CN104745697A - 检测nf1基因第31-34号全外显子的方法和引物 - Google Patents

检测nf1基因第31-34号全外显子的方法和引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测NF1基因第31-34号全外显子的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括扩增覆盖NF1基因第31-34号全外显子序列的3对正、反向引物和3对测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述3对测序引物可用于快速检测幼年型粒单核细胞白血病患者的NF1基因第31-34号全外显子序列的突变情况。

Description

检测NF1基因第31-34号全外显子的方法和引物
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测NF1基因第31-34号全外显子突变的引物和方法
背景技术
幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)是一种少见的儿童慢性髓系白血病，恶性程度高，兼有骨髓增生异常综合征(myelodysplastic，MDS)和骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disease，MPD)的特征。目前发现RAS信号通路中RAS，PTPN11，NF1，CBL 4种基因的突变在JMML患儿中占有极高的比例，治疗难度大，靶向治疗是目前研究的方向。
NF1基因定位于染色体17q11.2,跨距350kb长的基因组DNA,包含60个外显子,可转录成11～13kb的mRNA,其蛋白产物为神经纤维瘤素。其中8 457bp的读码框架，编码包含2818个氨基酸的神经纤维蛋白,相对分子质量为327×103。NF1基因这样大的长度与其很高的自发突变率及临床表现的复杂性相一致。NF1基因突变类型呈多样化,包括碱基置换、插入突变、缺失突变、重复突变、无义突变、错义突变、框架漂移等均有报道,大部分突变产生截短蛋白,仅有10％与氨基酸替代有关，国外研究结果显示,NF1基因并不存在突变热点。
Ι型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)NF1是一种常染色体遗传病，临床特点为:多系统、多器官损伤，主要特征为皮肤牛奶咖啡斑和多发性皮肤软组织纤维瘤，由NF1基因突变引起。NF1患儿具有极高的并发髓系肿瘤风险，尤其是，JMML，并且相对未发生NF1者，JMML患儿年龄偏大，有文献报道，诊断JMML者，约11％伴有NF1，无NF1者约10％～15％存在NF1基因缺失。近来Steinemann等研究发现，合并NF1的15例JMML患儿2/3存在杂合子NF1基因缺失，且绝大多数该基因染色体存在单亲二倍体，少数为染色体中间缺失，剩余1/3患儿存在复合杂合子突变，进一步证实了NF1功能缺失在NF1发展为JMML中起重要作用。
幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)是一种少见的儿童慢性髓系白血病，占儿童期白血病的1％～2％。国外文献报道JMML的年发病率为(0.12～0.30)/(1×104)，美国每年新发JMML为25～50例，我国迄今尚无关于JMML发病率研究的确切流行病学资料。目前发现RAS信号通路中RAS，PTPN11，NF1，CBL4种基因的突变在JMML患儿中占有极高的比例，治疗难度大，靶向治疗是目前研究的方向。RAS、PTPN11、NF1及CBL4种基因突变约占JMML患儿80％～85％，其中PTPN11约占35％，NF约占11％，KRAS、NRAS两者占17％～30％，CBL占10％～17％。诊断JMML者，约11％伴有NF1，无NF1者约10％～15％存在NF1基因缺失。
多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于NF1基因突变的检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于NF1基因容量大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布,故而阻止了对NF1基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。
本发明采用Sanger测序法检测NF1基因第31-34号全外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展整个第31，32,33,34号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解NF1基因第31-34号全外显子的基因突变情况，并不受NF1基因的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
发明内容
本发明提供检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测JMML患者体内检测NF1基因第31-34号全外显子突变的情况。
本发明的目的在于提供检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子突变的3对正、反向引物；其碱基序列为：
NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。
进一步地，所述引物还包括3对测序引物，其碱基序列为
NF1_S-F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_S-R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_S-F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_S-R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_S-F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_S-R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。
进一步地，所述3对正、反向引物的使用浓度比为：NF1_F31:NF1_R31＝1:1；NF1_F32-33：NF1_R32-33＝1:1；NF1_F34：NF1_R34＝1:1。
进一步地，所述3对测序引物的使用浓度比为：
NF1_S-F31:NF1_S-R31＝1:1；NF1_S-F32-33：NF1_S-R32-33＝1:1；NF1_S-F34：NF1_S-R34＝1:1。
本发明的目的还在于提供一种检测NF1基因第31-34号全外显子的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用3对扩增引物NF1_F31与NF1_R31，NF1_F32-33与NF1_R32-33，及NF1_F34与NF1_R34对(1)中的DNA进行扩增，获得覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子突变的得扩增产物；
(3)利用3对测序引物NF1_S-F31与NF1_S-R31，NF1_S-F32-33与NF1_S-R32-33，及NF1_S-F34与NF1_S-R34对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型RUNX1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：
NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_F34:   GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
NF1_S-F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_S-R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_S-F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_S-R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_S-F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_S-R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
