JP6163104B2 - ヒト・トロホブラスト幹細胞からの神経幹細胞の生成 - Google Patents

ヒト・トロホブラスト幹細胞からの神経幹細胞の生成 Download PDF

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Description

クロスリファレンス
[0001]本出願は、２０１０年１１月１５日出願の米国仮出願第６１/４１３，８９２号、および２０１１年１月２０日出願の米国仮出願第６１／４３４，７９０号の恩典を請求し、これらの出願は本明細書に援用される。
[0002]ヒト・トロホブラスト幹（ｈＴＳ）細胞は、未分化状態で、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無限増殖が可能である。ｈＴＳ細胞は、潜在的な多系列分化能を維持する。ｈＴＳ細胞調製物を誘導して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでトロホブラスト系譜の細胞に分化させることも可能である。さらに、ｈＴＳ細胞を誘導して、ニューロン、例えばドーパミン作動性ニューロンに分化させることも可能である。ｈＴＳ細胞を用いて、黒質線条体経路におけるドーパミン作動性ニューロンの機能不全または喪失、例えばヒトにおける神経変性障害を治療することも可能である。
[0003]神経変性障害は、ヒト集団において、深刻な社会経済的影響を有する。現在の薬剤は、神経変性障害、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病などの神経変性障害の特定の症状を軽減することによって、限定された利益を提供するのみである。パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質線条体経路におけるドーパミン作動性ニューロンの機能不全または喪失によって引き起こされ、そしてヒトにおける一般的な神経変性障害である。本明細書に提供するのは、哺乳動物におけるパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多系統萎縮症、レビー小体認知症、末梢性感覚ニューロパシーまたは脊髄傷害を含む神経変性障害における、細胞に基づく代替療法用の単離神経幹細胞である。
[0004]本明細書に提供するのは、１つの側面において、トロホブラスト組織由来の単離神経幹細胞である。いくつかの態様において、トロホブラスト組織はヒト・トロホブラスト組織である。
[0005]１つの態様において、本明細書記載の単離神経幹細胞は、尾側（ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ）ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、Ｎａｎｏｇホメオボックス、ネスチン、オクタマー結合性転写因子４（Ｏｃｔ−４）、神経フィラメント、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、ネオマイシン欠失遺伝子（Ｎｅｏ−Ｄ）、微小管会合タンパク質−２（ＭＡＰ−２）、ＣＤ１３３、レチノイン酸受容体ベータ（ＲＡＲβ）、レチノイドＸ受容体アルファ（ＲＸＲα）、レチノイドＸ受容体ベータ（ＲＸＲβ）、細胞性レチノイン酸結合タンパク質２（ＣＲＡＢＰ−２）、細胞性レチノール結合タンパク質１（ＣＲＢＰ−１）、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ−２）またはレチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ３（ＲＡＬＤＨ−３）の１またはそれより多くの転写物を発現する。
[0006]１つの態様において、単離神経幹細胞は、ヒト神経幹細胞である。１つの態様において、細胞は正常核型を有する。別の態様において、単離神経幹細胞は、１またはそれより多い免疫特権特性を有する。別の態様において、１またはそれより多い免疫特権特性は、ＣＤ３３発現および／またはＣＤ１３３発現の非存在を含む。
[0007]さらに本明細書に提供するのは、単離神経幹細胞をニューロンに分化させる方法であって：前記単離神経幹細胞を哺乳動物の脳内に投与する、ここで前記の単離神経幹細胞はニューロンに分化する、工程を含む、前記方法である。別の態様において、ニューロンは、ドーパミン作動性ニューロン、グルタミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、またはＧＡＢＡ作動性（ガンマアミノ酪酸）ニューロンである。
[0008]１つの態様において、投与される（例えば移植される）単離神経幹細胞は、前記投与前に誘導薬剤で前誘導されている。別の態様において、単離神経幹細胞は、前記投与前に誘導薬剤で前誘導されていない。
[0009]１つの態様において、前記哺乳動物の脳は、前記投与前に、損傷を受けているか、またはニューロン喪失を被っている。別の態様において、前記損傷はドーパミン作動性ニューロン、グルタミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性（ガンマアミノ酪酸）ニューロンに対するものである。別の態様において、前記ニューロン喪失はドーパミン作動性ニューロンに対するものである。
[0010]１つの態様において、前記細胞は発現ベクターでトランスフェクションされている。
[0011]別の態様において、単離神経幹細胞は、前記被験体の脳内に投与された後、該被験体の脳の黒質緻密部（ＳＮＣ）領域に遊走する。別の態様において、前記投与は、前記哺乳動物において、感覚運動機能を改善させる。別の態様において、前記投与は、前記哺乳動物の硬直、無動症または平衡障害の減少を引き起こす。
[0012]本明細書に提供するのは、単離神経幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させる方法であって：前記単離神経幹細胞を哺乳動物の脳内に投与する、ここで単離神経幹細胞はＣｄｘ２、Ｎａｎｏｇ、ネスチン、Ｏｃｔ−４、神経フィラメント、ＮｇＮ３、Ｎｅｏ−Ｄ、ＭＡＰ−２、ＣＤ１３３、ＲＡＲβ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＲＡＢＰ−２、ＣＲＢＰ−１、ＲＡＬＤＨ−２またはＲＡＬＤＨ−３の１またはそれより多くの転写物を発現し、前記哺乳動物の前記脳は、損傷を受けているか、またはニューロン喪失を被っており、前記単離神経幹細胞の１またはそれより多くはドーパミン作動性ニューロンに分化する、工程を含む、前記方法である。
[0013]本明細書に提供するのは、単離神経幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させる方法であって：前記単離神経幹細胞を哺乳動物の脳内に投与する、ここで前記単離神経幹細胞は、トロホブラスト組織由来であり、前記哺乳動物の前記脳は、損傷を受けているか、またはニューロン喪失を被っており、前記単離神経幹細胞の１またはそれより多くはドーパミン作動性ニューロンに分化する、工程を含む、前記方法である。
[0014]上述の方法の１つの態様において、前記投与は、前記哺乳動物において、感覚運動機能を改善させる。上述の方法の別の態様において、前記投与は、前記哺乳動物の硬直、無動症または平衡障害の減少を引き起こす。
[0015]本明細書に提供するのは、単離ヒト・トロホブラスト幹細胞を神経幹細胞に分化させる方法であって：Ｃｄｘ２、Ｎａｎｏｇ、ネスチン、Ｏｃｔ−４、神経フィラメント、Ｎｇｎ−３、Ｎｅｏ−Ｄ、ＭＡＰ−２、ＣＤ１３３、ＲＡＲβ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＲＡＢＰ−２、ＣＲＢＰ−１、ＲＡＬＤＨ−２、またはＲＡＬＤＨ−３遺伝子の活性を調節する工程を含む、前記方法である。
[0016]本明細書に提供するのは、単離ヒト・トロホブラスト幹細胞を神経幹細胞に分化させる方法であって：Ｃｄｘ２、Ｎａｎｏｇ、ネスチン、Ｏｃｔ４、神経フィラメント、Ｎｇｎ−３、Ｎｅｏ−Ｄ、ＭＡＰ−２、ＣＤ１３３、ＲＡＲβ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＲＡＢＰ−２、ＣＲＢＰ−１、ＲＡＬＤＨ−２、またはＲＡＬＤＨ−３転写物のレベルを調節する工程を含む、前記方法である。
[0017]本明細書に提供するのは、単離ヒト・トロホブラスト幹細胞を神経幹細胞に分化させる方法であって：Ｃｄｘ２、Ｎａｎｏｇ、ネスチン、Ｏｃｔ４、神経フィラメント、Ｎｇｎ−３、Ｎｅｏ−Ｄ、ＭＡＰ−２、ＣＤ１３３、ＲＡＲβ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＲＡＢＰ−２、ＣＲＢＰ−１、ＲＡＬＤＨ−２、またはＲＡＬＤＨ−３タンパク質のレベルまたは活性を調節する工程を含む、前記方法である。
[0018]本明細書に提供するのは、疾患の治療または防止において使用するための化合物をスクリーニングする方法であって：単離ヒト・トロホブラスト幹細胞と前記化合物を接触させ；そして前記ヒト・トロホブラスト幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性における変化を検出する工程を含む、前記方法である。上述の方法の１つの態様において、前記ヒト・トロホブラスト幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性は、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離ヒト・トロホブラスト幹細胞に比較した際、減少している。上述の方法の別の態様において、前記ヒト・トロホブラスト幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性は、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離ヒト・トロホブラスト幹細胞に比較した際、増加している。上述の方法の別の態様において、疾患は神経変性障害である。上述の方法の別の態様において、疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症、または筋萎縮性側索硬化症である。
[0019]本明細書に提供するのは、疾患の治療または防止において使用するための化合物をスクリーニングする方法であって：単離ヒト・トロホブラスト幹細胞と前記化合物を接触させ；そして前記ヒト・トロホブラスト幹細胞における、少なくとも１つの転写物またはタンパク質のレベルにおける変化を検出する工程を含む、前記方法である。上述の方法の１つの態様において、前記ヒト・トロホブラスト幹細胞における、少なくとも１つの転写物またはタンパク質のレベルは、前記化合物と接触させなかった単離ヒト・トロホブラスト幹細胞に比較した際、減少している。上述の方法の別の態様において、前記ヒト・トロホブラスト幹細胞における、少なくとも１つの転写物またはタンパク質のレベルは、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離ヒト・トロホブラスト幹細胞に比較した際、増加している。上述の方法の別の態様において、疾患は神経変性障害である。上述の方法の別の態様において、疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症、または筋萎縮性側索硬化症である。
[0020]本明細書に提供するのは、細胞において変化を誘導する能力に関して、化合物をスクリーニングする方法であって：単離ヒト・トロホブラスト幹細胞と前記化合物を接触させ；そして前記ヒト・トロホブラスト幹細胞の分化の誘導を検出する工程を含む、前記方法である。
[0021]本明細書に提供するのは、細胞において変化を誘導する能力に関して、化合物をスクリーニングする方法であって：単離神経幹細胞と前記化合物を接触させ；そして前記神経幹細胞の分化の誘導を検出する工程を含む、前記方法である。
[0022]本明細書に提供するのは、疾患の治療または防止において使用するための化合物をスクリーニングする方法であって：単離神経幹細胞と前記化合物を接触させ；そして前記神経幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性における変化を検出する工程を含む、前記方法である。上述の方法の１つの態様において、前記神経幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性は、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離神経幹細胞に比較した際、減少している。上述の方法の別の態様において、前記神経幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性は、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離神経幹細胞に比較した際、増加している。上述の方法の別の態様において、疾患は神経変性障害である。特定の態様において、疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症、または筋萎縮性側索硬化症である。
[0023]本明細書に提供するのは、疾患の治療または防止において使用するための化合物をスクリーニングする方法であって：単離神経幹細胞と前記化合物を接触させ；そして前記神経幹細胞における、少なくとも１つの転写物またはタンパク質のレベルにおける変化を検出する工程を含む、前記方法である。上述の方法の１つの態様において、前記神経幹細胞における、少なくとも１つの転写物またはタンパク質のレベルは、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離神経幹細胞に比較した際、減少している。上述の方法の別の態様において、前記神経幹細胞における、少なくとも１つの転写物またはタンパク質のレベルは、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離神経幹細胞に比較した際、増加している。上述の方法の別の態様において、疾患は神経変性障害である。上述の方法の別の態様において、疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、統合失調症、または筋萎縮性側索硬化症である。
[0024]本明細書に提供する１つの態様は、神経学的障害を治療する必要がある哺乳動物において、こうした障害を治療する方法であって、少なくとも１つの神経幹細胞を前記哺乳動物に投与する、ここで該細胞が免疫特権を有する、工程を含む、前記方法を記載する。別の態様において、前記哺乳動物は、マウス、ラット、ブタ、イヌ、サル、オランウータンまたは類人猿（ａｐｅ）である。別の態様において、前記哺乳動物はヒトである。
[0025]１つの態様において、必要がある前記哺乳動物は、神経学的障害と関連する１またはそれより多い症状を有する。別の態様において、前記の１またはそれより多い症状は、硬直、無動症、平衡障害、振戦、歩行障害、位置異常歩行（ｍａｌｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｇａｉｔ）、認知症、過剰膨張（浮腫）、筋力低下、下肢萎縮、運動障害（舞踏病）、筋硬直、身体運動の緩慢化（動作緩慢）、身体運動の喪失（無動症）、物忘れ、認知（知的）損傷、認識喪失（失認）、意志決定および計画などの機能障害、片側顔面麻痺、感覚消失、しびれ、刺痛、極端な異常痛覚、脱力感、脳神経麻痺、発話困難、目の運動、視野欠損、失明、出血、滲出物、近位筋肉消耗、ジスキネシア、四肢の筋肉の緊張異常、筋緊張の減少、協調運動障害、指−指試験または指−鼻試験における誤った表示、測定障害、ホームズ−スチュワート現象、不完全または完全全身麻痺、視神経炎、複視、眼振などの眼球運動障害、痙性麻痺、有痛性強直性痙攣発作、レルミット症候群、運動失調、言語障害、膀胱直腸障害、起立性低血圧、運動機能の減少、夜尿、言語化障害、睡眠パターン障害、睡眠障害、食欲障害、体重変化、精神運動激越または遅延、活動力減退、倦怠感または過剰なもしくは不適切な罪悪感、思考または集中困難、死または自殺念慮または試みの反復、恐怖、不安、怒りやすさ、くよくよすることまたは強迫的熟考、身体的健康に関する過剰な懸念、パニック発作、および恐怖症からなる群より選択される。別の態様において、前記神経学的障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ失調症、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症、統合失調症、麻痺、多発性硬化症、脊髄傷害、脳傷害（例えば脳卒中）、脳神経障害、末梢性感覚ニューロパシー、癲癇、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルパース病、小脳／脊髄小脳変性、バッテン病、皮質基底核変性、ベル麻痺、ギラン−バレー症候群、ピック病、および自閉症からなる群より選択される。
[0026]本明細書にやはり提供するのは、１つの態様において、神経学的障害を治療する必要がある哺乳動物において、こうした障害を治療する方法であって、少なくとも１つの神経幹細胞を前記哺乳動物に投与する、ここで該細胞が免疫特権を有し、そしてトロホブラスト組織由来である、前記方法である。別の態様において、免疫特権細胞は低レベルのＣＤ３３発現を有する。別の態様において、免疫特権細胞は低レベルのＣＤ１３３発現を有する。別の態様において、神経前駆幹細胞は免疫反応を誘発しない。別の態様において、神経前駆幹細胞は腫瘍を形成しない。別の態様において、神経幹細胞は、Ｃｄｘ２、Ｎａｎｏｇ、ネスチン、Ｏｃｔ−４、神経フィラメント、ＮｇＮ３、Ｎｅｏ−Ｄ、ＭＡＰ−２、ＣＤ１３３、ＲＡＲβ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＲＡＢＰ−２、ＣＲＢＰ−１、ＲＡＬＤＨ−２またはＲＡＬＤＨ−３の１またはそれより多くの転写物を発現する。
[0027]別の態様において、方法は、前記の１またはそれより多い神経幹細胞を哺乳動物の脳内に投与する、ここで該細胞がニューロンに分化する、工程をさらに含む。別の態様において、前記投与は注射または移植を含む。別の態様において、前記ニューロンは、ドーパミン作動性ニューロン、グルタミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、またはＧＡＢＡ作動性（ガンマアミノ酪酸）ニューロンである。別の態様において、前記前駆細胞は前記投与前に誘導薬剤で前誘導されている。
[0028]やはり本明細書に提供するのは、１つの態様において、幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法であって：（ａ）幹細胞を誘導薬剤と接触させ；（ｂ）幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節し、ここで１またはそれより多いタンパク質が、ウィングレス型ＭＭＴＶ組込み部位２Ｂ（Ｗｎｔ２Ｂ）、フリズルドファミリー受容体６（Ｆｚｄ６）、ディシェベルド３（Ｄｖｌ３）、進行性Ｔ細胞リンパ腫における頻繁再編成化因子１（ＦＲＡＴ１）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）、β−カテニン、グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットアルファ１１Ｇｑクラス（Ｇαｑ／１１）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質ベータ（Ｇβ）、レチノイドＸ受容体アルファ（ＲＸＲα）、レチノイン酸受容体ベータ（ＲＡＲβ）、グルタミン酸受容体１（ＧＬｕＲ１）、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ｒａｃ−アルファ・セリン／スレオニン−プロテインキナーゼ（ＡＫｔ１）、ｒａｃ−ベータ・セリン／スレオニン−プロテインキナーゼ（ＡＫｔ２）、ｒａｃ−ガンマ・セリン／スレオニン−プロテインキナーゼ（ＡＫｔ３）、ラパマイシンの哺乳動物ターゲット（ｍＴＯＲ）、真核生物翻訳開始因子４Ｂ結合タンパク質（ＥＩＦ４ＥＢＰ）、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ホスホリパーゼＣベータ（ＰＬＣ−β）、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ阻害剤２（ＣａＭＫＩＩ）、真核生物翻訳開始因子４Ｂ（ＥＩＦ４Ｂ）、パーキン、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、チューブリン、カルシニューリン、コラプシン反応仲介タンパク質２（ＣＲＭＰ−２）、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ１）、インポーチン、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１）、下垂体ホメオボックス２（Ｐｉｔｘ２）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、またはＥ１Ａ結合タンパク質ｐ３００（ＥＰ３００）を含み；そして（ｃ）幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する工程を含む、前記方法である。
[0029]１つの態様において、幹細胞は哺乳動物トロホブラスト幹細胞である。別の態様において、幹細胞は哺乳動物胚性幹細胞である。別の態様において、幹細胞は哺乳動物人工多能性幹細胞である。別の態様において、幹細胞は内胚葉、中胚葉、外胚葉または間葉系幹細胞である。別の態様において、幹細胞は、マウス、ラット、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、イヌ、ブタ、ヤギ、イルカ、またはウシ由来である。別の態様において、幹細胞はヒト由来である。別の態様において、幹細胞はヒト・トロホブラスト幹細胞である。別の態様において、ニューロン特性を持つ細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）、ドーパミン産生細胞、ドーパミン作動性ニューロン、単極ニューロン、双極ニューロン、多極ニューロン、錐体細胞、プルキンエ細胞、および前角細胞、バスケット細胞、ベッツ細胞、レンショウ細胞、顆粒細胞、または中型有棘細胞である。
[0030]１つの態様において、誘導薬剤は、レチノイン酸、ニコチンアミドまたはベータ−メルカプトエタノール、ビタミンＢ１２、ヘパリン、プトレシン、ビオチン、またはＦｅ２＋、ブチル化ヒドロキシアニソール、バルプロ酸、フォルスコリン、５−アザシチジン、インドメタシン、イソブチルメチルキサンチン、またはインスリンを含む。別の態様において、調節は１またはそれより多いタンパク質の活性を増加させる工程を含む。別の態様において、調節は１またはそれより多いタンパク質の発現を増加させる工程を含む。別の態様において、発現増加は、１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つをコードするｍＲＮＡの量を増加させるか、あるいはｍＲＮＡから翻訳される１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの量を増加させる工程を含む。別の態様において、調節は、１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの活性を減少させる工程を含む。別の態様において、調節は、１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの発現を減少させる工程を含む。別の態様において、発現減少は、１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つをコードするｍＲＮＡの量を減少させるか、あるいはｍＲＮＡから翻訳される１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの量を減少させる工程を含む。
[0031]本発明にやはり記載するのは、幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法であって、前記ニューロン特性が、ドーパミン、グルタミン酸Ｎ−メチルＤ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体のサブユニット、シナプシンＩ、カルシウムチャネルマーカー、増殖関連タンパク質４３（ＧＡＰ−４３）、電位依存性Ｋ＋チャネル、電位依存性Ｃａ＋チャネル、または電位依存性Ｎａ＋チャネルの発現を含む、前記方法である。
[0032]１つの態様において、幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節する工程を含み、ここで１またはそれより多いタンパク質はＷｎｔ２Ｂである。別の態様において、Ｗｎｔ２Ｂは活性化される。別の態様において、Ｗｎｔ２Ｂは不活性化される。別の態様において、Ｗｎｔ２Ｂは活性化され、そして次いで不活性化される。別の態様において、Ｗｎｔ２Ｂは不活性化され、そして次いで活性化される。別の態様において、Ｗｎｔ２Ｂは幹細胞の分化または増殖を促進する。別の態様において、Ｗｎｔ２Ｂはドーパミン発現を促進するかまたは誘導する。
[0033]１つの態様において、幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節する工程を含み、ここで１またはそれより多いタンパク質はＧＳＫ３βである。別の態様において、ＧＳＫ３βは活性化される。別の態様において、ＧＳＫ３βは不活性化される。別の態様において、ＧＳＫ３βは活性化され、そして次いで不活性化される。別の態様において、ＧＳＫ３βは不活性化され、そして次いで活性化される。別の態様において、ＧＳＫ３βは幹細胞の分化または増殖を促進する。別の態様において、ＧＳＫ３βは微小管集合を調節する。
[0034]１つの態様において、幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節する工程を含み、ここで１またはそれより多いタンパク質はＣＲＥＢ１である。別の態様において、ＣＲＥＢ１は活性化される。別の態様において、ＣＲＥＢ１は不活性化される。別の態様において、ＣＲＥＢ１は活性化され、そして次いで不活性化される。別の態様において、ＣＲＥＢ１は不活性化され、そして次いで活性化される。別の態様において、ＣＲＥＢ１は幹細胞の分化または増殖を促進する。別の態様において、ＣＲＥＢ１はドーパミン発現を促進するかまたは誘導する。
[0035]１つの態様において、幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節する工程を含み、ここで１またはそれより多いタンパク質はＣａＭＫＩＩである。別の態様において、ＣａＭＫＩＩは活性化される。別の態様において、ＣａＭＫＩＩは不活性化される。別の態様において、ＣａＭＫＩＩは活性化され、そして次いで不活性化される。別の態様において、ＣａＭＫＩＩは不活性化され、そして次いで活性化される。別の態様において、ＣａＭＫＩＩは幹細胞の分化または増殖を促進する。別の態様において、ＣａＭＫＩＩは微小管集合を調節する。
[0036]１つの態様において、幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節する工程を含み、ここで１またはそれより多いタンパク質はＭＡＰＴである。別の態様において、ＭＡＰＴは活性化される。別の態様において、ＭＡＰＴは不活性化される。別の態様において、ＭＡＰＴは活性化され、そして次いで不活性化される。別の態様において、ＭＡＰＴは不活性化され、そして次いで活性化される。別の態様において、ＭＡＰＴは幹細胞の分化または増殖を促進する。別の態様において、ＭＡＰＴは微小管集合を調節する。
[0037]本明細書に提供するのは、１つの態様において、幹細胞が、免疫原性が減少した細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法であって：（ａ）幹細胞を誘導薬剤と接触させ；（ｂ）幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節し、ここで１またはそれより多いタンパク質が、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｆｚｄ６、Ｄｖｌ３、ＦＲＡＴ１、ＧＳＫ３β、ＨＤＡＣ６、β−カテニン、Ｇαｑ／１１、Ｇβ、ＲＸＲα、ＲＡＲβ、ＧＬｕＲ１、ＰＩ３Ｋ、ＡＫｔ１、ＡＫｔ２、ＡＫｔ３、ｍＴＯＲ、ＥＩＦ４ＥＢＰ、ＣＲＥＢ１、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＰＬＣ−β、ＰＩＰ２、ＣａＭＫＩＩ、ＥＩＦ４Ｂ、パーキン、ＳＮＣＡ、チューブリン、カルシニューリン、ＣＲＭＰ−２、ＮＦＡＴ１、インポーチン、ＬＥＦ１、Ｐｉｔｘ２、ＭＥＦ２Ａ、またはＥＰ３００を含み；そして（ｃ）幹細胞が、免疫原性が減少した細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する工程を含む、前記方法である。
[0038]１つの態様において、幹細胞は哺乳動物トロホブラスト幹細胞である。別の態様において、幹細胞は哺乳動物胚性幹細胞である。別の態様において、幹細胞は哺乳動物人工多能性幹細胞である。別の態様において、幹細胞は内胚葉、中胚葉、外胚葉または間葉系幹細胞である。別の態様において、幹細胞は、マウス、ラット、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、イヌ、ブタ、ヤギ、イルカ、またはウシ由来である。別の態様において、幹細胞はヒト由来である。別の態様において、幹細胞はヒト・トロホブラスト幹細胞である。
[0039]本明細書に記載するのは、１つの態様において、幹細胞が、免疫原性が減少した細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法であって、免疫原性が減少した細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）、ドーパミン産生細胞、ドーパミン作動性ニューロン、単極ニューロン、双極ニューロン、多極ニューロン、錐体細胞、プルキンエ細胞、および前角細胞、バスケット細胞、ベッツ細胞、レンショウ細胞、顆粒細胞、または中型有棘細胞である、前記方法である。別の態様において、免疫原性が減少した細胞は、免疫反応を誘導しないか、または免疫反応を阻害可能である。別の態様において、免疫原性が減少した細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞、マスト細胞、またはＮＫ細胞による免疫反応を誘導しないか、またはこうした免疫反応を阻害可能である。
[0040]１つの態様において、幹細胞が、免疫原性が減少した細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞を誘導薬剤と接触させる工程を含み、該誘導薬剤は、レチノイン酸、ニコチンアミドまたはベータ−メルカプトエタノール、ビタミンＢ１２、ヘパリン、プトレシン、ビオチン、またはＦｅ２＋、ブチル化ヒドロキシアニソール、バルプロ酸、フォルスコリン、５−アザシチジン、インドメタシン、イソブチルメチルキサンチン、またはインスリンを含む。
[0041]１つの態様において、幹細胞が、免疫原性が減少した細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節する工程を含み、調節は１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの活性を増加させる工程を含む。別の態様において、前記調節は１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの発現を増加させる工程を含む。別の態様において、発現増加は、１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つをコードするｍＲＮＡの量を増加させるか、あるいはｍＲＮＡから翻訳される１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの量を増加させる工程を含む。別の態様において、前記調節は、１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの活性を減少させる工程を含む。別の態様において、前記調節は、１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの発現を減少させる工程を含む。別の態様において、発現減少は、１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つをコードするｍＲＮＡの量を減少させるか、あるいはｍＲＮＡから翻訳される１またはそれより多いタンパク質の少なくとも１つの量を減少させる工程を含む。
[0042]１つの態様において、幹細胞が、免疫原性が減少した細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞がニューロン特性を持つ細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する工程をさらに含み、ニューロン特性は、ドーパミン、グルタミン酸ＮＭＤＡ受容体のサブユニット、シナプシンＩ、カルシウムチャネルマーカー、ＧＡＰ−４３、電位依存性Ｋ＋チャネル、電位依存性Ｃａ＋チャネル、または電位依存性Ｎａ＋チャネルの発現を含む。
[0043]１つの態様において、幹細胞が、免疫原性が減少した細胞に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節する工程を含み、ここで１またはそれより多いタンパク質はＮＦＡＴである。別の態様において、ＮＦＡＴは活性化される。別の態様において、ＮＦＡＴは不活性化される。別の態様において、ＮＦＡＴは活性化され、そして次いで不活性化される。別の態様において、ＮＦＡＴは不活性化され、そして次いで活性化される。別の態様において、ＮＦＡＴは幹細胞の分化または増殖を促進する。別の態様において、ＮＦＡＴは微小管集合を調節する。
[0044]本明細書にやはり記載するのは、ヒト・トロホブラスト幹細胞が、免疫原性が減少したまたは免疫反応を阻害可能なｔＮＳＣ（トロホブラスト神経幹細胞）に分化するのを誘導するかまたは促進する方法であって：（ａ）ヒト・トロホブラスト幹細胞を誘導薬剤と接触させ；（ｂ）幹細胞において、誘導薬剤で、１またはそれより多いタンパク質を調節し、ここで１またはそれより多いタンパク質が、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｆｚｄ６、Ｄｖｌ３、ＦＲＡＴ１、ＧＳＫ３β、ＨＤＡＣ６、β−カテニン、Ｇαｑ／１１、Ｇβ、ＲＸＲα、ＲＡＲβ、ＧＬｕＲ１、ＰＩ３Ｋ、ＡＫｔ１、ＡＫｔ２、ＡＫｔ３、ｍＴＯＲ、ＥＩＦ４ＥＢＰ、ＣＲＥＢ１、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＰＬＣ−β、ＰＩＰ２、ＣａＭＫＩＩ、ＥＩＦ４Ｂ、パーキン、ＳＮＣＡ、チューブリン、カルシニューリン、ＣＲＭＰ−２、ＮＦＡＴ１、インポーチン、ＬＥＦ１、Ｐｉｔｘ２、ＭＥＦ２Ａ、またはＥＰ３００を含み；そして（ｃ）ヒト・トロホブラスト幹細胞がｔＮＳＣに分化するのを誘導するかまたは促進する工程を含む、前記方法である。
[0045]１つの態様において、ヒト・トロホブラスト幹細胞が、免疫原性が減少したまたは免疫反応を阻害可能なｔＮＳＣ（トロホブラスト神経幹細胞）に分化するのを誘導するかまたは促進する方法は、ヒト・トロホブラスト幹細胞を誘導薬剤と接触させる工程を含み、ここで誘導薬剤は、レチノイン酸、ニコチンアミドまたはベータ−メルカプトエタノール、ビタミンＢ１２、ヘパリン、プトレシン、ビオチン、またはＦｅ２＋、ブチル化ヒドロキシアニソール、バルプロ酸、フォルスコリン、５−アザシチジン、インドメタシン、イソブチルメチルキサンチン、またはインスリンを含む。別の態様において、ｔＮＳＣは、免疫反応を誘導しないか、または免疫反応を阻害可能である。別の態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞、マスト細胞、またはＮＫ細胞である。
[0046]やはり本明細書に記載するのは、腫瘍細胞を阻害する方法であって：腫瘍細胞と化合物を接触させ；腫瘍細胞においてアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）を調節し；そして調節によって腫瘍細胞を阻害する工程を含む、前記方法である。さらに本明細書に記載するのは、腫瘍細胞増殖を減少させる方法であって：腫瘍細胞と療法剤を接触させ；腫瘍細胞においてＡｈＲを調節し；そして調節によって腫瘍細胞における増殖を減少させる工程を含む、前記方法である。１つの態様において、ＡｈＲの調節は、前記細胞におけるＡｈＲタンパク質活性を阻害する工程を含む。別の態様において、ＡｈＲの調節は、前記細胞におけるＡｈＲ遺伝子発現を阻害する工程を含む。別の態様において、腫瘍細胞を殺す。別の態様において、腫瘍は、肺、乳房、結腸、脳、骨、肝臓、前立腺、胃、食道、皮膚または白血病腫瘍である。別の態様において、腫瘍は固形または液性腫瘍である。別の態様において、ＡｈＲはＡｈＲアゴニストで調節される。別の態様において、ＡｈＲはＡｈＲアンタゴニストで調節される。別の態様において、ＡｈＲは抗エストロゲン活性を有する化合物で調節される。別の態様において、ＡｈＲは抗アンドロゲン活性を有する化合物で調節される。別の態様において、腫瘍細胞は哺乳動物である。別の態様において、腫瘍細胞はヒトである。
援用
[0047]本明細書に言及するすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的にそして個々に援用されると示されるのと同じ程度に、本明細書に援用される。
[0048]本発明の新規特徴は、付随する請求項に特に示される。本明細書に記載する特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理を利用する例示的態様を示す以下の詳細な説明、および付随する図を参照することによって得られるであろう：
