CN102186998A - 微小rna和1型神经纤维瘤病在诊断和治疗中 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了与非NF1对照相比,NF1细胞系和NF1肿瘤细胞系中特定微小RNAs(MiRNAs)的水平发生了改变。本发明提供例如诊断NF11和NF1肿瘤的方法。本发明还提供了治疗NF1、NF1相关的癌症以及由NF1所导致的认知障碍的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请涉及并请求享有申请日为2008年8月19日的美国临时申请No.61/090,155的优先权。前述申请的全文通过引用并入于此。
技术领域
1型神经纤维瘤病(NF1;OMIM#162200)是最常见的常染色体显性遗传疾病,全世界3500人中有1例感染(Riccardi等,Am J Pathol1994;145:994-1000;Gutmann等,JAMA 1997;278:51-7)。目前已有超过10万美国人患有NF1。NF1是一种肿瘤易感综合症。最常见的折磨人的肿瘤疾病是神经纤维瘤(发病率100%)、恶性外周神经鞘瘤(MPNST,15%发病率)和视神经胶质瘤(20%发病率)。NF1患者也可能有其它问题,包括儿童认知障碍。神经纤维瘤除了可能发生于神经组织、皮肤、骨骼和肌肉,这种疾病也与色素沉着过度有关。
多个神经纤维瘤是NF1的标志。神经纤维瘤的一个亚型,丛状神经纤维瘤,出现在约30%的NF1个体中。患有丛状神经纤维瘤的NF1个体中有高达10%的个体终身具有发展为恶性外周神经鞘瘤的风险(Evans等,J Med Genet 2002;39:311-4),最常见的恶性肿瘤与NF1有关。手术是丛状神经纤维瘤和MPNST唯一的治疗方法,但手术完全切除往往是不可能的。MPNST患者的预后较差,只有34%的人有5年存活率(Ducatman等,Cancer 1986;57:2006-21)。尽管迫切需要,靶向治疗MPNST以提高存活率的效果并不明显。
NF1肿瘤抑制基因(本文中通常是指神经纤维瘤,NF1基因,或简称NF1)中功能缺失的突变是这些疾病表型的病因。本文中NF1肿瘤抑制基因通常可与神经纤维瘤基因,NF1基因,或简称NF1互换,这对本领域技术人员而言是容易理解的。本领域技术人员还应能理解,NF1可以指NF1疾病状态,即患有1型神经纤维瘤病的状态。NF1编码的蛋白,神经纤维瘤蛋白,已被证明具有Ras-GTP酶激活蛋白(GAP)的功能。神经纤维瘤蛋白将Ras从其活性的GTP形式转化为其无活性的GDP同种型。NF1功能的缺失使Ras致癌信号通路失控,从而促进细胞异常增殖和肿瘤发生(Bollag G.,and McCormick F.Nature 1992;356:663-4)。许多NF1缺失的肿瘤含有高水平的RAS-GTP和/或显示出RAS-依赖的信号通路上调,支持了这一说法,使Ras信号失去控制,可能有助于肿瘤的发展(DeClue等,Cell 1992;69:265-73);Basu等,Nature 1992.356:713-5;Bollag G等,Nat Genet 1996.12:144-8;Feldkamp等,Surg Neurol 1999.51:211-8;Ingram DA等,JExp Med 2001.194:57-69)。人们普遍接受的是雪旺氏细胞是神经纤维瘤中主要的转化细胞,而雪旺氏细胞中NF1基因座的杂合性缺失(LOH)引发肿瘤发生和神经纤维瘤的发展。NF1基因座的LOH仅发现存在于雪旺氏细胞中,而在NF1神经纤维瘤和MPNST的其它细胞中没有发现(Kluwe L等,Genes Chromosomes Cancer 1999.24:283-5;Rutkowski JL等,Hum Mol Genet 2000.9:1059-66;Legius E等,.NatGenet 1993.3:122-6)。雪旺氏细胞系Nf1基因特异切除的小鼠发展为神经纤维瘤(Zhu Y等,Science 2002.296:920-2;Zhang L等,Proc Natl Acad Sci U S A 2006.103:9136-41;Wu J等,Cancer Cell 2008.13:105-16)。虽然人们已确定NF1神经纤维瘤肿瘤发生中所涉及的细胞,但对基因网络、信号通路和它们的上游调控网络知之甚少。
事实上,NF1中功能缺失的突变发生在神经纤维瘤和MPNST中,表明单独的NF1突变不足以使神经纤维瘤恶化成MPNST。最近的研究表明,某些神经纤维瘤亚型积累了其它变化,如那些影响p19ARF-MDM2-TP53和p16INK4A-Rb信号通路的变化,导致它们转变成MPNST(Carroll,和Ratner.Glia 2008.56:1590-605)。在29%~75%的NF1MPNST中已发现p53基因座的缺失或其它类型的突变(Menon,等,Proc Natl Acad Sci U S A 1990.87:5435-9);Legius等,Genes Chromosomes Cancer 1994.10:250-5;Rasmussen等,Genes Chromosomes Cancer 2000.28:425-31)。与p53在恶化为MPNST中的作用相一致,具有Nf1和Tp53突变的小鼠可发展为MPNST(Cichowski等,Science 1999.286:2172-6)。涉及到少数几个其它基因的改变,例如EGFR、TWIST1和SOX10(Tabone-Eglinger等,Sarcoma 2008;2008:849156;Miller等,Cancer Res 2006.66:2584-91)。然而,较少有有关NF1MPNST转变的调控网络的信息。
微小RNAs(miRNAs)是NF1肿瘤发生和发展的潜在的上游调节因子。miRNAs是一类约19-25个核苷酸的小非编码RNAs,其作为负的转录后基因调节因子,能调节整套基因(Lim等,Nature 2005.433:769-73)。miRNAs与靶mRNAs的3′非翻译区(UTR)杂交,抑制翻译或介导mRNA切割。miRNA在各种生物学过程中具有重要的调节功能,包括发育、细胞增殖、分化和凋亡。研究表明,miRNAs通过靶向定位癌基因、抑癌基因或与增殖、血管生成和细胞凋亡有关的基因,严格调控肿瘤发生和恶化(Hwang等,Br J Cancer 2006.94:776-80;Hwang等,Br J Cancer 2007.96Suppl:R40-4)。不同的肿瘤类型和在不同阶段分化的肿瘤表现出不同的miRNA分布(Rouhi等,Mamm Genome 2008.19:517-25;Visone等,Am J Pathol 2009.174:1131-8)。
目前,无法根治NF1和NF1-肿瘤。因此改进诊断那些具有发展为NF1风险的个体的方法和NF1的治疗方法将是大有裨益的。
发明概述
本发明对本领域的贡献在于揭示了与非NF-1对照相比,NF-1细胞系和NF-1肿瘤细胞系中特定的微小RNAs(MiRNAs)水平发生改变。
在一个方面,本发明涉及诊断个体是否具有发展1型神经纤维瘤病(NF1)或其体征或症状的风险的方法,包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中,测试样品中的至少一种miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体具有发展NF1的风险,其中至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-155、pre-miR-155、miR-335、pre-miR355、let-7a、pre-let7a、let-7b和pre-let7b。
在一个实施方案中,miR-10b基因产物的水平显著高于在对照样品中的水平。
在一个实施方案中,let-7a基因产物的水平显著低于在对照样品中的水平。
在一个实施方案中,测定miR-10b基因产物,且所述方法进一步包括测定神经纤维瘤蛋白的表达。
在一个实施方案中,测定let-7a基因产物,且所述方法进一步包括测定Ras信号通路的激活水平。
在另一方面,本发明涉及诊断个体是否患有或具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险的方法,包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中,测试样品中的miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体或者患有,或者具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险,其中至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-155、pre-miR-155、miR-335、pre-miR355、let-7a、pre-let7a、let-7b和pre-let7b、miR-137、pre-miR-137、miR-490、pre-miR-490。
在另一方面,本发明涉及提高靶细胞中神经纤维瘤蛋白表达的方法,包括用有效量的能够下调细胞中miR-10miRNA水平的miR-10b抑制剂作用于细胞,使靶细胞中神经纤维瘤蛋白的表达提高。
在另一方面,本发明涉及降低靶细胞中Ras信号通路活性的方法,包括用有效量的能够上调细胞中Let-7a水平的let-7a增强剂作用于细胞,使靶细胞中Ras信号通路的活性下降。
在另一方面,本发明涉及治疗患有NF1的患者的方法,包括给患者施以有效量的能够调节靶细胞中至少一种miRNA基因产物水平的药物,其中至少一种药物选自miR-10b抑制剂和let-7a增强剂。
在一个实施方案中,miR-10b抑制剂是含有与miR-10b互补的核苷酸序列的miR-10b阻断剂(antigomir)。
在一个实施方案中,miR-10b阻断剂含有核苷酸序列5’-CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA-3’。
在一些实施方案中,miR-10b抑制剂通过抑制TWIST1间接抑制miR-10b。
在一些实施方案中,本发明的阻断剂或合成的miRNA具有稳定修饰。在一些实施方案中,稳定突变(包括主链硫代磷酸化。在其它的实施方案中,稳定修饰包括至少一种核苷酸2’-糖修饰。
在其它的实施方案中,本发明的阻断剂或合成的miRNA具有胆固醇修饰。
在一个实施方案中,let-7a增强剂包括带有至少一种稳定修饰的合成的miRNA。
在一个实施方案中,合成的miRNA包括核苷酸序列5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’或5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’。
在一个实施方案中,至少一种稳定修饰包括主链硫代磷酸化。
在一个实施方案中,至少一种稳定修饰包括至少一种核苷酸2’-糖修饰。
在另一方面,本发明涉及治疗患有,或具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险的个体的方法,包括给个体施用有效量的调节靶细胞中至少一种miRNA基因产物水平的药物,其中至少一种药物选择miR-10b抑制剂、miR-335抑制剂、miR-490抑制剂和miR-137抑制剂。
在一个实施方案中,所述药物为含有的核苷酸序列与miR-335、miR-335前体、成熟miR-335或miR-335*互补的miR-335阻断剂。在一个实施方案中,RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUGA-3’。在另一个实施方案中,RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC-3’。
在一个实施方案中,所述药物为含有的核苷酸序列与miR-10b、pre-miR-10b、成熟miR-10b或miR-10b*互补的miR-10b阻断剂。在一个实施方案中,RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA-3’。
在一个实施方案中,所述药物为含有的核苷酸序列与miR-490互补的miR-490阻断剂。
在一个实施方案中,RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-ACCCACCTGGAGATCCATGG-3’。
在一个实施方案中,所述药物为含有的核苷酸序列与miR-137互补的miR-137阻断剂。
在一个实施方案中,RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-ctacgcgtattcttaagcaataa-3’。
在一个实施方案中,所述方法进一步包括施y用其它的抗肿瘤药物。
在一个方面,本发明涉及改善患有NF1、NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的青少年患者的认知障碍的方法,包括给患者施用有效量的能够降低靶细胞中miR-10b miRNA基因产物水平的药物。
在一个实施方案中,所述药物为含有与miR-10b互补的核苷酸序列的miR-10阻断剂。
在一个实施方案中,阻断剂包括核苷酸序列5’-cacaaattcggttctacagggta-3’。
在一个实施方案中,阻断剂为19~24个核苷酸长。
在另一个实施方案中,阻断剂全长与miRNA有至少95%互补,其中阻断剂5’端的8个核苷酸与miRNA的相应核苷酸为100%互补。
在一个实施方案中,阻断剂含有胆固醇修饰。
在一个实施方案中,靶细胞为神经嵴细胞。
在一个实施方案中,靶细胞为神经细胞。
在一个实施方案中,靶细胞为雪旺氏细胞。
在一个实施方案中,将药物直接施用于中枢神经系统。
在本发明的一些优选实施方案中,靶细胞为神经细胞、神经鞘细胞、雪旺氏细胞、上皮细胞、免疫细胞或骨细胞。
在另一方面,本发明涉及鉴定能够改善至少一种与NF1有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1有关的体征或症状的药物,其中至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-355、pre-miR355、let-7a和pre-let7a。
在一个实施方案中,测定miR-10b基因产物的水平,该方法进一步包括测定细胞中神经纤维瘤蛋白的表达。在一个实施方案中,测定let-7a基因产物的水平,且该方法进一步包括测定细胞中Ras信号通路。
在另一方面,本发明涉及鉴定能够改善至少一种与NF1-相关肿瘤、白血病或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1肿瘤、白血病或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物,其中至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-137、pre-miR-137、miR-490和pre-miR-490。
在另一方面,本发明涉及鉴定能够改善至少一种与NF1肿瘤、白血病或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中TWIST1水平的影响,其中细胞中TWIST1水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1肿瘤、白血病或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物。在一些实施方案中,TWIST1的水平为基因表达水平(例如,mRNA的水平)。在另一个实施方案中,TWIST1的水平为蛋白的水平。在另一个实施方案中,TWIST1的水平为蛋白活性的水平。
在另一方面,本发明涉及鉴定能够提高细胞中神经纤维瘤蛋白表达的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够提高神经纤维瘤蛋白表达的药物,其中至少一种miRNA基因产物选自miR-10b和pre-miR-10b。
在另一方面,本发明涉及诊断个体是否患有或具有发展为骨病的风险的方法,包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中,测试样品中的miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体或者患有或者具有发展骨病的风险,其中至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-155、pre-miR-155、miR-335、pre-miR355、let-7a、pre-let7a、let-7b和pre-let7b。
在一些优选的实施方案中,骨病为脊柱侧弯,miRNA基因产物为miR-10b或pre-miR-10b。在其它的实施方案中,miRNA基因产物为miR-335。在特定的实施方案中,miRNA基因产物的水平是提高的。在一些优选的实施方案中,骨病为NF1-相关的骨骼发育不良、胫骨发育不良、骨骼发育缺陷、脊柱侧弯、骨愈合缺陷、骨质疏少、骨质疏松症或牙骨质增生。
在另一方面,本发明涉及治疗患有或具有发展骨病的风险的个体的方法,包括对个体施用有效量的能够调节至少一种靶细胞中miRNA基因产物水平的药物,其中至少一种药物选自miR-10b抑制剂和miR-335抑制剂。在特定的实施方案中,miR-10b抑制剂的核苷酸序列与miR-10b、成熟miR-10b、miR-10b*或miR-10b*前体互补。在进一步的实施方案中,miR-335抑制剂的核苷酸序列与miR-335、成熟miR-335、miR-335*或成熟miR-335互补。在特定的实施方案中,RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUGA-3’,核苷酸序列5’-UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC-3’或核苷酸序列5’-CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA-3’,
在另一方面,本发明提供诊断个体是否患有或具有发展NF1、NF1-相关肿瘤或NF1-相关疾病的风险的方法,包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中,测试样品中的miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体或者患有,或者具有发展神经纤维瘤相关肿瘤的风险,其中至少一种miRNA基因产物选自miR-137、pre-miR-137、miR-490和pre-miR-490。
在其它相关的方面,本发明提供治疗患有或具有发展NF1、NF1-相关肿瘤或NF1-相关疾病的风险的个体的方法,包括给个体施用有效量的调节靶细胞中至少一种miRNA基因产物水平的药物,其中至少一种药物选择miR-490抑制剂和miR-137抑制剂。
