KR20090076989A

KR20090076989A - 태반 줄기세포군으로 뼈의 결함을 치료하기 위한 방법과 조성물

Info

Publication number: KR20090076989A
Application number: KR1020097010688A
Authority: KR
Inventors: 제임스 더블유. 에딘져; 로버트 제이. 하리리; 지아-룬 왕; 퀴안 예; 크리스텐 에스. 라바조; 마리안 페레이라; 사스차 다운 애브람손
Original assignee: 안트로제네시스 코포레이션
Priority date: 2006-10-23
Filing date: 2007-10-23
Publication date: 2009-07-13
Also published as: AU2007309447A1; EP2084268A2; WO2008051568A2; US8562972B2; IL198008A; EP2084268B1; EP2420567A2; JP2013216661A; EP3483263A1; ZA200902233B; CN101631852A; EP2420568A3; CN104099290A; EP2420567A3; WO2008051568A9; US20080213228A1; EP2418271A3; US20190262406A1; PT2084268T; MX2009004238A

Abstract

본 명세서에서는 부착성(adherent) 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군을 이용하는 방법과 이들을 배양하고, 증식하며 증폭하는 방법을 제공한다. 또한 본 명세서에서는 태반 줄기세포를 분화하는 방법도 제공한다. 나아가 본 명세서에서는 상기 태반 줄기세포를 이용하여 환자에게 투여하는데 적합한 이식 또는 주사 가능한 조성물을 제형화하는 방법을 제공한다. 더욱 나아가 본 명세서에서는 줄기세포와 줄기세포를 함유하는 조성물을 이용하여 뼈의 결함을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

태반 줄기세포군으로 뼈의 결함을 치료하기 위한 방법과 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF BONE DEFECTS WITH PLACENTAL CELL POPULATIONS}

본 명세서에서는 분리된 태반 세포(isolated placental cell), 예를 들어 태반 관류물, 부착성과 비부착성(non-adherent) 태반 줄기세포, 태반 줄기세포의 세포군, 상기 줄기세포를 함유하는 조성물, 이 줄기세포를 얻는 방법, 이 줄기세포를 함유하는 조성물의 제형화 방법 그리고 이 줄기세포와 조성물로 뼈의 결함을 치료하는 방법을 제공한다.

사람 줄기세포는 여러 종류의 성숙한 세포 계통을 생성할 수 있는 전능성(totipotent)이거나 다능성(pluripotent)인 전구세포(precursor cell)이다. 줄기세포는 모든 조직이 아니라면 수많은 조직을 재형성하고, 생체적·해부학적 기능을 되살리는데 쓰일 수 있다는 것을 밝혀주는 증거들이 있다.

수많은 서로 다른 포유류 줄기세포들의 특성이 분석된 바 있다. 예를 들어 Caplan 외 미국 특허 제5,486,359호(사람 중간엽 줄기세포)), (Boyse 외 미국 특허 제5,004,681호(태아와 신생아 조혈 줄기세포와 전구세포)), (Boyse 외 미국 특허 제5,192,553호 (상동)), (Beltrami 외, Cell 114(6):763~766 (2003) (심근 줄기세포)), (Forbes 외, J. Pathol 197(4):510~518 (2002) (간 줄기세포)를 보라. 제대 혈과 제대혈에서 유래한 모든 유핵세포는 절제 시술을 받은 환자들의 조혈 기능을 완전히 또는 부분적으로 회복하기 위한 이식에 쓰인 바 있다.

발명의 요약

본 명세서에서는 분리된 태반 세포(isolated placental cell), 예를 들어 태반 관류물, 부착성과 비부착성(non-adherent) 태반 줄기세포, 태반 줄기세포의 세포군, 상기 세포를 함유하는 조성물, 이 세포들을 얻는 방법, 이 조성물의 제형화 방법 그리고 이 세포들로 뼈의 결함을 치료하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서는 분리된 줄기세포와 이러한 줄기세포를 함유하는 세포군을 제공하는데, 여기서 이 줄기세포는 태반 조직(예를 들어, 양막, 융모막, 태반엽, 탯줄 등)에 존재하고 그로부터 분리할 수 있으며, 뼈의 결함(bone defect)을 고치는데 유용하다. 이 태반 줄기세포는 줄기세포의 특성(예를 들어, 줄기세포와 연관된 표지를 나타내고, 미분화된 상태에서 배양시 적어도 10~20회 복제하며, 3대 배엽층의 대표적인 성체 세포로 분화한다)을 하나 이상 나타내고, 조직 배양 기질(예를 들어 조직 배양 접시나 다중 웰 배양판 표면과 같은 조직 배양 플라스틱)에 부착할 수 있다.

본 명세서의 한 실시 태양에서는 비부착성(non-adherent)인 분리된(isolated) 태반 줄기세포를 제공한다. 몇몇 태양에서는 상기 분리된 줄기세포가 CD34⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 분리된 줄기세포가 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 분리된 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포를 효소 소화로 사람 태반에서 분리해 낸다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포를 관류로써 사람 태반에서 분리한다. 몇몇 실시 태양에서는, 무기질 침착 매트릭스(mineralized matrix)의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 상기 분리된 줄기세포가 배양 중인 태반 세포군 속에서 무기질 침착 매트릭스의 형성을 촉진한다.

다른 실시 태양에서는 비부착성인 분리된 태반 줄기세포군을 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD34⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD44^-인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺또는 CD166⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺ 또는 CD200⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 함유하는 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 함유하는 줄기세포의 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 증폭(expansion)시킨다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 적어도 한 차례 계대한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 적어도 다섯 차례 계대한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 적어도 열 차례 계대한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 적어도 스무 차례 계대한다. 몇몇 실시 태양에서는 무기질 침착 매트릭스(mineralized matrix)의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 상기 분리된 줄기세포가 배양 중인 태반 세포군 속에서 무기질 침착 매트릭스를 형성하거나 그 형성을 촉진한다.

본 명세서의 한 측면에서는 CD34⁺이고 CD44^-인 분리된 태반 줄기세포군을 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포의 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 증폭시킨다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 적어도 한 차례 계대한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 적어도 다섯 차례 계대한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 적어도 열 차례 계대한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 적어도 스무 차례 계대한다. 몇몇 실시 태양에서는 무기질 침착 매트릭스(mineralized matrix)의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 상기 세포군이 배양 중인 한 태반 세포군 속에서 무기질 침착 매트릭스를 형성하거나 그 형성을 촉진한다.

한 실시 태양에서는, CD200⁺ 또는 HLA-G⁺인 분리된 태반 줄기세포군을 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 이 세포가 CD200⁺이고 HLA-G⁺이다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 이 줄기세포가ks CD34^-, CD38^-또는 CD45 이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에서, 태반 줄기 세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 상기 줄기세포가 촉진한다.

본 명세서의 다른 태양에서는 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 여러 실시 태양에서는 상기 분리된 태반 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%나 그 이상이 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포이다. 상기 세포군의 어느 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 더 구체적인 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 구체적 태양에서는 상기 세포군을 증폭시키는데, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 적어도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 적어도 열다섯 차례 또는 적어도 스무 차례 계대한다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군이 하나 이상의 배아유사체를 형성한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는, 분리된 태반 줄기세포로서 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 세포들을 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에서, 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 상기 줄기세포가 촉진한다.

다른 실시 태양에서는, 분리된 태반 세포군으로서 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 줄기세포를 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 여러 실시 태양에서는 상기 분리된 태반 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 줄기세포이다. 상기 세포군의 어느 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 상기 세포군을 증폭시키는데, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 적어도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 적어도 열다섯 차례 또는 적어도 스무 차례 계대한다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군이 하나 이상의 배아유사체를 형성한다.

본 명세서에서는 또한 분리된 태반 줄기세포로서 CD200⁺이고 OCT-4⁺인 세포를 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺인 세포이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에서, 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 상기 줄기세포가 촉진한다.

다른 실시 태양에서는, CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 여러 실시 태양에서는 상기 분리된 태반 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD200⁺, OCT-4⁺줄기세포이다. 상기 세포군의 어느 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 상기 세포군의 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 상기 세포군을 증폭시키는데, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 적어도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 적어도 열다섯 차례 또는 적어도 스무 차례 계대한다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군이 하나 이상의 배아유사체를 형성한다.

다른 실시 태양에서는, CD73⁺이면서 CD105⁺인 분리된 태반 줄기세포를 제공하는데, 이 줄기세포는 배아유사체의 형성을 촉진하는 조건 하에서 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때 이 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체의 형성을 촉진한다. 한 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 OCT-4⁺이다. 더 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 OCT4⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

나아가 본 명세서에서는 CD73⁺, CD105⁺ 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 제공하는데, 이 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 여러 실시 태양에서는 상기 분리된 태반 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD73⁺, CD105⁺줄기세포이다. 상기 세포군의 어느 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 상기 세포군을 증폭시키는데, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 적어도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 적어도 열다섯 차례 또는 적어도 스무 차례 계대한다.

나아가 본 명세서에서는 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 분리된 태반 줄기세포를 제공한다. 한 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 OCT-4⁺이다. 다른 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 CD200⁺이다. 다른 구체적인 태양에서는 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때, 이 줄기세포가 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진한다.

나아가 본 명세서에서는 CD73⁺, CD105⁺와 HLA-G⁺인 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 여러 실시 태양에서는 상기 분리된 태반 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포이다. 상기 세포군의 어느 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 다른 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 CD200⁺이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺이고 CD200⁺이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 상기 세포군을 증폭시키는데, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 적어도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 적어도 열다섯 차례 또는 적어도 스무 차례 계대한다. 다른 구체적 실시 태양에서, 이 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 배아유사체를 형성한다.

나아가 본 명세서에서는 OCT-4⁺인 분리된 태반 줄기세포를 제공하는데, 이 세포는 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진한다. 어느 구체적 실시 태양에서는 이 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD73⁺, CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 CD200⁺이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

본 명세서에서는 또한 OCT-4⁺ 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 제공하는데, 이 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 여러 실시 태양에서는 상기 분리된 태반 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 OCT-4⁺줄기세포이다. 상기 세포군의 어느 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 CD200⁺이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 상기 세포군을 증폭시키는데, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 적어도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 적어도 열다섯 차례 또는 적어도 스무 차례 계대한다.

나아가 본 명세서에서는 본 명세서에서 기술하는 부착성 또는 비부착성 태반 줄기세포의 분리된 세포군을 제공하는데, 이 세포군은 제대혈을 제거하고 관류하여 잔여 혈액을 없앤 포유동물 태반을 관류하는 단계, 상기 태반을 관류 용액으로 관류하는 단계, 관류 결과 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 포함하고 있는 상기 관류 용액을 수집하는 단계와 상기 세포군으로부터 복수의 상기 태반 줄기세포를 분리하는 단계들을 포함하는 한 방법에 따라 제조한다. 어느 구체적 실시 태양에서는 이 관류 용액을 탯줄 정맥과 탯줄 동맥 양쪽으로 통과시키고 이 용액이 태반에서 스며 나오면 이를 수집한다. 다른 구체적 태양에서는 이 관류 용액을 제대 정맥으로 통과시킨 다음 제대 동맥에서 수집하거나 제대 동맥으로 통과시킨 다음 이를 제대 정맥에서 수집한다.

나아가서 본 명세서에서는 본 명세서에서 기술하는 분리된 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포의 분리된 세포군을 제공하는데, 이 세포는 다음 단계를 포함하는 한 방법에 따라서 제조한다: 태반 조직을 조직 파괴성 효소로 소화하여 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 얻는 단계와 상기 태반 세포의 나머지로부터 복수의 태반 줄기세포를 분리해내는 단계. 구체적 실시 태양에서는 상기 태반 조직이 전체 태반, 양막, 융모막, 양막과 융모막의 조합 또는 상기 모든 것의 조합이다. 다른 구체적인 태양에서는 상기 조직 파괴성 효소가 트립신이나 콜라겐 분해효소이다.

본 명세서에서는 더욱 구체적인 실시 태양으로서, 분리된 태반 줄기세포를 제공하는데, 이 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 하나 이상의 유전자를 측정 가능한 정도로 더 고도로 발현하는데, 상기 하나 이상의 유전자는 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, 및/또는 ZC3H12A이고, 여기서 상기 골수 유래 줄기세포는 배양 도중 상기 태반 줄기세포와 균등한 횟수로 계대한 것이다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포가 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN과 ZC3H12A를 측정 가능한 수준으로 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 더 많이 발현한다.

더 구체적인 실시 태양으로서, 본 명세서에서는 분리된 태반 줄기세포군을 제공하는데, 여기서 상기 줄기세포군은 하나 이상의 유전자를 측정 가능한 수준으로 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 더 고도로 발현하고, 이 때 상기 하나 이상의 유전자는 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, 및/또는 ZC3H12A이며, 이 때 상기 골수 유래 줄기세포는 배양 도중 상기 태반 줄기세포와 균등한 횟수로 계대한 것이고, 상기 골수 유래 줄기세포군은 상기 분리된 줄기세포군과 균등의 수의 세포를 가지고 있다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 분리된 줄기세포군이 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN과 ZC3H12A를 상기 분리된 골수 유래 중간엽 줄기세포군보다 측정 가능하게 더 높은 수준에서 발현한다.

본 명세서에서는 또 한편 본 명세서에서 기술하는 상기 줄기세포를 하나 이상, 예를 들어 태반 관류물, 태반 관류물 세포 또는 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 이 때 상기 세포는 태반에서 분리한 것이다. 바람직한 실시 태양에서는, 태반 세포를 함유하는 이 조성물이 뼈의 결함을 고치는데 유용하다. 따라서 본 명세서에서는 태반 관류물 또는 태반 관류물에서 분리한 세포, 예를 들어 태반 관류물 유래의 총 유핵세포를 함유하는 조성물을 제공한다.

본 명세서의 한 측면에서는 태반 관류물 도는 태반 관류물 세포, 예를 들어 태반 관류물 유래의 총 유핵세포를 함유하는 조성물을 제공한다.

본 명세서에서는 나아가서 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 줄기세포는 비부착성인 분리된 태반 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD34⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34⁺ 이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺, 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포를 효소 소화에 의하여 사람 태반으로부터 분리한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포를 관류에 의하여 사람 태반으로부터 분리한다. 몇몇 실시 태양에서는, 무기질 침착 매트릭스(mineralized matrix)의 형성을 허용하는 조건 하에서 태반 세포군을 배양하였을 때 상기 세포가 상기 세포군 속에서 무기질 침착 매트릭스의 형성을 촉진한다.

다른 측면으로서 본 명세서에서는 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 줄기세포는 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺ 또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD31⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포를 효소 소화에 의하여 사람 태반으로부터 분리한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포를 관류에 의하여 사람 태반으로부터 분리한다. 몇몇 실시 태양에서는, 무기질 침착 매트릭스(mineralized matrix)의 형성을 허용하는 조건 하에서 태반 세포군을 배양하였을 때 상기 세포가 상기 세포군 속에서 무기질 침착 매트릭스의 형성을 촉진한다.

몇몇 실시 태양에서는, 상기 조성물에 본 명세서에서 제공하는 분리된 줄기세포와 상기 줄기세포의 골 형성 세포(osteogenic cell)로의 분화를 유도하는 화합물이 포함된다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 조성물이 본 명세서에서 제공하는 분리된 줄기세포 또는 분리된 줄기세포군과 한 화합물을 포함하는데, 이 화합물은 상기 줄기세포 군 속에서 복수의 줄기세포가 골 형성 세포로 분화하도록 유도한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 화합물이 덱사메타손(dexamethasone)이나 아스코르브산이다.

본 명세서의 몇몇 실시 태양에서는, 분리된 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 줄기세포는 CD200⁺이고 HLA-G⁺이다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺인 세포이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는, 분리된 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 이 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺이다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺이다.

다른 실시 태양에서는 분리된 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 이 줄기세포는 CD200⁺이고 OCT-4⁺이다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺인 세포이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는, CD73⁺이면서 CD105⁺인 분리된 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 이 때 이 줄기세포는 배아유사체의 형성을 촉진하는 조건 하에서 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군 속에서 배아유사체의 형성을 촉진한다. 한 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 OCT-4⁺이다. 다른 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 OCT4⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

본 명세서의 다른 또 하나의 실시 태양에서는 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 분리된 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공한다. 한 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 부착성이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 OCT-4⁺이다. 다른 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 CD200⁺이다. 다른 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 OCT4⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

다른 실시 태양에서는, 본 명세서에서는 또한 OCT-4⁺인 분리된 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 줄기세포는 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 CD200⁺이다. 구체적인 또 다른 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

본 명세서에서는 나아가 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 이 줄기세포는 하나 이상의 유전자를 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 측정 가능하게 더 많이 발현하며, 여기서 상기 하나 이상의 유전자는 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN과 ZC3H12A로 이루어지는 군에서 선택하게 되며, 이 때 상기 골수 유래 줄기세포는 배양 중에 상기 태반 줄기세포와 동등한 횟수의 세포 계대를 거친 것이다l. 상기 조성물의 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN과 ZC3H12A를 골수 유래 중간엽 줄기세포군보다 측정 가능하게 더 높은 수준으로 발현하는데, 이 때 상기 줄기세포군과 상기 골수 유래 중간엽 세포군은 서로 동등한 수의 세포를 지니고 있다.

본 명세서의 다른 구체적 태양에서는 상기 조성물 중 어떠한 것이라도 매트릭스를 포함할 수 있다. 더 구체적인 태양에서 상기 매트릭스는 3차원 스캐폴드(scaffold)이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 매트릭스가 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 피브로넥틴, 펙틴, 오르니틴 또는 비트로넥틴을 포함한다. 다른 더욱 특정한 실시 태양에서, 상기 매트릭스는 양막 또는 양막 유래 생물질이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 매트릭스는 세포외 막단백질(extracelluar membrane protein)을 함유한다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 매트릭스는 합성 화합물을 함유한다. 다른 구체적인 실시 태양에서 상기 매트릭스는 생활성 화합물을 함유한다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 생활성 화합물은 성장 인자, 사이토킨, 항체 또는 5,000 달톤 미만의 유기 물질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 매트릭스가 폴리락트산이나 폴리글리콜산 등의 분해 가능한 합성 수지이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 매트릭스가 이식 가능한 스캐폴드용 기질(scaffolding substrate)이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질을 인산β-트리칼슘(β-tricalcium phosphate) 기질, 인산β-트리칼슘-콜라겐 기질, 콜라겐 기질, 인산칼슘 기질, 무기질 침착(mineralized) 사람 태반 콜라겐 기질, 히알루론산(hyaluronic acid) 기질과 세라믹 기질로 이루어지는 군에서 선택한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산β-트리칼슘 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산β-트리칼슘 -콜라겐 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 콜라겐 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산칼슘 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 무기질 침착 사람 태반 콜라겐 기질이다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 나아가 배지를 포함한 조성물을 제공하는데, 이 배지는 상기 줄기세포 도는 상기 줄기세포군 중 어느 것에 의한 조건 배지(conditioned medium)라도 좋다. 한 구체적 태양에서는 이러한 모든 조성물이 태반에서 유래하지 않은 줄기세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서는 상기 줄기세포가 배아 줄기세포이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포이다. 다른 더 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 골수 유래 줄기세포이다. 다른 더 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 조혈 전구세포이다. 다른 더 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 체세포 줄기세포이다. 더욱 구체적인 다른 실시 태양에서는 상기 체세포 줄기세포가 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 이자 줄기세포, 내피 줄기세포, 심장 줄기세포 또는 근육 줄기세포이다.

본 명세서의 다른 측면에서는 본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포나 태반 줄기세포군에 의한 조건 배지를 함유하는 조성물을 제공한다. 몇몇 태양에서는 이 조성물이 세포군, 예를 들어 본 명세서에서 제공하는 줄기세포군에 의한 조건 배지를 함유한다.

본 명세서에서는 또한 기질에 부착하지 하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 다른 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 제조 방법을 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 방법이 CD34를 발현하지만 CD44를 발현하지 않는 세포를 선택하는 단계와 여타 세포로부터 이러한 세포를 분리해내는 등의 방법으로 이들 세포를 농축시켜 세포군을 이루는 단계를 더 포함한다.

본 명세서의 몇몇 실시 태양에서는 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 기질에 부착하지 않고, (b) CD34를 발현하고 CD44를 발현하지 않으며 (c) 무기질 침착 매트릭스의 형성을 허용하는 조건 하에서 태반 세포군을 배양하였을 때 이 세포군에서 무기질 침착 매트릭스의 형성을 촉진하는 세포를 선택하는 단계와 이러한 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 기질이 피브로넥틴을 포함한다.

몇몇 태양에서 상기 방법은 CD9, CD29, CD54, CD90, CD166 또는 이들 표지를 조합 발현하는 세포를 선택하는 단계를 더 포함한다.

몇몇 실시 태양에서 상기 방법은 CD31, CD34, CD117, CD133, CD200 또는 이들 표지를 조합 발현하는 세포를 선택하는 단계를 더 포함한다.

몇몇 실시 태양에서는 이러한 선택이 항체를 이용하여 이루어진다. 몇몇 태양에서는 이 선택이 흐름 세포 측정법을 이용하여 이루어진다. 몇몇 태양에서는 이러한 선택을 자기 비드를 이용하여 수행한다. 몇몇 태양에서는 이러한 선택을 형광 표지 세포 분리(cell sorting)를 이용하여 수행한다. 몇몇 태양에서는 이 세포군을 증폭한다.

본 명세서의 다른 측면에서는 비부착성 태반 줄기세포군을 제공하는데, 이 세포는 냉동 보존된 것이고, 상기 세포군은 용기 속에 담고 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 태양에서는 이 세포를 냉동 보존하는데, 이 때 상기 세포군은 용기 속에 담기고, 상기 줄기세포는 무기질 침착 매트릭스 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 무기질 침착 매트릭스를 형성한다. 몇몇 태양에서는 이 용기가 액체의 정맥하 전달에 적합한 백이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는 이 세포군이 5×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는, 이 세포군이 1×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁸개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁸의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁹의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁹개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10¹⁰개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 5회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 10회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 15회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 20회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 상기 용기 속에서 증폭시킨다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 0.9% NaCl 용액 속에 담아 둔다.

본 명세서의 다른 측면에서는 매트릭스에 무기질을 침착시킬 수 있는 골 형성 세포(osteogenic cell)를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 명세서에서 제공하는 복수의 줄기세포 또는 본 명세서에서 제공하는 분리된 줄기세포군을 상기 줄기세포가 골 형성 세포로 분화하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는데, 이러한 배양은 상기 골 형성 세포가 칼슘 및/또는 인산이 풍부한 무기질 침착 매트릭스를 측정 가능한 양으로 생산하거나 생산하는 것을 촉진하기에 충분한 시간 동안 이루어진다. 몇몇 실시 태양에서는 이 골 형성 세포가 뼈를 제조한다.

본 명세서의 또 다른 측면에서는 매트릭스 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 명세서에서 제공하는 줄기세포군을 이식할 수 있는 스캐폴드용 기질과 결합하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 줄기세포가 비부착성이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포가 CD34⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포 중 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는 이 세포군이 5×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는, 이 세포군이 1×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁸개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁸의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁹의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁹개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10¹⁰개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 적어도, 대략 또는 많아야 5회이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 적어도, 대략 또는 많아야 10회이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 적어도, 대략 또는 많아야 15회이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 적어도, 대략 또는 많아야 20회이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 상기 용기 속에서 증폭시킨다.

몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질을 인산β-트리칼슘(β-tricalcium phosphate) 기질, 인산β-트리칼슘-콜라겐 기질, 콜라겐 기질, 인산칼슘 기질, 무기질 침착(mineralized) 사람 태반 콜라겐 기질, 히알루론산(hyaluronic acid) 기질과 세라믹 기질로 이루어지는 군에서 선택한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산β-트리칼슘 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산β-트리칼슘 -콜라겐 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 콜라겐 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산칼슘 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 무기질 침착 사람 태반 콜라겐 기질이다.

본 명세서의 또 다른 측면에서는 주사용 조성물의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 줄기세포군을 주사용 히알루론산이나 콜라겐과 결합하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 줄기세포가 비부착성이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포가 CD34⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포 중 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 일부 다른 실시 태양에서는, 상기 태반 줄기세포가 부착성이다. 구체적 실시 태양에서는 이 태반 줄기세포가 CD200⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺; CD200⁺이고 OCT-4⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 OCT-4⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 상기의 조합 중 어느 것이라도 만족할 수 있다. 상기 비부착성 태반 줄기세포의 더 구체적인 실시 태양에서는, 상기 분리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺; 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺; 상기 분리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; 제1항의 상기 분리된 줄기세포에서 상기 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD45^-, OCT-4⁺, CD200⁺; 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포가 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-; 및/또는 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 OCT-4⁺ 줄기세포가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포군을 증폭한다. 몇몇 태양에서는 상기 조성물이 주사용 히알루론산을 함유한다. 몇몇 태양에서는 이 조성물이 주사용 콜라겐을 함유한다. 본 명세서에서는 또한 비부착성 줄기세포군과 주사용 히알루론산 또는 콜라겐을 함유하는 조성물도 제공한다.

본 명세서의 다른 측면에서는 환자의 뼈 결함을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 명세서에서 제공하는 줄기세포군을 함유하는, 이식할 수 있거나 주사할 수 있는 조성물을 이 조성물이 필요한 환자에게 투여하여 그 환자의 뼈 결함을 치료하는 단계를 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 뼈 결함이 암, 골절, 척추와 관련된 뼈 용해(osteolysis) 병변인데, 예를 들어 융합(fusion)이 필요한 경우이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 뼈 용해 병변이 다발성 골수종, 골암이나 전이성 암에 관련이 있다. 몇몇 태양에서는 이 골절이 비결합(non-union) 골절이다. 일부 태양에서는 비부착성 줄기세포군을 함유하는 이식할 수 있는 조성물을 그 환자에게 투여한다. 몇몇 실시 태양에서는 이식할 수 있는 조성물을 외과적으로 이식하는데, 예를 들어 뼈 결함 자리에 이식한다. 몇몇 태양에서는 비부착성 줄기세포군을 함유하는 주사용 조성물을 그 환자에게 투여한다. 몇몇 실시 태양에서는 뼈 결함의 부위에 주사용 조성물을 외과적으로 투여한다. 몇몇 태양에서는 이 주사용 조성물을 전신 투여한다.

몇몇 실시 태양에서는 이 줄기세포가 비부착성이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포가 CD34⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포 중 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 일부 다른 실시 태양에서는, 상기 태반 줄기세포가 부착성이다. 구체적 실시 태양에서는 이 태반 줄기세포가 CD200⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺; CD200⁺이고 OCT-4⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 OCT-4⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 상기의 조합 중 어느 것이라도 만족할 수 있다. 상기 비부착성 태반 줄기세포의 더 구체적인 실시 태양에서는, 상기 분리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺; 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺; 상기 분리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; 제1항의 상기 분리된 줄기세포에서 상기 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD45^-, OCT-4⁺, CD200⁺; 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포가 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-; 및/또는 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 OCT-4⁺ 줄기세포가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포군을 증폭한다.

본 명세서의 또 다른 한 측면에서는 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 a) 기질에 부착하고 b) CD34를 발현하지만 CD44는 발현 않는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포들을 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 방법은 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 태양에서 세포군을 제조하는 상기 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD34를 발현하지만 CD44는 발현하지 않고, (c) 무기질 침착 매트릭스의 형성을 허용하는 조건 하에서 태반 세포군을 배양하였을 때 이 세포군에서 무기질 침착 매트릭스 형성을 촉진하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포들을 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 기질이 피브로넥틴을 함유한다. 일부 실시 태양에서는 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 a) 기질에 부착하지 않고 b) CD34를 발현하지만 CD44는 발현 않는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포들을 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 방법은 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 태양에서 세포군을 제조하는 상기 방법은 (a) 기질에 부착하지 않고, (b) CD34를 발현하지만 CD44는 발현하지 않고, (c) 무기질 침착 매트릭스의 형성을 허용하는 조건 하에서 태반 세포군을 배양하였을 때 이 세포군에서 무기질 침착 매트릭스 형성을 촉진하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포들을 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 기질이 피브로넥틴을 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 방법이 다음 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다: CD9, CD29, CD54, CD90, CD166 또는 이들의 모든 조합. 몇몇 실시 태양에서는 이 방법이 다음 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다: CD31, CD34, CD117, CD133, CD200 또는 이들의 모든 조합.

본 방법의 몇몇 실시 태양에서 상기 선택은 항체를 이용하여 이루어진다. 몇몇 실시 태양에서 상기 선택은 흐름세포 측정(Flow cytometry)을 통하여 이루어진다. 일부 실시 태양에서 상기 선택은 자석 비드(magnetic bead)를 이용하여 이루어진다. 일부 실시 태양에서 상기 선택은 형광 표지 세포 분리(FACS)를 통하여 이루어진다. 몇몇 실시 태양에서 상기 세포군은 증폭(expansion)된다.

몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-인데, 이 세포는 냉동 보존된 것이고, 상기 세포군을 용기 속에 담고 있다. 몇몇 태양에서는 이 세포를 냉동 보존하는데, 이 때 상기 세포군은 용기 속에 담기고, 상기 줄기세포는 무기질 침착 매트릭스 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 무기질 침착 매트릭스를 형성한다.

몇몇 태양에서는 이 용기가 액체의 정맥하 전달에 적합한 백이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는 이 세포군이 5×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는, 이 세포군이 1×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁸개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁸의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁹의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁹개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10¹⁰개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 5회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 10회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 15회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 20회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 상기 용기 속에서 증폭시킨다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군을 0.9% NaCl 용액 속에 담아 둔다.

본 명세서의 다른 측면에서는 골 형성 세포(osteogenic cell)를 얻는 방법을 제공하는데, 이 방법은 복수의 줄기세포 또는 분리된 줄기세포군을 상기 줄기세포가 골 형성 세포로 분화하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는데, 이러한 배양은 상기 골 형성 세포가 칼슘의 측정 가능한 양으로 침착하거나 침착하는 것을 촉진하기에 충분한 시간 동안 이루어진다.

본 명세서의 다른 측면에서는 매트릭스의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 줄기세포군을 이식 가능한 스캐폴드용 기질과 결합하는 단계를 포함하며, 이 때 상기 줄기세포는 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포 중 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 일부 실시 태양에서는, 상기 태반 줄기세포가 부착성이다. 구체적 실시 태양에서는 이 부착성 태반 줄기세포가 CD200⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺; CD200⁺이고 OCT-4⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 OCT-4⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 상기의 조합 중 어느 것이라도 만족할 수 있다. 상기 비부착성 태반 줄기세포의 더 구체적인 실시 태양에서는, 상기 분리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺; 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺; 상기 분리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; 제1항의 상기 분리된 줄기세포에서 상기 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD45^-, OCT-4⁺, CD200⁺; 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포가 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-; 및/또는 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 OCT-4⁺ 줄기세포가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포군을 증폭한다. 몇몇 태양에서는 상기 조성물이 주사용 히알루론산을 함유한다. 몇몇 태양에서는 이 조성물이 주사용 콜라겐을 함유한다. 본 명세서에서는 또한 비부착성 줄기세포군과 주사용 히알루론산 또는 콜라겐을 함유하는 조성물도 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는 이 세포군이 5×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는, 이 세포군이 1×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁸개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁸의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁹의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁹개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10¹⁰개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 5회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 10회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 15회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 20회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 세포군을 증폭시킨다.

몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질을 인산β-트리칼슘(β-tricalcium phosphate) 기질, 인산β-트리칼슘-콜라겐 기질, 콜라겐 기질, 인산칼슘 기질, 무기질 침착(mineralized) 사람 태반 콜라겐 기질, 히알루론산(hyaluronic acid) 기질과 세라믹 기질로 이루어지는 군에서 선택한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산β-트리칼슘 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산β-트리칼슘 -콜라겐 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 콜라겐 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 인산칼슘 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 이식 가능한 스캐폴드용 기질이 무기질 침착 사람 태반 콜라겐 기질 및/또는 스캐폴드이다.

본 명세서의 몇몇 측면에서는 주사용 조성물의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 줄기세포군을 주사용 히알루론산이나 콜라겐과 결합하는 단계를 포함하며, 이 때 이 줄기세포는 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포 중 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 태양에서는 이 세포군을 증폭시킨다. 몇몇 실시 태양에서는 이 줄기세포가 부착성이다. 몇몇 태양에서는 이 조성물이 주사용 히알루론산을 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 조성물이 주사용 콜라겐을 함유한다. 본 명세서에서는 또한 비부착성 줄기세포군과 주사용 히알루론산 또는 콜라겐을 함유하는 조성물을 제공한다.

본 명세서의 또 다른 측면에서는 환자의 뼈 결함을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 줄기세포군을 함유하는, 이식할 수 있거나 주사할 수 있는 조성물을 이 조성물이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 줄기세포는 CD34⁺이고 CD44^-이어서 이 환자의 뼈 결함을 치료한다. 몇몇 태양에서는 이 뼈 결함이 (a) 암에 관련된 뼈 용해(osteolysis) 병변, (b) 골절 또는 (c) 융합(fusion)이 필요한 척추이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 뼈 용해 병변이 다발성 골수종, 골암이나 전이성 암에 관련이 있다. 몇몇 태양에서는 이 골절이 비결합(non-union) 골절이다. 일부 태양에서는 비부착성 줄기세포군을 함유하는 이식할 수 있는 조성물을 그 환자에게 투여한다. 몇몇 실시 태양에서는 이식할 수 있는 조성물을 외과적으로 이식한다. 몇몇 태양에서는 비부착성 줄기세포군을 함유하는 주사용 조성물을 그 환자에게 투여한다. 몇몇 실시 태양에서는 뼈 결함의 부위에 주사용 조성물을 외과적으로 투여한다. 몇몇 태양에서는 이 주사용 조성물을 전신 투여한다.

몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 태양에서는 이 세포 중 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 태양에서는 이 세포군을 증폭시킨다.

본 명세서의 또 다른 측면에서는 환자의 뼈 결함을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 줄기세포군을 함유하는, 이식할 수 있거나 주사할 수 있는 조성물을 이 조성물이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 줄기세포는 CD34^-이어서 이 환자의 뼈 결함을 치료한다. 몇몇 태양에서는 이 뼈 결함이 (a) 암에 관련된 뼈 용해 병변, (b) 골절 또는 (c) 융합이 필요한 척추이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 뼈 용해 병변이 다발성 골수종, 골암이나 전이성 암에 관련이 있다. 몇몇 태양에서는 이 골절이 비결합 골절이다. 일부 태양에서는 부착성 줄기세포군을 함유하는 이식할 수 있는 조성물을 그 환자에게 투여한다. 몇몇 실시 태양에서는 이식할 수 있는 조성물을 외과적으로 이식한다. 몇몇 태양에서는 부착성 줄기세포군을 함유하는 주사용 조성물을 그 환자에게 투여한다. 몇몇 실시 태양에서는 뼈 결함의 부위에 주사용 조성물을 외과적으로 투여한다. 몇몇 태양에서는 이 주사용 조성물을 전신 투여한다.

상기 비부착성 태반 줄기세포의 더 구체적인 실시 태양에서는, 상기 분리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺; 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺; 상기 분리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; 제1항의 상기 분리된 줄기세포에서 상기 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD45^-, OCT-4⁺, CD200⁺; 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포가 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-; 및/또는 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 OCT-4⁺ 줄기세포가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는 이 세포군이 5×10⁶개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 태양에서는, 이 세포군이 1×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁷개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁸개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁸의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10⁹의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서 이 세포군은 5×10⁹개의 상기 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 세포군이 1×10¹⁰개의 상기 줄기세포를 포함한다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 5회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 10회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 15회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 줄기세포를 계대한 횟수가 20회 이하이다. 몇몇 태양에서는 이 세포군을 증폭한다.

본 명세서에서는 한편으로 포유동물 태반에서 유래한 줄기세포군을 생산하는 방법을 제공한다. 본 명세서 한 실시 태양에서는 예를 들어, (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 HLA-G를 발현하고 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 본 명세서의 다른 태양에서는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 본 명세서의 다른 태양에서는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 OCT-4를 발현하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 본 명세서의 다른 실시 태양에서는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73과 CD105를 발현하고, (c) 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 태반 세포군과 함께 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 다른 실시 태양에서는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 본 명세서의 다른 태양에서는 세포군의 생산 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 기질에 부착하면서 (b) OCT-4를 발현하고, (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 태반 세포군과 함께 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 전술한 상기 방법들의 다른 구체적인 실시 태양에서, 상기 기질은 피브로넥틴을 함유한다. 다른 구체적 태양에서, 상기 방법은 ABC-p를 발현하는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 다른 구체적인 태양에서 이 방법은 중간엽 줄기세포에 특이적인 특징을 적어도 하나 나타내는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 중간엽 줄기세포에 특징적인 특징은 CD29의 발현, CD44의 발현, CD90의 발현 또는 이들의 조합 발현이다. 본 방법의 다른 구체적 실시 태양에서 상기 선택은 항체를 이용하여 이루어진다. 다른 구체적 태양에서 상기 선택은 흐름세포 측정(Flow cytometry)을 통하여 이루어진다. 다른 구체 태양에서 상기 선택은 자석 비드(magnetic bead)를 이용하여 이루어진다. 다른 구체 태양에서 상기 선택은 형광 표지 세포 분리(FACS)를 통하여 이루어진다. 다른 구체적 실시 태양에서 상기 세포군은 증폭(expansion)된다.

본 명세서에서는 또한 줄기세포주를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 성장 촉진 단백질(growth-promoting protein)을 암호화하는 DNA 서열로 줄기세포를 변환(transformation)하는 단계와 상기 성장 촉진 단백질의 생산을 촉진하는 조건하에 상기 줄기세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 구체적 실시 태양에서는 상기 성장 촉진 단백질이 v-myc, N-myc, c-myc, p53, SV40 대형 T 항원, 폴리오마 대형 T 항원(polyoma large T antigen), E1a 아데노바이러스 또는 사람 파필로마바이러스 E7 단백질이다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 DNA 서열은 조절할 수 있는 것이다. 더 구체적인 태양에서 상기 DNA 서열은 테트라사이클린으로 조절할 수 있다. 다른 구체적 태양에서는 상기 성장 촉진 단백질의 활성을 조절할 수 있다. 다른 구체적 태양에서는 상기 성장 촉진 단백질이 온도 민감성 변이체(temperature-sensitive mutant)이다.

본 명세서에서는 또한 냉동보존된 줄기세포군을 제공한다. 예를 들어 본 명세서에서는 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 냉동보존되고 용기 속에 담겨 있는 것이다. 본 명세서에서는 또한 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 냉동보존되고, 상기 세포군은 용기 속에 담겨 있다. 본 명세서에서는 또한 CD200⁺, OCT-4⁺줄기세포군을 제공하는데, 이들은 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이다. 본 명세서에서는 또한 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이며, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 태반 세포군과 함께 배양되었을 때, 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 것이다. 본 명세서에서는 나아가 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺줄기세포군을 제공하는데, 이들은 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이다. 본 명세서에서는 또한 OCT-4⁺ 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이며, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 태반 세포군과 함께 배양되었을 때, 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 것이다. 전술한 냉동보존된 세포군 중 어느 것에 관한 구체적인 태양에서라도 상기 용기는 백일 수 있다. 여러 특정 실시 태양에서는 1×10⁶개의 상기 줄기세포, 5×10⁶개의 상기 줄기세포, 1×10⁷개의 상기 줄기세포, 1×10⁸개의 상기 줄기세포, 5×10⁸의 상기 줄기세포, 1×10⁹의 상기 줄기세포. 5×10⁹개의 상기 줄기세포 또는 1×10¹⁰개의 상기 줄기세포를 포함한다. 전술한 냉동보존 세포군에 관한 구체적 태양 중 어느 것에서라도 상기 줄기세포의 계대 횟수는 적어도, 대략 또는 많아야 5회, 많아야 10회, 많아야 15회 또는 많아야 20회이다. 전술한 냉동보존 세포군에 관한 구체적 태양 중 어느 것에서라도 상기 줄기세포는 상기 용기 속에서 증폭한다.