[0049]図１は、ｈＴＳ細胞における多能性および再生の特徴を示す。（１ａ）ｈＴＳ細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定される、内部細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉両方の特異的遺伝子を発現する。（１ｂ）は、免疫細胞化学染色によって視覚化されたステージ特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）−１、−３、および−４の例示的発現および細胞内局在を示す（黒い点）。ｈＴＳ細胞において（上部パネル）、ＳＳＥＡ−１は、大部分、細胞質において発現され（左上部パネル）、ＳＳＥＡ−３は、核において発現され（中央上部パネル）、そしてＳＳＥＡ−４は、細胞質および膜の両方において発現される（上部右パネル）。これらのＳＳＥＡ発現細胞は、組織学的に、異所性絨毛性栄養膜細胞層と同一であった（下部パネル）。（１ｃ）末端制限断片（ＴＲＦ）サザンブロット分析によって測定された、ｈＴＳ細胞培養の第三および第七継代での不変のテロメア長（上部および下部パネル）。（１ｄ）ベン図は、ｈＴＳ（８５９遺伝子）およびトロホブラスト関連胎盤由来間葉系幹細胞（ＰＤＭＳ細胞）（２４４９遺伝子）における遺伝子発現のマイクロアレイ分析を例示する。総数２，１４９および３，７３０遺伝子がｈＴＳ細胞およびトロホブラスト関連ＰＤＭＳ細胞で発現される（倍変化＞２倍）。（１ｅ）は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の異なる濃度（すなわち５００、２５０、１２５Ｕ／ｍｌ；Ｕ：単位／ｍｌ、アクチン：対照試料としてのβアクチン）に反応した転写因子発現の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析からの結果を例示する。ＬＩＦの退薬（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）は、ｈＴＳ細胞において、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２を抑制するが、ＮａｎｏｇおよびＣｄｘ２を過剰発現する。 （１ｆ）ＬＩＦ（１２５Ｕ／ｍｌ）のフローサイトメトリー分析は、ｈＴＳ細胞におけるＮａｎｏｇ、Ｃｄｘ２、Ｓｏｘ２、およびＯｃｔ４の発現を促進した（左パネル）。ヒストグラムは、ＮａｎｏｇおよびＣｄｘ２において、負の用量依存方式を示し（左パネル）、そしてＯｃｔ４およびＳｏｘ２において、正の用量依存方式を示した（右パネル）。（１ｇ）女性の卵管の異なるセグメントにおけるＬＩＦレベルの生理学的分布の図、特に、卵管において、膨大部から卵管峡部に向かって、ＬＩＦレベルの生理学的減少が見られる。Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２対Ｃｄｘ２の相対比は、各々、卵管の３つの異なるセグメントにおける用量依存性を示す。 （１ｈ）ｈＴＳ細胞における、特定の転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ）ＮａｎｏｇおよびＣｄｘ２に対する異なるｓｉＲＮＡの影響を、ＲＴ−ＰＣＲ（左）およびフローサイトメトリー分析（右）によって分析し、ｈＴＳ細胞の多能性の維持において、ＮａｎｏｇおよびＣｄｘ２の間の相反性の関係が例示された。データは、３回のアッセイに関する平均±ＳＤを示す。（１ｉ）遺伝子強度のヒストグラムは、ｈＴＳ細胞における均質なパターンを示し、一方、ＰＤＭＳ細胞は、二相性パターンを示す。 [0050]図２は、多様な表現型の神経幹細胞への、レチノイン酸（ＲＡ）誘導ｈＴＳ細胞の分化を例示する。（２ａ）グリア制限前駆体（ＧＲＰ）、ニューロン制限前駆体（ＮＲＰ）、多能性神経幹（ＭＮＳ）細胞、アストロサイト（ＡＳＴ）、および未定義トロホブラスト巨細胞（ＴＧＣ）を含む、多様な神経前駆体サブタイプの分布。時間（例えば１、３、５、および７日）とともに、ＲＡ誘導中、一定の比で分布するｈＴＳ細胞由来神経前駆体サブタイプの頻度を、それぞれ、第一列から第四列に示す。ｎ：計数した総細胞数を示す。（２ｂ）１日間のＲＡ（１０μＭ）誘導前および後の、ＲＡ（１０μＭ）誘導ｈＴＳ細胞から生成される、ネスチン、Ｏｃｔ４、神経フィラメント、Ｎｇｎ３、Ｎｅｏ−Ｄ、ＭＡＰ−２およびＣＤ１３３を含む神経幹細胞関連遺伝子のｈＴＳ細胞発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。（２ｃ）３日および５日のＲＡ誘導性ｈＴＳ細胞はどちらも、神経フィラメントタンパク質、ネスチン、およびＧＦＡＰを含む陽性免疫反応性神経幹細胞遺伝子を発現し、これはフローサイトメトリー分析によって観察されたものと類似の分布比を維持した。（２ｄ）免疫反応性ネスチン、チロシンヒドロキシラーゼ−２（ＴＨ−２）およびセロトニンを発現した（神経幹細胞）ｔＮＳＣの免疫細胞化学分析。 （２ｅ）フローサイトメトリー分析による、ｈＴＳ細胞、ｔＮＳＣおよび（ヒト胚性幹）ｈＥＳ細胞間での、免疫関連遺伝子の比較発現：ＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣクラスＩ）は、ｈＴＳ細胞（９９．４％）およびｔＮＳＣにおいて高発現されたが、ｈＥＳ細胞ではより低かった。ＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）は該細胞において発現されなかった。（２ｆ）フローサイトメトリー分析による、ｈＴＳ細胞、ｔＮＳＣおよびｈＥＳ細胞間での、免疫関連遺伝子の比較発現：該細胞間で、ＣＤ１４およびＣＤ４４発現における相違は観察されなかった。（２ｇ）フローサイトメトリー分析による、ｈＴＳ細胞、ｔＮＳＣおよびｈＥＳ細胞間での、免疫関連遺伝子の比較発現：膜貫通受容体ＣＤ３３は、ｈＴＳおよびｈＥＳ細胞において発現されるが、ｔＮＳＣでは発現されない。ＣＤ４５は該細胞において発現されなかった。（２ｈ）フローサイトメトリー分析による、ｈＴＳ細胞、ｔＮＳＣおよびｈＥＳ細胞間での、免疫関連遺伝子の比較発現：間葉系幹細胞マーカーＣＤ１０５の発現において、ｈＴＳ細胞、ｔＮＳＣおよびｈＥＳ間で強度の相違は見られなかったが、ｈＴＳ細胞（９３．６％）およびｈＥＳ細胞（９８．８％）に比較して、ｔＮＳＣにおいては、より少ない癌幹細胞マーカーＣＤ１３３（１１．８％）が発現された。 [0051]図３は、ＲＡ誘導性遺伝子発現を例示する。（３ａ）は、ｔＮＳＣにおけるｃ−Ｓｒｃ／Ｓｔａｔ３／Ｎａｎｏｇ経路の活性化におけるＲＡ（１０μＭ）の影響を例示する。ＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定された、ｃ−ＳｒｃのＲＡ誘導された見かけの発現は、１５分でピークとなり、そして次いで、より低いレベルで維持された（ｎ＝３）。（３ｂ）は、ウェスタンブロット分析による、それぞれ３０分、１時間、２時間、および４時間でのＲＡ刺激されたＲＸＲα、ｃ−ＳｒｃおよびＲＡＲβ発現を示す。ＲＡ誘導は、３０分でＧαｑ／１１およびＧβ発現の両方を促進し、Ｇタンパク質シグナル伝達の関与が示唆される。（３ｃ）免疫沈降（ＩＰ）アッセイは、ＲＸＲαおよびＲＡＲβ間のＲＡ誘導性直接結合を立証する；が、この相互作用は、ｃ−Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ１類似体によってブロックされ、ｃ−Ｓｒｃが、足場タンパク質複合体を形成するＲＸＲαおよびＲＡＲβ結合に関与することが示される。（３ｄ）ＩＰアッセイ分析は、ＲＸＲαが、Ｇαｑ／１１と独立の結合相互作用を有し、一方、ＲＡＲβが、Ｇβと独立の結合相互作用を有することを示す。 （３ｅ）は、ｈＴＳにおいて１時間での、ｃ−ＳｒｃのＲＡ誘導性早期産生、Ｔｙｒ７０５部位でのＳｔａｔ３の見かけのリン酸化およびＮａｎｏｇの活性化のウェスタンブロット分析を例示する。（３ｆ）ウェスタンブロッティングアッセイによれば、ｃ−Ｓｒｃタンパク質のこの迅速な産生は、次いで、Ｔｙｒ７０５部位でのＳｔａｔ３のリン酸化、ならびにＮａｎｏｇの過剰発現を誘導した。ウェスタンブロット分析によれば、ｃ−Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ１類似体（４μＭ）は、Ｔｙｒ７０５でのＳｔａｔ３のＲＡ誘導性リン酸化およびＮａｎｏｇの発現を阻害した。この阻害作用は、ＲＡの添加によってはレスキュー不能であった。（３ｇ）は、Ｓｔａｔ３およびＮａｎｏｇプロモーターのＲＡ刺激結合相互作用のクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）アッセイ分析を例示する。投入：溶解物、Ｃ：対照。 [0052]図４は、二重免疫金蛍光透過型電子顕微鏡（ＩＥＭ）アッセイ結果を例示する。形質膜での金小粒子標識ＲＸＲα（６μｍ）および金大粒子標識Ｇαｑ／１１（２０μｍ）の間のＲＡ誘導性結合相互作用を示す。動的共焦点免疫蛍光顕微鏡観察によって、免疫染色ＲＸＲαおよびＧαｑ／１１は、主に、細胞質または核のいずれかにおいて、均質な特徴であるように見えた（図４、上部パネル）。ＲＡで５分間処理することによって、細胞質ゾルＲＸＲα強度が核周辺領域で増加し、一方、核強度は減少し（第一のカラム）、刺激後の細胞質ゾル転位置が示された。核ＲＸＲα強度は、１５分で顕著になり、一方細胞質ゾル強度は減少した。これらの現象は、核における活性の増加が、細胞における定常状態を維持することを示唆する。見かけ上の細胞質ゾル転位置は、３０分でも再び観察された。一方、Ｇαｑ／１１発現の区画変化は、ＲＸＲαのものと類似であった（第二のカラム）。 [0053]図５は、パーキンソン病（ＰＤ）ラット内へのＧＦＰタグ化ｔＮＳＣ（３ｘ１０６）の移植の分析を例示する。（５ａ）アポモルフィン誘導性回転試験の分析；ｔＮＳＣ移植を受けたＰＤラットに相関するａ群（濃い影の円、ｎ＝４）は、移植後３週〜１２週に、対側回転の有意な減少を示す；５日間のＲＡ処理ｈＴＳ細胞を投与されたＰＤラットに相関するｂ群（薄い影の円、ｎ＝４）は、移植後６週で最初の有意な改善を示したが、この改善は第１２週までに次第に減少した；そして対照群としての未処置ＰＤラットに相関するｃ群（三角形、ｎ＝４）は、改善をまったく示さない。反復測定ＡＮＯＶＡによる統計分析：ｐ値＝０．００１および２群間の反復測定ＡＮＯＶＡ後のＬＳＤ事後比較：６週でｐ＝０．０３７（ａ群対ｃ群）およびｐ＝０．００８（ｂ群対ｃ群）；９週でｐ＝０．０１９（ａ群対ｃ群）；１２週でｐ＝０．００５（ａ群対ｃ群）およびｐ＝０．０１８（ａ群対ｂ群）。＊は、ｐ＜０．０５を示す。（５ｂ）は、移植後１８週のａ群の病変線条体におけるＴＨ陽性免疫組織化学染色を例示する（上部パネル）；免疫蛍光顕微鏡分析によって、免疫蛍光ＧＦＰタグ化ｔＮＳＣはなお、注入部位で斑状構成を伴い、病変線条体中に持続することが示される（下部パネル）。（５ｃ）は、移植後１８週のａ群の病変黒質緻密部（ＳＮＣ）において再生されたＴＨ陽性ニューロンを例示する（上部パネル）；末端領域の拡大を示す（下部左パネル）、スケールバー：１００μｍ；免疫蛍光顕微鏡分析によって、免疫蛍光ＧＦＰタグ化ｔＮＳＣは、分散分布で持続することが示される（下部右パネル、矢印はＧＦＰタグ化ｔＮＳＣを示す）。（５ｄ）は、移植後１８週のｂ群の免疫組織化学染色を例示する：左病変線条体（ｓｔｒ、上部パネル）または視床下核（ｓｔｎ、下部パネル）にはＴＨ陽性細胞はまったく見られなかった。（５ｅ）は、移植後１８週のｃ群の免疫組織化学染色を例示する：左病変線条体（ｓｔｒ、上部パネル）または病変ＳＮＣ（下部パネル）にはＴＨ染色細胞はまったく見られなかった；矢印は針の跡を示す。 [0054]図６は、「加齢」ＰＤラットの病変線条体内への１つの注射部位でのｔＮＳＣ（１．５ｘ１０６）の移植からの結果を例示する（ｎ＝１６；体重、６３０〜４９０グラム）。移植後３週ごとに行動評価を分析した。結果は、移植後３週〜１２週で評価される行動損傷の有意な改善があることを示した。スチューデントｔ検定：統計有意性として、＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。（６ａ）アポモルフィン誘導性回転試験の分析によって、ｔＮＳＣ移植を受けた加齢ＰＤラット（ｉｉ群、ｎ＝８、塗りつぶされた円）では、対照群としての未処置「加齢」ＰＤラット（ｉ群、ｎ＝８、塗りつぶされていない円）に比較して、３週から１２週に、回転ターンが有意に改善されたことが立証される。（６ｂ）は、無動症（秒）に関する行動評価結果を例示する。（６ｃ）は、ステップ長（ｍｍ）に関する行動評価結果を例示する。（６ｄ）は、ストライド長（ｍｍ）に関する行動評価結果を例示する。 （６ｅ）は、歩行速度（ｃｍ／秒）に関する行動評価結果を例示する。（６ｆ）は、支持基底面（ｍｍ）に関する行動評価結果を例示する。（６ｇ）は、行動評価に関して分析した歩行運動を例示する。Ａは正常ラットに相関し、Ｂは細胞移植前の半身パーキンソン症状ラットに相関し、そしてＣは細胞移植後の半身パーキンソン症状ラットに相関する。 [0055]図７は、ｈＴＳ細胞が、適切な誘導後、外胚葉、中胚葉および内胚葉を含む３つの一次胚葉層すべての構成要素を発現することを例示する；各パネルの左カラムは、誘導前の遺伝子発現に相関し；各パネルの右カラムは誘導後の遺伝子発現に相関する。 [0056]図８は、フローサイトメトリー分析結果を例示し、ｈＴＳ細胞が間葉系幹細胞マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＫ７、ビメンチンおよび神経フィラメント）を発現し、そして造血幹細胞マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ４５、α６−インテグリン、Ｅ−カドヘリン、およびＬ−セレクチン）に関しては陰性であることを示す。 [0057]図９は、適切な誘導に際して、ｈＴＳ細胞が多様な特定の細胞表現型に分化可能であったことを示す。 [0058]図１０は、オス重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス内へのｈＴＳ細胞の皮下移植が、移植６〜８週後に粘液様の異様な細胞を伴う小規模なキメラ反応しか引き起こさなかった組織学的分析を例示する（塗りつぶされた黒い矢印は異様な細胞を示し；塗りつぶされていない矢印は筋繊維を示す；「ＮＴ」は針の跡を示す）。 [0059]染色体分析は、ｈＴＳ細胞が核型パターンを変化させていないことを示す（４６、ＸＹ）。世代における細胞寿命をチェックするため、サザンブロット分析によれば、培養第三および第七継代の間で、有意なテロメア長短縮は観察されなかった。 [0060]図１２は、細胞分化に用いた特定の培地を例示する。 [0061]図１３は、ＲＴ−ＰＣＲに用いたＰＣＲプライマーを例示する。 [0062]図１４は、形質膜でのシグナル分子としてのＡｈＲの分析を例示し、Ｈｕｈ−７細胞におけるＢＢＰ（１μＭ）の導入による、形質膜でのトランスフェクションｐＧＦＰ−Ｃ１−ＡｈＲの活性を含む。（１４ａ）示す画像は、ＴＩＲＦ顕微鏡分析によって測定されたＧＦＰタグ化ＡｈＲの相対強度の発現である。円および矢印は、時間に渡って測定した領域を示す：刺激前（最初のパネル）、ピーク時（第二のパネル）および休止時（第三のパネル）。グラフ（第四のパネル）はピーク値が約２分で見られることを示し、矢印は、ＢＢＰを添加した時点を示す。（１４ｂ）ＢＢＰに反応したｍｅｍＡｈＲの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、５分で迅速な上昇があり、１５分でピークに達し、その後、２時間でより低いプラトーレベルに漸次減少することが示される。エラーバーは、標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定（ｎ＝３）。 （１４ｃ）ウェスタンブロットアッセイの分析によって、ＢＢＰが１５分でＡｈＲ上昇を促進し、その後、３０分でわずかに減少させ、そして６０分で再上昇させることが明らかになる。（１４ｄ）ウェスタンブロットアッセイの分析によって、ＢＢＰが３０分でＧαｑ／１１およびＧβ両方の産生を誘導することが明らかになる。（１４ｅ）免疫沈降（ＩＰ）アッセイによって、ＢＢＰ刺激後のＡｈＲおよびＧαｑ／１１間の相互作用が示され、文字Ｃは対照に相当する。（１４ｆ）ｓｉＲＮＡによるＡｈＲのノックアウトによって、ＢＢＰが、Ｈｕｈ−７細胞におけるウェスタンブロットによって測定されるＡｈＲおよびＧαｑ／１１発現両方を抑制することが立証され、文字Ｓは陰性対照としてのスクランブル化ｓｉＲＮＡを示す。 [0063]図１５は、動的免疫蛍光画像化の結果を例示する。（１５ａ）は、未処置対照細胞の免疫染色を例示し；ＡｈＲおよびＧαｑ／１１発現は、Ｈｕｈ−７細胞において、主に核で、そして細胞質ゾルで弱く観察された。；バースケール：５０μｍ。（１５ｂ）ＢＢＰ（１μＭ）で５分および１５分処理した細胞は、各々、核から細胞質ゾル区画へのＡｈＲおよびＧαｑ／１１両方の転位置を明らかにする。免疫染色Ｇαｑ／１１は、１５分で細胞膜に特異的に集積する。（１５ｃ）ＡｈＲ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、細胞質ゾルおよび核区画両方で、ＡｈＲ強度を非常に減少させ（上部パネル）、一方、スクランブル化ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、免疫染色強度を変化させない（下部パネル）。（１５ｄ）ＢＢＰは、ＡｈＲ ｓｉＲＮＡでプレトランスフェクションされた細胞において、１５分後、ＡｈＲおよびＧαｑ／１１の両方の強度をレスキューした。 [0064]図１６は、二重免疫金透過型電子顕微鏡分析の結果を例示する。（１６ａ）免疫金染色Ｇαｑ／１１（白い矢印）は、対照として、Ｈｕｈ−７細胞中の細胞膜で、一重または二重または三重の実体として存在可能であった。（１６ｂ）２０分時、ＢＢＰ（１μＭ）処理細胞は、免疫金タグ化ＡｈＲ粒子（サイズ６ｎｍ、黒い矢印）および免疫金タグ化Ｇαｑ／１１粒子（サイズ２０ｎｍ、白い矢印）の相互作用を示し、複合体を形成し、異なる実体として現れた：形質膜の単量体（未提示）、二量体（未提示）、三量体（左）および多量体実体（右）。（１６ｃ）ＡｈＲおよびＧαｑ／１１の三量体複合体が細胞膜に現れた。ＣＭ：細胞膜、Ｎ：核、およびバースケール：５００ｎｍ。 [0065]図１７は、「引くおよび押す」機構および生化学プロセスを例示する。（１７ａ）は、Ｈｕｈ−７細胞におけるＢＢＰ処理に反応したＧαｑ／１１シグナル伝達カスケードの測定を例示する。ウェスタンブロット分析は、ＢＢＰ（１μＭ）が、３０分時、Ｇαｑ／１１およびＧβ両方の産生を誘発することを明らかにした。活性化されたＧαｑ／１１は、ＰＩＰ２の減少を導き、ＩＰ３Ｒレベルの増加を引き起こす。（１７ｂ）は、Ｈｕｈ−７細胞における免疫蛍光Ｆｌｕｏ−４標識カルシウムの反応性の分析を例示する。示すのは、未標識細胞（左上部パネル）およびＦｌｕｏ−４標識カルシウム（緑、左下部パネル）である。やはり示すのは、ＢＢＳ培地（中央上部パネル）およびカルシウム不含培地（中央下部パネル）におけるＢＢＰ（１μＭ）刺激（矢印）後の相対的カルシウムレベルの変化である。カルシウム不含培地中で培養し、ＩＰ３Ｒ阻害剤２−ＡＰＢ（１００μＭ、１時間）で前処理した細胞（右上部パネル）は、カルシウム強度の減少を示し（右上部パネル）、これは用量反応方式で生じた（ｙ＝−０．４ｘ＋２．５、Ｒ２＝０．９４）（右下部パネル）。エラーバーは、平均の標準偏差を示す（ｎ＝５）。 （１７ｃ）ウェスタンブロット分析の結果は、２−ＡＰＢ（３０μＭ、１時間）での前処理によって、ＢＢＰ誘導性ＣＯＸ−２発現が阻害されたことを示し、文字Ｃは対照を示す。（１７ｄ）は、ウェスタンブロット分析の結果を例示し、ＢＢＰ（１μＭ）がＡｈＲ／Ｃａ２＋／ＥＲＫ／ＣＯＸ−２経路を通じて、ＣＯＸ−２の過剰発現を誘導したことを示す。ＥＲＫ１／２は、ＢＢＰ処理後、１５分でリン酸化され、そして３０分で脱リン酸化された。（１７ｅ）は、ウェスタンブロット分析の結果を例示し、ＢＢＰ誘導性ＣＯＸ−２発現が化学薬品ＰＤ９８０５９（２０μＭ、１時間、Ｃａｌｃｉｏｃｈｅｍ）での前処理によって阻害されたことを示し、文字Ｃは対照を示す。（１７ｆ）は、ＡＲＮＴレベルが一晩測定されたＢＢＰ（１μＭ）での処理によって有意に阻害されたことを例示する。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３に相当し、そして＊：スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０１である。 （１７ｇ）は、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質シグナル伝達を通じた、リガンド誘導性非ゲノムＡｈＲシグナル伝達経路の根底にある、「引くおよび押す」機構の模式図を例示する。 [0066]図１８は、Ｎａｎｏｇ発現に対するＬＩＦの影響を例示する。（１８ａ）は、ＬＩＦがＮａｎｏｇの発現を促進することを例示する。左パネルは、フローサイトメトリー分析によって、Ｎａｎｏｇ発現が、ｈＴＳ細胞において負の用量依存方式で有意に抑制されることを例示する。データは、３つのアッセイに関する平均±ＳＤを示した。＊ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定、ｎ＝３）。右パネルは、ｈＴＳ細胞をＲＡ（１０μＭ）で一晩プレインキュベーションした後、異なるレベルのＬＩＦ（すなわち、各々、１２５、２５０および５００Ｕ／ｍｌ）で１日処理した際の、相対Ｎａｎｏｇ発現を例示する。（１８ｂ）は、フローサイトメトリー分析によって、ｈＴＳ細胞におけるＲＡ誘導（１日インキュベーション、１０μＭ）が、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の発現を刺激するが、Ｃｄｘ２およびＳｏｘ２の発現を刺激しなかったことを例示する。 [0067]図１９は、高齢ＰＤラットにおける行動改善の評価を例示する。（１９ａ）は、移植１２週後の一連の脳切片（３０μｍ）上のＴＨ＋ニューロンの免疫組織化学が、豊富な新規再生ＴＨ陽性ニューロンが病変黒質線条体経路に現れることを明らかにしたことを例示する（左部分）。ＳＮＣ領域において、ＴＨ陽性ニューロンは、宿主組織とのニューロン回路網を形成する、細胞体から突き出す多数の伸長を伴う特徴を示した。再生ドーパミン作動性ニューロンの数は、１匹のラットにおいて、反対の正常な側の２８．２％を占めた（ｎ＝５）。（１９ｂ）ラットの病変ＳＮＣにおけるドーパミン作動性ニューロンの数は、正常側に比較して、２８．２％に再生した。 [0068]図２０：（２０ａ）は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＩＣＭおよび栄養外胚葉（ＴＥ）両方の特定の遺伝子の発現を例示する；（２０ｂ）は、Ｆ１Ｂ−ＧＦＰプラスミド構築物のＤＮＡ混合物でｈＴＳ細胞をトランスフェクションして、９５％を超える成功率を得たことを例示する；（２０ｃ）は、ｅＩＦ４ＢのＲＡ誘導性産生の時間経過を例示する；（２０ｄ）は、ｅＩＦ４Ｂを用いることによって、ｃ−Ｓｒｃの活性化が阻害されたことを例示する；（２０ｅ）は、活性ｃ−ＳｒｃがＳｔａｔ３（シグナル伝達性転写因子）に直接結合することを示すＩＰ分析を例示する； （２０ｆ）は、ｃ−Ｓｒｃ ｓｉＲＮＡがＳｔａｔ３の発現を阻害したことを例示する；（２０ｇ）は、Ｓｔｓｔ３ ｓｉＲＮＡによってＮａｎｏｇ発現が阻害されたことを例示する；そして（２０ｈ）は、ｈＴＳ細胞における細胞内ｃ−Ｓｒｃ ｍＲＮＡ局在を通じた、ＲＡ誘導性ｃ−Ｓｒｃ／Ｓｔａｔ３／Ｎａｎｏｇ経路のスキームを例示する。 [0069]図２１は、Ｇαｑ／１１シグナル伝達経路の活性化を例示する：（２１ａ）は、ウェスタンブロットによって、長期に渡るＲＡ処理（１０μＭ）後のＧαｑ／１１経路関連構成要素の発現を例示する；（２１ｂ）は、カルシウム不含培地中で培養され、そしてＲＡ処理の２０分前にＢＳＳ緩衝液中のＦｌｕｏ４（１μＭ）を前装填されたｈＴＳ細胞における、リアルタイム生存細胞画像化顕微鏡観察（Ｃｅｌｌ−Ｒシステム、Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京）を例示する。（ａ）細胞内カルシウムのＲＡ誘導性枯渇は、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）を添加することによってＳＯＣＥパターンでレスキューされた。（ｂ）ＲＡ誘導性細胞内カルシウムレベルは、２−ＡＰＢ（１０分）によって、有意な用量依存方式（Ｒ２＝０．８９８４）で阻害された。（ｃ）ＥＲカルシウムの枯渇後、ＫＣｌ（６０ｍＭ）は、Ｌ型カルシウムチャネルの活性化を可能にした。（ｄ）ＫＣｌ依存性Ｌ型カルシウムチャネルは、ＥＲカルシウム枯渇後、阻害剤ニフェジピン（５μＭ）によってブロックされた。ｎ：計数された総細胞；（２１ｃ）は、ＣａＭＫＩＩがＣＲＥＢ１およびｅＩＦ４Ｂと直接相互作用したことを例示する；（２１ｄ）は、ウェスタンブロットによって、ｅＩＦ４Ｂ ｓｉＲＮＡが、ＣａＭＫＩＩ、カルシニューリン、およびｅＩＦ４Ｂの発現を阻害したことを例示する； （２１ｅ）は、ウェスタンブロットによって、ＫＮ９３（１μＭ、２時間）がｅＩＦ４Ｂ発現を阻害したことを例示する；（２１ｆ）は、パーキンがＣａＭＫＩＩおよびＭＡＰＴと直接相互作用したことを例示する；（２１ｇ）は、ＳＮＣＡがＭＡＰＴと直接相互作用したことを例示する；（２１ｈ）は、ＭＡＰＴがＧＳＫ３βおよびα−チューブリンと相互作用したことを例示する；（２１ｉ）は、ウェスタンブロットによって、２−ＡＰＢが、カルシニューリン、ＮＦＡＴ１、およびＭＥＦ２Ａの発現を阻害したことを例示する；（２１ｊ）は、インポーチンおよびＮＦＡＴ１の間の直接相互作用を例示する；（２１ｋ）は、分画アッセイによって、ＲＡがＮＦＡＴ１核転位置を刺激したことを例示する。ラミンＡ／Ｃ：核マーカーおよびα−チューブリン：細胞質マーカー；（２１ｌ）は、Ａｋｔ２がＧＳＫ３βと直接相互作用したことを例示する； （２１ｍ）は、異なる抗体とともにＲＡで４時間（ブランクカラム）および２４時間（黒いカラム）処理した細胞におけるＧＳＫ３β発現のフロー分析が動的変化を明らかにしたことを例示する。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を示す；（２１ｎ）は、フローサイトメトリー分析が、Ａｋｔ２ ｓｉＲＮＡがＲＡ誘導性ＧＳＫ３β発現を阻害することを示したことを例示する。 [0070]図２２は、転写複合体の形成を例示する：（２２ａ）は、β−カテニンおよびＬＥＦ１（上部）間、ならびにＬＥＦ１およびＰｉｔｘ２間の相互作用を例示する；（２２ｂ）は、ＬＥＦ１が、ＲＡ処理（４時間）によって、遺伝子Ｐｉｔｘ２遺伝子を転写するが、Ｐｉｘｔ３を転写しなかったことを例示する；（２２ｃ）は、ウェスタンブロットによって、ＭＥＦ２ＡがＮＦＡＴ１、ＭＥＦ２Ａ、Ｐｉｔｘ２、ＳＮＣＡ、およびＥＰ３００と直接相互作用したことを例示する；（２２ｄ）は、ウェスタンブロットによって、ＲＡが、ＭＥＦ２Ａ、ＥＰ３００、およびＰｉｔｘ２の産生を長期に渡って誘導したことを例示する；（２２ｅ）は、ウェスタンブロットによって、ＮＦＡＴ１ ｓｉＲＮＡがＭＥＦ２Ａの発現を阻害したことを例示する；（２２ｆ）は、ＣＲＥＢ１が、遺伝子ＭＥＦ２Ａのプロモーターをターゲティングしたことを例示する； （２２ｇ）は、ＭＥＦ２Ａが遺伝子ＳＮＣＡ（上部）、ＴＨ（中央部）、およびＭＥＳ２Ａ自身（下部）を転写したことを例示する；（２２ｈ）は、ウェスタンブロットによって、ＭＥＦ２Ａ ｓｉＲＮＡが、ＥＰ３００、Ｐｉｔｘ２、およびＭＥＦ２Ａの発現を阻害したことを例示する；（２２ｉ）は、ＥＰ３００が遺伝子ＨＤＡＣ６（上部）およびＴＨ（下部）のプロモーターをターゲティングしたことを例示する；（２２ｊ）は、ウェスタンブロットによって、４時間および２４時間の時点での多様な分子活性の同定を例示する。略語、ＩＰ：免疫沈降アッセイ；ＣｈＩＰ：クロマチン免疫沈降アッセイ。 [0071]図２３は、ｈＴＳ細胞におけるＲＡ誘導性神経発生の模式的制御ネットワークを例示する（上部パネル）。２つのｍＲＮＡ翻訳機構：キャップ依存性（左下部）およびキャップ非依存性（右下部）。灰色の線：時空間シグナル伝達経路；黒線：転写経路；双頭の矢印：他の経路への連結がある分子。 [0072]図２４は、ＲＡシグナル伝達がＷｎｔ２Ｂ／Ｆｚｄ６／β−カテニン経路を促進することを例示する：（２４ａ）は、前処理Ｗｎｔ２Ｂ ｓｉＲＮＡの阻害作用によって明らかであるように、ＲＡ（１０μＭ）一晩で、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｄｖｌ３、およびＦＲＡＴ１の有意な活性化が誘導されるが、ＧＳＫ３βが阻害されたことを例示する。データは平均±ＳＤ；ｎ＝３を示す；（２４ｂ）はＲＡ ＲＴ−ＰＣＲによって、Ｆｚｄ６ ｍＲＮＡ発現の増加を例示する。データは平均±ＳＤ；ｎ＝３を示す、＊：スチューデントｔ検定によるｐ＜０．０５；（２４ｃ）は、ウェスタンブロットによって、ＲＡが、長期に渡るβ−カテニンおよびＨＤＡＣ６の発現変化を誘導したことを例示する； （２４ｄ）は、ＩＰアッセイが、ＲＡとの一晩インキュベーションによる、ＨＤＡＣ６およびβ−カテニンの間の物理的相互作用を明らかにしたことを例示する；（２４ｅ）は、一晩インキュベーション後の分画アッセイによって、ＲＡがβ−カテニンの核／細胞質転位置を誘導したことを例示する。ラミンおよびα−チューブリンは、それぞれ、核および細胞質マーカーとして働く；（２４ｆ）は、ＲＡ誘導性β−カテニンおよびＨＤＡＣ６の動的変化が、３０分でのβ−カテニンの核転位置を示し、これがＨＤＡＣ６ ｓｉＲＮＡによって阻害されたことを示す、共焦点免疫蛍光顕微鏡観察を例示する；（２４ｇ）は、ＲＡ処理５分後のシナプス領域において、点状にβ−カテニンが現れたことを例示する（矢印）。 [0073]図２５は、共焦点免疫蛍光顕微鏡分析を例示する。ＨＤＡＣ６に対するｓｉＲＮＡの存在下で、β−カテニンの核局在がブロックされた。 [0074]図２６は、細胞膜での分子事象を例示する：（２６ａ）は、ウェスタンブロットによって、ＲＡが、長期に渡るＧαｑ／１１、Ｇβ、ＲＸＲα、およびＲＡＲβの産生を誘導したことを例示する。β−アクチンは対照としてである；（２６ｂ）は、リアルタイム共焦点免疫蛍光顕微鏡分析を例示し、ＲＡ刺激の０、４．５、および１３分後の核周辺領域から細胞膜（矢印）に向かう、代表的なＧＦＰタグ化ＲＸＲαの移動を明らかにする。核にはＲＸＲαは見えなかった。順相対比（左上部）および蛍光画像（右上部）。バーは３０μｍを示す；（２６ｃ）は、核（Ｎ）から細胞膜（Ｍ）への時系列での相対的定量的ＧＦＰタグ化ＲＸＲαの動的移動および強度の変化を例示する。順相対比および蛍光画像を上部右に示す； （２６ｄ）は、代表的な画像が、ＲＡ５分間による、細胞膜でのＲＸＲαおよびＧαｑ／１１の同時発現を明らかにしたことを例示する；（２６ｅ）は、２０分のＲＡ処理後に観察された、細胞膜でのＲＸＲα（６μｍ；黒い矢印）およびＧαｑ／１１（２０μｍ；白い矢印）の二重免疫金標識を例示する。Ｎ：核；（２６ｆ）は、ＲＸＲα ｓｉＲＮＡがＧαｑ／１１およびＲＸＲαのＲＡ誘導性相互作用を阻害したことを例示する（２４時間）；（２６ｇ）は、ＲＡＲβ ｓｉＲＮＡがＧβおよびＲＡＲβのＲＡ誘導性相互作用、ならびにＧβおよびＰＩ３Ｋの相互作用を阻害したことを例示する（２４時間）。ＩＰ：免疫沈降アッセイ；ＩｇＧ：陰性対照；Ｃ：陽性対照；（２６ｈ）は、ＩＰアッセイ分析を例示し、選択的ｃ−Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ１類似体がＲＸＲα−ＲＡＲβヘテロ二量体の形成を防止可能であったことを示すことを例示する；（２６ｉ）は、二重免疫金透過型電子顕微鏡によって観察された小胞体（ＥＲ）におけるＲＡ誘導性金粒子タグ化ＲＸＲαの係留を例示する。 [0075]図２７は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＲＡが古典的Ｗｎｔ２Ｂ経路を刺激することを例示する；ＲＡは、ｈＴＳ細胞において、一晩処理（１０μＭ）後、統計的に有意にＷｎｔ２Ｂシグナル伝達経路の構成要素の発現を誘導し；Ｗｎｔ２Ｂ ｓｉＲＮＡは、一晩処理後、Ｗｎｔ２Ｂ経路のＲＡに誘導された構成要素を阻害した。 [0076]図２８は、ＲＸＲαおよびＲＡＲβの局所合成を例示する：（２８ａ）は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＲＡ（１０μＭ）が、１５分で、ＲＸＲα ｍＲＮＡおよびＲＡＲβ ｍＲＮＡ両方の迅速な一過性上昇を誘導したことを例示する。データは、平均±ＳＤ；ｎ＝３を示す、ｔ検定＊：ｐ＜０．０５；（２８ｂ）は、ウェスタンブロットによって、ＲＡが、長期に渡って、ＰＩ３ＫおよびＡｋｔアイソフォームの発現を誘導したことを例示する；（２８ｃ）は、フローサイトメトリーによって、ＰＩＫ３阻害剤１２４００５が、ＲＡ誘導性Ａｋｔアイソフォームを阻害した（２４時間）ことを例示する。データは、平均±ＳＤ；ｎ＝３を示す； （２８ｄ）は、ウェスタンブロットによって、Ａｋｔ３がｍＴＯＲと相互作用するが、Ａｋｔ３ ｓｉＲＮＡによって阻害されたことを例示する；（２８ｅ）は、ウェスタンブロットによって、ＲＡが、ｍＴＯＲの一時的発現を誘導することを例示する；（２８ｆ）は、Ａｋｔ３ ｓｉＲＮＡが、ｍＴＯＲのＲＡ誘導性リン酸化を阻害したことを例示する；（２８ｇ）は、ｍＴＯＲが４ＥＢＰ１と直接相互作用した（４時間）ことを例示する；（２８ｈ）は、ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡまたは４ＥＢＰ１ ｓｉＲＮＡのプレインキュベーションを伴いまたは伴わず、ＲＡ（４時間）によって処理されたｈＴＳ細胞を、ｍＴＯＲ、４ＥＢＰ１、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４Ｂの発現に関してウェスタンブロットによって分析したことを例示する；（２８ｉ）は、ウェスタンブロットによって、ｅＩＦ４Ｅ ｓｉＲＮＡが、ＲＸＲαおよびＧαｑ／１１間（上部）のならびにＲＡＲβおよびＧβ間（下部）のＲＡ誘導性相互作用（４時間）を阻害したことを例示する。 [0077]（２９ａ）は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ｈＴＳ細胞における一晩処理後、ＰＩ３Ｋ阻害剤が、Ａｋｔアイソフォーム、Ａｋｔ１、２、および３のＲＡ誘導性発現を抑制したことを例示する；（２９ｂ）ＲＴ−ＰＣＲによって、Ａｋｔ２阻害剤が、β−カテニン ｍＲＮＡの発現を阻害したことを例示する；（２９ｃ）フローサイトメトリーによって、Ａｋｔ３ ｓｉＲＮＡがｍＴＯＲの発現を抑制したことを例示する。 [0078]図３０は、ＣＲＥＢ１がＴＨの転写を促進することを例示する：（３０ａ）は、ウェスタンブロットによって、ＣＲＥＢ１が、Ａｋｔ１およびβ−カテニンと直接相互作用したことを例示する；（３０ｂ）は、Ａｋｔ１ ｓｉＲＮＡがＣＲＥＢ１の発現を阻害したことを例示する。β−アクチン：対照；（３０ｃ）は、ＣＲＥＢ１がＴＨ遺伝子のプロモーターをターゲティングしたことを例示する。（３０ｄ）は、ウェスタンブロットによって、ＣＲＥＢ１ ｓｉＲＮＡがＴＨの発現を阻害したことを例示する；（３０ｅ）は、免疫蛍光組織分析によって、ＰＤラット脳（右パネル）において、ｔＮＳＣの移植１２週後、療法ＳＮＣ側においてＤＡニューロン（白い矢印）中、ＴＨ−ＦＩＴＣ（青色）およびＴＨ−Ｃｙ−３（赤色）の同時発現が明らかになったことを例示する。正常側（左上部）および療法側（左下部）における拡大されたＤＡニューロン。陽性ＣＲＥＢ１染色が核に見られた；（３０ｆ）は、正常（左；ｎ＝８６）および療法側（右；ｎ＝１１４）において、ＤＡニューロン中で発現された、ＴＨおよびＣＲＥＢ１の相対平均強度を示すヒストグラムを例示する。エラーバー：平均±ＳＤ；ｎ；計数された総細胞；ｐ＜０．０５：統計的有意。 [0079]図３１は、免疫組織蛍光分析を例示する：対照のＳＮＣにおけるＴＨ（＋）およびＮｅｕＮ（＋）運動ニューロン（矢印）（左上部）。６−ＯＨＤＡ傷害後１週間の減少したＴＨ（＋）（矢印）。傷害６週後、ＴＨ陽性神経末端（緑色顆粒）の攪乱および多様な変性腔形成（赤い爆発した円）を伴うＴＨ（＋）ニューロン減少が見られた。移植後、変性腔（赤い爆発した円；挿入図）の壁でＴＨ（＋）ニューロン（矢印）が見られ、ＴＨ（＋）神経末端（緑色）は、腔内に突き出している（右下部）。 [0080]図３２は、より少ない免疫反応での、ＴＨ（＋）およびＧＦＡＰ（＋）細胞のｉｎ ｖｉｖｏ再生を例示する：（３２ａ）は、傷害後、ＴＨ（＋）細胞の数が１週後および６週後、それぞれ、病変ＳＮＣ（濃い灰色）で４８％および１３％に、そして病変線条体（明るい灰色）で７８％および４％に減少したことを例示する。移植後、ＴＨ（＋）細胞は、病変ＳＮＣおよび線条体において、それぞれ、６７％および７３％に再増殖した（右パネル）。ソフトウェアＴｉｓｓｕｅｑｕｅｓｔ２．０（ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ、オーストリア・ウィーン）によってデータを分析した；（３２ｂ）は、損なわれていない側（右上部、挿入図ｂ）に比較した、拡大を伴う病変ＳＮＣ（下部パネル）（左上部、挿入図ａ）におけるドーパミン作動性ニューロンの再生を例示する；（３２ｃ）は、ｔＮＳＣ移植が、１２週後、損なわれていない側に比較して、病変ＳＮＣにおいて、ＴＨ陽性ニューロン（矢印）の７８．４±８．３％（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）の回復率を生じたことを例示する； （３２ｄ）は、病変線条体（左カラム）において、傷害６週後、ＴＨ−ＦＩＴＣ（＋）およびＧＦＡＰ−Ｃｙ−３（＋）ウィルソン鉛筆（ブランクの矢印）の変性を例示する。移植１２週後（右カラム）、いくつかのＧＦＡＰ（＋）細胞（矢印）は、再確立されたウィルソン鉛筆（ブランクの矢印）の細かい線維の内部に現れた；（３２ｅ）は、免疫組織蛍光画像分析を例示し、細胞を、細胞サイズ（直径８〜１０μｍ）の位置によって決定したゲート（左のスキャッタープロット）で計数し、そしてＧＦＡＰ−Ｃｙ−３の対応する強度を計測した。ゲート（赤いスキャッタープロット）：グリア細胞を計数；黒いスキャッタープロット；異様なサイズの爆発した（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ）細胞；青いスキャッタープロット：異常なＧＦＡＰ強度の細胞。線条体において、ＧＦＡＰ（＋）細胞は、損なわれていない側（右パネル）に比較して、処理前の病変側で６５．５％であり、そして細胞療法後、９３．９％になった；（３２ｆ）は、ＳＣＩＤマウス内へのｈＴＳ細胞移植が、小規模な免疫反応しか生じず、そして腫瘍形成は観察されなかったことを例示する。粘液様の異様な細胞（黒い矢印）、筋線維（黒い矢印）および針の跡（ＮＴ）。 [0081]図３３は、慢性ＰＤラットにおける免疫組織蛍光スキャッタープロットによって測定された、ＴＨ−ＦＩＴＣおよびＮｅｕＮ−Ｃｙ−３間の測定の係数を用いて、細胞療法前および後のＳＮＣにおけるＴＨ（＋）細胞の資質を例示する。（３３左上部）は、正常ＳＮＣを例示する：Ｒ２＝０．７２；（３３右上部）は、６−ＯＨＤＡ損傷によるＳＮＣを例示する（１週）；Ｒ２＝０．７７；（３３左下部）は、６−ＯＨＤＡ損傷によるＳＮＣを例示する（６週）；Ｒ２＝０．２５；（３３右下部）は、ｔＮＳＣ移植後のＳＮＣを例示する（１２週）；Ｒ２＝０．６６。示す結果は２匹のラットの平均に相当する。
[0082]神経組織由来幹細胞、多能性胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来の表現型が明記された前駆細胞、および多様な分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）非神経幹細胞由来の神経細胞は、すべてニューロンおよびグリアを生成する能力に関して前臨床研究において調べられてきており、そして臨床試験における神経幹細胞の使用が記載されてきている。胚性幹（ＥＳ）細胞は、細胞療法剤として潜在能力が示されてきているが（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ， Ｌ． Ｍ．ら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ２００２， ９９， ２３４４−４９）、こうした療法へのアクセスは限定されており、そして道徳的懸念と関連づけられている。
