WO2015105357A1 - 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제 - Google Patents

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cartilage
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하철원
김진아
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    • C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta

Definitions

  • the present invention relates to stem cells derived from the basal portion of chorionic trophoblast layer (bCT), which is a detailed tissue of the placenta, and a cell therapeutic agent comprising the same.
  • bCT chorionic trophoblast layer
  • Stem cells are undifferentiated cells and have the ability to differentiate into two or more different types of cells with self-replicating ability. Stem cells can be divided into embryonic stem cells and adult stem cells according to the cytological origin. Embryonic stem cells are derived from fertilized eggs or developing fetal tissue, while adult stem cells are derived from individual tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, fat, placenta, muscle, synovial membrane, brain, liver and pancreas after fetal growth is completed. On the other hand, embryonic stem cells have limitations for use as cell therapy because they have ethical limitations, whereas adult stem cells can be obtained mainly from bone marrow, fat, umbilical cord blood, and placenta. .
  • the placenta-derived stem cells by using the placenta discarded after childbirth, there is an advantage that can be easily collected and easily secure a large amount of stem cells.
  • Stem cells derived from adipose or bone marrow are limited in proliferative capacity and differentiation capacity due to the age or health status of the donor to be separated and extracted, and variable.
  • placental stem cells can be obtained at the earliest stage of adult stem cells.
  • Stem cells are hardly affected by stem cell capacity according to variables such as donor age and have excellent proliferation and differentiation capacity.
  • the placenta-derived stem cells have the advantage of being able to separate stem cell groups that can be used for various diseases such as neurological diseases, liver diseases, musculoskeletal diseases.
  • Korean Patent Registration No. 818214 discloses a method for separating stem cells from amnion or decidual membrane using NAC (N-acrtyl-L-cysteine) containing medium
  • Korean Patent Registration No. 871984 discloses bFGF. (Multi Fibroblast Growth Factor) -containing medium is disclosed for the multipotent of stem cells derived from amnion, meninges, basal decidual and placental tissue.
  • NAC N-acrtyl-L-cysteine
  • bFGF Multi Fibroblast Growth Factor
  • the present inventors continued to search for stem cells having excellent stem cell ability among the placental stem cells, and the soft chorionic trophoblast layer (tCT) of the placenta is about 25% thick as a soft part of the chorionic membrane.
  • Stem cells derived from the basal portion of chorionic trophoblast layer (bCT), which is a tissue layer, are prepared, and stem cells derived from the trophoblastic base layer are derived from whole placenta or other tissues as multipotent stem cells.
  • the present invention was completed by demonstrating homogeneous growth characteristics, excellent proliferation characteristics, and differentiation characteristics compared to stem cells, and having an excellent tissue regeneration effect in a tissue-deficient animal model.
  • an object of the present invention is to provide a stem cell derived from the basal portion of chorionic trophoblast layer (bCT), which is a detailed tissue of the placenta.
  • bCT chorionic trophoblast layer
  • Another object of the present invention is to provide a cell therapeutic agent and a composition for tissue regeneration comprising stem cells derived from the trophoblast base layer or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a stem cell derived from the basal portion of chorionic trophoblast layer (bCT) which is a detailed structure of the placenta.
  • bCT chorionic trophoblast layer
  • the present invention also provides a cell therapy agent comprising stem cells derived from the trophoblast base layer or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for tissue regeneration comprising stem cells derived from the trophoblast base layer or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • Stem cells derived from the basal portion of chorionic trophoblast layer (bCT) according to the present invention exhibit homogeneous growth characteristics, excellent proliferative characteristics and differentiation characteristics compared to conventional placental whole or other tissue-derived stem cells, and tissue defects. It has excellent tissue regeneration effect in animal model, so it can be usefully used for cell therapy.
  • CM placenta
  • CMT chorionic membrane and chorionic trophoblast layer
  • tCT total chorionic trophoblast layer
  • uCT chorionic trophoblast layer
  • bCT basal portion of chorionic trophoblast layer
  • Figure 2 is a view showing a photomicrograph (X100) of the cell morphology before passage (P0) and after long-term passage (P31) of the trophoblast basal layer (bCT) derived stem cells according to the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing a micrograph (X100) of the cell morphology before passage (P0) and long-term passage (P29) of the placenta-derived stem cells.
  • Figure 4 is a diagram showing the time of population multiplication of stem cells derived from the whole placenta, each subtissue of the placenta and other tissues.
  • FIG. 5 is a diagram showing colony forming units of stem cells derived from the entire placenta, each subtissue of the placenta and other tissues.
  • Figure 6 is a diagram showing the flow cytometry results for confirming the surface factor expression characteristics of trophoblastic basal layer (bCT) derived stem cells according to the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of staining for observing the degree of differentiation of stem cells derived from whole placenta, each sub-tissue of placenta and other tissues into adipocytes, chondrocytes, or osteoblasts. to be.
  • FIG. 8 is a diagram showing the result of quantification after staining with Safranin-O in order to observe the differentiation of stem cells derived from whole placenta, each sub-tissue of placenta and other tissues into chondrocytes.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of quantification after immunohistochemical staining using Type II collagen to observe the differentiation of stem cells derived from whole placenta, each sub-tissue of placenta and other tissues into chondrocytes. .
  • Figure 10 is a diagram showing the results of quantification after staining with Alkaline phosphate in order to observe the degree of differentiation of stem cells derived from the whole placenta, each sub-tissue of the placenta and other tissues into bone cells.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of quantification after staining with Alizarin red S in order to observe the degree of differentiation of stem cells derived from whole placenta, each sub-tissue of placenta and other tissues into osteoblasts.
  • Figure 12 is a diagram showing the results of quantification after staining with Oil red O in order to observe the differentiation of stem cells derived from the whole placenta, each sub-tissue of placenta and other tissues to adipocytes.
  • Figure 13 shows the results of cartilage regeneration through H & E and Safranin-O staining after administration of umbilical cord blood-derived stem cells (UCB) or trophoblast basal stem-derived stem cells (bCT) in a cartilage injury animal model.
  • UB umbilical cord blood-derived stem cells
  • bCT trophoblast basal stem-derived stem cells
  • FIG. 14 is a diagram showing the results obtained by quantifying the cartilage regeneration effect after administration of umbilical cord blood-derived stem cells (UCB) or trophoblast basal stem-derived stem cells (bCT) in a cartilage-damaged animal model using an international cartilage repair society (ICRS) macroscopic score to be.
  • UB umbilical cord blood-derived stem cells
  • bCT trophoblast basal stem-derived stem cells
  • the present invention provides stem cells derived from the basal portion of chorionic trophoblast layer (bCT), which is a detailed tissue of the placenta.
  • bCT chorionic trophoblast layer
  • the "stem cell” refers to a cell having the ability to differentiate into two or more different kinds of cells while having a self-replicating ability.
  • Stem cells can be classified into totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells.