나아가 본 명세서에서는 무기질 침착 콜라겐 매트릭스를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 콜라겐에 무기물을 침착시키고 이 무기질 침착 콜라겐 매트릭스를 가교하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 콜라겐이 태반 콜라겐이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 콜라겐이 인산칼슘으로 무기질 침착된다. 몇몇 실시 태양에서는 이 콜라겐이 부탄디올 디글리시딜 에테르로 가교된다. 몇몇 태양에서는 무기질 침착 반응에서 콜라겐에 대한 인산칼슘의 비율이 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10 또는 95:5이다.

용어의 정의

본 명세서에서 "SH2"라는 용어는 CD105 표지 분자 표면의 항원 결정기에 결합하는 항체를 일컫는다. 따라서 SH2⁺로 나타내는 세포는 CD105⁺이다.

본 명세서에서 "SH3"과 "SH4"라는 용어는 CD73 표지 분자 표면의 항원 결정기에 결합하는 항체들을 일컫는다. 즉 SH3⁺ 및/또는 SH4⁺라고 나타낸 세포는 CD73⁺이다.

본 명세서에서 "분리된 줄기세포"라는 용어는 상기 줄기세포가 유래한 조직, 예를 들어 태반의 다른 비줄기세포로부터 실질적으로 분리된 줄기세포를 말한다. 줄기세포는 그 줄기세포와 자연 상태에서 결부된 비줄기세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 예를 들어 상기 줄기세포의 수집 및/또는 세포 배양 과정에서 제거되었을 때 "분리된" 세포이다.

본 명세서에서 "분리된 세포군(isolated population of cells)"이라는 용어는 상기 세포군이 유래한 조직, 예를 들어 태반의 다른 세포들로부터 실질적으로 분리된 세포군을 말한다. 세포군은 그 세포군 또는 그 세포군이 유래한 세포와 자연 상태에서 결부된 세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 예를 들어 상기 줄기세포군의 수집 및/또는 세포 배양 과정에서 제거하였을 때 "분리된" 세포군이다.

본 명세서에서, "태반 줄기세포"라는 용어는 형상, 세포 표면 표지 또는 1차 배양 후 계대 수에 무관하게 포유류 태반에서 유래한 줄기세포 또는 전구세포로서 를 말한다. 그러나 본 명세서에서 "태반 줄기세포"라는 용어는 영양막 세포(trophoblast)를 가리키는 것은 아니다. 세포는 줄기세포의 특징 중 적어도 하나, 예를 들어, 표지 또는 유전자 발현 형태(profile)이 하나 이상 유형의 줄기세포와 관련되거나, 배양시 적어도 10~40회 복제하며, 3대 배엽층의 모든 세포로 분화할 수 있는 능력, 성체(즉 분화한) 세포 특성의 결여 등을 갖추고 있으면 "줄기세포"라고 간주한다. "태반 줄기세포"와 "태반 유래 줄기세포"라는 용어는 서로 교환하여 쓰일 수 있다.

본 명세서에서 "태반 관류물(placental perfusate)"이란 용어는 태반, 예를 들어 사람 태반의 적어도 일부를 예를 들어 태반 혈관계를 통하여 통과한 관류 용액을 의미하는데, 여기에는 이 관류 용액이 태반을 통과하는 동안 수집한 복수의 세포가 포함된다.

본 명세서에서 "태반 관류물 세포"는 태반 관류물에서 유래하였거나 유래할 수 있는 유핵 세포, 예를 들어 총 유핵 세포를 의미한다.

본 명세서에서 줄기세포는 특정 표지를 검출할 수 있으면 그 표지에 대하여 "양성"이다. 이를 테면 태반 줄기세포는 예를 들어 CD73에 대하여 양성(즉 CD73⁺)인데, 이는 태반 줄기세포에서 CD73 신호가 배경 신호보다 측정 가능하게 더 큰 신호를 나타내기 때문(이를 테면 동종 세포 유형 대조군에 견주어)이다. 세포는 또한 어느 표지를 이용하여 그 세포를 적어도 하나의 다른 세포 유형과 구별할 수 있을 때 또는 그 표지가 세포 표면에 나타나거나, 발현될 때 그 표지를 이용하여 그 세포를 선별 또는 분리할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다.

본 발명의 맥락에서 "골 형성 세포(osteogenic cell)"는 뼈의 주성분인 수산화인회석(hydroxyapatite)을 침착시킬 수 있거나, 수산화인회석을 침착할 수 있는 다른 세포로 분화할 수 있는 세포를 뜻한다. "골 형성 세포"는 구체적으로 뼈 모세포(osteoblast)나 뼈세포(osteocyte)포라고 통상적으로 가리키는 세포를 망라하기 위한 의도이다.

본 명세서에서, "매트릭스(matrix)"는 3차원 물질로서 물질 전체에 걸쳐 공간(lacuna)이 흩어져 있는 특징을 가진 것을 가리킨다. 이 공간(lacuna)은 예를 들어 세포의 성장에 좋은데, 예를 들어 상기 매트릭스 속의 줄기세포, 태반 유래 부착성 줄기세포 및/또는 골 형성 세포의 성장에 좋다. 예시 매트릭스로는 인산β-트리칼슘 기질, 인산β-트리칼슘-콜라겐 기질, 콜라겐 기질, 인산칼슘 기질, 무기질 침착 사람 태반 콜라겐 기질, 히알루론산 기질과 세라믹 기질을 들 수있지만 여기에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 이 매트릭스의 공간 속에 존재하는 골 형성 세포가 이 매트릭스에 무기질을 침착한다.

1. 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군.

태반 줄기세포는 태반 혹은 그 일부로부터 얻을 수 있는 줄기세포로서, 조직 배양 기질에 부착하고, 비태반 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖추고 있는 줄기세포이다. 태반 줄기세포는 태아 또는 모체에서 유래한 것(즉 태아 아니면 모체의 유전형을 띨 수 있음)이다. 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군은 오로지 태아 유래 또는 오로지 모체 유래인 태반 줄기세포를 포함할 수 있고, 또 태아와 모체 유래가 섞인 혼합 태반 줄기세포군을 포함할 수도 있다. 상기 태반 줄기세포와 상기 태반 줄기세포를 함유하는 세포군은 아래에 기술하는 형태학적 표지와 배양 특성에 따라 동정되고 선택될 수 있다.

1.1 물리적·형태학적 특성

본 명세서에서 제공하는 비부착성 CD34⁺ 줄기세포는 초대 배양되거나 세포 배양되었을 때 조직 배양 기질에 부착하지 않는 것이 전형적인 경우이다. 이 비부착성 줄기세포는 배양시 전형적으로 둥근 모습인데, 이는 골수 또는 말초 혈액에서 유래한 CD34⁺ 줄기세포와 유사하다.

본 명세서에서 제공하는 부착성 태반 줄기세포는 초대 배양되거나 세포 배양되었을 때 조직 배양 기질, 예를 들어 조직 배양 용기의 표면(조직 배양용 플라스틱 등)에 부착한다. 배양 중인 태반 줄기세포는 일반적으로 섬유모세포 형상이며 별 모양이고 세포체의 중심에서 세포질 돌기가 몇 군데 불거져 나온다. 이 태반 줄기세포는 그러나 같은 조건하에서 배양된 섬유 모세포와 형태학적으로 구별이 가능한데, 태반 줄기세포는 섬유모세포보다 그러한 돌기를 더 많이 나타내기 때문이다. 형태학적으로 태반 줄기세포는 조혈 줄기세포와도 구별할 수 있는데, 조혈 줄기세포는 배양시 더 둥글거나 조약돌 모양을 나타낸다.

1.2 세포 표면, 분자 표지와 유전적 표지

비부착성 태반 줄기세포: 본 명세서의 한 실시 태양에서는 분리된 비부착성 태반 줄기세포를 제공한다. 몇몇 태양에서는 상기 분리된 줄기세포가 CD34⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 분리된 줄기세포가 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 분리된 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포를 관류하거나 물리적이나 생화학적 조직 파괴, 예를 들어 효소 소화하여 사람 태반에서 분리해 낸다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포를 관류로써 사람 태반에서 분리한다. 몇몇 실시 태양에서는, 무기질 침착 매트릭스(mineralized matrix)의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 상기 분리된 줄기세포가 배양 중인 태반 세포군 속에서 무기질 침착 매트릭스의 형성을 촉진한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 비부착성인 분리된 태반 줄기세포군을 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD34⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD44^-인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺또는 CD166⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺ 또는 CD200⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺인 줄기세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 함유하는 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 세포군이 함유하는 줄기세포의 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다.

본 명세서의 다른 측면에서는 CD34⁺이고 CD44^-인 분리된 태반 줄기세포군을 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺ 또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포의 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다.

부착성 태반 줄기세포: 본 명세서에서 제공하는 부착성 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군은 상기 줄기세포 또는 이 줄기세포를 함유하는 세포군의 동정 및/또는 분리에 쓰일 수 있는 표지를 여러 개 발현한다. 본 명세서에서 제공하는 부착 성 태반 줄기세포와 줄기세포군(즉 둘 이상의 태반 줄기세포)은 태반으로부터 직접 얻거나 태반의 어느 일부분(예를 들어 양막, 융모막, 태반의 태반엽, 탯줄 등)에서 얻은 줄기세포와 줄기세포 함유 세포군을 포함한다. 태반 줄기세포군은 또한 배양 중인 태반 줄기세포와 백과 같은 용기 안에 든 세포의 군(즉 둘 이상의 태반 줄기세포)을 포함한다. 태반 줄기세포는 하지만 영양막 세포가 아니다.

본 명세서에서 제공하는 부착성 태반 줄기세포는 일반적으로 CD73, CD105, CD200, HLA-G 및/또는 OCT-4를 발현하고, CD34, CD38 또는 CD45를 발현하지 않는다. 태반 줄기세포는 또한 HLA-ABC(MHC-1)와 HLA-DR을 발현한다. 이들 표지는 태반 줄기세포를 동정하고 태반 줄기세포를 다른 유형의 줄기세포로부터 구별하는데 쓰인다. 상기 태반 줄기세포가 CD73과 CD105를 발현할 수 있기 때문에, 이들은 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 지닐 수 있다. 그러나 이 태반 줄기세포는 태아 특이적 표지인 CD200과 HLA-G를 발현할 수 있기 때문에 중간엽 줄기세포, 예를 들어 골수 유래 중간엽 줄기세포와 같이 CD200과 HLA-G를 발현하지 않는 것들과는 구별할 수 있다. 마찬가지 방식으로 CD34, CD38 및/또는 CD45의 미발현으로부터 이 태반 줄기세포가 비조혈 줄기세포임을 알 수 있다. 그러나 태반 줄기세포의 몇몇 부분 집합은 예를 들어 CD34를 발현할 수 있고, 그럼에도 본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포로 볼 수 있다.

한 실시 태양에서 본 명세서에서는 복수의 태반 세포로부터 복수의 줄기세포를 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 CD200⁺또는 HLA-G⁺인 태반 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 이 때 상기 세포는 태반 줄기세포이다. 구체적인 실시 태양에서는 상기 선별이 CD200⁺이면서 HLA-G⁺인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 특정 실시 태양에서, 상기 선별은 또한 CD73⁺이고 CD105⁺이기도 한 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별은 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이기도 한 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별은 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이기도 한 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별은 또한 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺이고 CD105⁺이기도 한 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 실시 태양에서 상기 선별은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양할 때, 배아유사체 발생을 촉진하는 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.

다른 실시 태양에서는 분리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 구체적인 태양에서 이 세포군은 태반 세포군이다. 다른 구체적인 태양에서 이 세포군은 분리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 줄기세포군이다. 여러 실시 태양에서 상기 세포 중 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%는 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포이다. 바람직하게는 적어도 약 70%의 상기 세포가 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포이다. 더 바람직하게는 상기 세포 중 적어도 약 90%, 95% 또는 99%가 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포이다. 상기 분리된 세포군의 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^- 이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 또한 CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 실시 태양에서, 상기 분리된 세포군은 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포군을 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 때 상기 세포 중 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포이다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD73⁺이면서 CD105⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성하는 복수의 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는, 분리된 줄기세포로서 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 세포들을 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 부착성 태반 줄기세포이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에서, 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 상기 줄기세포가 촉진한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺인 태반 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포는 태반 줄기세포이다. 구체적 실시 태양에서 상기 선별 단계는 HLA-G⁺인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때 그 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 더 포함한다.

다른 실시 태양에서는 분리된 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 구체적인 태양에서 이 줄기세포는 태반 줄기세포이다. 다른 구체적인 태양에서 이 세포군은 분리된 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 줄기세포군이다. 여러 실시 태양에서 상기 세포 중 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺⁺ 줄기세포이다. 다른 실시 태양에서는 적어도 약 70%의 상기 세포가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 줄기세포이다. 다른 태양에서는 상기 세포 중 적어도 약 90%, 95% 또는 99%가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 줄기세포이다. 상기 분리된 세포군의 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 구체 태양에서 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺이다. 다른 실시 태양에서, 상기 세포군은 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포군을 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 때 상기 세포 중 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 줄기세포이다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 HLA-G⁺이기도 한 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이기도 한 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이기도 한 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 태반 세포군을 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포군을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 명세서에서는 또한 분리된 줄기세포로서 CD200⁺이고 OCT-4⁺인 세포를 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺인 세포이다. 한 구체적 태양에서는 이 줄기세포가 태반 줄기세포이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 구체적인 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성을 허용하는 조건 하에서, 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 상기 줄기세포가 촉진한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 CD200⁺, OCT-4⁺인 태반 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포는 태반 줄기세포이다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 HLA-G⁺이기도 한 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 선별 단계가 태반 줄기세포의 선별을 포함하는데, 이 태반 줄기세포는 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서, 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다.

다른 실시 태양에서는, CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 태반 줄기세포이다. 다른 구체적 태양에서는 이 세포군이 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기세포군이다. 여러 실시 태양에서는 상기 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%가 CD200⁺, OCT-4⁺줄기세포이다. 다른 실시 태양에서는 상기 세포의 적어도 약 70%가 CD200⁺, OCT-4⁺줄기세포이다. 다른 태양에서는 상기 세포의 적어도 약 90%. 95% 또는 99%가 CD200⁺, OCT-4⁺줄기세포이다. 상기 분리된 세포군의 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군이 하나 이상의 배아유사체를 형성한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포군을 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 세포군을 선별하는 단계를 포함하며, 이 때 상기 세포 중 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD200⁺, OCT-4⁺인 줄기세포이다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 또한 CD73⁺이고 CD105⁺이기도 한 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 HLA-G⁺이기도 한 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.

나아가 본 명세서에서는 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 분리된 줄기세포를 제공한다. 한 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 태반 줄기세포이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 OCT-4⁺이다. 다른 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 CD200⁺이다. 더 구체적인 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺이고 CD200⁺이다. 다른 구체적인 태양에서는 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 이 줄기세포가 상기 세포군으로부터 배아유사체 형성을 촉진한다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 태반 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포는 태반 줄기세포이다. 구체적 실시 태양에서 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 OCT-4⁺인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD200⁺인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺이고 CD200⁺인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때 그 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하기도 하는 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.

본 명세서에서는 나아가 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 구체적인 태양에서 이 줄기세포는 태반 줄기세포이다. 다른 구체적인 태양에서 이 세포군은 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 줄기세포군이다. 여러 실시 태양에서 상기 세포 중 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%는 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺⁺ 줄기세포이다. 다른 실시 태양에서는 적어도 약 70%의 상기 세포가 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 줄기세포이다. 다른 태양에서는 상기 세포 중 적어도 약 90%, 95% 또는 99%가 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 줄기세포이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 구체 태양에서 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 CD200⁺이다. 본 명세서의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포군을 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포군의 세포 대부분이 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 태반 세포군을 선별하는 단계를 포함한다. 구체적 실시 태양에서 상기 대부분의 세포는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이기도 하다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 대부분의 세포는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이기도 하다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 대부분의 세포는 또한 CD200⁺이기도 하다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 대부분의 세포는 또한 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺이고 CD200⁺이기도 하다.

다른 실시 태양에서는, CD73⁺이면서 CD105⁺인 분리된 줄기세포를 제공하는데, 이 줄기세포는 배아유사체의 형성을 촉진하는 조건 하에서 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때 이 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체의 형성을 촉진한다. 한 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 이 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 OCT-4⁺이다. 더 구체적인 태양에서는 이 줄기세포가 OCT4⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

나아가 본 명세서에서는 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 제공하는데, 이 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 태반 줄기세포이다. 다른 구체적 태양에서 상기 세포군은 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포인 태반 줄기세포군으로서, 상기 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 여러 실시 태양에서는 상기 분리된 태반 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 CD73⁺, CD105⁺줄기세포이다. 상기 세포군의 어느 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 상기 세포군을 증폭시키는데, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 적어도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 적어도 열다섯 차례 또는 적어도 스무 차례 계대한다.

나아가 본 명세서에서는 OCT-4⁺인 분리된 줄기세포를 제공하는데, 이 세포는 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진한다. 어느 구체적 실시 태양에서는 이 줄기세포가 CD73⁺, CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 CD200⁺이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

본 명세서에서는 또한 OCT-4⁺ 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 제공하는데, 이 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 어느 구체적 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 태반 줄기세포이다. 다른 구체적 태양에서 상기 세포군은 CD105⁺ 줄기세포인 태반 줄기세포군으로서, 상기 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 여러 실시 태양에서는 상기 분리된 태반 세포의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%가 OCT-4⁺줄기세포이다. 상기 세포군의 어느 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34^-, CD38^-또는 CD45^-이다. 다른 구체적 태양에서 상기 줄기세포는 CD200⁺이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 구체적인 실시 태양에서는 상기 세포군을 증폭시키는데, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 적어도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 적어도 열다섯 차례 또는 적어도 스무 차례 계대한다.

나아가 본 명세서에서는 효소 소화(2.3절을 보라)나 관류(2.4절을 보라)에 의하여 얻은 태반 줄기세포를 제공한다. 예를 들어 본 명세서에서는 분리된 태반 줄기세포군을 제공하는데, 이 세포군은 제대혈을 제거하고 관류하여 잔여 혈액을 없앤 포유동물 태반을 관류하는 단계, 상기 태반을 관류 용액으로 관류하는 단계, 관류 결과 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 포함하고 있는 상기 관류 용액을 수집하는 단계와 상기 세포군으로부터 복수의 상기 태반 줄기세포를 분리하는 단계들을 포함하는 한 방법에 따라 제조한다. 어느 구체적 실시 태양에서는 이 관류 용액을 탯줄 정맥과 탯줄 동맥 양쪽으로 통과시키고 이 용액이 태반에서 스며 나오면 이를 수집한다. 이 방법으로 얻은 태반 줄기세포군은 태아 모체 세포의 혼합물을 포함하는 것이 전형적인 경우이다. 다른 구체적 태양에서는 이 관류 용액을 제대 정맥으로 통과시킨 다음 제대 동맥에서 수집하거나 제대 동맥으로 통과시킨 다음 이를 제대 정맥에서 수집한다. 이 방법으로 얻은 태반 줄기세포군은 실질적으로 전부 태아 유래 세포인 것이 전형적인 경우인데, 즉 예를 들어 세포군 속 태반 줄기세포의 90%, 95%, 99% 또는 99.5%를 넘는 수가 태아 유래이다.

여러 실시 태양에서 태반을 관류하여 얻은 세포군 속에 포함된 태반 줄기세포는 상기 태반 세포군의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 적어도 99.5%이다. 다른 구체적 태양에서는 관류로 수집한 태반 줄기세포는 모체와 태아 세포를 포함한다. 다른 특정 태양에서는 관류로 수집한 태반 줄기세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 적어도 99.5%가 태아 세포이다.

본 명세서의 다른 구체적 태양에서는 관류로 수집한 분리된 태반 줄기세포군을 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 이 태반 줄기세포를 수집하는데 쓰이는 관류 용액을 적어도 일부분 포함한다.

나아가서 본 명세서에서는 본 명세서에서 기술하는 분리된 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포의 분리된 세포군을 제공하는데, 이 세포는 다음 단계를 포함하는 한 방법에 따라서 제조한다: 태반 조직을 조직 파괴성 효소로 소화하여 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 얻는 단계와 상기 태반 세포의 나머지로부터 복수의 태반 줄기세포를 분리해내는 단계. 태반의 전부 또는 어느 일부분이라도 소화시켜 태반 줄기세포를 얻을 수 있다. 구체적인 실시 태양에서는 예를 들어, 상기 태반 조직이 태반 전체, 양막, 융모막, 양막과 융모막의 조합 또는 이 모든 것의 조합이다. 다른 구체적인 태양에서는 상기 조직 파괴성 효소가 트립신이나 콜라겐 분해효소이다. 여러 실시 태양에서 태반을 소화하여 얻은 세포군 속에 포함된 태반 줄기세포는 상기 태반 세포군의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 적어도 99.5%이다.

유전자 발현 양상 분석(gene profiling)은 분리된 부착성 태반 줄기세포와 분리된 태반 줄기세포군을 다른 세포, 예를 들어 골수 유래 줄기세포 등의 중간엽 줄기세포와 구별할 수 있다는 것을 확인하여 준다. 본 명세서에서 기술하는 부착성 태반 줄기세포를 하나 이상의 유전자 발현을 바탕으로 구별할 수 있는데, 이러한 발현은 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교했을 때 태반 줄기세포나 제대 줄기세포에 특이적이다. 특히 부착성 태반 줄기세포를 하나 이상의 유전자 발현을 토대로 중간엽 줄기세포와 구별할수 있는데, 이들 유전자의 발현은 태반 줄기세포에서 중간엽 줄기세포에서보다 현저하게 더 높으며(즉 적어도 2배 이상), 이 때 상기 하나 이상의 유전자는 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A이거나 이 유전자의 모든 조합인데, 이 유전자의 발현은 태반 줄기세포나 제대 줄기세포에서 골수 유래 중간엽 줄기세포군보다 측정 가능하게 더 높은 수준이며, 이 때 이들 줄기세포는 동등한 조건에서 배양한 것이다. 구체적인 태양에서 태반 줄기세포 특이적 또는 제대 줄기세포 특이적 유전자는 CD200이다.

이들 유전자의 발현 수준은 태반 세포군의 동정(同定)을 확인하거나 어느 세포군이 적어도 복수의 태반 줄기세포를 함유한다고 동정하는 용도 등에 쓰일 수 있다. 태반 줄기세포군으로 동정이 확인된 세포군은 클론성, 예를 들어 하나의 태반 줄기세포로부터 증폭된 태반 줄기세포군이거나 줄기세포의 혼합 세포군, 예를 들어 여러 태반 줄기세포들로부터 증폭된 태반 줄기세포들만을 포함하는 세포군이거나 태반 줄기세포와 적어도 하나의 다른 세포 유형을 포함하는 세포군일 수 있다.

이들 유전자의 발현 수준은 부착성 태반 줄기세포를 선별하는데 쓰일 수 있다. 예를 들어 세포군, 일례로 클론 증폭한 세포는 상기 세포군 시료에서 하나 이상의 이들 유전자의 발현이 대등한 중간엽 줄기세포군보다 현저하게 더 높을 경우 선별된다. 이러한 선별은 복수의 태반 줄기세포군에서 유래한 세포군, 복수의 세포군에서 유래한 세포군 또는 그 정체를 모르는 세포군 등일 수 있다.

이러한 하나 이상의 유전자 발현 수준과 중간엽 줄기세포 대조군에서의 상기 하나 이상의 유전자 발현 수준을 비교하여 부착성 태반 줄기세포를 선별할 수 있다. 한 실시 태양에서는 동등한 수의 중간엽 줄기세포를 포함하는 시료에서 상기 하나 이상의 유전자가 발현되는 수준을 대조군으로 이용한다. 다른 태양에서는 소정의 조건하에서 시험하는 태반 줄기세포에 대한 대조군은 동일한 조건하의 중간엽 줄기세포에서 상기 하나 이상의 유전자가 발현되는 수준을 나타내는 수치이다.

전술한 비부착성 또는 부착성 태반 줄기세포의 분리된 세포군과 태반 줄기세포군은 일반적으로 대략, 적어도 또는 많아야 태반 줄기세포 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹개 또는 그 이상의 수의 줄기세포를 함유한다.

1.3 세포 배양하의 성장

본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포의 성장은, 모든 포유류 세포와 마찬가지로 세포 성장용으로 선택한 특정 배지에 부분적으로 달려있다. 최적 조건 하에서 태반 줄기세포는 3~5 일만에 배증하는 것이 전형적이다. 세포 배양 중에 본 발명에 따른 상기 태반 줄기세포는 배양 기질, 예를 들어 조직 배양 용기의 표면(조직 배양 접시 플라스틱, 피브로넥틴 피복 플라스틱 등)에 부착하여 단일 세포층을 이룬다.

본 발명의 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군은 적절한 조건 하에서 배양되었을 때 배아유사체(embryoid-like body), 즉 상기 부착 줄기세포층 위로 세포가 자란 3차원적 덩어리를 형성한다. 상기 배아유사체 내부의 세포는 아주 초기의 줄기세포와 연관된 표지, 예를 들어 OCT-4, Nanog, SSEA3와 SSEA4를발현한다. 상기 배아유사체 내부의 세포는 배양 기질에 부착하지 않는 것이 전형적인 경우이고, 이는 본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포도 마찬가지이지만, 배양 도중에서는 부착 세포에 달라붙은 채로 있다. 배아유사체 세포는 생존을 위하여 부착 태반 줄기세포에 의존하는데, 배아유사체는 부착 줄기세포의 부재하에서는 형성되지 않는다. 상기 부착 태반 줄기세포는 따라서 부착 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군 속에서 하나 또는 그 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다. 어떤 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 이 배아유사체 세포는 배아 줄기세포가 피더(feeder) 세포층 위에 자라는 것처럼 부착 태반 줄기세포 위에서 성장하는 것으로 생각된다. 골수 유래 중간엽 줄기세포 등의 중간엽 줄기세포는 배양시 배아유사체를 형성하지 않는다.

2. 태반 줄기세포를 얻는 방법

2.1 줄기세포 수집용 조성액

본 발명은 나아가 태반 줄기세포를 수집하고 분리하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 줄기세포는 생리학적으로 적합한 용액, 예를 들어 줄기세포 수집용 조성액(stem cell collection composition)을 이용하여 포유류 태반으로부터 얻게 된다. 줄기세포 수집용 조성액은 2005년 12월 29일자 관련 미국 예비 출원 제60/754,969호 "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"에 자세하게 기재되어 있다.

줄기세포 수집용 조성액은 줄기세포의 수집 및/또는 배양에 적당한 모든 생리학적으로 적합한 용액을 함유할 수 있는데, 여기에는 식염수(예를 들어 인산염 완충 식염수, Kreb 용액, 변형 Kreb 용액, Eagle 용액, 0.9% NaCl 등), 배양 배지(DMEM, H.DMEM 등) 등이 있다.

줄기세포 수집용 조성액은 태반 줄기세포를 보존하는 성질이 있는 성분을 하나 이상 갖추고 있는데, 보존이란 즉 수집으로부터 시작하여 배양시까지 태반 줄기세포의 사멸을 막거나, 사멸을 지연하거나, 세포군 속에서 사멸하는 태반 줄기세포의 수를 줄이거나 하는 등의 특성이다. 이러한 성분으로는 세포자멸사 억제제(예를 들어 카스파제(caspase) 억제제, JNK 억제제), 혈관 확장제(vasodilator, 예를 들어 황산마그네슘, 혈압 강하제, 심방 나트륨 이뇨 펩티드(atrial natriuretic peptide, ANP), 부신피질자극호르몬, otropin), 피질자극호르몬 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨(sodium nitroprusside), 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘, 인산디에스테르 가수분해 효소 억제제 등), 세포 괴사 억제제(예를 들어 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노말레이미드, 디티오카르밤산피롤리딘 또는 클론아제팜), TNF-α 억제제 및/또는 산소 운반성 퍼플루오로카본(브롬화퍼플루오로옥틸, 브롬화퍼플루오로데실 등)을 들 수 있다.

줄기세포 수집용 조성액은 금속단백 분해효소, 세린 단백질 가수분해 효소, 중성 단백질 가수분해 효소, 리보핵산 가수분해효소, 디옥시리보핵산 가수분해 효소 등의 조직 분해 효소를 하나 이상 갖출 수 있다. 이러한 효소에는 콜라겐 분해 효소(예를 들어 콜라겐 분해효소 I, II, III 또는 IV, Clostridium histolyticum 유래 콜라겐 분해 효소 등), 디스파제(dispase), 터모리신(thermolysis), 엘라스타제, 트립신, 리버라제(LIBERASE), 히알루로니다제(hyaluronidase) 등이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

줄기세포 수집용 조성액은 살균 또는 정균(靜菌 bacteriostatic) 용도에 유효한 분량의 항생제를 포함할 수 있다. 몇몇 비제한적 실시 태양에서, 이 항생제는 마크롤리드(macrolide, 예를 들어 토브라마이신(tobramycin)), 세팔로스포린(예를 들어 세팔렉신(cephalexin), 세프라딘(cephradine), 세프록심(cefuroxime), 세프로질(cefprozil), 세파클로(cefaclor), 세픽심(cefixime) 또는 세파드록실(cefadroxil), 클라리트로마이신(clarithromycin), 에리드로마이신, 페니실린(페니실린 V 등) 또는 퀴놀론(오플록사신(ofloxacin), 시프로플락신(ciproflaxin) 또는 노르플록사신(norfloxacin)), 테트라사이클린, 스트렙토마이신이다. 특정 실시 태양에서, 이 항생제는 그램 양성 및/또는 그램 음성 세균, 예를 들어 Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus 등에 대한 활성이 있다.

줄기세포 수집용 조성액은 다음 화합물을 하나 이상 갖추고 있을 수 있다:

아데노신(약 1 mM에서 약 50 mM로), D-포도당(약 20 mM에서 약 100 mM), 마그네슘 이온(약 1 mM에서 약 50 mM), 분자량 20,000 달톤을 넘는 거대분자(예를 들어 합성 또는 천연 콜로이드, 덱스트란 등의 다당류 도는 폴리에틸렌 글리콜)로서 한 실시 태양에서는 내피의 정상적인 상태와 세포 생존능을 유지하기에 충분한 분량(약 25 g/L에서 약 100 g/L, 또는 약 40 g/L에서 약 60 g/L), 항산화제(예를 들어 약 25 μM 내지 약 100 μM 농도의 부틸화 수산화아니솔, 부틸화 수산화톨루엔, 글루타티온, 비타민 C 또는 비타민 E), 환원제(예를 들어, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM 농도의 N-아세틸시스테인), 세포로의 칼슘 유입을 방지하는 제제(약 2 μM 내지 약 25 μM의 베라파밀(verapamil)), 니트로글리세린(예를 들어 약 0.05 g/L 내지 약 0.2 g/L), 항응고제로서 한 실시 태양에서는 잔류 혈액의 응고를 막기에 충분한 양(예를 들어 헤파린 또는 히루딘 약 1000 단위/L 내지 약 100,000 단위/L), 또는 아밀로리드(amiloride) 함유 화합물(예를 들어 아밀로리드, 아밀로리드에틸이소프로필, 아밀로리드헥사메틸렌, 아밀로리드디메틸 또는 아밀로리드이소부틸 약 1.0 μM 내지 약 5 μM).

2.2 태반의 수집과 취급

일반적으로 사람 태반은 출산 후 태반을 압박 방출한 직후에 회수된다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 태반은 환자의 완전한 병력을 얻은 후 이를 그 태반에 연관지은 다음 환자에게 충분한 설명 이후 동의를 받아서 회수된다. 이러한 병력 기록은 분만 이후에도 계속 기록되는 것이 바람직하다. 이러한 병력 기록은 태반 또는 그로부터 얻은 줄기세포의 후속 이용을 조화시키는데 쓰일 수 있다. 예를 들어, 사람 태반 줄기세포는 병력을 감안하여, 상기 태반에 관련된 신생아 또는 그 신생아의 부모, 형제나 다른 친척의 개인화된 의료(personalized medicine)에 쓰일 수 있다.

태반 줄기세포의 회수 전에 제대혈과 태반 혈액을 제거하게 된다. 몇몇 실시 태양에서 분만 후 태반 속 제대혈을 제거하게 된다. 이러한 태반에 대해서는 통상적인 제대혈 회수 방법을 사용할 수 있다. 바늘 또는 카뉼라(cannula)를 써서, 중력을 이용하여 태반을 실혈(exsanguination)하는 것이 전형적이다(Anderson의 미국 특허 제5,372,581호, Hessel 외 미국 특허 제5,415,665호를 보라). 이 바늘 또는 카뉼라는 탯줄 정맥에 대개 놓이고 되고, 태반을 부드럽게 마사지하여 제대혈이 태반으로부터 빠져나오는 것을 돕는다. 이러한 제대혈 회수법은 상업적으로, 예를 들어 미국 뉴저지주 Cedar Knolls의 LifeBank Inc., ViaCord, Cord Blood Registry나 Cryocell을 통하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 이러한 태반을 다른 조작 없이 중력만으로 방혈시켜 제대혈 회수 과정에서의 조직 손상을 최소화한다.

태반은 제대혈을 회수하고 줄기세포를 수집하기 위한 예를 들어 관류 또는 조직 분리를 위하여 분만 장소나 분만실로부터 다른 장소, 예를 들어 실험실로 운반되는 것이 전형적인 경우이다. 이러한 태반은 멸균되고, 단열된 운반 장비(태반 온도를 20~28℃로 유지), 예를 들어 멸균 집록(zip-lock) 플라스틱백에 태아에 가까운 부위의 탯줄을 집게로 집은 태반을 단열 용기에 담아서 운반되는 것이 바람직하다. 다른 실시 태양에서 이러한 태반은 2005년 9월 19일 출원 미국 특허 출원 제11/230,760에 기술된 것과 실질적으로 같은 제대혈 수집 키트에 담겨 운반된다. 이 태반은 분만 후 4~24 시간 안에 실험실로 운반되는 것이 바람직하다. 몇몇 실시 태양에서 태아에 가까운 쪽 탯줄을 집게로 집게 되는데, 이때 제대혈 회수 전에 태반 원반(placental disk)의 삽입 지점으로부터 4~5 cm 내 위치를 집는 것이 바람직하다. 다른 실시 태양에서 태아에 가까운 쪽 탯줄은 제대혈 회수 후이고 태반의 후속 처리 전에 집게로 집히게 된다.

줄기세포 수집 전에 태반을 멸균 조건에서 실온 또는 5~25℃의 온도에서 저장할 수 있다. 이러한 태반은 48 시간보다 더 긴 기간 동안 저장될 수도 있으며, 바람직하게는 잔류 제대혈을 모두 제거하기 위한 태반 관류 4~24 시간 전까지 저장하게 된다. 이 태반은 5~25℃ 온도에서 항응고제 용액 속에 저장되는 것이 바람직하다. 적절한 항응고제 용액은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 헤파린 또는 워페린나트륨(warfarin sodium)을 쓸 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 이 항응고제 용액은 헤파린 용액(예를 들어 1:1000 희석 용액에서 1% w/w)을 포함한다. 이렇게 실혈된 태반의 저장 시간은 태반 줄기세포를 수집하기 36 시간 전을 넘기지 않는 것이 바람직하다.

위에 기술한 취지대로 수집과 준비를 마친 포유류 태반 또는 그의 일부분으로부터 종래 기술에 따른 모든 방법, 예를 들어 관류 또는 하나 이상의 조직 파괴 효소를 이용한 소화 등의 파괴에 의하여 줄기세포를 얻을 수 있다.

2.3 태반 조직의 물리적 파괴와 효소 소화

한 실시 태양에서, 줄기세포는 물리적 파괴, 예를 들어 태반의 효소 소화에 의하여 포유류 태반으로부터 얻어진다. 본 발명에 따른 줄기세포 수집용 조성액에 접촉하고 있는 채로 이 태반 또는 그 일부분을 예를 들어, 갈거나, 잡아 떼거나, 저미거나, 네모난 조각으로 썰거나, 잘게 썰거나, 액체에 담그어 연화시키는 등으로 처리할 수 있고 이어 하나 이상의 효소로 조직을 소화할 수 있다. 이러한 태반 또는 그 일부분을 하나 이상의 효소로 물리적으로 파괴하고 소화하여, 얻은 물질을 본 발명의 상기 줄기세포 수집용 조성액에 담그거나 섞을 수 있다. 예를 들어 트리판블루 배제법에 의하여 측정한 상기 장기 속의 세포 중 생존 세포 비율이 다수인 한, 바람직하게는 과반수인 한, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%인 한 어떠한 물리적 파괴법도 사용할 수 있다.

태반은 물리적 파괴 및/또는 효소 소화와 줄기세포 회수 단계 전에 구성 성분들로 나뉠 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기세포는 양막, 융모막, 태반엽, 또는 이들의 모든 조합으로부터 얻을 수 있다. 제대 줄기세포들 또한 본 발명의 방법에 쓰일 수 있다. 특정 실시 태양에서, 태반 줄기세포는 양막과 융모막을 함유한 태반 조직에서 얻는다. 태반 줄기세포는 태반 조직의 작은 덩어리, 예를 들어 부피가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80. 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 약 1000 ㎣인 태반 조직의 덩어리를 파괴하여 얻는 것이 전형적인 경우이다.

바람직한 줄기세포 수집용 조성액은 조직 파괴 효소를 하나 이상 갖추고 있다. 효소 소화는 여러 효소의 조합, 예를 들어 매트릭스 금속단백 분해 효소와 중성 단백질 분해 효소나 예를 들어 콜라겐 분해 효소와 디스파제의 조합을 이용하면 바람직하다. 한 실시 태양에서는 히알루론산의 소화를 위하여 태반 조직의 효소 소화에서 금속단백 분해 효소, 중성 단백 분해 효소와 점액 용해성(mucolytic) 효소의 조합을 사용하는데, 이를 테면 콜라겐 분해 효소, 디스파제와 히알루로니다제의 조합 또는 LIBERASE(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재 베링거 만하임 회사)과 히알루로니다제의 조합으로 이루어진 효소 조합을 사용한다. 태반 조직 파괴에 쓰일 수 있는 다른 효소로는 파파인, 디옥시리보핵산 가수분해효소와 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제 등의 세린 단백 분해 효소를 들 수 있다. 세린 단백 분해 효소는 혈청 속 알파-2-마이크로글로불린에 의하여 억제될 수 있으므로 소화에 사용되는 배지는 혈청이 포함되어 있지 않아야 한다. EDTA와 디옥시리보핵산 분해 효소는 세포 회수율을 높이기 위하여 효소 소화에 흔히 사용된다. 끈적한 소화물 속에 줄기세포가 갇히는 일을 막기 위하여 소화물을 희석하는 것이 바람직하다.

조직 소화 효소의 모든 조합을 사용할 수 있다. 조직 소화 효소의 전형적인 농도로는 예를 들어 콜라겐 분해 효소 I과 IV의 경우 50~200 단위/mL, 디스파제의 경우 10 단위/mL, 엘라스타제의 경우 10~100 단위/mL를 들 수 있다. 태반 줄기세포를 방출하기 위하여 단백질 분해 효소를 조합하여, 즉 둘 이상의 단백질 분해 효소를 같은 효소 소화 반응에 사용하거나, 순서대로 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시 태양에서는 태반 또는 그 일부분을 30 분 동안 적절한 양의 2 mg/mL 콜라겐 분해 효소 I로 먼저 소화시킨 다음, 37℃에서 10 분 동안 0.25% 트립신으로 소화한다. 다른 효소를 사용한 다음 이어서 세린 단백 분해 효소를 이용하는 것이 바람직하다.

다른 실시 태양에서 상기 줄기세포를 함유하는 상기 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 수집용 조성액에서 줄기세포를 분리하기 전에 이 조직을 파괴 및/또는 소화한 용액에, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌글리콜 비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 가하여 이 조직을 더 파괴할 수 있다.

