CN111569077A - Flot2抑制剂在抑制破骨细胞形成和/或破骨活性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明首次公开了Flot2抑制剂在抑制破骨细胞形成和/或破骨活性中的应用,采用Flot2‑siRNA特异干扰抑制Flot2表达后可显著降低RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收。发明人的研究团队发现Flot2直接参与破骨细胞的生成和骨吸收功能,并可能成为破骨细胞分化抑制剂新靶点。基于Flot2‑siRNA对破骨细胞的抑制作用,以及RNA干扰药物的应用前景,提供Flot2抑制剂作为抑制破骨细胞生成的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,更具体地,本发明涉及Flot2基因抑制剂在抑制破骨细胞形成和/或破骨活性中的应用。
背景技术
骨代谢的稳定需要破骨细胞(Osteoclasts,OCs)介导的骨吸收和成骨细胞(Osteoblasts,OBs)介导的骨形成作用间的动态平衡和偶联,在健康个体中,二者维持功能平衡,而平衡一旦打破则可能导致骨骼疾病的发生。
破骨细胞是体内唯一负责骨吸收的细胞。它可由破骨前体细胞经过激活后分化形成具有功能的成熟的破骨细胞。由于分化成熟的破骨细胞可吸收骨质,其过度激活会造成骨质丢失、骨质疏松,引发骨折疼痛,继发反应性骨增生,甚至残疾。破骨细胞过度活化相关的疾病不少,经典的有绝经后骨质疏松,此外比较重要的还有肿瘤转移骨破坏、炎症相关骨破坏(类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病关节炎、牙周炎等)等。破骨细胞活化相关骨破坏病人数量庞大,仅原发性骨质疏松(主要包含绝经后骨质疏松等)全世界就有上亿病人。
破骨细胞过度活化相关骨破坏疾病种类多样,病因也非常多样化,甚至一个疾病都会有多种发病相关因素,而其中一些又属于病因不明确或多元化病因的难治性疾病。但是直接针对破骨细胞,抑制破骨细胞分化或骨吸收功能的药物,可跨越疾病病因,直接改善相关的疾病骨破坏症状,并有效减轻病人骨折、疼痛等相关的痛苦。因此,破骨细胞分化抑制剂近些年成为一类药物,可用于绝经后骨质疏松等多种破骨细胞过度活化相关骨破坏疾病。
虽然,目前通过改善激素水平、抗炎等不同途径,治疗上述疾病的多种药物最终能够改善疾病,但是现在临床能够直接针对破骨细胞分化和功能的破骨细胞抑制剂很少,主要是双磷酸盐类和RANKL抗体Denosumab(地诺单抗)。另外,值得一提的是,尽管有些药物能够针对病因譬如抗炎治疗骨破坏疾病如类风湿性关节炎,理论上具有直接或间接抑制破骨细胞生成和炎症性骨破坏的可能性,但事实上很多常用药物反而被报导能够诱导破骨细胞形成、或加重骨质疏松。譬如治疗类风湿性关节炎的两个常用代表药物:糖皮质激素(如地塞米松)、甲氨蝶呤均能抑制外周或病变关节炎症因子包括TNF-α的产生,但两个药却都能引起骨破坏。糖皮质激素(如地塞米松)能体外促进诱导破骨细胞生成,体内在动物和病人都容易引骨质疏松;甲氨蝶呤使用后也会促进破骨细胞形成、引起骨破坏。
靶向抑制破骨细胞(OCs)分化被认为是逆转骨破坏最有效的治疗策略。破骨细胞起源于骨髓单核-巨噬细胞谱系细胞,在体内必须依赖于一些诱因诱导分化发育为多核的成熟破骨细胞,最后被活化。目前认为最直接活化破骨细胞的内源性分子是成骨细胞或骨髓基质细胞分泌的激活核因子NF-κB受体的配体(receptor activation of nuclearfactor NF-κB ligand,RANKL)。RANKL通过和破骨细胞膜上激活核因子NF-κB受体(receptor activation of nuclear factor NF-κB,RANK)结合,募集形成肿瘤坏死因子相关受体6(tumor neerosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)和c-Src酪氨酸激酶(c-Src tyrosine kinase,c-Src)复合体,激活NF-κB、MAPK、AP-1和Ca2+等信号通路,最后激活活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells cl,NFATc1),激活破骨细胞相关基因表达,例如抗酒石酸碱性磷酸酶(tartrate resistant acidphosphatase,TRAP),金属基质蛋白酶9(tartrate resistant acid phosphatase,MMP-9),整合素β3(integrinβ3)和组织蛋白酶K(cathepsin K),促进破骨细胞分化,增强骨吸收活性,抑制其凋亡,最终导致破骨细胞数量增多、功能亢进。此外,破骨细胞也能在RANKL非依赖的情况下生成。
