CN115581704B - 氯法拉滨在医学中的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了氯法拉滨的新医学用途，氯法拉滨在制备提高腺相关病毒在视网膜上转染率的药物中的应用。氯法拉滨在保证不改变细胞活性的前提下能有效提高AAV2在ARPE‑19细胞中的转染效果及EGFP蛋白的表达。本发明还提供了包括有氯法拉滨的用于遗传性眼底疾病的基因治疗类药物。应用本发明用于提高AAV2在视网膜上转染率的技术可有助于将编辑入AAV2中能改善眼底相关疾病的目的基因高效率转入视网膜，并持续有效的表达相关蛋白，从而达到更好地治疗遗传性眼底疾病的目的。

Description

氯法拉滨在医学中的新应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体是涉及氯法拉滨在医学中的新应用。
背景技术
目前以腺相关病毒(AAV，Adeno-Associated Viruses)作为基因治疗载体的潜力逐步被发掘。由于AAV其具有安全性、非致病性、易生产应用的特点(1)，被认为是转基因递送的理想载体，除此之外它具有免疫原性较低、广泛的组织嗜性、以及传递治疗性转基因作为附加体持续存在的能力，且具有较低的致突变力，同时能持续的转基因表达。通过AAV将核酸聚合物输送到宿主细胞中以达到治疗视网膜疾病的目的(2)。2008年Bainbridge JW等证明了AAV2基因治疗在治疗视网膜色素上皮特异性65-kDa蛋白(RPE65)基因突变引起的Leber先天性2型黑蒙(LCA2)中取得一定的疗效(3)。2012年第一个AAV的基因治疗药物Glybera获得欧洲药品管理局(EMA)的批准，2017年Luxturna成为第一个获得美国食品和药物管理局(FDA)批准的AAV基因治疗产品(4)。重组AAV2转基因治疗用于治疗由RPE65突变引起的Leber先天性黑蒙已在国外投入临床使用(5)。随着基因治疗在这些疾病中的逐步探究，为目前临床上主要的致盲疾病糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变等疾病的治疗提供了更优化的治疗方案。目前的糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变等眼底疾病仅能对症治疗，无法达到根治，但随着病情的发展，致盲率极高。通过提高基因治疗的效率，为难治性的眼底疾病的痊愈提供了可能。目前以AAV为载体，携带sFLT-1基因治年龄相关性黄斑变性已被证实可有效改善患者视力(6)，基因治疗也在糖尿病视网膜病变、视网膜营养不良等目前无法根治的眼底病中得到广泛的探究。。提高AAV的转染效率，针对性携带与眼底疾病相关基因，可有效治疗多种目前临床上难治性眼底病变，具有较大的临床价值。但是在AAV安全的计量范围内提高AAV的转染率使得目的基因的表达量达到治疗水平，依旧是目前需要解决的问题。
目前可通过优化AAV衣壳、降低机体对AAV的免疫反应、减缓细胞增殖的速度等方式来提高转染率。由于AAV载体使用剂量有安全极限，超过极限就会出现破坏性的炎症反应。Viney L等开发了新的AAV衣壳变体，称为AAV X-Vivo(AAV-XV)，来源于AAV12 VP1/2序列和AAV6的VP3序列的嵌合体。其转染率与AAV6相当，但其感染复数(MOI值)比AAV6低100倍，从而能够在低AAV剂量下进行T细胞工程，并证明了编码衣壳病毒蛋白和AAP的AAV基因组区域对于病毒产量和增强转染都至关重要(7)。但对AAV的衣壳蛋白进行重新包装设计，经济成本将会大大提高，且生产周期长，临床使用有一定的难度。因此寻求一种经济、快速、有效的提高AAV2转染率的方法更有利于在临床中推广使用。
