una poblacion de celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo tisular. En una realizacion espedfica, las celulas madre placentarias aisladas estan crioconservadas. En otra realizacion espedfica, el recipiente es una bolsa, un matraz o un frasco. En otra realizacion espedfica, dicha bolsa es una bolsa de plastico esteril. En otra realizacion espedfica, dicha bolsa es adecuada, permite o facilita, la administracion intravenosa de dicha poblacion de celulas madre placentarias aisladas, por ejemplo, por infusion intravenosa. La bolsa puede comprender multiples lumenes o compartimentos que estan interconectados para permitir la mezcla de las celulas madre placentarias aisladas y una o mas soluciones distintas, por ejemplo, un farmaco, antes o durante, la administracion. En otra realizacion espedfica, la composicion comprende uno o mas compuestos que facilitan la crioconservacion de las celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas estan incluidas en una solucion acuosa fisiologicamente aceptable. En otra realizacion espedfica, dicha solucion acuosa fisiologicamente aceptable es una solucion de NaCl al 0,9 %. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas comprenden celulas madre placentarias que son compatibles con el HLA de un receptor de dichas celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas combinada comprende celulas madre placentarias que son al menos parcialmente incompatibles con el HLA de un receptor de dichas celulas madre placentarias. En otra realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias aisladas proceden de una pluralidad de donantes.
En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas en el recipiente, son cualquiera de las celulas madre placentarias aisladas descritas en la Seccion 5.2.2 de este documento, en donde dichas celulas se han crioconservado y estan dentro de un recipiente.
En una realizacion espedfica de cualquiera de las celulas madre placentarias aisladas crioconservadas anteriores, dicho recipiente es una bolsa. En diversas realizaciones espedficas, dicho recipiente comprende aproximadamente, al menos, o como maximo, 1 x 106 de dichas celulas madre placentarias aisladas, 5 x 10° de dichas celulas madre
placentarias aislada^ 1 x 107 de dichas celulas madre placentarias aislada^ 5 x 107 de dichas celulas madre
placentarias aisladas, 1 x 10 de dichas celulas madre placentarias aisladas, 5 x 10 de dichas celulas madre
placentarias aisladas, 1 x 109 de dichas celulas madre aisladas, 5 x 109 de dichas celulas madre placentarias
aisladas, 1 x 1010de dichas celulas madre placentarias aisladas o 1 x 1010de dichas celulas madre placentarias aisladas. En otras realizaciones espedficas de cualquiera de las poblaciones crioconservadas anteriores, dichas celulas madre placentarias aisladas se han sometido a pases aproximadamente, al menos, o no mas de, 5 veces, no mas de 10 veces, no mas de 15 veces, o no mas de 20 veces. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las celulas madre placentarias aisladas crioconservadas anteriores, dichas celulas madre placentarias aisladas se han expandido en dicho recipiente.
5.6.2 Celulas madre placentarias modificadas mediante ingenieria genetica
En la presente memoria tambien se proporcionan celulas madre placentarias, en las que las celulas madre placentarias se han modificado mediante ingeniena genetica para producir citocinas recombinantes o exogenas
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asociadas a la supresion tumoral. Por ejemplo, en diversas realizaciones, las celulas madre placentarias estan modificadas mediante ingeniena genetica para expresar cantidades perceptibles de protema exogena, en donde dicha protema exogena es una o mas de una protema morfogenetica osea (BMP), activina A, osteonectina, osteoprotegerina o una conexina. Las secuencias que codifican la activina A se pueden encontrar, por ejemplo, en el GenBank con el No. de registro NM_002191. Las secuencias que codifican la osteonectina se pueden encontrar, por ejemplo, en el GenBank con el No. de registro NM_003118. Las secuencias que codifican la osteoprotegerina se pueden encontrar, por ejemplo, en el GenBank con el No. de registro NM_002546.
En realizaciones espedficas, la conexina es conexina 26 (Cx26) o conexina 43 (Cx43). Las secuencias que codifican Cx26 o Cx43 se pueden encontrar, por ejemplo, en el GenBank con los Nos. de registro NM_004004 y Nm_000165, respectivamente.
En realizaciones espedficas, dicha protema morfogenetica osea es una o mas de BMP1 (protema morfogenetica osea 1), BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9 (GDF2; Factor 2 de diferenciacion de crecimiento), BMP10, BMP11 (GDF11), BMP12 (GDF7), BMP13 (GDF6), BMP14 (GDF5) o BMP15, o cualquiera de sus combinaciones. Las secuencias que codifican las BMP se pueden encontrar, por ejemplo, en el GenBank, por ejemplo, con el No. de registro NM_001199 (BMP1), NM_001200 (BMP2), NM_001201 (BMP3), NM_001202 (BMP4), NM_021073 (BMP5), NM_021073 (BMP6), NM_001719 (BMP7), NM_181809 (BMP8a), NM_001720 (BMP8b), NM_016204 (BMP9/GDF2), NM_014482 (BMP10), NM_005811 (BMP11/GDF11), NM_182828
(BMP12/GDF7), NM_001001557 (BMP13/GDF6 ), NM_000557 (BMP14/GDF5) o NM_005448 (BMP15).
En otras realizaciones, proporcionadas en esta memoria, se hace referencia a celulas madre placentarias aisladas, en las que dichas celulas se modifican mediante ingeniena genetica para expresar IFN-p o IL-2 exogenos. En una realizacion espedfica, dichas celulas madre placentarias expresan IFN-p o lL-2 exogenos en una cantidad que da como resultado una mayor, por ejemplo, perceptiblemente mayor, supresion de la proliferacion de celulas tumorales, cuando dichas celulas tumorales se ponen en contacto con dichas celulas madre placentarias, en comparacion con las celulas madre placentarias que no expresan IFN-p o IL-2 exogenos.
Se pueden utilizar metodos para modificar celulas mediante ingeniena genetica, por ejemplo con vectores retrovmcos, vectores adenovmcos, vectores vmcos adenoasociados, polietilenglicol, u otros metodos conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen el uso de vectores de expresion que transportan y expresan moleculas de acido nucleico en las celulas. (Vease Geoddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). El ADN vectorial se puede introducir en celulas procariotas o eucariotas mediante tecnicas de transformacion o transfeccion convencionales. Pueden encontrarse metodos adecuados para transformar o transfectar celulas huesped en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), y en otros libros de texto de laboratorio.
Las celulas madre placentarias pueden modificarse mediante ingeniena genetica introduciendo ADN o ARN en la celula, por ejemplo, ADN o ARN que codifica una protema de interes, mediante metodos que incluyen la transferencia de virus, incluido el uso de vectores vmcos de ADN o ARN, tales como retrovirus (incluidos los lentivirus), virus del simio 40 (SV40), adenovirus, virus Sindbis y virus del papiloma bovino, por ejemplo; transferencia de productos qrnmicos, incluida la transfeccion de fosfato de calcio y los metodos de transfeccion de DEAE dextrano; transferencia de fusion de membrana, utilizando vesmulas de membrana cargadas con ADN tales como liposomas, eritrocitos fantasma y protoplastos, por ejemplo; o tecnicas de transferencia ffsica, tales como microinyeccion, electroporacion o transferencia de ADN desnudo. Las celulas madre placentarias pueden alterarse geneticamente mediante insercion de ADN exogeno, o mediante sustitucion de un segmento del genoma celular con ADN exogeno. La insercion de una o mas secuencias de ADN exogeno puede realizarse, por ejemplo, mediante recombinacion homologa o mediante integracion de virus en el genoma de la celula hospedadora, o incorporando el ADN en la celula, particularmente en su nucleo, utilizando un vector de expresion plasmfdico y una secuencia de localizacion nuclear. El ADN puede comprender uno o mas promotores que permiten la induccion positiva o negativa de la expresion de la protema de interes utilizando ciertos productos qrnmicos / farmacos, por ejemplo, tetraciclina; en otras realizaciones los promotores pueden ser constitutivos.
La transfeccion de fosfato de calcio puede utilizarse para introducir, en una celula, por ejemplo, en una celula madre placentaria, por ejemplo, ADN plasirndico que contiene una secuencia de polinucleotidos que codifica la protema de interes. En determinadas realizaciones, el ADN se combina con una solucion de cloruro de calcio y despues se agrega a una solucion tamponada con fosfato. Una vez que se forma un precipitado, la solucion se agrega directamente a las celulas cultivadas. El tratamiento con DMSO o glicerol puede utilizarse para mejorar la eficacia de la transfeccion, y los niveles de transfectantes estables se pueden mejorar utilizando bis-hidroxietilamino etanosulfonato (BES). Los sistemas de transfeccion de fosfato de calcio estan disponibles en el comercio (por ejemplo, PROFECTION®, Promega Corp., Madison, Wis.). Tambien puede utilizarse transfeccion de DEAE- dextrano.
Las celulas madre placentarias aisladas tambien pueden modificarse mediante ingeniena genetica por microinyeccion. En determinadas realizaciones, una micropipeta de vidrio se grna al interior del nucleo de celulas con un microscopio optico para inyectar ADN o ARN.
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Las celulas madre placentarias tambien pueden modificarse mediante ingeniena genetica utilizando electroporacion. En determinadas realizaciones, a una suspension de celulas cultivadas se anade ADN o ARN, y la suspension de celulas con ADN/ARN se coloca entre dos electrodos y se somete a un pulso electrico, causando una permeabilidad transitoria en la membrana externa de la celula que se manifiesta por la aparicion de poros a traves de la membrana.
El suministro de ADN o ARN por liposomas para modificar mediante ingeniena genetica las celulas, puede realizarse utilizando liposomas cationicos, incluyendo opcionalmente dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) o dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), por ejemplo, LlPOFECTIN® (Life Technologies, Inc.). Otros sistemas de suministro disponibles en el comercio incluyen EFFECTENE ™ (Qiagen), DOTAP (Roche Molecular Biochemicals), FUGENE 6™ (Roche Molecular Biochemicals) y TRANSFECTaM® (Promega).
Los vectores vmcos pueden utilizarse para alterar geneticamente las celulas madre placentarias suministrando en las celulas, por ejemplo, genes, polinucleotidos, moleculas antisentido o secuencias ribozimaticas diana. Los vectores retrovmcos son eficaces para transducir celulas que se dividen rapidamente, aunque se ha desarrollado una serie de vectores retrovmcos para transferir eficazmente tambien ADN a las celulas que no se dividen. Los expertos en la materia conocen bien lmeas celulares de presentacion de vectores retrovmcos. En determinadas realizaciones, un vector de ADN retrovmco contiene dos LTR retrovmcas, de tal manera que una primera LTR se localiza en 5' con respecto al promotor SV40, que esta unido operativamente a la secuencia genica diana clonada en un sitio multiclonal, seguido de una segunda LTR en 3'. Una vez formado, el vector de ADN retrovmco se transfiere a una lmea celular de presentacion utilizando transfeccion mediada con fosfato de calcio, como se describio anteriormente. Despues de aproximadamente 48 horas de produccion de virus, el vector vmco, que ahora contiene la secuencia del gen diana, se recoge. En la tecnica se conocen metodos de transfeccion de celulas utilizando vectores lentivmcos, herpesvirus recombinantes, vectores adenovmcos o vectores alfavmcos.
El exito de la transfeccion o transduccion de celulas diana se puede demostrar utilizando marcadores geneticos, en una tecnica conocida por los expertos en la materia. La protema fluorescente verde de Aequorea victoria, por ejemplo, ha demostrado ser un marcador eficaz para identificar y rastrear celulas hematopoyeticas modificadas mediante ingeniena genetica. Como marcadores de seleccion alternativos se incluyen el gen de p-Gal, el receptor de la forma truncada del factor de crecimiento nervioso o marcadores de seleccion de farmacos (incluidos, pero sin limitacion, NEO, MTX o higromicina).
