CN112501176B

CN112501176B - 一种多核苷酸及其应用

Info

Publication number: CN112501176B
Application number: CN202011481969.7A
Authority: CN
Inventors: 李斌; 任盛
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112501176A

Abstract

本发明涉及生物医药基因治疗技术领域，公开了一种多核苷酸序列及其应用。本发明所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥95％相同性。本发明证实密码子优化后的TCF8编码序列表达蛋白的效率要高于野生型序列，使用AAV‑coTCF8病毒类药物处理可以显著改善TCF8突变的小鼠角膜内皮细胞病变，对角膜营养不良发挥治疗和/或预防作用。

Description

一种多核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药基因治疗技术领域，更具体的说是涉及一种多核苷酸及其应用。

背景技术

角膜异常症(Corneal Dystrophies，CD)，也称作角膜营养不良，是对称性、非炎症性角膜疾病的总称。其发病率约为1/2000，男女发病之比为1.7:1.0。大多数患者为散发性，约占6％-10％患者有明确的阳性家族史，其遗传方式包括隐性和显性形式。其发病是由于正常角膜组织中的细胞在基因异常的作用下，使其结构或功能受到进行性损害，导致角膜组织中形成形态各异的沉淀物，因而逐渐降低视力，以及引发糜烂、畏光等并发症；晚期患者的角膜将布满沉积物，丧失视功能，不仅影响患者生活质量、美观，也给社会带来沉重负担。

近年来，随着分子遗传学的进展，许多学者从分子水平上探索其发病机制并分析其遗传特点。目前报道与角膜营养不良相关的基因包括：TCF8、TCF4、GSN、K12、M1S1、CHST6、COL8A2、SLC4A11等。

TCF8是一个转录抑制因子，可以抑制IL-2的表达，还可以依据细胞类型调节ATP1A1的表达。TCF8通过招募SMARCA4/BRG1来抑制E-cadherin启动子活性并诱导上皮间质转变。TCF8的突变会导致单倍剂量不足，从而引发角膜营养不良(Nicholas Katsanis，2010)。此外，TCF8可以结合到多种胶原蛋白基因的启动子，TCF8突变可能导致胶原蛋白的异常表达，这也和临床患者角膜后弹力层胶原蛋白异常累积相关(Krafchak,C.M.et al.,2005，Ula Jurkunas，2012)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多核苷酸，使得所述多核苷酸序列经过密码子使用偏好、DNA重复序列、mRNA二级结构、GC含量等多个参数的优化，可以使TCF8表达效率更高；

本发明的另外一个目的在于提供承载上述核苷酸序列的病毒载体，并具备预防或治疗TCF8突变导致角膜营养不良的作用；

本发明的另外一个目的在于提供包含上述病毒载体或核苷酸序列的药物制剂，并具备预防或治疗TCF8突变导致角膜营养不良的作用；；

本发明的另外一个目的在于提供上述核苷酸序列、病毒载体以及药物制剂在预防或治疗TCF8突变导致角膜营养不良领域的中相关应用，包括但不限于相关药品、试剂的制备以及预防或治疗方法中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供上述药物制剂的递送方法，将所述药物制剂注射至眼部，如通过基质内注射施用于角膜基质或通过前房内注射施用于前房或通过玻璃体内注射施用于后房或结膜下注射或眼表滴药。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥95％相同性。

作为优选，其与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥98％相同性；进一步优选地，其与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥99％相同性；在本发明具体实施方式中，其序列如SEQID NO:3所示。

作为优选，所述核苷酸序列为cDNA序列。

同时，本发明还提供了一种病毒载体，其包含有本发明所述多核苷酸序列。

作为优选，所述病毒载体为腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体；在本发明具体实施方式中，本发明采用腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体的血清型为AAV2野生型、AAV5野生型、AAV2.7M8突变型或AAV5.TYF突变型。

更具体地，所述病毒载体由启动子CMV、CAG、CDH5、FLT-1、ppET1或ICAM2调控TCF8蛋白的表达。

此外，本发明还提供一种药物制剂，包含本发明所述的核苷酸序列或本发明所述的病毒载体。

作为优选，所述药物制剂为液体制剂；所述药物制剂还可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明对TCF8 cDNA序列进行密码子优化(codon optimization)得到coTCF8，对优化前后的序列wtTCF8/coTCF8进行细胞水平表达效率检测，发现优化后的序列表达效率显著提高。然后通过体外实验检测了AAV-coTCF8药物对下游基因的抑制作用和对角膜内皮细胞中六边形细胞比例的提升，本发明证明AAV-coTCF8药物对TCF8突变导致的角膜营养不良具有潜在的治疗作用，预示AAV-coTCF8药物可以做为临床治疗或预防TCF8突变引起的角膜营养不良而进一步研究开发。

基于上述各项优异的技术效果，本发明提出了如下相关应用：

本发明所述多核苷酸序列在制备预防或治疗TCF8突变导致的眼部疾病的病毒载体或药物制剂中的应用，或在预防或治疗TCF8突变导致的眼部疾病中的应用；

本发明所述病毒载体在制备预防或治疗TCF8突变导致的眼部疾病的药物制剂中的应用，或在预防或治疗TCF8突变导致的眼部疾病中的应用；

本发明所述的药物制剂在预防或治疗TCF8突变导致的眼部疾病中的应用。

其中，所述TCF8突变导致的眼部疾病为TCF8突变导致角膜营养不良。

本发明还对应提供了一种本发明所述药物制剂的递送方法，将所述药物制剂注射至眼部，比如通过基质内注射施用于角膜基质或通过前房内注射施用于前房或通过玻璃体内注射施用于后房或结膜下注射或眼表滴药。