온전한 태반 또는 태아와 모체 세포 양쪽을 포함하는 그 태반의 일부(예를 들어, 태반에서 융모막과 태반엽을 함유하는 부분)를 이용하는 경우, 수집한 상기 태반 줄기세포는 모체와 태아 양쪽에서 유래한 태반 줄기세포를 포함한다는 것을 이해할 필요가 있다. 모체 세포(양막 등)를 전혀 가지고 있지 않거나 또는 무시할 수 있는 정도로 가지고 있는 태반의 일부분이 쓰인 경우는 수집한 상기 태반 줄기세포가 거의 전적으로 태아 태반 줄기세포이다.

3.4 태반 관류

태반 줄기세포는 또한 포유류 태반을 관류하여 얻을 수 있다. 포유류 태반을 관류하여 줄기세포를 얻는 방법, 예를 들어 Hariri의 미국 출원 공보 제2002/0123141호와 2005년 12월 29일자의 관련 미국 예비출원 제60/754,969호 "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs"에 개시되어 있다.

태반 줄기세포는 관류로써, 이를 테면 관류 용액으로서 줄기세포 수집용 조성액을 이용하여 태반 혈관계를 관통하여 얻을 수 있다. 한 실시 태양에서는 배꼽 동맥과 배꼽 정맥 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 관류 용액을 흘려보냄으로써 포유류 태반을 관류할 수 있다. 관류 용액을 태반에 흘려보내는 것은 예를 들어 중력을 이용하여 태반으로 흐르게 함으로써 이룰 수 있다. 바람직하게는, 이 관류 용액을 연동(連動 peristaltic) 펌프 등의 펌프를 이용하여 강제로 태반에 주입한다. 배꼽 정맥은 예를 들어 멸균 도관(tubing)과 같은 살균된 연결부에 이어진 테플론 또는 플라스틱 재질 카뉼라 등의 카뉼라로 삽관될 수 있다. 이러한 살균된 연결부는 관류 매니폴드(manifold)에 연결된다.

관류를 준비하면서 태반은 배꼽 동맥과 배꼽 정맥이 태반의 가장 높은 지점에 자리하도록 놓는(예를 들어 매달아 두는) 것이 바람직하다. 이 태반은 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액 등의 관류 용액을 태반 혈관계 또는 태반 혈관계와 주변 조직에 통과시켜 관류할 수 있다. 관류 용액을 제대 정맥에 통과시키고 제대 동맥에서 수집하거나 관류 용액을 제대 정맥에 통과시키고 제대 정맥에서 수집함으로써 이 태반을 관류할 수도 있다.

한 실시 태양에서는 예를 들어 배꼽 동맥과 배꼽 정맥이 동시에 피펫에 연결되어 있는데, 이 피펫은 유연한 연결부를 통하여 관류 용액 저장소에 이어져 있다. 이 관류 용액은 배꼽 정맥과 동맥으로 흘러간다. 이 관류 용액은 상기 혈관들로부터 태반 주변 조직으로 스며나오고/스며나오거나 이들 혈관을 따라 주변 조직으로 흘러들어가며, 태반 표면으로부터 임신 도중 자궁에 붙인 적당한 열린 용기 속에 모이게 된다. 이 관류 용액은 한편 탯줄의 구멍을 통하여 주입할 수도 있으며, 모체 자궁벽에 접하고 있는 태반의 벽에 있는 구멍 속으로 흘러들어가거나 구멍으로부터 걸러나올 수 있다. "걸러냄(pan) 법"이라고 부를 수 있는 이 방법에 의하여 수집한 태반 세포는 태아와 모체 유래 세포의 혼합물인 것이 전형적인 경우이다.

다른 실시 태양에서는 이 관류 용액으로 하여금 배꼽 정맥을 지나게 하여 배꼽 동맥에서 모으거나 배꼽 동맥을 지나게 하여 배꼽 정맥에서 모을 수 있다. "폐쇄 회로법"이라고 부를 수 있는 이 방법에 의하여 수집한 태반 세포는 거의 전적으로 태아 유래 세포인 것이 전형적인 경우이다.

상기 걸러냄 법을 이용하는 관류, 즉 관류물이 태반의 모체 쪽으로부터 스며나온 뒤 이를 수집하는 방법은 모체와 태아 세포의 혼합물을 낳는다는 점을 주지하여야 한다. 그 결과 이 방법으로 수집한 세포는 태아와 모체 유래 태반 줄기세포들을 모두 갖춘 혼합 세포군을 포함하고 있다. 이에 반하여 상기 폐쇄 회로법의 태반 혈관계만을 통한 관류에서는 관류 용액이 한두 개의 태반 혈관을 통과하고 오로지 나머지 혈관을 통하여 수집하게 되므로 거의 전적으로 태아 유래의 태반 줄기세포군을 수집할 수 있다.

한 실시 태양에서 상기 폐쇄 회로법의 관류는 다음과 같이 이루어질 수 있다. 분만 후 약 48시간 이내에 분만후 태반을 구한다. 탯줄을 집게로 집고 집게 위쪽을 잘라낸다. 이 탯줄은 버리거나 제대 줄기세포 등을 회수하고/회수하거나 생체 재료 생산을 위한 제대막을 위하여 처리할 수 있다. 양막을 관류하는 동안 태반 속에 두거나 예를 들어 손가락을 이용한 무딘 절개(blunt dissection)로 융모막으로부터 떼어낼 수 있다. 만약 양막을 관류 전에 융모막으로부터 떼어내려면 이 양막을 버리거나, 예를 들어 효소 소화에 의하여 줄기세포를 얻기 위하여 처리하거나, 예를 들어 양막 생체 재료를 생산하기 위하여 처리할 수 있는데, 일례로 이 생체 재료는 미국 출원 공보 제2004/0048796호에 기재되어 있다. 눈에 보이는 모든 피떡과 잔류 혈액을 태반으로부터, 예를 들어 멸균 거즈로 씻어 낸 다음, 제대 혈관을 노출, 예를 들어 제대막을 부분적으로 잘라 탯줄의 단면을 노출시킨다. 이 혈관들을 확인하고 예를 들어 닫힌 엘리게이터 집게(closed alligator clamp)를 각 혈관의 잘린 쪽 끝을 통하여 밀어 넣음으로써 혈관을 벌려 연다. 이어서 기구, 예를 들어 관류 장치나 연동 펌프(peristaltic pump)에 연결된 플라스틱 관을 각 태반 동맥 속에 삽입한다. 이 펌프로는 용도에 맞는 어떠한 펌프라도 선택할 수 있는데, 예를 들어 연동 펌프이다. 멸균 수집 저장소(collection reservoir) 예를 들어 250 mL 수집용 백 등의 혈액 백에 연결된 플라스틱 관을 상기 태반 정맥 속에 삽입한다. 대안적으로 상기 펌프에 연결된 관을 태반 정맥에 삽입하고 수집 저장소에 이어진 관을 한 쪽 또는 양쪽 태반 동맥에 삽입할 수도 있다. 태반을 이어서 소정량의 관류 용액, 예를 들어 관류 용액 750 mL로 관류한다. 이어서 이 관류물 속의 세포를 수집하는데, 예를 들어 원심분리한다.

한 실시 태양에서 태아쪽 탯줄은 관류 동안 집게로 집히게 되며, 더 바람직하게는 태반 원반에 탯줄이 삽입되는 지점에서 4~5 cm 이내 위치에서 집게로 집히게 된다.

실혈(exsanguination) 과정에서 포유류 태반으로부터 처음 얻은 관류액은 제대혈 및/또는 태반 혈액의 잔류 적혈구 때문에 색깔을 띠는 것이 일반적이다. 이 관류액은 관류가 진행됨에 따라서 색깔이 옅어지며, 잔류 제대혈 세포들은 태반에서 씻겨 나간다. 일반적으로 태반을 처음에 실혈하는데는 30에서 100 mL의 관류액이면 충분하지만 관측된 결과에 따라 관류액의 양을 가감할 수 있다.

태반 줄기세포를 수집하는데 쓰이는 관류액의 양은 수집할 줄기세포의 수, 태반의 크기, 한 태반에서 수집할 회수 등에 따라 달라진다. 많은 실시 태양에서, 관류액의 양은 50 mL 내지 5000 mL, 50 mL 내지 4000 mL, 50 mL 내지 3000 mL, 100 mL 내지 2000 mL, 250 mL 내지 2000 mL, 500 mL 내지 2000 mL 또는 750 mL 내지 2000 mL이다. 실혈 후 700~800 mL의 관류액으로 태반을 관류하는 것이 전형적인 경우이다.

태반을 여러 시간 또는 여러 날에 걸쳐서 여러 번 관류할 수 있다. 여러 번 태반을 관류하는 경우, 무균 조건하의 용기 또는 적절한 담체 속에서 태반을 유지하고 배양하고 항응고제(예를 들어 헤파린, 워페린나트륨, 쿠마린, 비스히드록시쿠마린)를 포함하거나 포함하지 않은 줄기세포 수집용 조성액 또는 표준 관류 용액(예를 들어 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 정상적인 식염수)으로 관류할 수 있는데, 이 조성액 또는 관류 용액은 항생제(예를 들어 β-메르캅토에탄올(0.1 mM)이나 스트렙토마이신(예를 들어 40~100 μg/mL 농도로), 페니실린(예를 들어 40 단위/mL), 암포테리신 B(예를 들어 0.5 μg/mL) 둥의 항생제)를 더 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 한 실시 태양에서 분리된 태반은 관류된 액체를 수집하지 않은 채로 일정 기간 유지되거나 배양되는데, 여기서 이 태반은 관류와 관류물 수집 이전에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안, 혹은 이틀, 사흘 또는 더 오랜 동안 유지되거나 배양된다. 이렇게 관류된 태반은 한 번 또는 여러 번에 걸쳐 유지될 수 있는데, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안 혹은 더 오랜 동안 유지할 수 있고, 이어서 두 번째 관류, 예를 들어 700~800 mL의 관류액으로 관류될 수 있다. 이 태반을 1, 2, 3, 4, 5회 또는 더 많이 관류할 수 있는데, 예를 들어 매 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간마다 관류할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 태반의 관류와 관류 용액, 예를 들어 줄기세포 수집용 조성액의 수집은 회수한 유핵 세포 수가 100 세포/mL보다 아래로 떨어질 때까지 반복된다. 서로 다른 시점에서 얻은 관류물을 개별적으로 더 처리하여 시간 의존적인 세포군, 예를 들어 줄기세포군을 회수할 수도 있다. 서로 다른 시점에서 얻은 관류물을 한 데 모을 수도 있다.

특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 태반을 실혈 후 충분한 시간 동안 관류한 다음에 태반 줄기세포는 실혈되고 관류된 태반의 미세혈액순환 속으로 옮겨가서 본 발명의 방법에 따라 채집되는 것으로 생각되는데, 채집은 관류에 의하여 수집 용기 속으로 씻어넣는 방식이 바람직하다. 분리된 태반을 관류하면 잔류 제대혈을 제거할 수 있을 뿐 아니라 태반에 산소를 포함하는 적절한 양분을 공급할 수 있다. 이 태반은 배양되거나 제대혈을 제거하는데 쓰인 것과 유사한 용액으로 관류될 수 있는데, 이 용액에는 항응고제를 넣지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법으로 관류하면 포유류 태반을 상기 용액으로 관류하지 않고, 줄기세포를 얻기 위하여 다른 처리(예를 들어 효소 소화 등의 조직 파괴)를 하지도 않은 경우와 견주었을 때보다 유의미하게 더 많은 수의 줄기세포를 포유류 태반에서 얻을 수 있다. 여기서 "유의미하게 더 많은"이란 적어도 10% 이상 더 많은 것을 뜻한다. 본 발명에 따라 관류하면 유의미하게 더 많은 태반 줄기세포를 얻을 수 있는데, 예를 들어 태반 또는 그 일부분이 배양된 배양 배지로부터 얻을 수 있는 태반 줄기세포 수보다 더 많다.

줄기세포는 하나 이상의 단백 분해 효소 또는 다른 조직 파괴성 효소를 갖추고 있는 용액으로 관류하여 분리할 수 있다. 특정 실시 태양에서, 태반 또는 그 일부분(예를 들어 양막, 양막과 융모막, 태반 소엽(placental lobule) 또는 태반엽 혹은 이들의 모든 조합)의 온도는 25~37℃로 조절되고, 이를 200 mL의 배양 배지 속에서 하나 이상의 조직 파괴성 효소와 30 분 동안 배양하게 된다. 이 관류물로부터 세포를 수집하고, 4℃로 식힌 다음, 5 mM EDTA, 2 mM 디티오트레이톨과 2 mM 베타메르캅토에탄올을 함유하는 차가운 억제제 혼합물로 세척한다. 몇 분 후 줄기세포를 찬(예를 들어 4℃) 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액으로 세척한다.

2.5 태반 관류물과 태반 관류물 세포

태반 관류물과 태반 관류물 세포, 예를 들어 태반 관류물에서 분리한 총 유핵세포는 이질적인 세포들을 수집한 혼합물이다. 태반 관류물과 태반 관류물 세포들로부터 사용 전에 적혈구를 제거하는 것이 전형적이다. 이러한 제거에는 적혈구를 유핵세포로부터 분리해내는 공지 방법을 이용할 수 있다. 몇몇 태양에서는 이 태반 관류물 또는 관류물 세포를 냉동 보존한다. 다른 실시 태양에서는 태반 관류물 또는 관류물 세포가 태아 세포만을 함유하거나 태아 세포와 모체 세포의 조합을 함유한다.

1회의 태반 관류에서 얻은 태반 관류물은 전형적으로 약 1억 개에서 약 5억 개의 유핵세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 태반 관류물나 관류물 세포가 CD34⁺ 세포를 함유하는데, 예를 들어 조혈 줄기세포 또는 전구세포이다. 이러한 세포는 더 구체적인 실시 태양에서 CD34⁺CD45^-줄기 또는 전구세포, CD34⁺CD45⁺줄기 또는 전구세포, 골수 전구세포, 림프 전구세포 및/또는 적혈구 전구세포를 함유할 수 있다. 다른 태양에서는 태반 관류물과 태반 관류물 세포가 부착성 태반 줄기세포, 예를 들어 CD34^- 줄기세포, 예를 들어 상기 1절에서 기술한 부착성 태반 줄기세포를 함유한다. 다른 태양에서는 태반 관류물과 태반 관류물 세포가 예Fmf 들어 내피 전구세포, 골 전구세포와 자연세포 독성 세포를 함유한다. 몇몇 실시 태양에서는 태반에서 수집한, 적혈구가 제거된 태반 관류물이나 그러한 관류물에서 분리한 관류물 세포가 예를 들어 FACS 분석 등의 흐름 세포 측정법으로 측정하였을 때 자연 세포 독성세포(CD3^-, CD56⁺)를 약 6~7%, T 세포를 약 21~22%(CD3⁺), B 세포를 약 6~7%(네스틴⁺), 조혈 전구세포를 약 2~5%(CD34⁺) 그리고 부착성 태반 줄기세포를 0.5~1.5%(예를 들어 CD34^-, CD117^_, CD105⁺, CD44⁺) 함유한다.

사람 태반 관류물 속 CD34⁺ 줄기 또는 전구세포는 혈관 신생 관련 표지, 예를 들어 CD31, VEGF-R 및/또는 CXCR4를 제대혈에서 분리한 동등한 수의 CD34⁺ 세포보다 측정 가능하게 더 높은 수준으로 발현한다. 몇몇 실시 태양에서는 1회 관류에서 얻은 사람 태반 관류물 단핵 세포를 VEGF 함유 ENDOCULT(등록상표, CFU-Hill 콜로니 성장을 위하여, StemCell Technologies, Inc.) 배지에서 배양하면 최대 약 20개, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 CFU-Hill 콜로니(내피세포의 전구세포)를 형성한다. 액상의 배지 속에서CFU-Hill 콜로니가 발생하는 것은 예를 들어 사람 태반 관류물 등에서 얻은 내피 전구세포가 디아세틸화 저밀도 지단백질(Dil-acLDL)을 흡수하는 것을, 예를 들어 ENDOCULT(등록상표) 배지 속에서 7일 배양 후에 측정함으로써 증명하고 평가할 수 있다.

게다가 사람 태반 관류물 유래 CD34⁺CD45^-세포는 혈관 신생 관련 표지인 CD31 및/또는 VEGFR를 CD34⁺CD45⁺ 세포보다 측정 가능하게 더 높은 수준으로 발현한다.

태반 관류물과 관류물 세포는 MHC 클래스 I의 발현이 제대혈 세포보다 낮은 것이 전형적이며, MHC 클래스 II 표지에 대해서도 대개 음성이다.

2.6 태반 줄기세포의 분리, 분류와 특성 파악

효소 소화 방식이건 관류에 의하여 얻은 것이건 관계 없이, 포유류 태반에서 얻은 줄기세포는 처음에 피콜(Ficoll) 농도구배 원심분리를 하여 다른 세포로부터 정제할 수 있다. 이러한 원심분리는 원심분리 속도 등에 관한 모든 표준적인 실험 방법에 따라 이루어질 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 태반에서 수집한 세포를 관류물에서 5000×g로 15분 동안 실온에서 원심분리하여 회수하는데, 이러한 원심분리로 파편이나 혈소판 등으로부터 줄기세포를 분리해낸다. 다른 실시 태양에서 태반 관류물은 약 200 mL로 농축되어, 피콜 위에 가해져 층을 이루고, 22℃에서 20분 동안 약 1100×g로 원심분리되어, 세포의 저밀도 계면층을 후속 처리를 위하여 수집하게 된다.

세포 펠렛은 신선한 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 유지에 적합한 배지, 예를 들어 2 단위/mL 헤파린과 2 mM EDTA를 함유한 IMDM 무혈청 배지(미국 뉴욕주 GibcoBRL)에 재현탁된다. 단핵 세포 총분획을 이를 테면 Lymphoprep(노르웨이 오슬로 Nicomed Pharma사) 등으로 (제조사의 설명에 따라) 분리한다.

본 명세서에서 태반 줄기세포의 "분리"란 처리하지 않은 포유류 태반 속에서 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 제거하는 것을 뜻한다. 한 장기에서 얻은 줄기세포를 포함하는 세포군은 처리하지 않은 상태의 그 장기 속에서 그 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50% 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다.

관류나 소화에 의하여 얻은 태반 세포는 예를 들어 차등 트립신 처리(differential trypsinization)로 더 분리되거나, 처음에 이를 이용하여 분리할 수 있는데, 여기서는 0.2% EDTA를 함유한 0.05% 트립신 용액(미국 미주리주 세인트루이스 Sigma사)을 사용한다. 차등 트립신 처리는 태반 줄기세포가 플라스틱 표면으로부터 약 5분 이내에 탈착하는데 반하여 다른 부착 세포군은 20~30 분보다 더 많은 배양 시간을 요하는 것이 전형적인 경우이기 때문에 가능하다. 탈착된 태반 줄기세포는 트립산 처리와 트립신 중화 용액(Cambrex사의 TNS) 등을 이용한 트립신 중화 처리 후에 수집할 수 있다. 부착 세포를 분리하는 한 실시 태양에서는 예를 들어, 5~10×10⁶ 개의 세포를 담은 분액을 여러 개의 T-75 플라스크에 각각 나누어 담게 되는데, 피브로넥틴 피복 T-75 플라스크가 바람직하다. 이 실시 태양에서는 세포를 시판되는 중간엽 줄기세포 성장 배지(Cambrex사의 MSCGM)으로 배양하고 조직 배양기(37℃, 5% CO₂) 속에 놓을 수 있다. 10~15 일 후 PBS 세척으로 비부착 세포를 상기 플라스크로부터 제거한다. 이어 PBS를 MSCGM으로 대체한다. 바람직하게는 플라스크를 날마다 점검하여 다양한 부착 세포 유형을 확인하는데, 특히, 섬유모세포 유형의 세포를 확인하고 세포군의 증폭 여부를 점검한다.

포유류 태반에서 수집한 세포의 수와 종류는 예를 들어 흐름세포 측정법, 세포 분류법, 면역세포화학(예를 들어 조직 특이적 또는 세포 표지 특이적 항체로 세포를 염색하는 것), 형광표지 세포 분리(FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준적인 세포 검출법을 이용한 세포 형태와 세포 표면 표지의 변화를 측정함으로써, 또는 빛이나 공초점 현미경을 이용한 세포 형태 분석 및/또는 PCR과 유전자 발현 분석(profiling) 등의 공지 기술을 이용한 유전자 발현 변화를 측정함으로써 감시할 수 있다. 이러한 방법은 하나 또는 그 이상의 특정 표지에 대하여 양성인 세포를 확인하는 데에도 쓰일 수 있다. 예를 들어 상기 방법에 따라 CD34에 대한 항체를 이용하면 어느 세포가 CD34를 측정 가능한 양으로 함유하는지 알 수 있는데, 그러할 경우 이 세포는 CD34⁺이다. 마찬가지로 어느 세포가 역전사 PCR로 측정할 수 있는 양의 OCT-4 RNA를 생산하거나, 성체 세포보다 유의미하게 더 많은 양의 OCT-4 RNA를 생산하는 경우, 이 세포는 OCT-4⁺이다. 세포 표면 표지(예를 들어 CD34와 같은 CD 표지)에 대한 항체와 OCT-4와 같이 줄기세포에 특이적인 유전자의 서열은 이 분야에 잘 알려져 있다.

태반 세포, 특히 피콜 분리, 차등 부착 또는 이들을 조합하여 분리한 세포는 형광표지 세포 분리 장치(FACS)를 이용하여 분류할 수 있다. FACS는 세포를 포함한 입자를 분류하는 공지의 방법으로서, 입자의 형광 특성에 바탕을 두고 있다(Kamarch의 Methods Enzymol, 151:150~165(1987)). 개별 입자의 형광부를 레이저로 들뜨게 하면 작은 전하가 발생하여 양과 음의 입자를 혼합물로부터 전자기적으로 분리할 수 있다. 한 실시 태양에서는 세포 표면 표지에 특이적인 항체 또는 리간드를 서로 다른 형광 표지로 표지한다. 이어서 사용된 항체에 결합하는지 여부에 따라 세포를 세포 분리기로 처리하여 분리한다. FACS로 분류된 입자들은 분리와 클로닝을 더 용이하게 하기 위하여 곧바로 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별 웰 속으로 운반될 수 있다.

한 세포 분류법에서는 태반에서 온 줄기세포를 CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류한다. 이러한 분류는 배양시 세포 부착 특성에 따라 줄기세포를 선별하는 방법과 함께 이루어질 수도 있다. 예를 들어 세포 부착 선별 단계는 표면 표지 발현에 따른 세포 분류 단계 전 또는 후에 수행할 수 있다. 일례로 한 실시 태양에서는 세포를 먼저 CD34의 발현 여부에 따라 분류하는데, CD34^- 세포는 남기고, CD200⁺HLA-G⁺인 세포는 다른 모든 CD34^- 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는 태반에서 얻은 세포를 CD200 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류하는데, 예를 들어 이들 표지 중 어느 하나라도 나타내는 세포는 후속 용도를 위하여 분리한다. 특정 실시 태양에서는 예를 들어 CD73 및/또는 CD105의 발현 여부 혹은 항체 SH2, SH3 또는 SH4가 인식하는 항원 결정기의 존부 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 미발현 여부에 따라 CD200 및/또는 HLA-G를 발현하는 세포를 추가적으로 분류할 수 있다. 한 실시 태양에서는 예를 들어, 태반 세포를 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38과 CD45의 발현 또는 미발현에 의거하여 분류하고, CD200⁺, HLA-G⁺, CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 태반 세포를 후속 용도를 위하여 다른 태반 세포로부터 분리한다.

한 실시 태양에서는 자기 비드를 이용하여 세포를 분리한다. 입자가 자기 비드(지름 0.5~100 ㎛)에 결합하는 능력에 따라 입자를 분리하는 방법인 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의하여 이 세포들을 분류할 수 있다. 이 자성의 미세구에는 유용한 변형을 다양하게 가할 수 있는데, 특정 세포 표면 분자 또는 불완전 항원(hapten)을 인식하는 항체를 공유 결합으로 연결하는 것 역시 이 변형에 포함된다. 이어서 이러한 비드를 세포와 섞어 주어 결합을 유도한다. 이 세포를 자기장 속에 통과시켜 특정 세포 표면 표지를 가지는 세포를 분리해 낸다. 한 실시 태양에서는 이들 세포를 이어서 분리한 다음 다른 세포 표면 표지들에 특이적인 항체와 결합한 자기 비드와 다시 섞어주게 된다. 이들 세포를 다시 자기장 속에 통과시켜 상기 항체 양쪽에 결합한 세포를 분리한다. 이러한 세포는 클론 분리를 위하여 각각의 미량역가판(microtiter dish)에 희석해 넣을 수 있다.

한편 세포 형태와 성장 특성을 바탕으로 하여 태반 세포를 특성화 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들어 태반 세포를 배양시 섬유모세포 유사(fibroblastoid) 형상을 나타내는 것으로 그 특성을 파악 및/또는 섬유모세포 유사 형상을 가지는지 여부에 따라 선별할 수 있다. 태반 줄기세포는 또한 배아유사체 형성 능력에 따라 특성 파악 및/또는 선별할 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는, 섬유모세포 유사 형상이고, CD73 및 CD105를 발현하며, 배양시 하나 또는 그 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는, 배양시 하나 이상의 배아유사체를 생성하는 OCT-4⁺ 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다.

다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 콜로니 형성 단위 분석(colony forming unit assay)를 이용하여 확인하고 특성 파악하게 된다. 콜로니 형성 단위 분석은 이 분양에서 널리 알려져 있는데, Mesen Cult(캐나다 브리티시 콜럼비아 주 밴쿠버의 Stem Cell Technologies, Inc.의 상표) 배양 배지를 예로 들 수 있다.

태반 줄기세포의 생존능, 증식 잠재성과 수명은 이 분야에 알려진 표준적인 기법을 이용하여 평가할 수 있는데, 이들 기법의 예는 다음과 같다: 트리판블루 배제 분석, 디아세트산플루오레사인 흡수 분석, (생존능 평가를 위한)요오드화프로피듐 흡수 분석, 티미딘 흡수 분석, (증식을 평가하는) MTT 세포 증식 분석. 수명도 이 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 장기 배양시 세포군 배증의 최대값을 측정하는 방법으로 알아낼 수 있다.

태반 줄기세포는 이 분야에 잘 알려진 기법을 이용하여 나머지 태반 세포로부터 분리할 수 있는데, 이러한 기법은 다음과 같은 것이 있다: 원하는 세포의 선택적인 성장(적극적 선별), 원하지 않는 세포의 선택적 파괴(소극적 선별), 대두 응집소(agglutinin) 등에 대한 혼합 세포군 내의 차별적 응집성에 바탕을 둔 분리법, 냉동-해동 과정, 여과, 통상적인 원심분리와 구역 원심분리, 원심분리 세정(centrifugal elutriation, counter-streaming centrifugation), 단위 중량(unit gravity) 분리, 대향류 분포법(countercurrent distribution), 전기 영동 등.

3. 태반 줄기세포의 배양

3.1 배양 배지( Culture media )

분리된 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포가 자라나오는 태반 조직은 세포 배양을 개시하거나 파종하는데 쓰일 수 있다. 세포는 무균 조직 배양 용기로 옮겨지는데, 이 용기는 표면이 라미닌, 콜라겐(예를 들어 천연 또는 변성), 젤라틴, 피브로넥틴, 오르니틴, 비트로넥틴과 세포외 막 단백질(미국 매사추세츠주 Bedford의 BD Discovery Labware사의 MATRIGEL)과 같은 세포외 매트릭스 또는 리간드로 피복되거나 피복되지 않을 수 있다.

이 분야에서 줄기세포 배양 용도로 적합하다고 인정받은 모든 배양 배지 또는 배양 조건을 이용하여 태반 줄기세포를 배양할 수 있다. 배양 배지는 혈청을 함유하는 것이 바람직하다. 태반 줄기세포는 예를 들어 다음 배양 배지를 이용할 수 있다: ITS(인슐린-트랜스페린-셀렌), LA+BSA(리놀레산+소 혈청 알부민), 포도당, L-아스코르브산, PDGF, EGF, IGF-I와 페니실린/스트렙토마이신 함유 DMEM-LG(Dulbecco's Modified Essential Medium, 저포도당)/MCDB 201(병아리 섬유모세포 기저(basal) 배지),

10% 소 태아 혈청(FBS) 함유 DMEM-HG(고포도당),

15% FBS 함유 DMEM-HG,

10% FBS, 10% 말 혈청과 하이드로코르티손 함유 IMDM (Iscove 변형 Dulbecco 배지),

10% FBS, EGF와 헤파린 함유 M199,

10% FBS, 글루타맥스(상표)와 겐타마이신 함유 α-MEM(최소 필수 배지),

10% FBS, 글루타맥스와 겐타마이신 함유 DMEM 등.

바람직한 배지는 2% FBS, ITS, LA+BSA, 포도당, L-아스코르브산, PDGF, EGF와 페니실린/스트렙토마이신 함유 DMEM-LG/MCDB-201이다.

태반 줄기세포 배양에 쓰일 수 있는 다른 배양 배지에는 DMEM(고농도 또는 저농도의 포도당), Eagle 기본 배지, Ham FlO 배지(FlO), Ham F-12 배지(F12), Iscove 변형 Dulbecco 배지, 중간엽 줄기세포 성장 배지(MSCGM), Liebovitz L-15 배지, MCDB, DMIEM/F12, RPMI 1640, 개량 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201(시그마사)와 CELL-GRO FREE가 포함된다.

이 배양 배지는 하나 또는 그 이상의 성분을 보충받을 수 있는데 이러한 성분으로는 혈청[예를 들어 바람직하게는 약 2~15%(v/v)인 소 태아 혈청, 말 혈청(ES), 사람 혈청(HS)], 바람직하게는 약 0.001%(v/v)인 베타-메르캅토에탄올(BME), 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-I), 백혈병 억제 인자(LIF), 혈관내피 성장 인자(VEGF)와 에리드로포이에틴이 있으며, L-발린을 포함하는 아미노산, 그리고 미생물 오염을 조절하기 위한 하나 또는 그 이상의 항생제 및/또는 항진균약(antimycotic)이 있는데 항생제 및/또는 항진균약에는 페니실린 G, 황산스트렙토마이신, 암포테리신 B, 겐타마이신과 니아스타틴이 있으며 단독으로 또는 이들을 조합하여 쓸 수 있다.

태반 줄기세포는 표준적 조직 배양 조건, 예를 들어 조직 배양 접시나 다중웰 플레이트에서 배양할 수 있다. 태반 줄기세포를 매달린 배지 방울법(hanging drop)으로 배양할 수도 있다. 이 방법에서는 태반 줄기세포를 약 5 mL 배지 속에 약 1×10⁴ 세포/mL 밀도로 현탁하고 이 배지 한 방울 또는 여러 방울을 조직 배양용기, 예를 100 mL 들이 페트리 접시 뚜껑의 내면에 놓는다. 이 방울들은 예를 들어 한 방울이거나 여러 방울, 예를 들어 다중 채널 피페터(multichannel pipetter)에서 온 것일 수 있다. 이 뚜껑을 조심스레 뒤집고 상기 접시 바닥에 놓는데, 이 접시 바닥에는 소정량의 액체, 예를 들어 접시 환경 속의 수분 함량을 유지하기에 충분한 멸균 PBS가 있고 여기서 줄기세포를 배양한다.

3.2 태반 줄기세포의 증폭과 증식

분리된 태반 줄기세포 또는 분리된 줄기세포군(예를 들어 생체 내에서 줄기세포 또는 줄기세포군에 정상적으로 결부되어 있는 태반 세포들을 적어도 50% 떼어낸 줄기세포 또는 줄기세포군)을 얻은 뒤에는 이 줄기세포 또는 줄기세포군을 시험관내에서 증식시키고 증폭시킬 수 있다. 예를 들어 태반 줄기세포군은 배양 접시, 플라스크, 다중웰 플레이트 등의 조직 배양 용기에서 그 태반 줄기세포가 세포 합류(confluence) 조건의 70~90%에 이르는데 충분한 시간, 즉 이 줄기세포와 그 자손이 조직 배양 용기 표면적의 70~90%를 차지할 때까지 배양할 수 있다.

태반 줄기세포는 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 파종할 수 있다. 예를 들어 이 세포들을 낮은 밀도(예를 들어 1 ㎠ 당 약 1000에서 약 5000 세포) 내지 높은 밀도(1 ㎠ 당 약 50,000 세포 또는 그 이상)로 파종할 수 있다. 한 바람직한 실시 태양에서는 이들 세포를 공기 중 부피비 약 0 내지 5% 이산화탄소 속에서 배양한다. 몇몇 바람직한 실시 태양에서는 이들 세포를 공기 중 부피비 약 2 내지 약 25% 산소 속에서 배양하고, 바람직하게는 약 5 내지 약 20퍼센트 산소를 사용한다. 이들 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 37℃에서 배양하게 된다. 이들 세포는 배양기 속에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양 배지는 정지상이거나 교반될 수 있는데, 예를 들어 생반응기를 이용할 수 있다. 태반 줄기세포는 낮은 산화성 스트레스(글루타티온의 첨가, 아스코르브산, 카탈라아제, 토코페롤, N-아세틸시스테인 등) 하에서 성장하는 것이 바람직하다.

70%~90% 세포 합류를 이룬 다음에는 이들 세포를 계대할 수 있다. 예를 들어, 공지 기술을 이용하여 이들 세포를 효소 처리, 이를 테면 트립신 처리하여 조직 배양 표면으로부터 떼어낼 수 있다. 피펫으로 세포를 떼어내고 그 세포 수를 세어 약 20,000~100,000 줄기세포, 바람직하게는 약 50,000 줄기세포를 신선한 배양 배지를 담고 있는 새 배양 용기에 옮겨 계대한다. 이 새로운 배양 배지는 상기 줄기세포를 들어낸 배양 배지과 같은 종류인 것이 전형적인 경우이다. 본 발명은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 회, 또는 그 이상 계대한 태반 줄기세포군도 망라하고 있다.

3.3 태반 줄기세포군

본 명세서에서는 태반 줄기세포군을 제공한다. 태반 줄기세포군은 하나 이상의 태반으로부터 곧바로 분리해 낼 수 있다. 즉, 이 태반 줄기세포군은 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군으로서, 관류물(perfusate)로부터 얻은, 혹은 관류물 안에 포함된 것이거나, 효소 소화물(digestate)로부터 얻은, 혹은 소화물 안에 포함된 것(즉 태반 또는 그 일부분을 효소 소화하여 수집한 세포)일 수 있다. 본 발명의 분리된 태반 줄기세포를 배양하고 증폭하여 태반 줄기세포군을 얻는데 사용할 수도 있다. 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군은 또한 배양하고 증폭하여 태반 줄기세포군을 얻는데 사용할 수도 있다.

본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포군은 태반 줄기세포를 포함하는데, 예를 들어 본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포를 포함한다. 많은 실시 태양에서는 분리된 태반 줄기세포군의 세포 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 태반 줄기세포이다. 즉 한 태반 줄기세포군에는 예를 들어 최대 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%의 비줄기세포가 포함될 수 있다.

본 명세서에서는 분리된 태반 줄기세포군을 생산하는 방법을 제공하는데, 예를 들어 효소 소화인지 관류 유래인지 무관하게, 특정 표지 및/또는 특정 배양 또는 형태적 특성을 나타내는 태반 줄기세포를 선별함으로써 제공한다. 본 명세서 한 실시 태양에서는 예를 들어, (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 HLA-G를 발현하고 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 본 명세서의 다른 태양에서는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 본 명세서의 다른 태양에서는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 OCT-4를 발현하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 본 명세서의 다른 실시 태양에서는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73과 CD105를 발현하고, (c) 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 다른 실시 태양에서는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 생산 방법을 제공한다. 본 명세서의 다른 태양에서는 세포군의 생산 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 기질에 부착하면서 (b) OCT-4를 발현하고, (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 세포를 선택하는 단계와 상기 세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 전술한 상기 태양 중 어느 것이라도 ABC-p(태반 특이적 ABC-전달 단백질, 예를 들어, Allikmets 외, Cancer Res . 58(23):5337~5339(1998)을 보라)를 발현하는 태반 세포를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한 이 방법은 예를 들어, 중간엽 줄기세포에 특이적인 특징, 예를 들어 CD29의 발현, CD44의 발현, CD90의 발현 또는 이들의 조합 발현을 적어도 하나 나타내는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 다. 본 방법의 다른 구체적 실시 태양에서 상기 선택은 항체를 이용하여 이루어진다.

이 명세서의 실시 태양에서, 기질은 예를 들어, 태반 줄기 세포의 배양 및/또는 선별을 할 수 있는 모든 표면이다. 전형적인 경우에, 이 기질은 플라스틱, 예를 들어 조직 배양 접시 또는 다중웰 플레이트의 플라스틱이다. 조직 배양 플라스틱은 예를 들어, 라미닌 또는 피브로넥틴 등의 생분자로 피복될 수 있다.

태반 줄기세포 등의 세포를 선별하여 태반 줄기세포군을 얻는데 세포 선별 분야에서 알려진 모든 수단을 쓸 수 있다. 예를 들어, 흐름 세포 측정 또는 FACS에서 하나 이상의 세포 표면 표지에 대하여 특이적인 항체(들)를 이용하여 세포를 선별할 수 있다. 항체와 자기 비드를 같이 사용하여 선별할 수도 있다. 특정 줄기세포 관련 표지에 대하여 특이적인 항체가 이 분야에서 알려져 있다. 그 예로는 OCT-4(미국 매사추세츠주 캠브리지 Abcam), CD200(Abcam), HLA-G(Abcam), CD73(미국 캘리포니아주 샌디에고 BD Biosciences Pharmaingen), CD105(Abcam, 미국 메인주 Saco의 BioDesign International)에 특이적인 항체 등을 들 수 있다. 다른 표지에 대한 항체 역시 시판 중인데, 예를 들어 CD34, CD38과 CD45에 대한 항체를 StemCell Technologies 또는 BioDesign International로부터 구할 수 있다.

분리된 태반 줄기세포군은 줄기세포가 아닌 태반 세포나 태반 세포가 아닌 세포를 함유할 수 있다.

분리된 태반 줄기세포군을 하나 이상의 비줄기세포 또는 비태반 세포 세포군과 혼합할 수 있다. 예를 들어 분리된 태반 줄기세포군을 혈액(예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈), 혈액 유래 줄기세포(예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈 유래 줄기세포), 혈액 유래 유핵 세포군, 골수 유래 중간엽 세포, 골수 유래 줄기세포군, 미정제 골수, 성체(체세포) 줄기세포, 조직 내에 포함된 줄기세포군, 배양된 줄기세포, 완전 분화된 세포군(예를 들어 연골세포, 섬유모세포, 양막 세포, 뼈모세포, 근육 세포, 심근 세포 등) 등과 혼합할 수 있다. 분리된 태반 줄기세포군 속의 세포와 다수의 다른 유형 세포를, 각 세포군의 총 유핵세포수를 비교하여 혼합할 수 있는데 그 혼합 비율은 약 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1,000, 1:2,000, 1:5,000, 1:10,000, 1:20,000, 1:50,000, 1:100,000, 1:500,000, 1:1,000,000, 1:2,000,000, 1:5,000,000, 1:10,000,000, 1:20,000,000, 1:50,000,000 또는 약 1:100,000,000이다. 분리된 태반 줄기세포군 속의 세포를 복수의 세포 유형을 가지는 복수의 세포들과 혼합할 수도 있다.

한 실시 태양에서는 분리된 태반 줄기세포군을 복수의 조혈 줄기세포와 혼합한다. 이러한 조혈 줄기세포는 예를 들어 다음 세포원으로부터 얻을 수 있다: 미처리된 태반 혈액, 제대혈 또는 말초 혈액 내, 태반 혈액·제대혈·말초 혈액 유래 총 유핵세포 속, 태반 혈액·제대혈·말초 혈액 유래 분리된 CD34⁺ 세포군, 미처리 골수, 골수 유래 총 유핵세포 속, 골수 유래 분리된 CD34⁺ 세포군 등.