Las celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea pueden modificarse mediante ingeniena genetica mediante cualquiera de los metodos y/o cualquiera de los genes descritos anteriormente.
5.6.3 Composiciones Farmaceuticas
Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas, o poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias aisladas, se pueden formular en composiciones farmaceuticas para uso in vivo, por ejemplo, en los metodos de tratamiento proporcionados en esta memoria. Dichas composiciones farmaceuticas comprenden una poblacion de celulas madre placentarias aisladas, o una poblacion de celulas que comprenden celulas madre placentarias aisladas, en un transportador farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, una solucion salina u otra solucion aceptada fisiologicamente aceptable para la administracion in vivo. Las composiciones farmaceuticas que comprenden las celulas madre placentarias aisladas descritas en esta memoria pueden comprender cualquiera, o cualquier combinacion, de las celulas madre placentarias aisladas descritas en cualquier parte en esta memoria. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender celulas madre placentarias fetales, maternas, o tanto fetales como maternas, aisladas. Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender ademas celulas madre placentarias aisladas obtenidas de un solo individuo o placenta, o de varios individuos o placentas.
Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en esta memoria pueden comprender cualquier cantidad de celulas madre placentarias aisladas. Por ejemplo, una sola dosis unitaria de celulas madre placentarias aisladas
puede comprender, en varias realizaciones, aproximadamente, al menos, o no mas de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 10 , 5 x 1010, 1 x 1011o mas celulas madre
placentarias aisladas, o de 1 x 105a 5 x 105, 5x 105a 1 x 106, 1 x 106a 5 x 106, 5 x 106a 1 x 10 7 1 x 107a 5 x 107, 5 x 10 7 a 1 x 108, 1 x 108a 5 x 108, 5 x 108a 1 x 109, 1 x 109a 5 x 109, 5 x 109a 1 x 10 10, 1 x 10 10 a
5 x 1010o 5 x 10 10 a 1 x 10 11 celulas madre placentarias aisladas.
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Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria comprenden poblaciones de celulas madre placentarias que comprenden 50% de celulas viables o mas (es decir, al menos el 50% de las celulas de la poblacion son funcionales o viven). Preferiblemente, al menos el 60% de las celulas de la poblacion son viables. Mas preferiblemente, al menos el 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las celulas de la poblacion en la composicion farmaceutica son viables.
Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en esta memoria pueden comprender uno o mas compuestos que, por ejemplo, facilitan el injerto (por ejemplo, anticuerpos contra receptores de linfocitos T, un inmunosupresor o similar); estabilizantes tales como albumina, dextrano 40, gelatina, hidroxietil almidon, Plasmalyte y similares.
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Cuando se formula como una solucion inyectable, en una realizacion, la composicion farmaceutica comprende aproximadamente HSA del 1% al 1,5% y aproximadamente dextrano al 2,5%. En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica comprende de aproximadamente 5 x 106celulas por mililitro a aproximadamente 2 x 107celulas por mililitro en una solucion que comprende HSA al 5% y dextrano al 10%, que opcionalmente comprende un inmunosupresor, por ejemplo, ciclosporina A en, por ejemplo, 10 mg / kg.
En otras realizaciones, la composicion farmaceutica, por ejemplo, una solucion, comprende celulas madre placentarias aisladas, en donde dicha composicion farmaceutica comprende entre aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 5,0 ± 1,5 x 10 6 celulas por mililitro. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica comprende entre aproximadamente 1,5 x 10 6 celulas por mililitro a aproximadamente 3,75 x 106 celulas por mililitro. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica comprende entre aproximadamente 1 x 106 celulas/ml a aproximadamente 50 x 106 celulas/ml, aproximadamente 1 x 106 celulas/ml a aproximadamente 40 x 106 celulas/ml, aproximadamente 1 x 10 6 celulas/ml a aproximadamente 30 x 10 6 celulas/ml, aproximadamente 1 x 106 celulas/ml a aproximadamente 20 x 10 6 celulas/ml, aproximadamente 1 x 10 6 celulas/ml a aproximadamente 15 x 10 6 celulas/ml, o entre aproximadamente 1 x 10 6 celulas/ml a aproximadamente 10 x 10 6celulas/ml. En determinadas realizaciones, la composicion farmaceutica no comprende masas de celulas visibles (es decir, no tiene, masas macrocelulares), ni sustancialmente dichos grupos visibles. Como se usa en la presente memoria, "masas macrocelulares" significa una agregacion de celulas visible sin aumento, por ejemplo, visible a simple vista, y generalmente se refiere a una agregacion celular mayor que aproximadamente 150 micrometros. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende aproximadamente un porcentaje de dextrano, por ejemplo, dextrano-40, de 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5% 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% o de 10%. En una realizacion espedfica, dicha composicion comprende un porcentaje de dextrano-40 de aproximadamente 7,5% a aproximadamente 9%. En una realizacion espedfica, dicha composicion comprende un porcentaje de dextrano-40 de aproximadamente 5,5%. En determinadas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende albumina de suero humano (HSA) de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%. En realizaciones espedficas, la composicion farmaceutica comprende un porcentaje de HSA de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 65, 75, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%. En una realizacion espedfica, dichas celulas se han crioconservado y descongelado. En otra realizacion espedfica, dichas celulas se han filtrado a traves de un filtro de 70 |jM a 100 |jM. En otra realizacion espedfica, dicha composicion no comprende masas celulares visibles. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 200 masas celulares por 106 celulas, en donde dichas masas celulares son visibles solo al microscopio, por ejemplo, al microscopio optico. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 150 masas celulares por 106 celulas, en donde dichas masas celulares son visibles solo al microscopio, por ejemplo, al microscopio optico. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 100 masas celulares por 106 celulas, en donde dichas masas celulares son visibles solo al microscopio, por ejemplo, al microscopio optico.
En una realizacion espedfica, la composicion farmaceutica comprende aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro, dextrano-40 a aproximadamente 5,5% (p/v), HSA a aproximadamente 10% (p/v) y DMSO a aproximadamente 5% (v/v).
En otras realizaciones, la composicion farmaceutica comprende una pluralidad de celulas madre placentarias aisladas en una solucion que comprende dextrano 40 al 10%, en donde la composicion farmaceutica comprende entre aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 10 6 celulas por mililitro a aproximadamente 5,0 ± 1,5 x 10 6 celulas por mililitro, y en donde dicha composicion no comprende masas celulares visibles a simple vista (es decir, no comprende masas macrocelulares). En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende entre aproximadamente 1,5 x 10 6 celulas por mililitro a aproximadamente 3,75 x 10 6 celulas por mililitro. En una realizacion espedfica, dichas celulas se han crioconservado y descongelado. En otra realizacion espedfica, dichas celulas se han filtrado a traves de un filtro de 70 jM a 100 jM. En otra realizacion espedfica, dicha composicion comprende menos de aproximadamente 200 masas microcelulares (es decir, masas celulares visibles solo con aumento) por 106 celulas. En otra realizacion espedfica, la composicion farmaceutica comprende menos de aproximadamente 150 masas microcelulares por 106 celulas. En otra realizacion espedfica, la composicion farmaceutica comprende menos de aproximadamente 100 masas microcelulares por 106 celulas. En otra realizacion espedfica, la composicion farmaceutica comprende un porcentaje de DMSO menor de 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% o 2% o menor de 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% o 0,1%.
Ademas, en la presente memoria, se proporcionan composiciones que comprenden celulas madre placentarias, en donde dichas composiciones se producen mediante uno de los metodos descritos en dicha memoria. Por ejemplo, en una realizacion, la composicion farmaceutica comprende celulas, por ejemplo, celulas madre placentarias, en donde la composicion farmaceutica se produce mediante un metodo que comprende filtrar una solucion que comprende celulas, por ejemplo, celulas madre placentarias, para formar una solucion que contiene celulas filtradas; diluir la solucion que contiene celulas filtradas con una primera solucion a aproximadamente de 1 a 50 x 106, de 1 a 40 x 106, de 1 a 30 x 106, de 1 a 20 x 106, de 1 a 15 x 106 o de 1 a 10 x 106 celulas por mililitro, por ejemplo, antes de la crioconservacion; y diluir la solucion resultante que contiene celulas filtradas con una segunda solucion que comprende dextrano, pero que no comprende albumina de suero humano (HSA), para producir dicha composicion. En determinadas realizaciones, dicha dilucion no es mayor que aproximadamente 15 x 106 celulas por mililitro. En determinadas realizaciones, dicha dilucion no es mayor que aproximadamente 10 ± 3 x 106 celulas por mililitro. En determinadas realizaciones, dicha dilucion no es mayor que aproximadamente 7,5 x 106 celulas por
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mililitro. En otras realizaciones determinadas, si antes de la dilucion, la solucion que contiene celulas filtradas comprende menos de aproximadamente 15 x 10 6 celulas por mililitro, la filtracion es opcional. En otras realizaciones determinadas, si antes de la dilucion la solucion que contiene celulas filtradas comprende menos de aproximadamente 10 ± 3 x 10 6 celulas por mililitro, la filtracion es opcional. En otras realizaciones determinadas, si antes de la dilucion la solucion que contiene celulas filtradas comprende menos de aproximadamente 7,5 x 106 celulas por mililitro, la filtracion es opcional.
En una realizacion espedfica, las celulas, por ejemplo, celulas madre placentarias, se crioconservan entre dicha dilucion con una primera solucion de dilucion y dicha dilucion con dicha segunda solucion de dilucion. En otra realizacion espedfica, la primera solucion de dilucion comprende dextrano y HSA. El dextrano en la primera solucion de dilucion o en la segunda solucion de dilucion puede ser dextrano de cualquier peso molecular, por ejemplo, dextrano que tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 150 kDa. En algunas realizaciones, dicho dextrano en dicha primera solucion de dilucion, o en dicha segunda solucion, es dextrano a aproximadamente 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5% 8,0 %, 8,5%, 9,0%, 9,5% o 10%. En otra realizacion espedfica, el dextrano en dicha primera solucion de dilucion, o en dicha segunda solucion de dilucion, es dextrano-40. En otra realizacion espedfica, el dextrano en dicha primera solucion de dilucion y en dicha segunda solucion de dilucion es dextrano-40. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano-40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano-40 al 5,0%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano-40 en dicha primera solucion de dilucion es dextrano-40 al 5,5%. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano-40 en dicha segunda solucion de dilucion es dextrano-40 al 10%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA del 1 a 15%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA con un porcentaje de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha solucion que comprende HSA es HSA al 10%. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende HSA. En otra realizacion espedfica, dicha HSA en dicha primera solucion de dilucion es HSA al 10%. En otra realizacion espedfica, dicha primera solucion de dilucion comprende un crioprotector. En otra realizacion espedfica, dicho crioprotector es DMSO. En otra realizacion espedfica, dicho dextrano 40 en dicha segunda solucion de dilucion es dextrano-40 a aproximadamente 10%. En otra realizacion espedfica, dicha composicion que comprende celulas comprende dextrano de aproximadamente 7,5% a aproximadamente 9%. En otra realizacion espedfica, la composicion farmaceutica comprende de aproximadamente 1,0 ± 0,3 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 5,0 ± 1,5 x 106 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, la composicion farmaceutica comprende de aproximadamente 1,5 x 106 celulas por mililitro a aproximadamente 3,75 x 106 celulas por mililitro.
