CN111926015B - 寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学领域，特别涉及寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该寡核苷酸为SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：21中的一个序列；或者与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：21中的一个序列的一致性不低于80％的核酸序列。本发明提供的寡核苷酸、病毒载体和RNAi药物制剂能有效的治疗和预防TGFBI Met619Lys突变引起的角膜异常症或角膜营养不良。

Description

寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂
技术领域
本发明涉及医学领域，特别涉及寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。
背景技术
角膜异常症(Corneal Dystrophies，CD)，也称作角膜营养不良，是对称性、非炎症性角膜疾病的总称。其发病率约为1/2000，男女发病之比为1.7:1.0。大多数患者为散发性，约占6％-10％患者有明确的阳性家族史，其遗传方式包括隐性和显性形式。其发病是由于正常角膜组织中的细胞在基因异常的作用下，使其结构或功能受到进行性损害，导致角膜组织中形成形态各异的沉淀物，因而逐渐降低视力，以及引发糜烂、畏光等并发症；晚期患者的角膜将布满沉积物，丧失视功能，不仅影响患者生活质量、美观，也给社会带来沉重负担。
近年来，随着分子遗传学的进展，许多学者从分子水平上探索其发病机制并分析其遗传特点。目前报道与角膜营养不良相关的基因包括：TGFBI、GSN、K12、M1S1、CHST6、COL8A2、SLC4A11等，其中TGFBI基因使第一个发现也是目前报道最为常见的相关基因。
TGFBI也被称为Keratoepithelin(角膜上皮蛋白，KE蛋白)，在最初的命名为BIGH3(Beta-induced Gene-h3)。TGFBI蛋白是细胞外基质的重要组成，在角膜、皮肤和其它结缔组织基质中均有表达。TGFBI蛋白分子量68KDa，由683个氨基酸组成。一些氨基酸的变异会导致蛋白三维结构和功能的改变，部分氨基酸的变异更会导致其不能被清理和降解。
Korvatska等认为氨基酸变化导致TGFBI带电变化是影响其水解的主要原因，也因此导致了角膜中TGFBI的累积；Choi等发现突变的TGFBI会诱导成纤维细胞的凋亡进程，使其缺乏正常的清理功能，因而导致沉积物的不断累积。
TGFBI是角膜上皮细胞分泌的重要因子之一，它参与细胞间的黏附和爬行，从而调控和维持角膜上皮细胞的正常增生和分化等形态学发生过程。突变会导致细胞黏附和爬行功能的异常，进而影响细胞的增生和分化，在变性产物的累积下，会导致反复地上皮糜烂。TGFBI在多种组织上均有表达，但研究中并未发现TGFBI在其它组织(如肝、肺、肾等)中的沉积。这可能是由于角膜组织的特殊性导致。
角膜为无血管、组织结构排列规则有序的、具有透明性的屈光介质，具有良好的自我修复特性。而该组织的修复正是通过分泌TGFBI蛋白来实现细胞的黏附和爬行。因此，外伤、紫外线等损伤刺激会诱使组织分泌TGFBI蛋白。正常人群会在这种修复机制下迅速痊愈，而角膜异常症患者则反而会产生大量不可降解的蛋白从而诱发和加重角膜异常症的症状。
RNA干扰(RNAi)是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式，它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰RNA诱导产生的一种转录后基因沉默现象。RNA干扰作用机制可分为2个部分：1)扩增与起始阶段，具有特异序列的dsRNA进入细胞后一方面在RNA依赖的聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)作用下呈指数级扩增，得到大量针对靶序列的RNA。一方面在Dicer酶的作用下，形成21～23nt的小干扰RNA(small interferenceRNAs,siRNA)，此siRNA含有2～3nt的3′突出端。2)效应阶段，siRNA结合到核糖核苷酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC，RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端，被切割后的断裂mRNA随即降解。
RNAi具有以下优点：1)高特异性，siRNA与目的基因结合严格遵守碱基配对原则，具有严格的序列特异性。2)高效性，微量的siRNA即可使其编码致病基因产物下降90％以上，达到敲除效果。3)高稳定性，siRNA 3′端突出的2个碱基使其不易被细胞内核酸酶降解。正是由于其特有的优越性，RNAi技术被迅速地应用于基础科研和临床应用。目前已有RNAi药物获批上市，还有部分RNAi药物处于临床试验阶段。但还未见针对TGFBI突变引起角膜营养不良的RNAi药物。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该寡核苷酸、病毒载体和RNAi药物制剂能有效的治疗和预防TGFBI Met619Lys突变引起的角膜异常症或角膜营养不良。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸选自如下核酸序列中的一种：