眼底疾病特别是遗传性眼底疾病为当前眼科致盲疾病的研究重点，本发明着力于研究化合物氯法拉滨(Clofarbine)在眼科疾病中的应用，探究其能否有效协助AAV2进行基因治疗，提高AAV2在视网膜RPE细胞中的转染率，为基因治疗在眼科中的应用提供新的治疗思路。
氯法拉滨(Clofarabine)，又名克罗拉滨，是第二代嘌呤核苷类似物，化学名为2-氯-9-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯糖基)腺嘌呤，分子式为C10H11ClFN5O3。氯法拉滨结合了氟达拉滨(Fludarabine)和克拉屈滨(Cladribine)的优点，既抑制DNA聚合酶，又抑制核糖核酸还原酶；对不同的细胞株和肿瘤模型都表现出了很强的抗癌活性。研究表明，氯法拉滨的浓度在微摩尔以下就能有效地抑制人体CNS肿瘤、肺癌、肾癌、白血病细胞和黑色素瘤细胞系的增殖,体内和体外实验表明，克罗拉滨对白血病细胞有细胞凋亡作用，此作用是通过下调BCL-2族蛋白BCL-X和MCL-1及AKT去磷作用实现的临床上用于治疗儿童急性淋巴细胞性白血病。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供氯法拉滨在医学中的新应用。
实现上述目的的技术方案包括如下：
氯法拉滨在制备提高腺相关病毒在视网膜上转染率的药物中的应用。
氯法拉滨在制备提高腺相关病毒在视网膜色素上皮细胞中转染率的药物中的应用。
氯法拉滨在制备提高腺相关病毒在视网膜色素上皮层细胞中转染率的药物中的应用。
一种用于眼底疾病的基因治疗类药物，包括递送的药物，作为载体的腺相关病毒，还包括氯法拉滨。
在其中一些实施例中，眼底疾病包括视网膜色素变性、老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变、视网膜营养不良、Best疾病、或先天性黑朦。
在其中一些实施例中，所述递送的药物为能够改善眼底相关疾病的目的基因，例如EGFP基因。
在其中一些实施例中，所述氯法拉滨的浓度为0.1um-0.5um。
本发明提供了在保证不改变细胞活性的前提下能有效提高AAV2在ARPE-19细胞中的转染效果及EGFP蛋白的表达的药物——氯法拉滨。由于基因治疗需要目的基因在组织中具有较高的表达才能对疾病有效治疗，应用本发明用于提高AAV2在视网膜上转染率的技术可有助于将编辑入AAV2中能改善眼底相关疾病的目的基因高效率转入视网膜，并持续有效的表达相关蛋白，从而达到更好地治疗遗传性眼底疾病的目的。
附图说明
图1.通过CCK-8细胞活性检测，测试细胞最佳加药时间及种板密度。
图2.通过CCK-8实验检测最适药物浓度。
图3.流式细胞检测RNR抑制剂对细胞凋亡的影响，其中，A.Annexin V/PI染色后，用流式细胞检测RNR抑制剂对细胞凋亡的影响，Q1区为坏死细胞，Q2区为晚期凋亡细胞，Q3区为早期凋亡细胞，Q4区为未发生凋亡的细胞；B.流式细胞检测RNR抑制对细胞凋亡的影响的定量分析。
图4.AAV2转染率检测结果，其中，A转染后每24h在荧光显微镜下进行拍摄；B转染后的第48h、96h、7天收集细胞做Western Blot检测AAV2转染后EGFP绿色荧光蛋白的表达情况；C转染后的第48h、96h、7天收集细胞做qPCR检测AAV2转染后EGFP绿色荧光蛋白基因的表达情况。
图5.流式细胞定量检测EGFP表达量检测结果，其中，A流式细胞检测EGFP的表达量结果图，P2峰值表示EGFP表达强度；B通过统计学分析统计EGFP的表达。
图6.对小鼠视网膜下注射4周后各组小鼠视网膜上EGFP表达情况；其中，A冰切后小鼠视网膜HE染色观察视网膜层次结构，EGFP抗体染色观察EGFP在视网膜上的表达；B通过分别提取小鼠视网膜的RPE层及剩余视网膜层进行Western Blot，观察EGPF在视网膜中的表达。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