4. 태반 줄기세포와 태반 관류물의 또는 태반 관류물 세포의 조합

본 명세서에서는 분리된 태반 관류물 세포를 갖춘 태반 관류물 및/또는 여기서 제공하는 태반 줄기세포의 조합을 제공한다. 여기서 이 태반 줄기세포는 CD34⁺ 태반 줄기세포, CD34^- 태반 줄기세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어 본 명세서의 한 실시 태양에서는 복수의 태반 관류물 세포 및/또는 복수의 태반 줄기세포로 보충한 태반 관류물을 소정량 제공한다. 구체적 태양에서는 예를 들어, 태반 관류물 매 밀리리터마다 약 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶개 또는 그 이상의 태반 관류물 세포나 태반 줄기세포로 보충한다. 다른 태양에서는 복수의 태반 관류물 세포를 태반 관류물 및/또는 태반 줄기세포로 보충한다. 다른 태양에서는 복수의 태반 줄기세포를 태반 관류물 및/또는 복수의 태반 관류물 세포로 보충한다. 관류물을 보충 용도에 쓰는 몇몇 태양에서는, 관류물의 부피가 전체 세포 부피(용액상)와 관류물을 더한 부피의 대략 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% 또는 1%이거나 대략 이 부피를 넘거나 대략 이 부피에 모자란다. 태반 관류물 세포로 복수의 태반 줄기세포를 보충할 때에는 이 태반 관류물 세포가 일반적으로 태반 관류물 세포에 태반 줄기세포를 더한 총 수의 대략 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% 또는 1%이거나 대략 이 수를 넘거나 대략 이 수에 모자란다. 유사하게 태반 줄기세포로 복수의 태반 관류물 세포를 보충하는 때에는 이 태반 줄기세포가 일반적으로 태반 관류물 세포에 태반 줄기세포를 더한 총 수의 대략 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% 또는 1%이거나 대략 이 수를 넘거나 대략 이 수에 모자란다. 태반 줄기세포나 태반 관류물 세포로 태반 관류물을 보충하는 때에는 이 세포들이 현탁되어 있는 용액(예를 들어 식염수, 배양 배지 등)의 부피가 관류물 총 부피에 세포를 더한 부피의 대략 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% 또는 1%이거나 대략 이 부피를 넘거나 대략 이 부피에 모자라는데, 이 때 상기 태반 줄기세포는 보충 전에 밀리리터 당 약 약 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸개 비율로 현탁한다.

본 명세서에서는 나아가 두 개 이상의 세포원, 예를 들어 두 개 이상의 태반에서 얻은 다음 합치는 등의 방법으로 조합한 합친(pooled) 태반 관류물을 제공한다. 이러한 합친 관류물은 각 세포원으로부터 대략 같은 부피의 관류물을 포함하거나 각 세포원으로부터 서로 다른 양을 포함하고 있다. 각 세포원에서 온 상대적인 양은 무작위로 택하거나 다음 요소를 토대로 정할 수 있는데, 예를 들어 사이토킨, 성장 인자, 호르몬 등 하나 이상의 세포 인자, 각 세포원의 관류물 속의 태반 세포의 수 또는 각 세포원의 관류물의 기타 특징이다. 같은 태반을 여러 번 관류하여 얻은 관류물을 비슷하게 합칠 수 있다.

유사하게 본 명세서에서는 두 개 이상의 세포원, 예를 들어 두 개 이상의 태반에서 얻은 다음 합친 태반 관류물 세포와 태반 줄기세포를 제공한다. 이러한 합친 세포는 상기 두 개 이상의 세포원으로부터 대략 같은 수의 세포를 함유하거나, 하나 이상의 상기 합친 세포원으로부터 서로 다른 수의 세포를 함유하고 있을 수 있다. 각 세포원으로부터 취하는 세포의 상대적인 수는 예를 들어 합칠 세포들 속에 있는 하나 이상의 특정 세포 유형의 수, 예를 들어 CD34^_ 줄기세포의 수 등을 토대로 선택할 수 있다.

합친 세포에는 예를 들어 태반 관류물 세포로 보충한 태반 관류물, 태반 줄기세포로 보충한 태반 관류물, 태반 관류물 세포와 태반 줄기세포 양쪽으로 보충한 태반 관류물, 태반 관류물로 보충한 태반 관류물 세포, 태반 줄기세포로 보충한 태반 관류물 세포, 태반 관류물과 태반 줄기세포 양쪽으로 보충한 태반 관류물 세포, 태반 관류물로 보충한 태반 줄기세포, 태반 관류물 세포로 보충한 태반 줄기세포 또는 태반 관류물 세포와 태반 관류물 양쪽으로 보충한 태반 줄기세포가 포함된다.

몇몇 태양에서는 태반 관류물, 태반 관류물 세포와 태반 줄기세포를 약학적 등급의 투여 단위로 제공한다. 이러한 투여 단위는 몇몇 정해진 부피로, 예를 들어 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 500 mL 등으로 제공할 수 있다. 이러한 투여 단위가 특정 수의 세포, 예를 들어 태반 관류물 세포, 태반 관류물 유래 중간 자연 세포 독성 세포(intermediate natural killer cell) 또는 양쪽 모두를 함유하도록 하여 제공할 수도 있는데, 예를 들어 밀리리터 당 세포 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸개 또는 그 이상, 혹은 투여 단위 당 세포 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹개 또는 그 이상이 될 수 있다. 이러한 투여 단위가 태반 관류물, 태반 관류물 세포 및/또는 태반 줄기세포 중 아무런 두 가지 또는 세 가지 모두를 특정한 수량으로 갖추도록 제공할 수도 있다.

상기 태반 관류물, 태반 관류물 세포 및/또는 태반 줄기세포의 조합에서, 상기 태반 관류물, 태반 관류물 세포 및/또는 태반 줄기세포 중 어느 하나, 어느 두 가지 또는 세 가지 모두는 투여 대상에서 자기 유래(autologous)한 것(즉 투여 대상으로부터 얻은 것)이거나 투여 대상과 동족(homologous)인 것(즉 투여 대상의 한 다른 개체에서 얻은 것)일 수 있다.

본 명세서에서는 또한 태반 관류물 세포 및/또는 태반 관류물을 함께 조합한 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공한다. 따라서 본 명세서의 다른 측면에서는 분리된 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하는데, 여기서 이 태반 줄기세포는 조성물 속 세포의 적어도 50%를 이룬다. 구체적 태양에서는 이 태반 줄기세포가 조성물 속 세포의 적어도 80%를 이룬다. 다른 구체적 태양에서는 이 조성물이 분리된 태반 관류물을 함유한다. 더 구체적인 태양에서는 상기 태반 관류물이 상기 태반 줄기세포와 동일한 개체로부터 유래한 것이다. 다른 더 구체적인 태양에서는 상기 태반 관류물이 상기 태반 줄기세포와 서로 다른 개체로부터 유래한 태반 관류물을 함유한다. 다른 구체적인 태양에서는 이 조성물이 태반 관류물 세포를 함유한다. 더 구체적인 태양에서는 이 태반 관류물 세포가 상기 태반 줄기세포와 동일한 개체에서 유래한 것이다. 다른 더 구체적인 태양에서는 상기 태반 관류물 세포가 상기 태반 줄기세포와 서로 다른 개체로부터 유래한 것이다. 다른 구체적인 태양에서는 이 조성물이 분리된 태반 관류물과 분리된 태반 관류물 세포를 더 포함하는데, 여기서 상기 분리된 관류물과 상기 분리된 태반 관류물 세포는 서로 다른 개체에서 유래한 것이다. 태반 관류물을 함유하는 전술한 실시 태양들 중 어느 것에 대한 더 구체적인 또 다른 실시 태양에서는 이 태반 관류물이 적어도 두 개체로부터 유래한 태반 관류물을 함유한다. 태반 관류물 세포를 함유하는 전술한 실시 태양들 중 어느 것에 대한 더 구체적인 또 다른 실시 태양에서는 이 분리된 태반 관류물 세포가 적어도 두 개체로부터 유래한다.

5. 태반 줄기세포 은행의 제조

출산 후 태반으로부터 얻는 줄기세포를 수많은 다른 방식으로 배양하여 태반 줄기세포 롯(lot)의 집단, 예를 들어 개별적으로 투여 가능한 용량의 집단을 이룰 수 있다. 이러한 롯은 예를 들어 태반 관류물 또는 효소 소화된 태반 조직으로부터 얻을 수 있다. 복수의 태반으로부터 얻은 태반 줄기세포 롯의 집단은 예를 들어 장기 저장을 위한 태반 줄기세포의 은행 속에 정렬할 수 있다. 일반적으로 부착 줄기세포는 태반 재료의 초기 배양으로부터 파종 배양물(seed culture)을 형성하여 얻게 되고, 이를 통제된 조건 하에서 증폭시켜 대략 횟수로 배증시켜 세포군을 제조하게 된다. 롯들은 한 태반 조직으로부터 유래하는 것이 바람직하지만, 복수의 태반 조직으로부터 유래할 수도 있다.

한 실시 태양에서 줄기세포 롯은 다음과 같이 얻을 수 있다. 태반 조직을 먼저 파괴, 예를 들어 잘게 썰고 콜라겐 분해 효소 등(앞의 2.3을 보라)의 적절한 효소로 소화하여 파괴한다. 이 태반 조직은 예를 들어 하나의 태반에서 얻은 양막 전체, 융모막 전체 또는 양자 모두를 포함하는 것이 바람직하지만 양막 또는 융모막의 일부만 포함할 수도 있다. 소화된 조직은 예를 들 어 1~3 주 동안 배양되는데, 바람직하게는 2 주가 좋다. 비부착성 세포를 제거한 다음, 형성되는 고밀도 콜로니를 수집, 예를 들어 트립신 처리를 통하여 수집한다. 이들 세포는 수집되어 편리한 분량의 배양 배지 속에 재현탁화되는데 이를 제0 계대(Passage 0) 세포라고 정의한다.

제0 계대 세포는 증폭 배양물(expansion culture)을 파종(seed)하는데 쓰인다. 증폭 배양물은 별개의 세포 배양 장치, 예를 들어 NUNC(상표)의 Cell Factory의 모든 배열일 수 있다. 제0 계대 배양물 속의 세포는 증폭 배양물을 파종하기 위하여 얼마든지 나뉠 수 있는데, 1×10³, 2×10³, 3×10³, 4×10³, 5×10³, 6×10³, 7×10³, 8×10³, 9×10³, 1×10⁴, 2×10⁴, 3×10⁴, 4×10⁴, 5×10⁴, 6×10⁴, 7×10⁴, 8×10⁴, 9×10⁴, 10×10⁴개의 줄기세포로 증폭 배양물을 파종할 수 있다. 바람직하게는 약 2×10⁴ 내지 약 3×10⁴개의 제0 계대 세포를 이용하여 증폭 배양물을 파종한다. 증폭 배양물의 수는 제0 계대 세포의 수에 달려 있는데, 이 수의 다소는 상기 줄기세포를 얻은 특정 태반(들)에 달려 있다.

증폭 배양물은 배양물 속 세포 농도가 일정한 값, 예를 들어 약 1×10⁵세포/㎠에 이를 때까지 성장시키게 된다. 이 시점에서는 세포를 수집하거나 냉동보존할 수 있고, 아니면 앞서 설명한 바와 같이 새로운 증폭 배양물로 계대할 수도 있다. 세포는 사용 전에 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19회 또는 20회 계대될 수 있다. 증폭 배양 도중에는 세포군 배증의 누적 횟수에 대한 기록을 가지고 있는 것이 바람직하다. 제0 계대 배양에서 얻은 세포는 배증 회수를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38회 또는 40회, 혹은 60회까지로 하여 증폭할 수 있다. 그러나 개별 투여량 별로 세포군을 나누기 전의 세포군 배증 횟수는 약 15 내지 약 30회, 바람직하게는 약 20회인 것이 적당하다. 이들 세포는 증폭 과정 내내 연속적으로 배양되거나, 증폭 도중 1회 이상 냉동될 수 있다.

개별 투여에 쓰일 세포는 나중에 쓰기 위하여 냉동, 예를 들어 냉동보존될 수 있다. 개별 투여량에는 예를 들어 1 mL 당 약 1백만 내지 약 1억개의 세포가 포함될 수 있고, 그 총수는 약 10⁶ 내지 10⁹개이다.

본 방법의 특정 실시 태양에서는 제0 계대 세포를 4회까지 배증하게 한 다음 1차 세포 은행 속에 냉동하여 둔다. 1차 세포 은행에서 나온 세포는 언 채로 있고 2차 세포 은행을 파종하는데 쓰이는데, 2차 세포 은행의 세포들은 약 8차례 더 배증하게끔 증폭된다. 이 단계의 세포를 수집하고 냉동한 다음 이를 이용하여 새로운 증폭 배양물을 파종하는데, 여기서 약 8차례 더 배증하도록 하여 누적 세포 배증 횟수를 약 20회로 한다. 계대 도중의 중간 시점에서 얻은 세포는 후속 증폭 배양을 위하여 1 mL 당 약 100,000 내지 약 1천만 세포, 바람직하게는 1백만 세포 단위로 냉동할 수 있다. 약 20 차례 배증한 세포는 투여 또는 줄기세포 함유 조성물을 제조하기 위하여 1 mL 당 약 1백만에서 약 1억개의 세포에 해당하는 용량의 개별 투여량으로 얼릴 수 있다.

한 바람직한 실시 태양에서는 태반을 기증한 기증자(예를 들어 모체)에 대하여 적어도 한 가지 병원체의 존부를 검사하게 된다. 검사 병원체에 대하여 산모가 양성이면 그 태반에서 얻은 전체 롯을 파기한다. 이러한 검사는 태반 줄기세포 롯의 제조 도중 어느 때이건 할 수 있고, 예를 들어 제0 계대 세포의 수립 전후 또는 증폭 배양 도중도 가능하다. 존부를 검사하는 병원체의 예로는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 사람 면역결핍 바이러스(I형과 II형), 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 바이러스 등이 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

6. 부착성 태반 줄기세포의 분화

6.1 신경 세포와 신경 형성( neurogenic ) 세포로의 분화 유도

태반 줄기세포의 신경 분화는 예를 들어 태반 줄기세포를 신경 세포로 분화하도록 유도하는 세포 배양 조건하에 놓음으로써 이룰 수 있다. 한 예시 방법에서는 신경 형성 배지가 DMEM/20% FBS와 1 mM β-메르캅토에탄올을 포함한다. 이러한 배지는 약 24시간의 배양 후 DMEM과 1~10 mM β-메르캅토에탄올로 이루어진 배지로 갈아 줄 수 있다. 다른 실시 태양에서는 이 세포를 DMEM/2% DMSO/200 μM 부틸화 하이드록시아니솔에 접촉시킨다. 한 구체적 태양에서는 이 분화 배지가 무혈청 DMEM F-12, 부틸화 하이드록시아니솔, 염화칼륨, 인슐린, 포르스콜린(forskolin), 발프르산(valproic acid)과 하이드로코르티손을 함유한다. 다른 태양에서는 태반 줄기세포를 B27 보충제와 L-글루타민, 그리고 선택적으로 bFGF 및/또는 ㄸEGF가uroba 보강된 Neurobasal-A 배지(캘리포니아주 Carlsbad의 Invitrogen사)가 있는 라미닌 피복 배양판 위에 도포함으로써 신경 분화를 이룬다. 신경 세포와 공동 배양하거나 신경 세포 조건 배지(conditioned-medium) 속에서 태반 줄기세포를 배양함으로써 신경 분화를 유도할 수 있다.

신경 분화는 예를 들어 신경 세포 유사 형태(예를 들어 길게 뻗은 돌기를 갖춘 양극 세포(bipolar cell))의 검출, 신경 성장 인자 수용체와 신경 섬유 중ㅅ소쇄(heavy chain) 유전자 등을 RT/PCR의 검출 또는 패치 클램프(patch clamp)법 등에 의한 전기 활성의 검출을 통하여 평가할 수 있다.

6.2 지방 형성( adipogenic ) 세포로의 분화 유도

태반 줄기세포의 지방 형성 분화는 예를 들어 태반 줄기세포를 지방 세포로 분화하도록 유도하는 세포 배양 조건하에 놓음으로써 이룰 수 있다. 한 바람직한 지방 형성 배지는 MSCGM(Cambrex)나 15% 제대혈 혈청으로 보강한 DMEM이다. 한 실시 태양에서는 태반 줄기세포에 지방 생성 유도 배지(Cambrex)를 가하고 3일 동안 (37℃, 5% CO₂에서) 배양하고 이어서 지방 형성 유지 배지(Cambrex)에서 1~3일 동안 배양한다. 완전한 유도/유지를 3 순환한 다음 이 세포를 7일 동안 더 지방 형성 유지 배지 속에서 배양하는데 2~3일마다 배지를 갈아준다.

다른 태양에서는 태반 줄기세포를 1 μM 덱사메타손, 0.2 mM 인도메타신, 0.01 mg/mL 인슐린, 0.5 mM IBMX, DMEM-고포도당, FBS와 항생제를 포함하는 배지 속에서 배양한다. 태반 줄기세포를 지방 형성 쪽으로 유도하는 것은 하나 이상의 당질 코르티코이드(예를 들어 덱사메타손, 인도메타손, 하이드로코르티손, 코르티손), 인슐린, 세포내 cAMP 농도를 높이는 화합물(예를 들어 디부티릴-cAMP, 8-CPT-cAMP((8-(4)-클로로페닐티오)아데노신-3,'5'-고리형 모노인산), 8-브로모-cAMP, 디옥탄오일-cAMP, 포르스콜린) 및/또는 cAMP의 분해를 억제하는 화합물(예를 들어, 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 이소틸크산틴메틸, 테오필린(theophylline), 카페인, 인도메타신 등의 인산디에스테르 분해 효소 억제제)를 함유하는 배지 속에서 배양하여 달성할 수도 있다.

지방 형성의 두드러진 징표는 친지질성 염료 오일인 레드오(red O)를 써서 쉽게 관찰할 수 있는 세포질내 지질 소포(vesicle)가 여러 개가 생성되는 것이다. 리파아제 및/또는 지방산 결합 단백질 유전자의 발현은 지방 세포로 분화하기 시작한 태반 줄기세포에서 RT/PCR로 확인할 수 있다.

6.3 연골세포로의 분화 유도

태반 줄기세포의 연골 형성 분화는 예를 들어 태반 줄기세포를 연골 세포로 분화하도록 유도하는 세포 배양 조건하에 놓음으로써 이룰 수 있다. 한 바람직한 연골세포 배지는 MSCGM(Cambrex)나 15% 제대혈 혈청으로 보강한 DMEM이다. 한 실시 태양에서는 태반 줄기세포 분액을 멸균 폴리프로필렌 튜브 속에 넣고 이를 원심분리(예를 들어 5분 동안 150×g)한 다음 불완전 연골 형성(incomplete chondrogenesis medium)(Cambrex)로 두 번 씻어 준다. 이 세포를 TGF-β-3 0.01 ㎍/mL를 함유하는 완전 연골 형성 배지(Cambrex) 속에 mL 당 세포 약 1~20×10⁵개 농도로 재현탁한다. 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 아스코르브산 포함 또는 무포함하에 외래(exogenous) 성장 인자, 예를 들어 GDF-5나 전환 성장 인자 β3(TGF-β3)와 접촉시킨다. 연골 형성 배지는 프롤린과 글루타민을 비롯한 아미노산, 피루브산나트륨, 덱사메타손, 아스코르브산, 인슐린/트랜스퍼린/셀렌으로 보충할 수 있다. 연골 형성 배지는 수산화나트륨 및/또는 콜라겐으로 보충할 수도 있다. 이 태반 줄기세포를 고밀도 또는 저밀도로 배양할 수 있다. 세포를 혈청 없이 배양하는 것이 바람직하다.

연골 형성은 다음과 같이 평가할 수 있는데, 예를 들어 호산성 바탕질(eosinohilic ground substance)의 생산 관찰, 글리코스아미노글리칸발현에 대한 사프라닌-O(safranin-O) 염색, 헤마톡실린/오신(hematoxylin/eosin) 염색 세포 형태 평가 및/또는 콜라겐 2와 콜라겐 9 발현의 RT/PCR 확증이 있다. 연골 형성은 줄기세포 펠렛 속에서, 예를 들어 줄기세포의 현탁액을 부드럽게 원심분리(예를 들어 약 5분 동안 약 800g)하여 얻은 펠렛 속에서 키움으로써 관찰할 수도 있다. 약 1~28일 뒤 상기 줄기세포 펠렛은 튼튼한 매트릭스를 형성하기 시작하고 유도되지 않은 세포주나 연골 형성성이 아닌 세포주에서는 볼 수 있는 구조적 강도를 지니는데, 유도되지 않거나 연골 형성성이 아닌 세포주의 펠렛은 약간 힘을 가하면 부서지는 경향이 있다. 연골 형성은 또한 예를 들어, 이러한 세포 펠렛을, 시리우스 레드(Sirius red) 등의 콜라겐을 염색하는 염료 및/또는 알시안 블루(alcian blue) 등의 글리코스아미노글리칸(GAG)을 염색하는 염료로 염색하여 증명할 수도 있다.

6.4 골 형성 세포로의 분화 유도

태반 줄기세포의 골 형성(osteogenic) 분화는 예를 들어 태반 줄기세포를 뼈발생 세포로 분화하도록 유도하는 세포 배양 조건하에 놓음으로써 이룰 수 있다. 한 바람직한 골세포 배지는 MSCGM(Cambrex)나 15% 제대혈 혈청으로 보강한 DMEM에 이어서 덱사메탄손 0.1 μM, 아스코르브산-2-인산 0.05 mM, 베타 글리세르인산(beta glycerophosphate) 10 mM을 함유하는 골 형성 유도 배지(Osteogenic Induction Medium)(Cambrex)를 포함한다. 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 덱사메타손 약 10^-7내지 약 10^-9 M, 아스코르브산 인산염(예를 들어 아스코르브산-2-인산) 약 10~50 μM과 β-글리세르인산 약 10 nM 내지 약 10 mM을 함유하는 배지(예를 들어 DMEM-저포도당) 속에서 배양한다. 골 형성 배지는 또한 혈청, 하나이상의 항생제/항진균제, 전환 성장 인자 β(예를 들어 TGF-β1) 및/또는 골 형태형성 단백질(bone morphogenic protein)(예를 들어 BMP-2, BMP-4 또는 이들의 조합)을 더 포함할 수 있다.

세포 분화는 칼슘 특이적 염색, 예를 들어 von Kossa 염색과 RT/PCR 검출, 예를 들어 알칼리성 인산 분해효소, 오스테오칼신(osteocalcin), 뼈 시알로단백질(sialoprotein) 및/또는 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자 발현을 검출하여 분석할 수 있다.

6.5 이자 세포로의 분화 유도

태반 줄기세포를 인슐린을 생산하는 이자 세포로 분화하는 것은 예를 들어 태반 줄기세포를 이자 세포로 분화하도록 유도하는 세포 배양 조건하에 놓음으로써 이룰 수 있다.

한 예시 방법에서는 이자 형성(pancreagenic) 배지가 10 ng/mL의 염기성 섬유모세포 성장 인자와 2 ng/mL의 전환 성장 인자로 보강한 DMEM/20% CBS를 포함한다. 이러한 배지는 50/50 v/v로 네스틴 야성 신경 세포 배양물에서 얻은 조건 배지와 혼합해 줄 수 있다. 녹아웃 혈청 대체물(knock-out serum replacement)를 CBS 대신 쓸 수도 있다. 세포를 14~28일 동안 배양하는데, 3~4일마다 배지를 갈아준다.

세포 분화는 예를 들어 인슐린 단백질 보호를 분석하거나 RT/PCR로 인슐린 유전자 발현을 분석하여 확인할 수 있다.

6.6 심장 세포로의 분화 유도

태반 줄기세포의 근육 형성(myogenic)(심장 형성(cardiogenic)) 분화는 예를 들어 태반 줄기세포를 심근 세포로 분화하도록 유도하는 세포 배양 조건하에 놓음으로써 이룰 수 있다. 바람직한 심근 세포 배지는 1 μM 레티노산, 10 ng/mL 염기성 섬유모세포 성장 인자, 2 ng/mL 전환 성장 인자 베타-1, 100 ng/mL 표피 성장 인자로 보강한 DMEM/20% CBS를 포함한다. 녹아웃 혈청 대체물(캘리포니아 Carlsbad의 Invitrogen)를 CBS 대신 쓸 수도 있다. 한편으로 태반 줄기세포를 50 ng/mL 카르디오트로핀-1(cardiotropin-1)이 보강된 DMEM/20% CBS 속에서 24시간 동안 배양할 수도 있다. 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 무단백질 배지 속에서 5~7일간, 이어서 사람 심근층 추출물로 자극하여 총 10~14일 배양하는데, 이 추출물은 예를 들어 사람 심근층을 1% 제대혈 혈청으로 보강한 1% HEPES 완충액 속에서 균질화하여 제조할 수 있다.

세포 분화는 심장 액틴 유전자 발현을 예를 들어 RT/PCR로 증명함으로써 확인한다.

7. 태반 줄기세포의 보존

태반 줄기세포는 보존될 수 있는데, 요컨대 장기 저장을 허용하는 조건 또는 세포 자멸사 또는 세포 괴사 등에 의한 세포 사멸을 억제하는 조건하에 둘 수 있다.

태반 줄기세포는 예를 들어 2005년 12월 29일자의 관련 미국 예비출원 제60/754,969호 "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"에 개시된 조성물인 세포 자멸사 억제제, 세포 괴사 억제제 및/또는 산소 운반성 퍼플루오로카본 함유 조성물을 이용하여 보존할 수 있다. 본 발명의 한 실시 태양에서는, 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포군을 세포 자멸사 억제제와 산소 운반성 퍼플루오로카본을 함유하는 줄기세포 수집용 조성액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포자멸사 억제제는 상기 세포자멸사 억제제로 처리하지 않은 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 세포자멸사를 방지하거나 감소시키는데 충분한 시간 동안 충분한 양으로 존재한다. 한 특정 태양에서 상기 세포 자멸사 억제제는 카스파제 억제제이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 세포자멸사 억제제는 JNK 억제제이다. 더 특정한 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분화 또는 증식을 조절하지 못한다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성액은 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본을 별도의 상 속에 함유한다. 다른 실시 태양에서, 상기 줄기세포 수집용 조성액은 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본을 유탁액으로 함유한다. 다른 실시 태양에서, 상기 줄기세포 수집용 조성액은 유화제, 예를 들어 레시틴을 더 함유한다. 다른 실시 태양에서 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본은 상기 줄기세포와 접촉할 때 약 0℃ 내지 약 25℃에 있다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본은 상기 줄기세포와 접촉할 때 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 5℃에 있다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 운송시 이루어진다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 냉동과 해동시에 이루어진다.

다른 실시 태양에서, 본 발명은 태반 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포군을 세포 자멸사 억제제와 장기 보존용(organ-preserving) 화합물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포자멸사 억제제는 상기 세포자멸사 억제제로 처리하지 않은 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 세포자멸사를 방지하거나 감소시키는데 충분한 시간 동안 충분한 양으로 존재한다. 특정 실시 태양에서 상기 장기 보존용 화합물은 UW 용액(ViaSpan으로도 알려져 있으며 미국 특허 제4,798,824호에 기재됨. 또한 Southard 외, Transplantation 49(2):251~257 (1990))이거나 Stern 외, 미국 특허 제5,552,267호에 기재된 용액이다. 다른 실시 태양에서 상기 장기 보존용 화합물은 히드록시에틸 전분, 락토비온산(lactobionic acid), 라피노스(raffinose) 또는 이들의 조합이다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성액은 산소 운반성 퍼플루오로카본을 2개의 상 속에 또는 유탁액 형태로 더 포함한다.

본 발명 방법의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 관류시 세포 자멸사 억제제, 산소 운반성 퍼플루오로카본, 장기 보존용 화합물 및 이들의 조합을 함유하는 줄기세포 수집용 조성액과 접촉시킨다. 다른 실시 태양에서는 상기 줄기세포를 효소 소화 등의 조직 파괴 과정 중에 접촉시킨다. 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 관류에 의한 세포 수집 또는 효소 소화 등의 조직 파괴에 의한 세포 수집 이후에 상기 줄기세포 수집용 조성액에 접촉시킨다.

전형적인 경우, 태반 세포의 수집 과정, 농축 과정과 분리시에는 저산소증과 기계적 응력에 말미암은 세포 스트레스를 없애거나 최소화하는 것이 바람직하다. 본 방법의 다른 실시 태양에서는 따라서 줄기세포 또는 줄기세포군이 세포 수집, 농축 또는 분리 중에 저산소 조건에 노출되는 시간을 해당 보존 과정 도중에 6 시간 미만으로 줄이는데, 여기서 저산소 조건이란 정상적인 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포군은 상기 보존 과정 도중 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 2시간 미만이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 줄기세포군은 세포 수집, 농축 또는 분리 도중 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 1 시간 미만 또는 30 분 미만이거나 저산소 조건에 노출되지 않는다. 다른 구체적인 실시 태양에서 상기 줄기세포군은 세포 수집, 농축 또는 분리 도중 전단 응력을 받지 않는다.

본 발명의 태반 줄기세포는 냉동보존될 수 있는데, 예를 들어 냉동보존용 배지가 담긴 앰퓰 등의 소형 용기 속에 보존될 수 있다. 적절한 냉동보존용 배지로는 이를 테면 성장 배지 또는 시판되는 세포 냉동 배지 C2695, C2639, C60939(Sigma) 등의 세포 냉동 배지를 포함하는 배양 배지를 들 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 냉동보존용 배지는 DMSO(디메틸술폭사이드)를 이를테면 약 10%(v/v) 농도로 포함하는 것이 바람직하다. 냉동보존용 배지는 메틸셀룰로오스 및/또는 글리세롤 등의 추가적 성분을 갖추고 있을 수 있다. 태반 줄기세포는 냉동보존시 분당 섭씨 1도씩 냉각하는 것이 바람직하다. 바람직한 냉동보존용 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 바람직하게는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 냉동보존된 세포를 사용하기 위하여 해동하기 전에 액체 질소 속으로 옮길 수 있다. 예를 들어 몇몇 실시 태양에서는 앰퓰의 온도가 약 -90℃에 이르면 이를 액체 질소 저장 공간으로 옮긴다. 냉동보존된 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 해동하는 것이 바람직하다.

8. 태반 줄기세포의 용도

8.1 태반 관류물, 줄기세포와 줄기세포군

태반 줄기세포군은 줄기세포군의 투여에 의하여 치료할 수 있는 어떠한 질병, 장애 또는 상태의 치료에라도 쓰일 수 있다. 본 명세서에서 "치료"는 질병, 장애나 상태 혹은 이들의 어떤 한 특성이나 증상의 치료, 구제, 개선, 정도를 덜거나 진행 경과를 단축하는 것을 망라하고 있다.

줄기세포나 줄기세포에서 분화한 세포가 필요한 환자에게 투여하기 위한 준비로서 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군을 생체 내에서 또는 생체 외에서 유도하여 특정 세포 유형으로 분화시킬 수 있다. 예를 들어 태반 줄기세포를 손상된 장기에 주사하고 생체내 장기 신생과 부상 복구에 쓸 수 있다. 이러한 부상은 암에서 생기는 병변을 비롯한 뼈 결함, 골절, 척추 융합 등으로 치료할 수 있는 척추 상태를 포함하는 상태와 장애 때문일 수 있는데, 이러한 예시 경우에만 한정되는 것은 아니다. 이러한 태반 줄기세포를 부상 뼈에 단독으로 또는 본 명세서에서 기술하는 이식 가능한 기질과 함께 도입할 수 있다. 구체적인 태양에서는 분리된 태반 세포군을 다발성 골수종, 골암, 신경모세포종, 골육종, Ewing 육종, 전이성, 다발성 골수종과 뼈의 전이라는 특징이 있는 모든 형태의 전이성 암을 비롯한 구체적인 질병이나 상태를 치료하는데 쓰일 수 있지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 이 분야의 당업자는 암으로 생긴 뼈의 결함의 치료가 반드시 암 그 자체도 완화하는 것이 아니라는 것을 알고 있을 것이다. 본 명세서에서 제공하는 뼈 결함의 치료는 추가적 암 요법의 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 수행할 수 있다. 따라서 한 실시 태양에서는 뼈 결함 치료를 항암 요법으로 암을 치료하기 전에 수행한다. 다른 태양에서는 뼈 결함 치료를 항암 요법으로 암 치료를 할 때 또는 그와 거의 같은 시간에 수행한다. 다른 태양에서는 뼈 결함 치료를 항암 요법으로 암 치료를 한 후에 수행한다.

분리된 태반 관류물, 태반 관류물 세포 및/또는 분리된 태반 줄기세포군을 골절 치료, 예를 들어 비결합성 골절 치료에 쓸 수도 있다. 분리된 태반 줄기세포군을 예를 들어 척추 융합이 필요한 환자에서 융합을 마치기 위하여 척추뼈들을 융합시키는데 쓸 수도 있다. 분리된 태반 줄기세포군을 줄기 또는 전구세포군과 함께 사용하여 전술한 치료를 수행할 수도 있다.

뼈 결함을 치료하는 상기 방법 중 일부 태양에서는 태반 관류물, 태반 관류물 세포 및/또는 태반 줄기세포, 예를 들어 부착성이나 비부착성 태반 줄기세포를 뼈 결함이 있는 개체에 투여할 수 있다. 이러한 개체에 대하여 예를 들어 태반에서 얻은 그대로의 태반 관류물, 하나 이상의 세포 유형, 예를 들어 적혈구를 제거하기 위하여 처리한 태반 관류물, 태반 관류물에서 분리한 태반 관류물 세포 또는 이들의 모든 조합을 투여할 수 있다. 이러한 조합은 또한 분리된 부착성 태반 줄기세포군 및/또는 분리된 비부착성 태반 줄기세포를 함유할 수 있는데, 이들에 대해서는 본 명세서 다른 곳에서 설명한다. 태반 관류물, 분리된 태반 관류물 세포 및/또는 태반 줄기세포의 조합은 뼈 결함의 치료나 뼈 결함이 있는 개체의 치료에 유용하며 이는 앞서 4절에 기술하였다.

치료 방법의 구체적 태양에서는 이 태반 줄기세포는 온전한(처리하지 않은) 태반 관류물 속에 포함되어 있다. 다른 구체적 태양에서는 이 태반 세포가 태반 관류물 세포이다. 다른 구체적 태양에서는 이 태반 세포가 태반 줄기세포이다. 더 구체적인 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 비부착성이다. 몇몇 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포의 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 일부 다른 실시 태양에서는, 상기 태반 줄기세포가 부착성이다. 구체적 실시 태양에서는 이 태반 줄기세포가 CD200⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺; CD200⁺이고 OCT-4⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 OCT-4⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 상기의 조합 중 어느 것이라도 만족할 수 있다. 상기 비부착성 태반 줄기세포의 더 구체적인 실시 태양에서는, 상기 분리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺; 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺; 상기 분리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; 제1항의 상기 분리된 줄기세포에서 상기 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD45^-, OCT-4⁺, CD200⁺; 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포가 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-; 및/또는 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 OCT-4⁺ 줄기세포가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포군을 증폭한다.

태반 관류물, 태반 관류물 세포나 태반 줄기세포를 현탁액 또는 주사 가능한 액체로 투여할 때에는 이 세포를 정맥하 투여하거나 바람직하게는 뼈 결함의 부위, 예를 들어 골절 부위에 투여할 수 있다.

본 명세서의 다른 측면에서는 주사용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 세포군을 주사용 히알루론산이나 콜라겐과 조합하는 단계를 포함한다. 어느 구체적 실시 태양에서는 이 태반 세포가 온전한(처리하지 않은) 태반 관류물 속에 포함되어 있다. 다른 구체적 태양에서는 이 태반 세포가 태반 관류물 세포이다. 다른 구체적 태양에서는 이 태반 세포가 태반 줄기세포이다. 더 구체적인 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 비부착성이다. 몇몇 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 줄기세포가 CD34⁺이고 CD44^-이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺또는 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 줄기세포가 CD9⁺, CD54⁺, CD90⁺이고 CD166⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺또는 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 상기 분리된 줄기세포가 CD31⁺, CD117⁺, CD133⁺이고 CD200⁺이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포의 적어도 약 70%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 몇몇 실시 태양에서는, 이 줄기세포의 적어도 약 90%가 CD34⁺이고 CD44^-인 줄기세포이다. 일부 다른 실시 태양에서는, 상기 태반 줄기세포가 부착성이다. 구체적 실시 태양에서는 이 태반 줄기세포가 CD200⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺; CD200⁺이고 OCT-4⁺; CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; CD73⁺, CD105⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 OCT-4⁺이면서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배아유사체의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양하였을 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나; 혹은 상기의 조합 중 어느 것이라도 만족할 수 있다. 상기 비부착성 태반 줄기세포의 더 구체적인 실시 태양에서는, 상기 분리된 CD200⁺, HLA-G⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺; 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺; 상기 분리된 CD200⁺, OCT-4⁺ 줄기세포가 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺; 제1항의 상기 분리된 줄기세포에서 상기 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포가 CD34^-, CD45^-, OCT-4⁺, CD200⁺; 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 CD73⁺, CD105⁺ 줄기세포가 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-; 및/또는 하나 이상의 배아유사체 형성을 촉진하는 상기 분리된 OCT-4⁺ 줄기세포가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-이다. 몇몇 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포군을 증폭한다. 몇몇 실시 태양에서는 이 조성물이 주사용 히알루론산을 함유한다. 몇몇 태양에서는 이 조성물이 주사용 콜라겐을 함유한다. 본 명세서에서는 또한 비부착성인 줄기세포군과 주사용 히알루론산이나 콜라겐을 함유하는 조성물을 제공한다.

태반 줄기세포를 이들 줄기세포의 분화를 가져 오는 조건 하에서 배양하지 않고 투여할 수도 있다. 한편으로 이 줄기세포를 예를 들어 골 형성 배지 속에서, 예를 들어 투여 전 약 1~20일 동안 배양할 수 있다. 한편으로, 태반 줄기세포를 분리하고 매트릭스 위에 파종한 다음, 이를 골 형성 배지 속에서, 예를 들어 약 1~20일 동안 배양할 수 있다. 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 예를 들어 골 형성 배지 속에서 예를 들어, 약 1~20일 동안 배양하고 매트릭스 위에 파종한 다음, 본 명세서에서 기술하는 골 형성 배지 속에서 예를 들어 약 1~20일 동안 배양할 수 있다.

다른 태양에서는 분리된 태반 줄기세포군을 자가 유래나 이종 유래 조직의 재생 또는 대체에 관한 치료나 요법에 쓸 수 있는데, 여기에는 각막 상피의 결함, 연골 복구, 얼굴 박피, 점막, 고막, 창자의 내면, 신경학적 구조(예를 들어 망막, 기저막의 청각 뉴런, 후각 상피의 후각 뉴런), 피부의 외상성 손상의 화상과 상처 복구 또는 손상되거나 병든 장기나 조직의 재구성이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.