[0083]幹細胞は、自己再生能および神経幹細胞を含む関連づけられた前駆体を産生する能力を所持する。Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ Ｂ． Ｅ．ら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２００１， １９， １１３４−１１４０。
[0084]本明細書に提供するのは、トロホブラスト組織由来の単離神経幹細胞である。さらに本明細書に提供するのは、頑強であり、そして細胞培養において数回の継代を生き抜き、そしてまた多能性および免疫特権の特性も所持する、単離神経幹細胞（ｔＮＳＣ）である。本明細書に記載する１つの態様において、ヒト・トロホブラスト幹（ｈＴＳ）細胞由来のｔＮＳＣからドーパミン作動性ニューロンを誘導するための方法を記載する。本明細書にさらに提供するのは、ドーパミン作動性ニューロンになる、移植されたｔＮＳＣの生存および増殖を可能にする方法、ならびに現在の療法措置に比較して減少した可変性を伴う結果を達成する、損なわれていない行動の回復の評価法である。
[0085]やはり本明細書において提供するのは、マウス胚性フィーダー細胞を用いることなく、問題がある混入を回避して培養されるｈＴＳ細胞由来の単離神経幹細胞である。本明細書に提供するのは、他の起源の細胞からドーパミン作動性ニューロンを誘導するのに用いられる他の方法とは区別可能な、ｈＴＳ細胞由来ｔＮＳＣを効率的にそして再現可能に生成して、均一な混合集団サブセットを導く方法である。本明細書に提供するのは、ドーパミン作動性ｔＮＳＣを細胞懸濁物として脳内に移植し、それによって組織移植に関連する不均一な増殖を回避するための方法である。
[0086]本明細書に提供するのは、誘導薬剤で幹細胞を調節して、ニューロン特性を持つ細胞に分化させる方法である。１つの態様において、誘導薬剤は、幹細胞における１またはそれより多いタンパク質の発現または調節活性を調節する。１つの態様において、１またはそれより多いタンパク質の１つは、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｆｚｄ６、Ｄｖｌ３、ＦＲＡＴ１、ＧＳＫ３β、ＨＤＡＣ６、β−カテニン、Ｇαｑ／１１、Ｇβ、ＲＸＲα、ＲＡＲβ、ＧＬｕＲ１、ＰＩ３Ｋ、ＡＫｔ１、ＡＫｔ２、ＡＫｔ３、ｍＴＯＲ、ＥＩＦ４ＥＢＰ、ＣＲＥＢ１、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＰＬＣ−β、ＰＩＰ２、ＣａＭＫＩＩ、ＥＩＦ４Ｂ、パーキン、ＳＮＣＡ、チューブリン、カルシニューリン、ＣＲＭＰ−２、ＮＦＡＴ１、インポーチン、ＬＥＦ１、Ｐｉｔｘ２、ＭＥＦ２Ａ、またはＥＰ３００である。１つの態様において、幹細胞は、トロホブラスト、胚性または人工前駆体幹細胞である。１つの態様において、ニューロン特性を持つ細胞は、ＮＳＣ、ドーパミン産生細胞、ドーパミン作動性ニューロン、単極ニューロン、双極ニューロン、多極ニューロン、錐体細胞、プルキンエ細胞、および前角細胞、バスケット細胞、ベッツ細胞、レンショウ細胞、顆粒細胞、または中型有棘細胞である。
[0087]やはり本明細書に提供するのは、幹細胞を誘導薬剤で調節して、免疫原性が減少した細胞に分化させる方法である。１つの態様において、誘導薬剤は、幹細胞において、１またはそれより多いタンパク質の発現または調節活性を調節する。１つの態様において、１またはそれより多いタンパク質の１つは、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｆｚｄ６、Ｄｖｌ３、ＦＲＡＴ１、ＧＳＫ３β、ＨＤＡＣ６、β−カテニン、Ｇαｑ／１１、Ｇβ、ＲＸＲα、ＲＡＲβ、ＧＬｕＲ１、ＰＩ３Ｋ、ＡＫｔ１、ＡＫｔ２、ＡＫｔ３、ｍＴＯＲ、ＥＩＦ４ＥＢＰ、ＣＲＥＢ１、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＰＬＣ−β、ＰＩＰ２、ＣａＭＫＩＩ、ＥＩＦ４Ｂ、パーキン、ＳＮＣＡ、チューブリン、カルシニューリン、ＣＲＭＰ−２、ＮＦＡＴ１、インポーチン、ＬＥＦ１、Ｐｉｔｘ２、ＭＥＦ２Ａ、またはＥＰ３００である。１つの態様において、幹細胞は、トロホブラスト、胚性または人工前駆体幹細胞である。１つの態様において、免疫原性が減少した細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞、マスト細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による免疫反応を誘導しないか、またはこうした免疫反応を阻害可能である。
ヒト・トロホブラスト幹細胞（ｈＴＳ細胞）
[0088]ヒト卵管は、女性において、受精部位であり、そして子宮外妊娠の一般的な部位であり、ここでは、いくつかの生物学的事象、例えば内部細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉間の区別、ならびに主要なエピジェネティック変化を伴う全能性から多能性への切り換えが起こる。これらの観察は、卵管を、着床前段階の胚盤胞関連幹細胞を採取するニッチ貯蔵所と見る裏付けを提供する。子宮外妊娠は、先進国において、すべての妊娠の１〜２％を占め、そして発展途上国でははるかに多い。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）および胎児脳組織の入手可能性が低いことを考慮して、本明細書に記載するのは、前駆細胞生成用の非常に入手しにくいｈＥＳ細胞の代替物としての子宮外妊娠由来のヒト・トロホブラスト細胞（ｈＴＳ細胞）の使用である。
[0089]１つの態様において、子宮外妊娠由来のヒト・トロホブラスト細胞は、ヒト胚の破壊を伴わない。別の態様において、子宮外妊娠由来のヒト・トロホブラスト細胞は、生存可能なヒト胚の破壊を伴わない。別の態様において、ヒト・トロホブラスト細胞は、非生存性子宮外妊娠と関連するトロホブラスト組織由来である。別の態様において、子宮外妊娠は救うことが不可能である。別の態様において、子宮外妊娠は、生存可能なヒト胚を導かない。別の態様において、子宮外妊娠は母親の生命を脅かす。別の態様において、子宮外妊娠は、卵管、腹部、卵巣または子宮頸のものである。
[0090]胚盤胞発生中、ＩＣＭ接着自体またはそれに由来する拡散可能な「誘導因子」が、極性栄養外胚葉において、高速の細胞増殖を誘発し、胚盤胞段階全体で、壁領域への細胞の移動を導き、そしてこれは、ＩＣＭからの栄養外胚葉の区別後であっても続きうる。ＩＣＭに重層する壁栄養外胚葉細胞は、ＩＣＭの「細胞記憶」を保持することが可能である。通常、着床開始時、子宮内膜からの機械的束縛のため、ＩＣＭの反対側の壁細胞は分裂を停止する。しかし、こうした制約は卵管には存在せず、子宮外妊娠の停滞した胚盤胞において、極性栄養外胚葉細胞の分裂が続いて、胚外外胚葉（ＥｘＥ）が生じる。１つの態様において、ＥｘＥ由来ＴＳ細胞は、ＩＣＭ分泌線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）およびその受容体、線維芽細胞増殖因子受容体２（Ｆｇｆｒ２）の相互作用に応じて、少なくとも４日間のウィンドウで増殖状態で存在する。別の態様において、ＥｘＥ由来ＴＳ細胞は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日のウィンドウで、増殖状態で存在する。臨床介入が生じるまで、これらの細胞プロセスは、着床前胚において、無限数のｈＴＳ細胞を生じる可能性もあり；こうした細胞は、ＩＣＭ関連遺伝子の発現によって反映される、ＩＣＭからの細胞記憶を保持する。
[0091]本明細書に記載する１つの側面は、子宮着床前のｈＴＳ細胞および絨毛性栄養膜細胞層である。１つの態様において、ｈＴＳ細胞は、内部細胞塊（ＩＣＭ）（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＦＧＦ４）および栄養外胚葉（Ｃｄｘ２、Ｆｇｆｒ−２、Ｅｏｍｅｓ、ＢＭＰ４）の両方の特異的遺伝子を所持し（図１ａ）、そしてすべての３つの一次胚葉の構成要素を発現する（図７）。別の態様において、ｈＴＳ細胞は、ｈＥＳ細胞関連表面マーカー、例えばステージ特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）−１、−３および−４（図１ｂ）、ならびに間葉系幹細胞関連マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＫ７およびビメンチン）を発現し、一方、造血幹細胞マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ４５、α６−インテグリン、Ｅ−カドヘリン、およびＬ−セレクチン）を発現しなかった（図８）。１つの態様において、ｈＴＳ細胞は、誘導に際して、３つの一次胚葉の多様な特異的細胞表現型に分化可能であった（図９）。オス重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス内にｈＴＳ細胞を皮下移植すると、移植６〜８週後、組織学的に小規模なキメラ反応しか引き起こされなかった（図１０）。１つの態様において、染色体分析によって、ｈＴＳ細胞は、核型パターンを変化させなかった（４６、ＸＹ）（図１１）。別の態様において、細胞寿命は、培養第三および第七継代の間でテロメア長において、有意に短縮されなかった（図１ｃ）。
[0092]本明細書に提供する１つの側面は、ｈＴＳ細胞および胎盤由来間葉系幹（ＰＤＭＳ）細胞間の全体的な遺伝子比較のため、ＧｅｎｅＣｈｉｐヒトゲノムＵ１３３プラス２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐを調べるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＴＭプラットホームを用いて、ｈＴＳ細胞およびＰＤＭＳ細胞の間の区別を記載する。１つの態様において、ｈＴＳ細胞は、ＰＤＭＳ細胞におけるよりも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５％少ない遺伝子発現を示した。別の態様において、ｈＴＳ細胞は、全部で２，１４０遺伝子（倍変化＞２倍）を示し、これはＰＤＭＳ細胞におけるもの（３，７３０遺伝子）より約４０％少ない（図１ｄ）。１つの態様において、ｈＴＳ細胞の遺伝子強度分布は、ＰＳＭＳ細胞におけるものとは異なる均質なパターンを示した。別の態様において、ｈＴＳ細胞は、着床前段階での栄養膜細胞層の別個な群に相当し、これによって、これらは、内部細胞塊（ＩＣＭ）および／または栄養外胚葉の分子ポートレートを所持する。別の態様において、ｈＴＳ細胞は、ｈＥＳ細胞のものと類似の多能性および自己再生特性を示す。
ＬＩＦの退薬は、ｈＴＳ細胞において、Ｎａｎｏｇの過剰発現を仲介する
[0093]栄養膜細胞層は、ヒトにおける合胞体栄養細胞の前駆体である（Ｂｅｎｉｒｓｃｈｋｅ， Ｋ．， Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｐ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ中， ３９−５１ Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．， １９９０）。トロホブラスト特定ゾーンは、胚が桑実胚の際に確立され、その細胞ゾーンでの転写因子の別個の組み合わせ、ならびにこれらに対する多様な環境上の合図および増殖因子の影響を反映する。
[0094]多くの証拠によって、初期エピブラストおよび真正ＥＳ細胞の天然多能性が、３つの転写オーガナイザー、Ｏｃｔ４、性決定領域Ｙ−ボックス２（Ｓｏｘ２）、およびＮａｎｏｇの作用に依存することが示されている（Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｉ．ら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２３：７１５０−７１６０（２００４）； Ｎｉｗａ Ｈ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３４：６３５−６４６（２００７））。ＥＳ細胞は、異なるシグナル伝達経路、ならびに白血病阻害因子（ＬＩＦ）、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびオクタマー結合転写因子３および４（Ｏｃｔ３／４）を含む転写因子の複雑な相互作用を通じて多能性を維持する。転写因子Ｎａｎｏｇは、マウスおよびヒトＥＳ細胞の多能性の維持に重要な役割を果たしている一方、ＬＩＦは、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇと協同で、多能性および自己再生を補助するよう働く（Ｃａｖａｌｅｒｉ， Ｆ．ら Ｃｅｌｌ １１３， ５５１−５５２（２００３））。
[0095]インターロイキン６クラスのサイトカインであるＬＩＦは、細胞増殖および分化に影響を及ぼす。ＬＩＦは、白血病阻害因子受容体α（ＬＩＦＲ−アルファ）に結合し、該受容体は、膜糖タンパク質１３０（ＧＰ１３０）共通受容体と、ヘテロ二量体受容体複合体を形成する。ＬＩＦの結合は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）／シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路ならびにマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化を導く。ＬＩＦは、通常、発生中の胚の栄養外胚葉において発現される。ＬＩＦは、未分化状態を維持する際に役割を果たすと考えられる。幹細胞培養からのＬＩＦの除去は、通常、培養幹細胞の分化を導く。ＬＩＦはまた、幹細胞維持に必須の役割を果たすことが知られる遺伝子であるＮａｎｏｇの発現にも影響を及ぼす。
[0096]通常、多面的サイトカイン、白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、子宮内膜におけるよりも卵管において、より高い濃度で発現され、膨大部から卵管峡部に向かって、漸次減少を示す（図１ｇ）。子宮外妊娠の間、ＬＩＦレベルは卵管において２〜４倍増加する（Ｗａｎｇｇｒｅｎ， Ｋ．ら， Ｍｏｌ． Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２００７， １３， ３９１−３９７）。機能的には、ＬＩＦは、他のシグナルを組み込んで、多能性転写因子、例えばＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを活性化して、マウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞における多能性および自己再生を維持することも可能である。ＬＩＦを退薬すると、細胞増殖は続くが、尾側関連ホメオボックス転写因子Ｃｄｘ２が活性化され、胚性幹（ＥＳ）細胞における栄養外胚葉分化が誘発される。
[0097]１つの態様において、多能性および自己再生の特性をｈＴＳ細胞がどのように維持するかを決定する方法を記載する。１つの態様において、ＬＩＦと多能性転写因子（例えばＳｍｉｔｈ， Ａ． Ｇ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３３６， ６８８−６９０（１９９８）， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｒ． Ｌ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３３６， ６８４−６８７，（１９９８）， Ｃａｖａｌｅｒｉ， Ｆ．ら， Ｃｅｌｌ １１３， ５５１−５５２（２００３）； Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｉ．ら， Ｃｅｌｌ， ２００３；１１３：６４３−６５５， Ｂｏｉａｎｉ， Ｌ． Ａ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６， ８７２−８８４（２００５）に記載される因子）の関連をｈＴＳ細胞において調べた。
[0098]妊娠５〜８週、卵管子宮外妊娠を患っている女性からｈＴＳ細胞を得て、そしてこれらの細胞は、栄養膜細胞層の別個の集団として特徴付けられ、ＩＣＭ由来ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞および栄養外胚葉の特定の遺伝子マーカー（例えば、Ａｄｊａｙｅ， Ｊ．ら， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２００５， ２３， １５１４−１５２５に記載されるマーカー）を所持した（図１ａ）。
[0099]本明細書に提供するのは、１つの態様において、ＬＩＦに対する前記細胞の曝露を調節することによって、ｈＴＳ細胞分化に影響を及ぼす方法である。例えば、ｈＴＳ細胞を３つの群に分け、そして異なる濃度のＬＩＦに曝露する。１つの態様において、ＬＩＦの濃度は、約１０００、約７５０、約６００、約５５０、約５２５、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、または約２５単位／ｍＬである。別の態様において、ＬＩＦの濃度は、５００、２５０、および１２５単位／ｍＬである。１つの態様において、ＬＩＦの濃度は５００単位／ｍＬである。別の態様において、ＬＩＦの濃度は２５０単位／ｍＬである。別の態様において、ＬＩＦの濃度は１２５単位／ｍＬである。
[00100]１つの態様において、ｈＴＳ細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間、異なる濃度のＬＩＦに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を３、６、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８、２４０、または２５２時間、異なる濃度のＬＩＦに曝露する。別の態様において、約１〜３０、約１〜２８、約１〜２６、約１〜２４、約１〜２２、約１〜２０、約１〜１８、約１〜１５、約１〜１３、約１〜１０、約１〜９、約１〜８、約１〜７、約１〜６、約１〜５、約１〜４または約１〜２日間、ｈＴＳ細胞を異なる濃度のＬＩＦに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を３日間、異なる濃度のＬＩＦに曝露する。
[00101]本明細書記載の１つの側面は、より低い濃度のＬＩＦが、限定されるわけではないが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｃｄｘ２、およびＮａｎｏｇを含む特定の遺伝子の発現を変化させることである。別の態様は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＬＩＦの退薬および／または低濃度のＬＩＦが、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２発現を抑制し、そして対照的にＣｄｘ２およびＮａｎｏｇを促進することを立証する。１つの態様において、これらの現象は、用量依存方式でのＯｃｔ４およびＳｏｘ２の抑制を示すフローサイトメトリー分析によってさらに確認された（図１ｆ）。
[00102]別の態様において、Ｏｃｔ４／Ｃｄｘ２比の相対発現は、初期胚分化において、細胞の運命を示す。別の態様において、ＬＩＦ曝露の退薬および／または減少は、Ｏｃｔ４発現減少を導く。別の態様において、ＬＩＦ曝露の退薬および／または減少は、用量依存方式で、転写因子Ｃｄｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２の発現を促進し、これは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析と一致する。
[00103]本明細書記載の別の側面は、ｈＴＳ細胞における、卵管のＬＩＦレベルの傾向（図１ｇ）と適合し、それによって、ｈＥＳ細胞に向かう細胞運命の選択を暗示する、卵管峡部に向かう漸次減少を伴う、膨大部での高いＯｃｔ４／Ｃｄｘ２比である。１つの態様において、相対的Ｎａｎｏｇ／Ｃｄｘ２比の上方制御（２倍）はさらに、細胞における多能性を強制する。１つの態様において、相対的Ｎａｎｏｇ／Ｃｄｘ２比の上方制御（２倍）は、ｈＴＳ細胞における多能性を維持する。別の態様において、Ｓｏｘ２／Ｃｄｘ２発現比は、ｈＴＳ細胞の多能性の維持を変化させない。別の態様において、Ｃｄｘ２過剰発現は、ｈＴＳ細胞がトロホブラスト表現型を維持するのに好ましい。
[00104]本明細書記載の１つの態様は、ｈＴＳ細胞におけるＮａｎｏｇおよびＣｄｘ２間の関係を調べる方法である。別の態様において、ｓｉＲＮＡを用いることによるＮａｎｏｇおよびＣｄｘ２両方のノックアウト研究は、それぞれ、Ｃｄｘ２およびＮａｎｏｇ発現を促進し（図１ｈ）、細胞運命選択のためのＥＳ細胞におけるＯｃｔ４およびＣｄｘ２のものと同様、ｈＴＳ細胞において、ＮａｎｏｇおよびＣｄｘ２間の相反性の関係を裏付ける（Ｎｉｗａ， Ｈら， Ｃｅｌｌ １２３， ９１７−９２９）。別の態様において、上昇したＮａｎｏｇ／Ｃｄｘ２比と組み合わせたＮａｎｏｇ過剰発現は、減少したＯｃｔ４／Ｃｄｘ２比を補償し、そしてｈＴＳ細胞において、細胞分化運命を決定する多様性および／または再生の維持に十分である。
[00105]本明細書の１つの側面は、ＬＩＦ退薬に際してのＮａｎｏｇ過剰発現が、ｈＴＳ細胞の多能性を維持する役割を果たす、少なくとも１つの因子であることを示す。
レチノイン酸（ＲＡ）および関連経路
[00106]ビタミンＡの誘導体であるレチノイン酸（ＲＡ）は、ＥＳ細胞分化および胚形成において役割を果たす。ＥＳ細胞において、ＲＡは、核受容体に結合し、そして特定のターゲット遺伝子の転写を誘導することによって作用して、多くの異なる細胞タイプを生成する。１つの態様において、ＲＡでの誘導は、ｈＴＳ細胞由来ｔＮＳＣが特定のパターン形成で安定して未分化の状態を維持することを可能にする。
[00107]１つの態様において、ｈＴＳ細胞をオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）で処理すると、ラット疾患モデル（例えばパーキンソン病モデル）への移植に適した神経幹細胞が生じる。別の態様において、ｈＴＳ細胞におけるＬＩＦ曝露の退薬および／または減少は、ｈＴＳ細胞の多能性および自己再生維持に関与するＮａｎｏｇの過剰発現を仲介する。やはり本明細書に記載するのは、可逆性上皮間葉転換（ＥＭＴ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびＷｎｔシグナル伝達経路クロストークにおいて役割を果たす経路を含み、そして神経幹細胞形成のためにターゲット遺伝子Ｐｉｔｘ２を誘発する、ＲＡに誘導されたｈＴＳ細胞が神経幹細胞に分化するのを可能にする特定の分子経路である。したがって、１つの態様は、ｈＴＳ細胞から神経幹細胞を生成するためのＲＡ関連経路の調節因子の使用を記載する。
ＲＡは、ＮＳＣサブタイプの均一な複合体を誘導する
[00108]１つの態様において、ｈＴＳ細胞を誘導して神経幹細胞を産生する。１つの態様において、ｈＴＳ細胞を誘導剤に曝露するかまたは誘導剤で処理する。１つの態様において、誘導剤には、限定されるわけではないが、レチノイン酸、神経増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ニューロトロピン（例えばニューロトロピン３）および／またはその組み合わせが含まれる。さらなる例示的誘導剤には、限定されるわけではないが：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ウィングレス型ＭＭＴＶ組込み部位（Ｗｎｔ）タンパク質（例えばＷｎｔ３ａ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、甲状腺ホルモン（Ｔ３およびＴ４型の両方を含むＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺放出ホルモン（ＴＲＨ）、ヘッジホッグタンパク質（例えばソニック・ヘッジホッグ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、サイクリックＡＭＰ、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、セロトニン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、フェロモン（例えば、２−ｓｅｃ−ブチル−４，５−ジヒドロチアゾール、２，３−デヒドロ−エキソ−ブレビコミン、アルファおよびベータ・ファルネセン、６−ヒドロキシ−６−メチル−３−ヘプタノン、２−ヘプタノン、トランス−５−ヘプテン−２−オン、トランス−４−ヘプテン−２−オン、ｎ−ペンチルアセテート、シス−２−ペンテン−１−イル−アセテート、２，５−ジメチルピラジン、ドデシルプロピオネート、および（Ｚ）−７−ドデセン−１−イルアセテート）、および／またはその組み合わせが含まれる。別の態様において、誘導剤は、天然誘導剤の活性を有する類似体または変異体である。
[00109]限定されない例として、レチノイン酸を用いて、ｈＴＳ細胞を化学的に誘導する。多面発現因子オールトランスレチノイン酸（ＲＡ）は、限定されるわけではないが、ＥＳ細胞においてＲＡ／ＲＡＲ／ＲＸＲシグナル伝達、Ｗｎｔシグナル伝達およびＥＲＫ経路を含む多数の経路を通じて、神経分化、パターン形成および運動軸索伸長において、ｉｎ ｖｉｖｏ機能を行う（Ｍａｄｅｎ， Ｍ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８， ７５５−７６５（２００７）、Ｌｕ Ｊら， ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００９， １０：５７、Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ Ｈら， Ｃｅｌｌ． ２００２； １１０：３８５−３９７）。ＲＡは、ｍＥＳ細胞（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ Ｈら， Ｃｅｌｌ． ２００２； １１０：３８５−３９７）、ｈＥＳ細胞（Ｌｉ， Ｌ．ら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２， ４４８−４５６（２００４））および成人神経発生（Ｊａｃｏｂｓ Ｓら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２００６， １０３（１０）：３９０２−７）において、ドーパミン作動性ニューロンの特徴となる酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現、および神経突起形成を誘導する。
[00110]１つの態様において、ＲＡで処理したｈＴＳ細胞の運命を決定する方法を記載する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または６５μＭのＲＡで処理する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を０．５〜７５、約１〜６５、約１〜６０、約１〜５０、約１〜５５、約１〜５０、約１〜４０、約１〜３５、約１〜３０、約１〜２５、約１〜２０、約１〜１５、約１〜１３、約１〜１０、約２〜１０、約５〜１０、または約８〜１０μΜのＲＡで処理する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を１０μＭのＲＡで処理する。
[00111]１つの態様において、ｈＴＳ細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を３、６、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８、２４０、または２５２時間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を約１〜２０、約１〜１８、約１〜１５、約１〜１３、約１〜１０、約１〜９、約１〜８、約１〜７、約１〜６、約１〜５、約１〜４または約１〜２日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を異なる期間：各々、１、２、３、４、５、６、７、または８日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を１日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を２日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を３日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を４日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を５日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を６日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を７日間、ＲＡに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を８日間、ＲＡに曝露する。
[00112]１つの態様において、ＲＡは、多様な表現型神経細胞へのｈＴＳ細胞分化を誘導し、こうした神経細胞には、限定されるわけではないが、神経幹細胞マーカーであるネスチンを免疫細胞化学的に発現している、グリア制限前駆体（ＧＲＰ）、ニューロン制限前駆体（ＮＲＰ）、多能性神経幹（ＭＮＳ）細胞、アストロサイト（ＡＳＴ）、および未定義トロホブラスト巨細胞（ＴＧＣ）が含まれる（図２ａ）。別の態様において、混合ＲＡ誘導性神経前駆体の類似の分布比が１〜５日間のＲＡ誘導期間に渡って生じる。別の態様において、細胞分化は、７日間のＲＡ処理に渡って、未定義トロホブラスト巨細胞になる。
[00113]したがって、本明細書に提供するのは、１つの態様において、ｈＴＳ細胞に由来するＲＡ誘導性神経幹細胞である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、３、６、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８、２４０、または２５２時間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、約１〜２０、約１〜１８、約１〜１５、約１〜１３、約１〜１０、約１〜９、約１〜８、約１〜７、約１〜６、約１〜５、約１〜４または約１〜２日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、１〜７日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、１日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、２日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、３日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、４日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、５日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、６日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、７日間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、２４時間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、１２時間である。別の態様において、ＲＡ誘導期間は、１時間〜２４時間である。
[00114]本明細書に記載するのは、１つの態様において、少なくとも１つの神経幹細胞遺伝子およびマーカーを発現するｔＮＳＣである。別の態様において、ｔＮＳＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの神経幹細胞遺伝子を発現する。別の態様において、ｔＮＳＣは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの神経幹細胞マーカーを発現する。神経幹細胞遺伝子およびマーカーの限定されない例には、ネスチン、神経フィラメント、Ｎｇｎ−３、ＭＡＰ−２、Ｎｅｏ−Ｄ、ＣＤ１３３およびＯｃｔ４が含まれる（図２ｂ）。１つの態様において、ｔＮＳＣはまた、ＲＡ受容体遺伝子も発現し、これには、限定されるわけではないが、ＲＡＲβ、ＲＸＲα、およびＲＸＲβ、細胞性レチノイン酸結合タンパク質（ＣＲＡＢＰ）−２、細胞性レチノール結合タンパク質（ＣＲＢＰ）−１、そして特に、ＥＳ細胞には存在しないことが見出されたＲＡ−合成酵素、ＲＡＬＤＨ−２および−３が含まれる。
[00115]したがって、１つの態様は、ｔＮＳＣの分化能を促進するための、ネスチン、神経フィラメント、Ｎｇｎ−３、ＭＡＰ−２、Ｎｅｏ−Ｄ、ＣＤ１３３およびＯｃｔ４、ＲＡ受容体遺伝子、例えばＲＡＲβ、ＲＸＲαおよびＲＸＲβ、ＣＲＡＢＰ−２、ＣＲＢＰ−１、ＲＡ−合成酵素、ＲＡＬＤＨ−２および−３などを含む発現された神経幹細胞遺伝子およびマーカーの使用、および／またはその調節を記載する。１つの態様において、３日間および５日間のＲＡ誘導性ｈＴＳ細胞はどちらも、同様の比で、ネスチン、ＧＦＡＰおよび神経フィラメントタンパク質を含む神経幹細胞マーカーを維持する（図２ｃ）。別の態様において、これらのｔＮＳＣは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）および５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）を免疫細胞化学的に発現し（図２ｄ）、ドーパミン作動性ニューロンならびにセロトニン作動性ニューロンに分化するこれらの能力が暗示される。本明細書記載の別の態様は、ｔＮＳＣのドーパミン作動性ニューロンおよびセロトニン作動性ニューロンへの分化である。
[00116]さらに本明細書に提供するのは、細胞培養において、遺伝的および表現型的に定常状態で維持可能な、均一に混合された神経上皮前駆細胞からなるｔＮＳＣである。産物におけるこの一貫性は、幹細胞に基づく療法を含む任意の治療措置に望ましい特性である。
Ｎａｎｏｇ発現に関するＬＩＦおよびＲＡ間の関連
[00117]初期胚発生において、ｔＮＳＣは、典型的にはＲＡＬＤＨ−２を発現する。本明細書記載の１つの態様は、ｈＴＳ細胞において、ＬＩＦがＲＡ誘導性神経発生にどのように影響を及ぼすかを評価する方法である。ＬＩＦがＲＡ誘導性ニューロン分化をマウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞において阻害する能力によって、移植がより困難になる（Ｍａｒｔｉｎ−Ｉｂａｎｅｚ Ｒら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｎ． Ｒｅｓ． ８５， ２６８６−２７１０（２００７）、Ｂａｉｎ Ｇら， Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １６８：３４２−３５７）。他の報告は、ＥＳ細胞がニューロンに分化する際のＬＩＦの陽性の役割を主張する（Ｔｒｏｐｅｐｅ Ｖ， Ｎｅｕｒｏｎ ２００１， ３０：６５−７８）。
[00118]１つの態様において、ｈＴＳ細胞におけるＮａｎｏｇ発現に関するＬＩＦおよびＲＡ間の関連を評価する方法を記載する。別の態様において、ｔＮＳＣをＬＩＦで処理し、そしてフローサイトメトリーによるＮａｎｏｇ発現の測定に供する（図１８ａ）。１つの態様において、ｔＮＳＣを、約１０００、約７５０、約６００、約５５０、約５２５、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、または約２５単位／ｍＬのＬＩＦで処理する。別の態様において、ｔＮＳＣを、１〜１０００、１〜５００、１〜４５０、１〜４００、１〜３５０、１〜３００、１〜２５０、１〜２００、１〜１５０、１〜１２５、１〜１００、１〜７５、または１〜５０単位／ｍＬのＬＩＦで処理する。別の態様において、ｔＮＳＣを、５００、２５０、および／または１２５単位／ｍＬのＬＩＦで処理する。
[00119]１つの態様において、ｈＴＳ細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間、ＬＩＦに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞をＬＩＦに一晩曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を、３、６、１２、１５、１８、２２、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８、２４０、または２５２時間、ＬＩＦに曝露する。別の態様において、ｈＴＳ細胞を、約１〜２０、約１〜１８、約１〜１５、約１〜１３、約１〜１０、約１〜９、約１〜８、約１〜７、約１〜６、約１〜５、約１〜４または約１〜２日間、ＬＩＦに曝露する。
[00120]１つの態様において、ＲＡでのｈＴＳ細胞の処理は、Ｎａｎｏｇ過剰発現を誘導する。別の態様において、ＬＩＦは、ＲＡ誘導性Ｎａｎｏｇを用量依存方式で抑制する。別の態様において、ＬＩＦは、ｔＮＳＣ発生に対して阻害作用を発揮する。
[00121]本明細書記載の１つの側面は、ＬＩＦがＥＳ細胞の神経分化に対してＲＡと相互作用することである。１つの態様において、ＬＩＦは、ｈＴＳ細胞において、多能性に対するＲＡの影響に影響を及ぼす。結果によって、ＲＡは、ｈＴＳ細胞において、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の過剰発現を誘導するが、Ｃｄｘ２およびＳｏｘ２の過剰発現を誘導しないことが示された（図１８ｂ）。脳の帯状回峡領域において、Ｎａｎｏｇ発現がＬＩＦ誘導細胞の６２．５％で観察された（図１Ｆ、左および右パネル）が、ＲＡ誘導細胞ではわずか２６．９％であった（図１８ｂ）。より高レベルのＬＩＦは、一般的に、ＲＡ誘導性Ｎａｎｏｇを抑制し、そしてＬＩＦの退薬は、ＲＡ誘導性Ｎａｎｏｇ発現を有意に増進することもまた観察された（図１８ａ）。これらの結果は、ｈＴＳ細胞が帯状回峡に向かって移動することを示した。１つの態様において、ＲＡは、Ｎａｎｏｇ発現によって、細胞多能性を維持する。
[00122]１つの態様において、ＲＡ濃縮微小環境におけるｔＮＳＣの移植は、幹細胞の連続増殖をｉｎ ｖｉｖｏで促進する。別の態様において、ｔＮＳＣは、脳内に移植される。別の態様において、ｔＮＳＣは、海馬、大脳皮質、線条体、中隔野、間脳、中脳、後脳、または脊髄基底核に移植されるかまたは注入される。別の態様において、ｔＮＳＣは、脳の線条体内に移植される。別の態様において、ｔＮＳＣは、中枢神経系の任意の部分に移植されるかまたは注入される。別の態様において、ｔＮＳＣは、特定の神経変性障害において変性する細胞の神経末端領域内に移植されるかまたは注入される。別の態様において、ｔＮＳＣは、黒質緻密部中、中脳内に移植されるかまたは注入される。別の態様において、ｔＮＳＣは、前脳における神経末端領域内に移植されるかまたは注入される。別の態様において、ｔＮＳＣは、脳室系内に移植されるかまたは注入される。別の態様において、ｔＮＳＣは、側脳室内に移植されるかまたは注入される。
