CN109251937B - 一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用 - Google Patents

一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人‑Sin3相关多肽P18(SAP18)过表达质粒的构建方法及其应用。该方法包括如下步骤：以SEQ ID No：2‑3为引物，GenBank登录号NC_10284的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶XbaI和Not I对PCR产物和pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copRFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得过表达质粒。所得人‑Sin3相关多肽P18在制备预防或治疗卡波氏肉瘤的产品上的应用。本发明人为过表达内皮细胞的SAP18，能够明显抑制内皮细胞的迁移、侵袭能力和血管生成，SAP18可以作为诊疗KS的新的分子标记和药物靶点。

Description

一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用。
背景技术
卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)感染可以导致卡波氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma，KS)的发生(Science(New York,NY)1994；266:1865-1869.)。KS组织病理学特征表现为，病灶组织中存在裂隙状血管、梭形细胞肉瘤样增生、红细胞外渗和大量含铁血黄素沉积(Science(New York,NY)1994；266:1865-1869.)。作为一种内皮细胞来源的恶性血管肉瘤，KS具有高度的的侵袭性和异常的血管增生特征(Arizonamedicine 1981；38:902-904.)。尽管KS病灶组织中KSHV的检出率高达95％，但是KSHV感染诱导KS发病的详细机制目前尚不清楚。与此同时，KS也是艾滋病(AIDS)患者频繁发生的重要并发症，被称之为艾滋相关的卡波氏肉瘤(AIDS-related KS，AIDS-KS)。作为世界范围内AIDS患者最流行的恶性肿瘤，AIDS-KS其侵害部位皮损数量多，范围广，且极易播散转移至口腔、生殖器、胃肠道和肺部。AIDS-KS发展快、预后差、病死率极高，是最具侵袭性和传播性的KS类型。
从KSHV感染进展到KS的形成主要包括四个过程：(1)病毒的初始感染过程；(2)病毒感染的内皮细胞发生增生、迁移；(3)炎症应答的诱导；(4)KS肿瘤的生成。血管增生不仅为KS肿瘤的生长提供了营养和氧气支持，而且为肿瘤的转移准备了特殊通道。单纯靶向KS肿瘤细胞的治疗，忽略了阻断肿瘤血管的生成，极易导致肿瘤的复发与转移。目前局部手术切除、放射治疗、细胞毒性和靶向药物治疗、抗HIV治疗(HAART)以及系统性化疗等方法，均不能彻底治愈KS。因此，从KSHV诱导内皮细胞侵袭与血管生成的机制这一角度探讨KS的防治策略，已成为亟待解决的科学问题。
Sin3相关多肽P18(Sin3A associated protein 18，SAP18)由153个氨基酸分子组成，含有一个半胱氨酸，分子量为17.56KDa，最早是在转录调节因子Sin3(transcriptionalregulator SIN3，Sin3)相关蛋白的免疫共沉淀中被鉴定(Gene 1998；207:267-275；Cell1997；89:357-364.)。研究表明，SAP18参与Sin3-组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)转录阻遏复合物形成，增强转录抑制，参与调节细胞分裂、胚胎发育和病毒复制(American journal of medical genetics Part A 2003；123A:5-28；TheBiochemical journal 2004；378:353-362；Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 2002；99:5442-5447.)。SAP18还能招募Sin3A-哺乳动物的毛球族同族体1(mammalian tribbles homolog 1，TRIB1)复合物结合到微粒体TG转运蛋白(microsomal TG transfer protein，MTTP)的调控序列，促进MTTP基因转录，参与脂质代谢过程(Journal of lipid research 2015；56:1145-1152.)。另外，SAP18与富含丝氨酸RNA结合蛋白1(RNA-binding protein with serine-rich domain 1，RNPS1)和核凋亡性染色质浓缩诱导剂(apoptotic chromatin condensation inducer inthe nucleus，Acinus)组成凋亡-剪接相关蛋白(apoptosis-and splicing-associatedprotein，ASAP)复合物，参与调控细胞RNA代谢过程，包括转录、剪接、翻译以及无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)(International journal ofbiological sciences 2017；13:545-560.)。然而，SAP18是否在KSHV感染及KS肿瘤形成中发挥作用目前尚不清楚。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用。