En otra realizacion, la composicion farmaceutica se prepara mediante un metodo que comprende (a) filtrar una solucion que contiene celulas que comprende celulas madre placentarias antes de la crioconservacion, para producir una solucion que contiene celulas filtradas; (b) crioconservar las celulas en la solucion que contiene celulas filtradas a aproximadamente de 1 a 50 x 106, de 1 a 40 x 106, de 1 a 30 x 106,de1 a 20 x 10, de 1 a 15 x 106, o de 1 a 10 x 10 6 celulas por mililitro; (c) descongelar las celulas; y (d) diluir con una solucion de dextrano-40, la solucion que contiene las celulas filtradas de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:11 (v/v). En determinadas realizaciones, si el numero de celulas es menor que aproximadamente 10 ± 3 x 10 6 celulas por mililitro antes de la etapa (a), la filtracion es opcional. En otra realizacion espedfica, las celulas en la etapa (b) se crioconservan a aproximadamente 10 ± 3 x 10 6 celulas por mililitro. En otra realizacion espedfica, las celulas en la etapa (b) se crioconservan en una solucion que comprende un porcentaje de dextrano-40 y HSA de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%. En determinadas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (b) no es mayor que aproximadamente 15 x 106 celulas por mililitro.
En otra realizacion, la composicion farmaceutica se prepara mediante un metodo que comprende: (a) suspender celulas madre placentarias en una solucion de dextrano-40 al 5,5% que comprende HSA al 10% para formar una solucion que contiene celulas; (b) filtrar la solucion que contiene celulas a traves de un filtro de 70 pM; (c) diluir la solucion que contiene celulas con una solucion que comprende dextrano-40 al 5,5%, HSA al 10% y DMSO al 5%, a aproximadamente de 1 a 50 x 106, de 1 a 40 x 106,de1 a 30 x 106, de 1 a 20 x 106, de 1 a 15 x 106o de 1 a 10 x 10 6 celulas por mililitro; (d) crioconservar las celulas; (e) descongelar las celulas; y (f) diluir con dextrano-40 al 10% la solucion que contiene celulas a una proporcion de 1:1 a 1:11 (v/v). En determinadas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (c) no es mayor que aproximadamente 15 x 106 celulas por mililitro. En determinadas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (c) no es mayor que aproximadamente 10 ± 3 x 10 6 celulas/ml. En determinadas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (c) no es mayor que aproximadamente 7,5 x 10 6 celulas/ml.
En otra realizacion, la composicion que comprende las celulas se prepara mediante un metodo que comprende: (a) centrifugar una pluralidad de celulas, por ejemplo, celulas madre placentarias, para recoger las celulas; (b) resuspender las celulas en dextrano-40 al 5,5%; (c) centrifugar las celulas para recoger las celulas; (d) resuspender las celulas en una solucion de dextrano-40 al 5,5% que comprende HSA al 10%; (e) filtrar las celulas a traves de un filtro de 70 pM; (f) diluir las celulas en dextrano-40 al 5,5%, HSA al 10% y DMSO al 5% a aproximadamente de 1 a 50 x 10 6, de 1 a 40 x 10 6, de 1 a 30 x 10 6, de 1 a 20 x 10 6, de 1 a 15 x 10 6 o de 1 a 10 x 10 6 celulas por
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mililitro; (g) crioconservar las celulas; (h) descongelar las celulas; y (i) diluir las celulas de dextrano-40 al 10%. En determinadas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f)
aproximadamente 15 x 10 celulas por mililitro. En determinadas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f) no es mayor que aproximadamente 10 ± 3 x 10 6 celulas / ml. En determinadas realizaciones, dicha dilucion en la etapa (f)
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no es mayor que aproximadamente 7,5 x 10 6 celulas / ml. En otras realizaciones determinadas, si el numero de celulas es menor que aproximadamente 10 ± 3 x 10 6 celulas por mililitro, la filtracion es opcional.
Se pueden utilizar otras formulaciones inyectables, adecuadas para la administracion de productos celulares.
Las composiciones farmaceuticas utiles en la presente invencion pueden comprender cualquiera de las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, por ejemplo, como se describe en la Seccion 5.2.2 anterior, util en la invencion. En una realizacion, la composicion farmaceutica comprende celulas madre placentarias aisladas que son sustancialmente, o completamente, de origen no materno, es decir, tienen el genotipo fetal; por ejemplo, al menos aproximadamente el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o aproximadamente el 100% son de origen no materno. En determinadas realizaciones, una composicion farmaceutica comprende una poblacion de celulas madre placentarias aisladas que son, CD10+, CD34-, CD105 + y CD200+. En otros ejemplos, las celulas son CD200+y HLA-G-; CD73 +, CD105+ y CD200+; CD200 + y OCT-4 +; o CD73 +, CD105 + y HLA-G-; o una combinacion de lo anterior, en donde al menos el 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de dichas celulas madre placentarias aisladas son de origen no materno. En otra realizacion, una composicion farmaceutica comprende una poblacion de celulas madre placentarias aisladas que son CD10 +, CD105 +, CD200 + y CD34-; CD10 +, CD105 +, CD200 +, CD34 - y al menos una de CD90+ o CD45 -; CD10+, CD90 + , CD105 + , CD200 +, CD34 + y CD45 -; CD10 + , CD90 + , CD105 + , CD200 + , CD34 - y CD45-. En otros ejemplos las celulas son CD200 + y HLA-G -; CD73 +, CD105 + y CD200 +; CD200 + y OCT-4 + ; CD73 + , CD105 + y HLA-G -; una o mas de CD117-, CD133-, KDR-, CD80-, CD86-, HLA-A,B,C+, HLA- DP, DQ, DR- y/o PDL1 +; o una combinacion de lo anterior, en donde al menos el 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de dichas celulas madre placentarias aisladas son de origen no materno. En una realizacion espedfica, la composicion farmaceutica comprende adicionalmente una celula madre que no se obtiene de una placenta.
Las celulas madre placentarias aisladas en las composiciones, por ejemplo, en las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria, pueden comprender celulas madre placentarias obtenidas de un solo donante o de varios donantes. Las celulas madre placentarias aisladas pueden ser completamente compatibles, o parcial o completamente incompatibles, con el HLA de un receptor destinatario.
Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender ademas BM- MSC. En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias y las BM-MSC estan presentes en la composicion farmaceutica en una proporcion, por ejemplo, de 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50 : 50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 o 1: 99 por numero de celulas o entre 99:1 y 95:5, entre 95:5 y 90:10, entre 90:10 y 85:15, entre 85:15 y 80:20, entre 80:20 y 75:25, entre 75:25 y 70: 30, entre 70:30 y 65:35, entre 65:35 y 60:40, entre 60:40 y 55:45, entre 55:45 y 50:50, entre 50:50 y 45:55. entre 45:55 y 40:60, entre 40:60 y 35:65, entre 35:65 y 30:70, entre 30:70 y 25:75, entre 25:75 y 20:80, entre 20:80 y 15:85, entre 10:90 y 5:95, o entre 5:95 y 1:99, por numero de celulas.
5.6.4 Matrices que comprenden celulas madre placentarias aisladas
Ademas, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden matrices, hidrogeles, armazones, y estructuras similares, que comprenden celulas madre placentarias. Dichas composiciones pueden utilizarse en lugar de, o ademas de, celulas en suspension lfquida. En determinadas realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas se combinan con plasma rico en plaquetas. En otras realizaciones, las celulas madre placentarias aisladas se combinan con alginato.
Las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria, pueden sembrarse en una matriz natural, por ejemplo, en un biomaterial placentario tal como un material de membrana amniotica. Dicho material de membrana amniotica puede ser, p. ej., una membrana amniotica disecada directamente de una placenta de mairnfero; una membrana amniotica fijada o tratada termicamente, una membrana amnioticas sustancialmente deshidratada (es decir, con un porcentaje de H20 <20%), una membrana corionica, una membrana corionica sustancialmente deshidratada, una membrana amniotica y corionica substancialmente deshidratada, y similares. En Hariri, Publicacion de solicitud de Estados Unidos N° 2004/0048796 se describen biomateriales placentarios preferidos en los que pueden sembrarse celulas madre placentarias aisladas.
Las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria pueden suspenderse en una solucion de hidrogel adecuada, por ejemplo, para inyeccion. Los hidrogeles adecuados para dichas composiciones incluyen peptidos de autoensamblaje, tales como RAD16. En una realizacion, se puede permitir que una solucion de hidrogel que comprende las celulas se endurezca, por ejemplo en un molde, para formar una matriz que tenga celulas dispersas en su interior para su implantacion. Las celulas madre placentarias aisladas en dicha matriz tambien se pueden cultivar para que las celulas se expandan por mitosis antes de la implantacion. El hidrogel es, por ejemplo, un polfmero organico (natural o sintetico) que se reticula mediante enlaces covalentes, ionicos o de hidrogeno, para crear una estructura reticular tridimensional abierta que atrapa las moleculas de agua para formar un gel. Los materiales formadores de hidrogel incluyen polisacaridos, tales como alginato y sus sales, peptidos, polifosfazinas y poliacrilatos, que estan reticulados ionicamente, o polfmeros en bloque, tales como copolfmeros en bloque de poli(oxido de etileno) y polipropilenglicol que estan reticulados por temperatura o pH, respectivamente. En algunas realizaciones, el hidrogel o la matriz es biodegradable.
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En algunas realizaciones, la formulacion comprende un gel polimerizable in situ (vease, por ejemplo, la Publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos 2002/0022676; Anseth et al., J. Control Release, 78 (1 - 3): 199 - 209 (2002); Wang et al, Biomaterials, 24 (22): 3969-80 (2003).
En algunas realizaciones, los polfmeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas tamponadas, o soluciones acuosas de alcohol, que tienen grupos laterales cargados, o una sal ionica monovalente de los mismos. Son ejemplos de polfmeros que tienen grupos laterales acidos que se pueden hacer reaccionar con cationes los poli(fosfazenos), poli(acidos acnlicos), poli (acidos metacnlicos), los copolfmeros de acido acnlico y acido metacnlico, el poli(acetato de vinilo) y los polfmeros sulfonados, tales como como el poliestireno sulfonado. Tambien se pueden utilizar copolfmeros que tienen grupos laterales acidos formados por reaccion de monomeros o polfmeros de acido acnlico o acido metacnlico y vinil eter. Son ejemplos de grupos acidos los grupos de acido carboxflico, grupos de acido sulfonico, grupos alcoholicos halogenados (preferiblemente fluorados), grupos OH fenolicos y grupos OH acidos.
Las celulas madre placentarias aisladas descritas en esta memoria o cocultivos de las mismas, pueden sembrarse en una estructura o armazon tridimensional e implantarse in vivo. Dicha estructura se puede implantar en combinacion con uno o mas factores de crecimiento, celulas, farmacos u otros componentes que, p. ej., estimulan la formacion de tejido.
Como ejemplos de armazones que se pueden utilizar se incluyen alfombrillas no tejidas, espumas porosas o peptidos autoensamblables. Las alfombrillas no tejidas pueden formarse utilizando fibras que comprenden un copolfmero absorbible sintetico de acidos glicolico y lactico (por ejemplo, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, NJ). Como armazones tambien se pueden utilizar espumas, compuestas, por ejemplo, por copolfmero de poli(g-caprolactona)/ poli(acido glicolico) (PCL / PGA), formado por procesos tales como criodesecacion o liofilizacion (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.355.699).
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas se pueden sembrar sobre un fieltro o ponerse en contacto con el mismo, que puede estar compuesto, por ejemplo, por un hilo de multifilamento fabricado con un material bioabsorbible, tal como copolfmeros de PGA, PLA, PCL o combinaciones, o acido hialuronico.