ｔＮＳＣの多能性維持におけるＧタンパク質シグナル伝達
[00123]本明細書に記載する別の側面は、ｔＮＳＣがその多能性状態をどのように維持しているかを調べる方法である。１つの態様において、ＲＡは、約１５分でｃ−Ｓｒｃ ｍＲＮＡ発現ピークを誘導する（図３ａ）。本明細書に記載する別の態様は、ウェスタンブロット分析によって、ＲＸＲα、ｃ−ＳｒｃおよびＲＡＲβのＲＡ刺激発現に基づくＧＰＣＲシグナル伝達経路を評価する（図３ｂ）。１つの態様において、ＲＡは、３０分間でＧαｑ／１１およびＧβ発現の両方を促進する。別の態様において、免疫沈降（ＩＰ）アッセイの分析は、ＲＡがＲＸＲαおよびＲＡＲβ間の直接結合を誘導するが、この相互作用は、ｃ−Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ１類似体によってブロックされることを立証し、ｃ−Ｓｒｃが、ＲＸＲαおよびＲＡＲβ間に関与して、足場タンパク質複合体を形成することを示す（図３ｃ）。
[00124]免疫沈降（ＩＰ）分析によって（図３ｄ）、本発明者らは、ＲＸＲαがＧαｑ／１１との結合相互作用を示し、一方、ＲＡＲβは、Ｇβと独立に結合相互作用を示すことを観察した。これらの結果は、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質シグナル伝達の「引くおよび押す」モデルと適合する（Ｔｓａｉら， “Ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｇｐ７８ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓａｒｃｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＫＡＩｌ ｆｏｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ”． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３， １５０４−１５０９， （２００７））。
[00125]１つの態様において、ＲＡＲおよびＲＸＲのヘテロ二量体対は、核および内因性細胞表面シグナル分子において、リガンド活性化転写因子の役割を果たす。恒常的に活性化されたＲＸＲαは、受容体コンホメーションを破壊し、そしてｃ−Ｓｒｃを補充して、会合したＧαｑ／１１と相互作用させ、そして／または該分子を活性化する。１つの例において、この非ゲノムＲＡシグナル伝達は、非レチノイン酸応答配列（ＲＡＲＥ）仲介性遺伝子発現の解釈を補助する（Ｍａｄｅｎ， Ｍ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８， ７５５−７６５（２００７））。
[00126]したがって、本明細書に提供するのは、本明細書に提供する神経幹細胞の移植前および移植後の細胞過剰増殖を防止するための戦略である。１つの態様は、ＲＡ関連経路を調節し、それによって過剰増殖および／または移植片拒絶を防止し、そして／または減少させ、そして／または軽減する剤の使用を記載する。
癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼ（Ｓｒｃ）およびＮａｎｏｇ
[00127]ｃ−Ｓｒｃは、ＥＳ細胞を未分化状態に維持する（Ａｎｎｅｒｅｎ Ｃ．ら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７９， ５９０−５９８（２００４））。ＮａｎｏｇおよびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ３依存性プロモーターに相乗的に結合して、これを活性化する（Ｔｏｒｒｅｓ Ｊ．ら， Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０， １９４−２０１（２００８））。１つの態様において、ｃ−Ｓｒｃは、Ｔｙｒ７０５部位でのシグナル伝達性転写因子３（Ｓｔａｔ３）リン酸化を誘導し、そしてこの作用は、ｃ−Ｓｒｃ阻害剤、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ−１）類似体によってブロックされ、それによって、ｃ−ＳｒｃおよびＳｔａｔ３分子間が関連づけられる（図３ｆ）。別の態様において、Ｓｔａｔ３は、Ｎａｎｏｇプロモーターに直接作用する（図３ｇ）。別の態様において、Ｓｔａｔ３は、Ｎａｎｏｇプロモーターには直接作用しない。別の態様において、ＲＸＲαは、Ｎａｎｏｇプロモーターに直接作用する。別の態様において、ＲＸＲαは、Ｎａｎｏｇプロモーターには直接作用しない。別の態様において、ＲＡＲβは、Ｎａｎｏｇプロモーターに直接作用する。別の態様において、ＲＡＲβは、Ｎａｎｏｇプロモーターには直接作用しない。別の態様において、ＲＡは、ｈＴＳ細胞において、ｃ−Ｓｒｃ、ｐＳｔａｔ３（図３ｅ）、およびＮａｎｏｇ（図１ｅ）の過剰発現を誘導する。別の態様において、ＲＸＲαおよびＲＡＲβはどちらも、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質シグナル伝達を通じて、ＲＡに反応して形質導入の役割を果たす。
[00128]本明細書に記載するのは、１つの態様において、ｔＮＳＣにおける多能性を維持する方法であって、ｃ−Ｓｒｃ／Ｓｔａｔ３／Ｎａｎｏｇ転写経路を活性化する工程を含む、前記方法である。別の態様において、ｃ−ＳｒｃおよびＧαｑ／１１の相互作用は、ｃ−Ｓｒｃ／Ｓｔａｔ３／Ｎａｎｏｇ経路を活性化する。画像化研究によって、ＲＸＲαおよびＧαｑ／１１間の直接相互作用をさらに検証するため、二重免疫金蛍光透過型電子顕微鏡（ＩＥＭ）を利用した。ＲＡは、形質膜で、金小粒子標識ＲＸＲα（６μｍ）および金大粒子標識Ｇαｑ／１１（２０μｍ）間の結合相互作用を誘導した（図４）。動的共焦点免疫蛍光顕微鏡観察によって、どちらも免疫染色されたＲＸＲαおよびＧαｑ／１１は、主に、細胞質または核いずれかの均質な特徴で現れた（図４、上部パネル）。ＲＡで５分間処理することによって、細胞質ゾルＲＸＲα強度は、核周辺領域で増加した一方、核では減少し（図４、第一のカラム）、刺激後に細胞質ゾルに転位置したことが示された。核ＲＸＲα強度は、１５分で顕著になり、一方、細胞質ゾルのものは減少した（図３ａ）。
[00129]１つの態様において、細胞核における活性の増加は、細胞の定常状態を維持する。明確な細胞質ゾル転位置が３０分で再び観察された。一方、Ｇαｑ／１１発現の区画変化は、ＲＸＲαのものと類似であった（図４、第二のカラム）。１つの態様において、刺激３０分後、細胞膜でＧαｑ／１１の明確な集積が観察された。別の態様において、ＲＡは、ｈＴＳ細胞において、ＲＸＲαおよびＧαｑ／１１両方の合成および恒常的な転位置の促進を可能にする。
[00130]したがって、本明細書に提供するのは、ｔＮＳＣの生成のため、ゲノムＲＡ／ＲＸＲ／ＲＡＲ経路から区別可能な、形質膜でのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）−Ｇタンパク質シグナル伝達を通じた、ｈＴＳ細胞に対して作用するＲＡの使用である。本明細書に示すように、ｈＴＳ細胞をｔＮＳＣに分化させる際、ＲＡは、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４を通じて作用するが、ＣｄｘおよびＳｏｘ２経路では作用しない。本明細書にやはり提供するのは、ｔＮＳＣにおける多能性および自己再生の維持のための、ＲＡ誘導性Ｎａｎｏｇ活性化の使用である。本明細書に提供するのは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）−Ｇタンパク質シグナル伝達経路のＲＡ活性化、ならびにＲＸＲα／Ｇαｑ／１１／ｃ−Ｓｒｃ／Ｓｔａｔ３／Ｎａｎｏｇ経路の同時活性化の使用である。本明細書に提供するのは、ｔＮＳＣにおける多能性の維持のため、形質膜でのシグナル伝達分子としてのＲＸＲαおよびＲＡＲβ機能のヘテロ二量体の使用である。やはり本明細書に提供するのは、多能性および再生の維持のため、Ｎａｎｏｇ過剰発現によるｈＴＳ細胞の神経幹細胞（ＮＳＣ）へのＲＡ誘導性分化の使用である。
[00131]本明細書に記載するｔＮＳＣは、神経発生を補助する、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＲＡＬＤＨ）−２および−３を発現する。本明細書に記載するｔＮＳＣにおけるＲＡＬＤＨの存在およびＣＤ３３の非存在によって、ｔＮＳＣが感覚運動ニューロンへの分化において、ｈＥＳ細胞より優れていることが示される。したがって、本明細書に提供するのは、神経発生および／または再生医薬のための、本明細書記載のｔＮＳＣの使用である。
[00132]線条体および海馬の発生において、増加したＳｒｃキナーゼ活性は、ニューロン分化および増殖のピーク期間と一致する。しかし、ＲＡは、２４時間のインキュベーションによって、リボソームＳ６キナーゼおよびその下流の真核開始因子４Ｂ（ｅＩＦ４Ｂ）のリン酸化を抑制して、多くの細胞タイプで増殖抑止を引き起こしうる。ＲＡは、ｈＴＳ細胞において、１５分で、ｃ−Ｓｒｃ ｍＲＮＡピークの迅速な一過性発現を誘導し（図３ａ）、その後、１時間でｃ−Ｓｒｃタンパク質を産生する（図３ｅ）。１つの態様において、ｃ−Ｓｒｃ ｍＲＮＡは、内部リボソーム進入部位を含有する。別の態様において、ＲＡは、ｅＩＦ４Ｂを一過性に産生し、４時間でピークとなるが、２４時間で徐々に消えていく（図２０ｃ）。この作用は、ｅＩＦ４Ｂ ｓｉＲＮＡを用いることによって阻害された（図２０ｄ）。ｍＴＯＲ／ｅＩＦ４ＥＢＰ１シグナル伝達（ラパマイシン／真核開始因子４Ｅ結合タンパク質１の機械的ターゲット）の関与は排除された（図２０ｂ）。別の態様において、ＲＡは、ｅＩＦ４Ｂを細胞内ｍＲＮＡ局在のために活性化して、ｃ−Ｓｒｃを産生する。
[00133]活性ｃ−Ｓｒｃは、部位Ｔｙｒ７０５のリン酸化によって、Ｓｔａｔ３（シグナル伝達性転写因子）に直接結合して（図２０ｃ）、タンパク質を産生する（図３ｅ）。１つの態様において、この作用は、ｃ−Ｓｒｃ ｓｉＲＮＡを用いることによって阻害される（図２０ｆ）。別の態様において、この作用は、選択的ｃ−Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ−１類似体によって阻害される（図３ｆ）。別の態様において、Ｎａｎｏｇ遺伝子プロモーターに対するＳｔａｔ３の直接作用は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイによって観察される（図３ｇ）。別の態様において、Ｎａｎｏｇは４時間で産生され（図３ｆおよび２０ｆ）、これはＰＰ１類似体（図３ｆ）およびＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ（図２０ｇ）を用いることによって遮断可能であった。
[00134]本明細書に記載するのは、１つの態様において、ｔＮＳＣの多能性を維持する方法であって、細胞を誘導剤に曝露して、非ゲノムｅＩＦ４Ｂ／ｃ−Ｓｒｃ／Ｓｔａｔ３／Ｎａｎｏｇシグナル伝達経路仲介性ｃ−Ｓｒｃ細胞内ｍＲＮＡ局在を調節する工程を含む、前記方法である（図２０ｈ）。別の態様において、誘導剤はＲＡである。
ＲＡおよびＷｎｔシグナル伝達
[00135]本明細書にやはり提供するのは、ｈＴＳ細胞を神経幹細胞に誘導する方法である。１つの態様において、方法は、Ｗｎｔ２Ｂ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路を調節する工程を含む。別の態様において、方法は、ＲＡＲ−Ａｋｔシグナル伝達経路を調節する工程を含む。別の態様において、方法は、Ｗｎｔ２Ｂ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路およびＲＡＲ−Ａｋｔシグナル伝達経路を調節する工程を含む。別の態様において、ｈＴＳ細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）の処理によって誘導される。別の態様において、ｈＴＳ細胞を神経幹細胞に誘導する方法は、転写因子Ｐｉｔｘ２を活性化する工程をさらに含む。別の態様において、ｈＴＳ細胞を神経幹細胞に誘導する方法は、転写因子ネトリン（ＮＴＮ）を活性化する工程をさらに含む。別の態様において、ｈＴＳ細胞を神経幹細胞に誘導する方法は、転写因子Ｐｉｔｘ２およびＮＴＮを活性化する工程をさらに含む。別の態様において、ＲＡＲおよびＲＸＲは、そのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を通じてレチノイン酸応答配列（ＲＡＲＥ）ＤＲ−５に結合するヘテロ二量体として存在する。別の態様において、コリプレッサーはＲＡＲに結合し、そしてヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を補充して、転写抑制を引き起こす。別の態様において、ｈＴＳ細胞を神経幹細胞に誘導する方法は、転写因子Ｐｉｔｘ２およびＮＴＮの活性化をさらに含む。別の態様において、ＲＡをｈＴＳ細胞に添加し、そしてＲＡＲへのＲＡ結合によって転写を活性化する。別の態様において、ＲＡＲはＲＡに結合し、そして次いで、コアクチベーターおよびＨＡＴを補充する。
[00136]ＲＡ仲介性Ｗｎｔシグナル伝達経路は、ｉｎ ｖｉｖｏで成人神経発生および生存中の必須の寄与因子である。神経幹細胞微小環境中に存在するＷｎｔタンパク質は、初期胚発生において細胞性の振る舞いの重要な制御因子であり、そして神経幹細胞強度を維持しうる。成人神経発生において、Ｗｎｔタンパク質は、受容体フリズルド（例えばＦｚｄ６）に結合して、例えば特定のターゲット遺伝子に関するベータ−カテニン／ＬＥＦシグナル伝達を活性化することによって、多くのシグナル伝達カスケードを形質導入する。
[00137]Ｗｎｔシグナルは、神経発生中、細胞周期調節および形態形成に関与する。これらの中で、Ｗｎｔ２Ｂは、網膜ニューロンの分化を阻害可能であり、そして比較インテグロミクス（ｉｎｔｅｇｒｏｍｉｃｓ）分析を用いて、ＮＳＣの幹細胞因子であると示唆されてきている。１つの態様において、Ｗｎｔ２Ｂは、フリズルドファミリー受容体６（Ｆｚｄ６）の発現を調節する。別の態様において、Ｗｎｔ２Ｂは、Ｆｚｄ６の発現を誘導する。別の態様において、Ｆｚｄ６は、Ｗｎｔ２Ｂの存在下で過剰発現される。１つの態様において、ＲＡは、ｈＴＳ細胞におけるドーパミン作動性分化のための古典的Ｗｎｔ２Ｂ／Ｆｚｄ６／β−カテニンシグナル伝達経路を調節する。１つの態様において、ＲＡは、ｈＴＳ細胞におけるドーパミン作動性分化のための古典的Ｗｎｔ２Ｂ／Ｆｚｄ６／β−カテニンシグナル伝達経路を誘導する。
[00138]本明細書に提供する１つの態様は、阻害性ＧＳＫ３βを誘導するとして古典的Ｗｎｔ経路を記載し、これが細胞において核転位置のためのβ−カテニンの安定化を生じる。別の態様において、ＲＡは、Ａｋｔ２の下流エフェクターであるＧＳＫ３βのリン酸化を、Ｔｙｒ２１６部位で迅速に誘導する。別の態様において、ＲＡは、Ｔｙｒ２１６部位でＧＳＫ３βのリン酸化を迅速に誘導し、最初の数時間でβ−カテニンのリン酸化を導き、これが、後の古典的Ｗｎｔ経路の「プライミング」効果として働く。別の態様において、これらの活性化されたＦｚｄ６およびＤｖｌ３は、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）と細胞骨格の相互作用を促進するか、または細胞内Ｃａ２＋レベルを増加させ、これが次に、非古典的Ｗｎｔ／Ｃａ２＋シグナル伝達経路において、シナプス機能のためＣａＭＫＩＩを活性化する。時間が進むにつれ、非古典的から古典的Ｗｎｔ経路への切り換えが起こり、Ｓｅｒ９／２１部位でのＧＳＫ３βのリン酸化に寄与する。１つの態様において、Ｇタンパク質は、初期段階で非古典的Ｗｎｔ２Ｂシグナル伝達の伝達を制御する。別の態様において、古典的Ｗｎｔ２Ｂシグナル伝達は、初期発生ニューロン分化のより後の段階で起こる。
ＨＤＡＣ６
[00139]本明細書にやはり提供するのは、ｈＴＳ細胞を神経幹細胞に誘導する方法であって、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を調節する工程を含む、前記方法である。主に細胞質に位置する酵素であるヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）は、細胞遊走、免疫シナプス形成、ウイルス感染、およびミスフォールディングされたタンパク質の分解を含む、多くの生物学的プロセスを制御する。例えば、ＨＤＡＣ６は、チューブリン、Ｈｓｐ９０およびコルタクチンを脱アセチル化し、そして他のパートナータンパク質と複合体を形成する。
[00140]ＨＤＡＣ６は、β−カテニンを核局在のためにシャトルすることが可能である。１つの態様において、ＨＤＡＣ６は、細胞内分画アッセイによれば、β−カテニンと相互作用し、β−カテニンの核転位置を導く。別の態様において、ＲＡは、新規古典的Ｗｎｔ２Ｂ／Ｆｚｄ６／β−カテニンシグナル伝達経路を誘導し、ｈＴＳ細胞におけるβ−カテニンの核転位置を可能にする。核において、β−カテニンは、重要な遺伝子発現プログラムを仲介する際に、または転写を刺激する多様な転写コアクチベーターのドッキング・プラットホームとして関与する。
ＨＤＡＣ４
[00141]ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）は、機能性ｈＴＳ細胞誘導性神経幹細胞の重要なエピジェネティクス制御因子である。ＨＤＡＣ４は、細胞周期進行を阻害し、そしてニューロンを細胞死から保護する。ＲＡＲによる転写制御は、核コリプレッサーによってＲＡターゲット遺伝子に補充される、ＨＤＡＣによるクロマチン修飾を伴い、ＲＡに対する示差反応を決定する。
ＬＥＦ／ＴＣＦ／Ｐｉｔｘ２
[00142]Ｌｅｆ−１およびＰＩＴＸ２は、ベータ−カテニンを補充してそしてこれと相互作用して、ターゲット遺伝子を活性化することによって、Ｗｎｔシグナル伝達経路において機能する。ＰＩＴＸ２は、Ｌｅｆ−１タンパク質内の２つの部位と相互作用する。さらに、ベータ−カテニンは、ＰＩＴＸ２ホメオドメインと相互作用し、そしてＬｅｆ−１はＰＩＴＸ２ Ｃ末端テールと相互作用する。Ｌｅｆ−１およびベータ−カテニンは、２つの異なる部位を通じてＰＩＴＸ２と同時にそして独立に相互作用して、ＰＩＴＸ２転写活性を制御する。これらのデータによって、示差Ｌｅｆ−１アイソフォーム発現、ならびにＬｅｆ−１およびベータ−カテニンとの相互作用を通じた、細胞増殖、遊走、および細胞分裂におけるＰＩＴＸ２の役割が裏付けられる。
ネトリン１（ＮＴＮ１）
[00143]ＮＴＮ１の分子機構は、軸索ガイダンスおよびニューロン細胞遊走の調節に主に関与すると見なされる。
ＲＡによるＷｎｔ／ＰＳ１／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化およびＧＳＫ３−ベータの阻害
[00144]増加したＷｎｔシグナル伝達は、幹細胞プールを拡大し、そして安定化されたβ−カテニンの発現を強制し、増殖性前駆細胞の数の増加および分化したニューロンの対応する減少のため、大きな脳を生じる（Ｃｈｅｎｎ， Ａ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７， ３６５−３６９， （２００２））。β−カテニンは、接合部タンパク質として、そして古典的Ｗｎｔシグナル伝達において、二重の役割を有し、表現型は、Ｗｎｔシグナル伝達増加（ＮＳＣ自己再生に関連する）または接合部安定性増加による可能性がある。
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達
[00145]本明細書に記載するのは、１つの態様において、ｔＮＳＣの多能性を維持する方法であって、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路を調節する工程を含む、前記方法である。Ｇ−タンパク質ベータ／ガンマヘテロ二量体はまた、ホスホイノシチド−３−キナーゼ、制御サブユニット５（ＰＩ３Ｇ ｒｅｇクラスＩＢ（ｐ１０１））も活性化し、これがホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒性ガンマポリペプチド（ＰＩ３Ｋ ｃａｔクラスＩＢ（ｐ１１０−ガンマ））が仲介するホスファチジルイノシトール４，５−ビホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２）のホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）［３］への変換を導く。ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３は、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ−１（ＰＤＫ（ＰＤＰＫ１））およびＶ−ａｋｔネズミ胸腺腫ウイルス癌原遺伝子相同体１（ＡＫＴ（ＰＫＢ））に直接結合する二次メッセンジャーである。ＰＤＫ（ＰＤＰＫ１）は、ＡＫＴ（ＰＫＢ）をリン酸化し、そしてＡＫＴシグナル伝達を活性化する［４］。
[00146]ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達は、以下の幹細胞系において、自己再生および分化能を制御する。始原生殖細胞（ＰＧＣ）からの多能性胚性生殖（ＥＧ）細胞の派生は、ＰＧＣ特異的Ｐｔｅｎ欠損マウスにおいて増進される（Ｋｉｍｕｒａ Ｔ，ら， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３０： １６９１−１７００， （２００３））。
[00147]Ａｋｔシグナル伝達の条件的活性化を用いると、１つの態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達は、休止幹細胞の活性化において役割を果たすことが示される。別の態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達は、成人表皮における前駆体の増殖において役割を果たす。
[00148]１つの態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達は、培養に適応したこれらの幹細胞における拘束された前駆体の生成よりも、幹細胞の自己再生を促進する。１つの態様において、ＲＡは、ｈＴＳ細胞において、タンパク質ＲＸＲαおよびＲＡＲβをコードする細胞内ｍＲＮＡ翻訳を誘発する、Ａｋｔ３／ｍＴＯＲシグナル伝達の活性化を調節する。１つの態様において、ＲＡは、ｈＴＳ細胞において、タンパク質ＲＸＲαおよびＲＡＲβをコードする細胞内ｍＲＮＡ翻訳を誘発する、Ａｋｔ３／ｍＴＯＲシグナル伝達の活性化を誘導する。別の態様において、誘導剤は、Ａｋｔ３／ｍＴＯＲシグナル伝達の活性化を阻害する。別の態様において、選択的移動およびＲＸＲα／Ｇαｑ／１１およびＲＡＲβ／Ｇβシグナル伝達経路の相互作用は、独立に開始される。
[00149]別の態様において、ＲＡは、多指向性および細胞背景依存性の方式に応じて、細胞機能のための遺伝的プログラム転写活性を制御し；すなわち出力表現型は、ＡＰ−１および／またはベータ−カテニン−ＬＥＦ／ＴＣＦ阻害およびＲＡＲＥ活性化の影響の組み合わせである。
ＧＳＫ３βは微小管集合を制御する
[00150]ｈＴＳ細胞は、ＧＳＫ３βの初期活性化がニューロン分化を促進し、そして後期不活性化が神経発生における前駆体増殖を促進する、主なＧＳＫ３β機能を含む。休止細胞において、ＧＳＫ３の基本的な活性は、一般的に比較的高く、一方、細胞がガイダンスの合図に曝露されると、その特異的活性は、１０分間で３０〜７０％減少しうる。ＧＳＫ３βは、すでにリン酸化されている基質に強い優先性を有し；したがって、古典的Ｗｎｔ２Ｂシグナル伝達においては、先にプライミングされたβ−カテニンは、後の阻害性ＧＳＫ３βに好ましいものとなる。
[00151]１つの態様において、迅速な時空間活性ＧＳＫ３βは、軸索増殖コアに局在するＭＡＰＴをリン酸化し、チューブリンヘテロ二量体の活性化を導き（図２１ａおよび２１ｂ）、これが微小管集合、ニューロン極性、および軸索伸長を促進し、これは軸索微小管集合にＧＳＫ３βの活性化が関与するという概念と一致する。さらに、ＧＳＫ３βはまた、ＣＲＭＰ−２のリン酸化を制御可能であり、微小管集合に寄与し、それによって、ＣＲＭＰ−２はチューブリンヘテロ二量体に優先的に結合し、この二量体はＭＡＰＴのものとは異なるようである。ＣＲＭＰ−２の突然変異体は、ドミナントネガティブ方式で、軸索成長および分枝を阻害する。
[00152]本明細書に提供するのは、１つの態様において、ＧＳＫ−３シグナル伝達がホメオスタシス調節の重要な仲介因子であり、発生中の脳において神経前駆体を制御するというｉｎ ｖｉｖｏでの説明を補助する機械的基礎である。別の態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の最初の局所活性化は、ｈＴＳ細胞において、Ｔｙｒ２１６でのＧＳＫ３βの活性化を誘導する。１つの態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の最初の局所活性化は、Ｅ１８ラット胚から単離された海馬ニューロンにおいて、Ｓｅｒ９／２１リン酸化によって誘導されるＧＳＫ３βの不活性化とは別である。１つの態様において、ＧＳＫ３βの異なる部位でのリン酸化は、時間要因に応じて、異なる細胞運命を生じる。リン酸化されたＧＳＫ３βは、核排出を促進することによって、カルシニューリン誘導性ＮＦＡＴ１のＤＮＡ結合を防止する。ＮＦＡＴは、免疫反応中のＴ細胞におけるサイトカイン遺伝子を含めて、遺伝子転写を促進する際に中心的な役割を果たす。これらの事実は、少なくとも部分的に、ｈＴＳ細胞およびｔＮＳＣがどちらも、ＰＤラットにおいて頭蓋内移植を促進する免疫上の利点を所持するのはなぜかを説明する。
Ｇタンパク質およびニューロン可塑性
[00153]ＮＳＣにおける高い度合いの自律性は、神経発生中、ｍＲＮＡサブセットの選択的局在および翻訳によって、ガイダンスの合図に対する迅速な局所反応を可能にする。ここで、ｍＴＯＲは、典型的には、ＮＳＣにおいて、ｍＲＮＡ翻訳およびリボソーム合成の重要な制御因子をリン酸化することを通じて、タンパク質合成を上方制御する。ｈＴＳ細胞において、活性Ａｋｔ３／ｍＴＯＲシグナル伝達は、ｍＲＮＡ翻訳を誘発して、独立にＲＸＲαおよびＲＡＲβタンパク質を合成し、これがそれぞれ、Ｇαｑ／１およびＧβシグナル伝達経路を活性化する。ここで、局所ＣＲＥＢ１が活性化され、そして転写のためにＴＨ遺伝子を一過性にターゲティングする誘導性遺伝子発現に役割を果たし、神経伝達因子ドーパミンを産生する。樹状突起ＲＮＡ顆粒において、ＲＡがＲＡＲα発現を促進し、そして局所グルタミン酸受容体１（ＧｌｕＲ１）合成を活性化することが示され、ホメオスタシスシナプス可塑性を暗示する。したがって、ＣＲＥＢの上流エンハンサーであるドーパミンＤ１／Ｄ５受容体の活性化は、ニューロンのシナプス部位でのＧｌｕＲ１挿入を誘導可能である。
[00154]本明細書に提供するのは、１つの態様において、ＲＡシグナル関連可塑性の研究のための分子モデルである。
ドーパミン作動性神経発生のための転写因子
[00155]１つの態様において、核におけるβ−カテニンおよびＣＲＥＢ１の相互作用は、ＴＨ転写の主流に相当する。１つの態様において、活性β−カテニンはリンパ系エンハンサー因子１／Ｔ細胞因子１（ＬＥＦ１）に結合し、転写のリプレッサーからアクチベーターへのＬＥＦ１の切り換えを導く。ＬＥＦ１は、次いで、ビコイド関連因子のスーパーファミリーのメンバーであるＰｉｔｘ２を補充し、そしてこれと相互作用する。１つの態様において、ＬＥＦ１は、Ｐｉｔｘ２遺伝子転写を促進する。別の態様において、ＬＥＦ１はＰｉｔｘ３遺伝子を促進する。別の態様において、ＬＥＦ１は、Ｐｉｔｘ３およびＰｉｔｘ２遺伝子転写の両方を促進する。１つの態様において、β−カテニン、Ｐｉｔｘ２、およびＬＥＦ１は相乗的に相互作用して、ＬＥＦ−１プロモーターを制御する。
[00156]さらに、一過性核活性ＮＦＡＴ１は、転写因子として働いて、免疫反応のため、サイトカインおよびＴＮＦ−αを産生する。しかし、この作用は、この場合に起こる可能性は低く、これはリン酸化されたＧＳＫ３βが、核におけるカルシニューリンに誘導されたＮＦＡＴ１のＤＮＡ結合を阻害し、そして核排出を促進することも可能であるためである。したがって、活性細胞質ＮＦＡＴ１は、細胞質転写因子筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）と相互作用し、そしてこれを活性化し（図２２ｃおよび２２ｄ）、これは、この作用がＮＦＡＴ１ ｓｉＲＮＡによって阻害可能であったためである（図２２ｅ）。特に、迅速な誘導性ＣＲＥＢ１は核に進入し、そしてＭＥＦ２Ａ遺伝子を転写し、ＭＥＦ２Ａタンパク質を産生した（図２２ｆ）。ＭＥＦ２Ａは、遺伝子転写で多数の方式で機能可能であり（図２２ｇ）、より多くのＭＥＦ２Ａを産生する自己制御を通じた自身の転写、ドーパミン作動性特定のためのＴＨ遺伝子転写、ＳＮＣＡ／ＭＡＰＴ／パーキン複合体形成のためのＳＮＣＡ遺伝子の転写、ならびにＥＰ３００およびＰｉｔｘ２との相互作用が含まれ、これは、ＭＥＦ２Ａ ｓｉＲＮＡによって阻害された（図２２ｈ）。
[00157]１つの態様において、活性ＥＲ３００は、ＨＤＡＣ６遺伝子およびＴＨ遺伝子をターゲティングする。１つの態様において、活性ＥＲ３００はＨＤＡＣ６遺伝子をターゲティングする。別の態様において、活性ＥＲ３００はＴＨ遺伝子をターゲティングする。１つの態様において、活性ＥＲ３００はＨＤＡＣ６遺伝子およびＴＨ遺伝子の転写を促進する。別の態様において、活性ＥＲ３００はＨＤＡＣ６遺伝子およびＴＨ遺伝子の転写を阻害する。別の態様において、ＨＤＡＣ６は核転位置のため、β−カテニンを輸送する。
[00158]本明細書に提供するのは、１つの態様において、ＴＨ遺伝子転写のために形成され、そして運命づけられる実行転写複合体の性質決定である。例えば、ＣＲＥＢ１、ＥＰ３００、およびＭＥＦ２Ａは、ＴＨ遺伝子のプロモーターをターゲティング可能であり、一方、β−カテニン、ＬＥＦ１、およびＰｉｔｘ２は、転写プロセス中のエンハンサーのコアクチベーターとして実行する。本明細書に提供するのは、１つの態様において、これらの遺伝子が、ドーパミン作動性ＮＳＣにおいて分化および増殖間のバランスをどのように制御するかを理解する方法であり、これは疾患機構（例えばＰＤ）の評価のための暗示を有する。
ＣａＭＫＩＩの多様な面
[00159]ＮＳＣ発生において、電位開口型カルシウムチャネルまたは神経伝達分子受容体いずれかを通じた局所カルシウム流入は、ＣａＭＫＩＩの活性化を生じ、いくつかのメッセージを先に送達する。１つの態様において、時空間ＣａＭＫＩＩは、活性化されたｅＩＦ４Ｂを通じてｃ−Ｓｒｃ ｍＲＮＡ局在を誘発し、ｃ−Ｓｒｃタンパク質を合成して、興奮−転写カップリングのため、ｈＴＳ細胞における自己再生および増殖のためのＮａｎｏｇ活性化を生じる。別の態様において、ＣＡＭＫＩＩは、局所ＣＲＥＢ１の活性化を誘発し、転写のため遺伝子ＭＥＦ２Ａをターゲティングする、核への逆行性の追跡を導く。ＭＥＦ２Ａは、ニューロン分化および増殖においてのみではなく、骨格筋および心筋発生においても細胞性の機能を仲介する。１つの態様において、ＣａＭＫＩＩはＭＡＰＴ仲介パーキンタンパク質を活性化し、そして次に、ＭＡＰＴが微小管集合のため、チューブリンヘテロ二量体を活性化する（図２２ａおよび２２ｊ）。これらの結果は、初期時空間ＣａＭＫＩＩシグナルが、初期発生中のＮＳＣにおいて微小管集合、ニューロン遊走、およびニューロン分極を促進するチューブリンの活性化に十分であり、脳における線条体ターゲットとの適切な連結性を確実にすることを示唆する。
[00160]Ｌ型カルシウムチャネルは、別の方式で、ホメオスタシスのため、細胞内カルシウムを制御し、成人ＮＳＣにおいて、興奮−神経発生に関与する。塩化カリウム（ＫＣｌ）レベルの上昇は、膜脱分極を導き、Ｌ型電位感受性カルシウムチャネルを通じたカルシウム流入を生じ、これはニューロンにおいてＥＲおよびミトコンドリア間のクロストークを通じて、ミトコンドリア機能不全を誘導するのに十分である。１つの態様において、ＲＡは、Ｌ型カルシウムチャネルと関連する細胞内ＥＲカルシウムを調節する。
[00161]Ｌ型Ｃａ２＋チャネルの下流エフェクターであるＣａＭＫＩＩ（カルモジュリン（ＣａＭ）依存性プロテインキナーゼＩＩ）は、一過性低振幅カルシウムスパイクに反応して、Ｃａ２＋／カルモジュリンに対する、より低いアフィニティを示す。１つの態様において、ＲＡはＣａＭＫＩＩの時空間活性化を調節する。別の態様において、ＲＡは、ＣａＭＫＩＩの時空間活性化を誘導する。別の態様において、ＲＡは、ＣａＭＫＩＩの時空間活性化を阻害する。
[00162]ＣａＭＫＩＩは、ＩＰアッセイによれば、ＣＲＥＢ１を直接リン酸化し、そして活性化し（図２１ｃ）、これは、興奮−転写カップリングにおいて、ＣａＭＫＩＩがＬ型カルシウムチャネル活性を局所的にコードし、核ＣＲＥＢにシグナルを伝達するという先の研究と一致する。軸索は、特異的タンパク質合成をコードする多様なｍＲＮＡを局所的に含有し、これには、発生中のニューロンにおけるＣａＭＫＩＩ、カルシニューリンおよびＣＲＥＢ１が含まれ、これらが真核開始因子４Ｂ（ＥＩＦ４Ｂ）ｓｉＲＮＡによって阻害可能である（図２１ｄ）ため、外因性ＲＡが誘発するｍＲＮＡ翻訳機構が起こっていることが示唆される。したがって、この局所ＣＲＥＢ１は、遠位軸索のシグナルに関与する、核における特定の転写プロセスの逆行性追跡を可能にする。これらの結果は、細胞外の合図に際して、遺伝子転写が迅速に誘導されることが示唆された。
[00163]これらの結果は、まず、Ｇαｑ／１１シグナルに由来するＣａＭＫＩＩ興奮が、ｔＮＳＣの自己再生の維持に関与することを調べた。合わせると、これらの結果は、初期神経発生における軸索の振る舞いの重要性を示唆した。ＳＮＣＡはリン脂質膜と相互作用し、そしてＰＤおよびアルツハイマー病を含む神経変性障害の病因において、非常に重要な役割を果たす。
カルシニューリン／ＮＦＡＴ１シグナル伝達
[00164]１つの態様において、ＲＡはカルシニューリンの産生を調節する。１つの態様において、ＲＡはカルシニューリンの産生を誘導する。別の態様において、ＥＲカルシウムは、先の研究と一致して、カルシニューリン／ＮＦＡＴ１シグナル伝達に関連づけられる。別の態様において、細胞分画アッセイによれば、ＲＡは、ＮＦＡＴ１および核細胞質輸送体であるインポーチンの一過性相互作用を誘導し、ＮＦＡＴ１核転位置を導く。ＮＦＡＴ１のこの一時的効果は、持続性および一過性カルシウムシグナル間を細胞が区別する１つの機構であると考えられる。１つの態様において、ＲＡ誘導性カルシニューリン／ＮＦＡＴ１シグナル伝達は、初期神経発生に関与する。
初期神経発生での細胞リモデリング
[00165]本明細書に提供するのは、１つの態様において、ｈＴＳ細胞のｔＮＳＣに向かう移行中、分子プロセスを誘導するための方法である。１つの態様において、分子プロセスはＲＡによって誘導される。１つの態様において、分子カスケードを２つの時点：４時間（初期）および２４時間（後期）で調べる。１つの態様において、分子事象は２期で起こる。特定の態様において、１期には、形態形成における時空間反応が含まれる（例えば図２３；初期；灰色の線）。別の特定の態様において、１期には細胞分化および増殖における遺伝子転写が含まれる（例えば図２３；後期；黒い線）。
[00166]１つの態様において、初期ニューロン形態形成における機構が特徴付けられる。幹細胞が外部ガイダンスシグナルを感じ取ると、これに反応して、多様な特異的細胞内ｍＲＮＡ局在が、核における遠い転写プロセスを超えて、特定のタンパク質の局所作製を開始する。タンパク質−タンパク質相互作用および「感覚経験」を通じて、これらの局所タンパク質は細胞内領域に集積して、初期発生ＮＳＣにおいて成長円錐形成を開始する。遺伝子転写に付随して、非対称分裂が始まる。例えば、β−カテニンの存在は、５分間のＲＡ処理後にシナプス膜で可視であり（図２３ｇ）、そして局所で活性化されたＣＲＥＢ１は、核に戻るように移動して、転写のため、遺伝子ＭＥＦ２Ａをターゲティングする。
[00167]１つの態様において、限定されるわけではないが、ＲＸＲα、ＲＡＲβ、β−カテニン、Ａｋｔ、ＣＲＥＢ１、ｍＴＯＲ、ＣａＭＫＩＩ、カルシニューリン、ｃ−Ｓｒｃ、ＧＳＫ３β、ＳＮＣＡ、およびＭＡＰＴを含む、一連の分子プロセスが相乗的に起きて、ミトコンドリア機能、膜の脂質代謝、軸索成長、ニューロン遊走および可塑性、ならびに微小管集合を制御する。別の態様において、ＭＥＦ２Ａ、ＥＰ３００、およびＣＲＥＢ１でのＴＨ遺伝子の転写は、誘導性遺伝子発現に相当し、これは染色体テリトリーからのクロマチンループ形成を誘導し、後期遺伝子転写を促進する。別の態様において、ＲＡ誘導性Ｇタンパク質シグナル伝達の構成要素は、ニューロン形態形成において、そしてまたＴＨ遺伝子の転写を活性化する際の組込み部分において、重要な役割を果たす。
[00168]本明細書に記載するのは、ｔＮＳＣの定常状態を維持する分化および増殖間の平衡である。１つの態様において、神経分化は、ＲＡシグナル伝達を調節することによって、調節される。ｈＴＳ細胞の操作は、これらの制御機構の理解を通じて、再生医薬または薬剤発見におけるさらなる適用の前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでより効率的に可能である。
ｔＮＳＣは免疫特権を所持する
[00169]本明細書に提供する１つの態様は、細胞が免疫特権を有する少なくとも１つのｔＮＳＣを用いて、神経学的障害を治療する方法を記載する。別の態様において、ｔＮＳＣは免疫反応を誘発しない。別の態様において、ｔＮＳＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ミクログリア、ＮＫ細胞、またはマスト細胞からの免疫反応を誘発しない。別の態様において、ｔＮＳＣは免疫反応を阻害する。別の態様において、ｔＮＳＣは減少した免疫原性を有する。別の態様において、ｔＮＳＣは、腫瘍形成を導かない。別の態様において、ｔＮＳＣは、免疫特権を有するように設計される。本明細書に提供する別の態様において、ｔＮＳＣ細胞集団を用いて神経学的障害を治療する方法であって、細胞が免疫特権を有する、前記方法を記載する。別の態様において、細胞療法としての幹細胞またはその誘導体の適用は、移植後の免疫抑制剤の適用の決定を補助する免疫原性の理解から利益を得る。
[00170]本明細書に記載する別の側面は、ｈＴＳ細胞、ｔＮＳＣおよびｈＥＳ細胞の間の免疫関連遺伝子およびマーカーの発現を調べ、そして比較する方法である。１つの態様において、発現をフローサイトメトリー分析によって調べる。