몇몇 실시 태양에서는 조혈 줄기세포의 전부 또는 일부 손실을 입은 개체, 예를 들어 치사량에 못미치는 (공업적, 의학적 또는 군사적을 불문하는) 방사선에 노출된 개체, 암 치료 등의 일환으로 골수 절제를 받은 개체의 조혈 기능 재구성에 분리된 태반 줄기세포군을 사용한다. 분리된 태반 유래 줄기세포군은 골수 또는 골수나 골수에서 유래한 줄기세포군을 대체하거나 보충하는데 쓰일 수 있다. 전형적인 경우에 골수 이식에서의 골수 착상(engraftment)을 위하여 조직 환자 체중 1 kg에 대하여 골수 유래 단핵세포를 대략 1×10⁸ 내지 2×10⁸개를 주입한다(즉 70 kg 기증자로부터는 골수 약 70 mL). 70 mL를 얻으려면 다량을 기증하여야 하고, 기증 과정에서 기증자의 혈액을 상당량 잃게 된다. 여러 실시 태양에선 조혈 기능 재구성을 위한 분리된 태반 줄기세포군이 태반 줄기세포를 대략, 적어도 또는 많아야 태반 줄기세포 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹개 또는 그 이상 함유한다.

본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포는 단독으로 또는 다른 줄기세포나 전구세포군과 함께 조직이나 장기의 생체내 제조에 쓰일 수 있다. 본 명세서에서 제공하는 방법에는 태반에서 얻는 세포, 예를 들어 줄기세포나 전구세포를 이용하여 매트릭스에 파종하고 이를 적절한 조건 하에서 배양함으로써 세포가 분화하여 이 매트릭스를 채우도록 하는 것을 망라하고 있다. 본 명세서에서 제공하는 방법으로 얻는 조직과 장기는 연구와 치료 용도를 비롯한 여러 가지 용도에 쓸 수 있다.

한 바람직한 실시 태양에서는 본 명세서에서 제공하는 부착성 태반 줄기세포와 그러한 줄기세포의 세포군을 HLA 일치 또는 불일치 형태의 조혈 이식을 비롯한 자가 이식과 동종간(同種間 allogenic) 이식에 쓸 수 있다. 태반 줄기세포를 동종간 조혈 이식 용도로 사용하는 한 실시 태양에서는, 기증된 세포의 면역 거부를 줄이거나, 면역 관용을 달성(예를 들어 미국 특허 제5,800,539와 5,806,529호를 보라)하기 위하여 숙주를 처리한다. 다른 실시 태양에서는 면역 거부를 줄이거나 면역 관용을 이루기 위하여 숙주를 처리하지 않는다.

본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 줄기세포군과 함께 치료용 이식, 예를 들어 간, 이자, 콩팥, 허파, 신경계, 근육계, 뼈, 골수, 가슴샘, 지라, 점막 조직, 생식샘이나 털의 줄기 또는 전구세포를 보강하거나 대체하는 데에 쓰일 수 있다. 덧붙여서 전구세포가 전형적으로 쓰이는 치료 또는 연구 분야에 태반 줄기세포가 특정한 류의 전구세포(예를 들어 연골세포, 간세포, 조혈세포, 이자 중간엽 세포, 신경모세포, 근육 전구세포 등) 대신 쓰일 수 있다.

본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포와 그 세포군을 연골, 힘줄, 인대의 보강, 복구 또는 대체에 쓸 수 있다. 예를 들어 일부 태양에서는 본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포로부터 자란 연골 조직 구성체로 대체할 수 있다. 다른 실시 태양에서는 본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포로부터 성장시킨 대체용 연골 조직 구성체(construct)로 보철물(예를 들어 엉덩이 보철물)을 피복한다. 다른 태양에서는 태반 줄기세포로부터 자라난 연골 조직 구성체를 가지고 연결부(joint)를재구성한다. 연골 조직 구성체를 또한 여러 종류의 연결부에 대한 주요한 재건 수술에 쓸 수 있다.(Resnick과 Niwayama 편집, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 제2판, W. B. Saunders Co,(1988)를 보라).

본 명세서에서 제공하는 부착성 태반 줄기세포는 예를 들어 외상, 대사 장애나 질병에서 비롯하는 조직과 장기의 손상을 복구하는데 쓰일 수 있다. 이러한 태양에서는 환자에게 태반 줄기세포를 단독으로 또는 다른 줄기나 전구세포와 함께 투여하여 질병의 결과 손상된 조직이나 장기를 재생하거나 복원할 수 있다.

8.2 태반 줄기세포 함유 조성물

본 명세서에서는 태반 줄기세포 또는 그들로부터 얻은 생분자를 함유하는 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 제공하는 부착성 줄기세포는 예를 들어 연구 또는 치료 용도에 사용하기 위하여, 생리학적으로 적합 또는 의학적으로 적합한 모든 화합물, 조성물 또는 장치와 결합하여 쓰일 수 있다.

8.2.1 냉동보존된 태반 줄기세포

본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포군은 장래의 사용을 위하여 보존, 예를 들어 냉동보존될 수 있다. 줄기세포와 같은 세포의 냉동 보존을 위한 방법은 잘 알려져 있다. 태반 줄기세포군은 개체에게 쉽게 투여할 수 있는 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명은 의학 용도에 적합한 용기에 담긴 태반 줄기세포군을 제공한다. 이러한 용기의 예로는 무균 플라스틱백, 플라스크, 단지(jar) 또는 상기 태반 줄기세포군을 쉽게 꺼낼 수 있는 다른 용기를 들 수 있다. 예를 들어 이 용기는 혈액백 또는 다른 플라스틱, 수용 대상에게 정맥 투여하기 적합한, 의학적으로 허용되는 백일 수 있다. 이 용기는 통합한 줄기세포군의 냉동보존을 지원하는 것이 바람직하다.

냉동보존된 면역억제성 태반 줄기세포군은 한 기증자 또는 여러 기증자로부터 유래한 태반 줄기세포를 포함할 수 있다. 이 태반 줄기세포군은 의도한 수용자와 완벽하게 HLA 유형이 맞거나, 부분적 또는 완전히 HLA-불일치할 수 있다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 태반 줄기세포군을 용기에 담은 조성물을 제공한다. 한 특정 실시 태양에서는 이 줄기세포군을 냉동보존한다. 다른 특정 실시 태양에서는 이 용기가 백, 플라스크 또는 단지이다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 백이 무균 플라스틱 백이다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 백이 상기 태반 줄기세포군의 정맥 투여에 적합하거나, 이를 허용하거나 촉진한다. 이 백은 투여 전에 또는 도중에 약물 등의 용액이 하나 이상 상기 태반 줄기세포와 섞일 수 있도록 서로 연결된 내부 빈 공간(lumen) 또는 구획을 여러 가지고 있을 수 있다. 다른 구체적 실시 태양에서는 이 조성물이 통합 줄기세포군의 냉동보존을 촉진하는 화합물을 하나 이상 함유한다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포군이 생리적으로 허용되는 수용액 속에 함유되어 있다. 더 특정한 실시 태양에서는 상기 생리적으로 허용되는 수용액이 0.9% NaCl 용액이다. 다른 구체적 실시 태양에서, 상기 태반 줄기세포군은 상기 줄기세포군의 투여 대상자와 HLA 유형이 일치하는 태반 세포를 함유한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 통합 줄기세포군은 적어도 부분적으로 상기 줄기세포군의 투여 대상자와 HLA-불일치하는 태반 세포를 함유한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 복수의 기증자에서 유래한 것이다.

8.2.2 약학 조성물

태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군을 생체 내에서 사용하기 위한 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군을 약학적으로 허용되는 담체속에 포함하고 있는데, 이러한 담체로는 식염수 또는 생체내 투여에 적합한 다른 생리적으로 허용되는 용액을 들 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 태반 줄기세포군 또는 본 명세서에서 언급한 태반 줄기세포 유형 중 아무 것이나 함유하여도 좋다. 본 발명의 약학 조성물은 태아, 모체 또는 양쪽 태반 줄기세포를 모두 갖추고 있을 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 나아가 단일 기증자 또는 그 태반이나 여러 기증자 또는 그 태반들에서 유래한 태반 줄기세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 태반 줄기세포를 얼마든지 함유할 수 있다. 예를 들어 여러 실시 태양에서 태반 줄기세포 1회 투여량은 적어도 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹또는 이보다 더 많은 수의 태반 줄기세포를 함유하거나, 적어도 이 정도 수의 줄기세포를 함유하거나, 혹은 이 정도 수 이하의 줄기세포를 함유한다.

본 발명의 약학 조성물은 세포 생존률이 50% 이상(즉 세포군 속의 세포 중 적어도 50%가 기능을 발휘하거나 살아 있음)인 세포군을 포함한다. 적어도 세포군 속 세포의 60%가 생존하고 있는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 상기 약학 조성물 속 세포군의 생존률이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%이다.

본 명세서에서 제공하는 약학 조성물은 예를 들어 골수 착상을 촉진하는 화합물(예를 들어 항-T-세포 수용체 항체, 면역 억제제 등), 알부민, 덱스트란 40, 젤라틴, 하이드록시에틸 전분 등의 안정제를 하나 이상 함유할 수 있다.

8.2.3 태반 줄기세포의 조건 배지

본 발명의 태반 줄기세포를 이용하여 조건 배지(conditioned medium), 즉 상기 줄기세포가 분비 또는 배설하는 생분자를 하나 이상 함유하는 배지를 제조할 수 있다. 많은 실시 태양에서, 이 조건 배지는 태반 줄기세포가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 또는 더 오래 동안 성장한 배지를 포함하고 있다. 다른 실시 태양에서 조건 배지는 태반 줄기세포가 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 세포 합류하거나 100% 세포 합류에 이른 배지를 포함하고 있다. 이러한 조건 배지는 별도의 태반 줄기세포군 또는 다른 종류의 줄기세포의 배양을 지원할 수 있다. 다른 실시 태양에서 조건 배지는 태반 줄기세포가 성체 세포 유형으로 분화한 배지를 포함하고 있다. 다른 실시 태양에서 본 발명의 조건 배지는 태반 줄기세포와 비태반 줄기세포가 배양된 배지를 포함한다.

8.2.4 태반 줄기세포를 함유하는 매트릭스

본 명세서에서는 나아가 태반 줄기세포나 태반 줄기세포군을 함유하는 하이드로겔, 스캐폴드(scaffold) 등의 매트릭스를 제공한다. 몇몇 실시 태양에서는 이매트릭스가 뼈 결함을 치료하는데 유용하다고 이 분야에 알려진 모든 기질일 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이 매트릭스가 인산β-트리칼슘(β-tricalcium phosphate) 기질, 인산β-트리칼슘-콜라겐 기질, 콜라겐 기질, 인산칼슘 기질, 무기질 침착(mineralized) 콜라겐 기질, 히알루론산(hyaluronic acid) 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 매트릭스가 인산β-트리칼슘 기질이다. 몇몇 실시 태양에서는 이 매트릭스 속 콜라겐이 태반 콜라겐이다. 태반 콜라겐을 분리하고 제조하는 방법이나 이를 위한 조성물에 관한 문헌은 광범위한데, 예를 들어 2006년 6월 9일 출원한 미국 특허 출원 제11/450,934호가 있다.

태반 줄기세포는 세포 분화 단계 이전 또는 이후에 뼈 결함 치료를 위하여 매트릭스에 파종할 수 있다. 예를 들어 태반 줄기세포를 골 형성 배지 속에서, 예를 들어 약 1~20일 동안 배양하고 매트릭스 위에 파종할 수 있다. 한편으로 태반 줄기세포를 분리하고 매트릭스 위에 파종한 다음, 이를 본 명세서에서 기술하는 골 형성 배지 속에서, 예를 들어 약 1~20일 동안 배양할 수 있다. 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 예를 들어 골 형성 배지 속에서 예를 들어, 약 1~20일 동안 배양하고 매트릭스 위에 파종한 다음, 본 명세서에서 기술하는 골 형성 배지 속에서 예를 들어 약 1~20일 동안 배양할 수 있다.

본 발명의 태반 줄기세포는 천연 매트릭스, 예를 들어 양막 소재와 같은 태반의 생물질에 파종할 수 있다. 이러한 양막 소재로는 포유류 태반에서 바로 절제된 양막, 고정되거나 열처리된 양막, 실질적으로 건조(즉 <20% H₂O)한 양막, 융모막, 실질적으로 건조한 융모막, 실질적으로 건조한 양막과 융모막 등을 들 수 있다. 태반 줄기세포를 파종할 수 있는 바람직한 태반 생물질은 Hariri의 미국 출원 공보 제2004/0048796호에 기재되어 있다. 이러한 매트릭스, 예를 들어 하이드로겔은 태반 줄기세포 조건 배지 속에 담그거나 이를 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 태반 줄기세포는 예를 들어, 주사 등에 적합한 하이드로겔 용액 속에 현탁할 수 있다. 이러한 조성물에 적합한 하이드로겔로는 RAD16과 같은 자가 조립(self-assembling) 펩티드를 들 수 있다. 한 실시 태양에서는 상기 세포를 함유하는 하이드로겔 용액을, 예를 들어 틀 속에서 굳혀서 착상(implantation)을 위하여 그 속에 세포를 함유하는 매트릭스를 형성할 수 있다. 이러한 매트릭스 속의 태반 줄기세포를 배양하여 착상 전에 체세포분열로 세포를 증폭할 수도 있다. 상기 하이드로겔은 예를 들어 유기 고분자(천연 또는 합성)로서 공유, 이온 또는 수소 결합을 통하여 가교되어 물을 가둘 수 있는 열린 3차원 격자를 만듦으로써 겔을 이룬다. 하이드로겔 형성 물질로는 알긴산과 그 염과 같은 다당류, 펩티드, 폴리포스파진(polyphosphazine)과 폴리아크릴레이트 등 이온결합으로 가교되는 것들 혹은 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체와 같이 각각 온도, pH에 의하여 가교되는 블록 공중합체를 들 수 있다. 몇몇 실시 태양에서 본 말명의 상기 하이드로겔 또는 매트릭스는 생분해성이다.

본 발명의 몇몇 실시 태양에서는 상기 제형에 제자리(in situ) 중합성 겔이 포함된다(예를 들어 미국 특허 출원공보 제2002/0022676호, Anseth 외, J. Control Release, 78(l~3):199~209 (2002) 또는 Wang 외, Biomaterials, 24(22):3969~80(2003)을 보라).

몇몇 실시 태양에서 이 고분자는 적어도 수용액 속에서 부분적으로 용해성인데, 수용액으로는 물, 완충 염 용액 또는 하전된 측쇄를 가지는 수성 알코올 용액 또는 그의 단일가 이온염을 들 수 있다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측쇄를 가지는 고분자의 예로는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메트아크릴산), 아크릴산과 메트아크릴산의 공중합체, 폴리(아세트산비닐)과 술폰화 폴리스티렌과 같은 술폰화 고분자를 들 수 있다. 산성 측쇄를 가지는 공중합체로서 아크릴산 또는 메트아크릴산과 비닐에테르 모노머 또는 고분자를 반응시켜 얻는 공중합체도 사용할 수 있다. 산성 측쇄의 예로는 카르복시기, 술폰산기, 할로겐화(바람직하게는 플루오르화) 알코올기, 페놀성 OH기와 산성 OH기가 있다.

본 발명의 태반 줄기세포 또는 이들의 공배양물을 3차원 구조 또는 골격에 파종된 다음 생체 내에서 착상(implant)시킬 수 있다. 이러한 구조는 하나 이상의 모든 성장 인자, 세포, 약물 혹은 조직 형성을 촉진시키거나 본 발명의 실시를 다른 방식으로 향상·개선하는 다른 성분과 조합함으로써 착상될 수 있다.

본 발명에 쓰일 수 있는 3차원 골격의 예로는 부직 매트, 다공성 포말 또는 자가 조립 펩티드를 들 수 있다. 부직 매트는 글리콜산과 락트산의 합성 흡수성 공중합체(PGA/PLA 등)를 포함하는 섬유(미국 뉴저지주 Somerville의 Ethicon Inc.사의 Vicryl)로부터 만들 수 있다. 포말은 예를 들어 동결건조 또는 냉동진공건조(미국 특허 제6,355,699호 등을 보라)와 같은 공정에 의하여 제조된 폴리(ε-카프롤락탐)/폴리(글리콜산)(PCL/PGA) 공중합체로 구성된 포말을 3차원 골격으로 쓸 수도 있다.

본 발명의 태반 줄기세포는 생리적으로 허용되는 세라믹 소재에 파종하거나 접촉시킬 수 있는데, 이러한 세라믹 소재에는 인산모노-, 인산디-, 인산트리-, 인산알파트리-, 인산베타트리- 와 인산테트라칼슘, 수산화인회석, 불소인회석, 황산칼슘, 플루오르화칼슘, 산화칼슘, 탄산칼슘, 인산마그네슘칼슘, BIOGLASS(등록상표)와 같이 생활성이 있는 유리 및 이들의 혼합물이 포함되지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 현재 시판 중인 생체적합한 다공성 세라믹 소재에는 SURGIBONE(캐나다 CanMedica Corp.의 등록상표), ENDOBON(프랑스 Merck Biomaterial France의 등록상표), CEROS(스위스 Bettlach의 Mathys AG의 등록상표), 그리고 HEALOS(미국 매사추세츠주 Raynham의 DePuy, Inc.의 상표) VITOSS(등록상표), RHAKOSS(상표) 및 CORTOSS(미국 펜실베니아주 Malvern의 Orthovita의 등록상표)와 같은 광물화 콜라겐 뼈 이식 제품 들이 포함된다. 이러한 구조는 천연 및/또는 합성 재료의 혼합물, 블렌드 또는 복합물일 수 있다.

다른 실시 태양에서 태반 줄기세포는 펠트에 파종하거나 접촉시킬 수 있는데, 이러한 펠트는 예를 들어 PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 블렌드 혹은 히알루론산과 같은 생흡수성 소재로부터 제조한 다중 필라멘트사(multifilament yarn)로 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포를 복합 구조일 수 있는 포말 골격(foam scaffold)에 파종할 수 있다. 이러한 포말 골격은 체내에서 수리, 교체, 보강되어야 할 특정 구조 부분의 모양처럼 유용한 형태로 성형할 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이 구조를 본 발명의 세포를 접종하기 전에 예를 들어 0.1 M 아세트산 처리하고, 이어 폴리리신, PBS 및/또는 콜라겐과 배양하여 세포 부착을 향상시킬 수 있다. 매트릭스의 외부면을 변형하여 세포의 부착과 성장 및 조직의 분화를 향상할 수 있는데, 이러한 변형에는 매트릭스의 혈장 피복 또는 하나 이상의 단백질(예를 들어 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코스아미노글리칸(예를 들어 황산헤파린, 황산-4-콘드로이틴, 황산-6-콘드로이틴, 황산데르마탄, 황산케라틴 등), 세포 매트릭스 및/또는 다른 물질의 부가가 있으며, 상기 물질은 젤라틴, 알긴산염, 한천, 아가로스와 식물 검 등이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 실시 태양에서는 이 3차원 골격을 혈전 형성을 방지하는 물질로 처리하거나, 이 3차원 골격이 그러한 물질을 함유한다. 이러한 물질과 그 처리는 내피 성장, 이동과 세포외 매트릭스 축적을 촉진하고 유지한다. 이러한 물질과 처리법의 예로는 라미닌과 제IV형 콜라겐과 같은 기저막 단백질, EPTFE 등의 합성 물질, PURSPAN(미국 캘리포니아주 버클리의 The Polymer Technonolgy Group Inc.의 상표) 등의 분절된 폴리우레탄요소 실리콘을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 3차원 골격은 또한 헤파린과 같은 항혈전 형성제를 함유할 수 있다. 태반 줄기세포의 파종 전에 상기 골격을 처리하여 표면 전하를 변화(예를 들어 혈장으로 피복)시킬 수 있다. 이 스캐폴드는 나아가 뼈 성장을 촉진 및/또는 골 흡수를 억제하는 제제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어 이 스케폴드는 뼈 형태 형성 단백질, 예를 들어 BMP-2 및/또는 BMP-7, WNT 억제제 등을 함유할 수 있다.

8.3 무한증식화된 태반 줄기세포주

포유류 태반 세포는 성장 촉진 유전자를 함유하는 모든 적절한 벡터를 이용하여 전환(transfection)됨으로써 조건부로 무한 증식(conditionally immortalized)할 수 있는데, 여기서 성장 촉진 유전자는 적절한 조건 하에서 전환된 세포의 성장을 촉진하여, 상기 성장 촉진 단백질의 제조 및/또는 활성을 외부 인자로 조절할 수 있게 하는 것이다. 상기 성장 촉진 유전자의 바람직한 실시 태양은 종양유전자인데, 예를 들면 v-myc, N-myc, c-myc, p53, SV40 대형 T 항원, 폴리오마 대형 T 항원, E1a 아데노바이러스 또는 사람 파필로마바이러스의 E7 단백질이 있지만 여기에 한정되지는 않는다.

상기 성장 촉진 단백질의 외부 조절은 상기 성장 촉진 유전자를 외부 조절 가능한 프로모터, 예를 들어 전환된 세포의 온도를 조절하거나 세포와 접촉하는 배지의 조성을 바꿈으로써 그 활성을 조절할 수 있는 프로모터의 조절하에 둠으로써 이룰 수 있다. 한 실시 태양에서는 테트라사이클린(tet) 조절 유전자 발현 시스템(Gossen 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992 또는 Hoshimaru 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996을 보라)을 이용할 수 있다. tet의 부재 하에서는 이 벡터 내부에 자리잡은, tet에 의하여 조절되는 트랜스 활성화 인자(tTA)가 ph _CMV ^* _-1 로부터 전사를 강하게 활성화하는데, ph _CMV ^* _- ₁ 는 사람 사이토메갈로바이러스의 최소 프로모터와 tet 조절 유전자 서열에 연결된 것이다. tTA는 대장균의 전위유전단위(transposon)-10 유래 tet 저항 오페론의 억제자(tetR)와 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP16의 산성 영역을 융합한 단백질이다. 낮고 독성이 없는 tet 농도(약 0.01~1.0 ㎍/mL)에서는 tTA에 의한 트랜스 활성화가 거의 중단된다.

한 실시 태양에서 이 벡터는 선별용 표지, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함한다. 세균 네오마이신 내성 유전자(neo ^R )는 본 발명에 쓰일 수 있는 표지의 한 예이다. neo ^R 을 가진 세포는 100~200 ㎍/mL의 G418을 성장 배지에 부가하는 것과 같이 당업자에게 잘 알려진 수단을 써서 선별할 수 있다.

세포의 전환은 역전사 바이러스 감염과 같이 당업자에게 잘 알려진(하지만 이것만으로 제한되지는 않는) 모든 수단을 사용하여 이루어질 수 있다. 일반적으로 세포 배양물의 전환은 상기 벡터를 생산하는 세포주로부터 수집한 조절 배지와 N2 보강 물질을 함유하는 DMEM/F12의 혼합물 속에서 세포를 배양함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어 상술한 바에 따라 마련한 태반 세포 배양물을 예를 들어 닷새 동안 시험관내 배양 후 상기 조절 배지 1부피와 N2 보강 물질을 함유한 DMEM/F12 2부피의 혼합물 속에서 약 20시간 동안 배양함으로써 감염시킬 수 있다. 선별용 표지를 갖춘 전환 세포는 앞서 설명한 바와 같이 선별할 수 있다.

세포 전환 후에 배양물을 세포 증식을 허용하는 표면, 예를 들어 24 시간 동안 적어도 30%의 세포가 배증하도록 허용하는 표면 위에 계대한다. 이때 기질은 폴리오르니틴(10 ㎍/mL) 및/또는 라미닌(10 ㎍/mL)으로 피복한 조직 배양 플라스틱으로 이루어진 폴리오르니틴/라미닌 기질, 폴리리신/라미닌 기질 또는 피브로넥틴으로 처리한 표면인 것이 바람직하다. 이어서 이 배양물에 3~4 일마다 성장 배지를 가하여 주는데, 이 배지는 하나 이상의 증식 향상 인자로 보강되었거나 보강되지 않았을 수 있다. 증식 향상 인자는 배양물이 50% 세포 합류 수준 미만일 때 성장 배지에 추가한다.

80~95% 세포 합류 수준일 때 트립신 처리와 같은 표준적인 방법을 이용하여 조건부 무한 증식 태반 줄기세포주를 계대할 수 있다. 약 스무번째 계대까지는 몇몇 실시 태양에서는 선별(예를 들어 네오마이신 내성 유전자를 가지는 세포를 선별용 G418 부가에 의한)을 유지하는 것이 바람직하다. 세포를 액체 질소에 얼려서 장기간 보존할 수 있다.

앞서 설명한 방법에 따라 마련한 조건부 무한 증식 사람 태반 줄기세포주로부터 클론 세포주를 분리할 수 있다. 일반적으로 한계 희석(limit dilution)이나 클로닝 고리(cloning ring) 등의 표준적인 방법을 이용하여 이러한 클론 세포주를 분리하고 증폭할 수 있다. 클론 세포주는 일반적으로 앞서 기술한 방식에 따라 영양분을 공급하고 계대해 줄 수 있다.

조건부 무한증식 사람 태반 줄기세포주는 클론성(clonal)일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없으며, 분화를 촉진하는 배양 조건하에서 상기 성장 촉진 단백질의 제조 및/또는 활성을 억제함으로써 분화하도록 유도할 수 있는 것이 일반적인 경우이다. 예를 들어, 상기 성장 촉진 단백질을 암호화하는 유전자가 외부 조절 가능한 프로모터 조절을 받는 경우, 배지의 온도 또는 조성을 변화시켜 성장 촉진 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 앞서 논한 테트라사이클린 조절 유전자 발현 시스템에서는 테트라사이클린을 가하여 상기 성장 인자의 전사를 억제함으로써 분화를 이룰 수 있다. 일반적으로 1 ㎍/mL 테트라사이클린을 4~5일 동안 처리하면 분화를 일으키기에 충분하다. 더 분화를 일으키려면 성장 배지에 추가적인 성분을 넣을 수 있다.

8.4 분석 방법

본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포는 배양 조건, 환경 요인, 분자(예를 들어 생분자, 소형 무기 분자 등) 등이 줄기세포의 증식, 증폭 및/또는 분화에 미치는 영향을 이러한 조건에 처하지 않은 태반 줄기세포와 비교하여 분석하는데 쓰일 수 있다.

한 바람직한 실시 태양에서는 본 명세서에서 제공하는 태반 줄기세포를 어느 분자와 접촉시켜 증식, 증폭 또는 세포 분화의 변화를 분석한다. 예를 들어 골 형성 분화는 알칼리성 인산 분해 효소 활성 및/또는 칼슘 침착을 관찰하여 분석할 수 있다.

본 명세서의 한 실시 태양에서는 예를 들어, 복수의 태반 줄기세포의 증식을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 복수의 태반 줄기세포를 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 화합물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 이 때 상기 복수의 줄기세포 증식에 상기 화합물과 접촉하지 못한 복수의 줄기세포의 경우와 비교하여 검출 가능한 변화가 일어나면 상기 화합물은 태반 줄기세포의 증식을 조절하는 화합물로 동정하게 된다. 어느 구체적인 태양에서, 상기 화합물은 증식 억제제로 동정된다. 다른 구체적 태양에서 상기 화합물은 증식 향상제로 동정된다.

본 명세서의 다른 태양에서는 예를 들어, 복수의 태반 줄기세포의 증폭(expansion)을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 복수의 태반 줄기세포를 상기 화합물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 이 때 상기 복수의 줄기세포 증폭에 상기 화합물과 접촉하지 못한 복수의 줄기세포의 경우와 비교하여 검출 가능한 변화가 일어나면 상기 화합물은 태반 줄기세포의 증폭을 조절하는 화합물로 동정하게 된다. 어느 구체적인 태양에서, 상기 화합물은 증폭 억제제로 동정된다. 다른 구체적 태양에서 상기 화합물은 증폭 향상제로 동정된다.

본 명세서의 다른 실시 태양에서는 복수의 태반 줄기세포의 세포 분화를 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 분화를 허용하는 조건 하에서 상기 줄기세포를 상기 화합물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 이 때 상기 줄기세포 분화에 상기 화합물과 접촉하지 못한 줄기세포의 경우와 비교하여 검출 가능한 변화가 일어나면 상기 화합물은 태반 줄기세포의 분화를 조절하는 화합물로 동정하게 된다. 어느 구체적인 태양에서, 상기 화합물은 분화 억제제로 동정된다. 다른 구체적 태양에서 상기 화합물은 분화 향상제로 동정된다.

도 1은 (A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막, (D) 양막-융모막판(amnion-chorion plate) 또는 (E) 제대 줄기세포에서 얻은 태반 줄기세포의 생존률(viability)을 나타낸다. x축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.

도 2는 A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막, (D) 양막-융모막판 또는 (E) 제대에 서 얻은 세포 중 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포의 백분율을 FACSCalibur로 측정한 것을 나타낸다. x축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.

도 3은 A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막, (D) 양막-융모막판 (E) 제대에서 얻은 세포 중 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포의 백분율을 FACSAria로 측정한 것을 나타낸다. x축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.

도 4는 태반 관류물에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 5는 양막에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 6은 융모막에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 7은 양막-융모막판에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 8은 제대에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 9는 A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막, (D) 양막-융모막판 또는 (E) 제대 유래의 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 평균 발현을 나타낸다.

도 10. 본 연구에 쓰인 양막/융모막(AC), 탯줄(UC), 골수 유래 줄기세포(BM- MSC)와 사람 피부 섬유모세포(NHDF) 세포주들을 배양했을 때의 진행 경과. 모든 세포 배양은 같은 파종과 계대 밀도로 이루어졌다. 동그라미는 RNA 분리에 쓰인 배양물을 가리킨다. 오래된 배양물은 세포 노쇠(senescence) 직전에 수확하였다. UC 세포 배양물 두 개를 38차 배증째에 수확(UC-38)하여 트립신 처리가 유전자 발 현에 미치는 영향을 비교하였다. 모든 다른 세포 배양은 RNA 분리 전에 그 배양 플라스크 속에서 바로 세포 용해하였다.

도 11. 양막/융모막(AC), 탯줄(UC), 골수 유래 줄기세포(BM-MSC)와 사람 피부 섬유모세포(DF) 세포들에서 유전자 8215개의 상대적 발현 수준을 나타낸 선 그래프. x축의 각 세포주 명칭에 연결된 숫자는 유전자 발현 수준을 평가하기 전에 세포를 배양한 날수를 가리킨다. 이 그래프는 GeneSpring 소프트웨어로 분석한 RNA 발현 데이터로부터 제작하였다. AC-03을 선택 조건으로 삼았다.

도 12. 전체 유전자 중에서 AC-03 하의 양막/융모막(AC), 탯줄(UC), 골수 유래 줄기세포(BM-MSC)와 사람 피부 섬유모세포(DF) 세포 속에서 6배 이상 과잉 발현된 유전자들을 나타내는 부분 집합. x축의 각 세포주 명칭에 연결된 숫자는 유전자 발현 수준을 평가하기 전에 세포를 배양한 날수를 가리킨다. 이 그래프는 GeneSpring 소프트웨어로 분석한 RNA 발현 데이터로부터 제작하였다. AC-03을 선택 조건으로 삼았다.

도 13A. 배율 변화 필터링으로 양막/융모막(AC), 탯줄(UC), 골수 유래 줄기세포(BM-MSC)와 사람 피부 섬유모세포(DF) 세포 중에서 태반 줄기세포 특이적이거나 제대 줄기세포 특이적인 유전자를 찾았다. x축의 각 세포주 명칭에 연결된 숫 자는 유전자 발현 수준을 평가하기 전에 세포를 배양한 날수를 가리킨다. 이 그래프는 GeneSpring 소프트웨어로 분석한 RNA 발현 데이터로부터 제작하였다. AC-03을 선택 조건으로 삼았다.

도 14. 서로 다른 배지 조성하에서 배양한 태반 줄기세포(도 14A)와 중간엽 줄기세포(도 14B) 양쪽의 알칼리성 인산 분해 효소(AP) 활성.

도 15A. 서로 다른 두 배지 조성하에서 배양한 태반 줄기세포(도 15A)의 무기질 침착.

도 16A. OS 배지 속에서는 태반 줄기세포에 무기질 침착 유도가 일어나지만 Anthro1B 배지에서는 그렇지 아니하다.

도 17. 서로 다른 스캐폴드 상에서 배양한 태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포의 성장의 진행 경과.

도 18. 인산β-트리칼슘 기질 상에서, OS 배지와 Anthro1B 배지 속에서 자란 태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포의 주사 전자 현미경상(20×).

도 19. 인산β-트리칼슘 기질 상에서, OS 배지와 Anthro1B 배지 속에서 자란 태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포의 주사 전자 현미경상(500×).

도 20. DMEM이 아닌 OS 배지 속에서 배양하면 칼슘 침착이 일어난다는 것을 보여주는 중간엽 줄기세포와 관류한 사람 태반 세포에서 얻은 줄기세포의 알리자린레드 염색 결과.

도 21. 인산β-트리칼슘 기질의 존재 하의 OS 배지 속에서 10일 동안 배양한 후의 중간엽 줄기세포와 줄기세포의 AP 활성.

도 22. 콜라겐 원섬유(fibril)와 (패널 A) 무기질 침착된 콜라겐 원섬유(패널 B)를 나타내는 전자현미경 상.

도 23. 가교한 무기질 침착 콜라겐의 최종 무기질/콜라겐 비율이 투입한 무기질/콜라겐 비율에 가깝다는 것을 보여주는 사진.

도 24. 이식 3주 후 머리뼈 결함의 조직학적 단면. 태반 줄기세포-HEALOS(상표) 체외 이식편(explant)에서 상기 결함 안에 대규모로 뼈 침착이 일어난 것을 볼 수 있다.

도 25A~25C. 이식 7주 후 머리뼈 결함의 X-선 분석. 도 25A: 화살표는 BMP-2+HEALOS(상표)인 양성 대조군을 가리킨다. 도 25B: 화살표는 뼈 침착을 보여 주는 태반 줄기세포+HEALOS 체외 이식편을 가리킨다. 도 25C: 음성 대조군. Healos 단독 조건이고 체외 이식편이 없는 머리뼈 결함.

도 26. 음영 계측법(densitometry)에 의한 뼈 형성 정도의 정량. 그레이스케일(Y 축) 값이 늘어나면 뼈 밀도/침착이 늘어나는 것을 가리킨다. X 축: 치료의 종류.

이하 실시예는 본 명세서의 실시 태양을 예시하기 위한 것이지 어떠한 형태로도 제한하기 위한 것으로 해석해서는 아니된다. 모든 경우에 본 명세서에서 인용하는 모든 참고 문헌은 특허 문헌, 관련 기술 문헌 혹은 기타 여부를 막론하고 인용을 통하여 그 내용이 여기에 포함된다.

1. 실시예 1: 태반 줄기세포의 배양

분만 후의 포유류 태반으로부터 관류 혹은 효소 소화 등의 물리적 파괴에 의하여 태반 줄기세포를 얻을 수 있다. 이 세포를 60% DMEM-LG(Gibco), 40% MCDB-201(Sigma), 2% 소 태아 혈청(FCS) (Hyclone Laboratories), 1×인슐린-트랜스페린-셀렌(selenium, ITS), 1×리놀렌산-소 혈청 알부민(LA-BSA), 10^-9M 덱사메타손(Sigma), 10^-4M 아스코르브산 2-인산(Sigma), 표피 성장 인자(EGF) 10 ng/mL(R&D Systems), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF-BB) lO ng/mL(R&D Systems)와 1OO 단위 penicillin/100O 단위 스트렙토마이신을 함유하는 배양 배지 속에서 배양한다.

이 세포들이 배양되는 배양 플라스크는 다음과 같이 마련할 수 있다. 피브로넥틴(FN) 피복 T75 플라스크는 5 ng/mL 사람 피브로넥틴(Sigma F0895)을 함유하는 PBS 5 mL를 이 플라스크에 가하여 마련할 수 있다. 이 피브로넥틴 용액을 담은 플라스크를 37℃에서 30 분 동안 방치한다. 이어서 세포 배양 전 이 피브로넥틴 용액을 덜어낸다. 이러한 처리 이후 플라스크를 건조할 필요는 없다. 혹은 이 플라스크를 4℃에서 하룻밤 동안 또는 더 오랜 동안 피브로넥틴 용액과 접촉시킬 수 있다. 세포 배양 전 이 플라스크를 덥히고 피브로넥틴 용액을 덜어낸다.

관류에 의한 태반 줄기세포의 분리

태반 관류물로부터 태반 줄기세포 배양을 확립하는 절차는 다음과 같다. 피콜 농도구배에서 얻은 세포를 상기와 같이 하여 얻은 피브로넥틴 피복 T75 플라스크에 플라스크 당 50~100×10⁶ 개 세포를 15 mL 배양 배지 속에 담아 파종한다. 5 개에서 10 개의 플라스크에 파종하는 것이 전형적인 경우이다. 이 플라스크를 12~18 시간 동안 37℃에서 배양하여 세포가 부착하도록 한다. 따뜻한 PBS 10 mL를 각 플라스크에 가하여 현탁된 세포를 제거하고 천천히 섞어 준다. 이 배지 15 mL를 덜어낸 다음 새 배양 배지 15 mL를 가한다. 모든 배지는 배양 시작 후 3~4일 후에 갈아준다. 그 다음 배지 교체에서는 배지의 50% 또는 7.5 mL를 덜어내어 갈아준다.

대략 제12일째에 이 세포 배양액을 현미경으로 확인하여 부착 세포 콜로니가 성장했는지 점검한다. 세포 배양이 약 80% 세포 합류 수준, 전형적으로는 배양 시작 후 제13일 내지 제18일째에 이르면 부착 세포를 트립신 소화에 의하여 수확한다. 이 1차 배양으로부터 수확한 세포를 제0 계대(zero)로 일컫는다.

물리적 파괴와 효소 소화에 의한 태반 줄기세포의 분리

소화된 태반 조직으로부터 태반 줄기세포 배양을 확립하는 절차는 아래와 같다. 관류된 태반을 무균 종이 시트 위에 모체 쪽을 위로 하여 올려 놓는다. 모체 쪽 태반 표면층의 약 0.5 cm를 칼날로 제거하고, 그 칼날을 이용하여 대략 1×2×1 cm 크기의 태반 조직 절편을 떼어낸다. 이 태반 조직을 다시 잘게 썰어 약 1 ㎣ 크기 조각으로 나눈다. 이들 조각을 50 mL 팔콘(Falcon) 튜브에 모으고 콜라겐 분해 효소 IA(2 mg/mL, Sigma)로 30분 동안 소화한 다음 트립신-EDTA (0.25%, GIBCO BRL)로 37℃ 물 중탕에서 10분 동안 처리한다. 이렇게 얻은 용액을 40O g에서 10분 동안 실온 원심분리하여 효소 소화 용액을 덜어낸다. 이 펠렛으로부터 약 10배 부피의 PBS 현탁액(예를 들어 5 mL 펠렛은 45 mL PBS에 현탁하게 된다)을 얻은 다음, 그 튜브를 40O g에서 10분 동안 실온 원심분리한다. 이 조직/세포 펠렛을 130 mL의 배양 배지 속에 재현탁한 다음, 피브로넥틴 피복 T75 플라스크마다 13 mL의 세포를 파종한다. 세포를 37℃의 5% 이산화탄소 농도 가습 공기 속에서 배양한다. 이 단계에서는 선택적으로 태반 줄기세포를 냉동보존할 수 있다.

태반 줄기세포의 계대 배양과 증폭

37℃ 물 중탕으로 냉동보존된 세포를 급히 해동한다. 따뜻한 배지 10 mL을 이용하여 냉동 비알로부터 태반 줄기세포를 곧바로 꺼내어 15 mL 짜리 무균 튜브로 옮긴다. 이 세포를 40O g에서 10분 동안 실온 원심분리한다. 이 세포를 피펫을 통하여 10 mL의 따뜻한 배지 속에 조심스레 현탁하고, 트리판블루 배제 실험으로 세포 생존률을 측정한다. 상술한 대로 준비한 피브로넥틴 피복 플라스크에 6000~7000 세포/㎠의 비율(T-75 플라스크 당 약 5×10⁵ 세포)로 세포를 파종한다. 이 세포를 37℃로 5% 이산화탄소와 90% 습도 하에서 배양한다. 세포가 75~85% 세포합류 수준에 이르면 사용된 배지 전부를 플라스크에서 무균 제거한 다음 버린다. 0.25% 트립신/EDTA(w/v) 용액 3 mL를 가하여 세포층을 덮고, 이 세포를 5분 동안 37℃, 5% 이산화탄소와 90% 습도 하에서 배양한다. 이 플라스크를 한 두 차례 가볍게 건드려 세포 탈착을 돕는다. 95%를 넘는 수의 세포가 탈착하고 구형이 되면, 각 T-75 플라스크에 따뜻한 배양 배지 7 mL를 가하고 이 용액을 세포층 표면에 몇 차례 피펫질하여 분산시킨다.