  • totipotent stem cells are pluripotent cells capable of developing as a single individual. Cells up to 8 cell stages after fertilization of eggs and sperm have these properties. When a cell is separated and transplanted into the uterus, it means a cell capable of developing as a complete individual.
  • pluripotent stem cells are cells that can arise from various cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endoderm, and are located inside the blastocyst appearing after 4-5 days of fertilization. It originates from the inner cell mass, which is called embryonic stem cells, and refers to cells that differentiate into various other tissue cells but do not form new life.
  • multipotent stem cells refers to cells that can only differentiate into specific cells that form tissues and organs containing stem cells. For the purposes of the present invention said “stem cells” are preferably multipotent stem cells.
  • placenta refers to an in vivo tissue made for the fetus during pregnancy, and has a disc shape having a weight of 500-600 g, a diameter of 15-20 cm, and a thickness of 2-3 cm.
  • One side of the placenta is in contact with the mother and the other is in contact with the fetus, between which the transfer of nutrients and oxygen occurs between the mother's blood and the fetus's blood vessels.
  • Placenta can be largely divided into three layers of amnion, chorion, and decidual membrane, and more specifically, can be divided into amnion epithelium, amnion, chorion, trophoblast, and decidual membrane.
  • a cross-sectional view of the placenta is briefly shown in FIG. 1.
  • the "nutrient base layer” is a tissue corresponding to 20 to 30% of the thickness of the trophoblast layer located between the chorionic and decidual membranes, and the tissue layer corresponding to a thickness of about 5-6 mm. Means.
  • Nutrient membrane in the present invention, the ectoderm layer of the embryo located outside the distribution, means a tissue that attaches the egg to the uterine wall and supplies nutrients to the embryo. From this, the chorion and amnion are derived, and the inner cell layer of the trophoblast covers the villi and is called cytotrophic membrane.
  • villi refers to the cellular membrane of the embryonic outermost layer in human embryology.
  • the "dropping film” means the mucous membrane of the uterus falling off after eruption.
  • Stem cells derived from the trophoblast basal layer according to the present invention are obtained by adding an enzyme solution to the trophoblast basal tissue isolated from the placenta and performing the enzyme reaction in a medium to which fetal bovine serum and antibiotics are added, without using growth factors. It can be obtained by culturing and then recovering.
  • the enzymes include trypsin, collagenase, dispase, DNase, RNase, protease, lipase, hyaluronidase and elastase. And the like, but are not limited thereto.
  • the collagenase includes collagenase A, I, II, III or IV.
  • Stem cells derived from the trophoblast basal layer according to the present invention exhibit the following characteristics.
  • Stem cells derived from the trophoblastic base layer according to the present invention can be differentiated into different kinds of cells, for example, various types such as adipocytes, chondrocytes, bone cells, nerve cells, ligament cells or tenocytes (tenocytes). Can differentiate into, but is not limited to.
  • differentiation generally refers to a phenomenon in which a relatively simple limit is separated into two or more qualitatively different sub-systems, specifically, a phenomenon in which structures or functions are specialized while cells divide and grow, In other words, it means a phenomenon in which the cells or tissues of a living organism change shape or function to perform a given task.
  • undifferentiated means a state in which the above-mentioned differentiation has not yet occurred, yet contains a characteristic as a stem cell.
  • the method of differentiating stem cells may be performed according to a conventionally known method, and is not particularly limited.
  • the stem cells are cultured in a medium containing dexamethasone (indamethasone), indomethacin (indomethacin), insulin and IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) to differentiate into adipocytes;
  • the stem cells were cultured in a medium containing dexamethasone, BMP-6 (bone morphogenetic protein 6), transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), ascorbic acid, and L-proline (L-proline).
  • the stem cells are cultured in a medium containing dexamethasone, ascorbic acid, ⁇ -glycrophosphate and ⁇ -glycrophosphate and ascorbic acid-2-phosphate to differentiate into bone cells. This is preferred.
  • the method for measuring the degree of differentiation of stem cells derived from the trophoblast basal layer differentiated by the above method is not particularly limited thereto, but may use flow cytometry, immunocytochemical, PCR or gene-expression profiles known in the art.
  • a method of measuring the change in cell surface labeling or morphology a method of investigating morphological changes of cells using an optical microscope or a confocal microscope, a method of measuring a change in gene expression profile, and the like.
  • -PCR Oil-red O staining, Safranin O staining, Type II collagen immunohistochemical staining, ALP (alkaline phosphate) staining or Alizarin red S staining can be used.
  • Stem cells derived from the basal portion of chorionic trophoblast layer (bCT) according to the present invention exhibit homogeneous growth characteristics, excellent proliferative characteristics and differentiation characteristics compared to conventional placental whole or other tissue-derived stem cells, and tissue defects.
  • the tissue regeneration effect is excellent in animal models. .
  • the present invention provides a cell therapy agent comprising stem cells derived from a trophoblastic basal layer or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • the differentiated cells are not particularly limited, but include adipocytes, chondrocytes, osteocytes, neurons, ligaments, psoriasis, and the like, and may be selected according to therapeutic purposes.
  • a "cellular therapeutic agent” is a medicine (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues prepared through isolation, culture, and special manipulation from humans.
  • a medicine US FDA regulation
  • cells may be used for the purpose of treating, diagnosing, and preventing diseases such as proliferating and screening living autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro or otherwise altering their biological characteristics. Means used as medicine.
  • Stem cells derived from the trophoblastic basal layer of the present invention are of various kinds in which tissues or organs of the body are modulated, strengthened, treated or replaced by engraftment, transplantation or infusion of a desired cell population, for example, a stem or differentiated cell population. Can be used in treatment protocols. Stem cells derived from the trophoblastic basal layer (bCT) of the present invention can replace or enhance existing tissue, resulting in new or changed tissue or bind to biological tissue or structures.
  • bCT trophoblastic basal layer
  • the cell therapeutic agent of the present invention can be used for the treatment of cartilage damage, cartilage defect, bone defect, tendon-ligament defect, adipose tissue defect and the like.
  • cartilage defect is a meaning encompassing the case that the cartilage included in the body is damaged, defective (defect) or lack, for example, cartilage trauma, cartilage rupture, cartilage softening, cartilage necrosis, osteochondritis, cartilage Defects or osteoarthritis, and the like.
  • the stem cells derived from the trophoblast basal layer of the present invention can be used for the purpose of treating lesions of articular cartilage by administering in the joint, or treating or preventing by administering to the tendon or ligament site.
  • stem cells derived from the trophoblastic basal layer of the present invention can be administered to a joint, tendon, or ligament site, recovery or adjustment of the damage site of the tissue is achieved, or stem cells derived from the trophoblastic base layer of the present invention.
  • Stem cell-derived materials such as derived cartilage tissue constructs, can be used to treat tissues of joints (eg, knee joints, etc.) by methods such as reconstitution or regeneration.
  • Preferred dosages of the cell therapy of the present invention vary depending on the condition and weight of the individual, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Administration may be administered once a day, may be administered several times, the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • Stem cells derived from the basal portion of the chorionic trophoblast layer (bCT) according to the present invention have excellent proliferative and differentiating ability and thus have an excellent tissue regeneration effect.