由以上技术方案可知，本发明证实密码子优化后的TCF8编码序列表达蛋白的效率要高于野生型序列，使用AAV-coTCF8病毒类药物处理可以显著改善TCF8突变的小鼠角膜内皮细胞病变，对角膜营养不良发挥治疗和/或预防作用。

附图说明

图1-图4所示为wtTCF8和coTCF8序列比对；优化后差异性的密码子序列加粗并用下划线标注；

图5所示为AAV-coTCF8载体图谱(A)、AAV-wtTCF8载体图谱(B)、AAV-GFP载体图谱(C)；载体包含AAV2 5’ITR，CMV启动子，密码子优化后的TCF8 cDNA或野生型TCF8 cDNA或阴性对照GFP，hGH polyA序列和AAV2 3’ITR；

图6所示TCF8密码子优化后mRNA和蛋白表达水平；在293细胞中瞬时转染AAV-CMV-coTCF8(实验组2)、AAV-CMV-wtTCF8(实验组1)或AAV-CMV-GFP质粒(对照组)，24小时后RT-Qpcr检测TCF8的mRNA表达水平(A)，48小时后WB检测TCF8的蛋白表达水平(B)；

图7所示AAV-coTCF8药物对患者角膜内皮细胞的下游基因表达影响；TCF8突变患者角膜内皮细胞感染AAV-GFP(对照组)或AAV-coTCF8(实验组2，MOI＝10000)后检测TCF8下游基因COL4A3，E-cadherin和COL4A1的表达，感染24小时后检测mRNA表达水平(A)，感染48小时后检测蛋白表达水平(B)；

图8所示AAV-coTCF8药物对TCF8突变患者角膜内皮细胞中六边形细胞比例影响；在TCF8突变患者来源的角膜内皮细胞中感染不同剂量的AAV-GFP(对照组)或AAV-coTCF8(实验组2，MOI＝1000，10000，100000)，8天后检测角膜内皮细胞中六边形细胞比例。

具体实施方式

本发明公开了一种多核苷酸序列及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述多核苷酸序列及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的多核苷酸序列及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明涉及一种用于预防和/或治疗遗传疾病的药物，该药物可以是病毒载体如腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体等，优选地在患有所述遗传疾病、或具有患所述遗传疾病的风险的人受试者中。通过使用本发明的腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体药物治疗和/或预防的优选的遗传疾病是人的角膜营养不良、更优选由TCF8突变引起的称为角膜营养不良的疾病。目前角膜营养不良并没有有效的药物治疗，仅有角膜移植手术可以进行治疗，但是受限于捐献的角膜数量，大量患者没有角膜可以使用。

与角膜营养不良发展相关的TCF8基因突变的存在是本领域公知的，但是目前没有任何公开的防止或治疗角膜营养不良发展或缓解其症状的方法。依据TCF8突变产生的单倍型剂量不足导致角膜营养不良患者发病的致病机理，本发明使用病毒载体过表达该基因密码子优化的多核苷酸的方法来补充TCF8基因的表达，抑制E-cadherin和COL4A3等基因的表达，从而维持上皮间质转变(EMT)，维持角膜内皮细胞的数量和密度，从而预防或者缓解角膜营养不良患者的病情。本发明使用腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体将TCF8的密码子优化的核苷酸表达于患者眼部前房或者角膜中。本领域的技术人员应该理解，如果腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体中的一种方法有效，其他的方法也具有相似的效果。

AAV-coTCF8药物可以有效的在角膜内皮细胞表达TCF8，修复患者因为TCF8突变造成的单倍剂量不足引起的角膜营养不良。TCF8基因编码的蛋白序列参见SEQ ID NO:1所示，野生型的TCF8 cDNA序列参见SEQ ID NO:2所示。

本发明通过优化密码子使用偏好，DNA重复序列，mRNA二级结构，GC含量等多个参数，得到了和野生型TCF8序列显著不同的优化序列TCF8，优化序列和野生型序列对比如图1-4所示。把密码子优化型和野生型TCF8序列构建到AAV载体上，图谱如图5所示，然后在293细胞中转染相同量的质粒，并检测TCF8基因的表达，序列优化后的TCF8表达效率更高，证明密码子优化能够在不改变蛋白序列的情况下提高蛋白的表达水平，增加了表达效率(图6)。

本发明从TCF8突变患者的角膜中分离培养了原代角膜内皮细胞。然后使用AAV-GFP对照组和AAV-coTCF8病毒药物感染原代角膜内皮细胞，感染24小时和48小时后检测了TCF8潜在下游基因如COL4A1、COL4A3、E-cadherin的表达，发现和对照AAV-GFP相比，AAV-coTCF8感染的细胞COL4A3和E-cadherin表达下降，COL4A1表达不变(图7A、7B)。而依据报道，TCF8突变患者的COL4A3和E-cadherin表达上调，并且可能是造成角膜营养不良的重要因素(Nicholas Katsanis，2010；Krafchak,C.M.et al.；2005，Ula Jurkunas，2012)。因此AAV-coTCF8药物处理可能改善患者角膜营养不良的病情。