[00171]ｈＴＳ細胞、ｔＮＳＣおよびｈＥＳ細胞の間の免疫関連遺伝子およびマーカーの例には、限定されるわけではないが、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０５、およびＣＤ１３３が含まれる。別の態様において、ｈＴＳ細胞およびｔＮＳＣにおけるＨＬＡ−ＡＢＣの発現は、ｈＥＳ細胞におけるものと比較してｔＮＳＣでより高い。１つの態様において、ＨＬＡ−ＤＲの陰性発現は３つの幹細胞すべてで観察される（図２ｅ）。別の態様において、ｈＴＳ細胞（９９．４％）およびｔＮＳＣ（９９．７％）におけるＨＬＡ−ＡＢＣの発現は、ｈＥＳ細胞におけるもの（１２．９％）に比較して、ｔＮＳＣではるかに高かった（図２ｅ）。別の態様において、ｈＴＳ細胞、ｔＮＳＣおよびｈＥＳ細胞の間で、ＣＤ１４およびＣＤ４４発現の相違はまったく見られなかった。別の態様において、ｈＥＳ細胞における陰性発現レベルに比較して、高レベルのＣＤ７３がｈＴＳ細胞およびｔＮＳＣで発現された（図２ｆ）。１つの態様において、ｔＮＳＣは、間葉系幹細胞の特徴を所持し、これはグリア細胞の増殖のために好ましい。
[00172]別の態様において、細胞外部分で免疫グロブリン構造を含有し、そして膜貫通受容体であるＣＤ３３は、ｈＴＳおよびｈＥＳ細胞で発現されるがｔＮＳＣでは発現されない（図２ｆ）。別の態様において、ｔＮＳＣにおけるＣＤ３３の非存在は、該分子が免疫防御に関与するため、細胞療法には好ましい。したがって、本明細書に提供するのは、低レベルのＣＤ３３発現を有し、そしてそれによって低い免疫原性を有するｔＮＳＣである。
[00173]１つの態様において、間葉系幹細胞マーカーＣＤ１０５の発現においては、強度の相違は見られない。別の態様において、ｈＴＳ細胞およびｈＥＳ細胞に比較して、ｔＮＳＣにおいて、癌幹細胞マーカーＣＤ１３３の低レベル発現が見られる。別の態様において、ｈＴＳ細胞（９３．６％）およびｈＥＳ細胞（９８．８％）に比較して、ｔＮＳＣにおいて、癌幹細胞マーカーＣＤ１３３の低レベル発現（１１．８％）が見られる（図２ｈ）。したがって、本明細書に提供するのは、ＣＤ１３３の低レベルの発現を有し、そしてしたがって低い腫瘍原性を有するｔＮＳＣである。
[00174]さらに本明細書に提供するのは、幹細胞療法のための移植および組織再生に有用な、ＣＤ１３３＋ ｔＮＳＣの選択的集団である。やはり本明細書に提供するのは、免疫特権状態を有するｔＮＳＣであり、これは細胞に基づく療法の実行可能な候補である。
[00175]１つの態様において、ＲＡは、免疫関連マーカーの発現変化を誘導し、例えばＣＤ３４（＋）細胞は増加するが、ＣＤ１３３（＋）は減少する。別の態様において、ＲＡは、ＣＤ３４（＋）ｈＥＳ細胞の平滑筋前駆細胞への分化を誘導する。別の態様において、ＣＤ３４（＋）免疫選択移植片でのｔＮＳＣの自己移植は、高リスクの神経芽細胞腫を持つ小児において実行可能である。
移植後分化および増殖
[00176]神経発生において、ＲＡおよびレチノイン酸応答配列（ＲＡＲＥ）間の関連（Ｍａｄｅｎ， Ｍ．ら， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ８， ７５５−７６５， （２００７））が知られているが、非ＲＡＲＥ作用の存在はほとんど理解されていない。１つの態様において、ＲＡは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）シグナル伝達の「引くおよび押す」機構を通じて、ＲＸＲα／ＲＡＲβ／ｃ−Ｓｒｃ複合体の活性化を誘導する。別の態様において、ＲＸＲαは、まず、Ｇαｑ／１１との相互作用によって、その後、ｃ−Ｓｒｃおよびその後の２時間のＲＸＲβの活性化によって活性化されて、複合体を形成する（図３ａおよび３ｂ）。それらの中で、ｃ−Ｓｒｃは、続いて、これらのｈＴＳ細胞由来ＮＳＣの多能性および自己再生の維持のため、Ｓｔａｔ３を通じてＮａｎｏｇ過剰発現を誘導する。
[00177]このシグナル伝達経路は、古典的ＲＡ／ＲＸＲ／ＲＡＲ／ＲＡＲＥ経路を誘発するのにＲＡが細胞に進入する必要はなく、その代わり、ＲＡは、シグナル伝達の概念と適合して、ＧＰＣＲシグナル伝達を通じて、Ｇタンパク質Ｇαｑ／１１を活性化することを暗示する。したがって、本明細書に提供するのは、１つの態様において、ＮＳＣの多能性および自己再生の、ＲＡが仲介する制御の調節のための方法、ならびに移植前および後のｈＴＳ細胞および／または神経幹細胞の操作である。別の態様において、ＷｎｔおよびＲＡは、近位プロモーターにおいて、それぞれ、非典型的なＲＡＲＥおよびＬｅｆ／転写因子（Ｔｃｆ）応答配列（ＬＲＥ）を通じて、尾側ホメオボックス１（Ｃｄｘ１）に影響を及ぼす。
[00178]１つの態様において、ＲＡは、古典的ＲＡ／ＲＡＲＥシグナル伝達経路を通じて、ドーパミン作動性ＮＳＣへのｈＴＳ細胞分化を誘導して、幹細胞特性を維持する。別の態様において、これは、機能性ドーパミン作動性ＮＳＣを生じるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達カスケードの活性化を通じた、非ＲＡＲＥシグナル伝達経路である。別の態様において、非ＲＡＲＥシグナル伝達の損傷は、ドーパミン産生の機能不全または喪失を引き起こし、ドーパミン作動性ニューロンの進行性変性変化を生じる。したがって、本明細書に提供するのは、別の態様において、非ＲＡＲＥシグナル伝達経路の活性化を通じて、ドーパミン作動性ニューロンに分化する神経幹細胞である。
[00179]ＲＡは、６時間で、ＲＡＲ−β発現誘導前に、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）経路を活性化する。ＲＡは、２分で、細胞内ジアシルグリセロール（ＤＧ）の一過性の１．３倍の増加を引き起こし、そして５分以内にＰＫＣのガンマアイソザイム（ＰＫＣ−γ）の転位置を引き起こす。Ｋｕｒｉｅ Ｊ．Ｍ．ら， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９３， １１７９（２）：２０３−７。これらの知見は、ＰＫＣ経路活性化が、ＲＡ仲介性ヒトＴＣ分化において初期段階であり、そしてＰＫＣ−γが、ＲＡのＲＡＲ転写活性化に対する影響を増強しうることを明らかにする。したがって、本明細書に提供するのは、ｈＴＳ細胞分化を調節する方法である。１つの態様において、ＰＫＣシグナル伝達経路の調節は、ｈＴＳ細胞分化を調節する。
[00180]骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）は、ＬＩＦとともに、未分化ｍＥＳ細胞の拡大を補助する。ＢＭＰ４は、ｈＥＳ細胞のトロホブラスト分化を誘導する。Ｑｉ Ｘら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００４； １０１ ：６０２７−６０３２。Ｉｄタンパク質のＢＭＰ誘導は、ＳＴＡＴ３と共同で分化を抑制し、そして胚性幹細胞自己再生を維持する。Ｙｉｎｇ， Ｑ． Ｌ．ら， Ｃｅｌｌ． ２００３； １１５：２８１−２９２。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ＬＩＦと組み合わされて作用して、自己再生を維持し、そして多系譜分化、キメラコロニー形成、および生殖系列伝達特性を保持する。Ｘｕ ＲＨら， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００２； ２０：１２６１−１２６４。したがって、本明細書に提供するのは、１つの態様において、ＰＫＣおよび／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の調節によって、本明細書記載のｔＮＳＣのドーパミン作動性分化を誘導するための方法である。
疾患の治療
[00181]本明細書に提供するのは、障害を治療する方法であって、純粋なニューロン集団または特定の神経幹細胞集団の複合体を患者に移植する工程を含み、患者はこうした治療の必要がある、前記方法である。１つの態様において、患者は神経学的疾患と診断されている。別の態様において、患者は精神神経障害と診断されている。別の態様において、患者は神経変性障害と診断されている。別の態様において、ニューロンの純粋な集団は、ドーパミン作動性ニューロンを含む。
[00182]本明細書記載の任意の方法を用いて、疾患または障害を治療することも可能である。１つの態様において、疾患は、神経学的疾患である。別の態様において、疾患は神経変性疾患または障害である。神経学的障害の限定されない例には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ失調症、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症、統合失調症、麻痺、多発性硬化症、脊髄傷害、脳傷害（例えば脳卒中）、脳神経障害、末梢性感覚ニューロパシー、癲癇、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルパース病、小脳／脊髄小脳変性、バッテン病、皮質基底核変性、ベル麻痺、ギラン−バレー症候群、ピック病、および自閉症が含まれる。
[00183]したがって、本明細書記載のｔＮＳＣは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄傷害、緑内障等を含み、そしてこれらに限定されない神経変性障害の治療に適している。
[00184]さらに、ｔＮＳＣはまた、神経伝達分子セロトニンも発現する。したがって、１つの態様は、精神神経障害の治療におけるｔＮＳＣの使用を記載する。精神神経傷害の限定されない例には、抑鬱、統合失調症、認知症、自閉症、注意欠陥多動障害、および双極性障害が含まれる。
[00185]本明細書記載の任意の方法を用いて、神経学的疾患または障害の症状を軽減するかまたは改善することも可能である。神経学的疾患または障害に関連する症状の限定されない例には、振戦、歩行障害、位置異常歩行（ｍａｌｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｇａｉｔ）、認知症、過剰膨張（浮腫）、筋力低下、下肢萎縮、運動障害（舞踏病）、筋硬直、身体運動の緩慢化（動作緩慢）、身体運動の喪失（無動症）、物忘れ、認知（知的）損傷、認識喪失（失認）、意志決定および計画などの機能障害、片側顔面麻痺、感覚消失、しびれ、刺痛、極端な異常痛覚、脱力感、脳神経麻痺、発話困難、目の運動、視野欠損、失明、出血、滲出物、近位筋肉消耗、ジスキネシア、四肢の筋肉の緊張異常、筋緊張の減少、協調運動障害、指−指試験または指−鼻試験における誤った表示、測定障害、ホームズ−スチュワート現象、不完全または完全全身麻痺、視神経炎、複視、眼振などの眼球運動障害、痙性麻痺、有痛性強直性痙攣発作、レルミット症候群、運動失調、言語障害、膀胱直腸障害、起立性低血圧、運動機能の減少、夜尿、言語化障害、睡眠パターン障害、睡眠障害、食欲障害、体重変化、精神運動激越または遅延、活動力減退、倦怠感または過剰なもしくは不適切な罪悪感、思考または集中困難、死または自殺念慮または試みの反復、恐怖、不安、怒りやすさ、くよくよすることまたは強迫的熟考、身体的健康に関する過剰な懸念、パニック発作、および恐怖症が含まれる。
[00186]本明細書に記載するのは、特定の望ましい特性を有するｔＮＳＣである；まず、ｔＮＳＣは、表現型が均質で、安定遺伝子発現および多能性特性を持つ、不均一なサブタイプで構成される混合細胞集団である；第二に、これらは、ドーパミン作動性神経発生を実質的に増強する、グリア前駆細胞およびアストロサイトを含有する；第三に、これらは、機能不全ドーパミン作動性ニューロンおよび免疫特権特性を「レスキュー」する本質的能力を所持する；そして最後に、宿主組織に対する、異なる神経前駆体から分泌される神経栄養効果は、構造修復を促進するであろう。
[00187]本明細書に提供するのは、いくつかの態様において、移植療法において適切な操作を可能にする、特定の望ましい特性を有するｔＮＳＣである：１）ユニークなｔＮＳＣは、質の均一さおよび豊富な細胞供給源に関して、単純に、そして効率的に、ＲＡによって誘導され；２）移植されたｔＮＳＣは、病変黒質経路において、機能的に、新規ドーパミン作動性ニューロンを生成し、これは少なくとも移植後１８週間生存可能であり、３）感覚運動損傷は、早くも移植後３週間で有意に改善され；４）ｔＮＳＣは、免疫特権を所持し、幹細胞療法を促進し；５）本明細書に記載するような細胞増殖における分子機構の操作によって、移植後の腫瘍形成を防止する戦略の開発が可能になり；６）ｔＮＳＣは数回の細胞継代を通じて、培養中で増殖可能であり；そして７）ｔＮＳＣは、マウス胚性フィーダー細胞を含まずに培地中で培養可能である。
[00188]本明細書に提供するのは、１つの態様において、急性および慢性疾患を治療する方法であって、ｈＴＳ細胞由来ｔＮＳＣの移植を含む、前記方法である。１つの態様において、ｔＮＳＣは、神経学的障害を患う患者の脳内に移植される。別の態様において、ｔＮＳＣは、神経学的障害を患う患者の線条体に移植される。
[00189]本明細書に記載する１つの側面は、神経学的疾患を治療する方法であって、ｔＮＳＣの部位特異的組込みを含む、前記方法である。１つの態様において、ｔＮＳＣは、ｈＴＳ細胞由来である。別の態様において、腫瘍形成の可能性は、ｈＥＳ細胞療法に比較してより低い。
ドーパミン作動性ニューロンの再生による神経変性疾患の治療
[00190]本明細書に提供するのは、哺乳動物においてドーパミン作動性ニューロンを誘導するための方法であって、本明細書記載のニューロン前駆細胞を、細胞懸濁物として移植して、それによって、組織の塊の移植と比較してより均質な神経再生を産生する、前記方法である。１つの態様において、本明細書に記載するようなドーパミン作動性ニューロンの誘導は、ジスキネジアのリスクを減少させ、そして臨床的に有益な効果の可能性を増加させる。１つの態様において、哺乳動物はヒトである。別の態様において、哺乳動物はラット、マウス、ブタ、イヌ、サル、オランウータンまたは類人猿である。
[00191]ｔＮＳＣの移植は、黒質線条体経路において、新規に生成されたドーパミン作動性ニューロンを誘導し、そしてパーキンソンラットにおいて行動損傷を実質的に改善する。これらの結果は、ｈＴＳ細胞が、神経変性疾患を治療する臨床的適用において使用するのに適したヒト多能性幹細胞であることの証拠を提供する。
[00192]第一の実験を行って：１）異なる期間、ＲＡで処理したｔＮＳＣが、ＰＤラットにおいて、行動欠陥の改善において、有効性に影響を及ぼすかどうか、そして；２）こうして移植されたｔＮＳＣがどのくらい長期間、脳で生存可能であるかを調べる。アポモルフィン誘導性回転アッセイによって、病変線条体の２つの部位内へのＧＦＰタグ化ｔＮＳＣの移植（１．５ｘ１０６）は、第３週から１２週まで、行動欠陥を有意に改善した（図５ａ）。５日間のＲＡで誘導されたｔＮＳＣを移植されたＰＤラットは、移植６週間後から有意に改善したが、この効果は、その後、１２週で、対照のものと同程度まで失われた。理由は、５日間に渡る誘導後、神経遺伝学的に運命を制限されたＧＲＰ（Ｇｏｔｚ）の大部分が、未定義のトロホブラスト巨細胞に分化する際、隆線に配置されることによって説明可能である。行動の改善を考慮して、ＧＦＰタグ化ｔＮＳＣの生存度を調べるため、ラットを１８週で屠殺した。脳切片によって、黒質線条体経路において、新規に生成されたドーパミン作動性ニューロンが豊富に明らかとなり、細胞体からは多数の伸長突起が見られ、周囲の脳領域で免疫組織化学的に神経再分布が見られた（図５ｂ）。しかし、こうした現象は５日間のＲＡ誘導性ｔＮＳＣを投与されたラット（図５ｃ）および対照ＰＤ群（図５ｄ）では観察されなかった。免疫蛍光顕微鏡観察によって、第１８週、ＧＦＰタグ化ｔＮＳＣがなお、病変領域に存在し、分散されたまたは斑状のパターンで注入部位に分布することが示された。奇形腫形成は見られず、また免疫抑制剤は用いられなかった。
[00193]ドーパミン作動性過成長および不均一でそして斑状の神経再分布による不都合な影響を回避するため、「加齢」ＰＤラット（ｎ＝１６；体重、６３０〜４９０グラム）において、病変線条体への１つの部位での注射によって、より少ないｔＮＳＣ（１ｘ１０６）を移植する第二の実験を試みた。移植後、３週ごとに、行動評価を分析した。結果によって、アポモルフィン誘導性回転試験において、移植後３週間から１２週間、対側性の回転の有意な改善があることが示された（図６ａ）。無動症、硬直ならびに歩行および平衡障害によって特徴付けられる、体位不均衡および歩行障害（ＰＩＧＤ）における細胞療法の効果を評価するため、歩行速度、ステップ長、ストライド長、および支持基底面などのいくつかの試験を行った。「バーテスト」において、バー上での罹患した前肢の把握時間は、３週までに有意に短くなり、そして１２週の終わりで改善し続け（図６ｂ）、前肢の掴む力が非常に迅速に改善したことが示された。ステップ長（図６ｃ）、ストライド長（図６ｄ）、歩行速度（図６ｅ）および支持基底面（図６ｆ）の測定は、ｔＮＳＣの移植が、早期の３週から１２週に向かって、機能的に感覚運動障害を有意に改善することを示した。１つの態様において、ｔＮＳＣは、再生医薬において、神経変性疾患（例えばパーキンソン病）患者における幹細胞に基づく療法の適切な候補である。１２週の終わりに、ラットを屠殺し、そして脳切片をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫染色に供した。実験によって、黒質線条体経路において、新規ドーパミン作動性ニューロンの再生が示された（図１９）。濃度測定を用いることによって、新規に生成されたドーパミンニューロンを評価して、２８．２％の回復が明らかになった。１つの態様において、ｔＮＳＣは、神経変性疾患患者の治療における、ｈＥＳ細胞および胎児中脳組織両方の代替置換物である。
[00194]本明細書に提供するのは、１つの態様において、ｈＥＳ細胞ではないが、初期胚形成における多能性および自己再生の類似の特徴を持つヒト多能性幹細胞であるｈＴＳ細胞である。ｉｎ ｖｉｖｏで、移植ｔＮＳＣは、病変黒質線条体経路において、新規ドーパミン作動性ニューロンを機能的に生成し、これはＰＤラットにおいて移植後少なくとも１８週間生存可能である。感覚運動損傷は、若いおよび加齢ＰＤラット両方において、行動評価のセットによって、早くも移植後３週間で有意に改善する。ｈＴＳ細胞由来ＮＳＣを、脳の神経毒除神経線条体内に移植すると、失われたドーパミン作動性ニューロンの再生が可能になり、そしてＰＤラットにおける主な行動欠陥が改善する。
[00195]１つの態様において、黒質線条体経路においてＤＡニューロンが再生する。別の態様において、移植されたｔＮＳＣは、線条体において、グリア細胞を増加させる。別の態様において、ＲＡは、ＧＲＡＰおよびＧＦＡＰ陽性前駆細胞の発現を誘導し、ＣＮＳを通じて、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトを生じさせる。
アルツハイマー病の治療
[00196]本明細書に提供するのは、アルツハイマー病を治療するための方法であって、哺乳動物脳内にニューロン前駆細胞を移植する工程を含む、前記方法である。１つの態様において、哺乳動物はヒトである。別の態様において、ヒトは、アルツハイマー病と診断された患者であるか、またはアルツハイマー病を発展させるリスクがあり、例えば該疾患の家族歴がある個人または該疾患のリスク要因を有すると同定されている個人である。別の態様において、哺乳動物は、ブタ、イヌ、サル、オランウータンまたは類人猿である。別の態様において、哺乳動物はマウスである。別の態様において、哺乳動物はラットである。別の態様において、ラットまたはマウスは、アルツハイマー病の症状を提示する。１つの態様において、ニューロン前駆細胞は、疾患の非ヒト動物モデル（例えばＡＤ７ｃ−ＮＴＰが過剰発現されているマウスモデル、アルツハイマー病ラットモデル、トランスジェニックマウスモデル等）に移植される。
[00197]１つの態様において、ｈＴＳ細胞を誘導剤で処理して、バイオマーカー・シグネチャーを持つニューロン細胞集団を提供する。特定の態様において、誘導剤はＲＡである。１つの態様において、分子機構またはシグナル経路を調節して多能性を維持する。別の態様において、分子機構またはシグナル伝達経路を調節して、移植後の腫瘍形成を防止する。
[00198]別の態様において、哺乳動物の脳内に、ｔＮＳＣを移植するかまたは挿入する。１つの態様において、ニューロン前駆細胞を細胞懸濁物として移植して、それによってより均質な再神経形成を生じる。別の態様において、ニューロン前駆細胞を前記哺乳動物の脳内に注射する。別の態様において、ｈＴＳ細胞由来のｔＮＳＣを脳の脳室下領域内に挿入する。１つの態様において、哺乳動物はヒトである。
[00199]１つの態様において、本明細書記載のニューロンの誘導は、腫瘍形成リスクを減少させ、そして臨床的に有益な効果の可能性を増加させる。別の態様において、ｔＮＳＣのレシピエントは、アルツハイマー病に関連する症状の改善を示す。別の態様において、脳におけるニューロン間の連結が増加し、そして強化される。
統合失調症の治療
[00200]本明細書において提供するのは、統合失調症を治療するための方法であって、哺乳動物脳内にニューロン前駆細胞を移植する工程を含む、前記方法である。１つの態様において、哺乳動物はヒトである。別の態様において、ヒトは、統合失調症と診断された患者であるか、または統合失調症を発展させるリスクがあり、例えば該疾患の家族歴がある個体または該疾患のリスク要因を有すると同定されている個体である。別の態様において、哺乳動物はマウスである。別の態様において、哺乳動物はラットである。別の態様において、哺乳動物は、ブタ、イヌ、サル、オランウータンまたは類人猿である。別の態様において、ラットまたはマウスは、統合失調症の症状を提示する。
[00201]１つの態様において、ニューロン前駆細胞は、疾患の非ヒト動物モデル（例えば統合失調症ラットモデル、トランスジェニックマウスモデル等）に移植される。１つの態様において、モデルマウスは、ニューロン系の改変された正常生理学的制御を有する。別の態様において、細胞内レベルで作用する潜在的な療法剤および／または療法措置のスクリーニングのため、モデル動物または組織を利用してもよい。
[00202]１つの態様において、ｈＴＳ細胞を誘導剤で処理して、バイオマーカー・シグネチャーを持つニューロン細胞集団を提供する。特定の態様において、誘導剤はＲＡである。１つの態様において、分子機構またはシグナル経路を調節して多能性を維持する。別の態様において、分子機構またはシグナル伝達経路を調節して、移植後の腫瘍形成を防止する。
[00203]別の態様において、哺乳動物の脳内に、ｔＮＳＣを移植するかまたは挿入する。１つの態様において、ニューロン前駆細胞を細胞懸濁物として移植して、それによってより均質な再神経形成を生じる。別の態様において、ニューロン前駆細胞を前記哺乳動物の脳内に注射する。
[00204]１つの態様において、本明細書記載のニューロンの誘導は、腫瘍形成リスクを減少させ、そして臨床的に有益な効果の可能性を増加させる。別の態様において、ｔＮＳＣのレシピエントは、統合失調症に関連する症状の改善を示す。
投薬および投与
[00205]本明細書に記載する単離神経幹細胞調製物の投与様式には、限定されるわけではないが、全身性静脈内注射および意図される活性部位への直接注射が含まれる。調製物を、好適な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって投与してもよく、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与してもよい。１つの態様において、投与は全身性局在投与である。
[00206]１つの態様において、神経幹細胞調製物または組成物は、ヒトを含む哺乳動物への静脈内投与に適合する薬学的組成物として配合される。いくつかの態様において、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物にはまた、注射部位でのいかなる痛みも軽減する、局所麻酔剤も含まれる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入瓶を用いて分配してもよい。組成物を注射によって投与する場合、注射用無菌水または生理食塩水のアンプルを提供して、投与前に成分を混合するようにしてもよい。
[00207]１つの態様において、適切な薬学的組成物は、前駆体幹細胞の療法的有効量および薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む。こうしたキャリアーには、限定されるわけではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、およびその組み合わせが含まれる。
[00208]１つの態様において、特定の組織に細胞をターゲティングするのに適した送達系によって、本明細書記載の単離ｔＮＳＣをターゲット部位（例えば脳、脊髄または神経傷害および／または変性の任意の他の部位）に送達する。例えば、ターゲット部位で細胞（単数または複数）の緩慢な放出を可能にする送達ビヒクル中に細胞を被包する。特定の組織を特異的にターゲティングするように送達ビヒクルを修飾する。ターゲティングされた送達系の表面を多様な方式で修飾する。リポソームターゲティング送達系の場合、リポソーム二重層と安定して会合してターゲティングリガンドが維持されるように、脂質基をリポソームの脂質二重層内に取り込む。
[00209]別の例において、コロイド分散系を用いる。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球体、ビーズ、および脂質に基づく系が含まれ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが含まれる。
[00210]本明細書記載のｔＮＳＣの投与は、場合によって：（１）注射する細胞の量を増加させるかまたは減少させる；（２）注射の回数を変化させる；（３）細胞の送達法を変化させる；あるいは（４）例えば細胞を遺伝的に操作するかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養由来のものなど細胞供給源を変化させることによって、個体に合わせて仕立てられる。
[00211]レシピエントにおいて、細胞の移植を促進するのに有効な量で、ｔＮＳＣ調製物を用いる。医師の判断で、投与を調製して、最適な有効性および薬理学的投与を満たす。
スクリーニング法
[00212]本明細書に提供するのは、疾患の治療または防止において使用するための化合物をスクリーニングする方法である。１つの態様において、方法は、単離ヒト・トロホブラスト幹細胞と前記化合物を接触させる工程を含む。別の態様において、方法は、単離神経幹細胞と前記化合物を接触させる工程を含む。別の態様において、方法は、前記ヒト・トロホブラスト幹細胞における少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性の変化を検出する工程をさらに含む。別の態様において、方法は、前記ヒト・トロホブラスト幹細胞における少なくとも１つの転写物またはタンパク質のレベルの変化を検出する工程をさらに含む。別の態様において、方法は、前記神経幹細胞における少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性の変化を検出する工程を含む。
[00213]本明細書に提供する１つの態様は、細胞における変化を誘導する能力に関して化合物をスクリーニングする方法を記載する。１つの態様において、方法は、単離ヒト・トロホブラスト幹細胞と前記化合物を接触させる工程を含む。別の態様において、方法は、単離神経前駆幹細胞と前記化合物を接触させる工程を含む。別の態様において、方法は、前記ヒト・トロホブラスト幹細胞の分化の誘導を検出する工程をさらに含む。別の態様において、方法は、前記神経幹細胞の分化の誘導を検出する工程をさらに含む。
[00214]本明細書にやはり提供するのは、細胞傷害性または細胞の調節のための化合物をスクリーニングする方法であって、本発明の分化細胞と化合物を接触させる工程を含む、前記方法である。別の態様において、方法は、化合物との接触から生じる、細胞におけるいかなる表現型または代謝変化も決定し、そして変化を細胞傷害性あるいは細胞機能または生化学における任意の他の変化と相関させる工程をさらに含む。別の態様において、薬剤、毒素、または分化の潜在的調節因子のスクリーニングが促進される。これらの物質（例えば薬剤、毒素、または潜在的調節因子）を培地に添加してもよい。
[00215]本明細書に提供する１つの態様は、増殖因子、分化因子、および薬剤をスクリーニングする方法を記載した。１つの態様において、ヒト・トロホブラスト幹細胞または神経幹細胞を用いて、培養中のヒト・トロホブラスト幹細胞または神経幹細胞の特性に影響を及ぼす因子（例えば小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド等）または条件（例えば培養条件または操作）をスクリーニングする。１つの態様において、この系は、試験化合物によるフィーダー細胞の混乱によって引き起こされる二次的影響によって複雑になることがないという利点を有する。別の態様において、増殖に影響を及ぼす物質を試験する。別の態様において、馴化培地を培養から抜き取って、そしてより単純な培地で置換する。別の態様において、異なるウェルを、次いで、馴化培地の構成要素と置き換える候補である可溶性因子の異なるカクテルで処理する。処理した細胞が維持され、そして満足できる方式で、場合によってまた馴化培地中で増殖するかどうか、各混合物の有効性を決定する。試験プロトコルにしたがって細胞を処理し、そして次いで、処理した細胞が、特定の系譜の分化した細胞の機能的または表現型的特性を発展させるかどうかを決定することによって、潜在的な分化因子または条件を試験してもよい。
[00216]１つの態様において、ヒト・トロホブラスト幹細胞または神経幹細胞を用いて、細胞分化の潜在的な調節因子をスクリーニングする。１つの態様において、細胞分化は、神経分化である。例えば、細胞分化の調節因子をスクリーニングするための１つのアッセイにおいて、ヒト・トロホブラスト幹細胞または神経幹細胞を、状況が必要とするように、ＬＩＦの存在下または非存在下、調節剤の存在下、そしてＲＡの存在下または非存在下で、血清不含、低密度条件下で培養して、そして分化に対する影響を検出してもよい。別の態様において、本明細書記載のスクリーニング法を用いて、細胞発生と関連する状態を研究し、そして状態の潜在的な療法または矯正薬剤または調節因子に関してスクリーニングしてもよい。例えば、１つの態様において、正常ヒト・トロホブラスト幹細胞または神経幹細胞の発生を、状態を有する細胞を用いた発生と比較する。
[00217]１つの態様において、遺伝子およびタンパク質発現を、ヒト・トロホブラスト幹細胞または神経幹細胞から得られる異なる細胞集団間で比較して、そしてこれを用いて、分化の経過中で上方制御されるかまたは下方制御される因子を同定し、そして性質決定して、そして影響を受ける遺伝子のヌクレオチド・コピーを産生することも可能である。
[00218]１つの態様において、フィーダー不含ヒト・トロホブラスト幹細胞または神経幹細胞培養はまた、薬剤研究における薬学的化合物の試験にも使用可能である。候補薬学的化合物の活性の評価は、一般的に、本発明の分化した細胞と、候補化合物を組み合わせ、生じたいかなる変化も決定し、そして次いで、観察された変化を伴う化合物の影響を相関させる工程を含む。別の態様において、例えば化合物が特定の細胞タイプに対する薬理学的効果を有するように設計されているため、または別の箇所で効果を有するように設計された化合物が意図されない副作用を有するため、スクリーニングを行う。別の態様において、２またはそれより多い薬剤を組み合わせて試験して（細胞と、同時にまたは連続して組み合わせることによって）、ありうる薬剤−薬剤相互作用効果を検出する。別の態様において、化合物をまず、潜在的な毒性に関してスクリーニングする。別の態様において、細胞生存率、生存、形態に対する影響、特定のマーカー、受容体、または酵素の発現または放出に対する影響、ＤＮＡ合成または修復に対する影響によって、細胞傷害性を決定するものとする。
[00219]用語「治療する」、「治療」等は、本明細書において、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。いくつかの態様において、個体（例えば神経変性障害に罹患している、そして／または遺伝的にその傾向があると推測される個体）を、本明細書記載のｔＮＳＣの調製物で予防的に処置して、そしてこうした予防的治療が、完全にまたは部分的に、神経変性障害あるいはその徴候または症状を防止する。いくつかの態様において、個体を療法的に治療する（例えば患者が神経変性障害に罹患している場合）、こうした療法治療は、障害の部分的または完全な治癒を引き起こし、そして／または障害に起因しうる不都合な影響を逆転させ、そして／または障害を安定化させ、そして／または障害の進行を遅延させ、そして／または障害の後退を引き起こす。
[00220]治療が必要な領域へのｔＮＳＣの投与（例えば移植）は、例えばそして限定としてではなく、手術中の局所注入によって、注射によって、カテーテルの使用によって、または移植物の使用によって、達成され、前記移植物は、多孔性、非多孔性、またはゼラチン性材料であり、これには膜、例えばシラスティック膜または線維が含まれる。
[00221]哺乳動物内への組成物の「移植」は、当該技術分野において確立される任意の方法によって、哺乳動物の体に組成物を導入する工程を指す。導入される組成物は「移植物」であり、そして哺乳動物は「レシピエント」である。移植物およびレシピエントは同系、同種、または異種であってもよい。さらに、移植は自己移植であってもよい。
[00222]「有効量」は、意図される目的を達成するのに十分な療法剤の量である。例えば、ｈＴＳ細胞またはｔＮＳＣの数を増加させるのに有効な因子の量は、場合によって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで神経幹細胞数の増加を生じるのに十分な量である。神経変性疾患または状態を治療するかまたは改善させる組成物の有効量は、神経変性疾患または状態の症状を減少させるかまたは除去するのに十分な組成物の量である。所定の療法剤の有効量は、剤の性質、投与経路、療法剤を投与しようとする動物のサイズおよび種、ならびに投与目的などの要因に応じて多様であろう。
[00223]本明細書にさらに提供するのは、１つの態様において、遺伝的に修飾されたｔＮＳＣである。操作は、細胞の多様な特性を修飾し、例えば、特定の環境条件により適応するかまたは耐性であるようにし、そして／または例えば細胞の生存を改善しうる、１またはそれより多い特定の物質の産生を誘導する。細胞を移植における使用により適したものにするために、例えばレシピエントからの拒絶を回避するために、こうした遺伝的改変を行ってもよい（遺伝子療法の概説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５６：８０８； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ９２６； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５７：４５５； Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６（１０）： １１４９；およびＹｕら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １：１３を参照されたい）。
[00224]「ベクター」は、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルス、または適切な宿主細胞への導入に際して、本明細書記載の前駆細胞の修飾を生じる他のベクターを指す。適切な発現ベクターは、一般の当業者に周知であり、そしてこれには、真核および／または原核細胞において複製可能であるもの、そしてエピソームに残ったままのものまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが含まれる。
[00225]例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載されるような技術を用いて、ベクターの構築を達成する。１つの態様において、単離プラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立てて、そしてプラスミドを生成するのに望ましい型で再連結する。望ましい場合、任意の適切な方法を用いて、構築されたプラスミド中に正しい配列があることを確認する分析を実行する。発現ベクターを構築し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を調製し、ＤＮＡを宿主細胞内に導入し、そして遺伝子発現および機能を評価するための分析を実行するための適切な方法が知られる。遺伝子の存在、増幅、および／または発現は、試料において直接、例えば本明細書に提供する配列に基づいてもよい適切に標識したプローブを用いて、慣用的サザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、測定される。
[00226]本明細書において、用語、例えば「トランスフェクション」、「形質転換」等は、細胞または生物に、機能する型で核酸をトランスファーすることを示す。こうした用語には、細胞に核酸をトランスファーする多様な手段が含まれ、ＣａＰＯ４でのトランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入、リポフェクション、リポソームを用いた送達、および／または他の送達ビヒクルが含まれる。
[00227]アフィニティ技術によって、または細胞ソーティング（例えば蛍光活性化細胞ソーティング）によって、細胞をソートし、ここでこれらは適切な標識、例えばアンチセンス核酸分子または免疫グロブリンにコンジュゲート化されたかまたはその一部であるフルオロフォア、あるいは本質的蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその変異体で標識される。本明細書において、「ソーティング」は、第一の細胞タイプから第二のものの少なくとも部分的な物理的分離を指す。
[00228]本明細書において、用語「約」は、±１５％を意味する。例えば、用語「約１０」には、８．５〜１１．５が含まれる。
材料
[00229]抗体。イムノブロットおよび免疫細胞化学用：一次抗体：ＳＳＥＡ−１、−２、−３、ＣＤ９０およびネスチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。神経フィラメントおよびＧＦＡＰ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）。Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｃｄｘ２およびＳｏｘ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンノゼ）。Ｇαｑ／１１（Ｃ−１９、ｓｃ−３９２）、Ｇβ（Ｔ−２０、ｓｃ−３７８）、ＲＸＲα、ＲＡＲβ、ｃ−Ｓｒｃ、ｐＳｔａｔ３、Ｓｔａｔ３、ＰＰ１類似体およびβ−アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）、ＴＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ミズーリ州セントルイスおよびカリフォルニア州テムコウラ）ならびにセロトニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ミズーリ州セントルイス）。
[00230]二次抗体
[00231]ｓｉＲＮＡ： Ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡおよびＣｄｘ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ミズーリ州セントルイス）。