在一些实施方案中,所述药物为含有的核苷酸序列与miR-490互补的miR-490阻断剂。在一些实施方案中,RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-ACCCACCTGGAGATCCATGG-3’。
在其它的实施方案中,所述药物为含有的核苷酸序列与miR-137互补的miR-137阻断剂。在一些实施方案中,所述阻断剂包括核苷酸序列5’-CTACGCGTATTCTTAAGCAATAA-3’。
在另一个实施方案中,除了所述药物,该方法包括施用其它的抗肿瘤药物。
在另一方面,本发明提供鉴定能够改善至少一种与NF1、NF1-相关肿瘤或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1、NF1-相关肿瘤或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物,其中至少一种miRNA基因产物选自下组:miR-137、pre-miR-137、miR-490和pre-miR-490。
本领域技术人员应能理解,在本发明的一些实施方案中所述的方法或组合物中,优选miRNAs前体、成熟miRNAs、初级miRNAs(pri-miRNAs)、miRNA*s和它们的片段。例如,本发明的阻断剂可根据miRNA序列、它的成熟形式、初级miRNAs、miRNA*或互补序列或它们的片段设计或包括上述的序列。
附图说明
图1显示在肿瘤细胞系和正常细胞系中几种miRNAs表达量的倍数变化。相对于非-NF1雪旺氏肿瘤细胞系(STS26T),发现miR-10b、137、490在NF1雪旺氏肿瘤细胞系(ST8814和T265)中过表达。在肿瘤细胞中,MiR-10b的水平高出20-30倍,而miR-137的水平高出5倍。在肿瘤细胞中,MiR-490的水平高出约20-70倍。在NF1雪旺氏肿瘤细胞系中,let-7a的水平减半。
图2显示miRNAs在小鼠胚胎干(ES)细胞的表达:Nf1野生型胚胎干细胞(Nf1+/+)vs.敲除Nf1的胚胎干细胞(Nf1-/-)。Nf1-/-胚胎干细胞显示出miR-10b高表达,let-7a低表达,miR-30b表达量无变化。还检测到miR-10a高表达,Nf1-/-胚胎干细胞中miR-490表达量无变化。
图3显示NF13’UTR中,几种miRNAs的靶位点。
图4显示miRNA在NF1MPNST细胞系中的分布。通过qRT-PCR研究miRNA在非-NF1(ST262T)以及NF1(ST8814)相关的MPNST细胞中的表达。miR-10b、miR-155和miR-335在NF1MPNST细胞中的表达水平显著高于在非-NF1MPNST细胞中的表达水平,而let-7a和let-7b的表达水平显著低于在NF1MPNST细胞中的表达水平。PCR产物在5%琼脂糖凝胶中进行电泳,所得结果与qRT-PCR数据一致。ST8814vs.ST262T:*P<0.05,***p<0.001,n=3。
图5显示miRNA在NF1肿瘤组织中的分布。根据临床和病理学诊断,将人肿瘤样本划分为NF1神经纤维瘤组(n=13),NF1MPNST组(n=8)和非-NF1MPNST组(n=4)。通过qRT-PCR研究miRNA的表达。与神经纤维瘤组相比,在NF1MPNST组织中,miR-10b的表达水平明显较高,而let-7a和let-7b的表达水平明显较低。与非-NF1MPNST相比,在NF1MPNST中,miR-10b的表达水平明显较高。三组中,miR-155和miR-335的表达水平相同。a:与NF1神经纤维瘤组相比,P<0.05;b:与非-NF1MPNST组相比,P<0.05。
图6显示miRNA在NF1神经纤维瘤的初级雪旺氏细胞中的分布。初级雪旺氏细胞分离自正常成人坐骨神经和NF1表皮以及丛状神经纤维瘤。NF1MPNST细胞系ST8814和T265p21也用于比较。通过qRT-PCR来研究miRNA的表达。miR-10b在NF1表皮雪旺氏细胞中的表达水平显著高于在正常雪旺氏细胞中的表达水平,在NF1丛状雪旺氏细胞中也显示出较高的miR-10b表达水平,但统计学差异不显著(P=0.07)。在NF1MPNST细胞中,miR-10b表达水平最高。在NF1MPNST细胞中,miR-155和miR-335的表达水平显著较高。在NF1MPNST细胞中,let-7b和let-7a的表达水平显著较低。NF1神经纤维瘤细胞和正常雪旺氏细胞之间的miR-155、miR-335和let-7a的表达水平差异不显著。SC:雪旺氏细胞。a:P<0.05vs.正常SC;b:P<0.05vs.表皮或丛状SC;n=3-4。
图7显示miR-10b直接靶向NF13’UTR。A:用TargetScan软件分析NF1基因的3’UTR,确定了miR-10b作用的靶序列。该靶序列在种间高度保守。B:将NF13’UTR克隆至Luc报告载体的3’UTR上,用得到的结构稳定转染HEK293细胞。miR-10b共转染显著降低了含NF13’UTR的Luc报告基因的表达,表明miR-10b直接靶向NF13’UTR。C:用MDH1-PGK-GFP/小RNA-10b(载体/miR-10b)或MDH1-PGK-GFP载体(载体)转染HEK293细胞。用荧光显微镜监测转染效率,并用qRT-PCR确定miR-10b的表达水平。D;转染的细胞用不含血清的培养基(对照)或添加20%胎牛血清(20%FBS)的培养基刺激15分钟,通过蛋白质印迹分析磷酸化ERK和总ERK。过表达miR-10b诱导了较高的磷酸化ERK表达。P<0.05vs.对照;n=3。
图8显示结果为miR-10b的反义抑制修正了NF1MPNST细胞的异常生长。用miR-10b抑制剂或阴性对照转染NF1MPNST细胞(ST8814)。A:将细胞在血清饥饿状态下培养24h,然后在不含血清的培养基(对照)或添加20%FBS的培养基中培养15分钟。通过蛋白质印迹检测磷酸化ERK和S6。与对照相比,血清刺激的结果是抑制了miR-10b表达,降低了磷酸化ERK和S6水平。B:在第4-7天,抑制miR-10b表达显著降低了细胞增殖。C:抑制miR-10b降低了克隆的形成。D:抑制miR-10b显著降低了细胞迁移和侵染(n=3)。miR-10b抑制剂vs.阴性对照:*P<0.05,**P<0.01,***p<0.001。
图9显示在NF1MPNST细胞中恢复miR-155、miR-335和let-7a的表达的影响。用miR-155抑制剂、miR-335抑制剂、let-7a增强剂或阴性对照转染NF1MPNST细胞(ST8814)。A:血清刺激的结果是增强了let-7a表达,降低了磷酸化ERK水平。B:抑制miR-155或miR-335,或增强let-7a表达不影响细胞增殖(各时间点n=5;MTT测试)。C:抑制miR-155或miR-335,或增强let-7a表达不影响细胞迁移(n=3)。D:抑制miR-335或增强let-7a表达显著降低了细胞侵染(n=3)。vs.阴性对照:*P<0.05,**P<0.01,***p<0.001。
发明详述
本发明解决了未满足的需求,提供NF1和NF1相关疾病,例如NF1-肿瘤的诊断和治疗。本发明涉及将调节miRNAs的药物递送至细胞(体内或体外),包括但不限于寡核苷酸,例如与miRNA的至少一部分完全反义的寡核苷酸,包含miRNA序列的寡核苷酸(例如,具有茎-环结构或miRNA双链的寡核苷酸)和/或编码寡核苷酸序列的表达载体。
I.定义
在进一步描述本发明之前,某些术语定义如下:
本文中使用的术语“miR”、“mir”和“miRNA”是指微小RNA,一类能够调节RNA水平的小RNA分子。(见Zeng和Cullen,RNA,9(1):112-123,2003;Kidner和Martienssen,Trends Genet,19(1):13-6,2003;Dennis C,Nature,420(6917):732,2002;Couzin J,Science298(5602):2296-7,2002,各自通过引用并入于此)。
MiRNA是一类新的非编码微小RNAs,通常作为基因转录后的负调节子。一般MiRNA与靶RNAs,通常是mRNAs的3’非翻译区(UTR)杂交,形成翻译抑制或RNA断裂/破坏。近来研究表明miRNAs在多种生物学过程中具有重要的调节功能,包括细胞增殖、分化、发育和细胞凋亡;还与许多癌症相关联,可能在恶化为癌症中起主要作用。
不受理论的约束,编码miRNA的基因可被转录,形成pre-miRNA,称为初级miRNA(pri-miRNA)。初级miRNA可以是含有多个初级miRNAs的多顺反子RNA的一部分。初级miRNA可通过茎和环形成发夹结构,且茎部可能包括错配碱基。
初级miRNAs的发夹结构可被Drosha,RNase III核酸内切酶识别。Drosha加工可产生带有5’磷酸和约一个2位核苷3’悬垂的pre-miRNA茎环。初级miRNA的加工是本领域熟知的,可见于,例如美国专利申请20070050146,其通过引用并入于此。一般认为pre-miRNA可被Dicer识别并进一步加工,Dicer也是一个RNase III核酸内切酶。得到的可包含错配碱基的类siRNA双链,包括成熟miRNA和小片段,称为miRNA*(miRNA小星星)。miRNA和miRNA*可来自初级miRNA和pre-miRNA的对应臂上。MiRNA*序列可在miRNAs克隆库中找到,但一般比miRNAs出现的频率更低。
虽然开始时是以双链形式miRNA*存在,miRNA最终能够以单链RNAs整合至核糖核蛋白复合物中,称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)。多种蛋白可形成RISC,这可能导致形成特异miRNA/miRNA*复合物、靶基因结合位点、miRNA活性(抑制或激活)的变化形式,miRNA/miRNA*复合物的链负载于RISC上。
当miRNA:miRNA*复合物的miRNA链负载于RISC上时,miRNA*可被去除并降解。负载于RISC上的miRNA:miRNA*复合物的链可以是5’端配对不严格的链。在miRNA:miRNA*的两端都具有大致相当的5’配对的情况下,miRNA和miRNA*都具有基因沉默活性。
基于miRNA和mRNA之间的高水平互补,RISC可识别靶核酸,特别是miRNA的2-8个核苷酸。仅有一例在动物中的报道,miRNA与靶核酸之间的相互作用是沿着miRNA的全长(Yekta等,2004,Science304-594)。
本文中使用的术语“miRNA基因产物”可以是任何从miRNA基因转录得到的产物,包括初级转录物、初级miRNA、pre-miRNA、miRNA*或成熟miRNA。
本发明优选的核酸包括let-7a、pre-let-7a、miR-10b、pre-miR-10b、miR490、pre-miR-490、miR-137、pre-miR-137、miR-30b、miR-10a、pre-miR-30b、pre-miR10a、miR-155、pre-miR155、miR-355、pre-miR355或与它们互补的核酸分子。
人let-7a具有以下序列:
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(DNA:TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT),且包含于pre-miRNA(UGGGAUGAGGUAGUAG GUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA)中。其它优选的miRNA序列如下:hsa-miR-10b(UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG,互补序列:CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA),hsa-miR-490(CCAUGGAUCUCCAGGUGGGU,互补序列:ACCCACCTGGAGATCCATGG),hsa-miR-137(UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG,互补序列:CTACGCGTATTCTTAAGCAATAA),hsa-miR-10b(UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG,互补序列:CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA),以及miRNA-30b(UGUAAACAUCCUACACUCAGCU,互补序列:AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA)。
本发明进一步优选的序列如下(以下序列来自microrna.sanger.ac.uk的miR数据库):miR-155(hsa-mir-155MI0000681:CUGUUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUUUUUGCCUCCAACUGACUCCUACAUAUUAGCAUUAACAG;hsa-miR-155,成熟序列MIMAT0000646:UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU;hsa-miR-155*MIMAT0004658:CUCCUACAUAUUAGCAUUAACA;miR-155成熟序列的互补序列:ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA);miR-335(hsa-mir-335MI0000816:UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA;hsa-miR-335成熟序列,MIMAT0000765:UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU;hsa-miR-335*MIMAT0004703:UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC;miR-335成熟序列的互补序列:ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUGA);let-7b(hsa-let-7b MI0000063:CGGGGUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUUCAGGGCAGUGAUGUUGCCCCUCGGAAGAUAACUAUACAACCUACUGCCUUCCCUG;hsa-let-7b成熟序列,MIMAT0000063:UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU;和hsa-let-7b*MIMAT0004482:CUAUACAACCUACUGCCUUCCC)。在一些实施方案中,优选测定miRNA序列的表达水平或活性。在其它实施方案中,优选测定成熟miRNA序列的表达水平或活性。在其它实施方案中,优选测定成熟miRNA*序列的表达水平或活性。
本文所述的检测miRNA序列的方法(例如,诊断和预测方法)可用于检测初级miRNA转录物、成熟miRNA或它们的互补形式。根据本文所述的治疗方法(例如,治疗患有或具有发展NF1肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险的个体的方法,或改善患有NF1的青少年患者的认知障碍的方法),使用初级miRNA转录物的互补形式或成熟miRNA的互补形式(例如,作为阻断剂或反义调节子)上调或下调本发明的miRNA水平是可取的。在近似的实施方案中,可使用初级miRNA的互补形式。在其它实施方案中,可使用miRNA*序列(或它的互补形式)。在特定的实施方案中,可制备miRNA*的抑制剂(例如,阻断剂或反义序列)以上调或下调其在靶细胞中的水平。本领域技术人员应理解的是,互补序列不必是精确的互补形式,在本发明范围内可以使用miRNA片段、互补序列的片段或与miRNA或其互补形式近似的序列。在一个实施例中,用与miR-10b互补的序列、与miR-10b互补的片段或例如,与miR-10b的互补形式序列同一性为80%、85%、90%、95%或99%的序列,可下调miR-10b的水平,当抑制剂、增强剂或其它药物“上调”或“下调”核酸(例如,miRNA、pre-miRNA、miRNA*或初级miRNA)时,应理解为抑制剂、增强剂或药物分别提高或降低核酸的表达。
本文使用的,当表达水平或活性为“显著高”时,是指可测得的表达水平或活性比对照样本高,或比没有患有NF1(或NF1-肿瘤或NF1相关疾病)个体的样本高,这对本领域普通技术人员而言,表示的是生物学意义的<。在一些实施方案中,“显著高”表示高表达水平或活性为统计学意义上的显著,例如,t-试验(或等价的参数或非参数试验)的p-值<0.1,<0.07,<0.05,<0.01,<0.005,<0.001,<0.0005或<0.0001。在其它实施方案中,“显著高”表示表达水平或活性高1或2倍。在其它实施方案中,“显著高”表示表达水平或活性高3-5或5-10倍。在其它实施方案中,“显著高”表示表达水平或活性高10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍或更高。
本文使用的,当表达水平或活性为“显著低”时,是指可测得的表达水平或活性比对照样本低,或比没有患有NF1(或NF1-肿瘤或NF1相关疾病)个体的样本低,这对本领域普通技术人员而言,表示的是生物学显著。在一些实施方案中,“显著低”表示低表达水平或活性为统计学意义上的显著,例如,t-试验(或等价的参数或非参数试验)的p-值<0.1,<0.07,<0.05,<0.01,<0.005,<0.001,<0.0005或<0.0001。在其它实施方案中,“显著低”表示表达水平或活性低1或2倍。在其它实施方案中,“显著低”表示表达水平或活性低3-5或5-10倍。在其它实施方案中,“显著低”表示表达水平或活性低10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍或更低。
本文使用的“治疗”是针对患者的疾病、障碍或生理疾病或患者易于感染的疾病、障碍或生理疾病进行的临床干预。治疗的目的包括减轻或预防知识一种体征和/或症状,延缓或停止疾病、障碍或病症的恶化或加重,和/或减轻疾病、障碍或病症。“治疗(treatments)”或“诊治(treating)”是指治疗和/或预防性治疗或预防的方法。需要治疗的人包括那些已遭受疾病或障碍或生理疾病的人,以及那些需要预防疾病或障碍或生理疾病的人。
本发明方法中使用的疾病的“症状”或“体征”是疾病的主观或客观证据。疾病的主观证据或表现可以是患者的感觉或患者外观或身体功能的变化。例如,疼痛的症状可由患者主观感觉到的疼痛程度而决定。疾病的客观证据或表现可包括客观证据或疾病的建议也可能包括定性和/或定量测试结果,或医生的诊断。例如,神经纤维瘤的存在可能是NF1的客观证据。
在一个实施方案中,本发明方法可用于延缓或阻止患有NF1的患者向MPNST的恶化。