En otra realizacion, las celulas madre placentarias aisladas proporcionadas en esta memoria pueden sembrarse en armazones de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Dichos armazones de espuma se pueden moldear para adoptar una forma util, tal como una porcion de una estructura espedfica, por ejemplo, un hueso que contiene una lesion. En algunas realizaciones, el armazon se trata, por ejemplo, con acido acetico 0,1 M seguido de incubacion en polilisina, PBS y / o colageno, antes de la inoculacion de las celulas para mejorar la adhesion celular. Las superficies externas de una matriz pueden modificarse para mejorar la adhesion o el crecimiento de las celulas y la diferenciacion de los tejidos, como por recubrimiento de plasma de la matriz o la adicion de una o mas protemas (p. ej., colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glucoprotemas, glucosaminoglucanos (por ejemplo, sulfato de heparina, sulfato de condroitina-4, sulfato de condroitina-6, sulfato de dermatan, sulfato de queratina, etc.) una matriz celular y/u otros materiales tales como, pero sin limitacion, gelatina, alginatos, agar, agarosa, gomas vegetales y similares.
En algunas realizaciones, el armazon comprende, o se trata con, materiales que lo hacen no trombogenico. Estos tratamientos y materiales tambien pueden promover y mantener el crecimiento endotelial, la migracion y la deposicion de la matriz extracelular. Como ejemplos de estos materiales y tratamientos se incluyen, pero sin g/ml limitacion, materiales naturales tales como protemas de la membrana basal, tales como laminina y colageno de tipo IV, materiales sinteticos tales como EPTFE y siliconas de poliuretanourea segmentadas, tales como PURSPAN ™ (The Polymer Technology Group, Inc. , Berkeley, California). El armazon tambien puede comprender agentes antitromboticos tales como heparina; los armazones tambien pueden tratarse para alterar la carga superficial (p. ej., recubriendo con plasma) antes de la siembra con celulas madre placentarias aisladas.
Las celulas madre placentarias proporcionadas en la presente memoria tambien pueden sembrarse sobre un material ceramico fisiologicamente aceptable, o ponerse en contacto con el, que incluye, pero sin limitacion, mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri- y tetra- fosfato de calcio, hidroxiapatita, fluoroapatites, sulfatos de calcio, fluoruros de calcio, oxidos de calcio, carbonatos de calcio, fosfatos de calcio magnesio, vidrio biologicamente activos, tal como BIOGLASS® y mezclas de estos. Materiales ceramicos biocompatibles porosos, actualmente disponibles en el comercio incluyen, SURGIBONE® (CanMedica Corp., Canada), ENDObOn® (Merck Biomaterial France, Francia), CEROS ®(Mathys, AG, Bettlach, Suiza), y productos de injerto oseo de colageno mineralizado, tales como HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) y VITOSS®, RHAKOSS™ y CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). El armazon puede ser una mezcla, una combinacion o un compuesto de materiales naturales y/o sinteticos.
En una realizacion, sobre un armazon adecuado se siembran, o se ponen en contacto con el mismo, de aproximadamente 0,5 x 10 6 a aproximadamente 8 x 10 6 celulas madre placentarias aisladas/ml.
5.7 LfNEAS DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS INMORTALIZADAS
Las celulas madre placentarias utiles en el tratamiento de un cancer relacionado con hueso, en la supresion de la proliferacion de celulas cancerosas relacionadas con hueso o en la supresion de la maduracion de progenitores de
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osteoclastos, pueden inmortalizarse condicionalmente por transfeccion con cualquier vector adecuado que contenga un gen promotor del crecimiento, es decir, un gen que codifique una protema que, en condiciones apropiadas, promueva el crecimiento de la celula transfectada, de tal manera que la produccion y / o la actividad de la protema promotora del crecimiento pueda regularse mediante un factor externo. En una realizacion preferida, el gen promotor del crecimiento es un oncogen tal como, pero sin limitacion, v-myc, N-myc, c-myc, p53, antfgeno T grande del SV40, antigeno T grande del polioma, adenovirus E1a o protema E7 del virus del papiloma humano.
La regulacion externa de la protema promotora del crecimiento se puede realizar colocando el gen promotor del crecimiento bajo el control de un promotor que puede regularse mediante un factor externo, por ejemplo, un promotor cuya actividad se puede controlar, por ejemplo, modificando la temperatura de las celulas transfectadas o la composicion del medio en contacto con las celulas. En una realizacion, se puede emplear un sistema de expresion genica controlado por tetraciclina (tet) (vease Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1518-1523, 1996). En ausencia de tet, un transactivador controlado con tet (tTA) dentro de este vector, activa fuertemente la transcripcion de phowvM, un promotor mmimo del citomegalovirus humano fusionado a secuencias del operador tet. tTA es una protema de fusion del represor (tetR) del operon de resistencia a tet derivado del transposon 10 de Escherichia coli y el dominio acido de VP16 del virus del herpes simple. Concentraciones bajas, no toxicas (por ejemplo, 0,01 -1,0 |ig/ml) de tet, anulan casi por completo la transactivacion por tTA.
En una realizacion, el vector contiene ademas un gen que codifica un marcador de seleccion, por ejemplo, una protema que confiere resistencia a los farmacos. El gen bacteriano que confiere resistencia a la neomicina (neoR) es uno de los marcadores que se puede emplear dentro de los metodos actuales. Las celulas que llevan neoR pueden seleccionarse por medios conocidos por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, la adicion de G418 100200 |jg / ml al medio de crecimiento.
La transfeccion puede realizarse mediante cualquiera de una variedad de medios conocidos por los expertos en la materia, incluyendo pero sin limitacion, infeccion retrovmca. En general, un cultivo celular se puede transfectar por incubacion con una mezcla de medio acondicionado recogido de la lmea celular productora para el vector y DMEM/F12 que contiene complemento de N2. Por ejemplo, un cultivo de celulas madre placentarias preparado como se describe anteriormente, puede infectarse despues, por ejemplo, cinco dfas in vitro por incubacion durante aproximadamente 20 horas en un volumen de medio acondicionado y dos volumenes de dMeM F12 que contiene complemento de N2. Las celulas transfectadas que llevan un marcador de seleccion pueden seleccionarse como se describe anteriormente.
Despues de la transfeccion, las celulas se pasan a una superficie que permite la proliferacion, por ejemplo, permite que al menos el 30% de las celulas se duplique en un penodo de 24 horas. Preferiblemente, el sustrato es un sustrato de polioritina / laminina, que consiste en un plastico de cultivo tisular recubierto con polioritina (10 jg / ml) y / o laminina (10 jg / ml), un sustrato de polilisina / laminina o una superficie tratada con fibronectina. Los cultivos se alimentan cada 3-4 dfas con medio de crecimiento, que puede complementarse o no con uno o mas factores potenciadores de la proliferacion. Los factores potenciadores de la proliferacion pueden anadirse al medio de crecimiento cuando los cultivos alcanzan una confluencia menor de 50%.
Las lmeas de celulas madre placentarias condicionalmente inmortalizadas pueden someterse a pases utilizando tecnicas convencionales, tal como mediante tripsinizacion, cuando alcanzan una confluencia de 80-95%. Hasta aproximadamente el vigesimo pase es, en algunas realizaciones, beneficioso para mantener la seleccion (por ejemplo, por adicion de G418 para las celulas que contienen un gen que confiere resistencia a la neomicina). Las celulas tambien pueden congelarse en nitrogeno lfquido para su almacenamiento prolongado
Las lmeas celulares clonales pueden aislarse de una lmea de celulas madre de placenta humana condicionalmente inmortalizadas preparadas como se describio anteriormente. En general, dichas lmeas celulares clonales se pueden aislar utilizando tecnicas convencionales, tales como por dilucion lfmite o utilizando anillos de clonacion, y se expanden. Las lmeas celulares clonales pueden alimentarse y someterse a pases en general como se describe anteriormente.
Las lmeas de celulas madre placentarias humanas condicionalmente inmortalizadas, que pueden ser, pero no necesariamente, clonales, pueden inducirse generalmente para diferenciarse al suprimir la produccion y / o la actividad de la protema promotora del crecimiento en condiciones de cultivo que facilitan diferenciacion. Por ejemplo, si el gen que codifica la protema promotora del crecimiento esta bajo el control de un promotor regulable mediante un factor externo, las condiciones, por ejemplo, la temperatura o la composicion del medio, pueden modificarse para suprimir la transcripcion del gen promotor del crecimiento. Para el sistema de expresion genica controlado por tetraciclina descrito anteriormente, la diferenciacion puede realizarse mediante la adicion de tetraciclina para suprimir la transcripcion del gen promotor del crecimiento. En general, 1 jg / ml de tetraciclina durante 4-5 dfas es suficiente para iniciar la diferenciacion. Para promover una mayor diferenciacion, se pueden incluir agentes adicionales en el medio de crecimiento.
Las BM-MSC tambien pueden inmortalizarse utilizando cualquiera de los metodos anteriores.
5.8 Kjts
En otro aspecto, en la presente memoria se describen kits, adecuados para el tratamiento de un individuo que tiene un cancer relacionado con hueso, por ejemplo, mieloma multiple o condrosarcoma, o uno de los otros canceres relacionados con hueso enumerados en cualquier otra parte de este documento, que comprende, en un recipiente 5 separado del resto del contenido del kit, celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo tisular, por ejemplo, las celulas madre placentarias aisladas descritas en la Seccion 5.2.2, anterior y / o celulas madre mesenquimatosas de medula osea aisladas, e instrucciones de uso. Preferiblemente, las celulas madre placentarias y / o bM-MSC se proporcionan en una solucion farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, una solucion adecuada para administracion intralesional o una solucion adecuada para administracion intravenosa.
10 Los kits pueden comprender uno o mas componentes que facilitan el suministro de las celulas madre placentarias y / o BM-MSC al individuo. Por ejemplo, el kit comprende componentes que facilitan el suministro intralesional de las celulas al individuo. En dichos casos, el kit puede comprender, por ejemplo, jeringas y agujas, adecuadas para el suministro de las celulas al individuo, y similares. En dichos casos, las celulas madre placentarias pueden estar contenidas en el kit en una bolsa, o en uno o mas viales. En otros casos determinados, el kit comprende 15 componentes que facilitan el suministro intravenoso o intraarterial de las celulas placentarias al individuo. En dichos casos, las celulas madre placentarias pueden estar contenidas, por ejemplo, en un frasco o en una bolsa (por ejemplo, una bolsa de sangre o una bolsa similar, que puede contener una solucion, que contiene las celulas, de hasta aproximadamente 1,5 l).
Ademas, el kit puede comprender uno o mas compuestos que reducen el dolor o la inflamacion en el individuo (por 20 ejemplo, un analgesico, un compuesto antiinflamatorio esteroideo o no esteroideo, o similar). El kit tambien puede comprender un compuesto antibacteriano o antivmco ( ej., uno o mas antibioticos), un compuesto para reducir la ansiedad en el individuo (por ejemplo, alaprazolam), un compuesto que reduce la respuesta inmunitaria en el individuo (p. ej., ciclosporina A), un antihistammico (difenhidramina, loratadina, desloratadina, quetiapina, fexofenadina, cetirizina, prometazina, clorepirenamina, levocetirizina, cimetidina, famotidina, ranitidina, nizatidina, 25 roxatidina, lafutidina, o similares).
Adicionalmente, el kit puede comprender productos desechables, por ejemplo, toallitas esteriles, productos de papel desechables, guantes o similares, que facilitan la preparacion del individuo para el suministro, o que reducen la probabilidad de infeccion en el individuo como resultado de la administracion de las celulas madre placentarias.
6. Ejemplos
30 6.1 EJEMPLO 1: LAS CELULAS MADRE PLACENTARIAS PROMUEVEN LA FORMACION DE HUESO
IN VIVO
Este ejemplo demuestra la capacidad de las celulas madre placentarias aisladas adherentes a plastico de cultivo tisular para promover la formacion de hueso.