[00232]フローサイトメトリー一次抗体のため： ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＫ７、ビメンチン、６−インテグリン、Ｅ−カドヘリン、Ｌ−セレクチン、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｃｄｘ２およびＳｏｘ２をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンノゼより購入し； ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３３、ＣＤ４４およびＣＤ１０５をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国カリフォルニア州サンディエゴより購入し； ＣＤ１３３をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツより購入した。
[00233]ＴＨ−２およびセロトニン免疫染色のため、細胞を０．１Ｍ ＰＢＳ中、４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄した。ブロッキング溶液（５０ｍｌ ０．１Ｍ ＰＢＳ、０．０５ｇアジ化ナトリウム、１％ウマ血清および１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で室温で１時間インキュベーションした後、細胞を再び洗浄した。細胞を一次抗体、すなわちＴＨ−２（１：２００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）およびセロトニン（１：１００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で２時間インキュベーションし、そしてＰＢＳで洗浄した。抗マウスＩｇＧとＦＩＴＣまたはＰＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）と１時間インキュベーションすることによって、細胞をＰＢＳで完全に洗浄し、そして免疫蛍光アッセイに供した。
実施例１：単離、分化および細胞培養
[00234]ヒト被験体研究および道徳委員会の施設審査委員会によって認可された腹腔鏡下手術を通じて、女性において、初期子宮外妊娠（妊娠年齢：６〜８週）の卵管から胚性絨毛膜絨毛（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｉｏｕｓ）を得た。血清不含α−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）中で組織を切り刻み、そして０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で１５分間トリプシン処理して、そしてこの消化を１０％ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭを添加することによって停止させた。この処置を数回反復した。遠心分離後、細胞を収集し、そして２０％ＦＢＳ（ＪＲＨ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭで、５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。培地中のｈＣＧ発現は、商業的キット（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州カーピンテリア）によって測定すると、培養２継代後に検出不能となった。
[00235]細胞分化。ｈＴＳ細胞を、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ＣｙｔｏＬａｂ Ｌｔｄ、イスラエル・レホボト）を含有する馴化α−ＭＥＭ中、３７℃５％ＣＯ２中で培養した。培地を３日ごとに交換した。５回継代した後、公表されたプロトコルを修飾して用いることによって、多様な特殊化表現型への分化を開始した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州ニューヨーク）中での細胞培養のため、上部チャンバーを、４：１の比で、ＰｕｒｅＣｏｌ（Ｉｎａｍｅｄ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、カリフォルニア州フレモント）および馴化Ｌ−ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含有する５００μｌのコラーゲンゲルでコーティングした。細胞（４ｘ１０５）を馴化Ｌ−ＤＭＥＭ（１ｍｌ）中で培養した。下部チャンバーは、馴化Ｈ−ＤＭＥＭ（３ｍｌ）を含有した。予備実験によって、どちらのチャンバー中のグルコースレベルも、４時間で平衡状態に到達可能であることが示された。
[00236]サブ表現型の細胞分化。２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ＣｙｔｏＬａｂ Ｌｔｄ、イスラエル・レホボト）を含有する馴化α−ＭＥＭ中、３７℃５％ＣＯ２中で細胞を培養した。一般的に、培地を３日ごとに交換した。培養を５回継代した後、図１２中の表に示すように、多様な戦略によって、多様な特定の細胞表現型への細胞分化を実行した。骨形成性分化のため、アリザリンレッドＳアッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、細胞化学ミネラルマトリックスを分析して、カルシウムミネラル含量を検出した。カルシウム沈着を同定するため、細胞を固定し、そして２％硝酸銀溶液（ｗ／ｖ）で暗所で１０分間インキュベーションし、その後、脱イオン水で洗浄して、そして明色光下に１５分間曝露した。商業的キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、細胞をフォン・コッサ染色で処理して、アルカリホスファターゼ活性を検出した。酸性ｐＨレベルで、アルシアンブルー染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、軟骨形成分化を確認した。筋性分化のため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％過酸化水素と１０分間インキュベーションして、内因性ペルオキシダーゼ酵素活性を停止した。１０％ヒト血清および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳで６０分間処理することによって非特異的部位をブロッキングして、そしてブロッキング緩衝液によって５分間洗浄した。骨格筋ミオシン重鎖特異的モノクローナル抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を含有するブロッキング緩衝液中で細胞を１時間インキュベーションし、そしてＶｅｃｔａＳｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて染色した。脂肪生成分化のため、馴化培地によって細胞を誘導し、そして１％カルシウムを含有する４％パラホルムアルデヒド中、６０分間固定し、そして７０％エタノールで洗浄した。２％オイルレッドＯ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）に５分間曝露した後、７０％エタノールによって過剰な染色を除去し、その後、水でリンスした。オイルレッドＯ染色を細胞内脂質集積の指標として適用した。エタノール中の１０μＭオールトランスレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）によって、神経幹細胞を誘導した。
実施例２：プラスミドトランスフェクション
[00237]プラスミドトランスフェクションのため、ｈＴＳ細胞をオールトランスレチノイン酸（１０μＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で一晩誘導し、その後、先に記載されるように（Ｍｙｅｒｓ）、Ｆ１Ｂ−ＧＦＰのＤＮＡ混合物中で同時トランスフェクションした。簡潔には、ＤＯＴＡＰ（３０μｌ）リポソームトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナ州インディアナポリス）を含有するＤＯＴＡＰ（１００μｌ）溶液、およびＮａＣｌ（８０ｍｌ Ｈ２Ｏ中の８６７ｇ）に加えて２ｍｌ ＨＥＰＥＳ溶液（１Ｍ、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ）を含有する７０μｌ ＨＢＳＳ緩衝液内に、ＤＮＡ混合物をゆっくりと添加した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＤＮＡ混合物とよく混合した。一晩インキュベーションした後、２〜３週間の培養を通じて、コロニーが形成されるまで、Ｇ４１８選択（４００μｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）することによって、安定細胞株を得た。Ｇ４１８耐性細胞をプールし、そして溶解し、そしてモノクローナル抗ＧＦＰ抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いてウェスタンブロッティングによって分析して、ＧＦＰを発現するトランスフェクタントの割合を定量化した。継代培養によって、トランスフェクションされたｈＴＳ細胞をメタノールで固定し（１０分間）、免疫蛍光によってＧＦＰの発現を検出した。トランスフェクション率は、９５％を超える有効性を生じた。
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
[00238]ＲＴ−ＰＣＲのため、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって、１０５〜１０６細胞から総ＲＮＡを抽出し、そしてＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＲＴ−ＰＣＲビーズキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国バッキンガムシャー）を用いることによって、ｍＲＮＡ発現を調べた。簡潔には、反応産物を１．５％アガロースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロミドで視覚化した。β−アクチンまたはβ−２ミクログロブリンを陽性対照として用いた。すべての実験を３つ組で行った。ｑＰＣＲのため、ｉＱ５リアルタイムＰＣＲ検出系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で遺伝子発現を測定し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ ｉＱ５光学系ソフトウェア、バージョン２．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分析した。比較Ｃｔ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、指示マニュアル）を用いて相対的ｍＲＮＡレベルを計算し、そして生物学的対照に対する比として示した。１周期内の産物の量がほぼ倍になり、そして予測されるサイズの単一の産物が生じるように、すべてのプライマー対を確認した。
実施例４：ウェスタンブロット
[00239]血清不含培地を含む１０ｃｍディッシュ内に細胞を一晩植え付け、そして示すように、多様な時間間隔で、ＲＡ（１０μＭ）を含みまたは含まずに処理した。刺激後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｍｉｎｉｐｏｒｅ）によって溶解した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ）によってタンパク質濃度を決定した。等量のタンパク質（３０μｇ）を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに溶解し、ＰＶＤＦ膜上にトランスファーし、そして室温で１時間、５％脱脂粉乳でブロッキングした。ブロッキング後、膜を一次抗体と４℃で４時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、そして次いで、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体と室温で１時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、そして次いで、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体と室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴ緩衝液で６回洗浄した後、膜を化学発光基質（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と１分間インキュべーションした。化学発光キット（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、特異的バンドを視覚化した。
実施例５：サザンブロット
[00240]先に記載される（Ｔｓａｉ）ようなサザンイムノブロット分析によって、第三および第七継代でｈＴＳ細胞のテロメア長を測定した。簡潔には、断片をＨｙｂｏｎｄＮ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にトランスファーし、そしてＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ標識ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したＴＴＡＧＧＧ反復のプローブに６５℃でハイブリダイズさせた。テロメア反復配列に相補的な標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、末端制限断片を視覚化した。ＴＲＦのサイズ分布をＤＮＡ長さ標準と比較した。
実施例６：末端制限断片（ＴＲＦ）サザンブロット
[00241]細胞が癌性変化を開始した後、テロメアは非常に短くなるであろう。ｈＴＳ細胞培養中、テロメア長を第三および第七継代で測定した。簡潔には、断片をＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にトランスファーして、そしてＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＤＮＡ標識ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることによって、α−［３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識したＴＴＡＧＧＧ反復のプローブに６５℃でハイブリダイズさせた。テロメア反復配列に相補的な標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって末端制限断片を視覚化した。末端制限断片のサイズ分布をＤＮＡ長標準と比較した。電子顕微鏡観察のため、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−２０００ ＥＸＩＩ、ＪＥＯＬ、日本・東京）によってｈＴＳ細胞由来ブドウ様細胞塊を調べて、細胞の基盤を同定した。
[00242]ウェル間光学変動の規準化のため、内部受動的参照色素としてフルオレセインを用いる、ＩＱ５リアルタイムＰＣＲ検出系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、ｆｇｆｒ２、ＦＧＦ４、ＢＭＰ４、Ｃｄｘ２、および内因性対照β−アクチン（ＡＣＴＢ）をｈＴＳおよび５００単位のＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）によって処理したｈＴＳ細胞で測定した。１２．５μｌの２ｘＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、０．５μｌの各１０μＭプライマーおよび０．５μｌのｃＤＮＡ試料を含有し、そして滅菌水と混合された総体積２５μｌ中で、ＰＣＲ増幅を行った。反応を９５℃３分間で開始した後、９５℃３０秒間の変性、６０℃３０秒間のアニーリング、７２℃１５秒間の伸長からなる６０回の３工程増幅周期を行った。最終解離段階で、増幅産物特異性の検証のため、融解曲線を生じるために実行した。リアルタイムｑＰＣＲを監視し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ ＩＱ５光学系ソフトウェアバージョン２．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって分析した。比較Ｃｔ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ指示マニュアル）を用いて相対的ｍＲＮＡレベルを計算し、そして生物学的対照に対する比で提示した。ＡＣＴＢ転写レベルを確認して、ウェルと総ＲＮＡ量を相関させて、そしてしたがって、全体の規準化に用いた。用いたすべてのプライマー対を確認して、１つの周期内の産物の量をほぼ倍にし、そして予測されるサイズの単一の産物を得た。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、ｆｇｆｒ２、ＦＧＦ４、ＢＭＰ４、Ｃｄｘ２、および内因性対照β−アクチン（ＡＣＴＢ）のプライマー配列を補助データ表３に示す。
表１．遺伝子発現に用いた、多様なＰＣＲプライマー
実施例７：免疫細胞化学
[00253]培養を４％パラホルムアルデヒドで、室温で３０分間固定し、そして次いでＰＢＳで３回洗浄した。製造者の推奨のように、免疫細胞化学染色のため、ＬＳＡＢキット（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州）を用いた。ＳＳＥＡ−１および−４染色のため、細胞をトリス−リン酸緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）でリンスし、そしてＨ２Ｏ２で１０分間洗浄した。反応をヤギ血清（１：２００、Ｄａｋｏ）で３０分間ブロッキングした後。次いで、細胞を一次抗体と一晩インキュベーションした。ＴＢＳで細胞を洗浄し、そしてストレプトアビジンで２０分間処理した後、細胞をビオチンによって（２０分間）染色し、再び洗浄し、そして四塩化３，３’ジアミノベンジジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ・マンハイム）で１０分間処理した。最後に、細胞をヘマトキシリン染色で対比染色した。ＳＳＥＡ−３染色のため、類似の方法にしたがったが、例外は、Ｈ２Ｏ２で洗浄する前に回収した抗原を添加したことであり、これはクエン酸緩衝液中、圧力鍋を１５分間用いることで得られた。最後に、細胞をＰＢＳで徹底的に洗浄し、そして免疫蛍光アッセイに供した。
実施例８：免疫沈降（ＩＰ）
[00254]細胞を一晩血清枯渇させ、そしてＲＡ（１０μＭ）で３０分間処理した。プロテインＧ−アガロース（Ｍｉｎｉｐｏｒｅ）で３０分間プレクリアした後、特異的抗体またはＩｇＧを添加し、そして一晩インキュベーションした。プロテインＧ−アガロースと２時間インキュベーションし、ビーズをＲＩＰＡ溶解緩衝液で３回洗浄し、緩衝液中で煮沸し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして示すような多様なターゲットに関して免疫ブロット分析を行った。
実施例９：フローサイトメトリー
[00255]細胞（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）を多様な一次抗体と３０分間インキュベーションし、そして次いで、調整した希釈で、適切なフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、またはＲｈｏコンジュゲート化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）と４℃で１時間インキュベーションした。完全に洗浄した後、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁し、そしてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）に供した。Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータを分析した。
実施例１０：マイクロアレイ
[00256]ｈＴＳ細胞を、ＲＡ（１０μＭ）を伴いまたは伴わずに、各々、１日または５日間処理した。ＴＲＩｓｏｌ試薬を用いて総ＲＮＡを抽出し、そして製造者のプロトコル（カリフォルニア州サンタクララ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）にしたがい、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３プラス２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて、国立台湾大学医学部、台湾・台北のゲノム医学センターで行って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイに供した。
実施例１１：二重免疫金電子透過型顕微鏡（ＩＥＭ）
[00257]ＲＡ（１０μＭ）の処理を行ったまたは行わなかった細胞を、先に記載されるように（Ｔｓａｉら）調べた。簡潔には、固定超薄切片を５％メタ過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液で前処理し（１０分間）、そして再蒸留水で洗浄した。グリッドを、ＲＸＲα（１：５０）またはＧαｑ／１１（Ｃ−１９；ｓｃ−２９３；１：５０）に対するＩｇＧ抗体のアリコットとインキュベーションし、そしてその後、二次抗マウス６ｎｍ金粒子（１：１０；ＡＢ Ｃｈｅｍ、カナダ・ドーバル）または抗ウサギＩｇＧ ２０ｎｍ金粒子（１：１０；ＢＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＫ）でプロービングした。インキュベーション工程の間にグリッドをＰＢＳで洗浄し、そして１％オボアルブミンを含むＰＢＳの滴上にグリッドを置く（１５分間）ことによって、切片をブロッキングした。ＩｇＧ金の後、グリッドをＰＢＳでジェット洗浄し、その後、蒸留水で洗浄した。すべての工程を室温で行った。次いで、切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、そしてＨｉｔａｃｈｉ Ｈ−７００モデル透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌｔｄ、日本）上で性質決定した。
実施例１２：共焦点免疫蛍光顕微鏡
[00258]２％ゼラチンでコーティングしたカバースリップ上で細胞を培養し、そしてＲＡ（１０μＭ）を伴いまたは伴わずに、各５、１５および３０分間処理した。次いで、細胞をＰＢＳで３回リンスし、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、そしてＰＢＳ中の０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する２％ＦＢＳで１５分間、透過処理した。この反応を５％ＦＢＳ、４℃で一晩ブロッキングし、その後、ＰＢＳ中の一次抗体ＲＸＲα（１：１００）またはＧαｑ／１１（１：１００）、４℃で一晩インキュベーションした。洗浄後、細胞を色素Ｌｉｇｈｔ ４８８または色素Ｌｉｇｈｔ ５４９コンジュゲート化二次抗体（１：５０；Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ギルバーツビル）で１時間インキュベーションした。ＤＡＰＩ（１：５，０００）と５分間インキュベーションし、カバーガラスを風乾し、そして共焦点免疫蛍光顕微鏡観察（Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京）のために密封した。
実施例１３：ｈＴＳ細胞と定義されるヒト栄養膜細胞層のユニークな集団の分析
[00259]異所性絨毛膜絨毛から得られる細胞を培養し；コロニーが最初に形成され、そして続いて接着性線維芽細胞様細胞に増殖した（図１ａ）。免疫細胞化学的に、これらの細胞は、ステージ特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）−１、−３、および−４（図１ｂ）を発現した。異所性絨毛膜絨毛において、これらのＳＳＥＡ陽性細胞は、栄養膜細胞層と組織学的に同じと提示された。しかし、胎盤絨毛という点では、これらは主に、絨毛核の区画に現れた。
[00260]幹細胞の特性を評価するため、フローサイトメトリー分析によって、これらの細胞が高レベルの間葉系幹細胞マーカー：ＣＤ９０、ＣＤ４４、ビメンチン、および神経フィラメント、ならびにトロホブラストマーカー、サイトケラチン（ＣＫ）−７を発現することが明らかになった。これらは、造血幹細胞マーカー：ＣＤ３４およびＣＤ４５、ならびに上皮細胞マーカー：Ｅ−カドヘリン、α６−インテグリン、およびＬ−セレクチンを発現しなかった。これらはまた、弱くネスチンおよびＣＤ９を発現した（図１ｃ）。これらの事実によって、これらの栄養膜細胞層は、成熟胎盤組織から単離されるトロホブラスト様下位集団とは別個であることが示された（Ａｂｏａｇｙｅ−Ｍａｔｈｉｅｓｅｎら， １９９６； Ｂａｃｚｙｋら， ２００６）。さらに、他の裏付けとなる証拠には：１）これらの細胞をオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）で処理すると、先に記載されたもの（Ｙａｎら、２００１）と類似の巨細胞の形成が生じ（図１ｄ）；２）一連の染色体分析によって、核型が不変であることが示され（補助図１ａを参照されたい）；３）テロメア長の続く測定によって、染色体安定性が確認され（補助図１ｂを参照されたい）；そして４）重症複合免疫不全マウスに細胞を移植すると、陽性の免疫キメラ反応が生じた（補助図１ｃを参照されたい）ことが含まれた。総合すると、これらの単離された細胞は、栄養膜細胞層の非常に均質な集団に相当するようであり、間葉系幹細胞の特性を示した。したがって、これらの細胞は、ｈＴＳ細胞と見なされる。
実施例１４：ｈＴＳおよびｈＥＳ細胞間の遺伝的および生物学的特性における類似性
[00261]ｈＴＳ細胞の遺伝子プロファイリングを調べるため、転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を多様なプライマーで実行した（補助表１を参照されたい）。結果は、ｈＴＳ細胞がＴＳ細胞マーカー（Ｃｄｘ２、ＢＭＰ４、Ｅｏｍｅｓ、およびＦｇｆｒ−２）だけでなく、ＥＳ細胞マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＦＧＦ４）も発現することを示した（図２ａ）。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３プラス２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（カリフォルニア州サンタクララ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）を用いることによって分析された包括的遺伝子プロファイルを比較することによって、ｈＴＳ細胞は、ＰＤＭＳ細胞（Ｃ．−Ｐ． Ｃｈｅｎ博士から寄贈）とは区別された（図２ｂ）。
[00262]興味深いことに、ｈＴＳ細胞は、ＥＳ細胞の三胚葉の遺伝子発現を示し、これには：中胚葉のオステオポンチン、オステオカルシン、パールカン、コラーゲンＩＩ型、ミオゲニン、ｍｙｏＤ１、ＰＰＡＲγ−２、およびアジプシン；外胚葉の神経フィラメント、ニューロゲニン（Ｎｇｎ）−３、ＣＤ１３３、ＭＡＰ−２、Ｎｅｏ−Ｄ、およびネスチン；ならびに内胚葉のインスリン、Ｐｄｘ−１、ＣＫ−１９、ソマトスタチン、Ｉｓｌ−１、Ｎｋｘ−２．２、Ｎｋｘ−６．１、およびＰａｘ−６（図２ｃ）が含まれる。機能的には、修飾を伴って（補助表２を参照されたい）適切な措置（Ｉｎ’ｔ Ａｎｋｅｒら， ２００４； Ｆｕｋｕｃｈｉら， ２００４； Ｙｅｎら， ２００５）を用いることによって、ｈＴＳ細胞は、ｈＥＳ細胞に見られるように中胚葉細胞系譜の特殊な表現型に分化可能であり、これらの細胞には、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、および脂肪細胞が含まれた（図２ｄ）。ｈＴＳ細胞を選択的に誘導して、それぞれ、外胚葉および内胚葉由来のものの代表として、ドーパミン作動性ＮＳＣおよびインスリン産生膵島前駆細胞（以下を参照されたい）に分化させた。これらの結果は、ｈＴＳ細胞が、三胚葉の特殊化表現型に分化可能なｈＥＳ細胞の遺伝的および生物学的特性の両方を所持することを立証した。
実施例１５：Ｎａｎｏｇは、ＬＩＦ退薬によるヒト・トロホブラスト幹細胞の多能性を維持する
[00263]ヒト・トロホブラスト幹（ｈＴＳ）細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞およびトロホブラスト幹（ＴＳ）細胞両方の多能性遺伝子マーカー、例えばＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＣｄｘ２を発現するため、ヒト・トロホブラスト幹（ｈＴＳ）細胞に対するＬＩＦ退薬の影響を調べた（図１ａ）。ｈＴＳ細胞を異なる投薬量のＬＩＦ、すなわち５００（膨大部を模倣）、２５０（中央部を模倣）、および１２５単位（卵管峡部を模倣）で各３日間処理し、ＬＩＦがＯｃｔ４発現を促進するが、Ｃｄｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２発現を用量依存方式で抑制することを示した（図１ｂ）。定量的ＰＣＲ分析は、これらの知見を支持した（図１ｃ）。Ｏｃｔ４対Ｃｄｘ２の相対発現比が初期胚分化における細胞の運命を決定可能である（Ｎｉｗａら、２０００）ため、Ｏｃｔ４／Ｃｄｘ２比（０．４倍）は、膨大部で最高であるようであり、これが中央部で０．２倍に減少し、そして卵管峡部でほぼ１になった（図１ｄ）。このＯｃｔ４／Ｃｄｘ２比の減少傾向は、実際、栄養外胚葉運命に向かう分化を促進する（Ｎｉｗａら、２００５）。驚くべきことに、１２５単位のＬＩＦで処理した細胞では、より高いＮａｎｏｇ／Ｃｄｘ２比（２倍）が見られ、一方、５００単位のＬＩＦでは０．１倍であった。これらの結果は、相対的に減少したＯｃｔ４発現のレスキュー因子としてのＮａｎｏｇが、ｈＴＳ細胞が多能性を維持するための重要な決定因子であることを強く示唆した。レスキュー因子のこの役割は、５００単位のＬＩＦの比に比較した、１２５単位のＬＩＦの顕著に高いＮａｎｏｇ／Ｏｃｔ４比、および１２５単位のＬＩＦでのＣｄｘ２／Ｏｃｔ４比の見かけの増加によってさらに支持された（図１ｅ）。Ｓｏｘ２／Ｃｄｘ２の明らかな変化は見られなかった。
[00264]総合すると、これらの結果は、ヒト卵管の膨大部から卵管峡部に向かうＬＩＦ濃度の漸次退薬によって、主に、ｈＴＳ細胞におけるＮａｎｏｇの上昇が誘導され、これによって、フィーダー細胞を伴わずに、マウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞およびヒトＥＳ細胞増殖におけるものを模倣した、ｈＴＳ細胞の自己再生および多能性特性が維持されることを立証する。この結果は、ＮａｎｏｇがｈＴＳ細胞の多能性を維持する際に役割を果たすことを示す。
実施例１６：ＲＡがＮａｎｏｇ発現を増進する
[00265]ＲＡは、ニューロン分化の強力な制御因子であり、そして通常、これは、ターゲット遺伝子の制御領域におけるレチノイン酸応答配列（ＲＡＲＥ）と相互作用する核受容体に結合することによる（Ｍａｄｅｎ）。細胞におけるＲＡ産生の供給因子であるレチノール（ビタミンＡ）が、ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの上方制御によって仲介される細胞分化を抑制することが示されてきている（Ｃｈｅｎ）。ＲＡがｈＴＳ細胞におけるＮａｎｏｇに対して類似の影響を示すかどうかを調べた。ｈＴＳ細胞をＲＡで１日処理し、そしてフローサイトメトリーに供した。この結果は、ＲＡがＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の発現を促進するが、Ｃｄｘ２の発現は促進しないことを示し（図２ｆ）、これは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐオリゴヌクレオチド・マイクロアレイによるマイクロアレイｍＲＮＡ発現プロファイリングと一致した（図２ｇ）。さらに、ｓｉＲＮＡでのＮａｎｏｇのノックアウトは、ＲＡ誘導性Ｎａｎｏｇを抑制したが、Ｃｄｘ発現を増加させた。対照的に、Ｃｄｘ２ ｓｉＲＮＡはＮａｎｏｇを促進し、そしてフローサイトメトリーによって、ＲＡ誘導性ｈＴＳ細胞においてＣｄｘ２を抑制した（図２ｈ）。総合すると、これらの結果は、ＲＡがｈＴＳ細胞におけるＮａｎｏｇの過剰発現を誘導し、それによって、ＲＡが、細胞運命の決定において、Ｎａｎｏｇ／Ｃｄｘ２比を変化させないことを示す。
実施例１７：ＲＡはその受容体ＲＸＲαの活性化を促進する
[00266]ＲＡは、ウェスタンブロッティングアッセイによれば、最初の５分間でその受容体ＲＸＲαの活性化を促進するが、この作用は３０分間しか持続しなかった。その代わり、増加したＲＡＲβ産生が６０分以内に観察された（図２ｉ）。ＲＡは、免疫沈降アッセイによれば、ＲＸＲαおよびＲＡＲβに直接相互作用することが観察された（図２ｊ）。さらに、活性化されたＲＸＲαは、１５分をピークとして、核に向かって転位置し、そしてこれ以降、核強度は免疫蛍光顕微鏡観察によれば減少した（図２ｋ）。タンパク質Ｇαｑ／１１サブユニットはまた、３０分で活性化された（図２ｌ）。この目的を達成するために、細胞性レチノイン酸結合タンパク質２（ＣＲＡＢＰ−２、図１ｄ）の補助を伴わずに、最初の反応段階で、ＲＡがＲＡＲと相互作用するようである。
実施例１８：ＲＸＲα／ＲＡＲβは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーのメンバーに属するようである
[00267]この概念は、二重免疫金電子顕微鏡観察による、ＲＸＲαおよびＧαｑ／１１サブユニット間の直接相互作用の観察によって確認された（図２ｍ）。次に、ＲＸＲα／ＲＡＲβおよびＮａｎｏｇ間を関連づけるため、免疫沈降アッセイ分析によって、ＲＡＲβではなくＲＸＲαがＮａｎｏｇのプロモーターに対して直接作用することが示唆される（図２ｎ）。さらに、ＥＳ細胞とは異なり、ｈＴＳ細胞は、ｈＴＳ細胞がレチノールをＲＡに代謝するのを可能にする、主要ＲＡ生成酵素：レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ２型および３型（ＲＡＬＤＨ−２および−３）を含有する（図１ｄ）。ＲＡがｈＴＳ細胞に作用して、Ｎａｎｏｇのプロモーターに結合する、ＧＰＣＲと関連したＲＸＲα／ＲＡＲβ複合体との直接相互作用によって、Ｎａｎｏｇを産生することが立証される。
実施例１９：ｈＴＳ細胞におけるＲＡ誘導性Ｎａｎｏｇ発現は、卵管において、勾配ＬＩＦ含量によって影響を受ける
[00268]ＬＩＦの退薬は、フローサイトメトリーによれば、ｈＴＳ細胞において、ＲＡ誘導性Ｎａｎｏｇ発現を有意に増進可能であり（図２ｉ）、ｈＴＳ細胞由来ＮＳＣがＬＩＦの非存在下でのＲＡ誘導による前駆細胞として振る舞うことが可能になる位置にあり、適切な微小環境条件下で、神経サブタイプ特定の多能性特性を維持することが示唆される。
実施例２０：ＲＡは、非ＲＡＲＥ経路を通じてＴＨ発現を促進する
[00269]これらの結果は、ウェスタンブロットによって測定されるｈＴＳ細胞において、それぞれ、５、１２０および５分間で、ＲＡがＲＸＲ−α、ＲＡＲ−βおよびｃ−Ｓｒｃ発現を刺激する、最初の結果に基づいて、ＲＡが非ゲノムシグナル伝達経路を誘導することを示す（図３ａ）。ＲＸＲ−α／ＲＡＲ−β相互作用が、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーに属するかどうかを決定するため、二重免疫金電子顕微鏡を用いて、Ｇ−タンパク質Ｇαｑ／１１およびＲＸＲ−α間の相互作用を調べた。結果は、ＲＸＲ−αが、細胞膜で、Ｇαｑ／１１と結合相互作用を有し（図３ｂ）、そして続いて、解離Ｇαｑ／１１が膜結合ホスホリパーゼＣベータ（ＰＬＣβ）を刺激して、ＰＩＰ２（少量の膜ホスホイノシトール）を２つの二次メッセンジャー、ＩＰ３およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に切断することを示した（図３ｂ）。
[00270]続いて、ＲＡは、免疫沈降アッセイおよび特異的ｃ−Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ１類似体を用いることによって、ＲＸＲα、ＲＡＲβおよび［ｃ−Ｓｒｃ］の足場形成を誘導した（図３ｃ）。
実施例２１：ＲＡはＷｎｔ２Ｂ／Ｆｚｄ６／β−カテニン経路を活性化する
[00271]ウェスタンブロット分析によって、ＲＡが、４時間および２４時間インキュベーション後、Ｗｎｔ２Ｂおよび癌原遺伝子ＦＲＡＴ１を有意に上方制御することが立証された（図２４ａ）。ｈＴＳ細胞を、Ｗｎｔ２Ｂに対するｓｉＲＮＡを伴いまたは伴わず、ＲＡと一晩インキュベーションした。フローサイトメトリー分析によって、ＲＡが、Ｗｎｔ２Ｂ、ならびに仲介タンパク質ディシェベルド３（Ｄｖｌ３）および癌原遺伝子ＦＲＡＴ１を含むその下流ターゲットを有意に上方制御し、阻害性グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ３β）を導き、これはｓｉＲＮＡによってＷｎｔ２Ｂをノックダウンすることによって阻害可能であることが示された（図２４ｂおよび２４ｃ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析によってもまた、類似の結果が観察された（図２７）。ＲＡはまた、７回スパン膜貫通受容体のフリズルドファミリーのメンバーであるＦｚｄ６ ｍＲＮＡの過剰発現も促進した（図２４ｄ）。Ｆｚｄ６のＷｎｔ２Ｂ仲介発現におけるＲＡの役割を検証するため、本発明者らはまた、Ｄｖｌ３およびその下流エフェクターＦＲＡＴ１の発現レベルも分析し、そしてＦｚｄ６のＲＡ仲介増進が、Ｗｎｔ２Ｂに対するｓｉＲＮＡの存在によって抑制可能であり、ＧＳＫ３βの同時減少が伴うことを示した（図２４ｂおよび２４ｃ）。続いて、ウェスタンブロット分析によって、ＲＡが３０分および２４時間の間に有意にβ−カテニンを活性化することが示された（図２４ｅ）。ＲＡは、新規古典的Ｗｎｔ２Ｂ／Ｆｚｄ６／β−カテニンシグナル伝達経路を誘導し、ｈＴＳ細胞において、阻害性ＧＳＫ３βが細胞質β−カテニンを安定化し、そして活性化するのを可能にする。
実施例２２：ＲＡはヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を調節する