  • the present invention provides a composition for tissue regeneration comprising stem cells derived from the trophoblast base layer or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • the tissue is not particularly limited, but includes tissues such as cartilage, fat, bone, nerves, ligaments, tendons, and the like.
  • the cartilage includes hyaline cartilage, fibrocartilage, or elastic cartilage.
  • articular cartilage articular cartilage, ear cartilage, non-cartilage, elbow cartilage, meniscus. (meniscus), knee cartilage, costal cartilage, ankle cartilage, tracheal cartilage, laryngeal cartilage or spinal cartilage, but is not limited thereto.
  • the fat includes all irrespective of the location of the body, for example, subcutaneous fat, fat (omentum, mesentery), bone marrow fat, retroperitoneal fat, etc. Including, but not limited to.
  • Placenta was collected from mothers who agreed to donate at normal delivery after cesarean section at Samsung Medical Center.
  • the collected placenta was transferred to a sterile container and the amniotic membrane was removed from the placenta tissue, and approximately 25 of the amnion layer (tCT) located between the chorion membrane (CM) and the decidual membrane (DC) were light (adjacent) to the chorionic membrane.
  • the trophoblast basal tissue corresponding to the% thickness (about 5-6 mm thick), was carefully separated using sterile sachets W and scalpel.
  • the separated trophoblast basal tissues were transferred to a 150 mm dish and washed 8-10 times using PBS to remove blood and blood cells.
  • DMEM medium to which 0.2% collagenase was added was added and reacted at 37 ° C. for 2-3 hours using a stirrer to obtain cells derived from the trophoblast base layer.
  • Cells derived from the obtained trophoblast base layer were filtered through a 70 ⁇ m mesh to remove undigested tissues, and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added, followed by centrifugation at 25 ° C. and 1000 rpm for 4 minutes.
  • the supernatant was removed and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added to the remaining precipitated cells, and cultured under 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the cells attached to the bottom of the culture vessel in the culture were selected to obtain stem cells derived from the trophoblast base layer.
  • DMEM medium to which 0.2% collagenase was added to the washed placental tissue was added and reacted using a stirrer at 37 ° C to obtain placental cells.
  • the obtained placental cells were filtered through a 70 ⁇ m mesh to remove undigested tissues, and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added, followed by centrifugation at 25 ° C. and 1000 rpm for 4 minutes. The supernatant was removed and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added to the remaining precipitated cells, and cultured under 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the cells attached to the bottom of the culture vessel in the culture were selected to obtain stem cells derived from whole placenta (Pla).
  • CM Chorionic membrane
  • CMT chorionic membrane and chorionic trophoblast layer
  • CCT total chorionic trophoblast layer
  • UCT upper portion of chorionic trophoblast layer
  • tCT amnion layer
  • CM chorion
  • DC decidual membrane
  • DMEM medium containing 0.2% collagenase was added and reacted at 37 ° C. for 2-3 hours using a stirrer.
  • Cells derived from the upper layer were obtained respectively.
  • Each obtained cell was filtered through a 70 ⁇ m mesh to remove undigested tissue, and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added, followed by centrifugation at 25 ° C. and 1000 rpm for 4 minutes. The supernatant was removed and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added to the remaining precipitated cells, and cultured under 37 ° C and 5% CO 2 .
  • Cells attached to the bottom of the culture vessel in the culture were selected to obtain stem cells derived from the chorion, chorion-nutrition membrane, whole trophoblast layer, and trophoblast layer, respectively.
  • Bone marrow was transferred to a 50 ml tube, washed with the same amount of PBS, and centrifuged at 25 ° C. and 2580 rpm for 10 minutes. After repeating the washing process twice, the supernatant was removed and the remaining precipitated bone marrow was suspended in the same amount of PBS (total 5 ml), and the solution was slowly transferred onto a 25 ml Ficoll solution prepared in advance, followed by 25 ° C. , Centrifuged at 2580 rpm for 30 minutes. Only the cell layer located in the middle of the three layers separated by the density difference was separated and washed, and then centrifuged at 25 ° C. and 2580 rpm for 5 minutes. DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added to the cells obtained through the above process, and growth was performed under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions to obtain bone marrow-derived stem cells.
  • Umbilical Cord Blood was transferred to a 50 ml tube, washed with an equal amount of PBS, and centrifuged at 25 ° C. and 2580 rpm for 10 minutes. After repeating the washing process twice, the supernatant was removed and the remaining precipitated umbilical cord blood was suspended in the same amount of PBS (total 5 ml), and the solution was slowly transferred onto a 25 ml Ficoll solution prepared in advance, followed by 25 ° C. , Centrifuged at 2580 rpm for 30 minutes. Only the cell layer located in the middle of the three layers separated by the density difference was separated and washed, followed by centrifugation at 25 ° C. and 2580 rpm for 5 minutes. Stem cells derived from cord blood were obtained by adding DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics without growth factors to the cells obtained through the above procedure, and culturing under 37 ° C and 5% CO 2 .
  • Adipose or synoviium tissues were transferred to 150 mm dishes and washed 2-3 times with PBS to remove blood and blood cells. After cutting the fat or synovial tissue finely, each tissue was transferred to a 50 ml tube, DMEM medium added with 0.2% collagenase was added, and reacted using a stirrer at 37 ° C. to obtain adipose or synovial cells. . The obtained fat or synovial cells were filtered through a 70 ⁇ m mesh to remove undigested tissue, and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added, followed by centrifugation at 25 ° C. and 1000 rpm for 4 minutes.
  • the remaining precipitated cells were added with DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics without growth factors, and cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions to obtain adipose or synovial stem cells. It was.
  • Example 2 Passage culture of stem cells derived from the trophoblast basal layer, which is a detailed tissue of the placenta
  • the stem cells derived from the trophoblast basal layer which is a detailed tissue of the placenta obtained in Example 1, with PBS, the DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added every 2-3 days without growth factors. Incubated.
  • the stem cells grow more than 80%, by treating (TryPLE) to separate the stem cells from the culture vessel, dilution of the separated stem cells in a ratio of 1/4, and then passage in another culture vessel method Cultivation was performed. As the passage was repeatedly performed, passage numbers that were no longer passaged were measured, and the cell morphology before passage (P0) and after passage for a long time was observed under a microscope.
  • the trophoblast-derived stem cell (bCT) -derived stem cells according to the present invention has an excellent proliferative capacity up to the passage number 31, it was confirmed that long-term culture is possible.
  • whole placenta (Pla) -derived stem cells exhibit the morphological characteristics of the fibroblast shape from the beginning of passage culture, a plurality of different types of cells, not one form is mixed It could be confirmed. That is, compared with FIG. 2, stem cells derived from the trophoblastic base layer before and after subculture were specifically maintained only a single cell, but stem cells derived from the whole placenta were mixed with different types of cells.