临床上应用的RNR抑制剂目前种类众多，RNR抑制剂是否能效提高AAV2在视网膜组织细胞中的转染率？是否能在提高转染率的同时不对组织细胞造成凋亡？
本发明根据发明人对眼底疾病和对RNR抑制剂的研究，发现了对提高AAV2在视网膜细胞中转染效果最显著的小分子RNR抑制剂-氯法拉滨，可在控制其细胞毒性的浓度下，使用剂量最低，转染效果最高。
本发明例举了相对小分子量的药物Hydroxyurea、Timidox、Clofarabine、Didox，通过对ARPE-19细胞进行预处理，再将搭载有增强绿色荧光蛋白(EGFP，Enhanced GreenFluorescent Protein)的AAV2转染至细胞中，观察细胞中的EGFP的表达。经过以下实验的比较，可以证明，其中氯法拉滨(Clofarabine)在促进AAV2的转染率的效果最好，具有临床运用价值。
1.筛选出有效提高AAV2转染率的RNR抑制剂。
从RNR抑制剂中，挑选出相对小分子量的药物Hydroxyurea、Timidox、Clofarabine、Didox，对ARPE-19细胞进行预处理，再将搭载有增强绿色荧光蛋白(EGFP，Enhanced Green Fluorescent Protein)的AAV2转染至细胞中，观察细胞中的EGFP的表达。
(1)CCK-8筛选合适药物浓度，及药物处理时间。流式细胞检测药物对细胞凋亡影响。
(2)通过荧光显微镜、Western Blot、流式细胞检测对EGFP表达定性及定量，qPCR进行EGFP基因表达定量。
(3)流式细胞检测药物对细胞周期的影响。RNA测序，通过seq-RNA测序分析检查可能影响AAV2转染率的通路并进行验证。
2.小鼠视网膜下注射AAV2与RNR抑制剂混合液，探究RNR抑制剂对AAV2在小鼠视网膜下转染率的影响。
C57BL/6J小鼠80只，雌性成年(6-8周龄)，体重20g左右，通过细胞实验筛选出最有效的RNR抑制剂，进行小鼠视网膜下注射。随机分为4组，每组5只。AAV2组：右眼视网膜下仅注射AAV2。AAV2+高浓度RNR抑制剂组：右眼视网膜下注射AAV2与高浓度RNR抑制剂混合液。AAV2+低浓度RNR抑制剂组：右眼视网膜下注射AAV2与低浓度RNR抑制剂混合液。PBS对照组：右眼玻璃体注射同等剂量、等频率PBS。对视网膜EGFP荧光蛋白表达作检测:每组小鼠进行视网膜下注射后的第4周，取小鼠眼球，做冰冻切片及Western Blot，检测荧光蛋白的表达情况。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
以下是实验方法及结果分析的详细描述。
1、通过CCK-8检测ARPE-19细胞的生长趋势。
1.1实验步骤
共设4个种板密度，密度设置为每孔细胞数(个)分别为2500、5000、10000、20000，每孔100ul培养基，将细胞种于96孔板中，每个密度设6个复孔，并设一组仅加完全培养基组作为CCK-8空白对照，分别在种板后4h、24h、48h、72h后每孔加入10ul CCK-8试剂，避光，放入培养箱37℃，5％CO2，孵育2h。避光取出培养板，于酶标仪上，450nm吸光度测试。计算细胞存活率，细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％。具体结果见图1。
注：As：实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和不同浓度药物)
Ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液)
Ab：空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液、不含细胞及药物