正常角膜内皮细胞是较为规则的六边形形态，但是角膜营养不良患者的角膜内皮细胞由于后弹力层的赘生物，以及角膜内皮细胞的丢失等等因素，会发生形态变化，变为不规则的形态，这也是角膜营养不良的主要特征之一。因此，本发明在对照组AAV-GFP和AAV-coTCF8感染第8天检测的内皮细胞中六边形细胞的比例。和感染对照组病毒的角膜内皮细胞相比，感染了AAV-coTCF8病毒药物的角膜内皮细胞中六边形细胞比例显著升高，而且呈现剂量依赖效应(图8)。

综合以上效果，表明AAV-coTCF8药物可以使角膜内皮细胞维持正常形态，改善角膜营养不良的病情发生发展，这一新发现为研制角膜营养不良药物提供了理论和事实基础。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：密码子优化的TCF8载体构建和表达验证

(1)质粒载体构建

1.将AAV-CMV质粒骨架，coTCF8片段、wtTCF8片段和GFP片段分别同时用HindIII与XhoI双酶切，然后将酶切后的片段分别于骨架进行连接。

2.连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落进行酶切验证与测序验证。

(2)细胞转染

1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％。

2.对于每孔细胞，使用50μl无血清DMEM培养基稀释0.8μg-1.0μgDNA。

3.对于每孔细胞，使用50μl DMEM培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合。

4.混合稀释的DNA和稀释的LIPOFECTAMINE 2000在室温保温20分钟。

5.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

6.在37℃，5％的CO₂中培养24-48小时。

7.在细胞中加入复合物24或48小时后，细胞收样进行RNA或蛋白表达检测。

(3)qPCR测定mRNA含量

逆转录反应体系，如表1所示，dNTP(2’-脱氧核苷酸-5’-三磷酸)混合液包含四种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，DEPC水是用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水；逆转录反应条件：37℃1小时，75℃10分钟，得到对应cDNA作为下一步RT-PCR反应的模板。

表1逆转录反应体系

RNA模板	1.0μg
		核糖核酸酶抑制剂	0.5μL
寡聚胸腺嘧啶引物	1μL
		5×RT-PCR反应缓冲液	5μL
10mM dNTP混合液	1μL
		逆转录酶	1μL
补足DEPC水至	25μL

目的基因的检测引物和内参(GAPDH)引物：

COL4A3的检测引物:5’-GACTCGCCCAGGCTCTGA-3’(正向引物)；

5’-GAACCCGTGAGTCCTGGAAG-3’(反向引物)；

COL4A1的检测引物:5’-GGCAGATTCGGACCACTAGG-3’(正向引物)；

5’-GCGTCTGTGGCAATACTAGC-3’(反向引物)；

E-cadherin的检测引物:5’-TGAAAACAGCAAAGGGCTTGGA-3’(正向引物)；

5’-GCAGTGTCTCTCCAAATCCGA-3’(反向引物)

GAPDH的内参引物:5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’(正向引物)；

5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’(反向引物)；

RT-PCR反应体系，如表2所示；RT-PCR反应程序，如表3所示。

表2 RT-PCR反应体系

SYBR绿色荧光定量PCR预混液	10μL
		检测引物(正向+反向)	1μL
cDNA模板	1μL
		补足水至	20μL

表3 RT-PCR反应程序

(4)Western Blot

1.蛋白样品制备，按1:100的比例在裂解液中加入PMSF(按用量现配现用)。

2.使用强裂解液裂解细胞。

3.使用BCA法测定蛋白浓度。

4.电泳

a、根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶(5ml/块)，待分离胶凝固。

b、配制5％的浓缩胶(2ml/块)，加满玻璃板，插入梳子。

c、将5μl预染蛋白质分子marker SDS-PAGE加入加样孔内，使用1x的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液10μl上样到样品孔边上的空白加样孔内。

5.转膜

将转膜白夹子上面放上湿的垫层，垫层上面铺三张叠在一起的湿滤纸，滤纸上面依次放置湿pvdf膜、胶、滤纸、垫层、黑夹板，将装好的夹板放入装有转膜缓冲液的电泳槽，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

6.封闭

转膜完毕后，漂洗1-2分钟，用滴管吸尽缓冲液，加入5％的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭15-60min。加入TBS洗涤液洗涤5分钟。共洗涤3次。

7.一抗孵育

按照比例使用5％的脱脂奶粉/PBS+2％BSA稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。

8.二抗孵育

加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。

9.蛋白检测

使用ECL类试剂来检测蛋白，各取1ml混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。结果如图6A、图6B所示，24小时后检测TCF8 mRNA表达水平，发现和对照组(AAV-CMV-GFP,下同)相比，实验组1(AAV-CMV-wtTCF8，下同)和实验组2(AAV-CMV-coTCF8，下同)过表达后，TCF8 mRNA表达水平显著提高，而且密码子优化的TCF8 mRNA表达水平更高。转染48小时候检测TCF8蛋白表达水平，发现和对照组相比，实验组1和实验组2过表达后，TCF8蛋白表达水平显著提高，而且实验组2的TCF8蛋白表达水平更高。这说明经过密码子优化后TCF8的表达效率确实提高了。