  • Example 3 Analysis of colony forming ability of stem cells derived from trophoblast basal layer, which is a detailed tissue of placenta
  • the population doubling time and colony forming ability of stem cells derived from the trophoblastic basal layer which is a detailed tissue of the placenta obtained in Example 1, was confirmed. More specifically, the stem cell derived from the trophoblast base layer obtained in Example 1 was subjected to the first passage culture by the method of Example 2, 5 X 10 3 in a 100 mm dish at the time when the passage is terminated After seeding, dogs were cultured in DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics without growth factors for 10 days. The time taken to double the number of stem cells from P2 to P6 (group doubling time) was measured, and the number of colonies formed in stem cells was performed by performing Giemsa staining on the cultured stem cells. It was.
  • the trophoblastic basal layer (bCT) -derived stem cells As shown in FIG. 4, the trophoblastic basal layer (bCT) -derived stem cells according to the present invention have a significantly shorter population doubling time than the whole placenta, other placental sub-tissues, and other tissue-derived stem cells, so that cell proliferation is faster. It was confirmed.
  • the trophoblast-derived stem cells (bCT) derived stem cells according to the present invention was confirmed that the colony forming ability is significantly superior to the whole placenta, other placental substructures and other tissue-derived stem cells.
  • stem cells derived from the trophoblast basal layer which is a detailed tissue of the placenta obtained in Example 1
  • the following experiment was performed.
  • stem cells derived from the trophoblast basal layer were washed with PBS, triple treated, and the stem cells were collected and centrifuged at 1000 rpm for 4 minutes. After removing the supernatant, the stem cells were washed by adding a mixture of 2% FBS and PBS to inhibit nonspecific binding, and then centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, the stem cells were suspended in PBS, and each 1 ⁇ 10 5 cells were dispensed into a flow cytometer-specific round flask.
  • trophoblastic basal layer (bCT) -derived stem cells shows a positive marker expression characteristics for CD44, CD73, CD90 and CD105, CD31, CD34, CD45 and HLA-DR It was confirmed that the marker marker expression characteristics were negative.
  • the stem cells were known to induce differentiation of known chondrocyte differentiation medium (0.1 ⁇ M dexamethasone, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid).
  • chondrocyte differentiation medium 0.1 ⁇ M dexamethasone, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid.
  • DMEM medium containing 40 ⁇ g / ml L-proline, 10 ng / ml TGF- ⁇ 3, 500 ng / ml BMP-6, 50 mg / ml ITS premix
  • the trophoblastic basal layer (bCT) -derived stem cells according to the present invention is excellent chondrocyte differentiation ability that can be uniformly differentiated into chondrocytes than whole placenta, other placental substructures and other tissue-derived stem cells. It was confirmed that it has.
  • Example 6 Confirmation of differentiation of stem cells derived from trophoblast basal layer, which is a detailed tissue of placenta, into osteoblasts
  • the stem cells are known osteoblast differentiation induction medium (10% FBS, 1% anti-biotics, Differentiation into bone cells was induced by culturing for 4 weeks in 100 ⁇ M dexamethasone, 50 mM ascorbic acid-2-phosphate, 10 ⁇ M ⁇ -glyclophosphate, DMEM medium containing 250 ⁇ M ascorbic acid).
  • the trophoblastic basal layer (bCT) -derived stem cells according to the present invention can be differentiated into bone cells uniformly than whole placenta, other placental substructures and other tissue-derived stem cells. It was confirmed that the osteoblast differentiation ability.
  • stem cells were known as adipocyte differentiation induction medium 1 (10% FBS, 1% Anti-biotics, DMEM medium with 1 ⁇ M dexamethasone, 20 ⁇ M indomethacin, 10 ⁇ M insulin, 50 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)) and adipocyte differentiation induction medium 2 (10% FBS, 1% Anti-biotics, DMEM medium containing 10 ⁇ M insulin) was alternately added for 3 to 4 days to incubate for 3 weeks to induce differentiation into adipocytes.
  • adipocyte differentiation induction medium 1 (10% FBS, 1% Anti-biotics, DMEM medium with 1 ⁇ M dexamethasone, 20 ⁇ M indomethacin, 10 ⁇ M insulin, 50 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)
  • adipocyte differentiation induction medium 2 (10% FBS, 1% Anti-biotics, DMEM medium containing 10 ⁇ M
  • the trophoblastic basal layer (bCT) -derived stem cells according to the present invention is excellent adipocyte differentiation ability that can be uniformly differentiated into adipocytes than the whole placenta, other placental substructures and other tissue-derived stem cells It was confirmed that it has.
  • the knee was flexed while looking down to observe the inside of the joint. After confirming that there was no unusual pathological findings, a small awl was scratched 1 mm above the upper anterior end of the interchondylar notch of the patella and then drilled with a diameter of 3 mm and depth. Holes of 5 mm were made to damage the cartilage full thickness. 8 and 16 weeks after the cartilage damage was induced as described above, the damage site was observed to confirm that the cartilage damage site did not heal naturally.
  • 500 ⁇ l was injected into the cartilage damage site made on the right side of the animal model (500 ⁇ l is insufficient in the amount of a composition or a mistake during the procedure). It is prepared for the convenience of the procedure in consideration of the case).
  • the patella was returned to its original position, the soft tissue around the patella was closed with absorbent thread and the skin was closed with nonabsorbent thread.
  • the opposite leg was injected with the same amount of hyaluronic acid and cord blood stem cells as a positive control. After waking up from anesthesia, rabbits were allowed to move freely. Pain and antibiotics were administered to prevent infection for 5 days after surgery.
  • H & E and Safranin O stains were obtained from sections of the cartilage that were damaged and treated from each rabbit, and newly formed by quantification using the International Cartilage Repair Society (ICRS) macroscopic score. Cartilage was analyzed. The results are shown in FIGS. 13 and 14.
  • ICRS International Cartilage Repair Society
  • the group injected with trophoblast-derived stem cells (bCT) -derived stem cells according to the present invention was confirmed that the overall thickness of the newly generated cartilage cell layer more than twice as compared to the group injected with cord blood-derived stem cells It was. Therefore, it is confirmed that the trophoblastic basal layer (bCT) -derived stem cells can produce chondrocytes at the damaged joint cartilage region with excellent efficiency, thereby effectively treating articular cartilage damage.
  • the stem cells derived from the whole placenta of the conventional placenta are mixed with stem cells derived from substructures having various characteristics, and thus the ability to differentiate into different cells does not appear uniformly, but according to the present invention Stem cells derived from the trophoblast basal layer, which is a detailed tissue of, were found to exhibit superior characteristics compared to the stem cells derived from the whole placenta in terms of excellent differentiation ability and homogeneity for various characteristics of other stem cells.
  • the trophoblast-derived stem cells according to the present invention showed a consistent pattern in the characteristics of growth, proliferation, morphology and differentiation of stem cells derived from chorion, chorion-nutrition membrane, trophoblast, and trophoblast-derived stem cells, which are the most excellent stem cells. Showed characteristics. Therefore, when the stem cells derived from the trophoblastic base layer can be used to improve the differentiation efficiency to the desired cells, it was confirmed that it can be usefully used as a cell therapy in various diseases.