本文中使用的“NF1-相关肿瘤”、“NF1-相关癌症”和“NF1-肿瘤”是由NF1引发的肿瘤或癌症。NF1-肿瘤和癌症的实例包括恶性脑肿瘤、白血病青少年白血病、神经鞘膜瘤(Schwannomas)、神经瘤、听神经瘤、神经鞘瘤和某些肌肉(横纹肌)肿瘤、神经纤维瘤、肾上腺肿瘤(嗜铬细胞瘤)、肾癌(例如,肾母细胞瘤)或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统瘤(CNS)、脊髓轴瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、恶性胶质瘤、视神经胶质瘤、椎旁神经纤维瘤、椎管内肿瘤、丛状神经纤维瘤以及其它临床医生已知的与该疾病相关的病症。
NF1的传统诊断标准包括以下两项或两项以上的存在(美国专利No.5391575,通过引用并入于此):(1)在青春期后的个体中出现6个或多个最大直径≥15mm的咖啡牛奶(色素过度沉着的)色斑,或在青春期前的个体中出现直径为5mm的色斑;(2)2个或多个任何类型的神经纤维瘤或1个丛状神经纤维瘤;(3)在腋窝或腹股沟出现雀斑;(4)视神经胶质瘤;(5)2个或多个Lisch结节(虹膜错构瘤结节,iris hamartomas);(6)具有或不具有假关节的独特的骨病变,如蝶骨发育不良或长骨皮质变薄;(7)NF1对应的一级程度(Von Recklinghausen,F.,″Uber die multiplen fibrome der Haut und ihre Beziehung zu den multiplen,″Neuromen.,″Hirschwald,Berlin(1882))。其它NF1体征/症状可包括身材矮小、骨骼畸形(例如,脊柱侧弯)、大头畸形及经常的学习障碍如注意力缺陷多动障碍(ADHD)、低智商、行为困难或其它认知障碍。“认知障碍”多发生于儿童,可能由影响神经组织或大脑的神经纤维瘤、其它脑肿瘤、神经鞘瘤所引发,或由于神经组织中神经纤维瘤蛋白(NF1肿瘤抑制基因)的减少而影响。在一个实施方案中,本文中所述治疗方法可用于改善一种或多种这些症状。
为实施本发明的方法,例如诊断方法,可从生物样本如组织或生物液中收集miRNA。组织可以是所收集部位的和/或分散的细胞群体,包括但不限于脑、心脏、乳腺、结肠、膀胱、子宫、前列腺、胃、睾丸、卵巢、胰腺、垂体、肾上腺、甲状腺、唾液腺、乳腺、肾、肝、肠、脾、胸腺、骨髓、气管和肺。组织和液体样本可来自癌、癌前期、非癌或良性组织。例如,在一些实施方案中,样本可来自NF1-肿瘤或来自NF1-肿瘤附件的组织。生物液包括唾液、精液、血清、血浆、血液、眼睛液体(ocular lens fluid)、脑脊髓液、汗液、尿液、牛奶、腹水、粘液、关节液、腹膜液和羊水,但不限于此。既可用侵入技术又可用非侵入技术获取此类样本,这是本领域熟知的。在一些实施方案中,从一个或少数几个细胞中收集miRNA。本文中使用的“测试样本”是疑似含有miRNA序列或其变体的生物标本。测试样本可以是任何生物来源,如生理液(例如,见上述列举的生物液),或发酵肉汤、细胞培养物、化学反应混合物等。测试样本可以(i)直接使用获得的来源或(ii)进行预处理以改善样本的性质。因此,测试样本可以在使用前进行预处理,例如,将血液制备成血浆,将固体材料制备成液体,从组织样本中制备细胞,从组织或细胞中分离核酸,稀释粘液,过滤液体,蒸馏液体,浓缩液体,灭活干扰成分,添加药物等。测试样本还可进行消化、限制酶切的预处理,使双链核酸序列变为单链。而且,测试样本可进行积累、纯化、扩增的预处理,以浓缩样本中含有的序列。本领域熟知的扩增反应可用于扩增靶序列。
本文中使用的“NF1-相关病疾(NF1-related pathologies)”或“NF1-相关疾病(NF1-related diseases)”包括NF1、NF1-相关疾病以及NF1相关的体征或症状。例如,不限于任意一项,NF1-相关疾病包括认知障碍,骨病(例如,上述提及的),NF1-肿瘤,例如上述提及的,白血病,神经肿瘤,神经鞘瘤,外周神经鞘瘤,MPNST,生长激素缺乏症,神经纤维瘤,椎旁神经纤维瘤,椎管内肿瘤,丛状神经纤维瘤,骨质增生,骨侵蚀,骨变形,皮下肿块,紊乱的皮肤色素沉着,咖啡牛奶斑,腹股沟或腋窝(arm pit)雀斑,立奇氏结节和虹膜斑。
II.本发明的核酸分子
本文中使用的术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以表示至少两个核苷酸共价相连。本领域技术人员应理解的是,单链的描述也给出了互补链的序列。因此,基于沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对原理,单链核酸分子的公开也构成了对所描述的单链的互补链的公开。
本领域技术人员应理解的是,许多核酸分子的变体可作为相同目的的给定核酸分子使用。因此,核酸还包括基本上相同的核酸及其互补形式,以及核酸分子的修饰形式,例如,包括化学修饰或额外的能够使核酸分子具有有益特性的基团。核酸分子还包括在严格杂交条件下能够与另一个核酸分子杂交的探针。
在一些优选的实施方案中,本发明的核酸分子具有5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40或50个碱基或核苷酸等。
本发明的核酸分子可以是单链或双链或可含有双链或单链序列的一部分(例如,可以是部分双链和部分单链)。核酸分子可以是DNA(例如,基因组或cDNA)、RNA或含有的核酸为脱氧核糖和核糖核苷酸组合的杂合体,其中碱基组合包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、乌嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异乌嘌呤。可通过本领域熟知的或许合成方法或重组方法获得核酸。
在一些实施方案中,核酸分子,例如miRNA可分离自,例如脊椎动物细胞诸如哺乳动物细胞。分离出本发明优选的核酸分子。本文中使用的“分离的”分子是指分子基本上是纯的,且与其它物质是分开的,通常发现这些物质在天然条件下或体内系统中是与分子结合的,以达到实际和适于特定的应用的程度。特别地,分子是完全纯的且与其它宿主细胞的生物组分是完全分开的,适合用于,例如生产药用制剂或测序。由于本发明的分离的分子在药用制剂中可能与药用载体相混合,所述分子可能仅占制剂重量的一小部分。然而所述分子是分离的是指它们基本上从活体系统中与其结合的物质,例如相邻的基因组核酸序列上分离出来。
一般核酸分子含有磷酸二酯键,然而也可包含带有至少一种不同键的核酸类似物,例如磷酰胺酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键或O-甲基亚磷酰胺酯键(O-methylphosphoroamidite)以及多肽核酸主链和键连接。其它的核酸类似物包括那些具有阳性主链,非离子型主链和非核糖主链的核酸类似物,包括美国专利Nos.5,235,033和5,034,506中描述的那些核酸类似物,通过引用并入于此。
含有一个或多个非天然存在或修饰的核苷酸的核酸分子也包含在核酸分子的一个定义内。一个或多个修饰的核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5′端和/或3′端或核酸分子内。核酸类似物的代表例可选自糖或主链修饰的核糖核苷酸。然而,应注意的是,核苷修饰的核糖核苷酸,即含有以非天然存在的核苷取代天然存在的核苷如5-位修饰的尿苷或胞苷的核糖核苷酸,例如5-(2-氨基)丙基尿苷,5-溴尿苷;8-位修饰的腺苷和乌苷,例如8-溴乌苷;去氮核苷酸,例如7-去氮-腺苷;O-和N-烷基化核苷酸,例如N6-甲基腺苷是适合的。2′-OH基团可被选自下组的物质取代:H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN,其中R为C1-C6烷基、烯基或炔基,卤素为F、Cl、Br或I。在优选的实施方案中,本发明修饰的核酸分子包括2′-O甲基修饰。
可基于多种原因对核糖-磷酸主链进行修饰,例如,提高这些分子在生理环境下的稳定性和半衰期或用作生物芯片的探针。可形成天然核酸和类似物的混合物,或者形成不同核酸类似物的混合物以及天然核酸和类似物的混合物。应进一步理解的是,同一核酸分子可形成修饰的组合(例如,主链键的修饰和2′-O修饰)。稳定化改变可包括使用非离子型DNA类似物,如烷基和芳基膦酸酯(其中带电荷的膦酸盐中的氧被烷基或芳基取代),磷酸二酯和烷基膦酸三酯,其中带电荷的氧基被烷基化。
在另一个实施方案中,本发明核酸分子的典型修饰包括整合额外的部分。例如,在一个实施方案中,本发明的核酸分子包括胆固醇部分。本发明优选的核酸分子包括寡核苷酸,例如DNA或RNA分子,如初级miRNA、pre-miRNA、miRNA和反义miRNA。
A.微小RNA增强剂
miRNA增强剂为能够提高细胞中miRNA基因产物水平的分子,例如核酸分子、小分子。
在一个实施方案中,miRNA增强剂可包括miRNA、miRNA*序列或它们的变体。在一个实施方案中,miRNA分子为合成的分子。在一个实施方案中,miRNA分子包括一个或多个稳定突变。miRNA序列可包括21-23、21-25、13-33、18-24、18-26或21-23个核苷酸。在一些实施方案中,miRNA序列可包括15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。miRNA的序列可以是pre-miRNA的前13-33或21-25个核苷酸。miRNA序列可以是pre-miRNA的后13-33或21-25个核苷酸。
本发明的核酸分子包括初级miRNA序列或其变体。初级miRNA序列可包括30-300、35-375、45-250、55-200、70-150或80-100个核苷酸。初级miRNA的序列可包括如下述的pre-miRNA、miRNA和miRNA*。成绩miRNA还可包括miRNA或miRNA*及它们的互补形式和变体。
初级miRNA可形成发夹结构。所述发夹结构可含有完全互补的第一和第二核酸序列。第一和第二核酸序列可以是37-50个核苷酸。第一和第二核酸序列可以被8-12个核苷酸的第三序列分开。根据维也纳算法(Vienna algorithm)默认参数,计算得到所述发夹结构的自由能小于-25Kcal/摩尔,如Hofacker等,Monatshefte f.Chemie 125:167-188(1994)中描述的,全文通过引用并入于此。所述发夹结构可包括由4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸组成的末端环。
本发明的核酸还包括pre-miRNA序列或其变体。pre-miRNA序列可包括30-50、40-100、45-90、60-80或60-70个核苷酸。pre-miRNA的序列可包括如下述的miRNA和miRNA*。pre-miRNA还可包括miRNA或miRNA*及它们的互补形式和它们的变体。pre-miRNA的序列还可以是初级miRNA的5′和3′端去掉0-160、0-150、0-130、0-120、0-100、0-80、0-60、0-50、0-40、0-30、0-20或0-10个核苷酸的初级miRNA。
B.MiRNA抑制剂
在一个实施方案中,本发明的核酸分子为miRNA抑制剂。例如,在一个实施方案中,抑制性的核酸分子为阻断剂。本文中使用的术语阻断剂为能够阻断miRNA或miRNA*活性的反义miRNA分子。反义miRNA可包括总计5-100或10-60个核苷酸。反义miRNA还可包括总计为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一个实施方案中,反义miRNA的序列可包括(a)至少5个与miRNA 5′端完全相同的核苷酸以及至少5-12个与所述miRNA 5′端靶位点的侧翼区完全互补的核苷酸,或(b)至少5-12个与所述miRNA 3′端靶位点的侧翼区完全互补的核苷酸。
本发明的反义miRNA序列可包括miRNA的互补序列,例如,与miRNA结合并阻断其活性的反义miRNA。
C.核酸分子的互补性
许多研究着眼于miRNA和其靶mRNA的碱基配对,达到有效的翻译抑制(Bartel回顾,2004,Cell 116-281)。在哺乳动物细胞中,miRNA的前8个核苷酸可能是重要的(Doench&Sharp 2004GenesDev2004-504)。然而,微小RNA的其它部分也可能参与mRNA结合。而且,3′端充分的碱基配对可弥补5′端的配对不充分(Brennecke等,2005PLoS 3-e85)。计算研究,分析结合到整个基因组上的miRNA,表明在靶向结合中miRNA 5′端的2-7个碱基起到特殊作用,而第一个核苷酸,通常发现为“A”(Lewis等,2005Cell 120-15)。近似地,用1-7或2-8个核苷酸确定和验证靶位点,Krek等(2005,Nat Genet 37-495)。
miRNA的核酸抑制剂与表达水平将要受到抑制的miRNA分子具有互补性。在一个实施方案中,抑制剂和miRNA为全长100%互补(即,与miRNA分子的核苷酸100%互补)。在另一个实施方案中,抑制剂和miRNA分子为全长99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%或90%互补。在所述分子互补小于100%的实施方案中,优选地,miRNA分子5′端的2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基与抑制剂相应位置上的核苷酸互补;错配可发生在其它位置并达到理想的互补水平。
“微小RNA种子序列”、“miRNA种子序列”、“种子区”和“种子部位(seed portion)”是指成熟miRNA序列的2-7或2-8个核苷酸。一般miRNA种子序列位于miRNA的5′端。在一些实施方案中,用于比较的miRNA“种子”区可在miRNA序列中命名,可基于与miRNA种子区互补或完全互补,选择潜在靶基因序列的UTR。在一些实施例中,种子区成核结合于miRNA和其互补序列之间,例如,与miRNA序列完全反义序列。本文中“种子”区还指miRNA序列的开始部位。miRNA的种子区可以是miRNA的任何适合的部位,例如,miRNA序列中3、4、5、6、7、8、9或10个连续的核苷酸。优选的,miRNA的种子区为miRNA序列中6、7或8个连续的核苷酸。例如,miRNA序列的种子区可方便地包括寡核苷酸5′端从1至7,从1至8,从2至7或从2至8定义的核苷酸。其它实施例包括寡核苷酸5′端从1至9,从1至10,从2至7,从2至8,从2至9,从2至10,从3至10,从4至12等。与种子区互补的UTR部位可以是“种子匹配”区或UTR的起始序列。在确定miRNA的种子区和潜在靶基因序列的UTR种子匹配区之间的匹配之后,在miRNA内定义“延伸”部位,所述延伸部位包括miRNA内,即使不完全与潜在靶基因序列的UTR互补,也能够至少部分互补(及,包括G:U配对)的核苷酸。miRNA的延伸部位所结合的UTR内的序列可以是UTR内的延伸序列。在一些实施例中,miRNA的延伸部位可以从miRNA的种子区的3′端和/或5′端方向开始定义,直至发现错配碱基。在其它实施例中,除了种子区,延伸部位可具有1、2、3、4或多个核苷酸。然而,在其它实施例中,可确定延伸部位与种子区相同。
因此,在一些实施方案中,本发明miRNAs的靶位点具有与miRNAs互补的序列,通常是与miRNA 5′端的区域互补。在一些实施方案中,靶序列与miRNA的种子区为100%序列同一性。
III.本发明的应用
A.诊断和预测NF1-相关疾病
本发明还涉及包括检测生物样本中疾病相关的miRNA差异表达水平的诊断方法。所述样本可来自患者。诊断患者的疾病状况以备预后和/或选择治疗策略。与对照相比,疾病相关的miRNA的差异表达可用于诊断患有该疾病或具有患该疾病风险的患者(例如,NF1、NF1-肿瘤或NF1相关疾病)。疾病相关的miRNA的表达水平还可用于监测治疗和患者的疾病状况。此外,疾病相关的miRNA的表达水平可用于筛选能够改变与疾病相关的特定表达水平或抑制与疾病相关的表达水平的候选药物。
可实施标记探针对组织芯片原位杂交。当比较患病个体与合适的对照或标准参照之间的疾病相关的miRNA水平时,本领域技术人员能够基于发现作出诊断、预后或预测。应进一步理解的是,指示诊断的基因可以与那些指示预后的基因不同,且细胞的分子分布可导致疾病应答或疑难疾病之间的不同或可预测结果。
在一个方面,本发明提供NF1和NF1-相关肿瘤的生物诊断标记。在相关的方面,本发明提供预测NF1和NF1-相关肿瘤发展的,例如向MPNST恶化的生物诊断标记。
在一个实施方案中,本发明提供诊断或预测是否个体具有发展NF1(或NF1-相关疾病)的风险的方法,包括,例如(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中,测试样品中的至少一种miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体具有发展NF1(或NF1-相关疾病)的风险。在一些实施方案中,测定的miRNA基因产物自下组:miR-10b、pre-miR-10b、let-7a和pre-let-7a、miR10a和pre-miR10a。在一个实施方案中,测定一个或以上的基因产物。在一个实施方案中,通过测定所述基因的表达水平来测定基因产物。在另一个实施方案中,测定所述基因产物的活性。
在一些实施方案中,患有或具有发展NF1(或NF1-相关疾病)的风险的个体将显示出某些miRNAs水平的改变。在一些实施方案中,患有或具有发展NF1(或NF1-相关疾病)的风险的个体具有高水平的miR-10b和/或miR-10a。因此,测定个体中miR-10b、pre-miR-10b、miR10a和/或pre-miR10a的水平或活性,并确定出一种或以上是提高的,可指示个体患有或具有发展NF1、NF1-相关疾病或NF1-肿瘤的风险。
在一些实施方案中,患有或具有发展NF1(或NF1-相关疾病)的风险的个体具有降低的let-7a和/或let7b水平。因此,测定个体中let-7a和/或let7b水平或活性,并确定是降低的,可指示个体患有或具有发展NF1、NF1-相关疾病或NF1-肿瘤的风险。
在一个实施方案中,测定个体中一种或以上如下物质的水平或活性:(i)miR-10b、pre-miR-10b、miR10a和/或pre-miR10a;(ii)miR-355、pre-miR-355,并确定一种或以上是提高的,可指示个体患有或具有发展NF1或NF1-相关疾病的风险(例如,肿瘤、骨病等)。在一个实施方案中,还可测定let-7a和/或let-7b的水平,如果与适合的对照相比是降低的,可指示个体患有或具有发展NF1、NF1-肿瘤、白血病或或NF1-相关疾病的风险。
在另一个实施方案中,本发明提供诊断或预测个体是否患有,或具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险的方法,包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中,测试样品中的miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体或者患有,或者具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险。在一些实施方案中,miRNA基因产物为miR-155、pre-miR-155、miR-355、pre-miR355、miR-137、pre-miR-137、miR-490、pre-miR-490。miR-10b和/或pre-miR-10b。