实施例2：AAV-coTCF8药物处理调节下游基因的表达并提高角膜内皮细胞中六边形细胞的比例

(1)TCF8突变患者角膜内皮细胞的分离和培养

1.从人角膜中分离出角膜内皮细胞，在含有2％胎牛血清(FCS)的培养基中培养，添加抗生素和两性霉素，持续培养四周。

2.将细胞接种到涂有层粘连蛋白和硫酸软骨素的培养皿上，使用F99基础培养基(两种培养基M199和Ham's F12的1：1混合物)培养，培养基中添加7.5％FCS、7.5％新生小牛血清(NCS)、20mg/ml抗坏血酸、20mg/ml胰岛素、10ng/mlbFGF。

3.37℃，5％CO₂的环境中培养至第二代传代，传代后血清中NCS含量降至5％。

(2)AAV病毒包装

1.聚合度90％以上的HEK293T细胞按1：3比例传盘。

2.转质粒前1-2h左右，换成无血清培养基，用转染试剂将目的基因质粒(AAV-coTCF8和AAV-GFP)和AAV2野生型辅助质粒转入HEK293T中。

3.质粒转化24h后，换新的无血清培养基；

4.转染72h收毒。带着培养基，吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。

5.将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，然后用超滤管进行浓缩。

(3)AAV感染角膜内皮细胞

1.准备好AAV-GFP对照病毒和AAV-coTCF8病毒药物。

2.将重组病毒以MOI为1*10³、1*10⁴或1*10⁵的感染复数感染角膜内皮细胞。

3.感染24h后，检测目的基因的RNA表达水平；感染48小时后，检测目的基因的蛋白表达水平；感染8天后，检测角膜内皮细胞中六边形细胞的比例。

(4)qPCR测定mRNA含量以及Western Blot

参照前述实施例步骤。

本实施例中，从TCF8突变患者的角膜中分离培养了原代角膜内皮细胞。然后使用对照组和实验组2病毒感染原代角膜内皮细胞，感染24小时和48小时后检测了TCF8潜在下游基因如COL4A1，COL4A3，E-cadherin的表达,发现和对照AAV-GFP相比，实验组2AAV-coTCF8感染的细胞COL4A3，E-cadherin表达下降，COL4A1表达不变(图7A，7B)。而依据报道，TCF8突变患者的COL4A3和E-cadherin表达上调，并且可能是造成角膜营养不良的重要因素(Nicholas Katsanis，2010；Krafchak,C.M.et al.；2005，Ula Jurkunas，2012)。因此AAV-coTCF8药物处理可能改善患者角膜营养不良的病情。

正常角膜内皮细胞是较为规则的六边形形态，但是角膜营养不良患者的角膜内皮细胞由于后弹力层的赘生物，以及角膜内皮细胞的丢失等等因素，会发生形态变化，变为不规则的形态，这也是角膜营养不良的主要特征之一。因此，我们在对照组AAV-GFP和实验组2AAV-coTCF8感染第8天检测的内皮细胞中六边形细胞的比例。和感染对照组病毒的角膜内皮细胞相比，感染了AAV-coTCF8实验组病毒的角膜内皮细胞中六边形细胞比例显著升高，而且呈现剂量依赖效应(图8)。这进一步说明我们的AAV-coTCF8药物可以是角膜内皮细胞维持正常形态，改善角膜营养不良的病情发生发展。这一新发现为研制角膜营养不良药物提供了理论和事实基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 一种多核苷酸序列及其应用

<130> MP2032072

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1124

<212> PRT

<213> TCF8 蛋白质序列(TCF8 protein)

<400> 1

Met Ala Asp Gly Pro Arg Cys Lys Arg Arg Lys Gln Ala Asn Pro Arg

1 5 10 15

Arg Asn Asn Val Thr Asn Tyr Asn Thr Val Val Glu Thr Asn Ser Asp

20 25 30

Ser Asp Asp Glu Asp Lys Leu His Ile Val Glu Glu Glu Ser Val Thr

35 40 45

Asp Ala Ala Asp Cys Glu Gly Val Pro Glu Asp Asp Leu Pro Thr Asp

50 55 60

Gln Thr Val Leu Pro Gly Arg Ser Ser Glu Arg Glu Gly Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Cys Trp Glu Asp Asp Arg Lys Glu Gly Gln Glu Ile Leu Gly Pro

85 90 95

Glu Ala Gln Ala Asp Glu Ala Gly Cys Thr Val Lys Asp Asp Glu Cys

100 105 110

Glu Ser Asp Ala Glu Asn Glu Gln Asn His Asp Pro Asn Val Glu Glu

115 120 125

Phe Leu Gln Gln Gln Asp Thr Ala Val Ile Phe Pro Glu Ala Pro Glu

130 135 140

Glu Asp Gln Arg Gln Gly Thr Pro Glu Ala Ser Gly His Asp Glu Asn

145 150 155 160

Gly Thr Pro Asp Ala Phe Ser Gln Leu Leu Thr Cys Pro Tyr Cys Asp

165 170 175

Arg Gly Tyr Lys Arg Phe Thr Ser Leu Lys Glu His Ile Lys Tyr Arg

180 185 190

His Glu Lys Asn Glu Asp Asn Phe Ser Cys Ser Leu Cys Ser Tyr Thr

195 200 205

Phe Ala Tyr Arg Thr Gln Leu Glu Arg His Met Thr Ser His Lys Ser

210 215 220

Gly Arg Asp Gln Arg His Val Thr Gln Ser Gly Cys Asn Arg Lys Phe

225 230 235 240

Lys Cys Thr Glu Cys Gly Lys Ala Phe Lys Tyr Lys His His Leu Lys

245 250 255

Glu His Leu Arg Ile His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Pro Asn