(a)核酸序列为SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：21中的一个序列；
(b)与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：21中的一个序列的一致性不低于80％的核酸序列。
作为优选，(b)中核酸序列与选自SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：21中的一个序列的一致性不低于85％；
优选地，(b)中核酸序列与选自SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：21中的一个序列的一致性不低于90％；以及
更优选地，(b)中核酸序列与选自SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：21中的一个序列的一致性不低于95％。
作为优选，寡核苷酸为化学修饰的寡核苷酸。
本发明还提供了一种病毒载体，病毒载体包含上述寡核苷酸。
作为优选，病毒载体为腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺病毒中的一种。
作为优选，病毒载体含有U6启动子。
作为优选，腺相关病毒的血清型为AAV2、AAV5野生型或7M8、TYF突变型中的一种或多种。
本发明还提供了上述寡核苷酸或病毒载体在制备预防或治疗眼部疾病药物中的应用。
作为优选，眼部疾病为TGFBI Met619Lys突变引起的角膜异常症或角膜营养不良。
本发明还提供了一种RNAi药物制剂，RNAi药物制剂包含上述寡核苷酸或病毒载体，以及药学上可接受的载体和赋形剂。
作为优选，RNAi药物制剂的赋形剂为纳米载体或脂质体。
作为优选，RNAi药物制剂为液体制剂。
作为优选，RNAi药物制剂的给药方式为前房注射、玻璃体腔注射、结膜下注射或者眼表滴药。
本发明提供了寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该寡核苷酸为SEQID NO：3至SEQ ID NO：21中的一个序列；或者与SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：21中的一个序列的一致性不低于80％的核酸序列。本发明的技术效果如下：
本申请首先使用含有野生型和TGFBI MET619LYS突变型靶序列的荧光素酶报告质粒和候选的RNAi序列质粒进行共转，筛选高效的、突变序列特异性的RNAi靶序列，然后对野生型TGFBI和MET619LYS突变TGFBI的稳转293细胞进行siRNA药物和AAV-shRNA药物处理，检测野生型和突变型TGFBI的mRNA和蛋白水平的变化，发现RNAi药物可以显著降低突变的TGFBI的表达，但是对野生型TGFBI的表达没有显著影响。此外，TGFBI MET619LYS突变会造成内质网压力的上调和细胞外基质中突变TGFBI蛋白的累积从而产生细胞毒性诱导凋亡和细胞丢失。对TGFBI MET619LYS突变的细胞使用AAV-shRNA药物处理，突变细胞的内质网压力下降(内质网压力指标GRP78/BiP表达下降)，而且细胞外基质中累积的TGFBI突变蛋白含量也有所降低，这说明RNAi药物可以有效缓解TGFBI MET619LYS突变造成的角膜营养不良。
RNAi药物在细胞和分子水平上对突变的TGFBI MET619LYS mRNA有降解作用，并且对正常TGFBI的表达没有显著影响。经过RNAi药物处理后，TGFBI MET619LYS突变细胞的内质网压力缓解，细胞外基质中累积的突变TGFBI蛋白含量降低，预示RNAi药物可以做为临床治疗或预防TGFBI MET619LYS突变引起的角膜营养不良而进一步研究开发。
附图说明
图1为TGFBI Met619Lys突变特异性shRNA设计示意图；
图2为AAV-shRNA载体图谱：
A：载体包含AAV25’ITR，U6启动子，不靶向TGFBI序列的shNC和AAV23’ITR；
B：载体包含AAV25’ITR，U6启动子，靶向TGFBI MET619LYS Mut序列的shRNA和AAV23’ITR；
图3示有效的RNAi序列筛选：将含有TGFBI野生型(WT)或MET619LYS突变(Mut)靶序列的荧光素酶报告基因和候选shRNA质粒共转293细胞，48小时后检测荧光素酶活性，筛选对靶序列有干扰效果的shRNA：
A：突变特异性shRNA对MET619LYS突变位点靶序列干扰效果的筛选；
B：突变特异性shRNA对MET619LYS突变位点和野生型位点差异性筛选；
图4示RNAi药物对野生型和MET619LYS突变型TGFBI表达水平的影响：
A：在野生型和MET619LYS突变型TGFBI稳转的293细胞中转染化学合成的si-RNAi对照或药物，24小时后检测TGFBI RNA表达水平；
B：在野生型和MET619LYS突变型TGFBI稳转的293细胞中感染AAV-RNAi对照或药物，24小时后检测TGFBI RNA表达水平；
C：在野生型和MET619LYS突变型TGFBI稳转的293细胞中转染化学合成的si-RNAi对照或药物，48小时后检测TGFBI蛋白表达水平；
D：在野生型和MET619LYS突变型TGFBI稳转的293细胞中感染AAV-RNAi对照或药物，48小时后检测TGFBI蛋白表达水平；
图5示RNAi药物可缓解TGFBI MET619LYS突变造成的细胞毒性：