一种人-Sin3相关多肽P18(SAP18)过表达质粒的构建方法，包括如下步骤：以SEQID No：2-3为引物，GenBank登录号NC_10284的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶Xba I和Not I对PCR产物和pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得过表达质粒。
作为改进的是，所述人-Sin3相关多肽P18的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
作为改进的是，所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃10s，55℃30s，72℃1min条件下扩增30个循环，最后72℃延伸7min。
作为改进的是，所述PCR产物与pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP载体的体积比为7:1。
上述人-Sin3相关多肽P18(SAP18)过表达质粒表达的人-Sin3相关多肽P18在制备预防或治疗卡波氏肉瘤的产品上的应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的SAP18在卡波氏肉瘤组织中呈现低水平表达，人为过表达内皮细胞的SAP18，能够明显抑制内皮细胞的迁移、侵袭能力和血管生成，因此，SAP18在KS发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗KS的新的分子标记和药物靶点。
附图说明
图1为SAP18的免疫组化结果图，其中，(a)正常皮肤组织，(b)KS组织；
图2为Western blotting图；
图3为过表达SAP18的内皮细胞迁移实验结果示意图，(a)Transwell迁移实验中于接种12h后迁移至小室底部的pCDH细胞；(b)Transwell迁移实验中于接种12h后迁移至小室底部的SAP18细胞；(c)迁移至小室底部的细胞结果统计；
图4为过表达SAP18的内皮细胞侵袭实验结果示意图，(a)Transwell侵袭实验中于接种12h后迁移至小室底部的pCDH细胞；(b)Transwell侵袭实验中于接种12h后迁移至小室底部的SAP18细胞；(c)迁移至小室底部的细胞结果统计；
图5为过表达SAP18的内皮细胞微管形成实验结果示意图，(a)微管形成实验中于接种6h后pCDH细胞；(b)微管形成实验中于接种6h后SAP18细胞；(c)微管形成的结果统计。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明的发酵方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
实施例1
SAP18在卡波氏肉瘤组织中的表达
1、材料
1.1组织
本发明的临床KS组织和正常皮肤组织标本来自于南京医科大学第一附属医院。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，得到了南京医科大学医学伦理委员会批准。
2方法
取石蜡标本切片进行HE染色并同时IHC检测皮肤组织中LANA(KSHV编码的潜伏期相关核抗原，为KS诊断的依据)、SAP18蛋白的表达。
3结果
免疫组化结果如图1所示，从图中可以看出，KS组织中SAP18的表达水平低于正常皮肤组织。
实施例2
构建过表达SAP18的内皮细胞系
1、材料
1.1质粒与细胞
慢病毒包装系统的载体质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2RFP基因表达的红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)可在荧光显微镜下被观察。脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)由武汉大学蓝柯教授惠赠，培养于含有20％灭活胎牛血清的DMEM培养基中。人胚肾上皮细胞(293T)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，培养于含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中。以上细胞培养条件均为37℃、5％CO2。
1.2试剂
