CN111944846B - 猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用，本发明成功构建猪Crabp2过表达载体并通过转染猪卵泡颗粒细胞实现细胞内表达。发现Crabp2过表达可降低猪卵泡颗粒细胞的凋亡率，促进颗粒细胞凋亡相关基因Bcl‑2的表达，抑制Bax、Caspase‑3、Fas和FasL的表达，进而在猪卵泡颗粒细胞中发挥抗凋亡的调控作用。

Description

猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种猪Crabp2基因在猪卵泡颗粒细胞中抗凋亡的用途。

背景技术

在哺乳动物卵巢中，每个生殖周期只有少数卵泡最终成熟并排卵，超过99％的卵泡都经历了一种称作闭锁的退化过程，卵泡闭锁是哺乳动物卵巢卵泡生长和发育的阴性选择过程。目前研究已经表明，卵巢颗粒细胞凋亡在卵泡闭锁过程中发挥主要作用。正常生长发育的卵泡内只有很少的凋亡的颗粒细胞，当正常晚期卵泡内颗粒细胞凋亡率达10％以上时卵母细胞就会被诱导凋亡，卵泡随即发生闭锁，因此颗粒细胞的凋亡也被看作是卵泡闭锁的主要原因之一。

相关研究表明，全反式视黄酸(All-trans retinoic acid,ATRA)对卵泡发育过程中颗粒细胞的功能起到重要的调控作用。细胞质视黄酸结合蛋白(Cytoplasm retinoicacid binding proteins,Crabps)可结合ATRA。虽然该蛋白质功能的重要性尚未被完全了解，但它可能发挥向核受体递送配体从而增强ATRA的生物学作用。Crabps(约16-17kDa)是一种与ATRA有高亲和性的蛋白，属于细胞内脂质结合蛋白(Lipid binding protein,ILBP)多基因家族。其中Crabp2是Crabps蛋白家族中的重要成员。Crabp2在细胞质和细胞核均有表达。鉴于它的表达特点及与ATRA的高亲和力和特异性，Crabp2被认为是细胞中传递ATRA信号的信使。已有研究表明，Crabp2可能参与将ATRA转运到细胞核，参与视黄酸受体的激活和ATRA依赖性基因的调节。猪Crabp2基因位于猪4号染色体上，编码138个氨基酸，与人、鼠的同源性分别为95％、92％，主要在脑和脂肪中高表达，其次是肺脏、骨骼肌和肾脏，在心脏和大肠中表达最低。前期研究发现Crabp2可参与多种细胞凋亡的调控，例如敲低Crabp2可诱导人恶性外周神经鞘瘤细胞的凋亡；过表达Crabp2可促进人子宫内膜细胞的凋亡；Crabp2沉默可促进成纤维样滑膜细胞的凋亡。但至今还未见有关于Crabp2对猪卵泡颗粒细胞凋亡作用的报道。

Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax与Caspase家族蛋白Caspase-3都是细胞凋亡过程中重要的调控蛋白。其中Bax是决定细胞凋亡的重要蛋白，Caspase-3是细胞凋亡的执行者，二者被认为是促凋亡蛋白；而Bcl-2可通过抑制细胞Bax的表达进而抑制细胞凋亡，被认为是抗凋亡蛋白。相关研究表明，死亡受体家族凋亡通路在细胞凋亡中起关键作用，而Fas/FasL死亡受体通路被认为是最重要的介导细胞凋亡的通路。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供一种Crabp2的新的功能，调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。

本发明的技术方案为：猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用。

进一步地，在猪卵泡颗粒细胞中过表达猪Crabp2基因，从而对猪卵泡颗粒细胞起到抗凋亡的作用。

进一步地，在猪卵泡颗粒细胞中过表达猪Crabp2基因，从而促进Bcl-2的表达。

进一步地，在猪卵泡颗粒细胞中过表达猪Crabp2基因，从而抑制Bax、Caspase-3、Fas和FasL的表达。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明成功构建猪Crabp2过表达载体并通过转染猪卵泡颗粒细胞实现细胞内表达。发现Crabp2过表达可降低猪卵泡颗粒细胞凋亡率，促进颗粒细胞凋亡相关基因Bcl-2的表达，抑制Bax、Caspase-3、Fas和FasL的表达，进而在猪卵泡颗粒细胞中发挥抗凋亡的调控作用。