전술한 것처럼 세포 수를 세고 생존률을 측정한 다음, 이 세포를 분당 회전수 1000으로 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 하나의 T-75 플라스크에서 나온 세 포 펠렛을 배양 배지 속에 부드럽게 현탁하고 이를 두 개의 피브로넥틴 피복 T-75 플라스크 표면에 골고루 나눠 폄으로써 세포를 계대한다.

상기 방법을 이용하여 CD105, CD117, CD33, CD73, CD29, CD44, CD10, CD90과 CD133을 발현하면서 CD34 또는 CD45를 발현하지 않는 부착성 태반 줄기세포군들을 동정하였다. 이 세포는 HLA-ABC 및/또는 HLA-DR를 발현할 수도 않을 수도 있다.

2. 태반 구조로부터 태반 줄기세포의 분리

2.1 실험 재료와 방법

2.1.1 관심 대상 표현형의 분리

정상적인 만기 임신으로부터 서로 다른 다섯 종류의 태반 세포군을 얻었다. 모든 기증자는 연구 목적을 위하여 자신의 태반이 사용되는데 대하여 전적으로 서면 동의하였다. 다섯 종류의 세포군을 분석하였다: (1) 태반 관류물(태반 혈관계를 관류하여 얻음) (2) 양막 효소 소화물 (3) 융모막 효소 소화물 (4) 양막-융모막판 효소 소화물과 (5) 제대 효소 소화물. 이들 다양한 조직을 무균 PBS(미국 캘리포니아주 Carlsbad의 Gibco-Invitrogen Corporation)로 세척하고 무균 페트리 접시 위에 각각 올려 놓았다. 이들 조직을 무균 수술용 작은칼(scalpel)로 잘게 썬 다음 50 mL 원추형 Falcon 튜브 속에 담았다. 잘게 썬 조직을 37℃ 물 중탕 속에서 1× 콜라겐 분해 효소(미국 미주리주 세인트루이스 Sigma- Aldrich)로 20분 동안 소화한 다음 원심분리하고, 0.25% 트립신-EDTA(Gibco-Invitrogen Corp)으로 37℃ 물 중탕 속에서 10분 동안 소화하였다. 다양한 이들 조직을 소화 후 원심분리하고 무균 PBS(Gibco-Invitrogen Corp)로 헹구어 주었다. 재구성한 세포를 두 차례 걸 러주었는데 한 번은 100 ㎛ 세포 체(strainers)로써 한 번은 30 ㎛ 분리용 필터로 걸러 잔류 세포외 매트릭스 또는 세포 파편을 없앴다.

2.1.2 세포 생존률 평가와 세포 수 세기

수동 방식의 트리판블루 배제법을 이용하여 소화 후 세포 수와 그 생존률을 측정하였다. 세포를 트리판블루 염료(Sigma-Aldrich)와 1:1 비율로 섞은 다음 이 세포를 혈구계로 세었다.

2.1.3 세포 표면 표지의 특성 분석

HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺인 세포를 특성 분석을 위하여 선별하였다. 이 표현형을 갖춘 세포를 동정하고, 수를 센 다음, 두 대의 Becton-Dickinson사 흐름세포 측정 장치(flow cytometer)인 FACSCalibur와 FACS Aria(미국 캘리포니아주 산호세 Becton-Dickinson)로 특성을 분석하였다. 이들 다양한 태반 세포를 세포 1백만 개당 약 10 μL 항체의 비율로 교반기 위에서 30 분 동안 실온에서 염색하였다. 아래 나타낸 항-사람 항체를 사용하였다: 이소티오시안산플루오레사인 결합(FITC-conjugated) 단일 클론항체로서, HLA-G(미국 노스캐롤라이나주 Raleigh의 Serotec), CD1O(미국 캘리포니아주 산호세의 BD Immunocytometry Systems), CD44(미국 캘리포니아주 산호세의 BD Biosciences Pharmingen)와 CD105(미국 미네소타주 미니아폴리스의 R&D Systems Inc.)에 대한 항체), (피코에리드린(PE) 결합 단일클론 항체로서, CD44, CD200, CD117 및 CD13에 대한 항체(BD Biosciences Pharmingen)), (피코에리드린-CY5(PE Cy5) 결합 스트렙아비딘과 단일 클론항체로서 CD117(BD Biosciences Pharmingen)에 대한 항체), (피코에리드린-Cy7(PE Cy 7) 결합 단일클론 항체로서 CD33과 CD1O 에 대한 항체(BD Biosciences)), (알로피코시아닌(APC) 결합 스트렙아비딘과 단일클론 항체로서 CD38에 대한 것(BD Biosciences Pharmingen)), (그리고 바이오틴화 CD90 (BD Biosciences Pharmingen). 배양 후, 이 세포를 한 번 헹구어 주어 결합하지 않은 항체를 씻어내고, 하룻밤 동안 4℃에서 4% 파라포름알데히드(미국 오하이오주 클리블랜드의 USB)로 고정하였다. 다음 날, 이 세포를 두 차례 헹구어 준 다음, 30 μm 필터로 여과하였다. 이어서 세포를 흐름 세포측정 장치에 넣고 실험하였다.

항 마우스 IgG 항체(BD Biosciences Pharmingen)로 염색한 시료를 음성 대조군으로 사용하여 광전 증배관(PM tube)을 조정하였다. 항 사람 항체 하나만으로 염색한 시료는 양성 대조군으로 사용하여 스펙트럼의 겹침/보상(overlaps/compensation) 정도를 보정하였다.

2.1.4 세포 분류와 배양

한 집단의 태반 세포(관류물, 양막 또는 융모막 유래)를 7-아미노-악티노마이신 D(7AAD, BD Biosciences Pharmingen)와 관심 대상 표현형에 특이적인 단일클론 항체로 염색하였다. 이 세포를 세포 백만 개 당 항체 10 μL의 비율로 염색하고 실온에서 30분 동안 교반기 위에서 배양하였다. 이어서 BD FACS Aria를 이용하여 이들 세포 중 관심 대상 표현형을 발현하는 살아 있는 세포를 분류하고 배지에 고루 발라주었다. 분류(sorted, 관심 대상 세포군)와 "전체"(all, 분류되지 않은 세포) 태반 세포군을 배지에 발라주어 비교하였다. 세포는 피브로넥틴(Sigma- Aldrich) 피복 96 웰 플레이트에 표 1에 나타낸 세포 밀도(세포/cm²)로 발라주었다. 이 세포 밀도, 그리고 해당 세포 유형을 이중으로 혹은 삼중으로 배지에 발라주는지 여부는 해당 관심 표현형을 발현하는 세포의 수에 따라 결정하였다.

배지에 바른 세포의 밀도

96 웰 플레이트 배양
배지 표면에 발라준 세포의 밀도
조 건	분 류(sorted)	전체(all)	전체 최고 밀도
세포원	A
제1집합	40.6×10³/㎠	40.6×10³/㎠	93.8×10³/㎠
제2집합	40.6×10³/㎠	40.6×10³/㎠	93.8×10³/㎠
제3집합	40.6×10³/㎠	40.6×10³/㎠	93.8×10³/㎠
세포원	B
제1집합	6.3×10³/㎠	6.3×10³/㎠	62.5×10³/㎠
제2집합	6.3×10³/㎠	6.3×10³/㎠	62.5×10³/㎠
세포원	C
제1집합	6.3×10³/㎠	6.3×10³/㎠	62.5×10³/㎠
제2집합	6.3×10³/㎠	6.3×10³/㎠	62.5×10³/㎠

완전 배지(60% DMEM-LG (Gibco)와 40% MCDB-201(Sigma)), (2% 소 태아 혈청(Hyclone Labs.)), (1×인슐린-트랜스페린-셀렌(ITS)), (1×리놀렌산-소 혈청 알부민(LA-BSA)), (10^-9 M 덱사메타손(Sigma)), (10^-4M 아스코르브산 2-인산(Sigma)), (표피 성장 인자 10 ng/mL (R&D Systems)), (혈소판 유래 성장 인자(PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems)) 를 상기 96 웰플레이트의 각 웰에 가하고 이 플레이트를 5% CO₂/37℃ 배양기 속에 놓았다. 제7일에 완전 배지 100 μL를 각 웰에 부가하였다. 이 96 웰 플레이트를 약 2주 동안 감시하고, 제12일에 배양물의 최종 평가를 마무리하였다.

2.1.5 데이터 분석

표준적 게이트 기법을 이용하여 FASCalibur 데이터를 FlowJo (Tree star, Inc) 소프트웨어로 분석하였다. BD FACS Aria 데이터는 FACSDiva 소프트웨어(Becton- Dickinson)로 분석하였다. FACS Aria 데이터는 표준적인 게이트 조절법뿐 아니라 중복 신호 구별 게이트 조절법(doublet discrimination gating)을 사용하여 중복신호(doublet)를 최소화하였다. 모든 결과는 마이크로소프트 엑셀에 정리하였고, 본 명세서의 모든 수치는 평균±표준편차(수치, 평균 표준오차 standard error of mean, SEM) 형태로 나타내었다.

2.2 결과

2.2.1 세포 생존률

소화 후 생존률은 수동 트리판블루 배제법(도 1)을 이용하여 평가하였다. (양막, 융모막 또는 양막-융모막 판에서 유래한) 대부분의 소화된 조직의 평균 세포 생존률은 약 70%였다. 양막 유래 세포는 평균 세포 생존률이 74.35%±10.31% (n=6, SEM=4.21), 융모막 유래 세포는 평균 생존률이 78.18%±12.65% (n=4, SEM=6.32), 양막-융모막 판은 평균 생존률이 69.05%±10.80% (n=4, SEM=5.40)이었고 제대 세포는 평균 생존률이 63.30%±20.13% (n=4, SEM=1O.06)였다. 관류물 유래의 세포는 소화 처리하지 않았는데, 가장 높은 생존률인 89.98±6.39% (n=5, SEM=2.86)을 나타내었다.

2.2.2 세포 계량

태반에서 유래한 5 종류의 서로 다른 세포군을 분석하여 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포의 수를 결정하였다. BD FACSCalibur 데이터 분석 결과, 양막, 관류물 그리고 융모막에서 이들 세포의 총수가 가장 많았다. 각각 30.72±21.80 세포 (n=4, SEM=10.90), 26.92±22.56 세포 (n=3, SEM=13.02)와 18.39±6.44 세포 (n=2, SEM=4.55)였다. 양막-융모막판과 탯줄은 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 총수가 가장 적었다. 각각 4.72±4.16 세포(n=3, SEM=2.40)와 3.94±2.58 세포(n=3, SEM=1.49)였다.

마찬가지로 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 총수를 백분율 분석하자, 양막과 태반 관류물이 이러한 표현형을 발현하는 세포를 가장 높은 비율로 함유하였다(각각 0.0319%±0.0202%(n=4, SEM=0.0101)와 0.0269%±0.0226%(n=3, SEM=0.0130)였다. 도 2 참조). 비록 탯줄은 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포를 조금밖에 가지고 있지 않았지만(도 2), 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율은 세번째로 높았다. 0.020±0.0226%(n=3, SEM=0.0131)(도 2). 융모막과 양막-융모막판은 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율이 가장 낮았는데, 각각 0.0184±0.0064%(n=2, SEM=0.0046)와 0.0177±0.0173%(n=3, SEM=0.010)이었다(도 2).

BD FACS Aria 데이터에서도양막, 관류물과 융모막이 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포를 나머지 세포원보다 더 많이 제공하는 것으로 나타나 상기 BD FACSCalibur 분석 결과와 부합하였다. 양막, 관류물, 융모막에서 관심 대상 표현형을 발현하는 세포 총수의 평균은 각각 126.47±55.61 세포(n=15, SEM=14.36), 81.65±34.64 세포(n=20, SEM=7.75)와 51.47±32.41 세포(n=15, SEM=8.37)였다. 양막-융모막판과 탯줄은 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율이 가장 낮았는데, 각각 44.89±37.43 세포(n=9, SEM=12.48)와 11.00±4.03 세포(n=9, SEM=1.34)였다.

BD FACS Aria 데이터는 B와 A 세포원이 가장 높은 비율로 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포를 함유하며, 각각 0.1523±0.0227%(n=15, SEM=0.0059)와 0.0929±0.0419%(n=20, SEM=0.0094)임을 나타내었다(FIG. 3). D 세포원은 관심 대상 표현형을 발현하는 비율이 세번째로 높았는데, 0.0632±0.0333%(n=9, SEM=0.0111)였다(도 3). C와 E 세포원은 관심 대상 표현형을 발현하는 비율이 가장 낮았는데, 각각 0.0623±0.0249%(n=15, SEM=0.0064)와 0.0457±0.0055%(n=9, SEM=0.0018)이었다(도 3).

각 세포원으로부터 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포들을 동정하고 그 수를 계량한 다음에, 나아가 세포가 세포 표면 표지 HLA-G, CD1O, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200과 CD105를 발현하는지 여부를 분석하고 특성 파악하였다.

2.2.3 태반 관류물 유래 세포

관류물 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 CD13표지에 대하여 양성이었다(도 4). 관류물 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 37.15%±38.55%(n=4, SEM=19.28)가 HLA-G 발현), (세포 중 36.37%±21.98%(n=7, SEM=8.31)가 CD33 발현), (세포 중 39.39%±39.91%(n=4, SEM=19.96)가 CD117 발현), (세포 중 54.97%±33.08%(n=4, SEM=16.54)가 CD10 발현), (세포 중 36.79%±11.42%(n=4, SEM=5.71)가 CD44 발현), (세포 중 41.83%±19.42%(n=3, SEM=11.21)가 CD200 발현), (세포 중 74.25%±26.74%(n=3, SEM=15.44)가 CD90 발현), (세포 중 35.10%±23.10%(n=3, SEM=13.34)가 CD38 발현), (세포 중 22.87%±6.87%(n=3, SEM=3.97)가 CD105 발현), (세포 중 25.49%±9.84%(n=3, SEM=5.68)가 CD13 발현.

2.2.4 양막 유래 세포

양막 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었다(도 5). 양막 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 57.27%±41.11%(n=3, SEM=23.73)가 HLA-G 발현), (세포 중 16.23%±15.81%(n=6, SEM=6.46)가 CD33 발현), (세포 중 62.32%±37.89%(n=3, SEM=21.87)가 CD117 발현), (세포 중 9.71%±13.73%(n=3, SEM=7.92)가 CD1O 발현), (세포 중 27.03%±22.65%(n=3, SEM=13.08)가 CD44 발현), (세포 중 6.42%±0.88%(n=2, SEM=0.62)가 CD200 발현), (세포 중 57.61%±22.10%(n=2, SEM=15.63)가 CD90 발현), (세포 중 63.76%±4.40%(n=2, SEM=3.11)가 CD38 발현), (세포 중 20.27%±5.88%(n=2, SEM=4.16)가 CD105 발현), (세포 중 54.37%±13.29%(n=2, SEM=9.40)가 CD13 발현.

2.2.5 융모막 유래 세포

융모막 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38와 CD13에 대하여 양성이었지만 CD33와 CD105의 발현은 가변적이었다(도 6). 융모막 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 53.25%±32.87%(n=3, SEM=18.98)가 HLA-G 발현), (세포 중 15.44%±11.17%(n=6, SEM=4.56)가 CD33 발현), (세포 중 70.76%±11.87%(n=3, SEM=6.86)가 CD117 발현), (세포 중 35.84%±25.96%(n=3, SEM=14.99)가 CD1O 발현), (세포 중 28.76%±6.09%(n=3, SEM=3.52)가 CD44 발현), (세포 중 29.20%±9.47%(n=2, SEM=6.70)가 CD200 발현), (세포 중 54.88%±0.17%(n=2, SEM=0.12)가 CD90 발현), (세포 중 68.63%±44.37%(n=2, SEM=31.37)가 CD38 발현), (세포 중 23.81%±33.67%(n=2, SEM=23.81)가 CD105 발현), (세포 중 53.16%±62.70%(n=2, SEM=44.34)가 CD13 발현.

2.2.6 양막- 융모막판 태반 세포

양막-융모막판 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었다(도 7). 양막-융모막판 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 78.52%±13.13%(n=2, SEM=9.29)가 HLA-G 발현), (세포 중 38.33%±15.74%(n=5, SEM=7.04)가 CD33 발현), (세포 중 69.56%±26.41%(n=2, SEM=18.67)가 CD117 발현), (세포 중 42.44%±53.12%(n=2, SEM=37.56)가 CD1O 발현), (세포 중 32.47%±31.78%(n=2, SEM-22.47)가 CD44 발현), (세포 중 5.56%(n=1)가 CD200 발현), (세포 중 83.33%(n=1)가 CD90 발현), (세포 중 83.52%(n=1)가 CD38 발현), (세포 중 7.25%(n=1)가 CD105 발현), (세포 중 81.16%(n=1)가 CD13 발현.

2.2.7 탯줄 유래 세포

탯줄 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었지만 CD117, CD1O, CD44와 CD200의 발현은 가변적이었다(도 8). 탯줄 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 62.50%±53.03%(n=2, SEM=37.50)가 HLA-G 발현), (세포 중 25.67%±11.28%(n=5, SEM=5.04)가 CD33 발현), (세포 중 44.45%±62.85%(n=2, SEM=44.45)가 CD117 발현), (세포 중 8.33%±11.79%(n=2, SEM=8.33)가 CD1O 발현), (세포 중 21.43%±30.30%(n=2, SEM=21.43)가 CD44 발현), (세포 중 0.0%(n=1)가 CD200 발현), (세포 중 81.25%(n=1)가 CD90 발현), (세포 중 64.29%(n=1)가 CD38 발현), (세포 중 6.25%(n=1)가 CD105 발현), (세포 중 50.0%(n=1)가 CD13 발현.

모든 표지 발현의 평균을 정리한 결과는 도 9에 나타내었다.

2.2.8 BD FACS Aria 분류 결과 보고서

HLA ABC, CD45, CD34와 CD133을 가장 높은 비율로 발현하는 세 가지 서로 다른 세포군(관류물, 양막과 융모막 유래 세포)를 7AAD와 이들 표지에 대한 항체들로 염색하였다. 이 세 종류의 세포군에 대하여 관심 대상 표현형을 발현하는 세포들을 선택하여 세포 분류하였다. BD FACS Aria 세포 분류 결과는 표 2에 나타나 있다.

BD FACS Aria 세포 분류 보고서
세포원	처리한 이벤트 수	분류한 이벤트 수 (관심 대상 표현형)	전체에 대한 %
관류물	135540110	51215	0.037786
양막	7385933	4019	0.054414
융모막	108498122	4016	0.003701

양성인 세포를 선택적으로 분류하여 얻은 세 종류의 서로 다른 세포군("분류")과 그에 대응하는 비분류 세포군을 배지 표면에 발라준 다음 배양하여 그 결과를 제12일째에 평가하였다(표 3). 분류된 관류물 유래 세포는 세포 밀도 40,600 세포/cm²로 발라주었는데, 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다. 관류물 유래 비분류 세포 세 집단 중 둘은 대부분 작고, 둥글며 웰 가장자리에 몇몇 부착세포를 가지는 비부착성 세포를 낳았는데, 이들은 세포 밀도를 40,600 세포/cm²로 하여 배지에 발라주었다. 관류물 유래 비분류 세포 중 배지에 93,800 세포/cm²로 발라준 것들은 대부분 작고, 둥글며 웰 가장자리에 몇몇 부착세포를 가지는 비부착성 세포를 낳았다.

양막 유래 분류 세포는 배지에 6,300 세포/cm²로 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 양막 유래 비분류 세포는 밀도를 6,300 세포/cm²로 하여 배지에 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 양막 유래 비분류 세포 중 밀도를 62,500 세포/cm²로 하여 발라준 것은 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다.

융모막 유래 분류 세포는 배지에 6,300 세포/cm²로 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 융모막 유래 비분류 세포는 밀도를 6,300 세포/cm²로 하여 배지에 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 융모막 유래 비분류 세포 중 밀도를 62,500 세포/cm²로 하여 발라준 것은 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다.

앞서 기술한 태반 줄기세포군은 조직 배양 플라스틱에서 배양하자 조직 배양면에 부착하였고, 특징적인 섬유모세포 형태를 띠었다.

3. 실시예 3 : 폐쇄 회로 관류에 의한 태반 줄기세포의 수집

이 실시예는 관류에 의하여 태반 줄기세포를 수집하는 한 가지 방법을 설명한다.

분만 후 태반을 산후 약 24시간 이내에 구한다. 태반 원반으로부터 대략 3~4 인치의 위치에서 탯줄을 탯줄용 집게(umbilical cord clamp)로 집고, 집게 위쪽을 잘라낸다. 이 탯줄은 버리거나 제대 줄기세포 등을 회수하고/회수하거나 생체 재료 생산을 위한 제대막을 위하여 처리할 수 있다. 과량의 양막과 융모막을 태반에서 잘라내어 태반 모서리 둘레에 약 1/4 인치를 남겨둔다. 잘라낸 막을 버린다.

태반 막의 모서리로부터 시작하여, 양막을 손가락을 이용한 무딘 절개(blunt dissection)로 융모막으로부터 떼어낸다. 양막을 완전히 융모막으로부터 떼어내면 가위로 탯줄 밑동을 따라 잘라서 이 양막을 태반 원반으로부터 떼어 낸다. 이 양막은 버릴 수도 있고, 예를 들어 효소 소화에 의하여 줄기세포를 얻기 위하여 처리하거나, 예를 들어 양막 생체 재료를 생산하기 위하여 처리할 수도 있다.

남은 태반 재료의 태아 쪽의 눈에 보이는 모든 피떡과 잔류 혈액을 멸균 거즈로 씻어 낸 다음, 멸균화하는데, 알코올 면봉이 아닌 요오드 면봉으로 문지른다. 이어서 무균 지혈기(hemostat)로 이 탯줄용 집게 아랫쪽을 가로질러(crosswise) 집은 다음, 이 지혈기를 돌려서 탯줄을 집게 위로 끌어당겨 주름을 잡는다. 이어서 상기 지혈기 아래의 탯줄을 부분적으로 잘라 집게가 지탱하고 있는 탯줄의 단면을 노출시킨다. 혹은 대안적으로 이 탯줄을 무균 지혈기로 집어 준다. 이어서 이 탯줄을 무균 거즈 위에 놓고 상기 지혈기로 붙잡아 잡아당겨 준다. 다음에 상기 지혈기 바로 아래에서 이 탯줄을 똑바로 잘라 혈관에 가까운 모서리를 다시 집게로 집어 준다.

전술한 방식으로 노출된 혈관은 보통 정맥 하나와 동맥 둘인데, 이 혈관들을 확인하고 다음과 같이 개방하게 된다. 닫힌 엘리게이터 집게(closed alligator clamp)를 각 혈관의 잘린 쪽 끝을 통하여 밀어 넣음으로써 혈관을 벌려 여는데, 이 때 혈관 벽을 집게로 뚫지 않도록 조심한다. 집게 끝이 탯줄 밑동의 약간 위에 오게 되면 집게를 밀어 넣는 것을 멈춘다. 이 집게를 이어서 살짝 열어 준 다음 혈관에서 서서히 빼 내어 혈관을 확장한다.

관류 장치나 연동 펌프(peristaltic pump)에 연결된 플라스틱 관을 각 태반 동맥 속에 삽입한다. 250 mL 수집용 백에 연결된 플라스틱 관을 상기 태반 정맥 속에 삽입한다. 이 관에 테이프를 붙인다.

무균 주사 등급의 0.9% NaCl 용액을 소량 써서 새는 곳을 확인한다. 새는 곳이 없으면 펌프 속도를 늘리고 약 750 mL의 주사 등급 0.9% NaCl 용액을 태반 혈관계로 펌프하여 넣는다. 바깥쪽 모서리로부터 탯줄 쪽으로 태반 원반을 부드럽게 마사지하여 관류를 도울 수도 있다. 수집용 백이 다 차면 플라스틱 관과 백을 이어주는 연결부(coupler)로부터 떼어내고 새 백을 관에 연결한다.

수집을 마치면 이 수집용 백의 무게를 재고 원심분리하기 위하여 균형을 맞춘다. 원심분리 후 세포 펠렛을 부서뜨리는 일 없이 각 백을 혈장 추출기(plasma extractor) 속에 놓아 둔다. 이어서 백 속의 상층액을 제거하고 버린다. 이 백을 이어서 부드럽게 마사지하고 세포를 남은 상층액에 재현탁한다. 무균 1 mL 주사기를 써서 세포 약 300~500 μL를 시료 채취 커플러(sampling site coupler)를 거쳐 상기 수집용 백으로부터 꺼내고 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮긴다. 남은 관류물의 무게와 부피를 측정하고 헤타녹말(hetastarch) 1/3 부피를 이 관류물에 가하여 완전히 혼합하여 준다. mL 당 세포의 수를 측정한다. 혈장 추출기로 적혈구를 관류물로부터 제거한다.

이어서 태반 세포를 즉시 배양하여 태반 줄기세포를 분리하거나 나중에 쓰기 위하여 냉동보존한다.

4. 실시예 4: 태반 줄기세포의 분화

4.1 뉴런으로의 분화 유도

태반 줄기세포를 뉴런으로 분화시키는 것은 예를 들어 이하와 같이 이루어질 수 있다:

1. 태반 줄기세포를 24시간 동안 DMEM/20％ FBS와 1 mM 베타-메르캅토에탄올로 이루어지는 유도 준비 배지(preinduction medium) 속에서 배양한다.

2. 상기 유도 준비 배지를 덜어 내고 세포를 PBS로 세척한다.

3. DMEM과 1~10 mM의 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 뉴런 유도 배지를 세포에 가해준다. 혹은 DMEM/2％ DMSO/200 μM 부틸화 히드록시아니솔로 이루어지는 뉴런 유도 배지를 세포에 가해 줄 수도 있다.

4. 몇몇 실시 태양에서는 무혈청 배지와 베타-메르캅토에탄올에 노출된 후 60분만에 형태적, 분자적 변화가 나타날 수도 있다. RT/PCR을 이용하여 예를 들어, 신경 성장 인자 수용체와 신경 필라멘트 중쇄 유전자의 발현을 평가할 수 있다.

4.2 지방세포로의 분화 유도

50~70% 세포 합류에 이른, 양막의 효소 소화에서 유래한 태반 줄기세포 배양물 몇 개를 (1) FCS 2%, 하이드로코르티손 0.5%, 이소부틸메틸크산틴 0.5 mM, 인도메타신 60 μM 함유 DMEM/MCDB-201 또는 (2) FCS 2%, 리놀레산(linoleic acid) 0.5% 함유 DMEM/MCDB-201을 포함하는 배지 속에서 분화 유도하였다. 세포의 형태 변화를 분석하였다. 3~7일 뒤 기름 방울이 나타났다. 또한 지방 형성과 관련된 특이적 유전자, 즉 PPAR-γ2, aP-2, 지질단백질 리파아제와 오스테오폰틴의 발현을 평가하기 위하여 정량적 실시간 PCR로 세포 분화를 평가하였다. 태반 줄기세포 배양물 두 개에서 지방세포 특이적 유전자의 발현이 각각 6.5배와 24.3배 증가하였다. 다른 네 개의 배양물에서는 지방 형성 유도 후에 PPAR-γ2의 발현에 약간의 증가(1.5~2.0배)가 나타났다.

다른 실험에서는 관류물에서 얻은 태반 줄기세포를 2% FCS 함유 DMEM/MCDB-201 (닭 섬유모세포 기저 배지) 속에서 배양하였다. 이 세포에 트립신 처리를 하고 원심분리하여 주었다. 이 세포를 지방 형성 유도 배지(AIM) 1 또는 2 속에 재현탁하였다. AIM1은 중간엽 줄기세포 지방 형성 보충제(StemCell Technologies)를보태어 준 사람 중간엽 줄기세포용 MesenCult 기저 배지(StemCell Technologies사)를 포함한다. AIM2는 2% FCS와 LA-BSA(1%) 함유 DMEM/MCDB-201을 함유한다. 태반 줄기세포 약 1.25×10⁵개를 T-25 플라스크 속의 AIM1 또는 AIM2 5 mL에서 성장시켰다. 이 세포를 배양기 속에서 7~21일 동안 배양하였다. 이 세포들은 세포질 속에 기름 방울 액포를 발생하였는데, 이는 오일레드 염색으로 확인할 수 있었고, 이것은 이 줄기세포가 지방세포로 분화했다는 것을 암시한다.

태반 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 것은 예를 들어 이하와 같이 이루어질 수 있다:

1. 태반 줄기세포를 MSCGM (Cambrex사) 또는 15％ 제대혈 혈청이 보강된 DMEM 속에서 생장시킨다.

2. 유도/유지 순환을 3회 반복한다. 각 순환은 태반 줄기세포에 지방 생성 유도 배지(Adipogenesis Induction Medium, Cambrex사)를 가하고 세포를 3일 동안 배양(37℃, 5％ 이산화탄소)하고, 이어서 1~3일 동안 지방 생성 유도 배지(Adipogenesis Maintenance Medium, Cambrex사) 속에서 배양하는 것으로 이루어진다. 혹은 유도 배지로서 1 μM 덱사메타손, 0.2 mM 인도메타신, 0.01 mg/mL 인슐린, 0.5 mM IBMX5, DMEM-고포도당, FBS와 항생제를 함유하는 다른 배지를 이용할 수도 있다.

3. 완전한 유도/유지 순환을 3회 시행한 다음, 이 세포들을 7일 동안 지방 생성 유지 배지 속에서 더 배양하여 주는데, 배지를 이틀에서 사흘마다 갈아준다.

4. 지방 생성의 두드러진 징표는 친지질성 염색유인 레드 O(red O)를 이용하여 쉽게 관찰할 수 있는 여러 개의 세포질내 지질 소낭(intracytoplasmic lipid vesicles)의 발달이다. 지방세포로 분화하기 시작한 태반 줄기세포 속 리파아제 및/또는 지방산 결합 단백질(fatty acid binding protein) 유전자의 발현은 RT/PCR로 확인할 수 있다.

4.3 골 형성 세포( osteogenic cell )로의 분화 유도

골 형성 배지는 Cambrex사의 분화 기저 배지(differentiation basal medium)인 Osteogenic과 SingleQuot(각각 덱사메타손, L-글루타민, 아스코르브산, 페니실린/스트렙토마이신, MCGS, β-글리세르인산) 185 mL로부터 마련하였다. 조직 배양 표면적 1 ㎠마다 MSCGM 0.2~0.3 mL 속에 세포를 조직 배양 표면적 1 ㎠마다 약 3×10³개씩의 비율로 관류물 유래 태반 줄기세포를 도포하였다. 전형적인 경우에, 모든 세포는 37℃, 5% CO₂하의 MSCGM 속에서 4~24 시간 동안 배양면에 부착하였다. 골 형성 분화는 이 배지를 골 형성 분화 배지(osteogenic differentiation medium)로 갈아줌으로써 유도하였다. 세포는 부착성 태반 줄기세포의 전형적인 방추(spindle) 모양의 형태로부터 입방체 형태로 바뀌기 시작하였고 무기질 침착을 동반하였다. 일부 세포는 분화 도중 조직 배양면으로부터 박리하였다.

태반 줄기세포의 골 형성 분화는 예를 들어 이하와 같이 이루어질 수 있다:

1. 부착성 태반 줄기세포 배양물은 MSCGM(Cambrex사) 또는 15％ 제대혈 혈청이 보강된 DMEM 속에서 배양할 수 있다.

2. 조직 배양 플라스크 속에서 세포를 24시간 동안 배양한다.

3. 골 생성 분화 유도는 MSCGM을 0.1 μM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산-2-인산, 10 mM 베타-글리세르인산을 함유하는 골 형성 유도 배지(Osteogenic Induction Medium, Cambrex사)로 바꾸어 줌으로써 이루어진다.

4. 2~3 주 동안 3~4일마다 세포에 골 생성 유도 배지를 가하여 준다.

5. 세포 분화는 칼슘 특이적 염색법과 알칼리성 인산 분해 효소와 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자 발현의 RT-PCR 검출을 이용하여 분석할 수 있다.

4.4 이자 세포로의 분화 유도

이자 세포로의 분화는 예를 들어, 다음과 같이 이루어질 수 있다:

1. 태반 줄기세포는 다음 성분들이 보강된 DMEM/20％ CBS 속에서 배양한다: 염기성 섬유모세포 성장 인자(10 ng/mL), 니코틴아미드(10 mM), B27(1×), N2 (1×), 전환 성장 인자 베타-1(2 ng/mL). CBS 대신 녹아웃 혈청 대체액(KnockOut Serum Replacement, 미국 캘리포니아 Carlsbad의 Invitrogen사)을 사용할 수도 있다.

2. 네스틴-양성 뉴런 세포 배양물에서 얻은 조건 배지(conditioned medium)을 상기 세포 배지에 50:50 농도로 가한다.

3. 세포를 14~28일 동안 배양하되, 3~4일 마다 배지를 갈아 준다.

4. 세포 분화는 인슐린 단백질을 분석하거나 인슐린 유전자 발현을 RT-PCR로 분석함을써 특성 파악할 수 있다.

4.5 심근 세포로의 분화 유도

근육 세포(심근 세포)로의 분화도 예를 들어, 아래와 같이 이루어질 수 있다:

1. 태반 줄기세포는 다음 성분들이 보강된 DMEM/20％ CBS 속에서 배양한다: 레티노산(1 μM), 염기성 섬유모세포 성장 인자(10 ng/mL), 표피 성장 인자(100 ng/mL), 전환 성장 인자 베타-1(2 ng/mL). CBS 대신 녹아웃 혈청 대체액(KnockOut Serum Replacement, 미국 캘리포니아 Carlsbad의 Invitrogen사)을 사용할 수도 있다.

2. 혹은 태반 줄기세포를 24시간 동안 50 ng/mL 카르디오트로핀-1(Cardiotropin-1)이 보강된 DMEM/20％ CBS 속에서 배양할 수도 있다.

3. 혹은 태반 줄기세포를 무단백질 배지 속에서 5~7 동안 유지한 다음, 사람 심근층 추출물(myocardium extract)로 자극(용량 증강 분석법 escalating dose analysis)한다. 심근층 추출물은 1 g의 사람 심근층을 1％ 제대혈 혈청이 보강된 1％ HEPES 완충액 속에서 균질화 처리하여 얻을 수 있다. 이 현탁액을 60 분 동안 배양한 다음 원심분리하여 상청액을 취한다.

4. 세포를 10~14일 동안 배양하는데, 3~4일 마다 배지를 갈아준다.

5. 세포 분화는 심근 액틴 유전자 발현을 RT/PCR로 관측하여 확인할 수 있다.

4.6 연골세포로의 분화 유도

4.6.1 일반적인 방법

태반 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 것은 예를 들어 이하와 같이 이루어질 수 있다:

2. 태반 줄기세포를 멸균 폴리프로필렌 튜브들 속에 나눠 넣는다. 이 세포를 원심분리(5분 동안 150×g)하고 미완성 연골 생성 배지(Incomplete Chondrogenesis Medium, Cambrex사)로 두 차례 세척한다.

3. 마지막 세척 후, 세포를 0.01 g/mL TGF-베타-3을 함유하는 완성 연골 생성 배지(Complete Chondrogenesis Medium, Cambrex사) 속에 5×10^-5세포/mL의 농도로 재현탁한다.

4. 0.5 mL의 세포를 15 mL 폴리프로필렌 배양 튜브 하나에 담는다. 이 세포를 150 x g에서 5분 동안 펠렛으로 가라앉힌다. 펠렛은 이 배지 속에 그대로 놓아 둔다.

5. 튜브의 뚜껑을 느슨히 하여 24 시간 동안 37℃, 5％ 이산화탄소 속에서 배양한다.

6. 이 세포 펠렛에 2~3일마다 새로이 마련한 완전 연골 생성 배지를 보태어 준다.

7. 매일 저속 보르텍스(vortex) 처리하여 펠렛이 배지 속에 현탁되어 있도록 한다.

8. 연골 생성된 세포 펠렛은 배양 14~28일째에 수확한다.

9. 연골 생성은 예를 들어, 호산성 바탕질(eosinophilic ground substance) 생성의 관찰, 세포 형태 평가 및/또는 RT-PCR에 의한 콜라겐 2와 콜라겐 9 유전자 발현 확인과 같은 방법으로 특성 파악할 수 있다.

4.6.2. 태반과 제대 줄기세포의 연골세포로의 분화

이 실시예는 태반 줄기세포를 연골세포로 분화하고 이러한 세포로부터 연골 유사 조직을 발생하는 것을 설명한다.

연골은 혈관과 림프관, 신경이 없는 조직이다. 연골은 연골세포 밀도가 낮지만(< 5%), 연골세포는 자신을 둘러싼 세포외 매트릭스를 유지하는데 놀라운 효율성을 지닌다. 몸 속에 있는 주된 연골은 세 종류가 있다: (1) 관절에서 관절 윤활을 촉진하는 관절 연골, (2) 관절 초승달과 추간판 등에서 충격을 흡수해 주는 섬유 연골, (3) 코와 귀 등에서 해부적 구조 형태를 유지해주는 탄력 연골. 이 세 종류 연골 모두는 그 생화학적 구조가 비슷하다.

관절 통증은 장애의 주된 원인이고 정형 외과 분야에서 통증 완화 요구에 부응하지 못하고 있는 부분이다. (관절 퇴행을 일으킬 수 있는) 1차 골관절염과 외상은 통증의 두 가지 흔한 원인이다. 미국 인구의 약 9%가 엉덩이나 무릎에 골관절염을 가지고 있고, 매년 2백만회를 넘는 무릎 수술이 이루어지고 있다. 불행히도 현재의 치료법은 연골의 복구보다는 증상의 치료에 더 중점을 두고 있다. 자연적 복구는 해당 부위를 섬유모세포 유사 세포가 침습하고 이를 정상 조직처럼 복원성이나 탄성을 갖추고 있지 않은 섬유 조직을 채울 때 일어나는데, 이 때문에 더 큰 피해를 가져 온다. 역사적으로 선택할 수 있는 치료법에는 조직 이식, 연골 밑 천공(subchondral drilling)이나 관절의 완전한 대체가 포함되었다. 더 최근의 치료법은 그러나 자가 연골세포 주입법인 CARTICEL(등록상표), 히알루론산 주사에 따른 임시적 통증 구제법인 SYNVISC(등록상표)와 ORTHOVISC(등록상표) 그리고 관절 초승달 복구를 위한 성체 중간엽 줄기세포 주사법인 CHONDROGEN(등록상표)을 포함한다. 일반적으로 현재 경향은 연골세포나 줄기세포에 관련한 세포 치료 및/또는 조직 공학 제품 쪽으로 기울어가고 있는 것 같다.

실험 방법과 재료

P3(제3계대)인 AC61665와 P5인 AC63919로 표시한 두 개의 태반 줄기세포주, P2인 UC672492와 P3인 UC67477로 표시한 두 개의 제대 줄기세포주를 아래에 그 개요를 적은 연구에서 사용하였다. 사람 중간엽 줄기세포(MSC)를 양성 대조군으로, 골육종 세포주인 MC3T3과 사람 피부 섬유모세포(HDF)들을 음성 대조군으로 사용하였다.