A：在MET619LYS突变型TGFBI稳转的293细胞中感染AAV-RNAi对照或药物，24小时后检测GRP78/BiP mRNA表达水平；
B：48小时后染色检测细胞外基质中TGFBI聚集并定量分析。
具体实施方式
本发明公开了寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明使用化学合成的siRNA和AAV表达的shRNA进行了治疗TGFBI MET619LYS突变引起的角膜营养不良有效性的验证。依据RNAi技术的原理，本领域技术人员可以合理推断，依据不同病毒载体的特点，业内人士可以合理推断，不同类型的病毒载体表达的shRNA有相似的治疗效果。
本发明涉及一种用于预防和/或治疗遗传疾病的药物，该药物可以是病毒载体如AAV、lentivirus等，或者是非病毒载体如小干扰RNA(siRNA)，反义寡核苷酸(ΑOΝ)等，优选地在患有所述遗传疾病、或具有患所述遗传疾病的风险的人受试者中，其中所述寡核昔酸与靶RNA分子至少部分互补。通过使用本发明的AAV、lentivirus、siRNA、ΑOΝ治疗和/或预防的优选的遗传疾病是人的角膜营养不良，更优选由TGFBI Met619Lys突变引起的称为角膜营养不良的疾病。
与角膜营养不良发展相关的TGFBI MET619LYS基因突变的存在是本领域公知的，但是目前没有任何公开的防止或治疗角膜营养不良发展或缓解其症状的方法。依据TGFBIMET619LYS突变导致角膜营养不良患者发病的致病机理，使用RNAi的方法抑制或降解TGFBIMET619LYS的mRNA，从而降低TGFBI MET619LYS的蛋白产生，减少TGFBI MET619LYS蛋白的累积，从而预防或者缓解角膜营养不良患者的病情。本发明使用AAV、lentivirus、siRNA或ΑOΝ将TGFBI MET619LYS的干扰RNA或者反义核苷酸表达于患者眼部前房或者角膜中。本领域的技术人员应该理解，如果AAV、lentivirus、siRNA或ΑOΝ中的一种方法有效，其他的方法也具有相似的效果。
本发明提供的寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂中所用试剂或仪器均可由市场购得。
RNAi药物可以结合到突变的TGFBI MET619LYS mRNA，从而降解mRNA，降低突变TGFBI MET619LYS蛋白的表达，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例一荧光素酶报告系统筛选高效的RNAi药物
一、哺乳动物细胞(贴壁)的培养
1、细胞复苏
1)预先准备好37℃-38℃温水，从液氮罐中取出需要复苏的细胞，用眼科手术镊子固定，迅速置于水中，保证冻存管完全浸没与水中，使其均匀受热，直到冻存管内的细胞完全融化；
2)用酒精消毒冻存管；
3)用吸管预先吸取5mL细胞培养基于T25细胞培养瓶中，再用新的吸管将融化的细胞转移到细胞瓶中并轻轻吹打一遍；
4)盖好细胞瓶盖，将细胞瓶放置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2静置培养；
5)约6-8小时后(取决于不同的细胞)，更换新鲜培养基以消除细胞冻存液中存留的DMSO对细胞生长的影响。
2、细胞的传代和冻存
1)当细胞长满T25细胞瓶后，用吸管吸取培养基并弃去；
2)加入10mL的PBS，轻柔洗涤细胞后用吸管吸取并弃去；
3)用吸管吸取1-1.5mL胰酶，使其覆盖住细胞瓶底部，将细胞瓶放入37℃、5％CO2细胞培养箱静止3-5min；
4)显微镜观察，贴壁细胞变圆并且全部从细胞瓶壁脱离；
5)在细胞操作台内，用吸管吸取约4mL培养基，加入细胞瓶内，轻柔的吹打，以吹散细胞和中和胰酶的消化效果；
6)用吸管吸取吹匀的细胞悬液(体积约1/3-2/3)到另一新的细胞瓶，再补加5mL的培养基，放置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2的环境下继续静置培养。
二、293细胞转染
1.转染前一天(约24h)用胰蛋白酶消化细胞后计数。按照对应的孔板取相应的细胞量进行接板，使其在转染时的细胞覆盖率为70-90％。
2.转染前将所有质粒、试剂置于室温，计算所需要质粒及PEI max的体积。
3.在一定体积的DMEM中分别加入对应体积的质粒，混匀，形成A液，用一定体积的DMEM加入对应体积的PEI max，混匀，形成B液。
4.将B液快速加入A液，混匀，静止20min，形成转染复合物。将转染复合物缓慢加入细胞培养基中，轻轻混合。
5.在37℃、5％的CO2中培养48h，即可进行双荧光素酶活性检测。
三、荧光素酶活性检测
在转染48h后，检测步骤按照Dual-GloTM luciferase assay system(Promega，美国)使用说明进行，具体实验操作如下：
1)从培养箱中取出细胞培养板，吸除培养基，加入PBS清洗一次，按照对应的孔板加入对应体积PLB裂解细胞，在水平摇床室温孵育15min。
2)取20μL细胞裂解液至96孔酶标板中，加入100μL LARII，混匀，用酶标仪检测luciferase化学发光信号。
3)检测完毕后每孔加入100μL Stop Substrate，混匀，用酶标仪检测Renilla化学发光信号。
四、试验结果