通过CCK-8细胞活性检测，测试细胞最佳加药时间及种板密度。发现细胞在种板24h、48h后出现快速生长。实验拟取每孔10000个细胞，既种板密度为1×105个/ml。
1.2结果
ARPE－19细胞在实验中种板密度为1×105个/ml。加药处理时间为种板后24h。
2、通过CCK-8实验检测最适药物浓度。
2.1 24h及48h作用时间药物浓度梯度设置如下：
Hydroxyurea(羟基脲)：25、5、1、0.2、0.04、0(单位：mM)
Didox(3,4-二羟基苯甲羟肟酸)：500、250、150、100、50、25、10、5、0(单位：uM)
Trimidox(2,2-二氟-1-甲磺酰氧基-2-脱氧核糖-3,5-二苯甲酸酯，C7H8N2O4)：1000、300、100、30、10、3、0(单位：uM)
Clofarbine(氯法拉滨)：50、25、10、5、1、0.5、0.05、0.005、0(单位：uM)
2.2实验步骤
(1)排枪种细胞至96孔板，每孔100ul细胞悬液，细胞密度为1×105个/ml。细胞孔周围孔加入每孔100ul PBS防止培养基蒸发。将96孔板放入培养箱24h，37℃，5％CO2。
(2)吸出96孔板中的原培养基
(3)按相应配制浓度，将含不同药物浓度得完全培养基加入96孔板中，每孔100ul，在不含细胞孔加入100ul新鲜完全培养基，作为CCK 8空白对照孔，每组共6个复孔。在对应位置标记浓度、细胞、日期、姓名。
(4)将96孔板放入培养箱，37℃，5％CO2。
(5)在分别培养24h及48h后取一块板，每孔加入10ulCCK8试剂，避光，放入培养箱37℃，5％CO2，孵育2h。
(6)避光取出培养板，于酶标仪上，450nm吸光度测试。
(7)导出数据分析，进行细胞存活率计算。
2.3作用24后，培养7天时间药物浓度梯度设置如下：
Hydroxyurea：1、0.2、0.04、0(单位：mM)；
Didox：150、100、50、25、10、5、0(单位：uM)；
Trimidox：100、30、10、3、0(单位：uM)；
Clofarbine：1、0.5、0.05、0.005、0(单位：uM)。
2.4实验步骤
(1)排枪种细胞至96孔板，每孔100ul细胞悬液，细胞密度为1×105个/ml。细胞孔周围孔加入每孔100ul PBS防止培养基蒸发。将96孔板放入培养箱24h，37℃，5％CO2。
(2)吸出96孔板中的原培养基
(3)按相应配制浓度，将含不同药物浓度得完全培养基加入96孔板中，每孔100ul，在不含细胞孔加入100ul新鲜完全培养基，作为CCK 8空白对照孔，每组共6个复孔。在对应位置标记浓度、细胞、日期、姓名。
(4)将96孔板放入培养箱，37℃，5％CO2。
(5)在培养24h后吸走原培养基，加入100ul新鲜完全培养基，继续放入培养箱37℃，5％CO2，每2天更换一次培养基。
(6)第7天取出培养板，每孔加入10ulCCK8试剂，避光，于酶标仪上，450nm吸光度测试。
(7)导出数据分析，进行细胞存活率计算。
参见图2.(A)通过CCK-8细胞活性实验，4种RNR抑制剂作用24h对细胞的凋亡影响普遍较小，其中Hydroxyurea 0.2mM、Trimidox 100uM、Clofarabin 0.5uM、Didox 100uM为作用24h后对细胞凋亡无影响的最大浓度。(B)通过CCK-8细胞活性实验，用4种RNR抑制剂作用24h后筛选的对细胞凋亡无影响的最大浓度处理细胞24h后继续培养细胞6天，检测细胞的活性。其中Hydroxyurea 0.2mM、Trimidox 100uM、Clofarabin 0.1uM、Didox 100uM为培养7天对细胞活性无影响的最大浓度。数据表示均为平均值±SD。采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)进行统计检验(*P<0.05)。
2.5结果