260 265 270

Cys Lys Lys Arg Phe Ser His Ser Gly Ser Tyr Ser Ser His Ile Ser

275 280 285

Ser Lys Lys Cys Ile Ser Leu Ile Pro Val Asn Gly Arg Pro Arg Thr

290 295 300

Gly Leu Lys Thr Ser Gln Cys Ser Ser Pro Ser Leu Ser Ala Ser Pro

305 310 315 320

Gly Ser Pro Thr Arg Pro Gln Ile Arg Gln Lys Ile Glu Asn Lys Pro

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Leu Ser Val Asn Gln Ile Lys Thr Glu Pro Val Asp

340 345 350

Tyr Glu Phe Lys Pro Ile Val Val Ala Ser Gly Ile Asn Cys Ser Thr

355 360 365

Pro Leu Gln Asn Gly Val Phe Thr Gly Gly Gly Pro Leu Gln Ala Thr

370 375 380

Ser Ser Pro Gln Gly Met Val Gln Ala Val Val Leu Pro Thr Val Gly

385 390 395 400

Leu Val Ser Pro Ile Ser Ile Asn Leu Ser Asp Ile Gln Asn Val Leu

405 410 415

Lys Val Ala Val Asp Gly Asn Val Ile Arg Gln Val Leu Glu Asn Asn

420 425 430

Gln Ala Asn Leu Ala Ser Lys Glu Gln Glu Thr Ile Asn Ala Ser Pro

435 440 445

Ile Gln Gln Gly Gly His Ser Val Ile Ser Ala Ile Ser Leu Pro Leu

450 455 460

Val Asp Gln Asp Gly Thr Thr Lys Ile Ile Ile Asn Tyr Ser Leu Glu

465 470 475 480

Gln Pro Ser Gln Leu Gln Val Val Pro Gln Asn Leu Lys Lys Glu Asn

485 490 495

Pro Val Ala Thr Asn Ser Cys Lys Ser Glu Lys Leu Pro Glu Asp Leu

500 505 510

Thr Val Lys Ser Glu Lys Asp Lys Ser Phe Glu Gly Gly Val Asn Asp

515 520 525

Ser Thr Cys Leu Leu Cys Asp Asp Cys Pro Gly Asp Ile Asn Ala Leu

530 535 540

Pro Glu Leu Lys His Tyr Asp Leu Lys Gln Pro Thr Gln Pro Pro Pro

545 550 555 560

Leu Pro Ala Ala Glu Ala Glu Lys Pro Glu Ser Ser Val Ser Ser Ala

565 570 575

Thr Gly Asp Gly Asn Leu Ser Pro Ser Gln Pro Pro Leu Lys Asn Leu

580 585 590

Leu Ser Leu Leu Lys Ala Tyr Tyr Ala Leu Asn Ala Gln Pro Ser Ala

595 600 605

Glu Glu Leu Ser Lys Ile Ala Asp Ser Val Asn Leu Pro Leu Asp Val

610 615 620

Val Lys Lys Trp Phe Glu Lys Met Gln Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln

625 630 635 640

Ser Ser Glu Pro Ser Ser Pro Glu Pro Gly Lys Val Asn Ile Pro Ala

645 650 655

Lys Asn Asn Asp Gln Pro Gln Ser Ala Asn Ala Asn Glu Pro Gln Asp

660 665 670

Ser Thr Val Asn Leu Gln Ser Pro Leu Lys Met Thr Asn Ser Pro Val

675 680 685

Leu Pro Val Gly Ser Thr Thr Asn Gly Ser Arg Ser Ser Thr Pro Ser

690 695 700

Pro Ser Pro Leu Asn Leu Ser Ser Ser Arg Asn Thr Gln Gly Tyr Leu

705 710 715 720

Tyr Thr Ala Glu Gly Ala Gln Glu Glu Pro Gln Val Glu Pro Leu Asp

725 730 735

Leu Ser Leu Pro Lys Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Arg Ser Thr Ile

740 745 750

Thr Ser Val Tyr Gln Asn Ser Val Tyr Ser Val Gln Glu Glu Pro Leu

755 760 765

Asn Leu Ser Cys Ala Lys Lys Glu Pro Gln Lys Asp Ser Cys Val Thr

770 775 780

Asp Ser Glu Pro Val Val Asn Val Ile Pro Pro Ser Ala Asn Pro Ile

785 790 795 800

Asn Ile Ala Ile Pro Thr Val Thr Ala Gln Leu Pro Thr Ile Val Ala

805 810 815

Ile Ala Asp Gln Asn Ser Val Pro Cys Leu Arg Ala Leu Ala Ala Asn

820 825 830

Lys Gln Thr Ile Leu Ile Pro Gln Val Ala Tyr Thr Tyr Ser Thr Thr

835 840 845

Val Ser Pro Ala Val Gln Glu Pro Pro Leu Lys Val Ile Gln Pro Asn

850 855 860

Gly Asn Gln Asp Glu Arg Gln Asp Thr Ser Ser Glu Gly Val Ser Asn

865 870 875 880

Val Glu Asp Gln Asn Asp Ser Asp Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys Met