临床上角膜营养不良患者TGFBI MET619LYS发生的DNA序列突变是T-A突变，ATG-AAG。本实施例也对应设计了野生型序列(SEQ ID NO：1)和突变靶序列(SEQ ID NO：2)的载体及突变特异性的shRNA(图1)。在293细胞中共转染含有野生型或突变型序列的荧光素酶质粒与RNAi对照(不靶向TGFBI的随机序列，下同)或候选RNAi药物(突变特异性shRNA)(图2)。转染48小时后检测荧光素酶活性，发现和转染RNAi对照相比，突变特异性靶向的4、6、10、13号药物对TGFBI MET619LYS突变型的荧光素酶活性有显著抑制作用；发现和转染RNAi对照相比，10号候选RNAi药物对野生型TGFBI的荧光素酶活性基本无影响(图3)。这提示，10号RNAi药物可能对突变TGFBIMET619LYS表达有特异性的抑制作用。
SEQ ID NO：1：野生型TGFBI Met619Lys靶序列
AACAAGGAGCCTGTTGCCGAGCCTGACATCATGGCCACAAATGGCGTGGTCCATGTCATCACC
SEQ ID NO：2：Mut型TGFBI Met619Lys靶序列
Figure BDA0002646380870000091
SEQ ID NO：3-21：Mut型特异性TGFBI Met619Lys shRNA序列
SEQ ID NO：3TTGCCGAGCCTGACATCAA
SEQ ID NO：4TGCCGAGCCTGACATCAAG
SEQ ID NO：5GCCGAGCCTGACATCAAGG
SEQ ID NO：6CCGAGCCTGACATCAAGGC
SEQ ID NO：7CGAGCCTGACATCAAGGCC
SEQ ID NO：8GAGCCTGACATCAAGGCCA
SEQ ID NO：9AGCCTGACATCAAGGCCAC
SEQ ID NO：10GCCTGACATCAAGGCCACA
SEQ ID NO：11CCTGACATCAAGGCCACAA
SEQ ID NO：12CTGACATCAAGGCCACAAA
SEQ ID NO：13TGACATCAAGGCCACAAAT
SEQ ID NO：14GACATCAAGGCCACAAATG
SEQ ID NO：15ACATCAAGGCCACAAATGG
SEQ ID NO：16CATCAAGGCCACAAATGGC
SEQ ID NO：17ATCAAGGCCACAAATGGCG
SEQ ID NO：18TCAAGGCCACAAATGGCGT
SEQ ID NO：19CAAGGCCACAAATGGCGTG
SEQ ID NO：20AAGGCCACAAATGGCGTGG
SEQ ID NO：21AGGCCACAAATGGCGTGGT
实施例二RNAi药物处理特异性地降低TGFBI MET619LYS基因表达
一、293-TGFBI野生型和TGFBI MET619LYS突变型稳定细胞构建
1.构建LV-CAG-TGFBI(WT)和LV-CAG-TGFBI MET619LYS的慢病毒载体；
2.使用三质粒系统包装慢病毒并检测病毒滴度；
3.使用MOI＝100的感染复数感染293细胞；
4.有限稀释，在96孔板中种植1细胞/孔，培养2周后鉴定单克隆的细胞有无TGFBI表达，并扩大培养阳性细胞。
二、293细胞转染：
方法同前所述。
三、逆转录荧光定量PCR检测TGFBI RNA的水平
1、逆转录反应体系如下：
Figure BDA0002646380870000101
逆转录反应条件：37℃1h，75℃10min
2、Real-time反应体系
1)目的基因的检测引物和内参引物
TGFBI:5’-AAGGTAACGGCCAGTACACG-3’(sense)
5’-TCGCCTTCCCGTTGATAGTG-3’(antisense)
GAPDH：5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’(sense)
5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’(antisense)
2)反应体系
Figure BDA0002646380870000102
3)反应程序：
Figure BDA0002646380870000111
四、AAV感染293细胞
1.准备好AAV RNAi对照病毒和RNAi药物病毒。
2.将重组病毒以MOI为1×104的感染复数感染293细胞。
3.感染48h后，检测TGFBI MET619LYS的RNA表达水平。
五、Western Blot
1.蛋白样品制备
1)使用裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白，测定蛋白浓度。
2)计算上样所需蛋白的溶液体积，加入SDS-PAGE上样缓冲液，混匀100℃金属浴5min，充分变性蛋白。
2.电泳
1)根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶，待分离胶凝固后，配制5％的浓缩胶，加满玻璃板，插入梳子。
2)将胶板装入电泳槽，长板在外侧，短板在内侧，倒入电泳缓冲液。
3)上样：将5μL预染蛋白质分子marker SDS-PAGE与蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。使用1x的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液10μL上样到样品孔边上的空白加样孔内。
4)电泳：上层胶时使用80V的低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用120V高电压恒压电泳。
3.转膜
按照对应的转膜装置装好转模夹板，放入装有转膜缓冲液的电泳槽，100V恒压转膜80-90min。
4.封闭