Las celulas madre placentarias se obtuvieron de la siguiente manera. En resumen, se obtuvo tejido placentario que 35 media aproximadamente 1 x 2 x 1 cm y se trituro en trozos de aproximadamente 1 mm3. Estos trozos se digirieron con colagenasa IA (2 mg / ml, Sigma) durante 30 minutos, seguido de digestion con tripsina-EDTA (0,25%, GIBCO BRL) durante 10 minutos, a 37 °C en un bano con agua. La solucion resultante se centrifugo a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido por la eliminacion de la solucion de digestion. El sedimento se resuspendio a aproximadamente 10 volumenes con PBS, y se centrifugo a 400 g durante 10 minutos a temperatura 40 ambiente. El sedimento tisular/celular se resuspendio en 130 ml de medio de cultivo, y las celulas se sembraron a 13 ml por matraz T-75 recubierto con fibronectina. Las celulas se incubaron a 37 °C con una atmosfera humidificada con CO2 al 5%. Las celulas utilizadas en los estudios descritos en esta memoria, y en los siguientes Ejemplos, se cultivaron en el pase 6 antes de su uso. Dichas celulas madre placentarias aisladas son generalmente CD34-, CD10+, CD105+y CD200+. El analisis con anticuerpos contra CD44 y CD90 mostro ademas que las celulas eran 45 CD34", CD10+, CD44+, CD90+, CD105+ y CD200+.
Las ratas utilizadas en este estudio teman aproximadamente 6 semanas de vida en el momento del estudio, y se asignaron 16 ratas a cada grupo. Se crearon defectos craneales bilaterales (izquierda y derecha; aproximadamente 3 mm x 5 mm) en 96 ratas macho atfmicas Hsd:RH-Foxnrnu (Charles River, Wilmington, Massachusetts). En resumen, en la zona craneal central entre las orejas se realizo una incision cutanea transversal y se coloco un 50 expansor tisular en la region central del margen rostral de la incision (colgajo cutaneo). El expansor abrio la incision y expuso el craneo. Despues de realizar la incision el periostio se retiro de los huesos parietales. Los lugares de los defectos se marcaron y se utilizo un torno Dremel a velocidad media para esculpir cuidadosamente el margen de ambos defectos, de aproximadamente 3 mm por 5 mm de area, en cada hueso parietal. Los bordes del defecto se comprobaron y se suavizaron cuidadosamente utilizando pinzas si fuese necesario. Una vez limpio y retirado el 55 exceso de lfquido, el defecto se trato por via intralesional, como se describe a continuacion. Despues, se retiro la dermis sobre el craneo y se cerro la incision dermica con sutura.
Los grupos de tratamiento fueron los siguientes. Se reparo un defecto por rata con HEALOS® (matriz biomimetica
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similar a una esponja que comprende colageno reticulado e hidroxiapatita; DuPuy Spine, Inc., Raynham, Massachusetts) sembrado con celulas madre placentarias (5 x 106celulas en 500 |jl), celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea (BM-MSC; obtenidas de aspirado de medula osea reciente (AllCells, Emeryville, California)) (5 x 106 celulas en 500 jl), HEALOS® solo como control negativo, o hEaLOS® complementado con protema morfogenetica osea 2 (BMP-2 ) (5 jg por explante) como control positivo. En otras ratas de control negativo, el defecto no se reparo. El defecto restante en cada rata se reparo utilizando solo HEALOS®.
Tres semanas despues de la implantacion, las ratas que recibieron HEALOS® + BMP-2, HEALOS® + celulas madre placentarias y HEALOS® + BM-MSC mostraron aproximadamente el mismo nivel de curacion, y una curacion significativamente mayor del defecto craneal que las ratas que recibieron solo HEALOS®, o que no recibieron tratamiento de reparacion. Vease la Figura 1.
Por lo tanto, las PDAC tienen la capacidad de promover la curacion de lesiones oseas, un smtoma de progresion del mieloma multiple.
6.2 EJEMPLO 2: LAS CELULAS MADRE PLACENTARIAS SUPRIMEN LA MADURACION DE OSTEOCLASTOS
Este ejemplo demuestra que las celulas madre placentarias adherentes a plastico (PDAC) de cultivo tisular inhiben la maduracion de precursores de osteoclastos. La supresion de precursores de osteoclastos proporcionana un beneficio a los pacientes con mieloma multiple que padecen lesiones oseas (y smtomas acompanantes) causados por la sobreproduccion de osteoclastos inducida por mieloma.
En placas de 24 pocillos, se prepararon precursores de osteoclastos humanos, obtenidos por enriquecimiento de celulas CD14+ de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), utilizando un kit de seleccion positiva a CD14 EASYSEP® Human (N° de cat. 18058) y se cultivaron en medio MEM complementado con factor estimulador de colonias de macrofagos (M-CSF) y Ligando Receptor del Activador del Factor Nuclear kB (RANKL; vease Yaccoby et al, Cancer Research 64 (6): 2016-2023 (2004)). Se cultivaron celulas madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, o celulas madre mesenquimatosas (MSC) fetales, con precursores de osteoclastos en condiciones sin contacto, sembrando las celulas en sistemas TRANSWELL® 1 |im (COSTAR®; CORNING®, Nueva York) (10.000 celulas/TRANSWELL®) y cultivando conjuntamente las celulas madre placentarias o MSC con los precursores de osteoclastos durante 5-6 dfas. Al final del cultivo, los sistemas TRANSWELL® se retiraron y se examinaron los precursores de osteoclastos y/o los osteoclastos para verificar la apoptosis con tincion de anexina V y yoduro de propidio (PI) utilizando un kit de anexina V/PI (Caltag Labs., Burlingame, California). La anexina V se une a la fosfatidilserina, que durante la apoptosis se transporta desde la lamina interna hasta la lamina externa de la membrana plasmatica; las celulas con membranas plasmaticas intactas no admiten el yoduro de propidio. Por lo tanto, las celulas que son positivas para la tincion de anexina pero no para la tincion de PI son celulas apoptoticas tempranas; las celulas que son positivas para la tincion tanto de anexina como de PI son celulas apoptoticas tardfas.
Se descubrio que las celulas madre placentarias indudan significativamente la apoptosis y redudan la viabilidad de los precursores de osteoclastos en comparacion con los controles en los que se cultivaron celulas de mieloma multiples sin celulas madre placentarias, como se muestra mediante un aumento de tincion de anexina V y yoduro de propidio.
Las celulas en los sistemas TRANSWELL® se fijaron con formalina y se tineron para fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP; un marcador de osteoclastos). En cada pocillo se realizo un recuento del numero de osteoclastos multinucleados que expresaban TRAP. Las celulas madre placentarias aisladas como se describe en el Ejemplo 1, inhibieron la diferenciacion de los osteoclastos, como lo indica una disminucion de la tincion de TRAP en cortes histologicos y una disminucion significativa (p <0,05) en el numero de osteoclastos positivos a TRAP (Figura 2).
Por lo tanto, las celulas madre placentarias no solo pueden reparar las lesiones oseas, sino que tambien pueden reducir el numero y la actividad de los osteoclastos que creanan o contribuinan a dichas lesiones.
6.3 EJEMPLO 3: LAS CELULAS MADRE PLACENTARIAS INHIBEN EL CRECIMIENTO DE CELULAS DE MYELOMA MULTIPLE
Este ejemplo demuestra que las celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo tisular (PDAC) tienen la capacidad de suprimir la proliferacion de celulas de mieloma multiple tanto in vitro como in vivo.
6.3.1 Supresion con PDAC de la proliferacion de celulas de mieloma multiple in vitro
Se establecieron lmeas celulares de mieloma multiple humano BN, JB, DNC y HLE (vease Li et ah, Br. J. Haematol. 138 (6): 802-11 (2007)) y ARP1 en el Institute de Investigacion y Terapia de Mieloma en la Universidad de Ciencias Medicas de Arkansas. La lmea celular de mieloma multiple U266 (Nilsson et al., Clin. Exp. Immunol. 7: 477 (1970)) se obtuvo en la coleccion americana de cultivos tipo. Estas lmeas celulares se transfectaron con una construccion lentivirica de luciferasa/GFP mediante metodos establecidos (vease Li et al, citado anteriormente) para facilitar el seguimiento y el analisis del crecimiento tumoral en presencia de celulas madre placentarias en condiciones de contacto entre celulas. Las lmeas celulares BN, JB y DNC son dependientes de estroma. En placas
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de 96 pocillos se cultivaron celulas madre placentarias, MSC fetales (FB-MSC) y MSC generadas a partir de medula osea de pacientes con mieloma multiple (Pt-MSC) a aproximadamente 10.000 celulas/pocillo). Se cultivaron conjuntamente celulas de mieloma multiple (10.000 celulas / pocillo) con celulas madre placentarias o MSC durante una semana en medio RPMI complementado con FBS al 10% y antibioticos. Al final del cultivo, el crecimiento de las celulas de mieloma multiple pudo determinarse midiendo la actividad luciferasa.
Los resultados de este estudio se resumen en la Figura 3, que muestra el factor de crecimiento de celulas de mieloma multiple en presencia de celulas madre placentarias en comparacion con el crecimiento en presencia de FB-MSC y Pt-MSC. El crecimiento de celulas de mieloma multiple en presencia de celulas madre placentarias, vario dependiendo de la lmea celular particular, pero el crecimiento de cada lmea celular fue significativamente menor para lmeas celulares cultivadas conjuntamente con celulas madre placentarias que para lmeas celulares cultivadas conjuntamente con MSC fetales o MSC de paciente con mieloma multiple.
Tambien se indujeron las MSC y las celulas madre placentarias aisladas como se describe en el Ejemplo 1, a diferenciarse en osteoblastos mediante incubacion con DMEM/suero bovino fetal (FBS) al 10% acondicionado con factores de osteogenesis osteoblasticos (por ejemplo, acido ascorbico, beta glicerofosfato y dexametasona) durante aproximadamente 3-3,5 semanas (vease Yaccoby et al, Haematologica 91 (2): 192-199 (2006)). Para ensayar los efectos sobre el crecimiento de las lmeas celulares de mieloma multiple, las placas se lavaron con PBS para eliminar los factores osteoblasticos. El crecimiento de las celulas de mieloma multiple en cocultivo con osteoblastos generados a partir de FB-MSC o Pt-MSC se redujo en comparacion con el crecimiento de celulas de mieloma multiple en cocultivo con FB-MSC o Pt-MSC. La diferenciacion de celulas madre placentarias en osteoblastos no tuvo ningun efecto sobre el crecimiento de lmeas celulares de mieloma multiple, o lo redujo ligeramente, en comparacion con el cocultivo con celulas madre placentarias. El experimento se repitio 3 veces para la mayona de las lmeas celulares.
Para estudiar el posible efecto del contacto entre celulas, las celulas se cultivaron en un sistema en donde se impedfa el contacto entre celulas. En particular, las MSC (FB-MSC o BM-MSC), o celulas madre placentarias aisladas como se describe en el Ejemplo 1, se cultivaron en un sistema TRANSWELL® en el lado posterior de membranas TRANSWELL® de 24 pocillos, mientras que las celulas plasmaticas de mieloma multiple se cultivaron en la camara superior del TRANSWELL®. Vease la Figura 4. Se aislaron celulas primarias de mieloma multiple de 6 pacientes utilizando separacion con perlas inmunomagneticas CD138 y durante 6-10 dfas se cultivaron conjuntamente a 500.000 celulas de mieloma multiple pocillo con MSC o celulas madre placentarias (100.000 celulas/TRANSWELL®). CD138 es un marcador de celulas plasmaticas.