885 890 895

Arg Lys Thr Glu Asn Gly Met Tyr Ala Cys Asp Leu Cys Asp Lys Ile

900 905 910

Phe Gln Lys Ser Ser Ser Leu Leu Arg His Lys Tyr Glu His Thr Gly

915 920 925

Lys Arg Pro His Glu Cys Gly Ile Cys Lys Lys Ala Phe Lys His Lys

930 935 940

His His Leu Ile Glu His Met Arg Leu His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr

945 950 955 960

Gln Cys Asp Lys Cys Gly Lys Arg Phe Ser His Ser Gly Ser Tyr Ser

965 970 975

Gln His Met Asn His Arg Tyr Ser Tyr Cys Lys Arg Glu Ala Glu Glu

980 985 990

Arg Asp Ser Thr Glu Gln Glu Glu Ala Gly Pro Glu Ile Leu Ser Asn

995 1000 1005

Glu His Val Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ser Gln Gly Asp Ser Asp Glu

1010 1015 1020

Arg Glu Ser Leu Thr Arg Glu Glu Asp Glu Asp Ser Glu Lys Glu Glu

1025 1030 1035 1040

Glu Glu Glu Asp Lys Glu Met Glu Glu Leu Gln Glu Glu Lys Glu Cys

1045 1050 1055

Glu Lys Pro Gln Gly Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val

1060 1065 1070

Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Ala Glu Asn Glu Gly Glu Glu Ala Lys

1075 1080 1085

Thr Glu Gly Leu Met Lys Asp Asp Arg Ala Glu Ser Gln Ala Ser Ser

1090 1095 1100

Leu Gly Gln Lys Val Gly Glu Ser Ser Glu Gln Val Ser Glu Glu Lys

1105 1110 1115 1120

Thr Asn Glu Ala

<210> 2

<211> 3327

<212> DNA

<213> 野生型的TCF8 cDNA序列(wild type TCF8 cDNA)