所用T4连接酶、核酸标准分子量Marker、TRIzol试剂及蛋白标准分子量Marker为美国Thermo Scientific公司产品；质粒小提试剂盒(Plasmid Mini Kit I)、凝胶纯化回收试剂盒(Gel Extraction Kit)购自美国Omega公司；PCR所用的高保真酶(Phanta酶)和RT-qPCR所用的逆转录酶(SYBR)购自南京诺唯赞科技有限公司；限制性内切酶(Xba I、Not I)为日本TaKaRa公司产品；感受态DH5α购自天根生化科技有限公司；RIPA细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂以及苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)为上海康成生物公司产品；用于Western blot检测的增强型化学发光试剂ECL为美国CellSignaling Technology公司产品；抗GAPDH单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)、抗HA多克隆抗体(polyclonal antibody，PAb)购自美国Abcam公司。
2、方法
2.1 SAP18过表达质粒的构建与鉴定
2.1.1引物及模板的合成
在GenBank中查询SAP18的CDS区序列组成，并使用Oligo 7软件设计SAP18的上下游引物。
上游引物序列为：5’-CTC TAG AGC CAC CAT GCT CGC TGC AGG GGT-3’(SEQ IDNo：2，下划线部分为Xba I识别序列)；
下游引物为：5’-TGC GGC CGC TTA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA ATATGG TCT CAT GCG CCC T-3’(SEQ ID No：3，倾斜部分为HA标签蛋白编码序列，下划线部分为Not I识别序列)。
2.1.2 PCR扩增SAP18序列(SEQ ID No：1)
以内皮细胞RNA逆转录获得的cDNA作为模板进行PCR，反应条件为：预变性95℃/5min，变性、退火、延伸95℃/10s、55℃/30s、72℃/1min，循环扩增30次，最后延伸72℃/7min。利用1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，条带位置正确后利用切胶纯化试剂盒回收备用。
PCR体系如下：
模板 1μL
上游引物(SEQ ID No：2) 1μL
下游引物(SEQ ID No：3) 1μL
2×Phanta Mix 25μL
ddH<sub>2</sub>O 22μL
总体积 50μL
2.1.3 SAP18过表达质粒的构建
用限制性内切酶Xba I和Not I对慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP(简写为pCDH)与2.1.2步骤中第一部分的PCR切胶回收产物同时进行双酶切，双酶切条件为37℃，恒温过夜。
酶切体系为：
纯化后的PCR产物 慢病毒载体
目的基因或载体质粒 10μL 5μL
Xba I 2.5μL 2.5μL
Not I 2.5μL 2.5μL
10×Buffer 5μL 2μL
ddH<sub>2</sub>O 30μL 8μL
总体积 50μL 20μL
双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶、回收、纯化，用T4连接酶4℃连接过夜，得连接产物。
连接体系为
目的片段 7μL
pCDH 1μL
10×T4 DNA Ligase 1μL
10×Buffer 1μL
总体积 10μL
2.1.4连接产物转化大肠杆菌、挑取单克隆、质粒小提
取含有氨苄西林抗性的LB琼脂培养板于室温中平衡30min备用。将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α，取50μL DH5α与10μL连接产物充分混匀，冰浴30min，42℃热激90s，然后冰浴3min，加入1mL LB培养基，于37℃摇床中转摇45min后，10 000rpm离心2min，弃去上清，将产物均匀涂抹在上述LB琼脂培养板上，37℃倒置培养12h。随机挑取单克隆菌落数个，分别接种于5mL含有50μg/mL氨苄西林的LB培养基中，200rpm/37℃转摇12h，最后利用质粒小提试剂盒提取质粒。
2.1.5 pCDH-SAP18质粒的鉴定
分别用用限制性内切酶Xba I、Not I对pCDH-SAP18质粒进行双酶切鉴定，双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，位置大小正确后送公司测序，将测序结果与设计序列进行比对。选取同源性为100％的质粒，命名为pCDH-SAP18。
2.2 pCDH-SAP18重组慢病毒包装