태반과 제대 줄기세포를 만기 분만한 사람 태반으로부터 효소 소화로 분리하고 정제하였다. 사람 MSC 세포와 HDF 세포는 Cambrex사로부터 구입하였고, MC3T3 세포는 미국 세포 유형 배양 콜렉션(ATCC)으로부터 구입하였다. 사용한 모든 세포주는 폴리프로필렌 원심분리관 속에서 5분 동안 800 rpm으로 펠렛으로 만들었으며, 연골 형성 유도 배지(Cambrex)와 비유도성 기저 MSC 배지(Cambrex사) 양쪽에서 키웠다. 세포 펠렛을 수확하고 제7, 14, 21, 28일에 Alcian Blue를 이용한 글리코스아미노글리칸(GAG) 염색 및/또는 시리우스 레드를 이용한 콜라겐 염색으로 조직학 분석하였다. 나아가 콜라겐 유형은 면역 염색으로 판단하였다. 연골 특이적 유전자에 대한 RNA 분석은 제7일과 제14일에 수행하였다.

결과

실험 1: 연골 생성 연구는 세 가지 주목표를 달성하도록 설계하였다: (1) 태반과 제대 줄기세포가 분화하여 연골 조직을 형성할 수 있다는 것을 증명, (2) 태반과 제대 줄기세포가 연골세포로 기능적 분화를 이룰 수 있다는 것을 증명, (3) 대조군 세포주를 평가하여 줄기세포로 얻은 결과를 확인/

첫째 목표를 위한 예비적 연구에서는 한 태반 세포주를 연골 형성 유도 배지 속에서 세포 펠렛 형태로 배양하였는데, 뼈 형태 형성 단백질(BMP)이 없거나 최종 농도 500 ng/mL로 함유되었다. 연골 형성 유도의 증거를 찾기 위하여 4주 동안 매주 펠렛을 분석하였다. 실험 결과는 시간이 지나면서 세포 펠렛이 실제로 커진다는 것을 가리켰다. 그러나 BMP⁺와 BMP^_ 시료 사이에는 가시적 차이가 없었다. GAG의 존부를 알기 위하여 펠렛을 또한 Alcian Blue로 염색하여 조직학 분석하였는데, GAG는 연골 조직의 지시 물질이다. BMP⁺ 세포는 일반적으로 창백한 액포와 함께 대사적으로 더 큰 활성이 있는 것으로 보였는데 반하여, BMP^- 세포는 더 작고 진하게 염색되는 핵과 더 작은 세포질(낮은 대사적 활성을 반영한다)을 갖고 있었다. 제7일에 BMP⁺ 세포는 강하게 파란색으로 염색되었지만 BMP^-는 희미하게 염색될 뿐이었다. 유도 제28일째에는 BMP⁺와 BMP^_ 세포 양쪽이 거의 같은 수준으로 Alcian Blue로 염색되었다. 전반적으로 세포 밀도는 시간이 지나면서 증가하였고, 매트릭스는 펠렛을 덮었다. 반면에 MC3T3 음성 대조군 세포주는 Alcian Blue로 염색하였을 때 GAG의 존재가 전혀 나타나지 않았다.

실험 2: 실험 1의 결과를 기초로 하여 두 개의 태반 줄기세포주와 두 개의 제대 줄기세포주의 연골 분화능을 평가하기 위하여 더 자세한 연구를 설계하였다. Alcian Blue 조직 분석에 더하여 세포를 또한 시리우스 레드로 염색하였는데, 시리우스 레드는 제II형 콜라겐에 특이적이다. 각 세포주에 대하여 유도 배지를 포함하거나 불포함하는 펠렛을 여러 개 만들었다.

펠렛을 형성한 배양 세포주에 대하여 먼저 거시적인 연골 형성 여부를 대강 관찰하였다. 전반적으로 이 세포주에서는 이르면 제1일째에 펠렛 형성을 볼 수 있었다. 이 펠렛은 시간이 지나면서 커져 튼튼한 매트릭스를 형성하였는데, 빛이 나고 희면서 연골 같아 보였고, 기계적 강도가 세졌다. 육안 관찰 결과 태반 줄기세포나 제대 줄기세포에 의한 펠렛은 MSC 대조군 펠렛보다 훨씬 더 컸다. 비유도성 배지 속의 대조군 펠렛은 제11일째에는 부서지기 시작하였고 제28일에는 연골 형성 유도 배지 속에서 배양한 세포가 만든 펠렛보다 훨씬 더 작았다. 육안으로는 태반 줄기세포나 제대 줄기세포가 형성한 펠렛에 차이가 없었다. 그러나 덱사메타손이 없는 배지에서 개시한 UC67249 줄기세포주는 더 큰 펠렛을 형성하였다. MC3T3 음성 대조군 세포는 펠렛을 이루지 않았다, 그러나 HDF는 펠렛을 형성하였다.

모든 시험군을 대표하는 펠렛들을 대상으로 GAG와 콜라겐의 조직학 분석을 하였다. 일반적으로 유도 조건하의 줄기세포가 형성한 펠렛은 비유도성 배지하의 펠렛보다 훨씬 더 컸고 온전하게 더 잘 유지되었다. 유도 조건에서 형성된 펠렛에서는 이르면 제7일째에 GAG 생산을 볼 수 있었고, 콜라겐 함량도 시간이 지나면서 늘어났지만, 비유도성 조건에서 형성된 펠렛에서는 거의 콜라겐 형성을 볼 수 없었는데, 이는 희미한 Alcian Blue 염색 결과로 나타났다. 일반적으로 상기 태반 줄기세포와 제대 줄기세포는 육안 관찰시 hMSC보다 더 단단하고 큰 펠렛을 형성하면서 시간이 지남에 따라 더 많은 콜라겐을 생산하는 것으로 보였다. 더욱이 이 연구 도중에 콜라겐은 더 두꺼워지고 콜라겐 유형도 바뀌는 것으로 보였는데, 이는 편광에서 섬유의 색깔이 달라진 것으로 증명된다(색깔은 섬유의 두께와 관련 있는데, 두께는 콜라겐 유형을 나타낸다). 비유도 태반 줄기세포는 제II형 콜라겐을 안 만들거나 만들더라도 유도된 줄기세포보다 훨씬 덜 생산하였다. 이 28일 동안 세포 밀도는 매트릭스 생성이 늘어남에 따라 줄어들었는데, 이는 연골 조직의 특징이다.

이 연구는 태반과 제대 줄기세포를 연골 형성 경로로 분화시킬 수 있으며, 연골 조직을 형성하도록 유도하는 것이 쉽다는 것을 확인하여 준다. 초기 관찰 결과는 이러한 줄기세포를 연골 조직 형성에 있어서 MSC보다 더 선호할 것이라는 점을 가리킨다.

5. 실시예 5 : 매달린 배지 방울법(hanging drop)에 의한 태반 줄기세포 배양

배양 중인 부착성 태반 줄기세포를 37℃에서 약 5분간 트립신 처리하고 손으로 두드려 배양 접시로부터 떼어낸다. 배양물에 10% FBS를 가하여 트립신 처리를 중단한다. 세포를 mL 당 약 1×10⁴개 비율로 5 mL의 배지 속에 희석한다. 배지 방울(한 방울이나 다중 채널 마이크로피펫에서 나온 여러 방울)을 100 mL 페트리 접시의 뚜껑 안쪽에 놓는다. 이 뚜껑을 조심스레 뒤집어 접시의 바닥 위에 놓는데, 이 접시는 멸균 PBS를 약 25 mL 담고 있어 접시 환경의 수분 함량을 유지한다. 세포를 6~7일 동안 키운다.

6. 실시예 6: 태반 줄기세포를 얻기 위한 태반 조직 소화

이 실시예에서 설명하는 것은 효소 소화에 의한 태반 줄기세포 분리법의 실험 규모를 키우는 것이다.

태반 조직(양막과 융모막) 약 10 g을 입수한 다음, 짓무른 다음 같은 부피의 콜라겐 분해 효소 A(1 mg/mL)(Sigma)와 트립신-EDTA(0.25%)(Gibco-BRL)를 가하여 전체 부피를 약 30 mL로 하여 37℃에서 약 30분 동한 소화한다. 소화에 의하여 해방된 세포를 세 차례 배양 배지로 씻어준 다음 네 개의 T-225 플라스크에 나누어 담고 실시예 1과 같이 배양한다. 태반 줄기세포 수득률은 10 g 출발 물질 당 약 4×10⁸과 5×10⁸ 사이였다. 제3 계대째에 세포 특성을 파악하자 대부분 CD10⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-이고 CD45^-였다.

7. 실시예 7 : 냉동보존된 줄기세포 산물의 생산과 줄기세포 은행

이 실시예는 태반 줄기세포의 분리와 냉동된 줄기세포에 바탕을 둔 산물을 생산하는 것을 설명한다.

요약: 태반 조직을 절개하고 소화한 다음 초대(primary)와 증폭 배양 (expansion culture)하여 대규모 세포량(cell dose)을 낳는 증폭된 세포 산물(expanded cell product)을 이룩한다. 세포를 두 층을 가진(two-tiered) 세포 은행에 저장하고 냉동 세포 산물로 배급한다. 하나의 기증된 태반에서 유래한 모든 세포량(cell dose)을 로트(lot)로 정의하고, 지정된 방에서 Class 100 라미나 흐름 후드를 다용하여 한 번에 한 태반 로트씩 처리한다. 이 세포 산물은 CD105⁺, CD200⁺, CD10⁺, CD34^-로 규정할 수 있고, 정상적인 핵형을 지니며 모체 세포 함량이 없다.

7.1 줄기세포를 얻는 방법

조직 절개와 소화: 압박 분만 24시간 후보다 전에 태반을 입수한다. 태반 조직을 양막, 양막과 융모막의 조합 또는 융모막에서 얻는다. 이 조직을 액 1 mm 크기의 작은 조각으로 다진다. 다진 조직을 1 mg/mL 콜라겐 분해효소 1A로 1시간 동안 37℃에서 소화한 다음 트립신-EDTA로 37℃에서 30분 동안 처리한다. 5% FBS를 갖춘 PBS로 3회 씻은 다음, 이 조직을 배양 배지 속에 재현탁한다.

초대 배양: 초대 배양(primary culture)의 목적은 소화된 태반 조직으로부터 세포를 수립하기 위함이다. 소화한 조직을 배양 배지 속에 현탁하고, Corning T-플라스크 속에 놓은 다음, 이를 37℃의 5% CO₂로 유지되는 가습 체임버 속에서 배양하였다. 배지의 절반은 5일 배양 후 갈아준다. 세포 밀도가 높은 콜로니는 배양 2주째에 생긴다. 트립신-EDTA로 콜로니를 수확하고, 이어서 2% FBS를 함유하는 PBS로 배양을 중지시킨다. 세포를 원심분리하고 배양 배지에 재현탁하여 파종 ㅈ증폭 배양물을 제조한다. 이 세포를 배증한 적이 없는 제0계대로 정의한다.

증폭 배양물: 초대 배양에서 수확한 세포, 증폭 배양물에서 수확한 세포 또는 세포 은행에서 해동한 세포를 증폭 배양물의 파종(seeding)에 쓴다. Cell Factory(NUNC사 상표)를 무균 필터를 통한 공기 중 5%의 CO₂로 10분 동안 분당 50 mL/트레이의 비율로 처리하고 이를 37℃의 5% CO₂로 유지되는 가습 체임버 속에서 덥혀 주었다. 파종할 세포를 트리판블루와 혈구계로 세고, 세포 수, 생존율과 계대수, 배증한 누적 총 수를 기록한다. 세포를 배양 배지 속에 mL 당 약 2.3×10⁴개로, 그리고 트레이 당 110 mL로 상기 Cell Factory에 파종한다. 배양 3~4일 후, 그리고 다시 5~6일 후에 배양 배지를 덜어내고 새 배지로 갈아준 다음 공기 중 5%의 CO₂로 한 번 더 처리해 준다. 세포가 ㎠ 당 약 10⁵개에 이르면 세포를 트립신-EDTA로 처리하여 수확하고, 2% FBS 함유 PBS로 배양을 중지시킨다. 세포를 이어서 원심분리하고 배양 배지 속에 재현탁한다.

냉동보존: 냉동할 세포를 배양물로부터 트립신-EDTA 처리로 수확하고 2% FBS 함유 PBS로 배양을 중지시킨 다음 혈구계로 그 수를 센다. 원심분리 후, 세포를 10% DMSO 함유 FBS에 mL 당 약 1백만 세포의 비율로 재현탁하여 세포 은행의 설립에 사용하고, mL 당 1천만 세포의 비율로 개별 냉동 세포량의 설립에 사용한다. 이 세포 용액을 냉동 용기에 옮기는데, 이 냉동 용기는 -80℃ 냉동고 속의 이소프로필 알코올 중탕 속에 있다. 다음 날 세포를 액체 질소로 옮긴다.

7.2 줄기세포 은행의 설계

"로트(lot)"는 한 기증 태반에서 유래한 모든 세포량(cell dose)으로 정의한다. 증폭 배양 과정에서 세포는 8 계대와 30 배증에 걸쳐서 정상적인 성장, 핵형과 세포 표면 표지 표현형을 유지하였다. 이러한 제약 하에서 세포량은 5 계대 이후, 약 20 배증된 것들을 포함한다. 공급할 동등한 세포를 생산하기 위하여 하나의 로트를 배양하여 증폭한 다음 두 층을 가지는 세포 은행과 냉동 세포로 보관한다. 특히 초대 배양에서 수확한, 배증을 겪지 않은 제0계대 세포로 정의한 세포들을 증폭 배양물을 개시하는데 사용한다. 첫번째 계대 후 약 4회의 배증을 거쳐 세포를 마스터 세포 은행(MCB) 속에 냉동시킨다. MCB로부터 얻은 비알을 사용하여 추가로 증폭 배양물을 파종한다. MCB에서 해동한 세포를 두 차례 더 계대하고 나서, 세포를 작업용 세포 은행(working cell bank, WCB) 속에 냉동시키는데, 약 12회 배증한 때이다. WCB로부터 얻은 비알을 이용하여 증폭 배양물을 파종하여 2회 더 계대하여, 약 20회 배증한 제5계대 세포를 얻는데, 이들을 개별 세포량으로 냉동한다.

7.3 배양을 위한 세포 해동

세포의 냉동 용기를 밀봉 플라스틱 백에 담고 37℃의 물 중탕 속에 담근다. 조그만 얼음 조각 외에는 내용물이 다 녹을 때까지 용기를 서서히 흔들어 준다. 용기를 상기 밀봉 플라스틱 백에서 꺼내고 10배 부피의 배양 배지를 세포에 부드럽게 섞어 주며 천천히 가한다. 시료를 채취하고 혈구계로 측정하여 증폭 배양물을 파종한다.

7.4 주사를 위한 세포 해동

세포의 냉동 용기를 건조 질소 이동 용기(dry nitrogen shipper)에 담아 투여할 곳으로 옮긴다. 투여하기 전에 용기를 밀봉 플라스틱 백 속에 넣고 이를 37℃의 물 중탕 속에 담근다. 조그만 얼음 조각 외에는 내용물이 다 녹을 때까지 용기를 서서히 흔들어 준다. 용기를 상기 밀봉 플라스틱 백에서 꺼내고 같은 부피의 2.5% HSA/5% 덱스트란을 가하여 준다. 더 이상의 세척 없이 세포를 주사한다.

7.5 시험 규격

모든 기증 태반에는 모체 혈액 시료가 따른다. 이 시료를 놓고 B형 간염 핵심 항체와 표면 항원, C형 간염 바이러스 항체와 핵산, HIV I과 II 항체와 핵산에 대하여 검사한다. 태반의 처리와 초대 배양은 시험 결과를 받기 전에 시작하지만, 모체 혈액 시료와 연결된 태반의 시험 결과가 모든 바이러스에 대하여 음성인 경우에만 계속한다. 기증자가 병원체 어떠한 것에라도 양성으로 시험 결과가 나오면 로트를 폐기한다. 나아가 표 3에 기재하는 시험을 MCB, WCB 및 WCB의 한 비알에서 유래한 세포량의 시료에 대하여 수행한다. 모든 규격을 만족할 때만 로트를 이용한다.

시 험	방 법	필요한 시험 결과
무균성	BD BACTEC PEDS PLUS/F 와 BACTEC Myco/F Lytic	음 성
내독소	LAL 겔 응고(gel clot)	≤ 5 EU/mL^*
생존율	트리판블루	생존율 > 70%
마이코플라스마	직접 배양, DNA-플루오크롬(FDA PTC 1993)	음 성
세포의 동정	흐름 세포 측정법(아래를 보라)	CD105⁺, CD200⁺, CD10⁺, CD34^-
세포의 순도	마이크로새틀라이트(microsatelite)	오염 세포 검출 무
핵 형	G-띠 분석(banding)과 중기 세포의 염색체 수 세기	정 상

* 세포량 당 냉동 세포 40 mL이고, mL 당 최대 5 EU로 설계한 세포 산물의 경우, 이 세포 산물은 체중이 40 kg을 넘는 세포 피투여자에 대한 최대값인 5 EU/kg/투여량 미만이다.

7.6 표면 표지 표현형 분석

세포를 1% 파라포름알데히드(PFA) 함유 PBS 속에 20분 동안 둔 다음 염색하기 전까지 (최대 1주 동안) 냉장고에 보관한다. 세포를 2% FBS, 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS(염색 완충액)으로 씻은 다음, 염색 완충액 속에 재현탁한다. 세포를 다음 항체 접합물로 염색한다: CD105-FITC, CD200-PE, CD34-PECy7, CD10-APC. 세포를 또한 면역 동형(isotype) 대조군으로 염색한다. 30분 배양 후 세포를 세척하고 염색 완충액에 재현탁한 다음 흐름 세포 측정기로 분석한다. 동형 대조군과 비교하여 형광이 늘어난 세포를 그 표지에 대한 양성 세포로 분류한다.

8. 실시예 8 : 태반 줄기세포 특이적 유전자의 동정

양막-융모막(AC)와 제대(UC) 유래 태반 줄기세포의 유전자 발현 양상을 중복성(multipotent) 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM)와 피부 섬유모세포(DF)의 유전자 발현 양상과 비교하였는데, DF는 분화를 마친 세포로 보고 있다. 세포를 1회 계대하는 동안, 회수의 정함이 없이 계대하는 동안, 여러 차례 계대하는 동안(세포 노화에 이르는 경우 포함) 키웠다. 실험 결과는 세포 배증 횟수가 유전자 발현에 중대한 영향이 있다는 것을 가리켰다. AC와 UC에서는 상향 조절(upregulation), BM과 DF에서는 하향 조절되거나 발현되지 않으며 계대 횟수에는 무관한 한 집단의 유전자를 동정하였다. 이 태반 줄기세포 특이적 또는 제대 줄기세포 특이적 유전자들의 집단은 상피 세포와 관련 있는 세포 골격 및 세포-세포 접착 단백질을 다수 암호화하고, 또한 모체-태아 면역 관용에 연루되어 있는 면역 글로불린 유사 표면 단백질인 CD200을 암호화한다. 이하 이 실시예에서는 태반 줄기세포와 제대 줄기세포를 함께 모아서 AC/UC 줄기세포라고 일컫는다.

8.1 실험 방법과 재료

8.1.1 세포와 세포 배양

BM (Cat# PT-2501)과 DF (Cat# CC-2511) 세포는 Cambrex에서 구입하였다. AC와 UC는 제0계대 조직 배양 플라스크에서 유래하였다. 플라스크 속 AC와 UC는 2063919로 표시한 기증 태반을 소화하여 얻었다. T-75 플라스크를 ㎠ 당 6000 세포로 파종하고 세포 합류에 이르면 세포를 계대하였다. 세포 배증은 트리판블루 세포 수로 가늠하였다. 3, 11~14와 24~38회 배증시에 세포 배양물의 유전자 발현을 분석하였다.

8.1.2 RNA , 마이크로어레이와 분석

세포를 그 조직 배양 플라스크 속에서 곧바로 용해하였는데, 예외적으로 한 배양물은 용해 전에 트립신 처리하였다. 총 RNA는 QIAGEN사의 RNeasy 키트로 분리하였다. RNA의 손상 여부와 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석하였다. 각 배양물로부터의 총 RNA 10 ㎍을 Affymetrix사 GENECHIP(등록상표) 방식의 마이크로어레이에 트기 형성(hybridization)시켰다. 총 RNA를 표지한 cRNA로 전환하고 제조사 설명에 따라 올리고뉴클레오티드 사람 게놈 U133A 2.0 어레이와 트기 형성하였다. 화상 파일을 Affymetrix사 MAS 5.0 소프트웨어로 처리하고 Agilent사 GeneSpring 7.3 소프트웨어로 정규화하고 분석하였다.

8.2 실험 결과

8.2.1 마이크로어레이 분석을 위한 BM - MSC , AC / UC 줄기세포 및 DF 배양물의 시점 선택

AC/UC 줄기세포에 고유한 유전자 발현 양상을 확립하기 위하여 AC(6)와 UC(6)의 두 줄기세포주를 BM-MSC, DF와 나란히 배양하였다. 세포 유래에 따른 유전자 발현 양상을 최대한 동정하고 소의 영향을 최소화하기 위하여 모든 세포를 같은 배지 속에서 키우고 같은 조건에 따라 파종하고 계대하였다. 세포를 총 수가 3회, 11~14회 또는 35회 배증 혹은 세포 노화 중 먼저 일어나는 것 이후에 수확하였다. AC/UC 줄기세포에서 배양한 시간에 의한 발현 변화가 없고 BM과 DF와 비교하여 발현이 상향 조절되는 유전자가 AC/UC 줄기세포 특이적 유전자의 후보이다.

도 10은 이 연구의 네 종류 세포주에 대한 성장 양상이다. 동그라미는 어느 배양물을 RNA 분리를 위하여 수확하였는지 가리켜 준다. 총 12 개의 시료를 채취하였다. BM, AC(6)와 UC(6)를 세포 수 3회 배증 후에 수확하였는데, 이들 시료는 "짧은" 시간 동안 배양한 것으로 간주하였다. "짧은" 시간 배양한 DF 시료는 채취하지 않았다. 중간 길이의 배양물인 11 내지 14회 배증한 세포들은 모든 세포 유형에 대하여 시료 채취하였다. 장기 배양물은 모든 세포 유형에 대하여 약 35회 배증 또는 세포 노화 직전에 채취하였는데, 둘 중 먼저 일어나는 쪽을 택하였다. 세포 노화는 BM에서는 15회 배증하기 전에, DF에서는 25회 배증시 일어났다. 구입한 BM과 DF 세포는 유전자 분석 전에 여러 차례 증폭하였고 초기 단계라고는 볼 수 없다. 그러나 실험상으로는 3회 배증시까지 배양한 BM 세포(BM-03)를 짧은 기간 배양물로 간주하였다. 마찬가지로 BM-11은 실험상으로 중간 길이 배양물이라고 일컫지만, 14회째의 배증에서 노화가 일어났기 때문에 BM-11은 생물학적으로는 장기간 배양물일 가능성이 높다.

8.2.2 계서화 클러스터 분석( hierachical clustering ) 결과 BM - MSC , AC/UC 줄기세포 및 DF 사이의 연관성이 드러나다

마이크로어레이 분석은 유전자 발현 양상을 동정하는데 계서화 클러스터 분석(HC)은 2차원적 맥락, 즉 첫번째 차원에 유전자를, 두 번째 차원에 서로 다른 조건(서로 다른 RNA 시료)을 놓고 유사성을 찾으려는 시도이다. 이 실험에 사용한 GeneChip은 22,000개가 넘는 탐침(probe)의 집합("총 유전자 목록"이라고 일컫겠다)을 갖추고 있었지만 이 집합 중의 다수는 어떠한 조건하에서도 발현되지 않는 유전자를 검사하는 것이었다. 총 유전자 목록을 단순화하기 위하여, 모든 시료에서 발현되지 않거나 낮은 수준으로 발현되는 것들(처리하지 않은 생 데이터로 250 미만)은 제거하여 8,215개의 유전자가 있는 목록을 얻었다.

8.2.3 선 그래프 보기( line graph view )를 이용한 유전자 발현 분석

상기 유전자 8215개의 유전자 발현 양상을 GeneSpring의 선 그래프 보기로 표시하였다(도 11). 여기서 x축은 12가지 실험 조건을, y축은 규격화한 탐침 집합의 발현 값을 로그 척도로 나타낸 것이다. 이 y축은 10,000배 변화 폭에 걸쳐 다루고 있고, 발현되지 않거나 아주 낮은 수준으로 발현되는 유전자는 값을 0.01로 정하였다. 설정에 따라 규격화된 값은 1로 놓았다. 각 선은 한 유전자(실제로는 탐침의 집합인데, 일부 유전자는 여러 탐침 집합을 가지고 있다)이고 상기 12 실험 조건 전부에 걸쳐 한 색깔로 나타난다. 이러한 색깔은 예를 들어 온도 지도(heatmap)에 나타낸 것과 같이, 서로 다른 발현 수준을 묘사하지만 색깔의 패턴은 한 조건을 택함으로써 정해진다. AC-03은 도 11에서 선택한 조건이다. 규격화 값에 비하여 상향 조절되는 유전자는 이 소프트웨어가 붉은색으로, 하향 조절되는 것들은 파란색으로 표시한다. AC-03에서 UC-11에 이르는 명백한 그래프의 위쪽 방향과 아랫쪽 방향 꼭지점은 이러한 조건에 절쳐서 여러 유전자가 차별적으로 발현된다는 것을 가리킨다. AC-03과 UC-03의 색깔 패턴의 놀라운 유사성은 이 두 시료에서 이 유전자들 중 여러 개가 같이 상향 조절되거나 하향 조절된다는 것을 보여준다. 가로 방향 선분들은 유전자의 발현 수준이 여러 조건에 걸쳐 변화하지 않는다는 것을 가리킨다. 이는 UC-36, UC-38과 UC-38-T를 비교하면 가장 두드러지게 알 수 있다. 뚜렷한 꼭지점은 없지만, UC-36과 UC-38-T 사이의 붉은 선 여러 개가 규격화한 값인 1에 못 미친다는 미세한 경향성이 있다. 이는 AC-03과 UC-03에서 상향 조절되는 이들 유전자가 후자의 배양물 속에서는 하향 조절된다는 것을 가리킨다. UC-38과 UC-38-T 사이의 발현 패턴이 너무 비슷하다는 사실은 RNA 분리 전세포의 트립신 처리가 유전자 발현에 거의 영향이 없다는 것을 가리킨다.

컴퓨터 계산 능력에 부담이 되는 HC 방법에 덧붙여서, 상기 두 BM 시료는 육안 관찰한 결과 다른 조건에 대해서보다는 서로에 대하여 더 유사하다. 이는 상기 두 DF 배양물에 대해서도 마찬가지이다. 비록 차별적으로 발현되는 유전자가 BM과 DF 시료 속에 다수 있지만, 일반적인 모습은 이 두 BM과 두 DF가 AC/UC 줄기세포에 대해서보다는 서로에 대하여 더 유사하다는 것을 시사한다. 이는 전술한 상기 HC 결과로도 확인할 수 있다.

상기 과정을 AC-11을 선택 조건으로 하였을 때 되풀이하면, AC-11과 UC-11이 차둥 발현되는 같은 유전자를 여러 개 공유하지만, 이 두 조건들 사이에 공통되는 유전자의 총 수는 AC-03과 UC-03 사이에서 공유하고 있는 차등 발현 유전자의 수보다 적게 나타난다는 점은 명백하다. 도 12는 AC-03에서 바탕선(baseline)에 대하여 6배 이상인, 차별적으로 과잉발현되는 유전자를 보여 준다. AC-03에서 상향 조절되는 유전자의 대다수는 또한 UC-03에서도 상향 조절되며, BM과 DF에서는 그 거동의 차이가 더 커진다.

8.2.4 AC / UC 줄기세포 특이적 유전자를 동정하기 위한 필터링 방법

모든 AC/UC 시료에서 일정한 값을 유지하고, BM과 DF에서 하향 조절되는 유전자는 AC/UC 줄기세포 특이적이라고 생각된다. 두 가지 필터링 방법을 결합하여 AC/UC 줄기세포 특이적 유전자의 목록 58개를 만들었다(도 4).

태반 줄기세포나 제대 줄기세포 특이적 유전자

기 호	유 전 자	생물학적 과정, 설명과 추가적 주석
ACTG2	액틴, 감마 2, 평활근, 장	근육 발생, 세포 골격, 제대 동맥과 전립선 상피에서 발현
ADARB1	아데노신 탈아민화효소, RNA-특이적, B1 (래트의 RED1 동족체)	RNA 처리, 중추 신경계 발생
AMIGO2	암포테린 유도 유전자 2	동종 친화성과 이종 친화성 세포 부착, Ig 유사 영역 함유 부착 분자 2
ARTS-1	아미노펩티드 분해 효소 조절자를 박리하는 제1형 종양 괴사 인자 수용체(type 1 tumor necrosis factor receptor shedding aminopeptidase regulator)	단백질 분해, 항원 처리, 혈관 신생, 태반에서 발현
B4GALT6	UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- 갈락토오스 전달 효소, 폴리펩티드 6	탄수화물 대사, 막에 통합되어 있음, 세포간 인식 및/또는 부착에서 기능을 맡고 있을 수 도
BCHE	부티릴콜린 에스테르 분해 효소	콜린 에스테르 분해 효소 활성, 세린 에스테르 분해 효소 활성, 하이드롤라제 활성
C11orf9	염색체 11 해독틀 9	가상적 단백질, p53-유사 전사 인자, 망막 색소 상피에서 발현
CD200	CD200 항원	면역글로불린 유사, 표면 단백질, 포식세포를 억제
COL4A1	제IV형 콜라겐, 알파 I	세포외 매트릭스, 기저막, 무섬유원성 콜라겐, 어레스텐(arresten) 영역 함유
COL4A2	제IV형 콜라겐, 알파 2	세포외 매트릭스, 생체 발생, 기저막, COL 4A1과 공동 발현, 형성 이상 상피에서 하향 조절됨
CPA4	카르복시펩티드 분해 효소 A4	단백질 분해성, 히스톤 아세틸화, 모계 날인, 전립선암 세포주에서 고도 발현
DMD	디스트로핀(근육 퇴행 위축, Duchenne과 Becker 유형)	근육 수축, 세포 형태와 크기 조절, 근육 발생
DSC3	데스모콜린 3(desmocollin 3)	동종 친화성 세포, 세포 부착, 결합소체에 편재화
DSG2	데스모글레인 2(desmoglein 2)	동종 친화성 세포, 세포 부착, 결합소체에 편재화
ELOVL2	아주 긴 사슬 지방산의 길이 연장(elongation of very long chain fatty acids)(FEN1/Elo2, SUR4/Elo3, 효모)-유사 유전자 2	지방산 생합성, 지질 생합성
F2RL1	응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 유전자 I	G-단백질 결합 수용체 신호 전달 경로, 대장 상피와 신경 요소에서 고도 발현
FLJ10781	가상적 단백질 FLJ10781	---
GATA6	GATA 결합성 단백질 6	전사 인자, 근육 발생
GPR126	G 단백질 결합성 수용체 126	신호 전환, 신경펩티드 신호 전달 경로
GPRC5B	G 단백질 결합성 수용체, C 패밀리, 제5군, 구성 요소 B	G-단백질 결합성 수용체 단백질 신호 전달 경로
ICAM1	세포간 부착 분자 1(CD54), 사람 라이노바이러스 수용체	세포-세포 부착, 막 관통 수용체 활성, 결막 상피에서 발현
IER3	최조기 반응 3	항세포자멸사, 배아 발생과 형태 생성, 세포 성장 및/또는 유지
IGFBP7	인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 7	세포 증식의 음성 조절, 노화한 상피 세포에서 과잉 발현
IL1A	인터류킨 1, 알파	면역 반응, 신호 전환, 사이토킨 활성, 세포 증식, 분화, 세포자멸사
IL1B	인터류킨 1, 베타	면역 반응, 신호 전환, 사이토킨 활성, 세포 증식, 분화, 세포자멸사
1L6	인터류킨 6(인터페론, 베타 2)	세포 표면 수용체 연결 신호 전환, 면역 반응
KRT18	케라틴 18	형태 생성, 중간 세사 태반, 태아와 상피 조직에서 발현
KRT8	케라틴 8	세포 골격의 조직과 생체 발생, 인산화, 중간 세사, KRTIB와 공동 발현
LIPG	리파아제, 내피	지질 대사, 지단백질 리파아제 활성, 지질 전달체, 인지질 리파아제 활성, 맥관의 생물학에 관련됨
LRAP	백혈구 유래 아르기닌 아미노펩티드 분해 효소	항원 처리, I형 MHC 경로의 내재적 항원, N-말단 아미노펩티드 분해 효소 활성
MATN2	마트릴린 2(matrilin 2)	섬유모세포나 상피 기원 세포주에서 광범위하게 발현됨, 비관절 연골 세포외 매트릭스
MEST	중배엽 특이적 전사물 동족체(마우스)	부계 날인 유전자, 중배엽 조직 발생, 태아 조직과 섬유모세포에서 발현
NFE2L3	핵 인자(적혈구 유래 유전자 2)-유사 유전자 3	전사 보조 인자, 초대 배양한 세포 영양막에서 고도로 발현되나 태반 섬유모세포에서는 아님
NUAK1	NUAK 패밀리, SNF1-유사 키나아제, I	단백질 아미노산 인산화, 단백질 세린-트레오닌 키나아제 활성
PCDH7	BH-프로토카데린(protocadherin)(뇌-심장)	세포-세포 부착과 인식, 카데린 반복부 7개 함유
PDLIM3	PDZ와 LIM 영역 3	알파-악티닌-2-연관 LIM 단백질, 세포 골격 단백질 결합성, 골격근에서 발현
PKP2	플라코필린 2(plakophilin 2)	세포-세포 부착, 결합소체에 편재화, 상피에서 발견됨, 카데린과 중간세사에 결합
RTN1	레티큘론 1(reticulon 1)	신호 전환, 뉴런 분화, 신경 내분비, 신경 내분비 세포에서의 생체내 교통(trafficking)
SERPINB9	세르핀 펩티드 분해효소 억제제, 시아드 B(ciade B) (난 알부민), 구성 요소 9	세린 단백분해효소 억제제, 응고, 섬유소 용해, 보체 결합, 매트릭스 재구성, 태반에서 발현됨
ST3GAL6	시알릴 전달 효소 10	아미노당 대사, 단백질 아미노산 글리코실화, 당지질 대사, 단백질 리포일화(lipoylation)
ST6GALNAC5	시알릴 전달 효소 7E	단백질 아미노산 글리코실화, 갱글리오시드 생합성
SLC12A8	용질 전달체 패밀리 12 (나트륨/칼륨/염화물 전달체(transporters)), 구성 요소 8	아미노산-폴리아민 전달체 활성, 양이온-염화물 공동전달체(cotransporter) 9, 상피 면역에서 역할 있을 수 있음(건선)
TCF21	전사 인자 21	전사 조절, 중배엽 발생, 콩팥의 상피 세포에서 발견됨
TGFB2	전환 성장 인자, 베타 2	세포 주기 조절, 신호 전환, 세포-세포 신호 전달, 세포 증식, 세포 성장
VTN	비트로넥틴(혈청 확산 인자, 소마토메틴 B, 보체 S-단백질)	면역 반응, 세포 부착, 분비성 단백질, 세포외 매트릭스 결합
ZC3H12A	12A 함유 아연 손가락 CCCM-형	MCP-I 처리-유도성 단백질, 핵산 결합성, 가상적 아연 손가락 단백질

먼저 모든 BM과 DF 시료와 상대하여 적어도 AC/UC 줄기세포 조건 8개 중 7개에서 세 배 이상 과잉 발현되는 유전자를 선별함으로써 유전자 58개를 동정하였다(도 13). 8개 AC/UC 줄기세포 조건 중 8개를 필터링한 결과도 비슷한 목록을 낳았다. 이 두번째 필터링은 Affymetrix사 MAS 5.0 소프트웨어에서 제공하는 "부재(absent)"와 "존재(present)" 호출(call) 기능을 이용하였다. 모든 BM과 DF에서 부재하면서 AC-03, AC-11, UC-03과 UC-11에 존재하는 유전자를 동정하여 목록을 만들었다. 이후의 AC/UC 줄기세포 조건에서의 유전자 호출은 특정하지 않았다(not stipulated).

이 두 가지 목록은 상당 부분 겹쳤고, 이를 합쳤다. 합친 목록에서 (1) 모든 혹은 거의 전부의 AC/UC 줄기세포 조건에서 매우 낮은 수준으로 발현되는 몇몇 유전자와 (2) Y 염색체에 존재하는 유전자를 뺌으로써 목록을 줄였다. FISH 분석 결과 이 연구에 사용한 AC와 UC 세포는 남성 기증자로부터, BM과 DF는 여성 기증자로부터 온 것으로 확인하였다. 이 결과 얻은 46개의 AC/UC 줄기세포 특이적 유전자는 표 5에 나타내었다.

유전자 존재론적 분류에 따라 정리한 AC/UC 특이적 유전자

세포 부착	세포 골격	발 생	세포외 매트릭스	상피 관련
AMIGO2	ACTG2	ADARB1	COL4A1	ACTG2
B4GALT6	DMD	IER3	COL4A2	C11orf9
DSC3	KRT18	IGFBP7	MATN2	COL4A1
DSG2	KRT8	IL1A	VTN	COL4A2
ICAM1	PDLIM3	IL1B		DSC3
PCDH7		MEST		DSG2
PKP2		TGFB2		F2RL1
VTN				ICAM1
글리코실화	면역 반응	단백질 분해	신호 전달	IGFBP7
B4GALT6	ARTS-1	ARTS-1	F2RL1	IL6
ST3GAL6	CD200	CPA4	GPR126	KRT18
ST6GALNAC5	IL1A	LRAP	GPRC5B	KRT8
전 사	IL1B		IL1A	MATN2
C11orf9?	IL6		IL1B	PKP2
GATA6	LRAP		IL6	SLC12A8
NFE2L3	SLC12A8		RTN1	TCF21
TCF21	VTN		TGFB2

이 46개 유전자의 목록은 다수의 존재론적 분류군(ontology groups)을 보여주는 단백질의 집합이다. 가장 많이 대표된 군인 세포 부착은 8개의 유전자를 포함한다. DNA 복제나 세포 분열에 관련된 유전자는 없었다. 상피에 구체적인 관련성을 언급하고 있는 유전자 16개 또한 목록에 실었다.

8.3 토 의

태반 줄기세포에 특이적이고 골수 유래 중간엽 세포와 구별할 수 있는 유전자 발현 양상을 동정하였다. 조작적으로는 모든 BM과 DF 시료와 상대적으로 모든 태반 줄기세포 시료에서 과잉 발현된 46개의 유전자가 이 양상에 포함된다.

본 실험의 설계는 짧은 기간, 중간 길이와 장기간 동안 배양한 세포를 비교하였다. AC와 UC 세포에서는 각 배양 기간은 차별적으로 발현되는 유전자 집단을 특징적으로 갖추고 있었다. 짧은 기간 또는 초기(AC-03과 UC-03) 배양에서는 상향 조절된 200개의 유전자가 8회 배증 후에 평균으로 회귀한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 초기 단계 유전자 발현 양상은 자연적인 태반 환경에 존재할 때의 AC와 UC의 발현 양상과 닮았을 가능성이 높다. 태반 속에서 이 세포들은 활발하게 분열하지 않고, 영양분을 대사하며, 자신들 사이에서 신호를 전달하고, 그 세포외 주변을 재구성하여 자신의 위치를 확보한다.