转膜完毕后，漂洗1-2min，用滴管吸尽缓冲液，加入5％的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭45-60min。加入TBS洗涤液洗涤5min。共洗涤3次。
5.抗体孵育
按照说明书推荐稀释比例使用PBS+2％BSA稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。按照说明书推荐稀释比例加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。
6.蛋白检测
使用ECL类试剂来检测蛋白，各取1mL混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。
六、试验结果
首先本实施例使用慢病毒感染，单克隆培养的方法构建了293-野生型TGFBI和293-TGFBI MET619LYS突变型的稳定细胞系。在野生型和突变型稳定细胞中转染了化学合成的siRNA对照及siRNA药物或者感染了AAV-shRNA对照及AAV-shRNA药物(MOI＝10000)。在转染/感染后24小时，收细胞样提取RNA检测TGFBI的表达。发现和对照相比，不论是化学合成的siRNA，还是AAV-shRNA，本申请的RNAi药物都可以显著抑制突变的TGFBI MET619LYS的RNA表达，但是对野生型TGFBI的RNA表达无明显影响(图4A，4B)。在转染/感染后48小时，收细胞样提取蛋白检测TGFBI的表达，发现和RNAi对照相比，本申请的RNAi药物可以显著抑制突变的TGFBI MET619LYS的蛋白表达，但是对野生型TGFBI MET619LYS蛋白表达无明显影响(图4C，4D)。
实施例三 RNAi药物可缓解TGFBI MET619LYS突变造成的细胞毒性
一、AAV感染293细胞：
方法同前所述。
二、逆转录荧光定量PCR检测GRP78/BiP RNA的水平
方法同前所述，目的基因检测引物：
GRP78/BiP:5’-ATAGCATCTGAGCTGGCTCCT-3’(sense)
5’-GCACATCTAGATCCCCGCATT-3’(antisense)
三、细胞外基质TGFBI染色
1.在培养板中将已铺满细胞的细胞爬片用PBS浸洗3次，每次3min；
2.用4％的多聚甲醛固定细胞爬片15min，PBS浸洗3次，每次3min；
3. 0.5％Tritonx-100(PBS配制)室温通透20min；
4.PBS浸洗玻片3次，每次3min，用吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5.吸水纸吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
6.加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST漂洗玻片3次，每次3min；
7.复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，用PBST漂洗4次，每次5min，洗去多余的DAPI；
8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察，采集图像。
四、实验结果和讨论
通过前面的实验已经证明，在体外，RNAi药物可以有效降低TGFBI MET619LYS突变的mRNA水平和蛋白水平的表达。而TGFBI MET619LYS突变会造成内质网压力的上调和细胞外基质中突变TGFBI蛋白的累积从而产生细胞毒性诱导凋亡和细胞丢失。为了进一步确定RNAi药物对TGFBI MET619LYS突变造成的角膜营养不良的治疗作用，本实施例分析了RNAi药物处理对细胞内质网压力和TGFBI胞外基质累积的影响。在MET619LYS突变型TGFBI稳转的293细胞中感染AAV-shRNA对照和药物，感染24小时后检测内质网压力标志基因GRP/BiP的RNA水平表达，发现和对照相比，AAV-shRNA药物处理可以显著降低GRP/BiP的mRNA表达水平，极大的缓解了内质网压力(图5A)；感染48小时后检测细胞外基质中TGFBI蛋白的累积，发现和对照相比，AAV-shRNA药物处理可以显著降低胞外基质中TGFBI的蛋白含量，有效的改善了胞外基质的蛋白动态平衡(图5B)。
至此，可以确定RNAi药物可有效、特异性地降解TGFBI MET619LYS突变基因的表达，并发挥治疗，预防TGFBI MET619LYS突变导致的角膜营养不良。这一新发现为研制角膜营养不良药物提供了理论和事实基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司
<120> 寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂
<130> MP2018047
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacaaggagc ctgttgccga gcctgacatc atggccacaa atggcgtggt ccatgtcatc 60
acc 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacaaggagc ctgttgccga gcctgacatc aaggccacaa atggcgtggt ccatgtcatc 60
acc 63