在一些实施方案中,患有或具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险的个体将显示出某些miRNAs水平的变化。在一些实施方案中,患有或具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险的个体具有提高的miR-10b、miR-490和/或miR-137水平。因此,测定个体中miR-155、pre-miR-155、miR-355、pre-miR355、miR-10b、pre-miR-10b、miR-490、pre-miR-490、miR-137和/或pre-miR-137的水平或活性,并确定一种或以上是提高的,可指示个体患有或具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险。在一些实施方案中,患有或具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险的个体具有降低的let-7a和/或let-7b水平。因此,测定个体中let-7a和/或let-7b的水平或活性,并确定是降低的,可指示个体患有或具有发展NF1-相关肿瘤的风险。
在一些实施方案中,患有或具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险的个体中的NF1基因将发生变化(例如,突变或多态现象),例如,能够阻止或增加NF1调节的突变或单核苷酸多态现象。此类突变或多态现象可存在于基因序列的任何地方。在一些实施方案中,改变发生于NF1启动子、5’UTR或3’UTR中。在一些实施方案中,由miR-335或miR-155带来的改变增强了NF1的调节。在一些实施方案中,改变发生于3’UTR中,miR-10b增强了NF1的调节。在一些实施方案中,由let-7a或let-7b带来的改变降低或消除了NF1的调节。本领域技术人员应理解的是,改变存在于NF1基因而不是NF1中,并影响NF1基因调节。例如,改变可存在于miR-10b、TWIST1、let-7a、let-7b、miR-335、miR-155或其它小分子中。在本发明范围内,检测NF1中发生的变化以及其它能够影响1型神经纤维瘤病、NF1-相关肿瘤发展或NF1基因调节的基因。可使用本领域已知的标准方法检测此类变化。例如,可采用DNA测序或SNP阵列。
本文中使用的“miRNA基因产物水平的变化”是指个体或样本中miRNA水平与另一个样本,例如对照样本相比,是提高的或降低的。在一些实施方案中,miRNA提高的或降低的量为1倍和20倍,或大于20倍。在特定的实施方案中,miRNA提高或降低1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍或以上。在其它的实施方案中,miRNA提高或降低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%或以上。事实上,任何可测得的miRNA水平的变化可用于诊断或预测NF1或NF1-相关疾病。在一个实施方案中,miRNA水平的变化是有意义的,即,能够被本领域技术人员识别并作为重要生物水平变化的指标。在另一个实施方案中,miRNA水平的变化具有统计学意义。
本发明方法中所述的核酸“水平”是指通过标准实验室方法测得的核酸量或其活性。该术语可指示样本中例如,通过northern杂交或微阵列分析测得的核酸量(例如,浓度或总量),或可指示根据,例如其抑制靶RNA的能力或其减少的靶RNA编码的蛋白的量或活性而测定的核酸的活性水平。
上下文中使用的术语“靶”为miRNA靶标,是指含有miRNA结合位点的RNA。因此,术语“靶”通常是指将被miRNA抑制的RNA。在一些实施方案中,术语“靶”可以是编码靶RNA的基因。近似地,在一些实施方案中,术语“靶”可以是受miRNA影响的蛋白(例如,miRNA可结合至并抑制mRNA的翻译,因此降低了由mRNA编码的“靶”蛋白的量)。“靶”还可以是与miRNA特异杂交的核酸序列,或者是miRNA的互补形式。
靶mRNA中的靶位点可存在于5′UTR、3′UTR或编码区中。有趣的是,多个miRNAs可通过识别相同位点或多个位点来调节相同的靶mRNA。在大多数基因鉴定靶位点中多个miRNA互补位点的存在表明多个RISCs的协同作用提供了最有效的翻译抑制。
通过两个机制中的任一个,miRNAs可指导RISC下调基因表达:mRNA断裂或翻译抑制。如果mRNA与miRNA具有一定程度的互补性,miRNA可专门断裂mRNA。当miRNA指导断裂时,断裂的位置可以在miRNA的核苷碱基对的第10和第11个残基之间。另外,如果miRNA不具有miRNA所需的程度的互补性,miRNA可抑制翻译。由于动物具有较低程度的互补性,翻译抑制在动物中更为普遍。
应注意的是,在任一对mRNA和mRNA*的5′和3′端可能存在变化形式。该变化形式可能是由于Drosha和Dicer对断裂位点的酶加工。miRNA和miRNA*的5′和3′端的变化形式还可能是由于初级miRNA和miRNA前体的茎结构中的错配。茎部链的错配可形成大量不同的发夹结构。茎结构中的变化形式还可导致由Drosha和Dicer形成的断裂产物的变化形式。
在一组实施方案中,mRNA序列的靶基因序列可通过比较潜在靶基因序列和互补匹配的mRNA序列而测定(例如,沃森-克里克互补配对和/或G:U配对)。例如,潜在靶基因序列的UTR可与mRNA序列进行互补匹配比较,鉴定出那些具有高度互补性的基因序列作为靶基因序列。测定可通过人工操作或用机器如计算机系统辅助操作。待搜索的潜在靶基因序列可来自一个或几个物种(例如,用于比较研究,即人和小鼠,人和大鼠,小鼠和大鼠,人和河豚(Fugu),人和狗,人和小鸡等)。
为了测定与疾病相关的miRNA或其变体的水平,可使用本领域已知的测定核酸表达的方法。例如,可通过用探针或生物芯片作用于样本并测定杂交量,从而测定与疾病相关的mRiNA的表达水平。可采用标准方法,如Northern杂交、聚合酶链式反应或微阵列分析测定imRNA。
此外,可通过用所带有的探针与靶核酸完全互补的生物芯片作用于含有靶核酸的样本,进行靶核酸检测,并检测与探针杂交的分子高于对照d的水平。
还可通过将待测核酸固定于固体支持物如尼龙膜上并用标记的探针与样本杂交来检测靶核酸。近似地,还可通过将标记的探针固定于固体支持物上,并与含有标记的靶核酸的样本杂交来检测靶核酸。然后进行清洗以去除非特异性的杂交,检测标记。
还可通过用标记的探针作用于透性化细胞或组织样本并与靶核酸杂交,进行原位检测靶核酸。然后清洗,去除非特异结合的探针,检测标记。
这些检测可以是直接杂交检测或包括夹心检测,其包括多个探针的使用,大体上描述于美国专利Nos.5,681,702;5,597,909;5,545,730;5,594,117;5,591,584;5,571,670;5,580,731;5,571,670;5,591,584;5,624,802;5,635,352;5,594,118;5,359,100;5,124,246和5,681,697,各自通过引用并入于此。
可采用多种杂交条件,包括上述高、中和低严格条件。在严格条件下进行的检测,探针仅与靶核酸杂交。可通过改变步骤中的热力学可变参数控制严格性,包括但不限于,温度、甲酰胺浓度、盐浓度、离液盐浓度pH或有机溶剂浓度。
可采用多种方法进行杂交反应。反应组分可同时加入或以不同顺序逐个加入。此外,反应还包括多种其它药物。它们包括用于优化最佳杂交和检测和/或减少非特异性或背景干扰的盐、缓冲液、中性蛋白,例如,白蛋白、去污剂等。还可适当地使用其它提高检测效率的药物,如蛋白酶抑制剂、核酶抑制剂和抗菌剂,这取决于样本制备方法和靶核酸的纯化。
还可通过研究靶蛋白的活性(即,由miRNA靶定位的RNA编码的蛋白)或蛋白通路的方法,来测定本发明核酸的水平和活性。例如,神经纤维瘤蛋白将Ras从它的活性GTP同种型转化为它的GDP同种型。由于在NF1中神经纤维瘤蛋白通常是功能缺失的,Ras信号通路将更活跃。因此,可通过检测到的Ras信号通路的抑制水平,来测定靶定位至核酸以抑制Ras通路中的Ras蛋白或其它蛋白。可采用本领域已知的标准方法检测细胞中Ras通路或其它信号通路或蛋白的状态,例如可采用phosphoELISATM、ELISA和蛋白质印迹。Ras通路可被胞内事件或通过因子与酪氨酸激酶(RTKs)的结合而激活。Ras通路促进增殖和细胞生长,并与许多癌症类型有关。Ras通路的激活可进一步通过测定磷酸化的Ras来进行检测(例如,通过ELISA或蛋白质印迹),或例如测定磷酸化的MEK、ERK或Elk-1,它们是Ras通路的成员。
此外,可采用本领域已知的其它检测miRNA的方法。例如,可使用美国专利公开Nos.US20060292616A1,美国2006/0228729和美国2007/0050146(全部通过引用并入于此)中描述的方法。
B.基因沉默
部分地,本发明涉及用本发明核酸降低靶基因例如NF1在细胞、组织或器官中的表达。通过表达本发明的所含序列与靶mRNA的一个或以上结合位点完全互补的核酸从而降低靶基因的表达。所述核酸可以是miRNA或其变体。所述核酸还可以是初级miRNA、pre-miRNA或它们的变体,它们可被加工成miRNA。表达的miRNA可与靶mRNA上完全互补的结合位点杂交,形成翻译抑制或RISC-介导的基因沉默的激活。
基因沉默的靶位点还可以是引起第二个基因或蛋白沉默的基因或蛋白。通过抑制靶基因的表达,可提高第二蛋白的表达。用于有效抑制的miRNA表达的实例见由Esau等2004JBC 275-52361和Cheng等2005Nucleic Acids Res.33-1290的研究,其通过引用并入于此。
C.基因增强
本发明还涉及用本发明的核酸提高细胞、组织或器官中靶基因表达的方法。可通过表达本发明的所含序列与初级miRNA、miRNA体、miRNA或它们的变体完全互补的核酸,来提高靶基因的表达。所述核酸可以是反义miRNA。该反义miRNA可与初级miRNA、pre-miRNA或miRNA杂交,由此降低基因的抑制活性。还可通过表达本发明的与靶基因中结合位点的一部分完全互补的核酸,来提高靶基因的表达,结合至结合位点的核酸能够阻止miRNA结合。
另外,miRNA可用于通过基因表达。近来证据显示miRNA可结合到基因启动子上并诱导转录(Place等PNAS.2008vol.105no.51608-1613)。
D.治疗NF-1相关疾病
本发明还涉及用本发明的核酸,例如miRNAs(例如let-7a、pre-let-7a、miR10a、pre-miR10a、miR-137、pre-miR-137、miR-490、pre-miR-490、miR-10b、miR-前体、miR-155、pre-miR-155和/或miR-355、pre-miR-355)作为NF-1相关疾病和病症的调节剂的方法。一般而言,请求保护的核酸分子可作为基因产物水平的调节剂,所述基因产物来自与所述核酸至少部分互补的基因。
在进一步优选的实施方案中,miRNA分子可用作治疗靶标,例如,当需要抑制miRNA以治疗疾病或其症状时。
例如,在一个实施方案中,抑制miR-10b或pre-miR-10b的水平,可延缓或阻止NF1-相关肿瘤、肿瘤发生和/或肿瘤恶化。在另一个实施方案中,抑制miR-335或pre-miR-355可延缓肿瘤生长。在另一个实施方案中,增强let7a的表达水平可延缓肿瘤生长。在一个实施方案中,可采用组合治疗,其中所述药物能够调节多于一种的上述药物。
此外,可将已有的miRNA分子作为起始材料用于制备序列修饰的miRNA分子,以修饰其靶核酸的特异性,例如,致癌基因、多药耐药基因或其它治疗靶基因。进一步地,可对miRNA分子进行修饰,使它们被加工,然后产生可再次直接作用于相关治疗靶位点的双链siRNAs。此外,miRNA分子可用于组织重设程序(tissue reprogramming procedures),例如通过将表达的miRNA分子导入不同的细胞类型或干细胞中,转化得到分化的细胞系。
因此,在另一方面,本发明提供NF1、NF1-相关疾病和NF1相关肿瘤的治疗方法。在一个实施方案中,本发明提供治疗患有NF1的患者的方法,例如,通过给患者施用有效量的能够调节靶细胞中至少一种miRNA基因产物水平的药物。在一些实施方案中,所述药物为miR-10b抑制剂和/或let-7a增强剂。
在一个实施方案中,靶基因产物的水平可间接减少。例如,在一个实施方案中,可TWIST1基因产物的水平以间接下调miR-10b。在另一个实施方案中,可降低TWIST1基因产物的活性以下调miR-10b。在本发明的实施方案中,可使用本领域已知的方法以改变TWIST1基因产物的水平或活性。
本发明还提供鉴定能够改善至少一种与NF1-相关肿瘤、白血病或其它NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中TWIST1水平的影响,其中细胞中TWIST1水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1肿瘤、白血病或其它NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物。本领域技术人员应理解的是,TWIST1的水平可以是通过本领域熟知的方法测得的基因表达水平、mRNA水平、蛋白表达水平或蛋白活性水平。
在另一个实施方案中,本发明提供治疗患有,或具有发展NF1-肿瘤、白血病和/或其它NF1-相关疾病的风险的个体的方法,包括给个体施用有效量的调节靶细胞中至少一种miRNA基因产物水平的药物。在一些实施方案中,所述药物为miR-490抑制剂和/或miR-137抑制剂。
本文中使用的“调节至少一种miRNA基因产物水平的药物”是指当药物施用于样本或个体时,至少一种miRNA的测量值是提高的或降低的。在一些实施方案中,miRNA提高的或降低的量为1倍和20倍,或≥20倍。在一些特定的实施方案中,miRNA提高或降低1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、9倍、10倍、12倍或15倍或以上。在其它的实施方案中,miRNA提高或降低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%或以上。
在一个实施方案中,能够提高或降低miRNA或其变体(包括初级miRNA或pre-miRNA)水平的“药物”可以是非核酸药物,例如抗体或其抗原结合片段(包括Fab片段、F(ab’)2片段、单链Fv片段、SMIP、亲合体、高亲和性多聚体(avimer)、纳米抗体和单域抗体),小分子,肽治疗剂,适体等。
NF1和/或NF1-肿瘤或NF1-相关疾病的改善可通过本领域已知的任何方法测定。在一个实施方案中,改善表现为患者显示出减轻的或降低的NF1或NF1-相关肿瘤的体征或症状。在另一个实施方案中,改善可通过测定各种miRNAs的量而确定。例如,当miRNA在患有NF1或NF1-相关肿瘤的患者中具有改变的表达水平时,如果miRNA表达水平返回到对照个体或未患有NF1或其它NF1-相关疾病,例如NF1-相关肿瘤的个体的水平,表明得到了改善。还可使用其它测定方法,例如肿瘤变小,神经纤维瘤变小或数量减少,防止神经纤维瘤的形成,防止或延迟认知障碍的的出现,延迟或防止NF1恶化(例如,与对照或普通患者相比,在接受治疗的患者中,NF1-相关肿瘤需要更长的时间发展或发展更缓慢)等。
在第四个方面,本发明提供治疗认知障碍的方法。本发明提供改善患有NF1、NF1-相关肿瘤、白血病和/或其它NF1-相关疾病的青少年个体的认知障碍的方法,包括给个体施用有效量的能够降低靶细胞中miR-10基因miRNA基因产物水平的药物。在一些实施方案中,降低miR-10a、miR-10b或miR-155、pre-miR-155、miR-355、pre-miR-355的水平或降低let7a的水平来治疗认知障碍是可取的。
通过改善的工作表现,较好的辨认率,改善的目标选择、计划和获得,来确定认知障碍治疗的有效性。还可以从不同的标准化测试来确定认知障碍治疗的有效性,如剑桥神经心理测试自动测试组(Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery,CANTAB),该测试对执行功能障碍敏感且能够报告多种认知损伤,包括空间短期记忆,空间工作记忆,设置转移能力,策划能力,空间识别记忆,延迟匹配样本和模式识别记忆。因此,本文所述的治疗认知障碍的疗法,应该改善个体的在这些测试或这些准则中的表现。
根据本发明的一个方面,可通过给个体施用组合物,如完全与miRNA反义的核酸或序列,当该序列由细胞表达时,引起细胞过表达所述miRNA,(例如,编码miRNA的DNA序列,使细胞中DNA起始的转录产生大量的miRNA)等,来调节个体中大量基因产物的水平。根据本发明的另一方面,可使用基因表达的改变来治疗以改变的基因表达为特征的疾病,例如癌症或其它细胞增殖失控的疾病。通过给个体施用含有本发明核酸的组合物,从而控制细胞增殖中所涉及基因的表达,以控制细胞生长。例如,可使用上述方法治疗癌症或肿瘤(例如,NF1-相关肿瘤或癌症)。例如,可向癌细胞中引入合成的核酸。然后,所述核酸与癌细胞内基因序列UTR发生作用,至少部分地抑制所述基因的表达,由此控制或消灭癌细胞。因此,本发明的一组实施方案提供,影响体外或体内细胞中miRNA水平变化的系统和方法。
E.诊断和预测骨病
患有NF1的患者可存在NF1-相关疾病或病症,带有症状包括骨病、骨骼畸形、脊柱侧弯、脊柱后凸、假关节、胫骨弯曲和具有或不具有假关节的独特的骨病变,如蝶骨发育不良或长骨皮质变薄。
本文中使用的“骨病”包括骨或骨骼异常。在一些优选的实施方案中,骨病为NF1-相关骨发育不良、长骨发育不良、胫骨发育不良、骨骼发育缺陷、脊柱侧弯、骨愈合缺陷、骨质疏少(osteopenia)、骨质疏松症(osteoporosis)、牙骨质增生、短角脊柱侧弯、蝶骨翼发育不良、骨矿物密度降低、破骨细胞增加、骨软化、身材矮小、大头畸形、假关节、营养不良和无营养不良性脊柱弯曲、营养不良性脊柱侧弯、硬膜扩张,脑膜中胚层发育异常、脊柱侧后凸,脊柱稳定减弱(例如,面、椎弓根及韧带)、脊膜膨出的形成、胸壁畸形、下漏斗胸、严重鸡胸、脊柱后凸、蝶骨翼缺陷(例如,蛛网膜囊肿、硬脑膜扩张或牛眼)、囊性病变骨、牙齿畸形、骨增生、骨侵蚀、骨变形、骨膜下血肿骨化、、增加的骨孔隙率和降低的骨钙含量。在一些优选的实施方案中,骨病为脊柱测土或脊柱畸形。在其它优选的实施方案中,骨病为脊柱后凸、关节炎或假关节。在其它优选的实施方案中,骨病为骨损伤。在其它的实施方案中,骨病为蝶骨发育不良、长骨皮质变薄、胫骨弯曲、骨发育不良(例如,腓骨和桡骨两边发育不良以及尺骨发育不良)、两胫骨发育不良和错位、腕骨和手指不规则,等。上述列举的为具体例子,但不限于此。
因此,本发明包括诊断或预测是否个体患有或具有发展骨病的风险的方法。在一些实施方案中,骨病为例如上述的NF1-相关疾病。在一些具体的实施方案中,骨病可与NF1不相关。
MiR-10b位于2号染色体(2q31)上且靠近HOXD基因家族。在2q31上的染色体断裂与骨病有关。例如,在2q31上染色体断裂的个体显示出骨异常,包括脊柱侧弯、尺骨发育不良、桡骨变短、手指畸形,腓骨和桡骨两边发育不良、尺骨两边发育不良、未骨化的腕骨和两胫骨发育不良和错位(例如,见Dlugaszewska等.Journal of Medical Genetics2006,43:111-118,通过引用并入于此)。