중간 길이 배양물에서의 유전자 발현은 신속한 세포 분열로 규정되는데, 이 때 차별적으로 발형되는 유전자는 초기에서 차별적으로 발현되는 유전자들과 사뭇 다르다. AC-11과 UC-11 및 BM-03과 DF-14에서 상향 조절되는 유전자들 중 다수는 염색체 복제와 세포 분열에 관련되어 있다. 유전자 발현을 토대로 할 때, BM-03은 생물학적으로는 중간 길이 배양물로 보인다. 이 중간 단계의 세포 유형 특이적 유전자 발현은 세포 증식에 의하여 압도된다. 덧붙여서, 짧은 기간 배양한 AC나 UC에서 과잉 발현된 거의 모든 유전자는 중간과 후속 단계 조건에서 하향 조절된다. 이렇게 고도로 증식하는 단계에서는 143개 유전자가 5배 이상 상향 조절되었는데, 이는 발현된 유전자의 약 1.7%를 차지한다.

장기간 배양물은 최종 또는 세포 노화기를 나타낸다. 이 단계에서는 세포가 분열할 수 있는 능력을 잃고 특히 AC와 UC에서는 차별적으로 발현되는 유전자의 절대 수가 두드러지게 줄어든다. 이는 세포가 그 배양 환경에 완전히 적응하여 생합성하여야 하는 부담이 줄어든 것 때문일 수 있다. 놀랍게도 말기의 BM과 DF 배양물은 이러한 거동을 나타내지 않는다. AC와 UC, 그리고 규격화한 값인 1과 비교할 때, BM-11과 DF-24에서는 다수의 유전자가 차별적으로 발현된다. AC와 UC는 장기간 배양물에서 BM, DF와 가장 두드러지게 차이가 난다.

상기 기술한 태반 줄기세포 특이적 유전자 목록은 다양하다. COL4A1과 COL4A2는 협동 조절되며, KRT18과 KRT8도 협동 조절되는 것으로 보인다. 이들 중 유전자 8개는 세포-세포 접촉에 관련된 단백질을 암호화하며, 이 중 세 개(DSC3, DSG2와 PKP2)는 결합소체(desmosome)에 편재화하는데, 결합소체는 케라틴 18과 케라틴 8과 같은 중간세사(intermediate filament) 세포 골격 단백질로 고정된 세포간 접촉점이다. 밀접한 세포-세포 접촉은 상피와 내피 세포의 특징이며, 섬유모세포와는 연관이 없는 것이 전형적인 경우이다. 표 3은 총 유전자 46개 중에서 상피 세포에 특징적인 유전자를 16개 들고 있다. 태반 줄기세포는 일반적으로 섬유모세포에 유사한 작은 방추 형상의 세포라고 기술한다. 이 형태는 BM과 DF와는 전형적으로 상이한데, 특히 세포 밀도가 낮을 때 그러하다. 한편 또 주목할 것은 CD200의 발현 양상인데, CD200은 AC/UC 줄기세포에 존재하지만 모든 BM과 DF 시료에서 부재하다. 더욱이 CD200은 태아의 발생에서 태반의 면역 관용과 관련이 있다고 증명된 바 있다(Clark 외, Am . J. Reprod . Immunol. 50(3):187~195 (2003)를 보라).

46 유전자로 된 상기 유전자의 부분 집합은 AC/UC 줄기세포를 골수 유래 중간엽 줄기세포나 섬유모세포와 구별하는 분자 생체 표지들의 집단이다.

9. 실시예 9 : 부착성 태반 줄기세포의 골 형성 세포로의 분화

이 실시예에서는 태반 줄기세포가 골 형성 세포로 분화하는 능력을 증명하는 실험 결과에 대해서 기술한다. 이 실시예는 또한 이러한 골 형성 세포가 시험관 내에서 적절한 스캐폴드에 무기질을 침착시키거나 무기질 침착에 기여하는 능력이 있다는 것을 증명한다.

9.1 분화한 태반 줄기세포의 골 형성 표지의 발현

처음에는 태반 줄기세포가 골 형성 전구세포로 분화하는 능력이 있는지를 알칼리성 인산 분해 효소(AP) 활성을 살펴서 평가하였다. AP 활성은 흔히 쓰이는 뼈 생성에 관한 초기 표지이다. 예를 들어 Kasten 외, 2005, Biomaterials 26:5879~89를 보라.

9.1.1 시 약

DMEM-LG, 인슐린-트랜스퍼린-셀렌-G 보충제(ITS), 페니실린-스트렙토마이신(P/S), 피코그린(PicoGreen) dsDNA 형광 분석법은 Invitrogen(오레곤주 Eugene)에서 구입하였다. MCDB201, 리놀레산, 덱사메타손, L-아스코르브산과 표피 성장 인자는 Sigma(미주리주 세인트루이스)에서 구입하였다. 소 태아 혈청(FBS)과 혈소판 유래 성장 인자는 각각 Hyclone(유타주 Logan)과 R&D Systems(미네소타주 미네아폴리스)에서 구입하였다. 냉동보존된 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSC), 중간엽 줄기세포 성장 배지(이 실시예에서는 "기저"로 표시)와 골 형성 세포 분화 배지(OS)는 Cambrex(뉴저지주 East Rutherford,)에서 구입하였다. 또한 전술한 5.4를 참조하라.

9.1.2 세포 배양

부착성 태반 줄기세포는 태반 내 서로 다른 몇 곳의 해부학적 부위를 물리적으로 파괴하는 방법을 비롯한 여러 가지 방법 중 하나를 써서 태반에서 분리하였다. 부착성 태반 줄기세포를 Anthro1B 배지(60% DMEM-LG, 40% MCDB201, 2% FBS, 1X P/S, 180 ng/mL 리놀레산, 0.05 μM 덱사메타손 0.1 mM L-아스코르브산, 10 ng/mL 혈소판 유래 성장 인자와 10 ng/mL 표피 성장 인자) 속에서 5 x 10³ 세포/cm² 밀도로 수립하고 계대하였다. 골수 유래 MSC를 기저 배지 속에서 5 x 10³ 세포/cm² 밀도에서 계대하였다. 조직 배양 폴리스티렌 상의 실험적인 연구를 위하여, 태반 줄기세포 및/또는 중간엽 줄기세포를 기저 배지나 Anthro1B 배지에 5 x 10³ 세포/cm²로 파종하고 Anthro1B 배지에서, 또는 OS에서 5주 동안 유지하였다. 세포는 2주마다 새 배지로 갈아 주었다. 3차원 스캐폴드에 관한 연구로서, 100 μL의Anthro1B 배지 속에 담긴 태반 줄기세포를 인산칼슘(CaP, BD Biosciences, 캘리포니아주 산호세)이나 인산β-트리칼슘(TCP, Therics, 오하이오주 Akron; VITOSS(등록상표), Orthovita, Inc.; 펜실베니아주 Malvern; HEALOS(상표) II, DePuy Spine, Inc.; 매사추세츠주 Raynham) 스캐폴드에 파종(스캐폴드 당 세포 2.5 x10⁵개)하였다. 37℃에서 1~2시간 배양한 다음, 스캐폴드를 함유한 웰에 180 μL의 배지를 가하여 주었다. 3~4일 뒤, 시료 중 절반을 Anthro1B 배지 속에서 유지하고, 나머지 절반의 시료를 OS 배지로 분화시켰다. 배지는 2주마다 바꾸어 주었다.

9.1.3 알칼리성 인산 분해 효소 분석

세포 용해액(cell lysate) 속의 알칼리성 인산 분해 효소(AP) 활성을 p-니트로페놀 생성물의 형성을 측정하는 비색법(캘리포니아주 샌디에이고의 Cell Biolabs)으로 측정하였다. AP 활성은 PicoGreen dsDNA 형광 분석(오레곤주 Eugene의 Invitrogen)을 이용하여 DNA ㎍에 대하여 규격화하였다. 스캐폴드 위에서 배양한 세포의 AP 활성을 확인하기 위하여, 세포-스캐폴드 구조물을 PBS로 씻고, 세포 용해 완충액 속에 담근 다음, 피펫 끝으로 분쇄하고, 12000g에서 원심분리하였다. 이어서 상층액의 AP 활성과 DNA 함량을 전술한 것과 같이 분석하였다.

9.1.4 결과와 토의

태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포를 기저 배지(Cambrex) 또는 Anthro1B 배지 속에 파종한 다음 기저, OS 또는 Anthro1B 배지 속에서 3주 동안 유지하였다(기저 배지 속에 파종하고 OS 배지로 유도한 세포들은 도 14에서 "기저-OS"라고 표시하였다). 도 14A와 도 14B에 나타낸 바와 같이, 기저 배지 속에 파종하고 유지한 세포는 예상대로 가장 낮은 AP 활성을 나타내며, 기저 배지에 파종하고 OS 배지로 유도한 세포는 비교적 더 높은 AP 활성을 나타낸다. 흥미롭게도 Anthro1B 속에 파종하고 유지한 세포는 가장 높은 AP 활성을 나타내는데, Anthro1B 배지 속에 파종하고 OS 배지로 유도한 세포보다도 더 높다. 따라서 이 실험에서는 적절한 배지 속에서 배양하였을 때 PDAC가 골 형성 전구세포로 분화할 수 있다는 점을 증명하였다.

9.2 PDAC 의 골 형성 세포로 분화에 대한 기능적 특성 파악

이 실시예는 태반 줄기세포로부터 분화한 골 형성 세포의 기능을 평가한 실험 결과에 관하여 기술한다. 구체적으로 골 형성 세포가 무기질 침착 매트릭스를 형성하는 능력이 있는지 평가한다. 전술한 9.1에서와 같이 태반 줄기세포를 마련하고 배양하였는데, 다만 태반 줄기세포를 Anthro1B 배지 속에 파종하고 3일 동안 배양한 다음 3주 동안 Anthro1B 배지 속에서 유지하거나 OS 배지로 유도하였다는 차이가 있다. 무기질 침착은 von Kossa 염색, 칼슘 분석법과 주사 전자 현미경(SEM) 시각화로 평가하였다.

9.2.1 von Kossa 염색

시편의 무기질은 von Kossa법으로 염색하였다. 특히 세포층을 10% 포르말린으로 10분 동안 염색하고 자외선 하에서 5% 질산은으로 20분 동안 배양한 다음 탈이온수로 씻고 5% 티오황산화물로 5분 동안 배양한 다음 탈이온수로 철저하게 씻었다.

9.2.2 칼슘 분석

세포 단일층을 인산 완충 식염수(PBS)로 두 차례 헹구어 준 다음 0.5 N HCl로 접시에서 긁어내었다. 4℃의 오비탈 교반기(orbital shaker)에서 밤새 배양하고 이어서 10분 동안 2000g로 원심분리하여 축적된 칼슘을 세포 성분으로부터 추출하였다. Stanbio Laboratory(텍사스주 Boerne)의 칼슘 정량 키트를 써서 이 상층액의 칼슘 양을 측정하였다. 세포 수의 차이를 반영하기 위하여 칼슘 농도를 총 세포 단백질 양에 대하여 규격화하였다.

9.2.3 SEM 분석

SEM 시료는 15분 동안 10% 포르말린 속에서 고정하고, PBS로 씻은 다음, 등급을 나눈 일련의 에탄올(20, 40, 60, 80과 100%)로 탈수하였다. 에탄올 탈수 후 스캐폴드를 파라핀 속에 고정하여 단면화(sectioning)를 쉽게 하였다. 단면화한 뒤 시료를 크실렌 속에서 배양하고 전술한 것처럼 등급을 나눈 일련의 에탄올로 탈수하였다. 이어서 모든 시편에 스퍼터링으로 금 피복을 하고 JEOL JSM-6400F 필드 방출 SEM(뉴저지주 East Windsor의 Evans Analytical Group)으로 분석하였다.

9.2.4 결과와 토의

도 15A에 나타낸 것처럼, OS 배지로 분화한 부착성 태반 줄기세포는 von Kossa 염색에서 칼슘 침착의 증거를 드러낸다. 이 침착물은 Anthro1B 배지 속에서 유지한 세포에서는 보이지 않았다. 무기질 침착 매트릭스의 무기질 양을 정량하기 위하여 세포 단일층에 결합된 칼슘을 측정하였다. 도 15B에 나타낸 것처럼, OS 배지로 유도한 세포 층에서 회수한 칼슘의 양이 Anthro1B 배지에서 배양한 세포에 비하여 세 배 더 많았다. 무기질 침착 매트릭스를 높은 분해능에서 관찰하기 위하여, 태반 줄기세포 시료를 Anthro1B 배지에서 유지하거나(도 16A) OS 배지로 유도하여(도 16 B) SEM 분석하였다.

무기질 침착이 일어난 매트릭스는 OS 배지로 유도한 태반 줄기세포에서 뚜렷하였는데, Anthro1B 배지에서 배양한 태반 줄기세포에서는 이러한 무기질 침착을 볼 수 없었다. 도 16B에 나타낸 X-선 분석에 의한 침착물의 원소 결정에서는 이 결절(nodule)이 칼슘과 인산으로 이루어졌다는 것을 확인하여 주었다.

도 14(Anthro1B 배지 존재하에 AP 활성 증가)와 도 15, 16(Anthro1B 배지의 존재하에 무기질 침착 부재) 사이에 상관 관계가 분명히 없다는 점은 Anthro1B가 매트릭스의 무기질 침착에서 인산의 원천으로 필요한 β-글리세르인산을 갖추고 있지 않다는 사실로 설명할 수 있다. Anthro1B 뿐 아니라 OS 배지에도 존재하는 덱사메타손과 아스코르브산은 줄기세포의 골 형성 분화에 흔히 쓰이는 유도 물질이다. 예를 들어 Sun 외, 2006, Biomaterials 27:5651~7을 보라. β-글리세르인산은 대개 골 형성 분화 배지에 인산원으로 포함되어 매트릭스의 세포 매개 무기질 침착이 일어날 수 있게 한다. β-글리세르인산 자체는 일반적으로 골 형성 분화의 유도 물질로 보고 있지 않다. AP 활성 데이터는 Anthro1B 속에 파종하고 유지한 태반 줄기세포가 가장 높은 골 형성 분화능을 지닐 것이라고 시사한다. 따라서 Anthro1B 배지 속에서 배양한 태반 줄기세포에서 무기질 침착을 관찰할 수 없던 것은 충분히 β-글리세르인산의 부재 탓일 수 있다.

9.3 3차원 스캐폴드 상에서의 PDAC 분화

이 실시예는 3차원 스캐폴드 위에서 태반 줄기세포가 골 형성 세포로 분화하는 것에 대하여 기술한다. 인산칼슘 기반 생체 재료와 인회석 기반 생체 재료를 골절과 뼈 결함의 치료에 임상 적용하여 왔으므로 3차원 스캐폴드 상에서 xoks 줄기세포 부착과 골 형성 기능성을 평가하기 위하여 시중에서 구할 수 있는 무기질 스캐폴드 두 종을 선택하였다. 태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포를 스캐폴드 위에 파종하고 시험관내에서 장기간 배양했을 때 이들이 이 스캐폴드에 부착하고 골 형성 기능을 가지는지 평가하였다. 도 17에 나타낸 것처럼, 태반 줄기세포 뿐 아니라 중간엽 줄기세포도 인산칼슘(CaP) 스캐폴드에 견주어 인산β-트리칼슘(TCaP)에 대한 부착을 선호하는데, 이 때 태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포가 나타내는 CaP에 대한 부착 수준은 유사하다. 게다가 전체 진행 과정에 걸쳐서 TCaP 스캐폴드 위에는 CaP 스캐폴드보다 일관되게 세포 수가 더 많다(태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포 모두). 배양 2주째에는 CaP 스캐폴드 위에서 부착성 태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포 양쪽을 다 볼 수 없었다. 이러한 데이터는 산소 감지판을 이용한 배양 배지 속의 산소 소모량을 분석한 결과가 뒷받침한다. 이러한 결과를 함께 놓고 볼 때, TCaP 스캐폴드가 적어도 어떤 조건 하에서는 CaP 스캐폴드보다 PDAC의 생존률을 유지하는데 더 바람직하다는 것을 시사한다.

스캐폴드 위에서 일어나는 골 형성 분화를 평가하기 위하여, 스캐폴드 위에서 배양한 세포의 AP 활성을 전술한 방식의 AP 분석법으로 관찰하였다. 태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포를 Anthro1B에 파종하고 이를 Anthro1B 배지 또는 OS 배지 속에서 실험 기간 동안 유지하였다. 도 18에 나타낸 것처럼, TCaP 스캐폴드 상의 태반 줄기세포는 Anthro1B 배지나 OS 배지 배양 여부에 관계 없이 AP 활성이 비슷하지만 TCaP 스캐폴드 상의 MSC는 OS 배지 속에서 배양한 경우보다 Anthro1B 배지 속에서 AP 활성이 더 높게 나타났다. 이러한 결과는 2차원 표면 위에서 얻은 AP 활성 데이터와도 호응하는데, 즉 Anthro1B 배지에 존재하는 인자가 OS 배지와 비슷한 수준으로 AP 활성을 자극하는 것일 수 있다. MSC와 PDAC 모두 CaP 스캐폴드 위에 파종했을 때는 AP 활성을 검출할 수 없었다.

3차원 스캐폴드 상의 태반 줄기세포 뼈 매트릭스 형성을 기능적으로 평가하기 위하여, 스캐폴드에 파종하고 Anthro1B나 OS 배지 속에서 3~5주 동안 배양한 부착성 태반 줄기세포를 SEM 분석하였다. 도 19에 나타낸 것처럼, 세포 없이 배양한 TCaP의 SEM상은 대단히 많은 수의 구멍 때문에 상당히 다공성인 표면(화살표로 표시)을 보여 주었다. 태반 줄기세포나 중간엽 줄기세포와 함께 배양한 스캐폴드는 표면 다공성이 나타나지 않는데, 이는 세포가 세포 이중층 또는 스캐폴드를 둘러싼 세포외 매트릭스 단백질 중 어느 하나 또는 양쪽 모두로 이루어진 단일층을 형성한다는 것을 시사한다.

세포가 스캐폴드 안쪽에 무기질 침착된 뼈 매트릴스를 형성하고 있었는지를 밝히기 위하여, 세포-TCaP 스캐폴드 구조물의 단면을 높은 분해능(5000×)에서 SEM으로 관찰하였다. 도 19에 나타낸 것처럼, 세포 부재하에 배양한 스캐폴드는 스캐폴드를 이루는 TCaP 결정의 날카로운 모서리로 특징 지울 수 있었다. 그러나 태반 줄기세포나 중간엽 줄기세포로 파종한 스캐폴드는 이러한 날카로운 모서리가 없고 대신 결절 구조(nodule structure)로 꾸며져 있는데, 이는 도 17에서 관찰한 것과 매우 가까워 태반 줄기세포와 중간엽 줄기세포 양쪽 모두가 TCaP 스캐폴드 상에 무기질 침착 뼈 매트릭스를 형성한다고 시사한다.

10. 실시예 10 : 태반 줄기세포의 골 형성 전구세포로의 분화

이 실시예에서는 관류로 분리한 태반 줄기세포가 골 형성 전구세포(osteogenic precursor)로 분화하는 능력을 평가하는 실험 결과에 대해서 기술한다. 세포는 실시예 3에 따라서 사람 태반으로부터 관류하여 분리하였다.

세포를 수집한 다음, 사람 태반 관류물(HPP) 세포를 10% FBS 함유 DMEM 배지나 OS 배지 속 VITOSS(등록상표)(펜실베니아주 Malvern의 Orthovita, Inc.) 상에서 10일 동안 배양하였다. 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛으로 만들었다. 이 세포 펠렛에 남아 있는 유체를 제거한 다음, 세포를 PBS-2% FBS 20 μL 속에 표시한 세포 수(25000, 50000 또는 100000)로 재현탁하였다. 이어서 스캐폴드를 2×3×5 ㎣ 크기 조각으로 잘라 96-웰 배양판의 웰 속에 놓았다. 세포 현탁액을 이 스캐폴드 위에 바로 가하고 37℃의 5% CO₂ 존재 하에서 30분 동안 배양한 다음, Cambrex사 골 형성 분화 배지(카탈로그 번호 PT-3002) 200 μL를 가하여 세포-스캐폴드가 잠기게 하였다. 세포 생존률 분석을 위하여 세포를 가한 스캐폴드를 BD 산소 바이오센서 시스템(BD Biosciences, 카탈로그 번호 353830) 속으로 옮기고 Cambrex 골 형성 분화 배지 200 μL로 잠기게 하였다.

이 다음 골 형성 능력을 염색과 AP 활성 관찰로 평가하였다. 구체적으로 칼슘 존부를 보기 위한 통상적인 기술에 따라 세포를 알리자린레드로 염색하였다. 도 20에 나타낸 것처럼, 줄기세포와 MSC 양쪽 다 OS 배지에서 칼슘 함유 무기질 침착 매트릭스를 형성하였지만 DMEM 속에서는 그렇지 않았다.

AP 활성 분석은 OS에서 10일간 배양한 다음 수행하였다. 분석을 위하여 스캐폴드 위의 HPP를 얼리고 해동하기를 2차례 거듭하여 0.2% Triton X-100 함유 PBS 100 μL 속에 세포 용해시켰다. 제조사인 BioAssay System의 지침에 따라 QuantiChrom 알칼리성 인산 분해 효소 분석 키트(카탈로그 번호 DALP-250)를 이용하여 세포 용해액 5 μL에 대하여 알칼리성 인산 분해 효소 활성을 측정하였다. 이 결과는 도 21에 나타내었는데, MSC와 HPP 양쪽 다 OS 배지에서 10일 동안 배양한 뒤 AP 활성을 보인다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 실험 결과는 전술한 방식으로 얻은 세포들을 함유하는 줄기세포 분획이 골 형성 전구세포로 분화하는 능력도 갖추고 있었다는 것을 보여준다.

11. 실시예 11 : 태반 줄기세포 함유 조성물에 의한 뼈 복구의 생체내 모형

이 실시예에서는 관류로 분리한 태반 줄기세포 함유 조성물에 의한 뼈 결함의 치료를 평가하기 위하여 수행한 실험에 대해서 기술한다. 뼈 질병의 몇 가지 모형을 변형하여 서로 다른 뼈 질병에 대한 상기 조성물 치료를 평가하였다.

양쪽 두개골 결함(cranial bilateral defect)의 모형을 위하여, 수컷 가슴샘 없는 래트(athymic rat)의 두개골 양쪽에 3 mm×5 mm의 결함을 외과적으로 만들었다. 이 결함을 매트릭스만으로, 매트릭스와 PDAC를 조합하여 또는 매트릭스와 HPP를 조합하여 치료하였다. 서로 다른 치료법의 용량 의존성을 평가하기 위하여 PDAC의 양을 달리하였다. 또한 매트릭스와 줄기세포의 서로 다른 조합들의 효과를 시험하기 위하여 서로 다른 매트릭스 재료들을 평가하였다.

래트 여섯 마리를 각 치료군에 배정하고 뼈 결함을 지정한 매트릭스와 세포의 조합으로 채워 넣었다. 4주 후 혈청을 모으고, 래트를 희생시켰다. 이식물에 대한 면역 반응을 보기 위하여 혈청을 검사하였다. 래트 두개골을 미세 방사선 촬영술을 위하여 수집하고 10% NBF 속에 놓아 두었다.

머리 덮개뼈를 파라핀 고정(embedding)과 절편 자르기를 위하여 처리하였다. 머리 덮개뼈의 조직학적 관상면(coronal section)을 통상적인 방법에 따라 톨루이딘 염료로 염색하였다. 상기 결함과 매트릭스 운반체(matrix carrier) 잔류물(remanant) 속으로의 뼈 내증식(ingrowth)은 0 내지 4점 척도로 평가하는데, 4에서 내증식 정도가 가장 높다. 염증과 섬유화도 평가하였다.

기술한 방법을 변형하면 암 전이에 따라 생기는 뼈 병변의 치료 효과를 평가할 수 있다. 간략하게 사람 유방암 세포를 넙다리 동맥과 엉덩 동맥 사이의 문합 도관(anastomosing vessel) 속으로 동맥하 주사하여 누드 래트에 자리 특이적 뼈 용해 병변을 유발하였다. 이 전이된 암을 통상적인 항암 요법(예를 들어 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법 또는 기타 요법)이나 외과적으로 치료하였다. 이어서 상기 전이 암에서 남은 병변을 전술한 서로 다른 매트릭스들로 채운다. 이 래트를 방사선과적으로 진단하여 적절한 시간이 지난 다음에 희생한다. 상기 매트릭스에 대한 면역 반응, 염증, 서유화, 뼈 내증식 정도와 매트릭스 운반체의 양을 평가하였다.

뼈 결함을 치료하기 위한 태반 줄기세포 함유 조성물의 효능을 평가하는데 사용하거나 변형할 수 있는 뼈 질병의 모형을 기술한 문헌의 추가적인 예에는 Mitsiades 외, 2003, Cancer Res . 63:6689~96; Chakkalakal 외, 2002, Alcohol Alcoholism 37:13~20; Chiba 외, 2001, J. Vet . Med . Sci . 63:603~8; Garrett 외, 1997, Bone 20:515~520과 Miyakawa 외, 2003, Biochem . Biophys . Res . Comm . 313:258~62가 포함된다.

12. 실시예 12 : 사람 태반 콜라겐으로부터의 무기질 침착 콜라겐 생산

약 3 mg/mL의 4℃ 사람 태반 콜라겐(HPC) 용액을 중화 완충액(200 mM Na₂HPO₄, pH 9.2)과 85:15 비율로 혼합하여 최종 Na₂HPO₄ 농도가 30 mM, pH가 7.2가 되도록 하였다. 사소한 pH값 조정은 저어주는 동안 1 N NaOH나 HCl을 가하여 하였다. pH 조정을 마치면 교반을 중단하고 이 반응을 분당 1℃씩 32℃까지 덮혔다. 20~24시간 동안 이 반응을 등온으로 유지하고, 원섬유 콜라겐(fibrillar collagen)을 원심분리하여 분리하였다. 이 콜라겐을 세 차례 인산 완충 식염수(PBS, 20 mM Na₂HPO₄, 130　mM NaCl, pH 7.4)에 재현탁하고 원심분리하여 콜라겐을 분리하였다. 최종 세척된 원섬유 콜라겐을 PBS에 10 mg/mL로 재현탁하고 사용시까지 4℃에 저장하였다. HPC을 연축 처리(fibrillation)하면 상기 가용성 콜라겐을 도 22a에 나타낸 것처럼 짧은 원섬유(fibril)과 긴 섬유로 재구성할 수 있다.

12.1 콜라겐 원섬유의 무기질 침착

콜라겐에 무기질을 침착시키기 위하여 59.7 mM H₃PO₄ 용액을 만들면서 Ca(OH)₂를 199.9 mmol/L로 분산하였다. 이 Ca(OH)₂과 H₃PO₄을 각각 2:1의 비율로 혼합하고 그 pH를 냉각수 재킷(water jacket)형 반응 용기 속에서 9로 맞추었다. 이리하면 Ca/P 비율이 1.67이 된다. 이 반응을 힘차게 저어 주면서 각각 순환 물 중탕과 자동 적정 장치를 통하여 온도를 40℃에, pH를 9에 고정하였다. PBS 속의 원섬유 콜라겐을 서서히 이 반응 혼합물에 가하고 그 pH를 9로 다시 돌려주었다. 무기물 대 콜라겐의 최종 비율은 80:20이었다. 이 반응을 힘차게 18시간 동안 저어준 다음 무기질 침착 콜라겐(MC)을 원심분리로 분리하고 PBS로 3 차례 씻어 주었다. 무기질 침착 반응 도중 상기 섬유들을 따라 도 22b에 나타낸 전자 현미경 사진에서 보이는 것처럼 Ca-P 무기질이 형성되었다. 최종 반응 수득률은 높았고(>80%), 재료의 최종 무기질/콜라겐 비율은 TGA로 측정(도 23)한 투입 무기질/콜라겐 비율에 가까왔다.

12.2: 복합체의 가교 형성

무기질 침착 콜라겐(MC)을 약 2.5 mg/mL의 농도가 되도록 PBS에 재현탁하고 냉각수 재킷형 반응 용기 속에 놓아 두었다. pH는 자동 적정 장치를 써서 반응 내내 9.5로 맞추어 일정하게 유지하였고 온도는 순환하는 물 중탕으로 25℃에 맞추었다. 부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)를최종 농도 50 mM로 가하였다. 이 반응을 24시간 동안 힘차게 저어 준 다음 원심분리로 생성물을 분리하고 PBS로 한 번 씻은 다음 0.5 M 글리신(pH 10) 함유 PBS에 재현탁하여 모든 원하지 않는 장류 에폭사이드기를 소진하였다. 이 반응을 25℃에서 24시간 동안 힘차게 저어 주고 PBS로 3회 세척하였다. 가교된 무기질 침착 콜라겐(CMC)을 원심분리를 이용하여 분리하였다. 이 CMC 제형의 특성을 광학 현미경과 주사 전자 현미경, 열 중량 분석(TGA), 시차 주사 열량법(DSC), X-선 회절법(XRD)과 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)으로 분석하였다.

콜라겐의 변성 온도가 DSC 측정 결과 약 50℃에서 약 70℃로 늘어난 것으로부터 가교 형성을 확인하였다. 이 가교된 재료는 가교되지 않은 재료보다 기계적 강도가 더 세었고, 입체 현미경과 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰하였을 때 섬유질이 더 많은 것처럼 보였다. FTIR은 탄산화된 인산칼슘 무기질의 존재를 가리켰다. XRD는 이 무기질이 결정화 정도가 낮은 수산화인회석임을 확인하였다.

13. 실시예 13 : 무기질 침착 사람 태반 콜라겐 매트릭스 상의 PDAC 성장

이 실시예는 부착성 태반 줄기세포가 무기질 침착 HPC 매트릭스에 부착하고 그 위에서 자랄 수 있는 능력을 평가하는 실험 결과에 대하여 기술한다. 이 실험에서는 전술한 것처럼 CMC를 생산하고 항생제와 항진균제로 무균 처리하였다. 비접촉성 세포 독성 연구를 위하여 제조사의 설명에 따라 태반 줄기세포를 이용하는 표준적인 락토오스 탈수소화 효소 세포 독성 분석(LDH)에서 무건조 시료(wet sample)를 트랜스웰(transwell)에 실었다. 배양 배지에 방출된 LDH를 세포 독성 사이의 상관 관계를 관찰하였다.

이어서 전술한 것과 같이 마련한 CMC를 PDAC 부착과 증식 실험에 사용하였다. 태반 줄기세포를 전술한 바와 같이 CMC에 파종하였다. PDAC 세포 수는 PicoGreen DNA 분석(오레곤주 Eugene의 Molecular Probes)을 이용하여 제1, 5, 7일에 측정하였다. PDAC의 LDH 생산은 CMC에 노출되었을 때와 조직 배양 폴리스티렌(TCPS)에 노출되었을 때 비슷한 수준으로 나타났는데, 이는 CMC의 독성이 낮다는 것을 가리킨다. PDAC는 또한 시험한 모든 파종 밀도에서 가교하지 않은 무기질 침착 콜라겐보다 CMC에 더 많은 수로 부착하였다. 파종 7일 후에도 이 경향은 지속되었는데, 태반 줄기세포의 수는 CMC 상에서 가장 많았다.

14. 실시예 14: 태반 줄기세포와 이식 가능한 매트릭스를 이용한 두개골 결함의 복구

줄기세포를 이용한 조직 공학은 조직이나 장기 이식의 유망한 대안으로서 떠오르고 있다. 분만후 태반에서 분리한 새로운 줄기세포(태반 유래 부착성 세포(placenta-derived adherent cell, PDAC))는 중복성 줄기세포의 특성과 표현형을 지닌다. PDAC는 손상되거나 병든 조직의 복구를 위한 선택 가능한 치료법에 쓰일 수 있는 줄기/전구세포의 중요하고도 논란이 없는 세포원을 맡고 있다. 본 연구에서는 생체내와 시험관내에서 PDAC의 골 형성 거동을 조사하였다.

실험 방법

시험관내 실험: 태반 조직을 서로 다른 해부학적 위치에서 물리적으로 파괴하여 태반 줄기세포를 얻은 다음, 기저 배지에 파종하고 이를 골 형성 분화(OS) 배지 속에서 전술한 것처럼 유도하였다. PDAC의 시험관내 골 형성 활성은 알칼리성 인산 분해 효소(AP) 활성으로 평가하였고, 세포외 매트릭스의 무기질 침착은 알리자린레드 염색으로 검출하였다. 3차원 스캐폴드 상의 태반 줄기세포 부하량과 생존률은 각각 DNA 분석과 CELLTITER GLO(등록상표) 발광 분석으로 측정하였다.

생체내 실험: 태반 조직을 스캐폴드(Orthovita의 VITOSS(등록상표)나 DePuy의 HEALOS(상표)) 위에 가하고 시험관내에서 1시간까지 배양하여 이식을 위한 세포/스캐폴드 구조물을 형성하였다. 제 위치 외 모형(ectopic model)을 위하여, 태반 줄기세포를 가한 VITOSS(등록상표) 구조물을 가슴샘 없는 래트 40 마리에 피하 이식하고 이식 6주 뒤 수집하였다. 체외 이식편을 면역 조직 화학(IHC)으로 분석하였다. 뼈 결함 모형을 위해서는 수컷 Hsd:RH-Foxn ^rnu 가슴샘 없는 래트(매사추세츠주 Wilmington의 Charles River) 96 마리에 양쪽 두개골 결함(3 mm×5 mm)을 만들고 이를 이용하여 태반 줄기세포+HEALOS(등록상표), 뼈 형태 형성 단백질-2(BMP-2)+HEALOS의 양성 대조군, 스캐폴드(HEALOS) 단독인 음성 대조군과 빈 채로 놔 둔 결함(치료 없음) 사이의 골 형성/복구 능력을 비교하였다. 래트는 이 연구 시점에서 약 6주령이었고, 각 군에는 래트 16마리를 배정하였다. 실험 조건에 따른 체외 이식편에 mL 당 5×10⁶개 세포 비율의 줄기세포 현탁액 500 μL를 가하였다. 양성 대조군은 25 mg 운반체 당 BMP-2를 5 μg 함유하였다. 음성 대조군은 HEALOS와 세포 배양 배지 500 μL를 함유하였다. 체외 이식편을 이식 후 3주나 7주째에 수집하고 미세 방사선 촬영술, 무기질 침착 조직 밀도(영상화 소프트웨어 ImageJ 1.37판), Lunar PIXI X-선 음영 계측기와 조직학 분석으로 조사하였다. 조직학 분석은 절개한 뼈 조직에 대하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin), T-blue와 비멘틴 염색을 이용하여 수행하였다.

실험 결과

태반 줄기세포의 시험관내 골 형성 거동은 AP 활성 유도와 이 세포들이 알리자린레드 양성인 침착물을 형성할 수 있다는 점에서 증명되었다. 생체내 결과: 태반 줄기세포+VITOSS(등록상표) 피하 체외 이식편은 사람 오스테오칼신에 대하여 양성인 면역 조직 화학적 염색을 나타내었는데, 이는 상기 태반 줄기세포의 생체내 골 형성 능력을 증명한다. 두개골 결함 연구에서는 3주 된태반 줄기세포+HEALOS(상표) 체외 이식편이 조직학 분석에서 상당한 골 형성을, X-선과 PIXI에서 고밀도 무기질 침착을 나타내었다. 이러한 골 형성 활성은 이식 후 7주째에 더 늘어났다. 대표적인 조직학 슬라이드, 미세 방사선 촬영 사진, 결함 부위 무기질 침착 정도의 반정량적인 측정값을 도 24~26에 나타내었다. 이러한 결과는 태반 줄기세포가 스캐폴드와 더불어 뼈 복구 과정을 보강하는 능력을 지녔다는 것을 증명한다.

결 론: 부착성 태반 줄기세포는 시험관 내에서 적절한 자극을 받으면 골 형성 경로로 기능적 분화하며 무세포 조건과 비교하였을 때 생체내 뼈 복구를 현저하게 향상시키는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 연구로부터 본 발명자들은 태반 줄기세포를 적절한 스캐폴드와 함께 뼈 조직 공학 용도의 세포 치료제로 쓸 수 있다고 결론 지었다.

균등물:

본 발명은 본 명세서에서 기술한 특정 실시 태양의 범위 내로 한정되지 아니한다. 실제로 당업자에게는 앞선 기재와 첨부 도면의 내용으로부터 전술한 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 있을 수 있다는 점은 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부하는 청구범위 내에 포함되는 것이다.

본 명세서에서 인용하는 많은 간행물, 특허와 특허 출원은 그 전문에서 개시하는 바를 참고 문헌으로 삼고 있다.

Claims

복수의 제1항의 줄기세포 또는 제12항의 분리된 줄기세포군을 이들 줄기세포가 골 형성 세포(osteogenic cell)로 분화하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 배양은 상기 골 형성 세포가 칼슘이나 인산이 풍부한 무기질 침착 매트릭스를 측정 가능한 양으로 생산하기에 충분한 시간 동안 이루어지는,

매트릭스에 무기질을 침착시킬 수 있는 골 형성 세포의 생산 방법.
제1항에 있어서,

상기 세포를 덱사메타손이나 아스코르브산과 접촉시키는 단계를 포함하는 생산 방법.
CD34⁺이면서 CD44^-인 비부착성 태반 줄기세포군을 이식 가능한 스캐폴드용 기질(scaffolding substrate)과 조합하는 단계를 포함하되,

상기 스캐폴드용 기질은 인산β-트리칼슘 기질, 인산β-트리칼슘-콜라겐 기질, 콜라겐 기질, 인산칼슘 기질, 무기질 침착 사람 태반 콜라겐 기질, 히알루론산 기질 또는 세라믹 기질인 매트릭스의 제조 방법.
CD34⁺, CD44^-인 비부착성 태반 줄기세포군을 주사용 히알루론산 또는 콜라겐 과 조합하는 단계를 포함하는 주사용 조성물의 제형화 방법.
비부착성 줄기세포군을 함유하는, 이식 가능하거나 주사 가능한 조성물을 그것이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이러한 투여로써 그 환자의 뼈 결함을 치료하는 환자의 뼈 결함 치료 방법.
제5항에 있어서,

상기 뼈 결함은 암과 관련된 뼈 용해성 병변, 골절 또는 융합이 필요한 척추인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제6항에 있어서,

상기 뼈 용해성 병변은 다발성 골수종, 골암 또는 전이성 암과 결부된 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제6항에 있어서,

상기 골절은 비결합성(non-union) 골절인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제5항에 있어서,

상기 이식 가능한 조성물은 외과적으로 이식하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제5항에 있어서,

비부착성 줄기세포군을 함유하는 주사 가능한 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제5항에 있어서,

상기 주사 가능한 조성물은 상기 뼈 결함의 부위에 외과적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제5항에 있어서,

상기 주사 가능한 조성물은 전신 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
이식 가능한 스캐폴드용 기질과 줄기세포군을 조합하는 단계를 포함하되, 상기 줄기세포는 CD200⁺; 또는 HLA-G⁺; 또는 CD34⁺이면서 CD44^-인 매트릭스의 제조 방법.
줄기세포군을 주사용 히알루론산 또는 콜라겐과 조합하는 단계를 포함하되, 상기 줄기세포는 CD200⁺; 또는 HLA-G⁺; 또는 CD34⁺이면서 CD44^-인 주사용 조성물의 제형화 방법.
줄기세포군을 함유하는, 이식 가능하거나 주사 가능한 조성물을 그것이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이러한 투여로써 그 환자의 뼈 결함을 치료하되, 상기 줄기세포는 CD200⁺; 또는 HLA-G⁺; 또는 CD34⁺이면서 CD44^-인 환자의 뼈 결함 치료 방법.
제15항에 있어서,

상기 뼈 결함은 다발성 골수종, 골암 또는 전이성 암과 결부된 뼈 용해성 병변, 골절 혹은 융합이 필요한 척추인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제15항에 있어서,

비부착성 줄기세포군을 함유하는, 이식 가능한 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제17항에 있어서,

상기 이식 가능한 조성물은 외과적으로 이식하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제15항에 있어서,

비부착성 줄기세포군을 함유하는, 주사 가능한 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제19항에 있어서,

상기 주사 가능한 조성물은 전신 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.