<400> 2

atgaaagtta caaattataa tactgtggta gaaacaaatt cagattcaga tgatgaagac 60

aaactgcata ttgtggaaga agaaagtgtt acagatgcag ctgactgtga aggtgtacca 120

gaggatgacc tgccaacaga ccagacagtg ttaccaggga ggagcagtga aagagaaggg 180

aatgctaaga actgctggga ggatgacaca ggaaaggaag ggcaagaaat cctggggcct 240

gaagctcagg cagatgaagc aggatgtaca gtaaaagatg atgaatgcga gtcagatgca 300

gaaaatgagc aaaaccatga tcctaatgtt gaagagtttc tacaacaaca agacactgct 360

gtcatttttc ctgaggcacc tgaagaggac cagaggcagg gcacaccaga agccagtggt 420

catgatgaaa atggaacacc agatgcattt tcacaattac tcacctgtcc atattgtgat 480

agaggctata aacgctttac ctctctgaaa gaacacatta aatatcgtca tgaaaagaat 540

gaagataact ttagttgctc cctgtgcagt tacacctttg catacagaac ccaacttgaa 600

cgtcacatga catcacataa atcaggaaga gatcaaagac atgtgacgca gtctgggtgt 660

aatcgtaaat tcaaatgcac tgagtgtgga aaagctttca aatacaaaca tcacctaaaa 720

gagcacttaa gaattcacag tggagagaag ccatatgaat gcccaaactg caagaaacgc 780

ttttcccatt ctggctccta tagctcacac ataagcagta agaaatgtat cagcttgata 840

cctgtgaatg ggcgaccaag aacaggactc aagacatctc agtgttcttc accgtctctt 900

tcagcatcac caggcagtcc cacacgacca cagatacggc aaaagataga gaataaaccc 960

cttcaagaac aactttctgt taaccaaatt aaaactgaac ctgtggatta tgaattcaaa 1020

cccatagtgg ttgcttcagg aatcaactgt tcaacccctt tacaaaatgg ggttttcact 1080

ggtggtggcc cattacaggc aaccagttct cctcagggca tggtgcaagc tgttgttctg 1140

ccaacagttg gtttggtgtc tcccataagt atcaatttaa gtgatattca gaatgtactt 1200

aaagtggcgg tagatggtaa tgtaataagg caagtgttgg agaataatca agccaatctt 1260

gcatccaaag aacaagaaac aatcaatgct tcacccatac aacaaggtgg ccattctgtt 1320

atttcagcca tcagtcttcc tttggttgat caagatggaa caaccaaaat tatcatcaac 1380

tacagtcttg agcagcctag ccaacttcaa gttgttcctc aaaatttaaa aaaagaaaat 1440

ccagtcgcta caaacagttg taaaagtgaa aagttaccag aagatcttac tgttaagtct 1500

gagaaggaca aaagctttga agggggggtg aatgatagca cttgtcttct gtgtgatgat 1560

tgtccaggag atattaatgc acttccagaa ttaaagcact atgacctaaa gcagcctact 1620

cagcctcctc cactccctgc agcagaagct gagaagcctg agtcctctgt ttcatcagct 1680

actggagatg gcaatttgtc tcctagtcag ccacctttaa agaacctctt gtctctccta 1740

aaagcatatt atgctttgaa tgcacaacca agtgcagaag agctctcaaa aattgctgat 1800

tcagtaaacc taccactgga tgtagtaaaa aagtggtttg aaaagatgca agctggacag 1860

atttcagtgc agtcttctga accatcttct cctgaaccag gcaaagtaaa tatccctgcc 1920

aagaacaatg atcagcctca atctgcaaat gcaaatgaac cccaggacag cacagtaaat 1980

ctacaaagtc ctttgaagat gactaactcc ccagttttac cagtgggatc aaccaccaat 2040

ggttccagaa gtagtacacc atccccatca cctctaaacc tttcctcatc cagaaataca 2100

cagggttact tgtacacagc tgagggtgca caagaagagc cacaagtaga acctcttgat 2160

ctttcactac caaagcaaca gggagaatta ttagaaaggt caactatcac tagtgtttac 2220

cagaacagtg tttattctgt ccaggaagaa cccttgaact tgtcttgcgc aaaaaaggag 2280

ccacaaaagg acagttgtgt tacagactca gaaccagttg taaatgtaat cccaccaagt 2340

gccaacccca taaatatcgc tatacctaca gtcactgccc agttacccac aatcgtggcc 2400

attgctgacc agaacagtgt tccatgctta agagcgctag ctgccaataa gcaaacgatt 2460

ctgattcccc aggtggcata cacctactca actacggtca gccctgcagt ccaagaacca 2520

cccttgaaag tgatccagcc aaatggaaat caggatgaaa gacaagatac tagctcagaa 2580

ggagtatcaa atgtagagga tcagaatgac tctgattcta caccgcccaa aaagaaaatg 2640

cggaagacag aaaatggaat gtatgcttgt gatttgtgtg acaagatatt ccaaaagagt 2700

agttcattat tgagacataa atatgaacac acaggtaaaa gacctcatga gtgtggaatc 2760

tgtaaaaagg catttaaaca caaacatcat ttgattgaac acatgcgatt acattctgga 2820

gaaaagccct atcaatgtga caaatgtgga aagcgcttct cacactctgg gtcttattct 2880

caacacatga atcatcgcta ctcctactgt aagagagaag cggaagaacg tgacagcaca 2940

gagcaggaag aggcagggcc tgaaatcctc tcgaatgagc acgtgggtgc cagggcgtct 3000

ccctcacagg gcgactcgga cgagagagag agtttgacaa gggaagagga tgaagacagt 3060

gaaaaagagg aagaggagga ggataaagag atggaagaat tgcaggaaga aaaagaatgt 3120

gaaaaaccac aaggggatga ggaagaggag gaggaggagg aagaagtgga agaagaagag 3180

gtagaagagg cagagaatga gggagaagaa gcaaaaactg aaggtctgat gaaggatgac 3240

agggctgaaa gtcaagcaag cagcttagga caaaaagtag gcgagagtag tgagcaagtg 3300

tctgaagaaa agacaaatga agcctaa 3327

<210> 3

<211> 3327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaggtta ccaactataa tacagtggtt gagaccaact cagattctga cgacgaggat 60