Abstract

본 발명은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer, bCT)으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체 또는 다른 조직 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 조직 결손 동물모델에서 우수한 조직 재생 효과를 가지고 있어, 세포치료제로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제
본 발명은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.
최근의 생명공학은 인간 복지를 최종 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 그 중 줄기세포를 이용한 기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식, 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급 장기 부족, 벡터 개발이나 질환 유전자에 대한 지식 부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다. 이에 줄기세포에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자들이 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 줄기세포의 적용 가능성을 다양하게 제시해 왔다.
줄기세포(stem cell)란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 줄기세포는 세포학적 유래에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 구분될 수 있다. 배아 줄기세포는 수정란이나 발생중인 태아 조직 등에서 유래하는 반면, 성체 줄기세포는 태아 성장이 완료된 후의 개체 조직인 골수, 제대혈, 지방, 태반, 근육, 활액막, 뇌, 간, 췌장 등에서 유래한다. 한편, 배아 줄기세포는 윤리적으로 제한이 있기 때문에 세포치료제로 사용하기 위한 한계가 있으나, 이에 반해 성체 줄기세포는 주로 골수, 지방, 제대혈 및 태반 등에서 획득이 가능하여 윤리적인 면에서 문제가 제기되지 않는다.
이중, 태반 유래 줄기세포의 경우 출산 후 폐기되는 태반을 이용함으로써, 채취가 용이하고 다량의 줄기 세포를 손쉽게 확보 가능한 장점이 있다. 지방이나 골수 유래 줄기세포는 분리, 추출되는 공여자의 나이나 건강상태 등에 영향을 받아 증식력이나 분화능 등에 제한이 있고 변동성이 많지만, 태반 유래 줄기세포의 경우 성체 줄기세포 중 가장 이른 시기에 수득할 수 있는 줄기세포로서 공여자의 나이 등의 변수에 따라 줄기세포능에 영향을 거의 받지 않으며 뛰어난 증식력 및 분화능을 가진다. 또한, 태반 유래 줄기세포는 신경계 질환, 간 질환, 근골격계 질환 등 다양한 질환에 활용 가능한 줄기세포군을 분리할 수 있다는 장점이 있다.
상술한 장점 때문에, 태반 유래 줄기세포에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 대한민국 특허등록 제818214호에는 NAC(N-acrtyl-L-cysteine) 함유 배지를 이용하여 양막 또는 탈락막으로부터 줄기세포를 분리하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제871984호에는 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) 함유 배지를 이용하여 양막, 장막, 기저 탈락막 및 태반 조직으로부터 유래된 줄기세포의 다분화능에 관해 개시하고 있다. 그러나 현재까지 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포에 대한 연구는 수행된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 태반 유래 줄기세포 중에서도 줄기세포능이 더욱 우수한 줄기세포를 찾기 위한 연구를 계속한 결과, 태반의 영양막층 전체(total chorionic trophoblast layer; tCT) 중 융모막에 연한 부위로서 약 25% 두께에 해당하는 조직층인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)을 분리하여 이로부터 유래된 줄기세포를 제조하고, 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포가 다분화능 줄기세포로서 종래의 태반 전체 또는 다른 조직 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 조직 결손 동물모델에서 우수한 조직 재생 효과를 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 및 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer, bCT)으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체 또는 다른 조직 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 조직 결손 동물모델에서 우수한 조직 재생 효과를 가지고 있어, 세포치료제로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 태반(Pla)의 세부 조직인 융모막(chorionic membrane; CM), 융모-영양막(chorionic membrane and chorionic trophoblast layer; CMT), 영양막층 전체(total chorionic trophoblast layer; tCT), 영양막 상층부(upper portion of chorionic trophoblast layer; uCT) 및 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)의 단면 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포의 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 계대 배양한 이후(P31)의 세포 형태를 현미경으로 관찰한 사진(X100)을 나타낸 도이다.
도 3는 태반 전체 유래 줄기세포의 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 계대 배양한 이후(P29)의 세포 형태를 현미경으로 관찰한 사진(X100)을 나타낸 도이다.
도 4는 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 집단 배가 시간을 나타낸 도이다.
도 5는 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 집락 형성 단위를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포의 표면인자 발현 특성을 확인하기 위한 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 지방세포(Adipogenesis), 연골세포(Chondrogenesis) 또는 골세포(Osteogenesis)로의 분화 정도를 관찰하기 위한 각 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 연골 세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여 Safranin-O로 염색한 후, 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 연골 세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여 Type II collagen을 이용한 면역조직화학염색을 수행한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 골세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여, Alkaline phosphate로 염색한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 골세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여, Alizarin red S로 염색한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 태반 전체, 태반의 각 세부조직 및 타 조직으로부터 유래된 줄기세포의 지방세포로의 분화를 관찰하기 위하여, Oil red O로 염색한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 연골 손상 동물모델에 제대혈 유래 줄기세포(UCB) 또는 영양막 기저층 유래 줄기세포(bCT)의 투여 후 H&E 및 Safranin-O 염색을 통해 연골 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 연골 손상 동물모델에 제대혈 유래 줄기세포(UCB) 또는 영양막 기저층 유래 줄기세포(bCT)의 투여 후 연골 재생 효과를 ICRS(International Cartilage Repair Society) macroscopic score를 이용한 정량화를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포를 제공한다.
본 발명에서 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화능에 따라, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있다.
본 발명에서 "만능 줄기세포(totipotent stem cells)"란, 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명에서 "전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)"란, 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하고 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못하는 세포를 의미한다. 본 발명에서 "다분화능 줄기세포"는 줄기세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 "줄기세포"는 바람직하게는 다분화능 줄기세포이다.
본 발명에서 "태반(placenta)"이란, 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 생체 내 조직을 의미하는데, 무게 500-600 g, 지름 15-20 cm, 두께 2-3 cm 정도의 원반형태이다. 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며, 그 사이에서 모체의 혈액과 태아의 혈관 사이에 영양분 및 산소의 전달이 이루어지게 된다. 태반은 크게 양막, 융모막, 탈락막의 3층으로 구분할 수 있고, 보다 상세하게는 양막 상피, 양막, 융모막, 영양막, 탈락막으로 구분 할 수 있다. 태반의 단면도를 도 1에 간략히 나타내었다.
본 발명에서 “영양막 기저층”이란, 융모막과 탈락막 사이에 위치한 영양막층 중 융모막에 연한(근접한) 부위의 20 내지 30% 두께에 해당되는 조직으로, 보통 약 5-6㎜의 두께에 해당하는 조직층을 의미한다.
본 발명에서 “영양막”이란, 배포 외부에 위치한 배자의 외배엽층으로, 난자를 자궁벽에 부착시키며 배자에 영양분을 공급하는 조직을 의미한다. 이것에서 융모막 및 양막이 유래하며, 영양막의 내세포층은 융모를 덮으며, 세포영양막이라 부른다.