[00272]ウェスタンブロット分析によって、ＲＡは、転写制御酵素であるヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の上昇を２時間で促進し、これは、同時免疫沈降（ＩＰ）アッセイによれば、２４時間のＲＡ処理後、β−カテニンと直接相互作用することが可能であることが示された（図２４ｆ）。さらに、本発明者らは、細胞分画アッセイによって、β−カテニンの核転位置が起こることを示し（図２４ｇ）、これはｈＴＳ細胞における２４時間のＲＡ処理後、古典的Ｗｎｔ２Ｂ／Ｆｚｄ６／β−カテニンシグナル伝達経路の存在を支持した。共焦点免疫蛍光顕微鏡観察によって、これらの観察がさらに確認された。ＨＤＡＣ６に対するｓｉＲＮＡの存在下で、β−カテニンの核局在がブロックされた（図２５）。興味深いことに、本発明者らは、ｈＴＳ細胞由来ニューロン様細胞において、細胞膜（シナプス）でのＲＡ処理後、５分間で、β−カテニンの非常に早期の発現が見られうることを見出した。核において、β−カテニンは、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーの転写因子と会合することによって、転写制御に関与する。細胞分画アッセイ分析によって、この相互作用がβ−カテニンの核転位置を導くことが示された（図２４ｅ）。
実施例２３：ＲＡＲβおよびＧβ間、ならびにＲＸＲαおよびＧαｑ／１１間の相互作用
[00273]ｈＴＳ細胞におけるウェスタンブロット分析によって、ＲＡが、Ｇαｑ／１１およびＧβ両方の迅速な産生を３０分で誘導し、そしてまた、レチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）およびレチノイン酸受容体β（ＲＡＲβ）を、それぞれ３０分および４時間で誘導することが立証された（図２６ａ）。リアルタイム共焦点蛍光顕微鏡分析によって、ＧＦＰタグ化ＲＸＲαは、ＲＡ刺激によって、数分以内に、細胞質ゾル区画から細胞内領域に向かって、迅速に移動し（図２６ｂおよび２６ｃ）、ここで、Ｇαｑ／１１とともに、免疫細胞化学的に同時発現される（図２６ｄ）。この現象はさらに、二重免疫金透過型電子顕微鏡観察によって裏付けられ、ここで、ＲＡは、細胞膜で小さい金でタグ化されたＲＸＲαおよび大きい金でタグ化されたＧαｑ／１１の結合を刺激した（図２６ｅ）。生化学的には、ＲＸＲαは、Ｇαｑ／１１と物理的に相互作用し、そして該作用は、ＩＰアッセイによれば、ＲＸＲα ｓｉＲＮＡを用いることによって阻害された（図２６ｆ）。ＲＡＲβおよびＧβ間でも類似の事象が起こり、そしてこの作用はまた、ＩＰアッセイによれば、ＲＡＲβ ｓｉＲＮＡを用いることによって阻害された（図２６ｇ）。ＩＰアッセイは、選択的ｃ−Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ１類似体が、ＲＸＲα−ＲＡＲβヘテロ二量体の形成を妨げることが可能であることを示し（図２６ｈ）、ＲＸＲαおよびＲＡＲβが別個に機能することを可能にする未知の機構の存在が示唆された。この知見はさらに、二重免疫金透過型電子顕微鏡によって観察される小胞体（ＥＲ）中のＲＡ誘導性金粒子タグ化ＲＸＲαの係留によって裏付けられた（図２６ｉ）。総合すると、データは、ＲＡ誘導性ＲＸＲαおよびＲＡＲβが、細胞膜で、それぞれ、Ｇαｑ／１１およびＧβと独立に相互作用することを示唆する。
実施例２４：Ａｋｔ３／ｍＴＯＲシグナル伝達およびｍＲＮＡ翻訳
[00274]リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によって、ＲＡがわずか１５分間、ＲＸＲα ｍＲＮＡおよびＲＡＲβ ｍＲＮＡの迅速な一過性上昇を誘導し（図２８ａ）、そして１時間以内にＲＡＲβおよびＲＸＲαの迅速な産生を誘導することが見出された（図２６ａ）。軸索成長コアにおけるｍＲＮＡの濃縮およびニューロンにおけるｍＲＮＡ局在とのその関連があり、そしてＲＡが増進するＲＡＲαレベルが樹状ＲＮＡ顆粒における局所ＧｌｕＲ１合成を仲介して、ニューロン膜でのシナプス形成のため、ＲＡＲα修飾翻訳に寄与するという事実に基づき、これらの細胞プロセスにおいて、ＲＸＲαの細胞内ｍＲＮＡ局在が関与するかどうかを調べることに重点を置いた。続いて、ＩＰアッセイによって、ＲＡは、Ｇβおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）間の結合を誘導し（図２６ｇ）、そしてウェスタンブロット分析によって、３０分から４時間の間に、ＰＩ３ＫとＡｋｔ１およびＡｋｔ２を含むすべてのＡｋｔアイソフォームである下流エフェクターを、そして１時間で一過性Ａｋｔ３を活性化することが示された（図２８ｂ）。フローサイトメトリー（図２８ｃ）およびＲＴ−ＰＣＲ分析（図２９ａ）によれば、ＲＡでの２４時間処理後、Ａｋｔアイソフォームのすべての発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンでの前処理によって阻害され、Ｇβ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の存在が示された。特に、Ａｋｔは、最近、ニューロン生存を促進する神経突起伸長に必須の制御因子であり、ＲＡ誘導性Ａｋｔ３（４時間）は、ラパマイシンの機械的ターゲット（ｍＴＯＲ）に結合可能であり、これはＡｋｔ３に対するｓｉＲＮＡによって阻害され（図２８ｄ）、特異的抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いることによって、４時間で、部位セリン２４４８でｍＴＯＲの一時的リン酸化を導くことが、近年、明らかになってきている。しかし、この作用は、２４時間のインキュベーション後には消失した（図２８ｅ）。この機能は、ウェスタンブロットによって（図２８ｆ）そしてフローサイトメトリーによって（図２９ｃ）、ｓｉＲＮＡを用いたＡｋｔ３のノックダウンによって阻害された。直ちに、ウェエスタンブロット分析は、ＲＡ処理４時間により、リン酸化されたｍＴＯＲは真核翻訳開始因子−４Ｅ結合タンパク質１（ｅＩＧ４ＥＢＰ１）と直接相互作用し（図２８ｇ）、そしてｅＩＦ４ＥＢＰ１（図２８ｈ）を活性化することを示した。ｓｉＲＮＡを用いることによるリン酸化ｍＴＯＲのノックダウン、ｅＩＦ４ＥＢＰ１のリン酸化が阻害された；その代わり、伸長開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）のリン酸化が活性化され（図２８ｈ）、ｅＩＦ４Ｅ／ｅＩＦ４ＥＢＰ１複合体からのｅＩＦ４Ｅの解離が起こったことが暗示された。ｅＩＦ４Ｅのリン酸化は、ｍＲＮＡのキャップ依存性翻訳を引き起こすことを可能にする。総合すると、これらの観察は、ＲＡが、どのように、ＲＸＲα ｍＲＮＡおよびＲＡＲβ ｍＲＮＡの活性化を通じて細胞内ｍＲＮＡ翻訳を誘導可能にし、局所的にそれぞれＲＸＲαおよびＲＡＲβを産生するかを説明し、これはｅＩＦ４ＥのｓｉＲＮＡによるノックダウンが、ＩＰアッセイによれば、ＲＸＲαおよびＧαｑ／１１の間の、ならびにＲＡＲβおよびＧβの間の相互作用両方を阻害したためであった（図２８ｉ）。これらの結果は、ＲＸＲαおよびＲＡＲβの局所合成の開始因子としてＡｋｔ３／ｍＴＯＲシグナル伝達が役割を果たすことを裏付ける。ＲＡは、伸長開始因子４Ｂ（ｅＩＦ４Ｂ）の上昇を刺激するが、この作用は、ｍＴＯＲまたは４ＥＢＰ１のいずれに対するｓｉＲＮＡによっても影響を受けず、ｅＩＦ４Ｂ発現の制御には別の機構があることが示唆された（図２８ｈ）。時空間Ａｋｔ３は、ｍＴＯＲシグナル伝達を通じて、ＲＸＲαおよびＲＡＲβ産生の細胞内局在を促進する。
実施例２５：ドーパミン作動性特定の主流に対するＣＲＥＢ１
[00275]Ｇβ／ＰＩ３Ｋ下流エフェクターＡｋｔ１は、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）に、セリン１３３部位でのリン酸化を通じて直接結合し、そしてこれを活性化する（図３０ａ）。Ａｋｔ１およびＣＲＥＢ１の相互作用は、Ａｋｔ１ ｓｉＲＮＡによって阻害された（図３０ｂ）。リン酸化されたＣＲＥＢ１は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイによると、ドーパミン前駆体チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子をターゲティングし、そして転写し（図３０ｃ）、これはＣＲＥＢ１ ｓｉＲＮＡによって阻害された（図３０ｄ）。この目標に向けて、結果によって、ＲＡ誘導性ＲＡＲβ／Ｇβ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ１／ＣＲＥＢ１経路が、ドーパミン作動性神経発生におけるＴＨ転写における役割を果たすことが示唆された。この知見をｉｎ ｖｉｖｏで裏付けるため、病変線条体でｈＴＳ細胞由来トロホブラストＮＳＣ（ｔＮＳＣ）の頭蓋内移植を受けた６−ＯＨＤＡ誘導性ＰＤラットを用いたモデルを用いた。移植１２週後の脳切片の検査によって、免疫蛍光組織分析により、黒質緻密部において、正常側と適合して、療法側における新規ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンにおいて、ＣＲＥＢ１およびＴＨの同時発現が観察された（図３０ｅ）。ＴＨおよびＣＲＥＢ１活性はどちらも、正常ニューロンに比較して再生ＤＡニューロンにおいて、より高かった（図３０ｆ）。興味深いことに、見かけのＣＲＥＢ１発現がＤＡニューロンの核で観察された。これらの知見は、ＣＲＥＢ１不全マウスがなぜ神経変性に感受性であるかを説明しうる。
実施例２６：ＥＲカルシウム制御におけるＲＸＲα／Ｇαｑ／１１の研究
[00276]３０分から４時間の間のウェスタンブロット分析によって、ＲＡがＧαｑ／１１の漸次活性化を誘導し、これが膜結合型ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ−β）の触媒を誘発して、膜ホスホイノシトールＰＩＰ２の分解を導き（図２１ａ）、先に記載される慣用的Ｇαシグナル伝達と一致して、二次メッセンジャー、イノシトール（１，４，５）三リン酸（ＩＰ３）を産生することが示された。ＩＰ３は、ＥＲに位置するその受容体ＩＰ３Ｒ（図２１ａ）を活性化し、細胞内カルシウム上昇を引き起こす（図２１ｂ）。細胞内カルシウムの起源を確認するため、細胞をカルシウム不含培地中で培養し、ここでＲＡは、リアルタイム生存細胞免疫蛍光顕微鏡測定によって、一過性の細胞内Ｃａ２＋放出を誘導した（図２１ｂ−ａ）。ＥＲカルシウムレベルの枯渇は、ホメオスタシスおよび細胞保護に関して、外因性ＣａＣｌ２を添加することによってレスキュー可能であり、ストア感受性カルシウム進入（ＳＯＣＥ）のパターンを示した。ＥＲにおけるカルシウム放出のプロセスは、用量依存方式で、ＩＰ３Ｒ特異的阻害剤２−ＡＰＢによって阻害された（図２１ｂ−ｂ）。これらの結果は、ＥＲ放出された細胞内カルシウム上昇が、ｈＴＳ細胞において、ＲＡ誘導性Ｇαｑ／１１シグナル伝達経路に関与することを示す。
[00277]ＫＣｌは、ｈＴＳ細胞において、カルシウム不含培地中、ＥＲカルシウムのＲＡ誘導性枯渇後、Ｌ型カルシウムチャネルを活性化可能であった（図２１ｂ−ｃ）。Ｌ型カルシウムチャネルアンタゴニスト、ニフェジピンは、このシグナル伝達を遮断可能であった（図２１ｂ−ｄ）。細胞内ＥＲカルシウムのＲＡ制御はＬ型カルシウムチャネルと関連づけられる。
実施例２７：興奮−神経発生カップリングにおけるＣａＭＫＩＩの研究
[00278]ウェスタンブロット分析によって、ＲＡが１〜２時間でＣａＭＫＩＩの時空間活性化を誘導することが示された（図２１ａ）。免疫沈降アッセイ分析は、ＣａＭＫＩＩがＬ型カルシウムチャネル活性をコードして、興奮−転写カップリングにおいて核ＣＲＥＢに局所的にシグナル伝達するという先の研究と適合して、ＣａＭＫＩＩがＣＲＥＢ１を直接リン酸化し、そして活性化する（図２１ｃ）ことを立証する。ウェスタンブロット分析によって、真核開始因子４Ｂ ｅＩＦ４Ｂ ｓｉＲＮＡは、ＣａＭＫＩＩ、カルシニューリン、およびｅＩＦ４Ｂの発現を阻害することが示された（図２１ｄ）。軸索は、発生中のニューロンにおいて、特異的タンパク質合成をコードする多様なｍＲＮＡを局所的に含有し、これには、ＣａＭＫＩＩ、カルシニューリン、およびＣＲＥＢ１が含まれる。ＣＲＥＢ１は、遠位軸索のシグナルに関与する、核における特異的転写プロセスのための逆行性追跡を可能にする。ＣａＭＫＩＩの外因性ＲＡ誘発局所タンパク質合成は、ｈＴＳ細胞において、ｅＩＦ４Ｂ ｓｉＲＮＡによって阻害可能である。したがって、この局所活性化ＣａＭＫＩＩシグナルは、ＣＲＥＢ１に対して同様に振る舞い、細胞外の合図に際して、迅速な誘導性遺伝子転写が示唆された。
[00279]一過性ＣａＭＫＩＩは、真核開始因子４Ｂ（ｅＩＦ４Ｂ）に結合し、そして活性化して（図２１ｃ）、キャップ非依存性機構を通じて、ｍＲＮＡ翻訳機構を開始した。ウェスタンブロット分析によって、ＲＡ処理後、選択的ＣａＭＫＩＩ阻害剤ＫＮ９３によって、この作用は阻害されることが示された（図２１ｅ）。このＣａＭＫＩＩ／ｅＩＦ４Ｂシグナル伝達は、次いで、ｅＩＦ４Ｂ／ｃ−Ｓｒｃ／Ｎａｎｏｇシグナル伝達経路を統合して、ｔＮＳＣの自己再生および増殖のため、ＲＸＲα／Ｇαｑ／１１からのシグナル伝達経路を達成した。これらの結果はまず、Ｇαｑ／１１シグナル由来ＣａＭＫＩＩ興奮が、ｔＮＳＣの自己再生の維持に関与することを調べた。
[00280]ウェスタンブロットアッセイおよび免疫沈降アッセイ分析は、ＣａＭＫＩＩがパーキンソンタンパク質２（パーキン）に結合し、そしてこれを活性化することを立証した（図２１ａおよび２１ｆ）。続いて、パーキンは、軸索に優先的に位置し、そして微小管集合を刺激する微小管会合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）と直接相互作用し、そしてこれを活性化した（図２１ａおよび２１ｆ）。その結果、ＭＡＰＴは、ＳＮＣＡに直接結合して（図２１ａおよび２１ｇ）、パーキン／ＭＡＰＴ／ＳＮＣＡ複合体を形成した。ここで、ＭＡＰＴは、もっぱらニューロンで発現され、微小管集合を安定化し、そして促進する微小管要素である、チューブリンと相互作用しそしてこれを活性化する（図２１ａおよび２１ｈ）。総合すると、これらの結果は、初期神経形成における軸索の振る舞いの重要性を示唆した。
実施例２８：カルシニューリン／ＮＦＡＴ１シグナル伝達の活性化
[00281]ウェスタンブロットアッセイ分析は、ＲＡがカルシニューリンの産生を誘導することを立証した（図２１ａ）。２−ＡＰＢでの前処理によって、カルシニューリン、ＮＦＡＴ１、およびＭＥＦ２Ａ発現が阻害され（図２１ｉ）、ＥＲカルシウムおよびカルシニューリン分子が関連づけられた。カルシニューリンは、直ちに、Ｔ細胞活性化およびアネルギーの重要な制御因子であるＮＦＡＴ１を脱リン酸化し、これは３０分〜２時間の一過性様式を示した（図２１ａ）。この作用はまた、免疫沈降アッセイ分析によって明らかであるように、２−ＡＰＢによっても阻害され（図２１ｈ）、ＥＲカルシウムがカルシニューリン／ＮＦＡＴ１シグナル伝達に関連づけられた。さらに、ＲＡは、ＮＦＡＴ１、および核細胞質輸送体であるインポーチンの一過性相互作用を誘導し（図２１ａおよび２１ｊ）、細胞分画アッセイによるＮＦＡＴ１核転位置を導いた（図２１ｋ）。ＮＦＡＴ１のこの一時的効果は、持続および一過性カルシウムシグナル間を細胞が区別する、１つの機構であると考えられる。
実施例２９：ＷｎｔおよびＧタンパク質シグナル伝達経路の研究
[00282]古典的Ｗｎｔシグナル伝達の阻害性ＧＳＫ３β（セリン／スレオニン部位）は、ＲＡで一晩処理した後の細胞質β−カテニンの安定化を維持したが、３０〜１２０分にわずかに減少したレベルであった（図２４ｄ）。予期せぬことに、Ａｋｔアイソフォームの中で、Ａｋｔ２はＧＳＫ３βに４時間で結合可能であった（図２１ｌ）；が、フローサイトメトリー分析によって、ＧＳＫ３βは、４時間でまず活性化されたが、一晩のＲＡ処理によって、後に阻害性に遷移した（図２１ｍ）。この現象はさらに、Ａｋｔ２ ｓｉＲＮＡを用いることによっても確認された（図２１ｎ）。この機能的多様性を説明するため、ＧＳＫ３βの最初の活性化が、Ａｋｔ２によるＴｙｒ２１６部位でのリン酸化のためであり、続く阻害は、セリン／スレオニン部位でのリン酸化のためであることが確認された（図２１ｍ）。これらの結果は、多様なプロテインキナーゼによるＧＳＫ３βの部位特異的リン酸化が、下流エフェクターの運命を決定することを立証する。さらに、活性ＧＳＫ３βは、直接相互作用を通じてＭＡＰＴをリン酸化した（図２１ｈ）。次いで、ＭＡＰＴはチューブリンと相互作用して、そしてこれを活性化し（図２１ａおよび２１ｈ）、微小管集合を促進した。特に、初期神経発生中、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｇβ、およびＧαｑ／１１シグナル伝達経路の間の対話架橋が構築される。
実施例３０：ドーパミン作動性神経発生のための転写因子の研究
[00283]核において、β−カテニンおよびＣＲＥＢ１の相互作用は、ＴＨ転写における主流に相当した（図３０ａ）。活性β−カテニンは、次に、リンパ系増進因子１／Ｔ細胞因子１（ＬＥＦ１）に結合し（図２２ａ）、ＬＥＦ１の転写リプレッサーからアクチベーターへの切り換えを導く。次いで、ＬＥＦ１は、ビコイド関連因子のスーパーファミリーのメンバーであるＰｉｔｘ２を補充し、そしてこれと相互作用した（図２２ａ）。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイによって、ＬＥＦ１はＰｉｔｘ２遺伝子転写を促進するが、Ｐｉｔｘ３遺伝子を促進せず（図２２ｂ）、これは、β−カテニン、Ｐｉｔｘ２、およびＬＥＦ１が相互作用して、相乗的にＬＥＦ−１プロモーターを制御することと適合した。
[00284]さらに、一過性核活性ＮＦＡＴ１は、転写因子として働いて、免疫反応のためのサイトカインおよびＴＮＦ−αを産生する。しかし、この作用は、この場合には起こらないようであり、これはリン酸化ＧＳＫ３βが、核においてカルシニューリンに誘導されたＮＦＡＴ１のＤＮＡ結合を阻害可能であり、そして核排出を促進可能であるためである。したがって、活性細胞質ＮＦＡＴ１は、細胞質転写因子筋細胞増進因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）と相互作用し、そしてこれを活性化し（図２２ｃおよび２２ｄ）、これはこの作用がＮＦＡＴ１ ｓｉＲＮＡによって阻害されたためであった（図２２ｅ）。特に、迅速な誘導性ＣＲＥＢ１は核に進入し、そしてＭＥＦ２Ａ遺伝子を転写し、これはＭＥＦ２Ａタンパク質を産生した（図２２ｆ）。ＭＥＦ２Ａは、多数の方式で、遺伝子転写で機能可能であり（図２２ｇ）、これには、より多くのＭＥＦ２Ａを産生する自己制御を通じた自身の転写、ドーパミン作動性特定のためのＴＨ遺伝子転写、ＳＮＣＡ／ＭＡＰＴ／パーキン複合体形成のためのＳＮＣＡ遺伝子の転写、ならびにＥＰ３００およびＰｉｔｘ２との相互作用が含まれ、これは、ＭＥＦ２Ａ ｓｉＲＮＡによって阻害された（図２２ｈ）。
[00285]活性ＥＲ３００は、ＣｈＩＰアッセイによれば、ＨＤＡＣ６遺伝子だけでなくＴＨ遺伝子もターゲティングする（図２２ｉ）。次いで、ＨＤＡＣ６は核転位置のためにβ−カテニンを所持可能にした（図２４ｅおよび２４ｆ）。総合すると、実行上の転写複合体が形成され、そしてＴＨ遺伝子転写のために運命付けられた。これらの間で、ＣＲＥＢ１、ＥＰ３００、およびＭＥＦ２Ａは、ＴＨ遺伝子のプロモーターを直接ターゲティングすることも可能であったが、β−カテニン、ＬＥＦ１、およびＰｉｔｘ２は、転写プロセス中、エンハンサーのコアクチベーターとして働いた。ウェスタンブロット分析は、４時間および２４時間で多様な分子活性を示す。
実施例３１：動物研究
[00286]動物研究のため、Ｆ１Ｂ（−５４０）−ＧＦＰおよびｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドをｈＴＳ細胞にトランスフェクションして、その後、Ｇ４１８で選択することによって、レポーター細胞を調製した。９５％を超えるｈＴＳ細胞が、Ｆ１Ｂ−ＧＦＰおよびＴＨ−２の同時発現を示した。次に、以下に記載するように、ラット脳の片側にニューロトキシン、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を注射することによって、「若い」スプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝１２、体重、２２５〜２５０グラム）で、パーキンソン病を誘導した。
[00287]すべての実験を、高雄市医科大学病院の病院施設審査委員会の倫理委員会、および国立成功（Ｃｈｕｎｇ Ｋｏｎｇ）大学医学部、台湾・台南の倫理委員会のガイドラインにしたがって実行し、そして行った。
パーキンソン症の誘導
[00288]１２匹のスプレーグ−ドーリーラット（体重５６０＋６５ｇ（前）、５４８＋４６ｇ（後））を、６−ＯＨＤＡ障害半身パーキンソン症のモデルとして用いた（Ｊａｖｏｙら， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １０２：２０１−１５， １９７６）。手術のため、抱水クロラール（４％、１ｃｃ／１００ｇ体重）によって麻酔した後、右内側前脳束（前後（ＡＰ）２．８／側方（Ｌａｔ）２．２／深度（Ｄｅｐ）８．０ｍｍ）内に、１μｇ／０．５μｌ／分の速度で８分間（注入ポンプ：ＣＭＡ１００）、６−ヒドロキシドーパミン（Ｓｉｇｍａ）の注入によって、定位損傷を実行した。１０分後、チューブを取り除いた。２週間後、アポモルフィン皮下注射（２５ｍｇ／ｋｇ）投与の２０分後、プラスチックボウル（直径３６ｃｍ）中で、アポモルフィン誘導性回転を試験した。対側性回転を監視し、そしてビデオカメラを用いて２０分間記録した。５分あたり２５を超える回転数を示すラットが、研究に適格と見なされた。細胞移植のため、右片側線条体内で、細胞を２つの部位（各部位：３ｘ１０６／４μｌ）（第一の部位；前後＋１／側方＋２．７／深度６．４ｍｍ；第二の部位：前後＋０／側方＋２．７／深度６．４ｍｍ）内に移植した。対照群には、同じアプローチでＰＢＳを投与した。細胞注射後、０、３、６、９、および１２週で、アポモルフィン誘導性回転を測定した。結果を対側性回転／５分間として表した（図５Ａ）。
[00289]ＲＡの異なる時間によって誘導されるＮＳＣの効果を調べるため、適格ラットをランダムに３つの群に分けた：１日および５日ＲＡ誘導群、ならびに対照群。移植前に、ｈＴＳ細胞をＦ１Ｂ−（−５４０）−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびｐＳＶ２ｎｅｏ組換えプラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、その後、Ｇ４１８選択で９５％を超える収率を達成した。各ラットには、総数６ｘ１０６細胞で、ＧＦＰタグ化ＮＳＣを投与し、そして対照ラットには、ビヒクルとしてリン酸緩衝生理食塩水を投与した。移植後３週ごとに、アポモルフィン誘導回転試験（Ｉａｎｃｕら、２００５）によって、療法効果を評価した。
[00290]実験１．成体スプレーグ・ドーリーラット（ＢＷ：２２５−２５０ｇ）を移植レシピエントとして用い、そしてこれらを１２時間明暗周期で、食物および水に不断にアクセスさせて飼育した。病変ラット（ｎ＝１２）をまず３つの群に分けた：（ａ）病変を有しそして１日ＲＡ誘導ＮＳＣを移植されたもの（ｎ＝４）、（ｂ）病変を有しそして５日ＲＡ誘導ＮＳＣを移植されたもの（ｎ＝４）、ならびに（ｃ）病変を有しそして移植されていない対照（ｎ＝４）。ラットをＺｏｌｅｔｉｌ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．、Ｖｉｒｂａｃ Ｌａｂ．フランス・カロス）によって麻酔し、そして病変ラットに、６−ＯＨＤＡ（０．１％ｌ−アスコルビン酸−生理食塩水中、８μｇ／４μｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州）を、十字縫合および硬膜に照らして（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ）、ｍｍで、左ＭＦＢ（前後２．８、側方２．０、深度８．０ｍｍ）およびＳＮ（前後５．０、側方２．２、深度７．５ｍｍ）内に片側性に注射し、そしてその部位で１０分間待った。ＤＡ枯渇線条体内への、２つの部位（前後＋１．０、側方＋２．７、深度６．４および前後＋０、側方＋２．７、深度６．４）でのｈＴＳ細胞由来ＮＳＣ（１ｘ１０６細胞／５μ１／５分）の移植を行い、そしてカニューレを５分間その場所に放置し、その後、ゆっくりと引き抜いた。移植処置中、細胞生存度は９６〜９８％の間で安定なままであった。シャムのラットには細胞を含まないビヒクルを投与した。６−ＯＨＤＡ病変が安定な半身パーキンソン状態（＞３００回転／時間）を達成した後、１週ごとにアポモルフィン誘導性回転によって、病変を評価した。アポモルフィン誘導性回転試験によって、３週ごとに、１２週まで、移植効果を評価した。移植１８週後、ラットを屠殺し、そして脳切片をＴＨ−ＤＡＢ免疫染色に供した。
[00291]実験２．ＰＤラットは、試験前に体重５６０＋／−６５ｇそして試験後に５４８＋／−４６ｇで管理された。病変ラット（ｎ＝１６）を実験１におけるように生成し、そして２群に分けた：１日ＲＡ誘導ＮＳＣでの移植による、（ａ）病変を有しそして細胞移植されたもの（ｎ＝８）および（ｂ）病変を有しそして対照として細胞を伴わない移植をされたもの（ｎ＝８）。前後＋１．０、側方＋２．７、深度６．４での注射によって細胞を移植した。以下に記載するように、移植後、３週ごとに１２週まで行動評価を行った。１３週で、すべてのラットを屠殺し、そして脳切片をＴＨ−ＤＡＢ免疫染色に供し、そしてＴＨ陽性細胞を濃度計によって分析した。
行動評価
[00292]自発運動アッセイ。ラットに関して、自然発生的な自発運動を円状廊下において監視した（幅１０ｃｍおよび直径６０ｃｍ、壁の高さ３０ｃｍ；Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．、バーモント州セントアルバンス）。４つの光電管は、円の壁周囲に等距離に配置され、光線中断によって、動物の水平方向歩行活性を検出した。カスタマイズされたソフトウェア（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を装備したＰＣを通じてデータを記録した。動物の別個の群を１０ｍｇ／ｋｇ（群あたりｎ＝６）および２０ｍｇ／ｋｇ（群あたりｎ＝１２）のコカインで試験した。動物を処置群（ＨＳＶ−ＬａｃＺおよびＨＳＶ−ＲＧＳ９−２）にランダムに分け、そして自発運動装置に２時間、慣らした。翌日、定位フレーム上、動物の側坐核中にＨＳＶベクターの投与を行った。２日間回復させた後、自発運動に関して、２時間、動物をコカインで試験した。ボンフェローニ事後検定で、データを２方向ＡＮＯＶＡ（ＨＳＶｘ時間）によって分析した。
[00293]マウスに関しては、活動チャンバーがプラスチックケージ（１２ｘ１８ｘ３３ｃｍ）であり、１０対の光電光線がチャンバーを１１の長方形フィールドに分ける、自動化系（Ｈｉｒｏｉら、１９９７）において、自発運動を測定した。マウスの遺伝子型を知らない実験者が、マウスを各日同じ時間に試験した。急性実験のため、動物を３０分間チャンバーに慣らし、その後、生理食塩水か、あるいは多様な用量のアンフェタミン、コカインまたはアポモルフィンのｉ．ｐ．注射を行い、そして自発運動をさらに３０分間評価した。慢性実験のため、最初の３日のｉ．ｐ．生理食塩水注射直後、動物をチャンバーに入れた。次いで、水平方向の活動を１０分間測定した。第４〜８日（Ｃ１〜Ｃ５）、動物にコカイン（７．５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）を投与し、そして活動を１０分間測定した。ラットおよびマウスに用いられた短い期間は、先の研究において、歩行自発運動の測定において典型的である、潜在的な混乱させる影響を回避することが示されてきている。
[00294]３つの行動試験を行った：（ｉ）病変および移植効果を評価する薬剤誘導性回転、（ｉｉ）後足歩行パターンを評価する足跡分析、および（ｉｉｉ）熟練歩行行動（後肢／前肢の組み合わせおよび足配置の正確さ）を評価するはしご段歩行試験。
[00295]アポモルフィン誘導性回転試験。簡潔には、アポモルフィンを皮下投与（０．９％正常生理食塩水中の０．０１％アスコルビン酸中、０．５ｍｇアポモルフィン／ｋｇ体重、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）した後、ラットを広く丸いチャンバー（直径１６ｃｍ）に４０分間入れた。すべての回転をビデオテープ上に記録し、そして純回転非対称性を計算した。データを３０分間の総回転数として計算した。Ｍａｔｌａｂソフトウェアを用いることによって、データを分析した。
[00296]また、アポモルフィン誘導性回転（ａｐｏ）を、０．５ｍｇ／ｋｇアポモルフィン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、０．９％正常生理食塩水の０．０１％アスコルビン酸中、０．５ｍｇアポモルフィン）の腹腔内注射後、６０分間観察した。先に記載されるように（［５９］；図２）、病変後（ＬＸの２および３週後）および移植後（ＴＸの３および６週後）、回転測定装置（ｒｏｔｏｍｅｔｅｒ）ボックス中、回転バイアスを評価した。ＬＸ２週後およびＴＸ３週後のデータでは、薬剤誘導性回転は示していない。３日後、１ｍｌ／ｋｇアンフェタミン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・シュタインハイム；１．０ｍｌ生理食塩水あたり２．５ｍｇのｄ−アンフェタミン）の腹腔内注射後、９０分間、アンフェタミン誘導性回転（ａｍｐｈ）を行った。アポモルフィン注射後の病変側への対側性の＜４．０の全身回転、およびアンフェタミン注射後の病変側への同側性の＜６．０の全身回転を示したため、５匹の動物を排除した。アポモルフィン誘導性回転は、負の値における純回転として提示し、そしてアンフェタミン誘導性回転は、正の値における純回転として提示する。
[00297]アポモルフィンの注射後（Ａ）およびアンフェタミンの注射後（Ｂ）の薬剤誘導性回転。回転バイアスを全身回転の総量として示す。ドルマーク（＄）は、シャムおよびｔｘラットの間の有意な相違を示す。プレＴＸ＝病変６週後、ポストＴＸ＝移植６週後。有意な移植効果があることに注目されたい（アポモルフィン注射後の回転バイアスの減少；アンフェタミン注射後の過剰補償）。
[00298]無動症に関するバー試験。バー試験のため、対側および同側前肢がどちらも、０．７ｘ９ｃｍサイズの水平アクリルバー上に交互に置かれるような姿勢で、ラットを穏やかにテーブル上に置いた。前肢の配置から、各々が最初にバーから完全に離れるまでの時間を記録した。ブロック上で各前肢が消費した時間の総計を先に記載されるように（Ｆａｎｔｉｎ）記録した。
[00299]足跡分析（時空間歩行分析）。先に記載されるように（Ｋｌｅｉｎ）、歩行速度、ステップ長、ストライド長および支持基底面を含む足跡分析を実行して、後肢歩行パターンを評価した。ラットは、通路（長さ５０ｃｍ、幅８ｃｍ）を通ってプラスチックボード上を歩かなければならない。５回の連続ステップで、ストライド長、肢回転（第三指および掌の中心を通じたバーチャルな線、ならびに歩く方向に平行なバーチャルな線の間の角度）および足の間の距離（左および右ステッピング周期の足の間の距離）を含むパラメーターをビデオカメラ（Ｃａｓｉｏ ＥＸ−Ｆ１、日本）によって記録し、そしてＭａｔｌａｂソフトウェアによって分析した。
[00300]適切な方法を用いて、足首関節の硬直を評価する。適切な電気生理学的アッセイを用いて、脳におけるドーパミン作動性ニューロンの回復％を決定する。
免疫組織化学
[00301]ＴＨ免疫組織化学のため、動物に最終用量６０ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンナトリウムをｉ．ｐ．投与し（Ａｐｏｔｅｋｓｂｏｌａｇｅｔ、スウェーデン）、そしてこれを５０ｍｌ生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ）で経心的に灌流し、その後、２００ｍｌ氷冷パラホルムアルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中４％ｗ／ｖ）を灌流した。脳を除去し、４％パラホルムアルデヒド中、２時間、事後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ）し、そしてスクロース（０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中２５％ｗ／ｖ）中、一晩、凍結保護し、その後、凍結マイクロトーム（Ｌｅｉｃａ）上で切片作製した。厚さ２０μｍの冠状切片を連続６枚収集した。
[00302]免疫組織化学法を以下のように行った。自由浮遊切片を、５％正常血清および０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）を含有するカリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水のインキュベーション溶液中、一次抗体と室温で一晩インキュベーションした。二次抗体を、２％正常血清および０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するカリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水中で希釈し、そして元来の溶液に室温で２時間適用した。ジアミノ−ベンジジンのペルオキシダーゼ駆動沈降、またはフルオロフォアのコンジュゲート化（二次抗体に直接、または必要な場合、ストレプトアビジン−ビオチン増幅工程を伴う）によって、一次−二次抗体複合体の検出を達成した。ｃ−Ｆｏｓの検出のため、硫酸ニッケル（２．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて、染色を増感させた。蛍光マーカーで標識し、スライドにマウントした切片を、ポリビニルアルコール−１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタンでカバースリップ処理し、そしてジ−アミノ−ベンジジン標識切片をアルコールおよびキシレン中で脱水し、そしてＤｅＰｅＸマウンティング培地（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、英国）でカバースリップ処理した。一次抗体および希釈因子は以下の通りであった：マウス抗カルビンジン２８ＫＤ（１：１０００：Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗ｃ−Ｆｏｓ（１：５０００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＧＦＰ（１：２０ ０００；Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＧＩＲＫ２（１：１００；Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ、イスラエル・エルサレム）、ウサギ抗ＰＩＴＸ３（１：１００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびマウス抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：１：４０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。１：２００の希釈で用いる二次抗体は以下の通りであった：（ｉ）直接検出−シアニン３またはシアニン５コンジュゲート化ロバ抗マウス、シアニン２コンジュゲート化ロバ抗ニワトリ、シアニン５コンジュゲート化ロバ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）および（ｉｉ）ストレプトアビジン−ビオチン増幅での間接検出−ビオチンコンジュゲート化ヤギ抗ウサギまたはウマ抗マウス（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、その後、ペルオキシダーゼコンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、またはシアニン２／シアニン５コンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。
ドーパミン作動性特定におけるＣＲＥＢ１発現に関するｉｎ ｖｉｖｏ研究
[00303]脳切片を得るため、ペントバルビトンナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、Ａｐｏｔｅｋｓｂｏｌａｇｅｔ、スウェーデン）によってラットを麻酔し、そして生理食塩水（５０ｍｌ、０．９％ｗ／ｖ）で、その後、氷冷パラホルムアルデヒド（２００ｍｌ、０．０２Ｍ ＰＢＳ中１０％ｗ／ｖ）での経心的灌流を、急性および慢性ＰＤラットにおいて、それぞれ、１８週および１２週で行った。示すように、脳切片を、免疫細胞化学、免疫組織化学、および免疫蛍光組織分析に供した。
[00304]病変線条体で、ｈＴＳ細胞由来トロホブラストＮＳＣ（ｔＮＳＣ）の頭蓋内移植を受けた６−ＯＨＤＡ誘導性ＰＤラットを調べて、ＣＲＥＢ１発現を調べた。移植１２週後の脳切片の検査によって、黒質緻密部において、ＣＲＥＢ１およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の同時発現が、療法側において、新規ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン中で観察され、これは、免疫蛍光組織分析によって、正常側におけるものと適合した（図３０ｅ、挿入図）。ＴＨおよびＣＲＥＢ１活性はどちらも、正常のもの（図３０ｆ）に比較して、再生ＤＡニューロンでより高かった。明らかなＣＲＥＢ１発現が、ＤＡニューロンの核中で観察された。これらの知見は、ＣＲＥＢ１不全マウスがどのように神経変性に感受性であるかの説明を補助しうる。
ドーパミン作動性黒質線条体経路の再生に関するｉｎ ｖｉｖｏ研究
[00305]細胞療法後のドーパミン作動性黒質線条体経路の再生をさらに検証するため、免疫蛍光組織分析を行った（ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ、オーストリア・ウィーン）。１４匹の急性ＰＤラット（すなわち傷害の１週後２匹および６週後２匹および２匹の対照、細胞移植１２週後６匹および２匹の対照）および４匹の慢性ＰＤラット（すなわち細胞療法の１２週後２匹および２匹の対照）を含めて、脳切片を調べた。ＳＮＣにおいて、６−ＯＨＤＡは、進行性の神経変性を引き起こし、傷害６週後に多様なサイズの腔を生じる（図３１）。興味深いことに、ｔＮＳＣ療法後、多くのＤＡニューロンが、腔内へのＴＨ陽性神経末端突起を伴って、腔の壁に見られた（図３１、挿入図）。定量的分析によって、損なわれていない側に比較して、ＳＮＣにおいて、ＤＡニューロンの数が、傷害１および６週後に、それぞれ、見かけ上４８％および１３％減少した（図３２ａおよび３３）。顕著なことに、ＤＡニューロンの喪失は、ｔＮＳＣ療法後、最大６７％減少する可能性もあった。