Hydroxyurea 0.2mM、Trimidox 100uM、Clofarabin 0.1uM、Didox 100uM为处理细胞24h后对细胞短期及长期培养均无细胞活性影响的最大浓度。
3、流式细胞检测化合物药物对细胞凋亡的影响
3.1实验步骤
(1)分组：实验分为空白对照组、Hydroxyurea 0.2mM组、Trimidox 100uM组、Clofarabin 0.1uM组、Didox 100uM组。均在药物处理24h后的24h、48h、72h、5天、8天进行细胞凋亡检测。
(2)种板：将细胞密度为1×105的细胞悬液种于6孔板中，每孔2ml，放入细胞培养箱种，37℃，5％CO2，培养24h。
(3)按照最佳药物浓度检测结果，将药物浓度配成Hydroxyurea 0.2mM、Trimidox100uM、Clofarabin 0.1uM、Didox 100uM加入对应组别，空白对照组加入完全培养基，放入培养箱37℃，5％CO2，培养24h。
(4)处理后48h、72h、5天、8天检测组每2天更换新鲜完全培养基。取24h组的培养板，消化收集细胞到EP管，离心1600转/分，7分钟，弃上清。加入PBS重悬把EDTA洗去，再次离心1600转/分，5分钟，弃上清；加入100μL Binding Buffer，混匀后先加入2.5μL AnnexinV-FITC，再加入2.5uL PI，抽屉避光，15分钟，进行染色。最后加入200uL Binding Buffer，转移到流式管，上机检测。
(5)48h、72h、5天、8天检测组实验步骤同24h组。
具体结果见图3。
参见图3。(A)Annexin V/PI染色后，用流式细胞检测RNR抑制剂对细胞凋亡的影响。Q1区为坏死细胞，Q2区为晚期凋亡细胞，Q3区为早期凋亡细胞，Q4区为未发生凋亡的细胞。(B)流式细胞检测RNR抑制对细胞凋亡的影响的定量分析，证实在采用有效提高AAV2转染率的浓度和剂量处理ARPE-19细胞后，所述化合物药物不会对细胞造成凋亡。数据表示均为平均值±SD。采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)进行统计检验(*P<0.05)。
3.2结果
通过流式细胞检测进一步证实实验所用药物浓度在处理细胞24h后对细胞存活率无明显影响。
4、AAV2转染率检测
4.1实验步骤
(1)分组：实验分为空白对照组、AAV2组、Hydroxyurea 0.2mM+AAV2组、Trimidox100uM+AAV2组、Clofarabin 0.1uM+AAV2组、Didox 100uM+AAV2组。
(2)种板：将细胞密度为1×105的细胞悬液种于6孔板中，每孔2ml，每组一个孔种于6孔板中。放入细胞培养箱种，37℃，5％CO2，培养24h。转染后48h、96h、7天各种一块板。
(3)加药处理：按照最佳药物浓度检测结果，将药物用完全培养基稀释成浓度为Hydroxyurea 0.2mM、Trimidox 100uM、Clofarabin 0.1uM、Didox 100uM的培养基，加入对应组别，空白对照组及AAV2组仅加入新鲜完全培养基。放入培养箱37℃，5％CO2，培养24h。
(4)转染：从-80℃冰箱中取出载有EGFP绿色荧光蛋白的AAV2(滴度：1013，MOI值：104)，放在冰上待用。取新鲜完全培养基，加入AAV2稀释后混匀。将药物处理24小时的培养板中的培养基吸出，每孔加入1ml含AAV2的完全培养基。空白对照组加入1ml不含AAV2的完全培养基。将6孔板放入培养箱，37℃，5％CO2，培养48h。
(5)培养箱中取出6孔板，吸走原培养基，加入新鲜完全培养基，每孔2ml。每两天更换一次培养基。
(6)分别在转染24h后每天取一块板进行荧光显微镜摄像观察，拍摄照片，连续7天。转染后的第48h、96h、7天收集细胞做Western Blot检测AAV2转染后EGFP绿色荧光蛋白的表达情况，做qPCR检测AAV2转染后EGFP绿色荧光蛋白基因的表达情况。具体结果见图4。