Los efectos de los cocultivos sobre la viabilidad de celulas de mieloma multiple, se determinaron mediante exclusion con azul de tripano y mediante un ensayo con MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). El ensayo con MTT es un ensayo colorimetrico que mide la actividad de enzimas que reducen MTT a formazan, dando lugar a un color purpura. Esta reduccion se produce solo cuando las enzimas reductasas mitocondriales estan activas y, por lo tanto, la conversion se usa a menudo como una medida de celulas viables. En un experimento, las celulas de mieloma multiple tambien se sometieron a analisis de flujo con anexina V/PI, como se describe en el Ejemplo 2 anterior. La supervivencia de las celulas primarias de mieloma multiple se redujo en el co-cultivo TRANSWELL® con celulas madre placentarias en comparacion con la supervivencia en el co-cultivo TRANSWELL® con MSC fetales, para celulas de mieloma de la mayona de los pacientes evaluados. Vease la figura 5.
6.3.2 Supresion de celulas de mieloma multiple con celulas madre placentarias
Proliferacion y aumento de la masa osea in vivo
El vector retrovmco pLEGFP, que contema una secuencia codificante de la Protema Verde Fluorescente Mejorada (EGFP, Enhanced Green Fluorescent Protein) (Clontech, Palo Alto, California, EE. UU.) se utilizo para transfectar transitoriamente la lmea celular de empaquetamiento Phoenix Eco (ecotrofica) utilizando SuperFect (QIAGEN Inc., Valencia, California, EE. UU.). La EGFP es una variante de la protema fluorescente verde de Aequorea victoria de tipo silvestre que cambia a color rojo, que se ha optimizado para una fluorescencia mas brillante y una expresion mas alta en celulas de mairnfero. Los sobrenadantes que conteman partmulas retrovmcas se recogieron 24-48 horas despues de la transfeccion. Para facilitar el seguimiento, las celulas madre placentarias se infectaron con las partmulas retrovmcas en presencia de polibreno 8 pg/ml durante 12 horas, momento en el cual los medios se reemplazaron por medio de cultivo reciente. En algunos experimentos, las celulas se expusieron a los sobrenadantes que conteman las partmulas retrovmcas una vez mas antes de seleccionarse cultivandolas en presencia de 200-400 pg/ml de G418 durante 2-3 semanas.
Como alternativa al uso de tejido oseo humano en un modelo SCID-hu de mieloma primario humano, se utilizo un sistema en donde se implantaron huesos de conejo en ratones SCID (ratones SCID-rab), seguido de la introduccion de celulas de mieloma directamente en el hueso implantado. Se construyeron ratones SCID-rab mielomatosos como se describio anteriormente. Vease Yata, K. y Yaccoby, S. et al., Leukemia 2004; 18: 1891-1897. Se obtuvieron ratones CB.17/Icr-SCID (de 6 a 8 semanas de vida) de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN, EE. UU.) y conejos prenados de Nueva Zelanda de Myrtle Rabbitry (Thompson Station, TN, EE. UU.). Los conejos de 3 - 4 semanas de vida fueron profundamente anestesiados con una dosis alta de pentobarbital sodico y se sacrificaron por dislocacion
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cervical. El femur y la tibia del conejo se cortaron en dos trozos, con los extremos proximal y distal cerrados, mientras que las vertebras se cortaron en pequenos fragmentos (1 x 2 cm2).
Para la implantacion de los huesos, el lado derecho o izquierdo del raton SCID se lavo con alcohol y se seco con una gasa esteril. El hueso del conejo se inserto por v^a subcutanea a traves de una pequena incision (5 mm). Despues, la incision se cerro con grapas quirurgicas esteriles y se permitio el injerto de los huesos durante 6-8 semanas. En algunos ratones experimentales, se implantaron dos huesos simultaneamente a cada lado en el mismo raton. Para cada experimento, se inyectaron 10 - 50 x 106celulas de medula osea de mieloma procedentes de pacientes humanos no separadas que conteman 17 +/- 8% de celulas plasmaticas (PC) o 3,3 +/-1,6 x 10 6 PC en 50 |jl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) directamente en el hueso de conejo implantado. Se utilizaron al menos dos ratones para cada experimento. Para medir los cambios producidos en los niveles de inmunoglobulina (Ig) humana circulante del isotipo protema M, periodicamente se extrajo sangre de la vena de la cola de los ratones.
El establecimiento del crecimiento del mieloma se demostro mediante niveles incrementados de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en sueros de raton, tal como se observo mediante ensayo ELISA, y mediante evaluacion radiografica de lesiones oseas ltticas. Antes de la transformacion se recogieron 5x105 celulas madre placentarias que expresaban EGFP, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, utilizando tripsina-EDTA y se resuspendieron en 50 jl de PBS. Las celulas madre placentarias se inyectaron directamente en los huesos implantados en los ratones SCID-rab. Los experimentos continuaron durante 8-16 semanas despues de la inyeccion. Los cambios en la densidad mineral osea (BMD, Bone Mineral Density) de los huesos implantados se determinaron utilizando un densitometro PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, WI). El efecto de las celulas madre placentarias sobre la proliferacion de celulas de mieloma multiple se determino rastreando los niveles de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en sueros de raton, tal como se observo mediante ensayo ELISA.
Se descubrio que las celulas de mieloma multiple de un paciente (denominado Paciente 1) crecfan en ratones SCID- rab/SCID-hu, y podfan pasarse a ratones SCID-rab/SCID-hu recien creados; sin embargo, no fueron capaces de crecer de manera independiente o en la capa del estroma in vitro. A seis ratones SCID-rab, injertados satisfactoriamente con las celulas de mieloma multiple, se les administro celulas madre placentarias transfectadas por via intralesional, y a seis se les administro un control (solucion salina tamponada con fosfato).
Se descubrio que el crecimiento de celulas de mieloma multiple se inhibia significativamente despues de dos y cuatro semanas de inyeccion de celulas madre placentarias, pero no de PBS, mediante deteccion de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en sueros de los ratones, como se observo mediante ensayo ELISA (p<0,007; Figura 6). El analisis de bioluminiscencia en animales vivos detecto celulas madre placentarias que expresan luciferasa en estos ratones; la intensidad de la bioluminiscencia a los 14 dfas se redujo en todos los ratones a los que se les administro celulas madre placentarias (Tabla 1 B). Ademas, los rayos X tomados antes de la administracion de celulas madre placentarias y 4 semanas despues del tratamiento revelaron un aumento de la masa osea despues de la inyeccion de celulas madre placentarias en huesos mielomatosos, aunque la masa osea disminuyo en los huesos tratados con PBS como control (Figura 7).
Tabla 1B: Resultados de ensayos de bioluminiscencia en animales vivos - numero de recuentos por animal.
Raton
1 2 3 4 5
3 dfas
5,20 x 106 6,50 x 105 8,3 x 106 2,30 x 10' 3,30 x 106
14 dfas
2,68 x 104 ND 2,80 x 105 1,10 x 106 2,00 x 104
Para ensayar el efecto de las celulas madre placentarias sobre la densidad de masa osea de hueso no mielomatoso, celulas madre placentarias (1 x 10 6 celulas / raton) o vehfculo se inyectaron directamente en los huesos no mielomatosos implantados en ratones SCID-rab. La inyeccion de las celulas madre placentarias, pero no del vetuculo, dio como resultado un notable aumento de la BMD del hueso implantado desde niveles de pretratamiento. Estos datos indican que la inyeccion directa de celulas madre placentarias en hueso mielomatoso o no mielomatoso da lugar a un aumento de la masa osea local y que el aumento de la formacion de hueso por las celulas madre placentarias se asociaba a una carga de mieloma reducida.
A continuacion, utilizamos celulas de mieloma de un segundo paciente, denominado Paciente 2, que se clasificaban molecularmente como un subtipo MMSET de alto riesgo (asociado a mieloma multiple agresivo y a un mal pronostico) y que expresaban un nivel moderado de DKK1. Las celulas de mieloma del paciente 2 no crecieron en cultivo, pero se pasaron con exito en el modelo SCID-rab descrito anteriormente. El tratamiento se inicio cuando el crecimiento del mieloma estaba bien establecido y las lesiones osteoltticas eran evidentes. Las celulas madre placentarias se inyectaron por via intralesional en el hueso implantado (0,1 a 1 x 106 celulas madre placentarias / hueso, 7 huespedes / grupo) o por via subcutanea, utilizando un transportador de hidrogel HyStem-C (5 x
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10 6 celulas madre placentarias / raton, 6 ratones). Analizada 4 semanas despues del tratamiento, la inyeccion intralesional de 0,5 y 1 x 10 6 celulas madre placentarias dieron como resultado un aumento de la BMD de los huesos implantados a partir de niveles de pretratamiento (p<0,01) o la prevencion de la perdida de hueso en comparacion con el grupo control (p <0,02) (Figura 8). El aumento de la masa osea mediante inyeccion de 1 x 10 6 celulas madre placentarias se asocio adicionalmente a un crecimiento reducido del mieloma a un nivel casi significativo (p <0,08, Figura 9).
Tambien se comparo el efecto de las celulas madre placentarias y las MSC fetales humanas en la enfermedad osea del mieloma y el crecimiento tumoral. Las celulas se inyectaron (1 x 10 6 celulas / raton) directamente en los huesos implantados de ratones SCID-rab injertados con celulas de mieloma del paciente 2 (7 hospedadores / grupo). El tratamiento con celulas madre placentarias y MSC dio como resultado un aumento de la BMD del hueso implantado en comparacion con el nivel de pretratamiento, sin embargo, el efecto de las celulas madre placentarias fue mas intenso (Figura 10). El tratamiento tanto con celulas madre placentarias como con MSC inhibio significativamente el crecimiento de celulas de mieloma del paciente n. ° 2 en el modelo SCID-rab (Figura 11). Estos resultados sugieren que, si bien tanto las MSC como las celulas madre placentarias son eficaces aumentando la BMD de huesos afectados por mieloma, las celulas madre placentarias tienen un mayor potencial anabolico oseo que las MSC fetales.
Por lo tanto, este ejemplo demuestra que las celulas madre placentarias pueden reducir significativamente la viabilidad de celulas de mieloma multiple, particularmente cuando se administran por via intralesional en individuos mielomatosos. Las celulas madre placentarias tambien reducen la viabilidad de celulas de mieloma multiple in vitro en condiciones que permiten el contacto entre celulas, y en condiciones que impiden el contacto entre celulas. Junto con la capacidad de las celulas madre placentarias para reparar el hueso, p. ej., lesiones oseas que son sintomaticas de mieloma multiple, e inhibir la maduracion de los osteoclastos, una de las principales causas del desarrollo de lesiones oseas relacionadas con el mieloma multiple, estos resultados indican que las celulas madre placentarias pueden ser un tratamiento terapeutico util contra el mieloma multiple.
6.4 EJEMPLO 4: LAS CELULAS MADRE PLACENTARIAS PROMUEVEN LA DETENCION DEL CICLO CELULAR DEL MIELOMA MULTIPLE
Este Ejemplo demuestra que las celulas madre placentarias adherentes a plastico de cultivo tisular (PDAC) suprimen el crecimiento de celulas de mieloma multiple.
6.4.1 Las celulas madre placentarias suprimen la proliferacion de celulas de mieloma multiple
Para estudiar el efecto de las celulas madre placentarias SOBRE el crecimiento de celulas de mieloma multiple, las celulas madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, se cocultivaron con 6 lmeas celulares de mieloma multiple (MMCL), denominadas U-266 (American Type Culture Collection (ATCC) N° de Catalogo TIB-196), RPMI-8226 (ATCC N° de Catalogo CCL-155), L-363 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) N° de catalogo ACC49), H929 (Gazdar, Blood 67: 1542-1549 (1986)), LP-1 (DSMZ N° de Catalogo ACC41) y OpM-2 (DSMZ N° de Catalogo ACC -50). Las cuatro lmeas celulares de mieloma multiple seleccionadas para estos experimentos representan la heterogeneidad de las celulas de mieloma multiple, como se aprecia por diferencias en la produccion de inmunoglobulinas (vease la Tabla 2) y las diferencias en la expresion del marcador celular (veanse las Tablas 3A-3C).