在一些实施方案中,本发明提供诊断或预测是否个体患有或具有发展骨病的风险的方法,包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中,测试样品中的miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体或者患有,或者具有发展骨病的风险。在一些实施方案中,miRNA基因产物为miR-155、pre-miR-155、miR-355、pre-miR355、miR-137、pre-miR-137、miR-490、pre-miR-490、miR-10b和/或pre-miR-10b。
在一些实施方案中,患有或具有发展骨病的风险的个体显示出某些miRNAs水平的变化。在一些实施方案中,患有或具有发展骨病的风险的个体具有提高的miR-10b、miR-490和/或miR-137。因此,测定个体中miR-155、pre-miR-155、miR-355、pre-miR355、miR-10b、pre-miR-10b、miR-490、pre-miR-490、miR-137和/或pre-miR-137的水平或活性,并确定一种或以上是提高的,可指示个体患有或具有发展骨病的风险。在一些实施方案中,患有或具有发展骨病的风险的个体具有降低的let-7a和/或let-7b水平。因此,测定个体中let-7a和/或let-7b水平和活性的降低,并确定其是降低的,可指示个体患有或具有发展骨病的风险。
在一些具体的实施方案中,确定miR-10b是提高的,指示个体患有或具有发展脊柱侧凸的风险。在另一个实施方案中,确定miR-10b是提高的,指示个体患有或具有发展脊柱后凸、假关节、胫骨弯曲、蝶骨发育不良或骨损伤的风险。
IV.本发明的筛选方法
在一个实施方案中,本发明提供用于检测能够调节(例如,上调或下调)样本,例如细胞(如神经细胞)中至少一种miRNA或pre-miRNA的药物的方法。所述方法涉及用能够检测至少一种miRNA或pre-miRNA分子或其活性或受miRNA分子调节的分子的药物作用于生物样本或样本(例如,细胞、细胞提取物、核酸分子)中的成分。已发现小分子能够调节miRNAs(Shan等.2008.Nature Biotechnology 26:2008),通过引用并入于此。
优选的检测miRNA或pre-miRNA水平的药物是能够特异地与miRNA或pre-miRNA杂交的核酸分子,用本领域已知的方法设计的能够扩增miRNA或pre-miRNA的一组引物。
本发明提供鉴定化合物,即能够调节至少一种miRNA分子水平的候选或测试化合物或药物(例如,拟肽类、小分子或其它药物)的方法。可用本文中所述的方法或本领域技术人员熟知的其它方法获得(例如,合成的miRNA分子、能作为增强剂上调miRNA水平的合成的DNA分子或与miRNA分子互补的可用于抑制或下调至少一种miRNA分子水平的阻断剂)或鉴定miRNAs调节剂。
在一个实施方案中,本发明涉及鉴定能够提高细胞中神经纤维瘤蛋白表达的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够提高神经纤维瘤蛋白表达的药物,其中至少一种miRNA基因产物选自下组:miR-10b和pre-miR-10b。在一个实施方案中,本发明进一步包括测定神经纤维瘤蛋白表达。在另一个实施方案中,本发明进一步包括测定改善与NF1或NF1-相关的疾病有关的至少一种体征或症状的测试化合物的能力的方法。
在另一个实施方案中,本发明涉及鉴定能够改善至少一种与NF1(或NF1-相关疾病)有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中TWIST1水平的影响,其中细胞中TWIST1水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1(或NF1-相关疾病)有关的体征或症状的药物,其中至少一种miRNA基因产物选自下组:miR-10b、pre-miR-10b、miR-355、pre-miR-355、let-7a和pre-let7a。
在一个实施方案中,测定miR-10b基因产物的水平,所述方法进一步包括测定细胞中神经纤维瘤蛋白的表达。
可使用本文中所述的方法或本领域已知的方法测定神经纤维瘤蛋白的表达。可通过检测基因的转录水平或蛋白水平测定其表达。
在一个实施方案中,测定let-7a基因产物的水平,所述方法进一步包括测定细胞中Ras信号通路。可使用本文中所述的方法或本领域技术人员已知的方法测定Ras信号通路的激活。
在一个实施方案中,本发明涉及鉴定能够改善至少一种与NF1,例如NF1肿瘤、白血病和/或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物的方法,包括:(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1,例如NF1肿瘤、白血病和/或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物,其中至少一种miRNA基因产物选自下组:miR-137、pre-miR-137、miR-355、pre-miR-355、miR-490和pre-miR-490。
用本文中所述的试验鉴定得到的化合物对治疗NF1(或NF1-相关疾病)或治疗至少一种与所述疾病有关的体征或症状,例如,本文中所述的一种或以上的体征或症状,如认知障碍、骨病、NF-相关肿瘤、色素过度沉着、神经纤维瘤、视神经胶质瘤、立奇氏结节(虹膜错构瘤结节)和蝶骨发育不良或长骨皮质变薄是有用的。
在另一方面,本发明涉及本文中所述的两种或以上测试的组合。例如,用基于细胞的测试鉴定调节药物,可在体内确定,例如在动物体内。
用本文中所述的筛选试验评价多种测试组合物。在特定的实施方案中,待测试的化合物可来自库(即,是化合物库的成员)。尽管可以使用本领域已建立的多肽库,还可以开发新技术制备其它化合物的混合物,如地西洋(Bunin等,(1992).J.Am.Chem.Soc.114:10987;DeWitt等,(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909)peptoids(Zuckermann.(1994).J.Med.Chem.37:2678)、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等,(1993).Science.261:1303-)和妥因类(hydantoins)(DeWitt等,同上)。合成104-105种小有机分子的分子库的方法如Carell等,(1994).Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059-;Carell等,(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061-所描述的。
用本领域已知的组合库的方法中的任一方法可获得本发明的化合物,包括:生物库,固相平行空间寻址(spatially addressable parallel solid phase)或液相库,需要重叠合法的合成库,“一珠一化合物”库法和用亲和层析筛选合成库的方法。所述生物库的方法限定于多肽库,而其它四种方法适用于多肽、非多肽低聚物或化合物的小分子库(Lam,K.S.(1997)Anticancer Compound Des.12:145)。还可以找到本领域用于合成分子库的其它典型的方法,例如:Erb等,(1994).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422-;Horwell等,(1996)Immunopharmacology33:68-;和Gallop等,(1994);J.Med.Chem.37:1233-。
化合物的库可存在于溶液中(例如,Houghten(1992)Biotechniques 13:412-421)或小珠上(Lam(1991)Nature 354:82-84),芯片(Fodor(1993)Nature364:555-556),细菌(Ladner USP 5,223,409),芽胞(Ladner USP′409),质粒(Cull等,(1992)Proc Natl Acad Sci USA89:1865-1869),或在噬菌体上(Scott and Smith(1990)Science249:386-390);(Devlin(1990)Science 249:404-406);(Cwirla等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382);(Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)。在另一个实施方案中,从cDNA文库中准备组合的多肽。
可筛选用于活性的典型化合物,包括但不限于,多肽、核酸、碳水化合物、小有机分子和天然产物提取物库。
候选/测试化合物包括,例如1)多肽如可溶多肽,包括具有Ig尾的融合多肽和随机多肽库的成员(见,例如Lam,K.S等,(1991)Nature354:82-84;Houghten,R等,(1991)Nature 354:84-86)以及由D-和/或L-型氨基酸组成的化学来源的组合的分子库;2)磷酸肽(例如,随机的和部分降解的、直接的磷酸肽库的成员,见,例如Songyang,Z.等,(1993)Cell 72:767-778);3)抗体(例如,多克隆、单克隆、人化的、抗独特型的、嵌合的和单链抗体以及Fab、F(ab′)2、Fab表达库片段和抗体的抗原表位结合片段);4)小的有机和无机分子(例如,从组合的和天然的产物库获得的分子);5)酶(例如,内切核糖核酸酶、水解酶、核酶、蛋白酶、合成酶、异构酶、聚合酶、激酶、磷酸酶、氧化还原酶和ATPases);以及6)miRNA分子的突变或灭活形式,例如显性负突变形式的分子。
本发明的测试化合物可使用本领域已知的组合库的方法中的任一种方法获得,包括:生物库,固相平行空间寻址或液相库,需要重叠合法的合成库,“一珠一化合物”库法和用亲和层析筛选合成库的方法。所述生物库的方法限定于多肽库,而其它四种方法适用于多肽、非多肽低聚物或化合物的小分子库(Lam,K.S.(1997)Anticancer Compound Des.12:145)。
本领域中可找到的合成分子库的方法的例子,例如DeWitt等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909;Erb等,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422;Zuckermann等,(1994)J.Med.Chem.37:2678;Cho等,(1993)Science 261:1303;Carrell等,(1994)Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.33:2059;Carell等,(1994)Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.33:2061;和Gallop等,(1994)J.Med.Chem.37:1233。
化合物的库可存在于溶液中(例如,Houghten(1992)Biotechniques 13:412-421)或小珠上(Lam(1991)Nature 354:82-84),芯片(Fodor(1993)Nature 364:555-556),细菌(Ladner USP 5,223,409),芽胞(Ladner USP′409),质粒(Cull等,(1992)Proc Natl Acad Sci USA89:1865-1869),或在噬菌体上(Scott and Smith(1990)Science249:386-390);(Devlin(1990)Science 249:404-406);(Cwirla等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382);(Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310;Ladner同上)。
在个体筛选测试中鉴定的化合物可用于调节一种或多种受本文描述的NF1基因或miRNA分子调节的生物反应的方法中。应理解的是,在将这类化合物作用于细胞之前,将其配制成药物组合物(描述同上)。
一旦采用上文中所述的多种方法中的一种,鉴定了能够直接或间接调节miRNA表达和/或活性的测试化合物,筛选得到的测试化合物(或“目标化合物”)可进一步评价其对细胞的影响,例如通过将目标化合物作用于体内(例如,给个体施用目标化合物)或体外(例如,从个体分离细胞并用目标化合物作用于分离的细胞,或者可选地,用目标化合物作用于细胞系)的细胞,测定目标化合物与适当的对照(如未处理的细胞或用对照化合物处理的细胞或不能调节生物应答的载体)相比,对细胞的影响。还可利用本领域已知的技术,采用基于药物设计的结构来鉴定目标化合物。
本发明还涉及上述检测中鉴定得到的化合物。
V.药物组合物和给药方法
A.药物组合物
在另一方面,本发明提供组合物,例如含有一种或多种核酸的,与药用载体一起配制的药物组合物,例如含有由本发明方法制备的miRNAs。本发明的药用组合物还可以在组合治疗中给药,即,与其它药物结合。例如,组合治疗可包括与至少一种其它抗癌药物结合的本发明蛋白。
本文中使用的“药用载体”包括任一或所有生理上相容的溶剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。优选地,所述载体适于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、胃肠外、经脊柱或表皮给药(例如,通过注射或输液)。取决于给药的方式,所述活性化合物,即本发明蛋白或其变体,可包被于材料中,使化合物免受酸和其它可能灭活该化合物的天然条件的作用。
本发明的药物组合物可包括一种或多种药用盐。“药用盐”是指保留了母体化合物可取的生物活性而不具有任何毒性影响的盐(见,例如Berge,S.M等.(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的离子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些衍生自无毒无机酸,如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸(phosphorous)等,以及衍生自无毒有机酸如脂肪族单一元和二元酸、苯基取代烷酸、羟基烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香磺酸等。碱加成盐包括那些衍生自碱土金属,如钠、钾、镁、钙等,以及衍生自无毒有机胺,如N,N′-二苄乙烯二胺、N-甲葡糖胺、氯、胆碱、乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
本发明的药用载体还包括药用抗氧化剂。药用抗氧化剂的例子包括:(1)水溶性抗氧化剂,如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠,亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,如抗坏血酸棕榈酸酯、二丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、丙基没食子酸、α-生育酚等;以及(3)金属螯合剂,如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药用组合物中可使用的适合的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及它们适当的混合物,植物油,如橄榄油和可注射的有机酯,如油酸乙酯。例如通过使用包被材料如卵磷脂,通过在分散情况下维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂,保持适当的流动性。
这些组合物还可包括佐剂,如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌程序和加入各种抗菌剂和抗真菌剂,例如,苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚山梨酸等以防止微生物的存在。组合物中可含有等渗剂,如糖、氯化钠等。此外,可注射药剂的延长吸收可通过加入能够延迟吸收的药物,如单硬脂酸铝和明胶。
药用载体包括无菌水溶液或分散剂以及用于临时制备无菌可注射性溶液或分散剂的无菌粉末。此类用于药用活性物质的介质和药物的使用是本领域已知的。除了任何传统的与所述活性化合物不相容的介质或药物之外,可以考虑将它们用于本发明的药物组合物。添加的活性化合物也可整合至所述组合物中。
示例性的制剂包括至少一种本发明的miRNA,可含有更低浓度的稳定(崩解)剂,除了本文中公开的方法,可用于阻止或减少核酸的聚集。因此,用于阻止聚集的传统方法可用于开发含有由本发明方法制备得到的核酸的药物组合物。例如,各种稳定或崩解化合物可包含于本发明的药物组合物中,这取决于它们的用途和它们的生物毒性。此类稳定化合物可包括,例如环糊精及其衍生物(美国专利No.5730969),烷基糖苷组合物(美国专利申请No.11/474,049),甜菜碱化合物(Xiao,Burn,Tolbert,Bioconjug Chem.2008May 23),表面活性剂(例如,Pluronic F127,Pluronic F68,吐温20(Wei等,International Journal of Pharmaceutics.2007,338(1-2):125-132))。
此外,在制剂中使用不同类的赋形剂的组合可以稳定核酸,例如(1)双糖(例如蔗糖,海藻糖)或多元醇(例如山梨醇,甘露醇)排除优选,用作稳定剂,还能够在冻干过程中作为冷冻保护剂,(2)表面活性剂(例如聚山梨酸酯80,聚山梨酸酯20),其作用是减小交界面上的交互反应,像液体/冰,液体/表面材料和/或液体/空气界面以及(3)缓冲液(例如磷酸、柠檬酸、组氨酸),有助于控制和维持制剂pH值。因此,除本发明方法外,此类双糖、多元醇、表面活性剂和缓冲液可用于进一步稳定核酸并阻止它们的聚集。
本发明的药物组合物还包括能够灭活DNA酶或RNA酶和稳定核酸组合物的螯合剂(例如,EDTA)和/或蛋白酶或其它物质。在其它实施方案中,可配制药物组合物,使其能够稳定蛋白并防止蛋白聚集,例如,通过病毒转化miRNA或miRNA编码载体。溶剂和稳定剂的描述见美国专利Nos.6271206;6271208;5547932;5981273;5854224;5705188和美国专利申请No.10/568,101,全部通过引用并入于此。