目前,破骨细胞抑制剂的上市药物主要是靶向RANKL的抑制Denosumab(地诺单抗),几个针对破骨细胞生成相关信号的RANKL以外的破骨细胞分化抑制剂仍处在临床研究阶段。地诺单抗最初作为治疗绝经后骨质疏松的药物被批准上市,2012年批准增加了新的临床适应症-肿瘤转移骨破坏,临床也被研究用于治疗类风湿性关节炎骨破坏等。然而,在很多骨吸收疾病如某些骨破坏肿瘤等RANKL表达并不明显,因此,临床也需要更多有效的、具有新靶向的破骨细胞抑制剂类药物。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一个正常的细胞过程:当一个基因被打开时,它所包含的信息被转录成单链信使RNA(mRNA),将DNA的指令转换成蛋白质。不携带蛋白质生成指令的小片双链RNA可以靶向并结合到特定的mRNA分子上,并标记它们进行破坏,在它们生成蛋白质之前将其阻止。一般的实验方法包括脂质体转染、慢病毒感染及腺病毒感染。如果目的细胞的质粒转染效率较低(低于70%),则应采用腺病毒或慢病毒载体,利用病毒载体的高感染率、高表达特性,更好地开展RNA干扰主体实验。目前上市的大多数药物,无论是药片还是生物制品,大都针对功能异常的蛋白质并试图把它们从体内消除。相比之下,RNAi(RNA干扰)可以追溯到蛋白质生产错误的根源,将基因到蛋白的表达途径关闭。可以说,RNAi是一种从源头上治愈疾病的手段。2018年,美国FDA首次通过基于RNA干扰(RNAi)机理治疗疾病的药物,该药药名为Patisiran,能够沉默一种导致遗传性甲状旁腺素淀粉样变性的罕见基因来达到治疗效果。它在2018年8月10日获取美国FDA批准,成为该领域上具有重大意义的里程碑。Patisiran公司和其他基于RNA干扰(RNAi)的疗法正在开发中,它们使用特制的人造RNA片段来人为操纵基因的活性,以达到治疗疾病的目的。预计未来会有更多的RNAi类药物面世。
Flot2,又称Reggie-1,是一个重要的脂筏(lipid raft)蛋白(integral membraneprotein),鼠和人的同源性高达99%,可参与各种脂筏调节的细胞内吞、调节细胞骨架等。它不仅是脂筏的重要组成成分,还参与多个细胞过程如膜受体介导的信号通路,神经细胞轴突再生,肿瘤细胞生长、迁移等。虽然Flot2参与多种细胞功能及疾病过程,但近年最引人注目的是它与肿瘤的关系。Flot2在乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、宫颈癌、肾癌、黑色素瘤等出现了异常升高,并与乳腺癌淋巴转移正相关,与乳腺癌、肾癌等肿瘤疾病进展相关。但Flot2对破坏骨细胞的影响未有报导。
发明内容
本发明第一个方面的目的,在于提供Flot2抑制剂在制备治疗骨质破坏疾病的药物中的应用。
本发明第二个方面的目的,在于提供Flot2抑制剂在制备抑制破骨细胞活性的药物中的应用。
本发明第三个方面的目的,在于提供Flot2抑制剂在制备抑制破骨细胞生成的药物中的应用。
本发明第四个方面的目的,在于提供一种治疗骨质破坏疾病的药物组合物。
本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供Flot2抑制剂在制备治疗骨质破坏疾病的药物中的应用。
本发明的第二个方面,提供Flot2抑制剂在制备抑制破骨细胞活性的药物中的应用。
本发明的第三个方面,Flot2抑制剂在制备抑制破骨细胞生成的药物中的应用。
根据本发明第一至第三任一个方面所述的应用,所述Flot2抑制剂为抑制Flot2活性的物质、或降解Flot2的物质、或降低Flot2表达水平的基因工具,
优选地,所述降低Flot2表达水平的基因工具选自siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA。
更优选地,所述Flot2抑制剂为Flot2的siRNA;
进一步地,所述Flot2的siRNA的正反义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO.3与SEQID NO.4构成的组或SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8构成的组。