Tabla 2: Produccion de tipos de inmunoglobulina por lmeas celulares de mieloma multiple.
Lmea celular
IgA IgG Cadena Kappa Cadena Lambda
H-929
0,0 0,1 98,9 0,9
OPM-2
0,6 0,1 3,5 97,3
RPMI-8226
0,0 0,0 0,9 85,8
U266
0,0 0,1 1,2 99,5
Tablas 3A-3C: marcadores celulares expresados por lmeas celulares de mieloma multiple (expresados como porcentaje de celulas que expresan un marcador).
Tabla 3A.
Muestra
CD38+ CD56+ CD19+ CD45+ CD11b+ CD40+ CD138+
H929
97,7 98,6 0,74 2,3 7,56 0,18 72,9
OPM-2
13,2 21,2 0,062 0,21 56,9 0,14 7,33
RPMI- 8226
96,7 64,4 0,093 0,3 29,4 18,3 16,7
U266
4,39 3,39 0,64 91,5 2,51 0,84 16,6
Tabla 3B.
Lmea celular
CD58+ CXCR4 (CD184)+ CD44+ CD49e (VLA5)+ CD117+ CD20+
H929
99,8 0,65 99,7 51,1 27,1 0,54
OPM-2
29 8,14 21,2 0,35 0,53 0,31
RPMI- 8226
95,8 4,2 6,48 67,6 7,73 0,057
U266
100 83,5 48,3 0,55 0,28 1,21
5 Tabla 3C.
Lmea celular
CD33+ CD54+ CD28+ CD49d (VLA4)+ CD106+ CD11a+
H929
0,76 99,2 95,3 99,6 0,2 12,4
OPM-2
0,2 1,01 2,44 0,059 0,2 0,1
RPMI-
26,2 99,9 99,7 2,75 6,39 46,5
8226
U266
6,83 100 99,9 99,5 0,58 5,77
Celulas madre placentarias de pase 6, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, se descongelaron con DMEM + suero bovino fetal (FCS, fetal calf serum) al 10%. En cada pocillo de placas de 24 pocillos, se sembraron 5 x 104 celulas madre placentarias. Despues de que las celulas madre placentarias crecieron hasta la confluencia, con 10 un cambio de medio de una sola vez, en cada pocillo se sembraron 5 x 10 4 celulas MMCL en la parte superior de las celulas madre placentarias y se incubaron durante 4-5 dfas a una temperatura de 37 °C con CO2 al 5%. Las celulas MMCL se recogieron los dfas 1, 2 y 5 del cultivo para su posterior analisis. Utilizando el sistema EASYCOUNT™ (Immunicon) se efectuo el recuento de las celulas.
Los resultados indicaron que las celulas madre placentarias alcanzaron una inhibicion significativa del crecimiento de 15 las lmeas celulares de mieloma multiple U266 (p <0,001 el dfa 5 de cocultivo), RPMI-8226 (p <0,03 el dfa 5 del cocultivo), H929 (p <0,003 el dfa 4 del cocultivo) y OPM-2 (p <0,01 el dfa 5 del cocultivo), en comparacion con estas celulas de mieloma multiple cultivadas solas. Vease la Figura 12. En experimentos distintos, el cocultivo de celulas L-363 con celulas madre placentarias dio como resultado una inhibicion sustancial del crecimiento (p <0,06 el dfa 5 del cocultivo) y el cocultivo de celulas LP-1 con celulas madre placentarias tambien dio como resultado la inhibicion 20 del crecimiento.
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6.4.2 Las celulas madre placentarias regulan negativamente la expresion de celulas de mieloma multiple de genes que codifican protemas que desempenan funciones clave en la senalizacion de NF-kB y en la activacion de linfocitos B
Para caracterizar adicionalmente la inhibicion del crecimiento de las celulas madre placentarias sobre las lmeas celulares de mieloma multiple, las celulas madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, se cocultivaron con celulas U-266, RPMI-8226, OPM-2 y H929 durante 4 dfas, despues, con una pipeta, se recogieron cuidadosamente celulas de mieloma multiple cocultivadas con celulas madre placentarias, o celulas de mieloma multiple cultivadas solas, sin alterar las celulas madre placentarias seguido de preparacion de ARN y analisis por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). La qRT-PCR se realizo utilizando tarjetas microflmdicas de 384 pocillos (TAQMAN® Custom Array, Applied Biosystems), que permiten realizar reacciones simultaneas de PCR en tiempo real. Las tarjetas conteman 300 genes involucrados en la regulacion del ciclo celular, el crecimiento y la proliferacion celular y la respuesta inmunitaria hormonal, incluidos los genes involucrados en la senalizacion de celulas B y en la senalizacion de NF-kB. La qRT-PCR se realizo utilizando el sistema de PCR en tiempo real 7900HT Fast (Applied Biosystems), y los datos se analizaron utilizando el programa informatico REALTIME STATMINER®.
El cocultivo con las celulas madre placentarias regulo negativamente, de manera significativa, genes que codificaban los componentes clave de la activacion de linfocitos B, incluidos TRAF1 (factor 1 asociado al receptor de TNF), TRAF6, y genes que codificaban componentes clave de la ruta de senalizacion de NF-kB, incluyendo TIRAP (Toll- Interleukin 1 Receptor TIR domain containing Adaptor Protein, protema adaptadora que contiene dominio TIR Receptor de Toll-Interleucina 1); p65/RelA y RelB. Vease mas adelante la tabla 4.
La protema DKK1, una protema producida por celulas de mieloma multiple, inhibe la actividad de osteoblastos y propicia el equilibrio entre osteoblastos y osteoclastos a favor de la reabsorcion osea. Despues del cocultivo con celulas madre placentarias, como se indico anteriormente, la expresion de DKK1 en celulas OPM-2 tambien se regulo negativamente. Vease la Tabla 4.
Tabla 4. Factor de cambio de la expresion genica en celulas OPM-2 cocultivadas con celulas madre placentarias en comparacion solo con OPM-2. Se calculo la desviacion tfpica de las medias del factor de cambio de 2 repeticiones.
Gen
Factor de cambio DESVTIP
DKK1
0,34 0,09
RELA
0,72 0,03
RELB
0,27 0,08
TIRAP
0,49 0,05
TRAF1
0,44 0,07
TRAF6
0,50 0,12
DESVTIP: Desviacion Tfpica
6.4.3 Las celulas madre placentarias regulan negativamente la expresion de celulas de mieloma multiple de genes que codifican Ciclinas y CDK, y regulan positivamente genes que codificacion inhibidores de CDK
Se analizo el efecto de las celulas madre placentarias (PDAC), aisladas como se describe en el Ejemplo 1, sobre la expresion de ciclinas (CCN) y quinasas dependientes de ciclina (CDK) mediante qRT-PCR utilizando tarjetas microflmdicas de 384 pocillos que conteman genes involucrados en la regulacion del ciclo celular, como se describio anteriormente, y se analizaron utilizando Ingenuity Pathways Analysis (INGENUITY® Systems,
www.ingenuity.com). Se descubrio que las celulas madre placentarias disminman la expresion en las lmeas celulares de mieloma multiple de los genes que codificaban determinadas CCN y CDK, y que aumentaban la expresion de genes para determinados inhibidores de CDK de una manera espedfica del tipo celular. Por ejemplo, en la lmea celular de mieloma multiple OPM-2, las CDK CDK3, CDK5 y CDK7 estaban reguladas negativamente; en las lmeas celulares de mieloma multiple RPMI-8226 y U-266, la CDK4 estaba regulada negativamente. Por el contrario, en la lmea celular de mieloma multiple OPM-2, los inhibidores de CDK, p16 y p19, y el inhibidor de CDK3 estaban regulados positivamente; en la lmea celular de mieloma multiple RPMI-8226, el inhibidor de CDK, p19 estaba regulado positivamente; en la lmea celular de mieloma multiple U266, p21 estaba regulado positivamente; y en la lmea celular de mieloma multiple H929, p19, p21 y p27 estaban regulados positivamente.
A continuacion, en las Tablas 5A-5D, se presenta un resumen de los cambios en la expresion de genes relacionados con el ciclo celular.
Tablas 5A-5D. Factor de cambio de expresion genica en celulas de mieloma multiple cocultivadas con celulas madre placentarias, en comparacion con celulas de mieloma multiple solo, para lmeas celulares de mieloma multiple OPM-
Tabla 5A OPM-2
Factor de cambio DESVTIP
CCNB3
0,39 0,07
CCNC
0,63 0,02
CCND1
0,01 0,00
CDK3
0,82 0,05
CDK5
0,82 0,00
CDK7
0,73 0,05
CDKN2A(p16)
1,55 0,26
CDKN2D (p19)
1,61 0,25
CDKN3
4,41 0,27
Tabla 5B U-266
Factor de cambio DESVTIP
CCNB1
0,16 0,01
CCNB2
0,16 0,03
CCND1
0,23 0,01
CCND2
0,08 0,00
CDK4
0,38 0,01
CDKNIA (p21)
1,45 0,14
E2F3
0,80 0,02
E2F4
0,44 0,00
E2F5
0,30 0,00
E2F6
0,22 0,00
5
Tabla 5C RPMI-8226
Factor de cambio DESVTIP
CCNB1
0,61 0,03
CCNB2
0,82 0,14
CCND1
0,64 0,06
CCND2
0,68 0,05
CDK2AP1
0,56 0,02
CDK4
0,56 0,03
CDKN2D(p19)
1,41 0,13
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15
20
25
Factor de cambio DESVTIP
E2F3
0,67 0,02
E2F4
0,75 0,10
E2F5
0,52 0,02
E2F6
0,63 0,07
Tabla 5D H929
Factor de cambio DESVTIP
CCNB1
0,52 0,03
CCNB2
0,71 0,07
CCNB3
0,54 0,37
CCNC
0,64 0,02
CDK10
0,40 0,00
CDK3
0,84 0,06
CDK5
0,83 0,09
CDK9
0,82 0,03
CDKN1A (p21)
3,71 0,99
CDKN1B (p27)
1,12 0,18
CDKN2D (p19)
1,18 0,08
Se descubrio que las celulas madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, tambien disminuyeron la expresion en lmeas celulares de mieloma multiple de genes que codificaban los miembros 3, 4, 5 y 6 de la familia de E2F (protemas que desempenan un papel importante en la transicion de la fase Gi a la S) y Rb fosforilada (protema del Retinoblastoma). Este hallazgo es significativo porque en el estado hipofosforilado, la protema Rb actua como supresor tumoral al inhibir los factores de la familia de E2F; sin embargo, la Rb fosforilada, apenas tiene funcion inhibidora en la progresion del ciclo celular.
Para investigar mas a fondo el efecto de las celulas madre placentarias sobre la proliferacion de celulas de mieloma multiple, se analizo el estado de fosforilacion de la protema del Retinoblastoma (Rb) mediante citometna de flujo utilizando el anticuerpo monoclonal J146-35 (BD Pharmingen, n° de cat. 558549) y el anticuerpo monoclonal J112- 906 (n° de cat. 558549, BD). El anticuerpo J146-35 reconoce la Rb fosforilada en la serina 780 (pS780), que afecta a la union de Rb con E2F, y el anticuerpo J112-906 reconoce la Rb fosforilada en las serinas 807 y 811 (pS807/pS811), que regula la union de c-Abl y la progresion del ciclo celular. H929, LP1 y OPM2 cocultivadas con las celulas madre placentarias mostraron disminucion de la fosforilacion de Rb en pS780 y en pS807/pS811, en relacion con las celulas cultivadas solas. Veanse las Figuras 13A-13C.