一般的治疗组合物在生产和贮存条件下,必须是无菌和稳定的。所述组合物可以配制成溶液、微乳、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。所述载体可以是含有例如,水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的适当混合物的溶剂或分散介质。例如,可通过包被卵磷脂,通过保持在分散情况下所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下,优选组合物中包括等渗剂,例如,糖,多元醇如甘露醇、山梨醇,或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中加入能够延迟吸收的药物,如单硬脂酸铝和明胶来实现。
可通过将溶于适当溶剂中的活性化合物按照需要量与上述列举成分中的一种或它们的组合相结合来制备无菌可注射溶液,如果需要,进行微滤除菌。通常地,可通过将所述活性化合物加入含有碱性分散介质和所需的来自上述列举的其它成分的无菌赋形剂中来制备分散剂。在以无菌粉末来制备无菌可注射性溶液时,优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干),即从无菌过滤后的溶液中制备活性成分和任何额外的所需成分。
与载体材料结合以制备单剂量形式的活性成分的量根据待治疗的个体和给药的特定模式而不同。与载体材料结合以制备单剂量形式的活性成分的量,通常是产生疗效的组合物的量。通常地,在活性成分和药用载体的组合中,每100%的组合中,活性成分的量为约0.01%~约99%,优选约0.1%~约70%,更优选约1%~约30%。
调整服用剂量以达到最佳理想的效果(例如,疗效)。例如,可给药单丸剂,分数次给药或根据治疗的紧急形势适当地降低或增加剂量。以剂量单位形式配制有利于胃肠外给药的组合物,以方便给药和剂量的均一。本文中使用的剂量单位形式是指物理上的适用于待治疗个体的单一剂量的离散单元;每个单位含有通过计算能够达到理想疗效的预定量的于所需药用载体结合的活性化合物。对本发明的剂量单位形式的说明直接取决于(a)活性化合物的独特性质和需要取得的特定疗效,以及(b)个体治疗中对活性化合物的敏感性,活性化合物组合的固有限度。
施用核酸的剂量范围是约0.0001~100mg/kg,更通常的是0.01~5mg/kg宿主体重。例如,剂量可以是0.3mg/kg体重,1mg/kg体重,3mg/kg体重,5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg.的范围内。典型的治疗方案需要每周给药1次,2周给药1次,3周给药1次,4周给药1次,每月给药1次,3个月给药1次或3~6个月给药1次。本发明蛋白的优选服用剂量为经静脉给药1mg/kg体重或3mg/kg体重,使用以下的剂量表施用抗体:(i)4周给药6个剂量,然后3个月给药6个剂量;(ii)每3周;(iii)3mg/kg体重,每3周1mg/kg体重。
另外,本发明核酸还可作为持续的释放剂给药,在这种情况下,无需频繁给药。剂量和频率的变化取决于对患者给药的物质的半衰期。给药剂量和频率的变化取决于治疗是预防性的或是治疗性的。在预防性的应用中,可以是较长时间内以相对不频繁的时间间隔给药相对的剂量。一些患者在余生中继续接受治疗。在治疗性的应用中,有时需要在相对短的时间间隔内给药相对高的剂量,直至疾病的恶化减弱或终止,优选直至患者所患疾病的体征或症状得到部分或完全改善。此后,患者可进行预防性给药方案。
本发明药物组合物中的活性成分的精确剂量水平可以是不同的,以实现对特定患者的理想疗效的活性成分的量,组合物和给药模式对患者而言是无毒的。选择的剂量水平取决于许多药代动力学因素,包括本发明使用的特定组合物或其酯、盐或胺类的活性,给药方式,给药时间,使用的特定组合物的排泄率,治疗持续的时间,与使用的特定化合物结合使用的其它药物,化合物和/或材料,年龄,性别,体重,身体状况,一般的健康状况和以前的治疗史以及医疗领域熟知的其它因素。
本发明核酸(例如,miRNA)的“治疗有效剂量”,优选能够使疾病症状的严重程度降低,提高无疾病症状的频率和持续时间,或防止由病痛形成的损伤或残疾。例如,在肿瘤治疗时,“治疗有效量”优选相对于未治疗的个体,抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20%,更优选至少约40%,更优选至少约60%,更优选至少约80%。可以在动物模型中评价化合物抑制肿瘤生长的能力以预测其在人肿瘤中的功效。另外,可通过熟练的医生所已知的试验检测化合物抑制,如体外抑制,来评价组合物的性质。治疗化合物的治疗有效量可减小肿瘤大小或改善个体症状。本领域技术人员能够基于以下因素确定该有效量:个体的高矮,个体症状的严重程度以及选择的特定组合物或给药方式。
如前所述,本发明的核酸可与一种或多种其它药物,例如miRNA抑制剂、miRNA增强剂、小分子、细胞毒性剂、放射性毒性剂、化学药物或免疫抑制剂共同给药,所述核酸可与所述药物联合给药或与所述药物分开给药。在后一种情况下(分开给药),所述核酸可以在其它的药物给药前、给药后或给药的同时进行给药,或可以与其它已知的疗法共同施用,例如,抗癌治疗,例如,辐射。此类药物其中包括抗肿瘤剂如阿霉素(阿霉素,adriamycin)、顺铂硫酸博莱霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲,它们本身在有效水平上对患者是有毒性的或亚毒性的。顺铂(Cisplatin)经静脉给药,每4周1次,100mg/剂量,阿霉素经静脉给药,每21天1次,60-75mg/剂量。将本发明的核酸和化学药物共同给药,形成两种抗癌药物,它们通过不同的机制发挥作用,对人肿瘤细胞产生细胞毒性。这种共同给药可以解决由抗药或肿瘤细胞抗原性的变化而导致它们对结合基团不起反应的问题。一般而言,本文中使用的术语“抗肿瘤治疗”包括上述药物,其它化学药物和在一些实施方案中,为本发明的核酸。
B.给药和递送方法
可采用一种或多种本领域已知的方法提供的给药方式施用本发明的组合物。本领域技术人员应理解的是,给药方式和/或模式根据需要达到的结果而不同。优选的结合本发明分子的给药方式包括静脉注射、肌肉注射、皮内、腹腔、皮下、脊柱或其它胃肠外给药方式,例如,通过注射或输液。本文中使用的词语“胃肠外给药”表示给药模式不是肠内和外用给药,而通常是通过注射以及包括,但不限于静脉注射、肌肉注射、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内,腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外以及胸骨内注射和输液。
另外,本发明的核酸,例如miRNA可通过非胃肠外途径给药,如外用、表皮或黏膜给药方式,例如,滴鼻、口服、阴道、直肠给药、舌下含服或外用。
所述活性化合物可与能够保护化合物免于快速释放的载体一起制备,如控释制剂,包括植入体、贴剂和微胶囊运载系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物,如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、多正酯类和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法已获得专利或通常为本领域技术人员熟知的。例如,见Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
治疗组合物可以用本领域已知的医疗装置给药。例如,在优选的实施方案中,本发明的治疗组合物可以用无针皮下注射装置给药,如美国专利Nos.5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824或4,596,556中公开的装置。本发明中有用的熟知的植入体和组件的例子包括:美国专利No.4,487,603,其公开了一种用于以可控速率分散药物的可植入式输液泵;美国专利No.4,486,194,其公开了一种经皮给药的治疗仪;美国专利No.4,447,233,其公开了一种以精确的输液率给药的药物输液泵;美国专利No.4,447,224,其公开了一种用于可持续给药的可变流动可植入式输液装置;美国专利No.4,439,196,其公开了一种具有多室的药物渗透给药系统;以及美国专利No.4,475,196,其公开了一种药物渗透给药系统。这些专利通过引用并入于此。许多其它的植入体、给药系统和组件式本领域技术人员已知的。
miRNA与靶mRNA序列的结合或其它联合可由限定的与靶mRNA序列UTR内的互补位点的碱基配对反应来实现。mRNA序列,例如,通过沃森-克里克(“W-C”)互补配对(A:U和C:G配对)(即,“完美”互补)和/或G:U配对。在一些情况下,所述配对还可以是与mRNA序列的编码部位的配对,即,与表达的mRNA部位(即,作为蛋白)配对,即,编码一种或多种表达为蛋白或多肽的氨基酸的部位,等。因此,应理解的是,本文中有关miRNAs结合至mRNAs的UTRs讨论仅通过例举的方式,在本发明的其它实施方案中,特定的miRNAs可结合至mRNA的编码部位,和/或既结合至编码部位,又结合至mRNA的UTR部位。
本发明的一些方法包括寡核苷酸结合至miRNA或mRNA。在一些实施例中,一部分寡核苷酸结合至靶mRNA的UTR内或miRNA内的互补位点。该部位与mRNA或miRNA序列完全互补,即,通过沃森-克里克互补配对,所述部位可以是5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个核苷酸长。在一些实施例中还可以是更长的部位。在其它实施例中,然而,除了沃森-克里克互补配对,miRNA或mRNA的UTR之间的互补区以及寡核苷酸部位还可包括G:U配对。
因此,无论何种特定的药用制剂,本发明涉及向细胞中递送分离的核酸,包括但不限于,与至少一部分的mRNA完全反义的寡核苷酸,含有miRNA序列的寡核苷酸(例如,具有茎-环结构或miRNA双链的寡核苷酸)和/或编码miRNA序列的表达载体。可使用任何核酸的给药和/或转染的方法或递送系统,这种给药和/或转染可发生于体外或体内。如果发生于体内,细胞可以在个体中,例如,人或非人哺乳动物,如猴、猿、牛、绵羊、山羊、野牛、羚羊、牛、马、驴、骡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛(water buffalo)、骆驼、骆马、羊驼、兔、猪、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫等。能够转录制备寡核苷酸的寡核苷酸或核苷酸序列,可单独被递送至细胞或与其它药物组合递送至细胞。递送系统的例子包括但不限于,粒子枪技术、胶体分散系统、电穿孔、载体等。在广义上,本文中使用的“递送系统”是任何能够便于将核酸(或核酸复合物)递送至细胞和/或使核酸易于被细胞吸收的载体。其它非限定的能够使核酸易于被细胞吸收的递送系统的实例包括硫酸钙或其它胞内递送的化学中间体,显微注射组合物或同源重组组合物(例如,将基因整合至细胞染色体的特定位置)。
本文中使用的术语“转染”是指将核酸导入细胞中,例如,miRNA或能够转录产生miRNA的核苷酸序列。转染可采用许多本领域技术人员已知的方法完成。此类方法包括但不限于,农杆菌介导的转化(例如,Komari等,Curr.Opin.Plant Biol.,1:161(1998)),粒子轰击介导的转化(例如,Finer等,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,240:59(1999)),原生质体电穿孔(例如,Bates,Methods Mol.Biol.,111:359(1999)),病毒感染(例如,Porta and Lomonossoff,Mol.Biotechnol.5:209(1996)),显微注射和脂质体注射。标准的分子生物技术是本领域公知的(例如,Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2.sup.nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1989))。例如,在本发明的一个实施方案中,用编码所含的寡核苷酸序列完全与miRNA反义,或所含序列能够转录产生与miRNA完全反义的寡核苷酸的基因转化哺乳动物细胞或其它脊椎动物细胞。
在一组实施方案中,可使用粒子枪技术,又称微粒或微颗粒轰击将遗传物质导入细胞中,其包括使用高速加速粒子。在该方法中,小的高密度粒子(微粒)与大的烧结粉末的微弹相结合,在粒子枪装置中被加速至高速。微粒具有充足的动力穿透细胞壁和细胞膜,并能将寡核苷酸递送至受到轰击的细胞内部。已证明,这种微粒能够进入细胞而不会导致细胞的死亡,它们能够将外源遗传物质有效地递送至完好的组织中。
在另一组实施方案中,可使用胶质分散系统便于将核酸(或核酸复合物)递送至细胞,例如,分离的与miRNA完全反义的寡核苷酸,能够转录产生所含的寡核苷酸与miRNA完全反义的序列,序列被细胞表达时能够引发细胞过表达所述miRNA的序列,等。本文中使用的“胶质分散系统”是指天然的或合成的分子,而不是细菌或病毒来源的,能够向细胞中递送并释放核酸。胶质分散系统包括但不限于,大分子复合物、小珠和基于脂类的系统,包括水包油乳状液、胶团、混合胶团和脂质体。一个胶质分散系统的例子是脂质体。脂质体是人工膜管。已表明大的单层管(“LUV”),大小为0.2-4.0μm,能够将大分子包于液体内部并将这些大分子以生物活性形式递送至细胞中(例如,Fraley等,Trends Biochem.Sci.,6:77(1981),通过引用并入于此)。
用于转染和/或胞内递送核酸的脂类制剂是市售获得的,例如,购自QIAGEN,例如EFFECTENETM(含有专门的DNA压缩增强剂的非脂质体脂类)和SUPER-FECTTM(新型作用树枝状大分子(dendrimeric)技术)以及Gibco BRL,例如LIPOFECTINTM和LIPOFECTACETM,其可形成阳离子脂类如N-[1-(2,3-二油氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(″DOTMA″)和双十八烷基二甲基溴化铵(″DDAB″)。脂质体为本领域熟知的并已在文献中广泛描述,例如Gregoriadis,G.,Trends in Biotechnology 3:235-241(1985)。
在另一组实施方案中,可使用电穿孔,将核酸(或核酸复合物)递送至细胞,例如,分离的与miRNA完全反义的寡核苷酸,能够转录产生所含的寡核苷酸与miRNA完全反义的序列,序列被细胞表达时能够引发细胞过表达所述miRNA的序列,等。本文中使用的“电穿孔”是将电作用于细胞,使核酸递送至细胞中而不杀死细胞。一般地,电穿孔包括使用一种或多种具有相对短的持续作用时间(通常小于1秒,通常为微秒或毫秒)的电压“脉冲”作用于含有细胞的基质。一般电脉冲便于将胞外核酸非致死性地递送至细胞中。确切的电穿孔方案(如脉冲的数量、脉冲持续的时间、脉冲波形,等)取决于以下因素,如细胞类型、细胞基质、细胞的数量、待递送的物质等,这些是本领域技术人员可以确定的。
在另一组实施方案中,可将核酸(例如,分离的与miRNA或mRNAUTR完全反义的寡核苷酸,能够转录产生所含的寡核苷酸与miRNA完全反义的序列,序列被细胞表达时能够引发细胞过表达所述miRNA的序列,等)至于载体中递送至细胞。广义上,“载体”是任何能够便于将核酸递送至细胞中,使所述核酸能够在细胞中加工和/或表达。相对于不用载体递送时核酸的降解程度,载体可将核酸递送至细胞以降低核酸的降解。所述载体可任意包括基因表达序列或能够增强核酸在细胞内表达的其它成分。本发明还包括用这些载体转染的细胞,包括那些前述的细胞。
一般而言,本发明中有用的载体包括但不限于,质粒、噬菌体、病毒、其它病毒或细菌来源的载体,它们通过插入或整合本发明所述的核苷酸序列(或前体核苷酸序列)进行操作。在特定实施方案中有用的病毒载体包括但不限于,来自于以下病毒的核酸序列:逆转录病毒如Moloney鼠白血病病毒、Harvey鼠肉瘤病毒、鼠乳癌病毒和劳斯肉瘤病毒;腺病毒或其它腺相关病毒;SV40-型病毒;多瘤病毒;爱泼斯坦-巴尔病毒;乳头状瘤病毒;疱疹病毒;牛痘病毒;脊髓灰质炎病毒或RNA病毒如逆转录病毒。操作者可容易地使用其它未命名的但本领域已知的载体。一些病毒载体可基于非细胞病变的真核生物病毒,其中非必须基因已被目标核苷酸序列取代。非细胞病变病毒包括逆转录病毒,其生命周期涉及基因组病毒RNA反转录为DNA,随后前病毒整合至宿主细胞DNA中。
基因改变的逆转录病毒病毒载体一般用于核酸的高效转导。制备复制缺血病毒的标准方法(包括将外源遗传物质整合至质粒,用质粒转染包装细胞系,用包装细胞系制备重组逆转录病毒,从组织培养物中收集病毒颗粒,并用病毒颗粒感染细胞)是本领域普通技术人员熟知的。标准方法的例子见于Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman Co.,New York(1990),或Murry,E.J.Ed.,Methods in Molecular Biology,Vol.7,Humana Press,Inc.,Cliffton,N.J.(1991)。
另一个用于特定用途的病毒的例子是腺相关病毒,其为双链DNA病毒。腺相关病毒可通过基因工程的方法改造成复制缺陷型且能够感染多种细胞类型和种类。腺相关病毒进一步具有的优点是,如热和脂类溶剂稳定性;在不同的细胞系中的高效转导;和/或缺少二重感染抑制,可进行多重转导。
适合用于本发明的另一个载体是质粒载体。质粒载体已在本领域中广泛报道,对本领域技术人员是熟知的。见,例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。这些质粒可含有与宿主细胞相容的启动子,且所述质粒可通过质粒内的可操作编码的基因表达多肽。一些通用质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40和pBlueScript。其它质粒是本领域技术人员熟知的。此外,质粒可以是定制的,例如,根据需要,用限制酶和链接反应,去除和加入特定的DNA片段或其它核酸。本发明还包括用于制备含有所需核苷酸序列(然后,例如其能够在细胞内被剪切或另外加工得到pre-miRNA)的核酸或核酸前体的载体。这些载体可包括编码核酸和体内表达元件的序列,进一步描述如下。在一些实施例中,体内表达元件包括至少一种启动子。
在一个实施方案中,核酸可与基因表达序列可操作地连接,指导胞内核酸的表达(例如,制备与miRNA完全反义的寡核苷酸,或能够转录产生含有与miRNA完全反义的序列的寡核苷酸的序列)。核酸序列和基因表达序列说成是“可操作地连接”,是指它们以这样的方式共价连接,即,将核酸序列的转录置于基因表达序列的作用或控制下。本文中使用的“基因表达序列”是指任何调控的核苷酸序列,如启动子序列或启动子-增强子组合,它们使可操作连接的核苷酸序列便于有效的转录和翻译。所述基因表达序列可以是,例如,真核启动子或病毒启动子,如组成型或诱导型启动子。启动子和增强子由短的DNA序列组成,与转录中涉及的细胞蛋白发生特异地相互作用,例如,Maniatis等,Science 236:1237(1987)中所述的。已从多种真核生物来源,包括植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒中分离得到启动子和增强子元件(相似的调控元件,即启动子,也在原核生物中发现)。在一些实施方案中,核酸与基因表达序列连接,是所述核酸可以在脊椎动物细胞中表达。能够使核酸在细胞中表达的序列是在特定细胞中基因选择活性的,由此使所述核酸在那些细胞中表达。基于细胞的类型,本领域普通技术人员能够容易地鉴定能够在细胞中表达核酸的启动子。