附图说明

图1猪卵巢组织cDNA PCR产物的鉴定；M：DL2 000DNA Marker；1、2：猪卵巢组织cDNA PCR产物。

图2Crabp2基因的扩增测序比对结果，Query：测序目的序列；Sbject：Genbank参考序列。

图3重组表达载体双酶切鉴定图，A：pGEM-T-Crabp2双酶切凝胶电泳图，M：DL2000DNA Marker，1、2：pGEM-T-Crabp2的酶切产物；B：pcDNA3.1-Crabp2双酶切凝胶电泳图，M：DL2 000DNA Marker，1、2：pcDNA3.1-Crabp2的酶切产物。

图4Crabp2过表达载体酶切产物测序结果图。

图5荧光显微镜观察猪卵泡颗粒细胞FSHR表达情况，A：FSHR抗体免疫的颗粒细胞(100×)；B：FSHR抗体阴性对照的颗粒细胞(100×)。

图6Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞Crabp2表达的影响，A：Crabp2过表达载体转染24h后颗粒细胞Crabp2 mRNA表达变化；B：Crabp2过表达载体转染48h后颗粒细胞Crabp2mRNA表达变化；C：Crabp2过表达载体转染颗粒细胞Crabp2蛋白表达变化。*表示0.01<P<0.05为差异显著，**表示P<0.01为差异极显著。

图7Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡率的影响，A：转染pcDNA3.1(+)空载体质粒的颗粒细胞检测结果；B：转染pcDNA3.1-Crabp2质粒的颗粒细胞检测结果；C：颗粒细胞凋亡率的变化。*表示0.01<P<0.05为差异显著，**表示P<0.01为差异极显著。

图8Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响，A：Crabp2过表达载体转染24h后颗粒细胞凋亡相关基因表达变化；B：Crabp2过表达载体转染48h后颗粒细胞凋亡相关基因表达变化。*表示0.01<P<0.05为差异显著，**表示P<0.01为差异极显著。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

1材料与方法

1.1材料

卵巢来源：成年猪卵巢采集自湖南省长沙市红星盛业食品股份有限公司屠宰场。

试剂、培养基：pcDNA3.1(+)真核表达载体(Invitrogen，美国)；pGEM-T质粒载体(Promega，美国)；T4 DNA连接酶和反转录酶M-MLV(Promega)；LA酶、限制性内切酶HindⅢ和EcolⅠ、DL2000 Marker(TaKaRa，日本)；琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega)；无内毒素质粒提取试剂盒、感受态细胞DH5α(Tiangen)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)；PrimeScript^TM RT reagent Kit、

Premix Ex Taq^TM(TaKaRa，日本)；RIPA细胞裂解液(碧云天)；蛋白定量测定试剂盒(南京建成)；DME/F-12培养基(Hyclone，美国)。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

根据NCBI GenBank中报道的猪Crabp2基因的mRNA序列，利用Primer Premier 5在基因的编码区内设计特异性上、下游引物。Crabp2基因过表达上游引物:5′-AAGCTT(HindIII)ATGCCCAACTTCTCTGG-3′(SEQ ID No.2)，下游引物:5′-GAATTC(EcoRI)TCACTCTCGGACATAGAC-3′(SEQ ID No.3)。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.2PCR扩增目的基因

提取完整猪卵巢总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板用含酶切位点的引物(SEQID No.2和SEQ ID No.3)进行PCR扩增，扩增出含HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的目的片段。扩增条件：cDNA模板1μL，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，Taq聚合酶0.14μL，加水补足25μL。反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，72℃退火1min，72℃延伸3min，循环30次，72℃延伸10min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，按照DNA胶回收试剂盒说明操作获得纯化的目的基因。

1.2.3连接pGEM-T质粒载体

胶回收产物先用T4 DNA连接酶连接到pGEM-T质粒载体。连接反应体系为10μL：胶回收产物1μL，pGEM-T质粒载体1μL，2×Rapid Libgation buffer 5μL，T4 DNA连接酶1μL，去离子水2μL，4℃连接过夜。连接后质粒载体命名为pGEM-T-Crabp2。将pGEM-T-Crabp2转化到DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，采用快速质粒小提试剂盒对菌液进行提取，获得纯化的pGEM-T-Crabp2质粒载体。