aagctgcata ttgtcgagga ggagagcgtg actgatgccg ctgactgtga aggggtgcca 120

gaggacgatc tccccaccga ccagacagtt ctgcctggtc ggtccagtga aagggaaggg 180

aatgccaaaa actgttggga ggatgacact ggcaaagagg gtcaggagat tttgggacct 240

gaagctcagg ccgatgaggc cggatgcact gttaaggacg atgaatgtga gagcgatgcc 300

gaaaatgaac agaatcatga tcctaatgta gaggagtttt tgcagcagca ggacacggca 360

gtcatcttcc ccgaagcccc agaggaggac caaagacaag ggacgcccga agcctctggc 420

catgatgaaa acggcacccc agatgcattc tcccaactgc tgacatgccc ctactgcgat 480

aggggatata aacgctttac ctctctcaag gagcacatta agtaccggca cgaaaaaaac 540

gaggacaatt tctcctgctc cctgtgtagt tatacatttg catatagaac ccaactggag 600

cgccatatga ccagtcacaa gagtggaaga gaccaaaggc atgtaaccca gagcggctgt 660

aatcggaagt ttaagtgcac ggagtgcgga aaggcgttta agtataaaca ccacctgaaa 720

gagcacctcc ggatccactc tggggagaag ccatatgagt gtcctaactg caaaaagagg 780

ttttcccatt ccggctccta ctcatcccat attagctcta aaaaatgcat aagcctcatt 840

ccagttaacg gcagaccaag aactggtctg aagaccagtc aatgttccag ccctagcttg 900

tccgcgtctc caggcagccc aactagaccc cagatacgac aaaagatcga gaacaagccc 960

ctccaggaac agctctccgt gaatcagatc aaaaccgaac ctgtagacta tgagtttaaa 1020

ccaatagtgg tggcgagtgg aatcaattgc tcaacacccc tgcagaacgg cgtgttcacc 1080

ggagggggac cactgcaagc cacaagcagc cctcagggga tggtgcaggc tgtggtgttg 1140

cctactgttg gactggtgag tccaatatcc atcaatctgt ctgacatcca gaacgtgctg 1200

aaagtggcgg tcgacggaaa cgtgatcaga caggtcctcg aaaacaacca ggcgaacctc 1260

gcaagtaaag agcaggagac aatcaatgca tccccaatcc aacaaggggg tcatagcgtg 1320

atctcagcaa tcagcctgcc ccttgtggac caggatggga ccaccaagat cataatcaat 1380

tattcactgg agcagcccag ccagctccag gtggtaccac agaatctcaa gaaagaaaat 1440

ccggttgcca ccaatagctg taagagtgag aaactccctg aagacttgac agtgaagagc 1500

gagaaagaca agtccttcga ggggggcgtg aatgactcca cttgtctgct gtgcgacgat 1560

tgcccaggtg acatcaatgc cctgcccgag ctgaaacatt atgatctgaa gcaaccaacc 1620

cagcctccac cactccctgc agcagaggca gaaaaaccag agtcttccgt ctcatccgcc 1680

accggcgacg gtaacttgag tccgtcccag cctccactga agaacctcct ctctctgttg 1740

aaagcatact atgcacttaa cgctcagccc agcgcggaag aactgtctaa aattgcagat 1800

tccgttaacc tccctctcga cgtcgtgaag aagtggttcg aaaaaatgca agccggacag 1860

ataagtgtgc agtcatccga gccttctagt ccggagccag gcaaggtaaa catccctgct 1920

aaaaataatg accagccgca atctgccaac gcaaatgaac cccaggactc cacagtgaac 1980

ctgcagtctc cgctgaagat gaccaattct ccagtgctgc ctgtggggag taccaccaac 2040

ggctctcggt ccagtacccc ttcaccatcc ccactgaacc tgagctcaag ccggaataca 2100

cagggatacc tttacactgc tgagggggcc caggaagagc cacaggtaga gccactggat 2160

ttgtctctgc caaagcagca gggggagctg ctggaaagat ctaccataac ttccgtgtac 2220

cagaactctg tgtattctgt gcaggaagaa cccctgaatc tgagttgtgc caagaaggaa 2280

ccccaaaaag atagctgtgt gactgattcc gagcctgtgg tgaacgtgat cccgccttcc 2340

gccaatccta ttaatatcgc gattccaaca gtcacagctc aactgcccac aattgttgcg 2400

atcgctgatc aaaactctgt gccttgtctg cgcgccttgg ctgcgaacaa acagaccatt 2460

ctcattcctc aagttgcata cacatattct accacagtat ccccagctgt gcaagaacca 2520

ccgctcaaag taatccagcc caatggcaac caggacgaac gccaggacac ttcttcagaa 2580

ggcgtgagta atgtggagga ccaaaacgac agcgattcca cccctcctaa gaagaaaatg 2640

agaaaaactg aaaatggtat gtacgcctgc gatctctgcg acaaaatctt ccaaaagagt 2700

tcaagtctgc tgcgccacaa atatgagcac accgggaaac gaccccacga atgcggcatt 2760

tgtaaaaagg ccttcaagca caaacatcat ctgatcgagc acatgcggct ccacagtggt 2820

gaaaaaccct atcagtgcga caaatgcggg aagcgatttt ctcatagcgg atcatactca 2880

cagcacatga accaccggta tagctactgt aagagggaag ccgaggagag agactcaacc 2940

gaacaggaag aggccgggcc ggagatcctt tctaacgagc acgttggtgc aagagctagc 3000

ccatctcagg gcgacagtga tgagcgcgag agccttacca gagaggagga tgaggactca 3060

gagaaagagg aagaagagga ggataaagaa atggaggagt tgcaagagga aaaggagtgt 3120

gagaagccac agggtgatga ggaggaagaa gaggaggaag aagaagtcga ggaagaggaa 3180

gttgaagagg cggaaaatga aggcgaggag gcaaagacag agggacttat gaaggatgac 3240

cgcgccgagt cacaggctag ctcactcggt cagaaggtgg gcgagagctc agagcaggtg 3300

tccgaagaga agacaaacga agcttaa 3327

Claims

1.一种多核苷酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述多核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为cDNA序列。

3.权利要求1-2任意一项所述核苷酸序列在制备治疗TCF8突变导致的眼部疾病的病毒载体或药物制剂中的应用，所述TCF8突变导致的眼部疾病为TCF8突变导致角膜营养不良。

4.一种病毒载体，其特征在于，其包含有权利要求1-2任意一项所述多核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。

6.根据权利要求5所述病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的血清型为AAV2野生型、AAV5野生型、AAV2.7M8突变型或AAV5.TYF突变型。

7.根据权利要求4-6任意一项所述病毒载体，其特征在于，所述病毒载体由启动子CMV、CAG、CDH5、FLT-1、ppET1或ICAM2调控TCF8蛋白的表达。

8.权利要求4-7任意一项所述病毒载体在制备治疗TCF8突变导致的眼部疾病的药物制剂中的应用，所述TCF8突变导致的眼部疾病为TCF8突变导致角膜营养不良。

9.一种药物制剂，其特征在于，包含如权利要求1-2任一项所述的多核苷酸序列或权利要求4-7任一项所述的病毒载体。

10.根据权利要求9所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为液体制剂。

11.根据权利要求9或10所述药物制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。