特定启动子和增强子的选择取决于所使用细胞的类型以及递送的模式。例如,从植物和动物中分离出多种启动子,它们不仅具有细胞来源的启动子的功能,还具有许多其它类型启动子的功能。还有其它可以使用的启动子(例如,病毒和Ti-质粒)。例如,这些启动子包括来自Ti-质粒的启动子,如章鱼碱合酶启动子、蓝曙红合酶启动子、甘露碱合酶启动子以及来自T-DNA中其它开放阅读框,如ORF7等的启动子。
真核细胞中典型的组成型病毒启动子包括,例如来自猴病毒、乳头状瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)和其它逆转录病毒以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其它组成型启动子是本领域普通技术人员已知的。用于本发明基因表达序列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子在诱导剂的存在下表达。例如,金属硫蛋白启动子在特定金属离子的存在下,启动转录和翻译。其它诱导型启动子是本领域普通技术人员已知的。
遗传,多种启动子和调控元件可用于本发明的表达载体。例如,在一些实施方案中,使用诱导型启动子,通过外界刺激调控核酸表达(例如,环境诱导型启动子)。在一些实施例中,核酸的表达时间和表达量是可控的。表达系统、启动子、诱导型启动子、环境诱导型启动子和增强子的非限定例子是本领域普通技术人员已知的。非限定的例子包括那些国际专利申请公开WO 00/12714、WO 00/11175、WO00/12713、WO 00/03012、WO 00/03017、WO 00/01832、WO 99/50428、WO 99/46976和美国专利Nos.6,028,250、5,959,176、5,907,086、5,898,096、5,824,857、5,744,334、5,689,044和5,612,472中描述的,各自通过完整的引用并入于此。
本文中使用的“表达元件”可以是任何调控核苷酸序列,如启动子序列或启动子-增强子组合,它们使核酸,例如分离的与miRNA完全反义的核酸,能够转录产生含有的序列miRNA完全反义的寡核苷酸的序列,易于有效地表达。所述表达元件可以是,例如哺乳动物或病毒启动子,如组成型或诱导型启动子。组成型哺乳动物启动子包括,但不限于,聚合酶启动子以及下列基因的启动子:次黄嘌呤磷酸转移酶(“HPTR”)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶和α-肌动蛋白。典型的具有真核生物组成型启动子功能的病毒启动子包括,例如,来自猴病毒、乳头状瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)和其它逆转录病毒以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其它组成型启动子是本领域普通技术人员已知的。用于本发明基因表达序列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子在诱导剂的存在下表达。例如,金属硫蛋白启动子在特定金属离子的存在下,启动转录和翻译。其它诱导型启动子是本领域普通技术人员已知的。根据需要,体内表达元件可包括,涉及转录起始的5′非转录和5′非翻译序列,且可任选包括增强子序列或上游激活序列。
使用任何基因转移技术,如上述技术,带有核酸的表达载体可被转化至细胞中,实现临时表达或长期表达。只要能够进行转化并在细胞中表达核酸前体,可使用任何适合的表达载体。在一个实施方案中,用pET载体(Novagen,Madison,Wis.)或pBI载体(Clontech,Palo Alto,Calif.)作为表达载体。在一些实施方案中,用进一步编码绿色荧光蛋白(″GFP″)的表达载体,能够简单筛选转染的细胞并监测表达水平。此类载体的非限定离子包括Clontech公司的″彩色荧光蛋白载体(Living Colors Vectors)″pEYFP和pEYFP-C1。
在一些实施例中,可将选择性标记加入待转化至细胞的核酸中。本文中使用的术语“选择性标记”是指使用编码酶活性的或其它可检测活性(例如,发光或荧光)的基因,这些选择性标记使细胞能够在缺少必需营养的培养基上生长。选择性标记还可以使表达该选择性标记细胞对抗生素或药物产生抗性。在一些实施例中,选择性标记可以是“显性的”;显性选择性标记编码能够在任何细胞或细胞系中检测到的酶活性或其它活性(例如,发光或荧光)。
任选地,除了体细胞,生殖细胞可用于本文中所述的方法。术语“生殖细胞”是指生物体中能够追溯它们最终的细胞系或者是雄性或者是雌性的生殖细胞。其它细胞,“体细胞”是指不直接产生配子或生殖细胞的细胞。然而,在一些实施方案中可使用体细胞。
因此,根据一组实施方案,可利用基因表达的改变,在体内或体外细胞中系统地抑制或表达基因,例如,通过施用组合物的方法,所述组合物如分离的含有的序列与细胞的miRNA完全反义的寡核苷酸。因此,在一个实施例中,通过加入分离的含有的序列与细胞的miRNA完全反义的寡核苷酸,可使正常细胞变为癌性细胞,然后通过不加入寡核苷酸,即停止施用寡核苷酸,使细胞变为非癌性细胞。癌性细胞/非癌性细胞的严谨调控对于构建疾病功能和表现的模型是非常有用的。
本发明通过下面的实施例进行进一步的描述,它们不应成为进一步的限制。贯穿本申请上下文中所有的数据和参考文献、专利和公开的专利申请以及附图,通过完整的引用并入于此。
实施例
实施例介绍
实施例1:
用生物信息软件系统TargetScan(targetscan.org/)分析NF1基因的3’UTR。推测以下miRNAs可能靶向作用于NF13’UTR:miRNAs 107、137、30、490、10、128。然后用实时定量聚合酶链式反应检测两对细胞系中这些miRNAs的表达水平。第一对细胞系是人MPNST:STS26T vs.ST8814和T265。STS26T来自非-NF1-相关的MPNST且表达正常的NF1蛋白并保留了正常的Ras信号。ST8814和T265来自NF1-相关的MPNST且表达非常低水平的NF1蛋白并显示出增强的Ras信号。发现与非NF1-雪旺氏细胞瘤的细胞系(STS26T)相比,在NF1雪旺氏细胞瘤的细胞系(ST8814和T265)(图1)中,miR-10b、137、490是过表达的。发现MiR-10b的水平高出20-30倍。发现MiR-137的水平高出5倍。发现MiR-490的水平高出约20-70倍。还发现在NF1雪旺氏细胞瘤的细胞系中,let-7a的水平减半(图1)。然而,miR-10a、miR-30b和107在NF1雪旺氏细胞瘤的细胞系和非NF1-雪旺氏细胞瘤的细胞系中的表达是近似的。
第二对细胞系是小鼠胚胎干(ES)细胞:Nf1野生型(Nf1+/+)ES细胞vs.Nf1敲除(Nf1-/-)ES细胞。Nf1+/+ES细胞表达正常的NF1蛋白且显示出正常的Ras信号。Nf1-/-ES细胞表达非常少量的NF1蛋白且显示出增强的Ras信号。与NF1MPNST细胞系相似,Nf1-/-ES细胞显示出miR-10b的高表达,let-7a的低表达以及miR-30b表达无变化(图2)。还发现在Nf1-/-ES细胞中miR-10a高表达,miR-490表达无变化(图2)。上述发现概括于下表1中。
表1
±无变化↑↑↑升高↓降低
由于在人NF1MPNST细胞系以及小鼠Nf1-/-ES细胞(两个细胞系均为NF1功能缺失)中,miR-10b和let-7a具有近似的结果,可以得出结论,miR-10b和let-7a是NF1特异的miRNAs。还可以得出结论,miR-137和miR-490是NF1肿瘤特异的miRNAs,miR-10a是ES细胞特异的miRNAs。这些miRNAs在NF13’UTR中的靶位点列于图3中。
实施例2-7
实施例2-7的材料和方法
本研究中所有人组织的获得是根据供体审查机构(Institutional Review Boards of the donor institutions)和缅因州人基因和健康研究院(Maine Institute for Human Genetics&Health)批准的人个体协议(human subject protocols)。获得了患者或患者监护人的同意。标准的人雪旺氏细胞和神经纤维瘤人雪旺氏细胞来自佛罗里达大学和俄亥俄州立大学。人神经纤维瘤和MPNST肿瘤组织来自加拿大病毒肿瘤库(Canadian Virtual Tumor Bank)。
细胞培养物:
初级雪旺氏细胞:标准的人雪旺氏细胞分离自成年人的坐骨神经,来自俄亥俄州的生命线(LifeLine of Ohio)。NF1雪旺氏细胞分离自采用前述方法修饰的NF1神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤(Jacob等,Otol Neurotol 2008.29:58-68)。在随后的传代中,用温和的胰蛋白酶消化并摇动,通过差异挤离(differential detachment)法富集雪旺氏细胞。在所有的测试中,用培养物传代3-4次。在用培养皿培养细胞前,用层粘连蛋白(在PBS中浓度为10μg/ml)在37℃下涂布培养皿1-2hr。涂布的培养皿用PBS洗3次,去除能够干扰细胞分裂的包被成分。然后将细胞置于含有DMEM、10%FBS、盘尼西林(50IU/ml),、链霉素(50μg/ml)和神经调节蛋白(50ng/ml)的雪旺氏细胞培养基中培养。每3天补充新鲜的培养液,每次加入神经调节蛋白。
MPNST细胞系:人NF1相关MPNST细胞系ST8814和T265P21、非-NF1相关MPNST细胞系STS26T(由Nancy Ratner博士惠赠,Cincinnati Children′s Hospital Medical Center,辛辛那提,俄亥俄州)保存于添加有10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、盘尼西林(50IU/ml)和链霉素(50μg/ml)的DMEM培养基中。
miRNA表达的分析:
将细胞培养于6孔或12孔板上24h,然后在含0.2%FBS的培养液中血清饥饿24h。在Trizol中用组织匀浆器(BioSpec Products Inc.,Bartlesville,OK)匀浆冷冻的神经纤维瘤和MPNST肿瘤组织。用Rneasy miRNA试剂盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA),从细胞或组织中提取RNA。用核酸蛋白测定仪(Biophotometer spectrophotometer)(Eppendorf,汉堡,德国)来定量测定RNA浓度。
miRNA微阵列:标记从ST8814和STS262T中获得的总RNA20μg,并在miRNA微阵列(LC Sciences,休斯顿,德克萨斯州)上进行杂交。设计能够检测软件Sanger miRBase Release 11.0中包含的833个miRNAs的miRNA转录物的芯片。原始信号强度表示与探针杂交为细胞系的平均值。每个芯片中包含多个对照探针。
实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR):根据生产商(Applied Biosystems,Foster City,CA)提供的方法,用Taqman微小RNA检测法分两步进行反转录(RT)和实时定量PCR。获取定量miRNA表达数据并用ABI Prism 7500HT序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行分析。各RNA样本一式三份,进行分析。用U6作为内参。用Livak和Schmittgen(Livak等,Methods 2001.25:402-8)描述的2-ΔΔCT法分析数据。
NF13’UTR报告试验:
从人基因组DNA中扩增NF1基因的3’UTR,通过DNA测序确定其序列。将NF13’UTR克隆至pMIR-REPORTTM miRNA报告载体(Ambion,Austin,TX)的3’UTR上。带有NF13’UTR的pMIR报告载体或pMIR报告载体稳定转染至HEK293细胞中。然后用空载体(MDH1-PGK-GFP)或miR-10b表达载体(MDH1-PGK-GFP/microRNA-10b,Ad dgene plasmid#16070)(Ma等,Nature 2007.449:682-8)与pMIR-REPORTTM β-半乳糖苷酶报告对照载体(Ambion,Austin,TX)一起,瞬间共转染稳定转染的细胞。转染30h后收集细胞,用双荧光酶检测药物盒(Promega,Madison,WI)测定β-半乳糖苷酶转化为荧光酶的比值。
HEK 293细胞中miR-10b过表达:
将MDH1-PGK-GFP/微小RNA-10b(载体/miR-10b)或MDH1-PGK-GFP vector(载体)转染至HEK 293T中。用荧光显微技术检测转染率。用qRT-PCR确定miR-10b表达水平。转染48h后,用血清饥饿细胞24h,收集蛋白和RNA进行蛋白质印迹和qRT-PCR分析。
蛋白质印迹:
将细胞培养于6孔或12孔板上。达到70-80%融合后,在含0.2%FBS的培养液中血清饥饿细胞24h,使血清中存在的生长因子的影响降至最低。在RIPA缓冲液中裂解饥饿的细胞。用BCA蛋白检测药物盒测定蛋白量(Pierce,Rockford,IL,USA)。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),每道上样20μg蛋白,进行分离。分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上。将印迹膜与不同的初级抗体在4℃下孵育过夜:抗p44/42MAP激酶(Cell Signaling,#9107,1∶1000),抗磷-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling,#9106,1∶1000),抗磷-S6核糖体蛋白(ser235/236)(Cell Signaling,#4858,1∶1000),抗神经纤维瘤蛋白(Santa Cruz,sc-67,1∶500)和抗β-肌动蛋白(Sigma,A5441,1∶1000)。用PBS洗3次后,将印迹膜与辣根过氧化物酶标记的二抗:抗羊或鼠IgG(Chemicon,Temecula,CA),稀释1∶10,000,在室温下孵育1h。用ECL加化学发光底物(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)使信号可视化。
细胞增殖:
MTT检测:将ST8814细胞置于96孔板上,密度为1000/孔,细胞可粘附于平板上,过夜培养。用脂质体转染(Lipofectin)法(Invitrogen)将各种miRNA抑制剂或前体或对照转染至细胞中。用血清饥饿24h后,在指定的时间点,用100μl含0.5mg/ml MTT的新鲜培养液替换培养液。孵育4h后,去掉培养液,将紫蓝色沉淀溶于150μl DMSO中。用WELLSCAN MK3ELIASA(Labsystems,Dragon,Finland)测定每孔中的相对光学密度(OD)。
菌落的形成:将miR-10b抑制剂或阴性对照转染的ST8814细胞置于6孔板上培养14天。转染的细胞用PBS洗3次,并用10%福尔马林固定20分钟。干燥后,将细胞用0.1%结晶紫溶液染色30分钟,用蒸馏水洗并干燥。用显微技术法统计菌落数。
细胞迁移和侵入:
用各种miRNA抑制剂、前体或对照转染ST8814细胞。培养48h后,转染的细胞用血清饥饿24h,然后用5μM细胞示踪绿(cell tracker green)(Invitrogen)对细胞脉冲30min。标记的细胞用胰蛋白酶消化,重置于不含生长因子的0.2%FBS培养液中,用于迁移试验的细胞密度为在半透膜(trans-well insert,孔直径3μm,BD Falcon)中,每孔密度为25,000个细胞,或在基质胶包被的、生长因子降低的平板中每孔50,000个细胞,用于侵入试验的侵入室(孔直径8μm,BD Biosciences)。培养6h后,进行迁移试验,或培养22h后,进行侵入试验,用PBS洗细胞3次并用4%多聚甲醛固定1h。刮掉每个室(insert)中顶部边缘的细胞,在10X放大的Zeiss Axiovert 200M显微镜中可观察到那些迁移至膜基部边缘的细胞。用Metamorph分析软件以自动模式分析细胞数量。
统计学分析:
用JMP 8.0软件(SAS Inc.,Cary,NC)进行分析。用非配对t-试验比较不同时间点的两组(图4和图8B、D)。用ANOVA比较多个组,如果检测到显著差异,接着是进行配对比较;用Tukey-Kramer试验比较所有组(图5、6)以及Tukey-Kramer试验用于比较对照组(图9C和D)。为确定基因操作(荧光酶和荧光酶/NF13’UTR)和治疗(对照或miR-10b)的影响,采用2种ANOVA和配对比较(图7B)。在双尾检验中,P<0.05表示具有显著差异。数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。
实施例2NF1MPNST细胞中的miRNA分布
首先通过微阵列测定ST8814细胞中的miRNA分布,ST8814细胞系来自于不表达可检测的神经纤维瘤蛋白的人NF1MPNST细胞(Fletcher等,l.N Engl J Med 1991.324:436-42;Barkan等,Clin Cancer Res 2006.12:5533-42),以及其在STS262T细胞中的分布,STS262T细胞来自于偶然表达大量神经纤维瘤蛋白的人非-NF1MPNST细胞(Barkan等,Clin Cancer Res 2006.12:5533-42)。在ST8814细胞中,70多种miRNAs的表达水平显著高于STS262T细胞,而40种miRNAs的表达水平显著低于STS262T细胞(将下表2A和2B)。致癌的miRNAs,miR-155、miR-10b和miR-335(Ma等,Nature 2007.449:682-8;Garzon 等,Proc Natl Acad Sci U S A 2008.105:3945-50;Eis等,Proc Natl Acad Sci U S A 2005.102:3627-32;Tavazoie等,Nature 2008.451:147-52)在ST8814细胞(密度大于1800)中表达水平非常高。let-7家族的成员,let-7a、7b、c、d、e和f(Johnson等,Cell 2005,120-635-47)在ST8814细胞中的表达显著低于在STS262T细胞中的。
表2A:miRNAs在ST8814细胞中的高表达
表2B:miRNAs在ST8814细胞中的低表达
表2A和2B:miRNA在NF1MPNST细胞中的分布。标记来自于ST8814和STS262T细胞的总RNA,在miRNA微阵列上进行杂交(LC Sciences,Houston,TX)(n=3)。列举了所有p值<0.01的差异表达的miRNAs。信号表示3个重复样本的平均信号值。根据差异率,将成熟的miRNAs单独分类。比值以log2值为标准,可简单快速地评价差异的方向以及差异的大小。log2值为正表示上调,log2值为负表示下调。