본 발명에서 “융모막”이란, 인체발생학에서는 배자체 최외층의 세포성 막을 의미한다.
본 발명에서 “탈락막”이란, 만출후에 탈락하는 자궁의 점막을 의미한다.
본 발명에 따른 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 태반으로부터 분리한 영양막 기저층 조직에 효소 용액을 가하여 효소반응을 수행하여 얻어진 세포를, 성장 인자를 사용하지 않고, 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지에서 배양한 다음 회수함으로써 수득될 수 있다. 상기 효소에는 트립신(Trypsin), 콜라게나아제(collagenase), 디스파아제(dispase), DNase, RNase, 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 엘라스타제 (elastase) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 콜라게나아제는 콜라게나아제 A, I, II, III 또는 IV등을 포함한다.
본 발명에 따른 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 다음과 같은 특징을 나타낸다.
(a) 섬유아세포(fibroblastic cell) 모양의 형태학적 특징;
(b) 25 내지 30 이상의 계대수에 이르도록 장기간 동안 증식할 수 있는 능력;
(c) 지방세포, 연골세포 또는 골세포로 분화할 수 있는 능력;
(d) 집락형성능;
(e) CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및,
(f) CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성;
본 발명에 따른 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 서로 다른 종류의 세포로 분화할 수 있으며, 예를 들어, 지방세포, 연골세포, 골세포, 신경세포, 인대세포 또는 건세포(tenocyte) 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순 한계가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 상대적으로, "미분화"란 상술한 분화가 일어나지 않은, 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다.
줄기세포를 분화시키는 방법은 종래 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 인슐린 및 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 포함하는 배지에서 배양하여 지방세포로 분화시키는 방법; 상기 줄기세포를 덱사메타손, BMP-6(bone morphogenetic protein 6), TGF-β(Transforming growth factor beta), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 L-프롤린(L-proline)을 포함하는 배지에서 배양하여 연골세포로 분화시키는 방법; 상기 줄기세포를 덱사메타손, 아스코르브산, β-글리크로포스페이트(β-glycrophosphate) 및 아스코르브산-2-포스페이트(ascorbic acid-2-phosphate)를 포함하는 배지에 배양하여 골세포로 분화시키는 방법 등을 사용함이 바람직하다.
상기 방법으로 분화된 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 분화 정도를 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 분야에 공지된 기법인 유세포 분석방법, 면역세포화학적 방법, PCR 또는 유전자-발현 프로파일을 사용하여 세포 표면 표지 또는 형태의 변화를 측정하는 방법, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태변화를 조사하는 방법, 유전자 발현 프로파일의 변화를 측정하는 방법 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 RT-PCR, Oil-red O 염색법, Safranin O 염색법, Type II collagen 면역조직화학 염색법, ALP(alkaline phosphate) 염색법 또는 Alizarin red S 염색법 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer, bCT)으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체 또는 다른 조직 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 조직 결손 동물모델에서 조직 재생 효과가 우수하다. .
따라서 본 발명은 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
상기 분화된 세포는 특별히 제한되지 않으나, 지방세포, 연골세포, 골세포, 신경세포, 인대세포, 건세포 등을 포함하며, 치료 목적에 맞게 선택될 수 있다.
본 발명에서 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 분화세포 군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 조정, 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 본 발명의 영양막 기저층(bCT)으로부터 유래된 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 세포치료제는 연골 손상, 연골 결함, 골 결손, 건-인대 결손, 지방조직 결손 등에 대한 치료용으로 이용될 수 있다.
본 발명에서 “연골 결함”이란 신체 내 포함되는 연골에 손상, 결함(defect) 또는 부족이 있는 경우를 포괄하는 의미로서, 예를 들어 연골외상, 연골파열, 연골연화, 연골괴사, 골연골염, 연골결손 또는 골관절염 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 관절 내에 투여함으로써 관절 연골의 병변을 치료하거나, 건 또는 인대 부위에 투여함으로써 치료 혹은 예방 하는 등의 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 관절이나 건, 또는 인대 부위에 투여함으로써 상기 조직의 손상부위에 대한 회복이나 조정을 도모하거나, 본 발명의 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포로부터 유래된 연골조직 구성물 등 줄기세포 유래 물질을 이용하여 관절(예를 들어, 무릎관절 등)의 조직을 재구성하거나 재생 등의 방법으로 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 세포치료제의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer, bCT)으로부터 유래된 줄기세포는 증식능과 분화능이 우수하여 조직 재생 효과가 우수하다.
따라서 본 발명은 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
상기 조직은 특별히 제한되지 않으나, 연골, 지방, 골, 신경, 인대, 건 등의 조직을 포함한다.
상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)등을 포함하며, 예를 들어, 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 또는 척추 연골일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 지방은 체내 위치에 상관없이 모두 포함하며, 예를 들어, 피하 지방(subcutaneous fat), 위장간에 위치하는 지방(omentum, mesentery), 골수지방(bone marrow fat), 후복강 지방(retroperitoneal fat)등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 수득
태반은 삼성서울병원 임상시험윤리위원회지침서에 따라 삼성서울병원에서 제왕 절개한 정상 분만에서 기증에 동의한 산모로부터 수집하였다. 수집된 태반은 멸균된 용기에 넣어 옮겼으며, 태반 조직으로부터 양막을 벗겨 낸 후, 융모막(CM)과 탈락막(DC)사이에 위치한 양막층(tCT) 중 융모막에 연한(근접한) 부위의 약 25% 두께에 해당(약 5-6 ㎜ 두께)되는 영양막 기저층 조직을 멸균된 포 W과 메스를 이용하여 조심스럽게 분리하였다. 분리된 영양막 기저층 조직을 150 ㎜ 디쉬에 옮긴 후, PBS를 이용하여 8-10번 세척하여 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 세척된 영양막 기저층 조직을 50 ml 튜브에 옮긴 후, 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 교반기를 이용하여 2-3시간 반응시켜 영양막 기저층으로부터 유래된 세포를 수득하였다. 수득한 영양막 기저층으로부터 유래된 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 수득하였다.
비교예 1: 타 조직 유래 줄기세포의 수득
1-1. 태반 전체로부터 유래된 줄기세포의 수득
전체 태반 조직을 세절하고, PBS로 세척하여 태반 조직으로부터 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 세척된 태반 조직에 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 교반기를 이용하여 반응시켜 태반 세포를 수득하였다. 상기 수득한 태반 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포를 수득하였다.