1.2.4重组质粒构建

分别用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ对质粒pGEM-T-Crabp2和pcDNA3.1(+)质粒空载体进行双酶切。质粒pGEM-T-Crabp2双酶切体系为50μL：pGEM-T-Crabp2 25μL，去离子水17μL，10×M buffer 5μL，限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ各1.5μL。pcDNA3.1(+)质粒空载体双酶切体系为20μL：pcDNA3.1(+)质粒空载体2μL，去离子水14μL，限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ各1μL，10×M buffer 2μL。室温反应1h。pGEM-T-Crabp2和pcDNA3.1(+)质粒空载体的双酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，反应体系为10μL：pGEM-T质粒载体双酶切产物3μL，pcDNA3.1(+)质粒空载体双酶切产物1μL，2×Rapid Libgation buffer 5μL，T4 DNA连接酶1μL，4℃反应过夜。连接后重组质粒载体命名为pcDNA3.1-Crabp2，转化到DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取重组质粒pcDNA3.1-Crabp2并用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切，室温反应1h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳鉴定后，菌液送上海生工测序。测序后对重组质粒pcDNA3.1-Crabp2和pcDNA3.1(+)空载体的菌液进行大提质粒，获得纯化的重组质粒pcDNA3.1-Crabp2和pcDNA3.1(+)空载体进行下一步实验。

1.2.5细胞转染

从屠宰场回收猪卵巢，放入事先预热含1％双抗生理盐水中，2～4h内运回实验室，用含1％青链霉素预热的生理盐水冲洗干净。注射器抽吸卵巢上3～6mm的卵泡，将卵泡液37℃沉降15min后，取上清液1000r/min离心7min，弃上清，沉淀用红细胞裂解液37℃处理2min，1000r/min离心7min，PBS洗涤2遍。将洗涤好的颗粒细胞移入培养瓶中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养。细胞成熟培养3天后，更换新鲜培养基直到长满，胰酶消化后按1×10⁶个/mL的细胞密度接种到6孔板中培养，再加入含12％胎牛血清的DME/F12培养基培养24h后，将重组质粒pcDNA3.1-Crabp2和pcDNA3.1(+)质粒空载体分别转染入卵泡颗粒细胞。分别于转染重组质粒和空载体24h和48h后收集细胞，用于后续基因和蛋白的检测。

1.2.6细胞免疫荧光

将猪卵泡颗粒细胞接种到6孔板中培养至长满，去除培养基，PBS洗涤细胞3次，加入4％多聚甲醛，室温固定2h。去除液体后加入0.2％Triton X-100室温透化30min。加入2％BSA溶液室温封闭2h。按照1:100的比例稀释促卵泡激素受体(Follicle stimulatinghormone receptor,FSHR)一抗(Proteintech，美国)，4℃孵育过夜。颗粒细胞用PBS洗三次，荧光标记二抗(1:100)(Proteintech，美国)室温孵育1h。PBS洗涤颗粒细胞，加入DAPI复染室温孵育15min，细胞洗涤后于荧光倒置显微镜下观察。

1.2.7实时荧光定量PCR

将收集的细胞提取总RNA，分光光度计测定其浓度，取1μg RNA反转录得到cDNA，以此cDNA为模板按荧光定量试剂盒提供的方法进行基因扩增以检测基因mRNA的表达水平。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq 5μL，上下游引物各0.2μL(0.2μmol/L)，50×ROX Reference Dye 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 3.4μL，总体积10μL。反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火延伸30s，共40个循环。所有操作过程均在冰上完成。反应在荧光定量PCR仪(ABI Step One)上进行，并按照2^-ΔΔCt方法计算基因表达的相对比值，以Gapdh作为内参基因。qRT-PCR引物设计见表1。

表1 qRT-PCR反应引物序列

1.2.8蛋白免疫印迹

RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，蛋白定量测定试剂盒测定总蛋白浓度，取30μg总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜并封闭。按照1:1000的比例稀释Crabp2一抗(Proteintech，美国)，4℃孵育过夜。二抗(稀释比为1:2000)室温摇床孵育1h后，添加ECL化学发光显色液30s，于Bio-Rad公司ChemiDocTM XRS⁺系统成像；并用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度分析，以Gapdh作为内参计算蛋白相对表达量。

1.2.9细胞凋亡率检测

猪卵泡颗粒细胞凋亡率的检测根据Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。细胞转染重组质粒pcDNA3.1-Crabp2和pcDNA3.1(+)质粒空载体24h后，应用不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。细胞经吹打后转移到离心管内，1000r/min离心5min，弃上清收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。先后加入Annexin V-FITC结合液、Annexin V-FITC染料、PI染料，混匀后室温避光孵育20min。应用流式细胞仪(BD LSRII Flow CytometerSystem)进行上机检测，结果通过FACS Diva Software软件进行分析。