qRT-PCR的结果与微阵列数据是一致的。miR-155在ST8814细胞中的表达比在ST262T细胞中的表达高>3330倍,miR-335高~56倍,miR-10b高~20倍,而let-7a低~50%,let-7b低~90%(图4)。所有这些差异是统计学上显著的(P<0.05)。为了进一步地分析,我们关注五种miRNAs(miR-155、miR-10b、miR-335、let-7a和let-7b),它们在NF1和非-NF1MPNST细胞中的表达水平显示出较大的差异。。
实施例3miRNA在人NF1肿瘤组织中的分布
为进一步研究miRNA在人MF1肿瘤组织中的分布,从冷冻的人NF1MPNST肿瘤组织(n=8,6名男性,2名女性,平均年龄:35)和非-NF1MPNST肿瘤组织(n=4,2名男性,2名女性,平均年龄:49)以及良性NF1神经纤维瘤组织(n=13,9名男性,4名女性,平均年龄:37)中分离总RNA。通过qRT-PCR测定所选择的miRNA的表达。神经纤维瘤是由雪旺氏细胞、成纤维细胞、肥大细胞和其它细胞类型组成的杂合良性肿瘤,由于大多数NF1MPNST肿瘤是由丛状神经纤维瘤转化而来,因此用良性神经纤维瘤作为对照。miR-10b仅在NF1MPNST组织中显著高地表达,而let-7a和let-7b在NF1MPNST和非-NF1MPNST组织中显著低地表达(图5)。与非-NF1MPNST组织相比,miR-10b在NF1MPNST组织中显著高地表达,miR-155和miR-335在NF1MPNST组织中表达较高,然而,由于在非-NF1MPNST组织中表达和样本大小的不同,没有达到统计学上的显著差异(图5)。
实施例4miRNA在初级人NF1雪旺氏细胞中的分布
雪旺氏细胞作为NF1神经纤维瘤和MPNST中的初级转化细胞。。为进一步研究NF1肿瘤发生中的miRNAs,从正常的成年人的坐骨神经、NF1表皮和丛状神经纤维瘤中分离初级雪旺氏细胞,用于和两个NF1MPNST细胞系,ST8814和T265p21相比较。通过qRT-PCR测定miRNA的表达。miR-10b是唯一的在来自于人NF1表皮神经纤维瘤的初级雪旺氏细胞中的表达高于正常的雪旺氏细胞的miRNA(图6,P<0.05)。miR-10b在NF1丛状雪旺氏细胞中的表达水平较高,但没有达到统计学上的显著差异(图6,P=0.07),这可能是由于样本量较小。结果是(Ofinterest),miR-10b在NF1MPNST ST8814和T265p21细胞中的最高表达水平是在普通雪旺氏细胞中的~10-20倍(图6,P<0.05)。miR-155和miR-335在NF1MPNST细胞中的表达水平比在普通雪旺氏细胞中的表达水平显著地高,但在来自于NF1表皮或NF1丛状神经纤维瘤的雪旺氏细胞中表达量不高(图6,P<0.01)。相比之下,let-7a和let-7b在NF1MPNST细胞中的表达水平显著地低(图6,P<0.05)。总的来说,我们的结果表明,与正常雪旺氏细胞或来自于良性神经纤维瘤的NF1雪旺氏细胞相比,NF1MPNST细胞具有显著高的miR-10b、miR-155、miR-335表达水平以及显著低的let-7a和let-7b表达水平。
实施例5miR-10b直接靶向作用于NF1mRNA的3’UTR并抑制神经纤维瘤蛋白的表达
用TargetScan(targetscan.org/)分析,推测miRNA-10b而不是miR-155、miR-335或let-7a/7b,能够潜在地靶向作用于NF1mRNA的3’UTR(图7A)。miRNA-10b作用的靶位点的种子序列在不同种类来源的NF1mRNAs中高度保守(图7A),表明miRNA-10b在NF1表达中的调节作用。为检测该可能性,我们克隆了NF13’UTR并将其置于荧光酶报告基因的3’UTR中。用miRNA-10b表达载体或对照载体共转染HEK293细胞,表明荧光酶活性在共转染miRNA-10b且报告结构中含有NF13’UTR的细胞中显著降低,确定了miRNA-10b直接靶向作用于NF1mRNA的3’UTR(图7B,P<0.05)。
为进一步研究miRNA-10b和NF1之间的关系,我们在HEK293细胞中过表达miRNA-10b。用绿色荧光蛋白标记哺乳动物表达载体MDH1-PGK-GFP/微小RNA-10b和对照载体。通过荧光显微镜监测转染效率。还通过qRT-PCR(数据未显示)确定miRNA-10b的表达水平。当用对照载体转染时,HEK293细胞为NF1+/+且表达神经纤维瘤蛋白。过表达miRNA-10b导致表型与NF1-缺陷细胞相似,具有非常低的神经纤维瘤蛋白水平和高的磷酸化的ERK水平(RAS信号的一个指数)(图7C、D)。这些结果表明miRNA-10b直接靶向作用于NF1mRNA且抑制神经纤维瘤蛋白表达。
实施例6miRNA-10b反义抑制修正了NF1MPNST细胞异常的细胞行为
由于NF1MPNST细胞表达高水平的miR-10b,我们想知道是否抑制miR-10b能够恢复NF1MPNST细胞异常的细胞行为。用miR-10b反义抑制剂或阴性对照(作为miR-10b反义抑制剂的相似的反义序列,但不抑制已知的miRNAs)转染ST8814细胞。用蛋白质印迹法分别评价磷酸化的ERK和S6(MAPK和mTOR信号通路的指示剂,二者都下调RAS信号)。与对照相比,抑制miR-10b的结果是,显著降低了细胞增殖、迁移和侵入(图8B、C、D)。相比之下,在非-NF1MPNST细胞(STS262T)中抑制miR-10b对细胞的生长没有影响(数据未显示)。总之,这些结果表明miR-10b在NF1MPNST的恶化中起重要作用。
实施例7恢复mi-155、mi-335以及let-7a和let-7b对NF1MPNST细胞的影响
为确定上调mi-155和mi-335以及下调let-7家族是否对NF1MPNST生长起到任何作用,我们用mi-155和mi-335的反义抑制剂,或let-7a的增强剂恢复这些miRNA在ST8814细胞中的功能。与对照相比,用let-7a增强剂转染的ST8814细胞在血清刺激后具有低的磷酸化ERK(图9A),而mi-155和mi-335的反义抑制剂不影响磷酸化ERK的水平(数据未显示)。虽然恢复这些miRNAs不改变ST8814细胞的增殖或迁移(图9B、C),抑制mi-335或增强let-7a导致细胞侵入的显著下降(图9D)。这些结果表明mi-335和let-7a在MPNST恶化中可能发挥作用。
相同的方案
本领域技术人员应理解或能够确定,在常规实验方法内的诸多选择,将等同于本发明具体实施方案中的描述。这些相同的方案包括在以下权利要求的范围内。
Claims (67)
1.诊断个体是否具有发展1型神经纤维瘤病(NF1)的风险的方法,该方法包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中测试样品中的至少一种miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体具有发展NF1的风险,其中所述的至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-155、pre-miR-155、miR-335、pre-miR355、let-7a、pre-let7a、let-7b和pre-let7b。
2.如权利要求1所述的方法,其中miR-10b基因产物的水平显著高于在对照样品中的水平。
3.如权利要求1所述的方法,其中let-7a基因产物的水平显著低于在对照样品中的水平。
4.如权利要求1所述的方法,其中包括测定miR-10b基因产物,且所述方法进一步包括测定神经纤维瘤蛋白的表达。
5.如权利要求1所述的方法,其中包括测定let-7a基因产物,且所述方法进一步包括测定Ras信号通路的激活水平。
6.诊断个体是否患有或具有发展NF1-肿瘤、白血病或其它NF1-相关疾病的风险的方法,该方法包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中测试样品中的miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体或者患有或者具有发展NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的风险,其中所述的至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-155、pre-miR-155、miR-335、pre-miR355、let-7a、pre-let7a、let-7b和pre-let7b。
7.提高靶细胞中神经纤维瘤蛋白表达的方法,该方法包括用有效量的能够下调细胞中miR-10miRNA水平的miR-10b抑制剂作用于细胞,使靶细胞中神经纤维瘤蛋白的表达提高。
8.降低靶细胞中Ras信号通路活性的方法,包括用有效量的能够上调细胞中let-7a水平的let-7a增强剂作用于细胞,使靶细胞中Ras信号通路的活性下降。
9.治疗患有NF1和NF1-相关疾病的个体的方法,该方法包括将有效量的能够调节靶细胞中至少一种miRNA基因产物水平的药物施用于个体,其中所述的至少一种药物选自miR-10b抑制剂和let-7a增强剂。
10.如权利要求7或9所述的方法,其中miR-10b抑制剂是含有与miR-10b互补的核苷酸序列的miR-10b阻断剂(antigomir)。
11.如权利要求10所述的方法,其中miR-10b阻断剂含有核苷酸序列5’-CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA-3’。
12.如权利要求10所述的方法,其中阻断剂包括至少一个稳定修饰。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述的至少一个稳定突变包括硫代磷酸酯主链。
14.如权利要求12所述的方法,其中所述的至少一个稳定修饰包括至少一个带有2’-糖修饰的核苷酸。
15.如权利要求7或9所述的方法,其中miR-10b抑制剂通过抑制TWIST1间接地抑制miR-10b。
16.如权利要求8或9所述的方法,其中let-7a增强剂包括带有至少一个稳定修饰的合成的miRNA。
17.如权利要求16所述的方法,其中合成的miRNA包括核苷酸序列5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’或5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’。
18.如权利要求16所述的方法,其中所述的至少一个稳定修饰包括硫代磷酸酯主链。
19.如权利要求16所述的方法,其中所述的至少一个稳定修饰包括至少一个带有2’-糖修饰的核苷酸。
20.治疗患有或具有发展NF1-肿瘤、白血病或其它NF1-相关疾病的风险的个体的方法,该方法包括将有效量的能够调节靶细胞中至少一种miRNA基因产物水平的药物施用于个体,其中所述的至少一种药物选自miR-10b抑制剂和miR-335抑制剂。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述药物为含有的核苷酸序列与miR-335或miR-335*互补的miR-335阻断剂。
22.如权利要求21所述的方法,其中RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUGA-3’。
23.如权利要求21所述的方法,其中RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC-3’。
24.如权利要求20所述的方法,其中所述药物为含有的核苷酸序列与miR-10b互补的miR-10b阻断剂。
25.如权利要求24所述的方法,其中RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA-3’。
26.如权利要求20所述的方法,进一步包括施用其它针对NF1-相关的肿瘤或NF1-相关的疾病的药物。
27.改善患有NF1、NF1-肿瘤、白血病或NF1-相关疾病的青少年患者的认知障碍的方法,包括将有效量的能够降低靶细胞中miR-10bmiRNA基因产物水平的药物施用于患者。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述药物为含有与miR-10b互补的核苷酸序列的miR-10阻断剂。
29.如权利要求28所述的方法,其中阻断剂包括核苷酸序列5’-CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA-3’。
30.如权利要求10所述的方法,其中阻断剂为19~24个核苷酸长。
31.如权利要求21或24任一项所述的方法,其中阻断剂为19~24个核苷酸长。
32.如权利要求28所述的方法,其中阻断剂为19~24个核苷酸长。
33.如权利要求10所述的方法,其中阻断剂全长与miRNA有至少95%互补,其中阻断剂5’端的8个核苷酸与miRNA的相应核苷酸为100%互补。
34.如权利要求21或24任一项所述的方法,其中阻断剂全长与miRNA有至少95%互补,其中阻断剂5’端的8个核苷酸与miRNA的相应核苷酸为100%互补。
35.如权利要求28所述的方法,其中阻断剂全长与miRNA有至少95%互补,其中阻断剂5’端的8个核苷酸与miRNA的相应核苷酸为100%互补。
36.如权利要求10所述的方法,其中阻断剂含有胆固醇修饰。
37.如权利要求21或24任一项所述的方法,其中阻断剂含有胆固醇修饰。
38.如权利要求28所述的方法,其中阻断剂含有胆固醇修饰。
39.如权利要求7、8、9、20或27任一项所述的方法,其中靶细胞为雪旺氏细胞(Schwann cell)、上皮细胞、神经细胞、免疫细胞或骨细胞。
40.如权利要求39所述的方法,其中靶细胞为神经细胞。
41.如权利要求9、20或27任一项所述的方法,其中药物直接施于中枢神经系统。
42.鉴定能够改善至少一种与NF1有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1有关的体征或症状的药物,其中所述的至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-355、pre-miR-355、let-7a和pre-let7a。
43.如权利要求42所述的方法,其中测定miR-10b基因产物的水平且该方法进一步包括测定细胞中神经纤维瘤蛋白的表达。
44.如权利要求42所述的方法,其中测定let-7a基因产物的水平且该方法进一步包括测定细胞中Ras信号通路。
45.鉴定能够改善至少一种与NF1-相关肿瘤、白血病或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1肿瘤、白血病或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物,其中所述的至少一种miRNA基因产物选自miR-10b和pre-miR-10b。
46.鉴定能够提高细胞中神经纤维瘤蛋白表达的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中至少一种miRNA基因产物水平的影响,其中细胞中至少一种miRNA基因产物水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够提高神经纤维瘤蛋白表达的药物,其中所述的至少一种miRNA基因产物选自miR-10b和pre-miR-10b。
47.诊断个体是否患有或具有发展为骨病的风险的方法,包括(i)测定来自于个体的测试样品中的至少一种miRNA基因产物的水平,其中,测试样品中的miRNA基因产物水平相对于对照样品中相应miRNA基因产物水平的改变指示个体或者患有,或者具有发展骨病的风险,其中所述的至少一种miRNA基因产物选自miR-10b、pre-miR-10b、miR-155、pre-miR-155、miR-335、pre-miR355、let-7a、pre-let7a、let-7b和pre-let7b。
48.如权利要求47所述的方法,其中骨病为NF1-相关的骨发育不良、胫骨发育不良、骨骼生长缺陷、脊柱侧弯、骨愈合缺陷(bone healing defects)、骨质减少、骨质疏松症或牙骨质过度生长。
49.如权利要求47所述的方法,其中miRNA基因产物为miR-10b或pre-miR-10b。
50.如权利要求47所述的方法,其中miRNA基因产物为miR-335或pre-miR-355。
51.如权利要求49或50所述的方法,其中miRNA基因产物的水平是提高的。
52.治疗患有或具有发展为骨病的风险的个体的方法,包括对个体施用有效量的能够调节靶细胞中至少一种miRNA基因产物水平的药物,其中所述的至少一种药物选自miR-10b抑制剂和miR-335抑制剂。
53.如权利要求52所述的方法,其中药物为含有与miR-335或miR-335*互补的核苷酸序列的miR-335阻断剂。
54.如权利要求53所述的方法,其中RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUGA-3’。
55.如权利要求53所述的方法,其中RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC-3’。
56.如权利要求52所述的方法,其中药物为含有与miR-10b互补的核苷酸序列的miR-10b阻断剂。
57.如权利要求56所述的方法,其中RNA阻断剂包括核苷酸序列5’-CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA-3’。
58.如权利要求53或56任一项所述的方法,其中阻断剂为19~24个核苷酸长。
59.如权利要求53或56任一项所述的方法,其中阻断剂全长与miRNA有至少95%互补,其中阻断剂5’端的8个核苷酸与miRNA的相应核苷酸为100%互补。
60.如权利要求53或56任一项所述的方法,其中阻断剂含有胆固醇修饰。
61.如权利要求21、24、28、53或56任一项所述的方法,其中阻断剂包括至少一个稳定修饰。
62.如权利要求61所述的方法,其中所述的至少一个稳定修饰包括硫代磷酸酯主链。
63.如权利要求61所述的方法,其中所述的至少一个稳定修饰包括至少一个带有2’-糖修饰的核苷酸。
64.鉴定能够改善至少一种与NF1肿瘤、白血病或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物的方法,包括:(i)用测试药物作用于细胞,(ii)测定测试药物对细胞中TWIST1水平的影响,其中细胞中TWIST1水平相对于适当对照的改变表明该测试药物是一种能够改善至少一种与NF1肿瘤、白血病或NF1-相关疾病有关的体征或症状的药物。
65.如权利要求64所述的方法,其中TWIST1的水平为mRNA的水平。
66.如权利要求64所述的方法,其中TWIST1的水平为蛋白的水平。
67.如权利要求64所述的方法,其中TWIST1的水平为蛋白活性的水平。
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