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgccgagcc tgacatcaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgccgagcct gacatcaag 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgagcctg acatcaagg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgagcctga catcaaggc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgagcctgac atcaaggcc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagcctgaca tcaaggcca 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcctgacat caaggccac 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcctgacatc aaggccaca 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctgacatca aggccacaa 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgacatcaa ggccacaaa 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgacatcaag gccacaaat 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacatcaagg ccacaaatg 19
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<211> 19
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acatcaaggc cacaaatgg 19
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catcaaggcc acaaatggc 19
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<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcaaggcca caaatggcg 19
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcaaggccac aaatggcgt 19
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaggccaca aatggcgtg 19
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<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaggccacaa atggcgtgg 19
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<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggccacaaa tggcgtggt 19

Claims (11)

1.一种寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸序列为SEQ ID NO：12。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸为化学修饰的寡核苷酸。
3.一种病毒载体，其特征在于，所述病毒载体包含权利要求1或2所述的寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺病毒中的一种。
5.根据权利要求3或4所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体含有U6启动子。
6.根据权利要求4所述的病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒的血清型为AAV2、AAV5野生型或7M8、TYF突变型中的一种或多种。
7.如权利要求1至2中任一项所述的寡核苷酸或权利要求3至6中任一项所述的病毒载体在制备治疗眼部疾病药物中的应用，所述眼部疾病为TGFBI Met619Lys突变引起的角膜异常症或角膜营养不良。
8.一种RNAi药物制剂，其特征在于，所述RNAi药物制剂包含权利要求1至2中任一项所述的寡核苷酸或权利要求3至6中任一项所述的病毒载体，以及药学上可接受的载体和赋形剂。
9.根据权利要求8所述的RNAi药物制剂，其特征在于，所述RNAi药物制剂的赋形剂为纳米载体或脂质体。
10.根据权利要求8所述的RNAi药物制剂，其特征在于，所述RNAi药物制剂为液体制剂。
11.根据权利要求8至10任一项所述的RNAi药物制剂，其特征在于，所述RNAi药物制剂的给药方式为前房注射、玻璃体腔注射、结膜下注射或者眼表滴药。
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