[00306]一方、線条体において、ＤＡニューロンは、傷害の１週および６週後、それぞれ７８％および４％減少した（図３２ａ）。同様に、失われたＤＡニューロンは、ｔＮＳＣ療法後、最大７３％再生可能であった。観察（図６）と一致して、ＤＡニューロン回路は、免疫組織化学的に、損なわれていない側と同様に、ＳＮＣの療法側でよく確立された（図３２ｂ）。ＤＡニューロンの回収速度は、免疫蛍光分析における６７％（図２３ａ）と一致して、ＳＮＣにおいて、７８．４±８．３％（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）を占めた（図３２ｃ）。
[00307]グリア細胞は、ニューロン遊走を目的地にガイドする仲介因子として、または神経再生の供給源として、役割を果たすため、６−ＯＨＤＡは、ＤＡニューロンおよびＧＦＡＰ（＋）細胞両方の変性を引き起こすだけでなく、線条体における線条体−淡蒼球−黒質軸索（ウィルソン鉛筆）の攪乱も引き起こした。これらの現象は、明らかに、ｔＮＳＣ療法後に改善され、多くのＧＦＡＰ（＋）細胞が細かい有髄線維中に包埋されていることが示された（図３２ｄ）。注目されるように、ＧＦＡＰ（＋）細胞は、病変線条体において、傷害６週後の６５．５％から、ｔＮＳＣ療法後には９３．９％まで再生した（図３２ｅ）。この事実は、アストロサイト活性化を反映する可能性もあり、移植されたｔＮＳＣサブタイプ、すなわちＧＲＰおよびアストロサイトに起因しうる。これらの結果は、ｔＮＳＣの移植が、慢性ＰＤラットにおいてドーパミン作動性黒質線条体経路を再生し、それによって、行動欠陥の改善を説明することを示す。ＤＡニューロンの再生の最適化は、病変経路において、ｔＮＳＣの保持に基づき、少なくとも移植後１８週、続くであろう（図５）。
[00308]ｉｎ ｖｉｖｏで、ｈＴＳ細胞をオス重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、６〜８週間、筋内移植した。組織学的に、奇形腫はまったく見られなかった；が、粘液様の異様な細胞を伴う小規模なキメラ反応が観察された（図７Ｈ）。これらの結果によって、奇形腫形成に関して、ｈＥＳ細胞に比較して、移植（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）医薬におけるｈＴＳ細胞およびｔＮＳＣの利点が明らかになる。
統計
[00309]すべてのデータを平均±ＳＥＭとして表す。分散の反復測定分析（ＡＮＯＶＡ）検定を用いることによって、相違を評価し（ＳＰＳＳリリース１２．０ソフトウェア）、そしてアポモルフィン誘導性回転分析のため、２群間の反復測定ＡＮＯＶＡ検定後、最小有意差検定（ＬＳＤ）事後比較を適用した。適切な場合、スチューデントｔ検定、ペアードｔ検定を用いた。ｐ値＜０．０５を有意と見なした。
[00310]動物実験によって、病変線条体内に注射したｔＮＳＣは、移植１８週後、ＧＦＰタグ化免疫蛍光研究によって明らかになる黒質線条体経路を通じて、黒質核下（ｓｕｂｎｉｇｒａｌ ｎｕｃｌｅｕｓ）の上流に遊走可能である。第二に、行動欠陥を改善する有効性は、予期されるより高く、例えば、移植１２週後にドーパミン作動性ニューロンの回復は２８．２％である。第三に、免疫抑制または腫瘍形成はいずれも観察されなかった。さらに、２８．２％のドーパミン作動性ニューロンおよび行動欠陥の改善は、慢性ＰＤラットにおいて、６−ＯＨＤＡ誘導後１年を超えて維持される。これらの結果は、ｔＮＳＣ移植が、ドーパミン作動性黒質線条体経路を再生し、そして急性ＰＤラットにおいて、行動欠陥を機能的に改善することが可能であることを示した。
慢性ＰＤ動物モデル
[00311]ＰＤ患者の病理学的に進行性の性質をより緊密に模倣するため、１年を超える（平均１２．３ヶ月）繁殖法によって、慢性ＰＤラットモデルを開発した。アポモルフィン誘導性回転試験を毎月行って、実験を通じて、ラットのＰＤ状態を確認した。群Ｉ（ｎ＝６）には、ｔＮＳＣを投与し、一方、群ＩＩは対照であった（ｎ＝６）。３週ごとに、アポモルフィン誘導性回転試験、無動症のためのバー試験、硬直のためのステッピング試験、ならびに姿勢不均衡および歩行障害のための足跡分析を含む、行動評価を実行した。
[00312]群Ｉにおいて、急性ＰＤラットにおける先の研究と同様に移植３週〜１２週で、アポモルフィン誘導性対側性回転の有意な改善が達成された（図６Ａ）。バー試験によって、３週で、罹患前肢の把握時間は有意に短くなり、そして１２週で改善し続けることが示された（図６Ｂ）。ステップ長（図６Ｃ）、ストライド長（図６Ｄ）、歩行速度（図６Ｅ）、および支持基底面（図６Ｆ）によるすべての評価によって、移植の３週から１２週後に有意な改善が明らかになった。これらの結果によって、ｔＮＳＣの移植は、ドーパミン作動性黒質線条体経路を再生し、そして慢性ＰＤラットにおいて行動欠陥を機能的に改善することが可能であることが示された。
実施例３２：押すおよび引く機構
[00313]Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、内部および外部環境の間を連絡し、そして細胞膜でヘテロ三量体Ｇタンパク質と共役する。しかし、活性化されたＧＰＣＲがどのようにこのプロセスを開始するかを説明する機構はより明らかでない。最近の報告によって、リガンドの導入に際して、Ｇα１３およびＧαｑ／１１サブユニットの両方が、ＡｈＲ相互作用タンパク質と相互作用し、ここでＧα１３が細胞質ゾルＡｈＲの脱安定化、転位置およびユビキチン化を導くことが示されてきている。非ゲノムＡｈＲ経路におけるＧタンパク質シグナル伝達の役割を調べた。ＢＢＰは、外因性リガンドとして選択され、そしてＣＯＸ−２は活性化ターゲットとして選択されており、これはＣＯＸ−２が、肝癌細胞を含む多様なヒト細胞において、炎症、代謝および発癌を引き起こすためである。
[00314]免疫蛍光研究は、細胞における分子変化のスナップショットを捕捉する能力を通じて、シグナル伝達の動的研究に重要であると見なされている。ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、ウィスコンシン州）を用いることによって、ヒト肝臓Ｈｕｈ−７癌細胞をｐＧＦＰ−Ｃ１−ＡｈＲでプレトランスフェクションして、そして全反射照明蛍光顕微鏡観察を用いて、形質膜直下の細胞質領域における分子事象を選択的に観察した。ＢＢＰを導入した際、ＧＦＰタグ化ＡｈＲの迅速だが一過性の補充および転位置が細胞内膜領域で生じ、迅速な上昇および１１５秒でのピーク、その後、数分間に渡って生じるＡｈＲの漸次減少が示された（図１４ａ）。細胞内膜でのｍｅｍＡｈＲのこの迅速な動的移動は、緩やかにつながれたシグナル伝達の知見を連想させる。ＡｈＲは、生体内分解酵素の制御を通じて、適応型の機能を提供し、そして細胞内での局在を変化させ、それ自体の活性化を誘発することが見出されている。
[00315]次に、ＢＢＰおよびＡｈＲの間の関連を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって調べた。ＢＢＰは、５分間で有意にｍＡｈＲ発現を誘導し、１５分でピークとなり、そして次第にわずかに高い恒常的安定状態に戻った（図１４ｂ）。興味深いことに、ウェスタンブロット分析は、ＡｈＲ産生において、１５分でＢＢＰ誘導性上昇を示し、３０分でわずかに産生が減少し、そして１時間で再上昇することを示した（図１４ｃ）。これらの２つのアッセイで見られる時点でのＡｈＲ発現の異なるパターンは、細胞内ｍＲＮＡ活性化および恒常的合成間の相違によって説明可能であり、「ｍＲＮＡ輸送における細胞骨格」の概念を裏付ける。したがって、Ｈｕｈ−７細胞が、外因性刺激に反応して局所タンパク質翻訳に必要なｍＲＮＡの構造機構を含有し２１、そしてこれがその後、ｍｅｍＡｈＲを呼ぶ可能性が高い。より低いｍＲＮＡレベルはおそらく、細胞の示差安定性の維持における恒常的ＡｈＲ活性に相当する。リガンド活性化に際して、ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、Ｇβγ二量体およびＧαサブユニットに解離する可能性もあり、これには、各々異なる機能を行う、ＧＳ、Ｇｉ、Ｇｑ／１１およびＧ１２／１３が含まれる。ＢＢＰは、Ｇαｑ／１１およびＧβ産生の両方を３０分で誘導した（図１４ｄ）。Ｇαｑ／１１の上昇は、ｍｅｍＡｈＲおよびＧαｑ／１１の間の直接相互作用のためであった（図１４ｅ）。細胞においてｓｉＲＮＡを用いたＡｈＲのノックアウトによって、これらの結果をさらに確認した（図１４ｆ）。明らかに、これらのデータは、ＢＢＰ刺激によって、ＧＰＣＲが興奮し、そしてヘテロ三量体ＧαβγをＧαおよびＧβγサブユニットに解離し、Ｇαｑ／１１がその上流アクチベーターｍｅｍＡｈＲと相互作用することを可能にした。ＡｈＲはＧα１３およびＧαｑ／１１活性と関連づけられており、そして肝細胞腫細胞において、ＡｈＲ活性は細胞運命プロセスを攪乱可能であるため、それによって、ＡｈＲの持続発現は、腫瘍細胞増殖を促進しうる。実験は、Ｇαｑ／１１シグナル伝達に関与する分子事象に対して向けられた。
[00316]１つの態様において、ＡｈＲ活性調節は、細胞増殖を阻害するかまたは減少させることも可能である。別の態様において、ＡｈＲ活性調節は、細胞を殺すことも可能である。１つの態様において、調節は、細胞におけるＡｈＲタンパク質活性の下方制御を含む。別の態様において、調節は、細胞におけるＡｈＲタンパク質活性の阻害を含む。別の態様において、調節は、細胞におけるＧタンパク質とＡｈＲタンパク質の会合の阻害を含む。別の態様において、調節は、細胞におけるＡｈＲ遺伝子発現の下方制御を含む。１つの態様において、細胞は腫瘍細胞である。１つの態様において、腫瘍は、肺、乳房、結腸、脳、骨、肝臓、前立腺、胃、食道、皮膚または白血病腫瘍細胞である。１つの態様において、腫瘍は固形腫瘍である。別の態様において、腫瘍は液性腫瘍である。１つの態様において、ＡｈＲ活性はＡｈＲアゴニストで調節される。別の態様において、ＡｈＲ活性はＡｈＲアンタゴニストで調節される。別の態様において、ＡｈＲ活性は、抗エストロゲン活性を有する化合物で調節される。別の態様において、ＡｈＲ活性は、抗アンドロゲン活性を有する化合物で調節される。１つの態様において、腫瘍細胞は哺乳動物にある。別の態様において、腫瘍細胞はヒトにある。別の態様において、ヒトにおいて腫瘍を治療するための方法は、腫瘍において、ＡｈＲタンパク質の活性を阻害するかまたは減少させる化合物をヒトに投与することによって提供される。別の態様において、ヒトにおいて腫瘍を治療するための方法は、腫瘍においてＡｈＲタンパク質の遺伝子発現を阻害するかまたは減少させる化合物をヒトに投与することによって提供される。
[00317]共焦点免疫蛍光画像化顕微鏡観察のため、細胞をＢＢＰで各５分間および１５分間処理し、その後、ＡｈＲおよびＧαｑ／１１の両方の免疫蛍光染色を行った。ＢＢＰの非存在下で、核におけるよりも細胞質において、ＡｈＲおよびＧαｑ／１１両方のより少ない発現が観察された（図１５ａ）。ＢＢＰによって刺激された細胞において、５分で核および核周辺領域において、ＡｈＲ発現の明らかな増加が見られ、その後、１５分で、ＡｈＲの外へ向かう拡散が観察された（図１５ｂ、最初のカラム）。これらの結果によって、恒常的ＡｈＲ活性および細胞質ゾル転位置が示される。Ｇαｑ／１１の発現に関して、ＡｈＲのものと類似の方式で、５分で刺激されるようであった（図１５ｂ、二番目のカラム）。しかし、Ｇαｑ／１１は、１５分で細胞質ゾル区画から細胞膜に転位置し、発癌の観点に基づいて、細胞膜への正しい輸送を行うことが可能なＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の成熟を支持するが、正確な機構は不明である。続いて、ＡｈＲのｓｉＲＮＡノックアウトは、核ＡｈＲの発現を抑制したが、細胞質ゾルＡｈＲを抑制せず、これはスクランブル化ｓｉＲＮＡを用いたＡｈＲのノックアウトによって確認された（図１５ｃ）。しかし、ＢＢＰを添加した際、ＡｈＲ発現は、５分で、核および核周辺領域で増加し、１５分で、細胞質ゾルにおいてホメオスタシス状態に到達した（図１５ｄ、最初のカラム）。特に、Ｇαｑ／１１は、ＡｈＲ ｓｉＲＮＡによって抑制され（図１５ｄ、第二のカラム）、これはＢＢＰを添加することによって、５分で部分的に回復し、そして１５分で完全に回復して、細胞膜でのＧαｑ／１１の見かけの集積を示した（図１５ｄ、第二のカラム）。これらの結果によって、Ｇαｑ／１１がｍｅｍＡｈＲの下流エフェクターであることが示された。ＡｈＲおよびＧαｑ／１１両方の動的移動および恒常的活性によって、さらに、細胞における活性化、転位置および成熟を伴う補償効果が示唆された。
[00318]空間時間動力学のため、二重免疫金透過型電子顕微鏡（ＩＥＭ）を用いて、形質膜でのｍｅｍＡｈＲの相互作用を示した。細胞をＢＢＰで２０分間処理し、そして金大粒子タグ化Ｇαｑ／１１（サイズ２０ｎｍ）および金小粒子タグ化ＡｈＲ（サイズ６ｎｍ）の特異的一次抗体および二次抗体を用いた免疫細胞化学に供した。試料を直ちにＬＲ Ｗｈｉｔｅ樹脂（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、カリフォルニア州レディング）中に包埋し、そしてＩＥＭ用に調製した。リガンドの非存在下で、これらの別個の免疫金タグ化Ｇαｑ／１１実体は、単一、二重および三重クラスターを含めて細胞膜でディスプレイされ（図１６ａ）、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の異なる実体の存在が反映された。細胞をＢＢＰで処理すると、大きい金タグ化Ｇαｑ／１１に接着した多数の小さい金タグ化ＡｈＲが、細胞膜でＡｈＲ−Ｇαｑ／１１複合体を形成することが観察された（図１６ｂ）。古典的単量体および最近認められた二量体に加えて、ポリマー性ＧＰＣＲ−Ｇαｑ／１１の存在が細胞膜で観察された。これによって、単量体、二量体およびポリマーを含むＧＰＣＲの多様なコンホメーション変化が示唆される（図１６ｃ）。ＡｈＲ−Ｇαｑ／１１複合体は、主に、形質膜で見られた。細胞質ゾルにはいくつか見られたが、核区画では見られず、核区画では、豊富なＡｈＲおよびＧαｑ／１１が独立に存在した。こうしたＡｈＲ−Ｇαｑ／１１相互作用は、対照細胞ではまったく見られなかった。データによって、ｍｅｍＡｈＲおよびＧＰＣＲ−Ｇαｑ／１１複合体のクラスターは、リガンド活性化の前にはあらかじめカップリングされないことが明らかになった。ＧＰＣＲの重合（ホモまたはヘテロマルチマーいずれか）は、相互作用する分子の機能、細胞内局在、および生物物理特性を調節するのに有効な様式であるため、意味がある。これはおそらく、アゴニストおよびアンタゴニストなどの外因性リガンド、または細胞表面での相乗結合のスクリーニングのための、より空間的なドッキング部位の生成を可能にする。あるいは、これは、生物学的影響の最も不可解な側面の１つ；具体的には、環境中の多環芳香族炭化水素化合物が、細胞における、毒性、代謝性および発癌性反応とどのように関連するかに関する手掛かりを提供する。
[00319]Ｇタンパク質シグナル伝達の生化学的プロセスを研究するため、先に記載されるように、ＢＢＰによって活性化された際、ｍｅｍＡｈＲはＧαｑ／１１と相互作用可能であることを検証した。続いて、ホスファチジルイノシトール（ＰＩＰ２）レベルの減少を観察し、ＰＩＰ２の２つの二次メッセンジャー：ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびＩＰ３への切断が生じるのを観察した（図１７ａ、第一のパネル）。ＩＰ３は、小胞体で、受容体ＩＰ３Ｒを通じて、細胞内カルシウムの放出を誘導することが知られる（図１７ａ、第二のパネル）。Ｇタンパク質活性化には、しばしば、カルシウムイオンの流入が付随するため、リアルタイム生存細胞免疫蛍光画像化顕微鏡観察によって、ＢＢＰ誘発細胞内ｆｌｕｏ−４タグ化Ｃａ２＋レベルの起源を調べた（図１７ｂ、中央上部）。細胞をカルシウム不含培地中で培養し、そして細胞内カルシウムの放出を見出し（図１７ｂ、中央下部）、これは、内部カルシウム貯蔵からの放出を示した。この結果はさらに、ＩＰ３Ｒブロッカー２−ＡＰＢを添加することによって確認され、該ブロッカーは、細胞内カルシウムレベルを用量依存的に阻害することが見出された（図１７ｂ、右カラム）。しかし、異常なカルシウム放出は、炎症反応４および腫瘍発生を誘導しうる。したがって、ＢＢＰは、１５分でＣＯＸ−２の産生を誘導することが観察され、これは２−ＡＰＢを添加することによってブロック可能であり（図１７ｃ）、細胞内カルシウムの増加とＣＯＸ−２の活性化が関連づけられた。さらに、ＢＢＰは、細胞外シグナルに制御されるプロテインキナーゼＥＲＫのリン酸化およびＣＯＸ−２の活性化を誘導し（図１７ｄ）、これは、ＭＡＰＫ経路の強力でそして選択的非競合阻害剤である化学薬品ＰＤ９８０５９によってブロックされ（図１７ｅ）、ＥＲＫがＣＯＸ−２の上流活性化因子であることが示された。この目的を達成するため、ＢＢＰは、分子プロセスにおいて、ｍｅｍＡｈＲが活性化するＧαｑ／１１シグナル伝達を通じてＣＯＸ−２の活性化を誘導することが示された。ＢＢＰが、ＡｈＲ核転位置因子タンパク質をコードする遺伝子であるＡＲＮＴ発現を有意に阻害するため、これは、非ゲノムＡｈＲ経路の存在を示す（図１７ｆ）。この阻害性効果は、先に記載されるように、同時活性化されたＧα１３の作用として解釈可能である。
[00320]ＡｈＲは、外部シグナルに反応したシグナル伝達分子である可能性があり、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質シグナル伝達の興奮を生じることが立証される。ヒト肝臓Ｈｕｈ−７癌細胞において、シグナルが、近くにある（活性化因子としての）細胞質ゾルｍｅｍＡｈＲを細胞膜に「引き」、解離した（エフェクターとしての）Ｇαｑ／１１に結合し、そしてこれを活性化して、そして機能のため、下流分子カスケードを「押す」と提唱される。この「引くおよび押す」モデルは、図１７ｇに例示するように、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質シグナル伝達の制御が、どのように開始され、そしてＡｈＲ仲介シグナル伝達が古典的ＡｈＲ経路を越えてどのように調節されているかを理解するために非常に寄与している。この発見はさらに、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の機械的制御に重点を置いた療法剤の開発にも影響を及ぼしうる。
[00321]細胞培養および化学薬品。Ｈｕｈ−７細胞を台湾国家衛生研究院から得て、そして１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１０μｇ）、アンホテリシン−Ｂ（０．２５ｍｇ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養し、そして３７℃、５％ＣＯ２中で増殖させた。培地には、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、Ｄ−グルコース（５．５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１３０ｍＭ）、ＫＣｌ（５．４ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）およびＭｇＳＯ４（１ｍＭ）を含有するＢＳＳが含まれた。カルシウム不含培地は、Ｄ−グルコース（５．５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１３０ｍＭ）、ＫＣｌ（５．４ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）およびＭｇＳＯ４（３ｍＭ）を含有した。化学薬品には、Ｆｌｕｏ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フタル酸ベンジルブチル（ＢＢＰ、Ｓｉｇｍａ）、２−アミノエトキシジフェニルボレート（２−ＡＰＢ、Ｓｉｇｍａ）、ＥＲＫ１／２阻害剤： ＰＤ９８０５９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）が含まれた。抗体には、ＡｈＲ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｃｏｘ−２（Ｍｉｎｉｐｏｒｅ）、Ｇαｑ／１１（ｓｃ−３９２）およびＧβ（ｓｃ−３７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ）、ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ホスホ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、色素Ｌｉｇｈｔ ４８８コンジュゲート化二次抗体（緑色）および色素Ｌｉｇｈｔ ５４９コンジュゲート化二次抗体（赤色）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）が含まれた。
[00322]初期卵管子宮外妊娠の女性において着床前の胚から得られたｈＴＳ細胞が、先に記載された。接着性ｈＴＳ細胞を、１０μｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ＪＲＨ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）、１０％ＦＢＳ、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する馴化α−ＭＥＭ中、３７℃５％ＣＯ２中で培養した。細胞を実験に応じて多様な時間間隔でＲＡ（１０μＭ）によって処理した。
[00323]ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ。Ｈｕｈ−７細胞（３ｘ１０５）を６ウェルディッシュ内に植え付け、そして２４時間インキュベーションした。血清不含培地中で一晩培養した細胞をＢＢＰ（１μＭ）で多様な時間間隔で処理した。ＢＢＰ刺激後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＴＲＩｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（２μｇ）を用いて、逆転写系（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、ｃＤＮＡを合成した。特異的プライマーによって、ｃＤＮＡを増幅した。プライマー対は、以下のように設計された：ＡｈＲ、順方向５’−ＴＡＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＣＴ ＧＧ−３’、逆方向５’−ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＣＴ ＣＣＧ ＡＴＴ ＣＣ−３’； β−アクチン、順方向５’−ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＣＣＡ−３’、逆方向５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＴＴＣ−３’。ＰＣＲ条件を、９５℃５分間および９５℃３０秒間、５４℃３０秒間、７２℃１分間、その後、７２℃１０分間（３６周期）に設定した。産物を２％アガロースゲルによって分離し、そしてエチジウムブロミドによって視覚化した。
[00324]ウェスタンブロッティング分析。Ｈｕｈ−７細胞（１ｘ１０６）を１０ｃｍディッシュに植え付け、そして一晩培養した。培地を血清不含培地に交換してもう一晩培養した。細胞を多様な時間間隔でＢＢＰ（１μΜ）で処理した。他の研究のため、細胞を化学薬品ＰＤ９８０５９（２０μΜ）または２−ＡＰＢ（３０μΜ）で１時間、前処理し、その後、ＢＢＰで処理した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｍｉｎｉｐｏｒｅ）で溶解した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ）でタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質（３０μｇタンパク質）を８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜上にトランスファーし、そして５％脱脂粉乳で室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、ＡｈＲ（１：１０００）、Ｃｏｘ−２（１：１０００）、Ｇαｑ／１１（１：１００）、Ｇβ（１：１００）、β−アクチン（１：５０００）、ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ（１：１０００）またはホスホ−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ（１：１０００）を含む一次抗体と膜を４℃で一晩インキュベーションした。細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、そして次いでＨＲＰコンジュゲート化二次抗体と室温で１時間インキュベーションした。洗浄後、増進化学発光キット（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、ブロットを視覚化した。
[00325]ＣｈＩＰ。ＣｈＩＰキット（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニューヨーク州レークプラシッド）を用いることによって、細胞を一晩、血清枯渇させ、そしてＲＡ（１０μΜ）で４時間処理した。アッセイのため、簡潔には、溶解物を氷上で超音波処理し、ＤＮＡを剪断した。架橋クロマチンをプロテインＧアガロースに加えて抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（陽性対照）、または正常マウスＩｇＧ（陰性対照）または示す一次抗体とインキュベーションした。５Ｍ ＮａＣｌ、ＲＮアーゼＡ、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ、およびプロテイナーゼＫで連続処理した後、スピンフィルターによってＤＮＡ混合物を得て、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した。
[00326]免疫沈降。Ｈｕｈ−７細胞を一晩、血清枯渇させ、そしてＢＢＰ（１μΜ）で３０分間処理した。プロテインＧ−アガロース（Ｍｉｎｉｐｏｒｅ）で３０分間プレクリーニングした後、特異的抗体Ｇαｑ／１１またはウサギＩｇＧを培養に添加し、これを再び一晩インキュベーションした。プロテインＧ−アガロースと２時間インキュベーションした後、ビーズをＲＩＰＡ溶解緩衝液で３回洗浄し、試料緩衝液中で煮沸し、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＡｈＲイムノブロッティング分析に供した。
[00327]細胞を一晩、血清枯渇させ、そしてＲＡ（１０μＭ）で４時間処理した。細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって溶解した。溶解物およびプロテインＡまたはプロテインＧアガロース（Ｍｉｎｉｐｏｒｅ）の混合物を揺動しながら４℃で２時間インキュベーションした。特異的一次抗体またはウサギＩｇＧ（対照）を添加し、そして一晩インキュベーションした。次いで、プロテインＡまたはプロテインＧいずれかを含むビーズ上に免疫タンパク質複合体を捕捉した。抗体−結合タンパク質を一晩揺動することによって沈降させた。免疫沈降タンパク質をＲＩＰＡ溶解緩衝液で洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび相互作用を測定する別の特異的抗体でイムノブロッティングして分析した。
[00328]免疫蛍光。免疫細胞化学のため、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ／０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した（１５分）。５％ＦＢＳブロッキング溶液（２時間）、そして３回リンスし、細胞をＰＢＳ中の特異的一次抗体と４℃で一晩インキュベーションした。適切なＦＩＴＣまたはＰＥまたはテキサスレッド・コンジュゲート化二次抗体を１時間添加し、その後、核のためＤＡＰＩ染色（５分間）を行って、そして顕微鏡観察に供した。
[00329]全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡観察。ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、ウィスコンシン州マディソン）を２４時間用いることによって、ｐＧＦＰ−Ｃ１−ＡｈＲ（Ｈ．Ｌｉより寄贈）でＨｕｈ−７細胞をプレトランスフェクションした。ＴＩＲＦ顕微鏡観察のため、細胞を血清不含培地中、カバースリップ上で一晩培養し、その後、ＢＢＰ（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）によって刺激した。Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ． ４．８ソフトウェアを伴うＺｅｉｓｓ ＴＩＲＦ顕微鏡を用いることによって、細胞膜でＧＦＰタグ化ＡｈＲの動的活性を観察し、そして分析した。
[00330]リアルタイム生存細胞画像化顕微鏡観察。細胞を、ＢＳＳ緩衝液中でＣａ２＋特異的色素であるＦｌｕｏ−４（１μＭ）で、３７℃で２０分間、前処理した後、ＢＢＰ（１μＭ）で処理した。リアルタイム細胞画像化顕微鏡観察によって相対細胞内カルシウム強度の測定を行い、そしてＣｅｌｌ−Ｒソフトウェア系（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって分析した。カルシウム不含培地または多様な濃度で用いるＩＰ３Ｒ阻害剤２−ＡＰＢを用いて、細胞培養中の細胞内カルシウム反応を試験した。
[00331]共焦点免疫蛍光画像化顕微鏡観察。ＡｈＲ ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションを伴うまたは伴わない細胞をＢＢＰ（１μＭ）で各々、５分間および１５分間処理した。ＡｈＲおよびＧαｑ／１１に関する一次抗体および二次抗体で処理した後、細胞を共焦点免疫蛍光顕微鏡観察に供して、細胞区画における動的運動を分析した。
[00332]二重免疫金透過型電子顕微鏡観察。マイクロ波固定およびプロセシングによって得たプラスチック包埋細胞の超薄切片２４を５％メタ過ヨウ素酸ナトリウムで前処理した（１０分間）。グリッドを、ＡｈＲまたはＧαｑ／１１に対するＩｇＧ抗体（Ｃ−１９、ｓｃ−３９２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）のアリコットとインキュベーションし、その後、それぞれ、二次抗マウスＩｇＧ金粒子（サイズ６ｎｍ）または抗ウサギＩｇＧ金粒子（サイズ２０ｎｍ）でプロービングした。洗浄後、１％オボアルブミンを含むＰＢＳの滴上にグリッドを置く（１５分間）ことによって、切片をブロッキングした。次いで、切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、そして透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ−７００モデル、日本）上で性質決定した。
[00333]本明細書に言及するすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的に、そして個々に、援用すると示されているのと同じ度合いまで、本明細書に援用される。Ｏｌａｎｏｗ， Ｃ． Ｗ． Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ５５， ４１−６０（２００４）。
[00383]いくつかの態様を本明細書に示し、そして記載してきているが、当業者には、こうした態様が例としてのみ提供されることが明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多くの変動、変化、および置換が当業者には思い浮かぶであろう。本明細書記載の発明の態様に対する多様な代替物を、本発明を実施する際に使用可能であることを理解すべきである。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、そしてこれらの請求項およびその同等物の範囲内の方法および構造が本明細書に含まれると意図される。

Claims (12)

  1. 尾側（ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ）ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、Ｎａｎｏｇ、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、レチノイン酸受容体ベータ（ＲＡＲβ）、レチノイドＸ受容体アルファ（ＲＸＲα）、レチノイドＸ受容体ベータ（ＲＸＲβ）、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ−２）およびレチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ３（ＲＡＬＤＨ−３）であるタンパク質を発現する、単離ヒト神経幹細胞であって、
    単離ヒト・トロホブラスト幹細胞と比較して、細胞表面タンパク質ＣＤ３３またはＣＤ１３３の発現が低レベルであるか、または、これらの細胞表面タンパク質を発現しない、前記単離ヒト神経幹細胞。
  2. 妊娠年齢６〜８週のトロホブラスト組織から得られる単離ヒト・トロホブラスト幹細胞から製造される、請求項１の単離ヒト神経幹細胞。
  3. 哺乳類の神経学的疾患もしくは障害の治療または防止において使用するための化合物をスクリーニングする方法であって：
    ａ．請求項１または２の単離ヒト神経幹細胞と前記化合物を接触させ；そして
    ｂ．前記単離ヒト神経幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の活性における変化を検出する
    工程を含む、前記方法。
  4. 前記単離ヒト神経幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の前記活性が、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離ヒト神経幹細胞に比較した際、減少している、請求項３の方法。
  5. 前記単離ヒト神経幹細胞における、少なくとも１つの遺伝子、転写物またはタンパク質の前記活性が、前記化合物と接触させなかった匹敵する単離ヒト神経幹細胞に比較した際、増加している、請求項３の方法。
  6. 前記神経学的疾患もしくは障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ失調症、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症、統合失調症、麻痺、多発性硬化症、脊髄傷害、脳傷害、脳神経障害、末梢性感覚ニューロパシー、癲癇、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルパース病、小脳／脊髄小脳変性、バッテン病、皮質基底核変性、ベル麻痺、ギラン−バレー症候群、ピック病、および自閉症である、請求項３〜５のいずれかの方法。
  7. 請求項１または２のヒト神経幹細胞を製造する方法であって：
    ａ．ヒト・トロホブラスト幹細胞をレチノイン酸と接触させ；そして
    ｂ．前記ヒト・トロホブラスト幹細胞において、ＰＩＰ２、または、１またはそれより多いタンパク質を調節し、ここで該１またはそれより多いタンパク質が、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｆｚｄ６、Ｄｖｌ３、ＦＲＡＴ１、ＧＳＫ３β、ＨＤＡＣ６、β−カテニン、Ｇαｑ／１１、Ｇβ、ＲＸＲα、ＲＡＲβ、ＧＬｕＲ１、ＰＩ３Ｋ、ＡＫｔ１、ＡＫｔ２、ＡＫｔ３、ｍＴＯＲ、ＥＩＦ４ＥＢＰ、ＣＲＥＢ１、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＰＬＣ−β、ＣａＭＫＩＩ、ＥＩＦ４Ｂ、パーキン、ＳＮＣＡ、チューブリン、カルシニューリン、ＣＲＭＰ−２、ＮＦＡＴ１、インポーチン、ＬＥＦ１、Ｐｉｔｘ２、ＭＥＦ２Ａ、またはＥＰ３００を含む
    工程を含む、前記方法。
  8. 請求項７の方法であって、ここで前記ヒト神経幹細胞が、ドーパミン産生細胞、ドーパミン作動性ニューロン、単極ニューロン、双極ニューロン、多極ニューロン、グルタミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性（ガンマアミノ酪酸）ニューロン、錐体細胞、プルキンエ細胞、前角細胞、バスケット細胞、ベッツ細胞、レンショウ細胞、顆粒細胞、ＧＲＰ細胞、ＮＲＰ細胞、ＭＮＳ細胞、ＡＳＴ細胞、ＴＧＣ細胞、または中型有棘細胞の表現型を有する、方法。
  9. 請求項７または８の方法であって、ここでヒト神経幹細胞が、ドーパミン、グルタミン酸ＮＭＤＡ受容体のサブユニット、シナプシンＩ、カルシウムチャネルマーカー、ＧＡＰ−４３、電位依存性Ｋ＋チャネル、電位依存性Ｃａ＋チャネル、または電位依存性Ｎａ＋チャネルの発現を含む１またはそれより多いニューロン特性を持つ、方法。
  10. 神経学的障害を治療する必要があるヒト対象における神経学的障害の治療における使用のための、請求項１または２の単離ヒト神経幹細胞を含有する医薬。
  11. 前記神経学的障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ失調症、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症、統合失調症、麻痺、多発性硬化症、脊髄傷害、脳傷害、脳神経障害、末梢性感覚ニューロパシー、癲癇、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルパース病、小脳／脊髄小脳変性、バッテン病、皮質基底核変性、ベル麻痺、ギラン−バレー症候群、ピック病、および自閉症である、請求項１０の医薬。
  12. ヒト神経幹細胞を製造する方法であって、単離ヒト・トロホブラスト幹細胞をレチノイン酸と接触させる工程を含み、ここで該単離ヒト・トロホブラスト幹細胞は妊娠年齢６〜８週のトロホブラスト組織に由来し、
    前記ヒト神経幹細胞が、尾側（ｃａｕｄａｌ ｔｙｐｅ）ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、Ｎａｎｏｇ、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、レチノイン酸受容体ベータ（ＲＡＲβ）、レチノイドＸ受容体アルファ（ＲＸＲα）、レチノイドＸ受容体ベータ（ＲＸＲβ）、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ−２）およびレチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ３（ＲＡＬＤＨ−３）であるタンパク質を発現し、
    前記ヒト神経幹細胞が、単離ヒト・トロホブラスト幹細胞と比較して、細胞表面タンパク質ＣＤ３３またはＣＤ１３３の発現が低レベルであるか、または、これらの細胞表面タンパク質を発現しない、方法。
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