根据本发明第一个方面所述的应用,所述骨质破坏疾病选自骨质疏松、肿瘤转移骨破坏、风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病关节炎和牙周炎中的至少一种。
本发明的第四个方面,提供一种治疗骨质破坏疾病的药物组合物,包括Flot2抑制剂。
优选地,根据本发明第四个方面所述的药物组合物,所述Flot2抑制剂为抑制Flot2活性的物质、或降解Flot2的物质、或降低Flot2表达水平的基因工具,
更优选地,根据本发明第四个方面所述的药物组合物,所述降低Flot2表达水平的基因工具选自siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA。
优选地,根据本发明第四个方面所述的药物组合物,所述Flot2抑制剂为含有Flot2的siRNA序列或其互补序列的重组载体、重组菌或重组细胞。
进一步地,根据本发明第四个方面所述的药物组合物,所述Flot2的siRNA正反义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4构成的组或SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8构成的组。
本发明的有益效果是:
本发明首次发现Flot2基因在多种因素诱导破骨前体细胞中均出现显著升高,用Flot2-siRNA特异干扰抑制Flot2表达后可显著降低RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收。发明人的研究团队发现Flot2直接参与破骨细胞的生成和骨吸收功能,并可能成为破骨细胞分化抑制剂新靶点。基于Flot2-siRNA对破骨细胞的抑制作用,以及前面阐述的RNA干扰药物的应用前景,提供Flot2抑制剂作为抑制破骨细胞生成的药物中的应用。
附图说明
图1三条Flot2-siRNA在RAW264.7细胞中的沉默效果(基因水平)。A:q-PCR机器样品排布;B:q-PCR统计结果;C:q-PCR扩增曲线。(注:与NC对照组比较,*P<0.05)。
图2三条Flot2-siRNA在RAW264.7细胞中的沉默效果(蛋白水平)。A:转染体系检测B:Western Blot结果C:蛋白相对表达量统计结果。(注:与NC对照组比较,*P<0.05,**P<0.01)。
图3敲低效率最高的Flot2-siRNA序列对RANKL诱导的破骨前体RAW264.7细胞分化成破骨细胞的影响的实验结果。A:破骨细胞成像图,其中“红色→”所指处为TRAP+破骨细胞;B:TRAP+破骨细胞生成数目统计结果图。(注:与RANKL组比较,**P<0.01)。
图4敲低效率最高的Flot2-siRNA序列对RANKL诱导的破骨细胞破骨活性的影响的实验结果。A:骨吸收陷窝成像图;B:骨吸收陷窝区域统计结果图。(注:与RANKL组比较,*P<0.05)。
图5根据敲除效率最高的Flot2-siRNA序列制作的腺病毒载体Ad-Flot2-siRNA对RANKL诱导的破骨前体BMMs细胞分化成破骨细胞的影响的实验结果。A:免疫荧光检测两组腺病毒感染效率成像图与破骨细胞生成成像图;B:TRAP+破骨细胞生成数目统计结果图。(注:与RANKL组比较,**P<0.01)。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例结合附图详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
实施例1
我们前期研究发现,Flot2基因表达在RANKL、LPS、肿瘤上清激活的破骨前体细胞中均出现显著升高,因此推测Flot2基因表达靶向抑制后可能具有抑制破骨细胞形成的作用。针对Flot2基因涉及三条特异siRNA序列,具体序列如表1所示,交由吉玛基因公司合成。
表1 RNA oligo序列表
1.细胞培养:
细胞来源:RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞购自中国科学院细胞库。
培养方法:选用生长状态良好的RAW264.7细胞按2×104/孔密度接种于24孔板,于37℃、5%CO2培养箱孵育。
2.细胞转染:
细胞稳定培养4-6小时后,按RNAiMAX Transfection Reagent说明书将Flot2-siRNA(吉玛基因)或对照NC-siRNA(吉玛基因)加入细胞,转染48小时,弃去上清液,收集RNA及蛋白样品检测Flot2基因及蛋白表达。
3.q-PCR检测基因沉默效果
(1)RNA的提取:按照Promega的RNA提取试剂盒说明书提取RNA。
(2)RNA逆转录合成cDNA