1-2. 태반 세부조직으로부터 유래된 줄기세포의 수득
태반으로부터 세부조직인 융모막(chorionic membrane; CM), 융모-영양막(chorionic membrane and chorionic trophoblast layer; CMT), 영양막층 전체(total chorionic trophoblast layer; tCT), 및 영양막 상층부(upper portion of chorionic trophoblast layer; uCT) 조직을 각각 분리하였다. 보다 구체적으로, 전체 태반 조직 중 멸균된 포 W과 메스를 이용하여 양막을 벗겨낸 후, 탈락막을 조심스럽게 제거하여 융모-영양막을 분리하였으며, 이 중 일부를 다시 융모막 및 영양막층 전체로 분리하였다. 상기 영양막층 전체 조직에서 영양막 상층부를 분리하기 위해, 상기 실시예 1의 영양막 기저층을 제외한, 융모막(CM)과 탈락막(DC)사이에 위치한 양막층(tCT) 중 탈락막에 연한(근접한) 부위의 약 75% 두께에 해당되는 조직을 멸균된 포 W과 메스를 이용하여 조심스럽게 분리하였다. 상기 과정을 통해 각각 분리된 태반 세부조직을 150 ㎜ 디쉬에 옮긴 후, PBS를 이용하여 8-10번 세척하여 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 세척된 태반 세부조직을 50 ml 튜브에 옮긴 후, 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 교반기를 이용하여 2-3시간 반응시켜 융모막, 융모-영양막, 영양막층 전체 및 영양막 상층부로부터 유래된 세포를 각각 수득하였다. 수득한 각 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 융모막, 융모-영양막, 영양막층 전체 및 영양막 상층부로부터 유래된 줄기세포를 각각 수득하였다.
1-3. 골수 유래 줄기세포의 분리
골수(Bone Marrow)를 50 ml 튜브에 옮긴 후 동량의 PBS를 넣어 세척하고, 25℃, 2580 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상기 세척 과정을 두 번 반복한 후, 상층액을 제거하고 남은 침전된 골수를 동량의 PBS에 현탁한 후(총 5 ml), 상기 용액을 미리 준비된 25 ml의 Ficoll 용액 위에 천천히 옮긴 뒤, 25℃, 2580 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 밀도차에 의해 분리된 세 개의 층 중 가운데에 위치한 세포층만을 분리하여 세척한 후, 다시 25℃, 2580 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 과정을 통해 수득한 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 골수 유래 줄기세포를 수득하였다.
1-4. 제대혈 유래 줄기세포의 분리
제대혈(Umbilical Cord Blood)을 50 ml 튜브에 옮긴 후 동량의 PBS를 넣어 세척하고, 25℃, 2580 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상기 세척 과정을 두 번 반복한 후, 상층액을 제거하고 남은 침전된 제대혈을 동량의 PBS에 현탁한 후(총 5 ml), 상기 용액을 미리 준비된 25 ml의 Ficoll 용액 위에 천천히 옮긴 뒤, 25℃, 2580 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 밀도 차에 의해 분리된 세 개의 층 중 가운데에 위치한 세포층만을 분리하여 세척한 후, 다시 25℃, 2580 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 과정을 통해 수득한 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 제대혈 유래 줄기세포를 수득하였다.
1-5. 지방 또는 활막 유래 줄기세포의 분리
지방(Adipose) 또는 활막(Synovium) 조직을 150 ㎜ 디쉬에 옮긴 후, PBS를 이용하여 2-3번 세척하여 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 지방 또는 활막 조직을 잘게 잘라 준 후, 각 조직을 50 ml 튜브에 옮기고 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가한 뒤, 37℃ 조건에서 교반기를 이용하여 반응시켜 지방 또는 활막 세포를 수득하였다. 상기 수득한 지방 또는 활막 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 각각 배양하여 지방 또는 활막 유래 줄기세포를 수득하였다.
실시예 2: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 계대 배양
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 PBS로 세척한 후, 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하였다. 상기 줄기세포가 80% 이상 성장한 시점에서 트리플(TryPLE)을 처리하여 줄기세포를 배양 용기에서 분리하고, 분리된 줄기세포를 1/4의 비율로 희석한 다음, 다른 배양 용기에서 배양하는 방법으로 계대 배양을 수행하였다. 상기와 같은 계대 배양을 반복적으로 수행하면서, 더 이상 계대 배양 되지 않는 계대수(passage number)를 측정하였으며, 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 동안 계대 배양한 이후의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 계대 배양을 수행한 후, 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 동안 계대 배양한 이후의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 계대수가 31에 이르기까지 우수한 증식능을 가지고 있어, 장기간 배양이 가능함을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포는 계대 배양 초기부터 섬유아세포 모양의 형태적 특성을 나타내고, 하나의 형태가 아니라 다수의 서로 다른 형태의 세포가 혼합되어 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 도 2와 비교하면, 계대 배양 전후로 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 단일의 세포만을 특이적으로 유지하였으나, 태반 전체로부터 유래된 줄기세포는 서로 다른 형태의 세포가 혼합되어 있었다.
실시예 3: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 집락형성능 분석
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 집단 배가 시간 및 집락형성능을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 상기 실시예 2의 방법으로 첫 번째 계대 배양을 수행하고, 상기 계대 배양이 종료되는 시점에서 100㎜ 디쉬에 5 X 103개씩 접종(seeding)한 후, 10일 동안 성장인자를 포함하지 않고 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. P2에서 P6까지 줄기세포의 수가 두 배가 되는데 걸리는 시간(집단 배가 시간)을 측정하였으며, 상기 배양된 줄기세포를 대상으로 김자 염색법(Giemsa stain)을 실시하여 줄기세포에서 몇 개의 집락이 형성되는지를 계수하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 집단 배가 시간 및 집락형성능을 측정하였다. 집락형성능의 경우 태반 전체 유래 줄기세포의 결과값을 100%로 하여 환산하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 집단 배가 시간(population doubling time)이 현저하게 짧아 세포 증식이 빠름을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 집락 형성능이 현저하게 우수함을 확인하였다.
실시예 4: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 표면 마커 분석
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 면역학적 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 PBS로 세척하고, 트리플 처리한 뒤 줄기세포를 수거하여 1000 rpm에서 4분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 비특이적 결합을 억제하기 위해 2% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 줄기세포를 세척한 후, 1000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 줄기세포를 PBS에 부유시켜 1 ×105 cell씩 플로우사이토미터 전용 둥근 플라스크에 분주하였다. 여기에 항체(PE-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)를 각각 넣고, 얼음에서 30분 동안 인큐베이션 한 후, 1000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 다시 상층액을 제거한 뒤 PBS로 세척하고 1000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 마지막으로 상층액을 제거한 후 줄기세포를 싱글화하고, 플로우사이토미터(FACS)를 이용해 면역학적 특성을 분석하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포의 면역학적 특성을 분석하였다. 그 결과를 표 1 및 도 6에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2015000205-appb-T000001
표 1 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 표지인자 발현 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 표지인자 발현 특성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5: 태반의 세부조직인 영양막기저층으로부터 유래된 줄기세포의 연골세포로의 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 연골세포 분화 유도 배지(0.1 μM 덱사메타손, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 40 ㎍/㎖ L-프롤린, 10 ng/㎖ TGF-β3, 500 ng/㎖ BMP-6, 50 mg/ml ITS premix가 포함된 DMEM 배지)에서 3주 동안 배양하여 연골세포로의 분화를 유도하였다. 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 정도를 측정하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 Safranin-O 염색 및 Type II 콜라겐을 이용한 면역화학염색법을 수행하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 측정하였다. 그 결과를 도 7 내지 도 9에 나타내었다.