图4(A)转染后每24h在荧光显微镜下进行拍摄。(B)转染后的第48h、96h、7天收集细胞做Western Blot检测AAV2转染后EGFP绿色荧光蛋白的表达情况。(C)转染后的第48h、96h、7天收集细胞做qPCR检测AAV2转染后EGFP绿色荧光蛋白基因的表达情况，并进行统计分析。数据表示均为平均值±SD。采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)进行统计检验(*P<0.05)。
4.2结果
(1)转染后连续每隔24h荧光显微镜下拍摄，AAV+Clofarabine组细胞荧光强度及转染细胞数均高于其他组，且最早开始出现荧光。
(2)转染后的第48h、96h、7天收集细胞，Western Blot检测后发现AAV2+Clofarabine组的EGFP蛋白条带(KDa值为27)显影曝光亮度较其他组最强。
(3)qPCR检测转染后的第48h、96h、7天收集细胞的EGFP表达量，发现AAV+Clofarabine组的EGFP基因表达量通过统计学分析，均高于其他组。
5、流式细胞定量检测EGFP表达量。
5.1实验步骤
(1)分组：实验分为空白对照组、AAV2组、Hydroxyurea 0.2mM+AAV2组、Trimidox100uM+AAV2组、Clofarabin 0.1uM+AAV2组、Didox 100uM+AAV2组。
(2)种板：将细胞密度为1×105的细胞悬液种于6孔板中，每孔2ml，每组一个孔种于6孔板中。放入细胞培养箱种，37℃，5％CO2，培养24h。转染后48h、96h、7天各种一块板。
(3)加药处理：按照最佳药物浓度检测结果，将药物用完全培养基稀释成浓度为Hydroxyurea 0.2mM、Trimidox 100uM、Clofarabin 0.1uM、Didox 100uM的培养基，加入对应组别，空白对照组及AAV2组仅加入新鲜完全培养基。放入培养箱37℃，5％CO2，培养24h。的培养基吸出，每孔加入1ml含AAV2的完全培养基。空白对照组加入1ml不含AAV2的完全培养基。将6孔板放入培养箱，37℃，5％CO2，培养48h。
(4)转染：从-80℃冰箱中取出载有EGFP绿色荧光蛋白的AAV2(滴度：1013，MOI值：104)，放在冰上待用。取新鲜完全培养基，加入AAV2稀释后混匀。将药物处理24小时的培养板中的培养基吸出，每孔加入1ml含AAV2的完全培养基。空白对照组加入1ml不含AAV2的完全培养基。将6孔板放入培养箱，37℃，5％CO2，培养48h。
(5)培养箱中取出6孔板，吸走原培养基，加入新鲜完全培养基，每孔2ml；每两天更换一次培养基。
(6)转染后的48h、96h、7天各取一块6孔板做流式细胞检测。消化收集细胞到EP管，离心1600转/分，7分钟，弃上清。加入PBS重悬把EDTA洗去，再次离心1600转/分，5分钟，弃上清；加入300ulPBS重悬细胞后将细胞悬液移入流式管中，上机检测EGFP表达量。具体结果见图5。
参见图5.其中，(A)流式细胞检测EGFP的表达量结果图，P2峰值表示EGFP表达强度。(B)通过统计学分析统计EGFP的表达。经过Clofarabine的处理后的EGFP基因的表达量高于未经RNR抑制剂处理的2倍以上。数据表示均为平均值±SD。采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)进行统计检验(*P<0.05)。
5.2结果
(1)Clofarabine可有效提高AAV2在ARPE-19细胞中的转染率。
(2)Clofarabine较其他化合物提高AAV2在ARPE-19细胞中的转染率效果更为显著。
6、C57BL/6J小鼠视网膜下注射AAV2