El efecto de las celulas madre placentarias sobre la proliferacion de lmeas celulares de mieloma multiple se ensayo adicionalmente utilizando los colorantes fluorescentes BrdU y 7-AAD utilizando un kit de flujo BrdU de APC (n° de catalogo 552598, BD biociencias). El co-cultivo con las celulas madre placentarias dio como resultado un porcentaje aumentado de celulas de mieloma multiple en fase G0/G1, y un porcentaje disminuido de dichas celulas en fase S, para las lmeas celulares RPMI-8226, OpM-2 y U266, en comparacion con las celulas de mieloma multiple cultivadas solas. Vease la tabla 6.
Tabla 6: Analisis celular de cocultivo de celulas madre placentarias: MMCL
5
10
15
20
25
G0/G1 Fase S
H929
63,5 27,0
H929 + Celulas madre placentarias
53,9 28,9
RPMI-8226
45,3 11,6
RPMI-8226 + Celulas madre placentarias
64,9 9,9
OPM2
49,2 42,8
OPM2 + Celulas madre placentarias
78,4 11,5
U266
43,0 19,2
U266 + Celulas madre placentarias
65,9 9,3
Las celulas de mieloma multiple secretan niveles aberrantemente elevados de inmunoglobulinas. Para estudiar el efecto de las celulas madre placentarias sobre la produccion de inmunoglobulina por lmeas celulares de mieloma multiple, mediante citometna de flujo se analizo la produccion de inmunoglobulina intracelular o superficial mediante MMCL cocultivadas con las celulas madre placentarias, o MMCL cultivadas solas. Se observo una disminucion de la produccion de inmunoglobulina en las lmeas celulares de mieloma multiple H929, OPM2 y LP1 cuando se cultivaron conjuntamente con las celulas madre placentarias en comparacion con las celulas de mieloma multiple cultivadas solas. Por ejemplo, las celulas H929 cocultivadas mostraron una disminucion de la produccion de inmunoglobulina Kappa (k); las celulas OPM2 cocultivadas mostraron una disminucion de la produccion de inmunoglobulina Lambda (X); y las celulas LP1 cocultivadas mostraron una disminucion de la produccion de inmunoglobulina Kappa intracelular y de la inmunoglobulina Lambda e IgG intracelular y superficial, en comparacion con las celulas cuando se cultivaron solas. Vease la tabla 7.
Tabla 7. Cambio de media geometrica de produccion de Ig en un sistema de cocultivo de celulas madre placentarias: MMCL
Lmea celular
ig Localizacion Dfa 1 Dfa 2 Dfa 4
H929
Kappa - N/A -81,0 %
OPM2
Lambda - -4,2 % -52,2 %
LP1
Lambda superficie -9,6 % -17,9% -48,7 %
Lambda
intracelular -31,6 % -16,5 % -13,5 %
LP1
IgG superficie -7,3% -10,0 % -36,4 %
IgG
intracelular -20,0 % -21,3 % -13,7 %
LP1
Kappa intracelular -15,1 % -11,4 % -13,4 %
Ig: tipo de inmunoglobulina
Los resultados anteriores que demuestran que las celulas madre placentarias reducen la proliferacion de celulas de mieloma multiple, no se debieron a un efecto general del cocultivo de celulas madre placentarias con otros tipos de celulas, sino que eran espedficos de celulas de mieloma multiple. Por ejemplo, se descubrio que las celulas madre placentarias aumentaban la expansion de celulas hematopoyeticas CD34 + cuando se cultivaban conjuntamente a tres proporciones diferentes (10:1, 1:1 y 1:10) durante 7 dfas.
Por lo tanto, los estudios anteriores demuestran que cuando las celulas madre placentarias se cocultivan con lmeas celulares de mieloma multiple, reducen la tasa de crecimiento de las celulas de mieloma multiple, regulan negativamente la expresion de genes de lmeas celulares de mieloma multiple que codifican protemas del ciclo celular necesarias para la progresion a traves del ciclo celular, y regulan positivamente genes que codifican inhibidores de la progresion del ciclo celular. Como tales, las celulas madre placentarias senan utiles en la reduccion de la proliferacion de celulas de mieloma multiple in vivo.
5
10
15
20
25
30
35
6.5 EJEMPLO 5: USO DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS PARA SUPRIMIR EL CRECIMIENTO DE CELULAS DE CONDROSARCOMA
Este ejemplo demuestra que las celulas madre placentarias (PDAC) suprimen la proliferacion de celulas de condrosarcoma en cultivo.
Cultivo en TRANSWELL®: para examinar los efectos de las celulas madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, sobre el crecimiento de celulas tumorales en un sistema de co-cultivo TRANSWELL®, se sembraron 1 x 104o 5 x 104PDAC en el camara inferior del sistema TRANSWELL® en 600 pl de medio de crecimiento y se sembraron 1 x 104 celulas de condrosarcoma (ATCC® No. CRL-7891; 400 pl en medio de crecimiento) en la camara superior del TRANS WELLs® (3 pm de diametro). Las celulas de condrosarcoma se cultivaron solas sin celulas madre placentarias como control. Todos los cocultivos del TRANSWELL® se colocaron en placas de 24 pocillos, y cada condicion se configuro por triplicado. Despues de 7 dfas de cultivo en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y con CO2 al 5%, las celulas de condrosarcoma, que estaban en la camara superior, se examinaron utilizando un microscopio Leica.
El condrosarcoma es un cancer caracterizado por la produccion de una matriz cartilaginosa alrededor de las celulas tumorales. De acuerdo con esta sintomatologfa, en el experimento realizado en TRANSWELL®, las celulas de condrosarcoma crecieron como agregados diferenciados, claramente visibles al microscopio, en ausencia de celulas madre placentarias. En presencia de celulas madre placentarias, ensayadas ambas proporciones, se apreciaban menos celulas de condrosarcoma, y las celulas se caracterizaron por una ausencia completa de agregados celulares que caracterizaron el crecimiento solo de las celulas tumorales. Como tales, las celulas madre placentarias inhibieron claramente el crecimiento de las celulas de condrosarcoma.
6.6 EJEMPLO 6: INHIBICION DE LA OSTEOCLASTOGENESIS UTILIZANDO LENALIDOMIDA
Este ejemplo demuestra que la lenalidomida de molecula pequena (comercializada con el nombre REVLIMID®; 3-(4- amino-1-oxo 1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il) piperidin-2,6-diona) se puede utilizar para suprimir la osteoclastogenesis.
La lenalidomida tiene un intenso efecto antiosteoclastogenico a concentraciones de aproximadamente 1 pM, generando una fuerte disminucion en el numero de osteoclastos formados (Figura 14). Cuando precursores de osteoclastos cultivados con las celulas madre placentarias, aisladas como se indica en el Ejemplo 1, y lenalidomida 0,1 pM o 1 pM, se compararon con osteoclastos cultivados con celulas madre placentarias o con celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea (BM-MSC), se descubrio que la lenalidomida disminma adicionalmente el numero de osteoclastos que se diferenciaban de los precursores de osteoclastos. Figura 15. Por lo tanto, hay un posible efecto antiosteoclastogenico sinergico o aditivo de las PDAC y la lenalidomida a una concentracion de entre aproximadamente 0,1 pM y 1 pM.
Por lo tanto, tanto la lenalidomida sola como la lenalidomida en combinacion con celulas madre placentarias, son eficaces para reducir el numero de precursores de osteoclastos y, por lo tanto, deben ser terapeuticos para reducir el numero y/o la gravedad de lesiones oseas asociadas a un cancer relacionado con hueso, tal como mieloma multiple.

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
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    25
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    45
    1. Celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para la supresion de la proliferacion de celulas de un cancer relacionado con hueso en un individuo humano, en donde el metodo consiste en poner en contacto dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, con una pluralidad de celulas madre placentarias, durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias supriman la proliferacion de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso, en comparacion con una pluralidad de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso que no se han puesto en contacto con celulas madre placentarias,
    en donde dichas celulas de un cancer relacionado con hueso son celulas de condrosarcoma, celulas de cancer de hueso, celulas de neuroblastoma, celulas de osteosarcoma, celulas de sarcoma de Ewing, celulas de cordoma, celulas de un histiocitoma fibroso maligno de hueso, o celulas de un fibrosarcoma de hueso,
    en donde dichas celulas madre placentarias son adherentes a plastico de cultivo tisular, son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo, y no son trofoblastos, citotrofoblastos o celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea.
  2. 2. Las celulas madre placentarias aisladas para el uso de la reivindicacion 1, en donde dichas placentarias son
    CD34-, CD45-, CD10+, CD90+, CD105+ y CD200+; o
    CD34-, CD45-, CD10+, CD80-, CD86-, CD90-, CD105+ y CD200+,
    como puede detectarse por citometna de flujo.
  3. 3. Las celulas madre placentarias aisladas para el uso de la reivindicacion 1, en donde dicha puesta en contacto comprende la administracion de al menos 1 x 108 de dichas celulas madre placentarias a dicho individuo humano.
  4. 4. Las celulas madre placentarias aisladas para el uso de la reivindicacion 1, en donde dicha puesta en contacto comprende la administracion de dichas celulas madre placentarias a dicho individuo humano en, o adyacente a, una lesion osea causada por dicho cancer relacionado con hueso.
  5. 5. Las celulas madre placentarias aisladas para el uso de la reivindicacion 1, en donde dichas celulas placentarias suprimen al menos un 50 % la proliferacion de dichas celulas de un cancer relacionado con hueso en comparacion con la proliferacion de un numero equivalente de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en ausencia de dichas celulas placentarias.
  6. 6. Celulas madre placentarias aisladas para su uso en un metodo para el tratamiento de un individuo humano que tiene un cancer relacionado con hueso, en donde el metodo consiste en la administracion a dicho individuo de una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre placentarias durante un tiempo suficiente para que dichas celulas madre placentarias mejoren uno o mas smtomas de, o reduzcan la progresion de, dicho cancer relacionado con hueso,
    en donde dicho cancer relacionado con hueso es condrosarcoma, cancer de hueso, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso o fibrosarcoma de hueso,
    en donde dichas celulas madre placentarias son adherentes a plastico de cultivo tisular, son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, como puede detectarse por citometna de flujo, no son trofoblastos, citotrofoblastos o celulas madre mesenquimatosas derivadas de medula osea, y tienen la capacidad de diferenciarse en celulas osteogenicas o condrogenicas.
  7. 7. Las celulas madre placentarias aisladas para el uso de la reivindicacion 6, en donde dichas celulas madre placentarias son
    CD34-, CD45-, CD10+, CD90+, CD105+ y CD200+; o
    CD34-, CD45-, CD10+, CD80-, CD86-, CD90+, CD105+ y CD200+,
    como puede detectarse por citometna de flujo.
  8. 8. Las celulas madre placentarias aisladas para el uso de la reivindicacion 6, en donde dichas celulas madre placentarias se administran a dicho individuo humano por via intravenosa, o en, o adyacente a, una lesion osea causada por dicho cancer relacionado con hueso.
  9. 9. Las celulas madre placentarias aisladas para el uso de la reivindicacion 8, que comprende la administracion de al menos 1 x 108 celulas placentarias a dicho individuo humano.
  10. 10. Las celulas madre placentarias aisladas para el uso de la reivindicacion 8, en donde dichas celulas placentarias suprimen al menos un 50 % la proliferacion de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en comparacion con la proliferacion de un numero equivalente de celulas de dicho cancer relacionado con hueso en ausencia de dichas celulas placentarias.
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