消化正常培养的293T细胞，将细胞按1.5×106个/皿细胞数接种在10cm细胞培养皿内，加入10mL含10％胎牛血清的DMEM培养基(无抗生素)，于37℃、5％CO2培养箱内过夜。次日，待皿中细胞汇合度达80％左右，利用LipofectamineTM 2000分别将包装质粒psPAX2(4.5μg)、包膜质粒pMD2.G(1.5μg)和目的质粒pCDH-SAP18(6μg)共同转染293T细胞，并将pCDH转染293T细胞作为对照。
转染10h后更换新鲜完全培养基(含抗生素)终止转染，48h后收取培养上清，经0.45μm滤器过滤后于-70℃保存。将所获得的慢病毒分别命名为Lv-SAP18和Lv-pCDH。
2.3构建稳定表达pCDH-SAP18内皮细胞
消化正常培养的HUVECs细胞，将细胞接种在6孔板内，于37℃、5％CO2培养箱内过夜，次日待孔中细胞的汇合度达到30～50％时，弃去原有培养基。将2.2步骤中收取的病毒液Lv-pCDH和Lv-SAP18分别加入至上述铺好的细胞中，2mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱培养，6h后弃去病毒液，更换完全培养基。感染48h后在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白RFP的表达。当RFP达90％以上时，说明稳定表达pCDH-SAP18及对照细胞构建成功。
2.4 Western blot验证蛋白表达
2.4.1提取细胞总蛋白
配置细胞裂解液每100μL RIPA加入1μL蛋白酶抑制剂、1μL磷酸酶抑制剂、1μLPMSF、25μL 4×十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sμlphate，SDS)缓冲液。按每1×104个细胞加入100μL细胞裂解液裂解细胞，涡旋震荡15s，冰浴8min，重复震荡三次。然后100℃沸水浴5min，再次冰浴5min，即为细胞总蛋白，蛋白分装后置于-70℃冰柜保存备用。
2.4.2 Western blot
配置10％SDS-PAGE电泳凝胶，将2.5.1制备的蛋白样品以每孔20μL加入泳道。恒压60V电泳，待条带置于分离胶后，调整电压110V继续电泳至结束。后用恒流100mA100min将蛋白转移至聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，转膜结束后将膜置于5％脱脂牛奶中37℃封闭1h。分别加入抗HA PAb、抗GAPDH MAb在4℃摇床孵育过夜。次日回收一抗，并用TBS-T洗涤条带(10min×3次)；然后分别加入辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗，于37℃恒温箱中作用1h，TBS-T洗涤条带(10min×3次)；最后利用化学发光法检测。
3.结果
Western blot结果如图2所示，从图中可以看出pCDH-SAP18内皮细胞构建成功。
实施例3
SAP18在抗卡波氏肉瘤中的应用
1、材料
1.1细胞和动物
实验所用到的SiHa细胞培养方法同实施例2。
1.2试剂
慢病毒pCDH和lncCRNN包装同实施例2。
Transwell小室(8μm)购自Millipore公司；基质胶(BD MatrigelTM BasementMembrane Matrix)为BD Biosciences公司产品；微管形成实验所用ibidi微血管生成板(micro-slide Angiogenesis ibiTreat)为德国易必迪公司产品。
2、方法
2.1 Transwell迁移实验
在24孔板中加入500μL DMEM培养基，将Transwell小室置于孔上，放入细胞培养箱平衡30min，分别消化pCDH和SAP18两组细胞，计数后用DMEM培养基配制成5×105个/mL的细胞悬液。平衡后的每个小室中加入200μL细胞悬液，即每孔细胞约为1×105个。每组设置3个复孔，将24孔板放入细胞培养箱，于培养12h后取出小室染色固定，显微镜下拍照计数，观察进入下室的细胞数量以判断细胞迁移情况。
2.2 Matrigel侵袭实验
将基质胶和DMEM培养基按体积1：8配成基质胶-DMEM混合液，置于冰上备用。将Transwell小室置于24孔板中，下室加入500μL DMEM培养基，每个小室加入60μL基质胶-DMEM混合液，于37℃、5％CO2细胞培养箱中凝胶1h。分别消化pCDH和SAP18两组细胞，计数后用DMEM培养基配制成5×105个/mL的细胞悬液。向每个小室加入200μL细胞悬液，即每孔1×105个细胞，每组设置3个复孔。将24孔板放入细胞培养箱，于12h取出小室染色固定，显微镜下拍照计数，观察进入下室的细胞数量以判断细胞侵袭情况。
2.3微管形成实验
取基质胶10μL铺入ibidi的每个孔板中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养1h。分别消化pCDH和SAP18两组细胞，计数后用DMEM培养基配制成1.4×103个/μL的细胞悬液。向每个小孔加入40μL细胞悬液，即每孔7×103个细胞，每组设置3个复孔。将ibidi板放入细胞培养箱，于6h后荧光显微镜下拍照，观察微管形成情况以判断细胞微管形成能力。
根据下列公式计算微管形成指数：
Figure BDA0001789787560000081