도 7 내지 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 균일하게 연골세포로 분화될 수 있는 우수한 연골세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 6: 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 골세포로의 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 골세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 골세포 분화 유도 배지(10% FBS, 1% anti-biotics, 100 μM 덱사메타손, 50 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 μM β-글리크로포스페이트, 250 μM 아스코르브산이 포함된 DMEM 배지)에서 4주 동안 배양하여 골세포로의 분화를 유도하였다. 이때, 분화 유도 시작 후 2주가 경과한 시점에서는 종래 공지된 방법에 따라 ALP(Alkaline phosphate) 염색법으로 염색하였고, 4주가 경과한 시점에서는 종래 공지된 방법에 따라 Alizarin red S 염색법으로 염색함으로써, 골세포로의 분화 정도를 분석하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포의 골세포로의 분화능을 측정하였다. 그 결과를 도 7, 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 7, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 균일하게 골세포로 분화될 수 있는 우수한 골세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 7: 태반의 세부조직인 영양막기저층으로부터 유래된 줄기세포의 지방세포로의 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 지방세포 분화 유도 배지 1(10% FBS, 1% Anti-biotics, 1 μM 덱사메타손, 20 μM 인도메타신, 10 μM 인슐린, 50 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)가 포함된 DMEM 배지) 및 지방세포 분화 유도 배지 2(10% FBS, 1% Anti-biotics, 10 μM 인슐린이 포함된 DMEM 배지)를 3~4일씩 교대로 가하여 3주 동안 배양하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 상기 줄기세포의 지방세포로의 분화 정도를 측정하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 Oil red O 염색을 수행하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 측정하였다. 그 결과를 도 7 및 도 12에 나타내었다.
도 7 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 태반 전체, 다른 태반 세부조직 및 타 조직 유래 줄기세포보다 균일하게 지방세포로 분화될 수 있는 우수한 지방세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 8: 태반의 세부조직인 영양막기저층으로부터 유래된 줄기세포의 연골 손상 동물모델에서 세포 치료제로서의 효과 검증
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포의 조직 결손 동물모델에서 세포 치료제로서의 효과를 검증하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, 가토(rabbit) 관절 연골 손상 동물모델을 제작하기 위하여, 건강한 가토를 선택하여 체중에 따른 적절한 양의 케타민과 럼푼으로 주사마취한 후, 가토가 충분히 전신마취가 되었음을 확인하고, 양쪽 하지의 슬관절 부위를 면도한 후, 자세를 유지시키면서 반창고로 고정하였다. 양측 슬관절 부위를 포비돈으로 소독하고, 슬개골을 촉지하여 위치를 확인한 후, 슬관절의 위, 아래, 슬개골의 내측을 지나는 절개선을 따라 방정중 접근(paramedian approach)으로 슬관절 내에 도달하고, 슬개골을 외측으로 젖히면서 슬관절을 굴곡시켜 관절 내부를 관찰하였다. 특이한 병적 소견이 없음을 확인한 후, 슬개골구 중앙 과간와(顆間窩, interchondylar notch)의 상단 앞 끝에서 1 ㎜ 위쪽에 뾰족한 송곳으로 흠집을 낸 후, 이를 중심으로 하여 드릴로 지름 3 ㎜, 깊이 5 ㎜의 구멍을 만들어 연골 전층(full thickness)에 손상을 주었다. 상기와 같이 연골 손상을 유발한지 8주와 16주 후에 손상 부위를 관찰하여, 연골 손상 부위가 천연 치유되지 않음을 확인하였다. 주사기를 이용하여 히알루론산과 본 발명에 따른 영양막 기저층 유래 줄기세포를 섞은 뒤, 500 ㎕를 상기 동물 모델의 오른쪽에 만들어진 연골 손상 부위에 주입하였다(상기 500 ㎕는 조성물의 양이 모자라거나 시술 시 실수할 경우를 생각하여 시술 편의상 여유있게 준비한 것임). 이후 슬개골을 원래 위치로 되돌린 후, 슬개골 주위의 연부 조직을 흡수성 실로 봉합하고, 피부를 비흡수성실로 봉합하였다. 반대측 다리에는 양성대조군으로 히알루론산과 제대혈 유래 줄기세포를 섞어 동량을 주입하였다. 가토가 마취에서 깨어나는 것을 확인한 후 자유롭게 움직일 수 있도록 허용하였으며, 수술 후 5일간 감염을 막기 위해 진통제와 항생제를 투여하였다. 8주와 16주가 경과한 후, 각 가토로부터 손상 및 치료를 수행하였던 관절 연골 부위의 절편을 얻어 H&E 및 Safranin O 염색을 수행하였으며, ICRS(International Cartilage Repair Society) macroscopic score를 이용한 정량화를 통해 새로 형성된 연골을 분석하였다. 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포를 주입한 군은 제대혈 유래 줄기세포을 주입한 군에 비해 새로 생성된 연골 세포층의 전체적인 두께가 2배 이상인 것을 확인하였다. 따라서 영양막 기저층(bCT) 유래 줄기세포는 손상된 관절 연골 부위에서 연골세포를 우수한 효율로 생성할 수 있어, 효과적으로 관절 연골 손상을 치료할 수 있음을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 종래의 태반 전체로부터 유래한 줄기세포가 다양한 특성을 가지는 세부조직으로부터 유래된 줄기세포가 혼합되어 있어 서로 다른 세포로 분화하는 능력이 균일하게 나타나지 않는데 반해, 본 발명에 따른 태반의 세부조직인 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 우수한 분화능과 기타 줄기세포의 여러 특성에 대한 균질성의 측면에서 볼 때, 종래의 태반 전체 유래 줄기세포에 비하여 우수한 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명에 따른 영양막 기저층 유래 줄기세포는 다른 태반 세부조직인 융모막, 융모-영양막, 영양막 및 영양막 상층부 유래 줄기세포보다 성장, 증식, 형태 및 분화의 특성에서 일관된 양상을 보여 주었고, 가장 우수한 줄기세포의 특성을 보여주었다. 따라서 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포를 이용할 경우 목적하는 세포로의 분화 효율을 향상시킬 수 있으며, 다양한 질환에서 세포치료제로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포는 융모막과 탈락막 사이에 위치한 영양막층 전체 중 융모막에 연한 부위로서 20 내지 30% 두께의 조직으로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  5. 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화된 세포는 연골세포, 지방세포, 골세포, 신경세포. 인대세포 및 건세포(tenocyte)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 세포치료제는 연골 손상, 연골 결함, 골 결손, 건-인대 결손, 또는 지방조직 결손 치료용인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 연골 결함은 연골외상, 연골파열, 연골연화, 연골괴사, 골연골염, 연골결손 및 골관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  9. 태반의 세부조직인 영양막 기저층(basal portion of chorionic trophoblast layer; bCT)으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조직은 연골, 지방, 골, 신경, 인대 및 건으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 연골은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 및 척추 연골로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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