按照Takara的试剂盒的逆转录说明书步骤,将总的RNA逆转录成cDNA。反应条件如下:37℃,15min;85℃,5s;4℃,∞。
表2 qRT-PCR反应液配制
(3)实时荧光定量PCR(Real-time PCR,qRT-PCR)
在冰上用Promega公司提供的Real-time PCR试剂盒,按照说明书配制qRT-PCR反应液,具体配方见表3。配制好上机反应液后,设置qRT-PCR扩增的程序:95℃,30秒;95℃,5秒;60℃,34秒;45个循环,上机检测。
表3 qRT-PCR反应液配制
实验结果以GAPDH作为内参基因,阴性对照组样本作为校准样本,不同刺激组作为待测样本,采用2-ΔΔCt方法计算比较目的基因的表达变化。
表4 Flot2基因引物
4.Western Blot检测蛋白沉默效果
(1)总蛋白的提取
1.弃去细胞培养上清,用预冷的PBS洗两遍6孔板细胞。加入新配好的裂解液RIPA100配好的孔,静置裂解10min。后用刮子刮6孔板底部的贴壁细胞。
2.用200部的的移液枪吸取刮下的细胞液(注意吹打)移入1.5ml EP管,插回冰上。每5min涡旋1次,共3次。
3.离心机4℃,12000g离心15min。
(2)蛋白定量
按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量。100℃金属浴中煮5min,使蛋白变性。
(3)SDS-PAGE电泳
1.配胶:按表5配制分离胶和浓缩胶,再加蛋白样品(30μg/泳道)。按浓缩胶80V,15min,分离胶120V,80min进行电泳。
表5分离胶和浓缩胶配方
2.转膜:按照下面的顺序排序压膜:(下)黑压膜夹→黑海绵→白滤纸→胶→PVDF膜(标记记号)→白滤纸→黑海绵→透明压膜夹(上)。PVDF膜和胶夹好后,100V恒压转膜90min。
3.封闭:封闭盒中倒入用TBST配置的5%脱脂牛奶,常温封闭1h。
4.一抗孵育:封闭后,将切好的膜卷进相应的Flot2和β-actin一抗中,4℃孵育过夜。
5.洗膜孵二抗:次日用TBST溶液洗膜,每10min洗1次,共3次。洗完后二抗孵育1h。用TBST溶液洗膜,每5min 1次,共6次。
6.曝光显影:将现配置好的ECL发光液覆盖在PVDF膜表面,轻微左右摇晃将ECL发光液晃匀,避光孵育2min,放入仪器内进行图像的成像。
7.灰度分析:将目的条带与内参条带用Image J软件进行光密度分析。
结果见附图1和2,从附图1和2中可以看出:在基因水平上,与NC组比较,加入siRNA-1可以敲低Flot2的表达,干扰效率具有统计学差异。在蛋白表达水平上,与NC组比较,siRNA-1的Flot2蛋白干扰效率最高,并且具有统计学差异,此外siRNA-3也具有一定的干扰效率,并且具有统计学差异。说明:siRNA-1可以在细胞水平敲低Flot2的基因和蛋白的表达。
发明人从基因和蛋白水平筛选出敲除效率最高的Flot2-siRNA,即Flot2-siRNA 1序列进行后续验证试验。
实施例2 Flot2-siRNA对诱导破骨前体细胞分化成破骨细胞的影响
选用生长状态良好的RAW264.7细胞按2×104/孔密度接种于24孔板,于37℃、5%CO2培养箱孵育。细胞稳定培养4-6小时后,按RNAiMAX TransfectionReagent说明书将经筛选得到的敲除效率最高的第一条siRNA(-260)Flot2-siRNA(吉玛基因)和对照NC-siRNA(吉玛基因)加入细胞,转染24h,然后加入RANKL(终浓度为50ng/ml),在诱导第4-5天行TRAP染色,显微镜下观察拍照,并按TRAP阳性且大于3个核的为破骨细胞进行计数。
结果如图3所示,从结果中可以看出Flot2-siRNA能够显著抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞形成TRAP阳性的破骨细胞,提示Flot2-siRNA能够抑制破骨细胞的生成。
实施例3 Flot2-siRNA对诱导的破骨细胞破骨活性的影响
接种RAW264.7细胞于包被有人工骨片的Osteo Assay 96孔板培养,于诱导第7天洗去细胞,在40×Nikon倒置光学显微镜光镜观察拍照,结果如图4中A所示,通过Image-Pro Plus软件计算每孔中骨吸收面积百分比,结果如附图4中B所示。
从结果中可以看出:与NC对照组相比,Flot2-siRNA组的白色骨凹陷面积显著减少,说明Flot2-siRNA能显著降低破骨细胞在骨片上形成的骨凹陷面积,即Flot2-siRNA对于破骨细胞的骨吸收活性有抑制作用。
实施例4含有Flot2-siRNA的腺病毒载体对诱导破骨前体细胞分化成破骨细胞的影响