值“0”表示出现的多角形结构的细胞只有1层；“1”表示出现的多角形结构的细胞有2-3层；“3”表示出现的多角形结构的细胞超过4层以上。
3、结果
3.1 SAP18对内皮细胞迁移和侵袭能力的影响
为了验证SAP18是否能够影响内皮细胞的迁移和侵袭能力，本发明实验通过Transwell小室迁移和侵袭实验检测了慢病毒pCDH或SAP18感染内皮细胞后不同时间点的细胞增殖情况。Transwell小室迁移实验结果显示，接种后12h后SAP18组细胞迁移到小室底部的数目明显少于对照细胞，提示SAP18具有抑制内皮细胞迁移的能力(图3)。
在Transwell迁移实验的基础上，于小室中包被基质胶，用于模拟体内天然基底膜，进行Transwell细胞侵袭实验。结果显示，接种12h后SAP18组穿膜进入下室的细胞数量都明显降低。提示SAP18具有抑制内皮细胞侵袭的能力(图4)。
3.2 SAP18对内皮细胞微管形成能力的影响
微管实验结果显示，过表达SAP18可明显降低内皮细胞的微管形成能力(图5)。
上述结果表明，SAP18的过表达能够明显抑制内皮细胞的迁移、侵袭能力及血管生成能力，说明KS中低水平表达的SAP18参与调控肿瘤发生的多个过程，而且具有抗KS的潜能，为KS的诊断和治疗提供了新的分子标记和药物靶标。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgctcgctg caggggtcgg aggtcagggc gagcgtctcg caggccgtag gaggaagatg 60
gcggtggagt cgcgcgttac ccaggaggaa attaagaagg agccagagaa accgatcgac 120
cgcgagaaga catgcccact gttgctacgg gtcttcacca ccaataacgg ccgccaccac 180
cgaatggacg agttctcccg gggaaatgta ccgtccagcg agttgcagat ctacacttgg 240
atggatgcaa ccttgaaaga actgacaagc ttagtaaaag aagtctaccc agaagctaga 300
aagaagggca ctcacttcaa ttttgcaatc gtttttacag atgttaaaag acctggctat 360
cgagttaagg agattggcag caccatgtct ggcagaaagg ggactgatga ttccatgacc 420
ctgcagtcgc agaagttcca gataggagat tacttggaca tagcaattac ccctccaaat 480
cgggcaccac ctccttcagg gcgcatgaga ccatattaa 519
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ctctacagcc accatgctcg ctgcaggggt 30
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
tgcggccgct taagcgtagt ctgggacgtc gtatgggtaa tatggtctca tgcgccct 58

Claims (2)

1.一种人-Sin3相关多肽P18在制备预防或治疗卡波氏肉瘤的产品上的应用，其特征在于，所述人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法，包括如下步骤：以SEQ ID No：2-3为引物，GenBank 登录号NC_10284的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶XbaI和Not I对PCR产物和pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得质粒，所述人-Sin3相关多肽P18的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述PCR产物与pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP载体的体积比为7:1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增条件为：95℃预变性5 min，然后95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min条件下扩增30个循环，最后72℃延伸7 min。
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Homo sapiens Sin3A associated protein 18 (SAP18)，mRNA;NCBI Reference Sequence: NM_005870.4;《genbank》;20180623;第1-3页 *
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