6.1实验方法
通过细胞实验已筛选出提高AAV2转染率最有效的Clofarabine。采用Clofarabine预混AAV2后进一步进行小鼠体内实验。
(1)分组：将小鼠随机分为4组，每组5只。PBS组、AAV2组、0.1um Clo+AAV2组、0.5umClo+AAV2组。PBS对照组：右眼玻璃体注射同等剂量、等频率PBS。每只小鼠的左眼为空白对照，右眼为注射眼。
(2)配制注射液：将Clofarabine用PBS配成0.1um、0.5um的含有AAV2的混合液。视网膜下注射用的AAV2滴度为1×109TU/μl。
(3)视网膜下注射：在显微镜下在用微量注射器向对应组别小鼠右眼注射相应浓度的混合液。每只眼1ul。PBS组小鼠右眼仅注射1ul PBS。注射后继续培养小鼠4周。
(4)小鼠视网膜下注射后，AAV2转染情况检测。
视网膜下注射后的第4周，将小鼠行颈椎脱臼处死，快速取出眼球。①眼球冰冻切片：在4℃将眼球固定在4％多聚甲醛溶液中24小时，再将眼球放于15％的蔗糖溶液中在4℃冰箱中脱水沉底后再将眼球转入30％的蔗糖溶液中4℃脱水沉底。脱水后将眼球取出，用滤纸吸干眼球表面的水分，进行OCT包埋，待变白变硬后进行切片。切片厚度约10um。②冰冻切片免疫荧光染色：将EGFP抗体进行免疫荧光染色，以观察AAV2在小鼠视网膜中的转染情况。③冰冻切片HE染色，以观察小鼠视网膜具体层次。④小鼠视网膜Western Blot:将新鲜取出的眼球快速将角膜虹膜等组织剪去，将眼球的视网膜层与RPE-脉络膜层分开，分别进行Western Blot，检测EGFP在视网膜各层的表达情况结果见图6。参见图6A.对小鼠视网膜下注射4周后EGFP在各组小鼠视网膜上的表达情况。通过荧光显微镜对冰冻切片的小鼠视网膜膜进行拍照。参照图中HE染色切片所示的视网膜结构层次，0.5um Clo+AAV2组EGFP的绿色荧光较AAV2组多且转染的层次更广。0.1um Clo+AAV2组EGFP的绿色荧光较AAV2组稍强。EGFP的表达较多集中在RPE层中。0.5um Clo+AAV2组中EGFP在RPE层的表达最强。图6B.为视网膜的Western Blot结果。RPE-脉络膜层中的EGFP的蛋白条带较视网膜层中的显影更强，且两组中的0.5um Clo+AAV2组的EGFP的表达均为最强。
6.2结果
(1)Clofarabine可有效提高AAV2在小鼠视网膜中的转染率
(2)AVV2主要在视网膜中的RPE层转染，且Clofarabine可增强AAV2在RPE层的转染及表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.氯法拉滨在制备提高腺相关病毒在视网膜上转染率的药物中的应用。
2.氯法拉滨在制备提高腺相关病毒在视网膜色素上皮细胞中转染率的药物中的应用。
3.氯法拉滨在制备提高腺相关病毒在视网膜色素上皮层细胞中转染率的药物中的应用。
4.一种用于眼底疾病的基因治疗类药物，包括递送的药物，作为载体的腺相关病毒，其特征在于，还包括氯法拉滨。
5.根据权利要求4所述的基因治疗类药物，其特征在于，所述眼底疾病包括视网膜色素变性。
6.根据权利要求4所述的基因治疗类药物，其特征在于，所述眼底疾病包括老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变、视网膜营养不良。
7.根据权利要求4所述的基因治疗类药物，其特征在于，所述眼底疾病包括Best疾病、先天性黑朦。
8.根据权利要求4-7任一项所述的基因治疗类药物，其特征在于，所述药物为能够改善眼底相关疾病的目的基因。
9.根据权利要求4-7任一项所述的基因治疗类药物，其特征在于，所述氯法拉滨的浓度为0.1um-0.5um。
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