交由商业公司制备含有Flot2-siRNA 1的腺病毒载体。
取8周的C57BL/6小鼠股骨和胫骨,剥离肌肉后剪去两端,用注射器吸取冰预冷的α-MEM反复冲洗股骨、胫骨的骨髓腔,冲出骨髓,直至骨髓腔发白,37℃、5%CO2培养箱放置30分钟后取上清悬液。细胞按1×105/ml密度接种于96孔板,静置两天后,换液,分别加入1×106PFU的Ad-GFP和1×106PFU的Ad-siFlot2病毒去感染细胞,10小时后换液,并且加入RANKL(终浓度为50ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)。每组3个复孔。每3天进行1次换液。
在诱导第5-6天行TRAP染色,在显微镜下观察拍照,并按TRAP阳性并且大于3个核的为破骨细胞进行计数(紫红色、多个细胞融合在一起的为破骨细胞),结果如图5所示。
从图5中可以看出:与NC对照组相比,Flot2-siRNA组的紫红色破骨细胞显著减少,说明Ad-siFlot2能够显著抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞,这提示着Ad-siFlot2确实也可以能够抑制破骨细胞的生成。
综合上述结果,Flot2-siRNA能够显著抑制体外RANKL诱导破骨前体细胞RAW264.7细胞及BMMs细胞形成破骨细胞,直接抑制破骨细胞的分化形成,并抑制破骨细胞骨吸收功能。Flot2-siRNA能抑制破骨细胞的生成、活化和破骨活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> Flot2抑制剂在抑制破骨细胞形成和/或破骨活性中的应用
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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acacattggg ggtaggaaca 20
Claims (10)
1.Flot2抑制剂在制备治疗骨质破坏疾病的药物中的应用。
2.Flot2抑制剂在制备抑制破骨细胞活性的药物中的应用。
3.Flot2抑制剂在制备抑制破骨细胞生成的药物中的应用。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用,其特征在于,所述Flot2抑制剂为抑制Flot2活性的物质、或降解Flot2的物质、或降低Flot2表达水平的基因工具,优选地,所述降低Flot2表达水平的基因工具选自siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述Flot2抑制剂为Flot2的siRNA,所述Flot2的siRNA的正反义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4构成的组或SEQID NO.7与SEQ ID NO.8构成的组。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述骨质破坏疾病选自骨质疏松、肿瘤转移骨破坏、风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病关节炎和牙周炎中的至少一种。
7.一种治疗骨质破坏疾病的药物组合物,包括Flot2抑制剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物,其特征在于,所述Flot2抑制剂为抑制Flot2活性的物质、或降解Flot2的物质、或降低Flot2表达水平的基因工具,优选地,所述降低Flot2表达水平的基因工具选自siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA。
9.根据权利要求7所述的药物组合物,其特征在于,所述Flot2抑制剂为含有Flot2的siRNA序列或其互补序列的重组载体、重组菌或重组细胞。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物,其特征在于,所述Flot2的siRNA正反义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4构成的组或SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8构成的组。
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