1.2.10统计分析

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，组间应用独立样本t检验进行方差分析和显著性检验，试验数据以“平均值±标准误”表示，所有数据均重复3次以上。P**<0.01表示差异极显著，0.01<P*<0.05表示差异显著。

2结果

2.1 Crabp2基因PCR扩增

以猪卵巢cDNA为模板对Crabp2基因进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增片段大小与目的基因片段(417bp)大小基本一致(图1)。扩增产物经胶回收纯化后测序，序列如SEQ ID No.1所示，测序结果与NCBI Genbank数据库中猪Crabp2 mRNA比对同源性为99％(图2)，进一步证实扩增片段为猪Crabp2基因。

2.2 Crabp2过表达载体的构建及鉴定

目的基因经胶回收纯化后连接到空质粒pGEM-T得到pGEM-T-Crabp2重组质粒，挑取阳性克隆进行培养，pGEM-T-Crabp2经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，获得大小约417bp和3000bp的条带，其大小与理论值一致(图3中A)。重组质粒pcDNA3.1-Crabp2应用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分析可见约417bp和5428bp两个条带，其大小与理论值基本一致(图3中B)。目的基因测序结果正确，与预期相符(图4)。上述结果表明过表达重组质粒pcDNA3.1-Crabp2构建成功。

2.3猪卵泡颗粒细胞的鉴定

应用细胞免疫荧光的方法，检测分离培养的猪卵泡颗粒细胞中卵巢颗粒细胞的标志分子FSHR的表达情况。结果显示，用FSHR抗体免疫细胞，荧光显微镜下观察被免疫的细胞发出绿色荧光(图5中A)，阴性对照组无绿色荧光(图5中B)，说明细胞分泌的FSHR蛋白与FSHR抗体结合，表明贴壁生长的细胞为猪卵泡颗粒细胞，所分离培养的细胞满足后续实验要求。

2.4猪卵泡颗粒细胞转染Crabp2过表达载体后Crabp2表达变化

将Crabp2过表达载体与pcDNA3.1(+)空载体分别瞬时转染猪卵泡颗粒细胞24h和48h后，通过qRT-PCR和Western Blot检测颗粒细胞Crabp2基因和蛋白的表达情况。结果显示，与空载体转染组相比，转染Crabp2过表达载体的颗粒细胞Crabp2 mRNA和蛋白表达量均极显著升高(P<0.01)(图6)。进一步证实过表达载体pcDNA3.1-Crabp2构建成功，并且利用瞬时转染的方法可有效提高Crabp2在猪卵泡颗粒细胞中的表达。

2.5Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡率的影响

为了研究Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响，本试验通过流式细胞术检测Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡率的影响。结果表明，与对照组相比，瞬时转染Crabp2过表达载体24h可显著降低颗粒细胞的凋亡率(P<0.05)(图7)。

2.6Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

为了进一步研究Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡的作用，试验通过qRT-PCR方法，检测Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞促凋亡基因Bax、Caspase-3、Fas及FasL与抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达的影响。结果表明，瞬时转染Crabp2过表达载体24h可显著促进颗粒细胞Bcl-2mRNA的表达(P<0.05)，极显著抑制Bax、Caspase-3与Fas mRNA的表达(P<0.01)，同时显著抑制FasL mRNA的表达(P<0.05)(图8中A)。转染Crabp2过表达载体48h，猪卵泡颗粒细胞Bcl-2mRNA的表达显著升高(P<0.05)，Bax、Caspase-3、Fas及FasL mRNA的表达显著降低(P<0.05)(图8中B)。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用

<141> 2020-08-11

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

atgcccaact tctctggcaa ctggaagatc atccgatcgg aaaacttcga ggatttgctc 60

aaagtgctgg gagtgaacgt gatgctgagg aagattgctg tggctgcggc atccaagcca 120

gctgtggaga tcaaacagga cggagacatt ttctacatca aaacctctac caccgtgcgt 180

accacggaga tcaacttcaa gatcggagaa gagtttgagg agcagactgt ggacgggaga 240

ccctgtaaga gcctggtaaa atgggagagt gagaacaaaa tggtctgcga gcagaggctt 300

ttgaagggag agggtcccaa gacctcctgg accagagaac tgaccaatga tggagagctg 360

atcctgacca tgacggcaga tgacatcgtg tgcaccaggg tctatgtccg agagtga 417

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aagcttatgc ccaacttctc tgg 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gaattctcac tctcggacat agac 24

Claims (1)

1.猪Crabp2基因在制备抗猪卵泡颗粒细胞凋亡的药物上的用途，所述猪Crabp2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

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