本发明的目的还在于提供一种检测NF1基因第31-34号全外显子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括3对扩增引物NF1_F31与NF1_R31，NF1_F32-33与NF1_R32-33及NF1_F34与NF1_R34，测序体系包括3对测序引物NF1_S-F31与NF1_S-R31，NF1_S-F32-33与NF1_S-R32-33，及NF1_S-F34与NF1_S-R34，包括：
NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
NF1_S-F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_S-R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_S-F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_S-R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_S-F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_S-R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer；dNTPs；KOD FX DNAPolymerase。
进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
本发明设计了扩增覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的3对正、反向引物，以及对所获得的扩增产物进行正反向测序的3对测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测NF1基因第31-34号全外显子序列的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。
有益效果：利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩展整个第31、32、33、34号全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解NF1基因第31-34号全外显子的基因突变情况，并不受NF1基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1样品1的检测结果图。
图2样品2的检测结果图。
图3样品3的检测结果图。
图4样品4的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的3对正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：
NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。
优选地，所述引物还包括3对测序引物，其碱基序列为
NF1_S-F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_S-R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_S-F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_S-R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_S-F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_S-R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。
在检测中，先利用上述3对正、反向引物对覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述3对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。
在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧，即扩增区域包括了该外显子的全部序列。因为NF1基因的突变位点很多，突变类型不定。因此本发明所述引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。因为第32和33号外显子序列都较短，在基因序列中的位置分别是168368-168526,169056-169153，中间的内含子序列也只有530bp，因此本发明在检测第32和33号外显子时，采用同一对扩展引物和测序引物。
检测NF1基因第31-34号全外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的提取试剂盒)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；检测目的基因用的3对上、下游引物NF1_F31(10μm)与NF1_R31(10μm)，NF1_F32-33(10μm)与NF1_R32-33(10μm)，及NF1_F34(10μm)与NF1_R34(10μm)。
测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：NF1_S-F31(3.2μm)与NF1_S-R31(3.2μm)，NF1_S-F32-33(3.2μm)与NF1_S-R32-33(3.2μm)，及NF1_S-F34(3.2μm)与NF1_S-R34(3.2μm)，以及Bigdye TerminatorV3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。
检测体系PCR反应液配制如下：
其中，NF1_F31与NF1_R31，NF1_F32-33与NF1_R32-33，及NF1_F34与NF1_R34的碱基序列为：
NF1_F31:  CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_R31；  GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_F32-33:  ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_R32-33:  AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_F34:  GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_R34；  CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
阳性对照品：含有NF1序列的溶液。
阴性对照品：无NF1序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2
血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的基因组DNA:
1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入3个检测体系PCR反应液中各2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：
(5)sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与测序引物：NF1_S-F31(3.2μm)与NF1_S-R31(3.2μm)，NF1_S-F32-33(3.2μm)与NF1_S-R32-33(3.2μm)，及NF1_S-F34(3.2μm)与NF1_S-R34(3.2μm)按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：将测序结果与野生型参考序列(GeneBank No.:NG_009018.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床幼年型粒单核细胞白血病患者样本4份，4份样本都不伴有Ι型神经纤维瘤病(NF1)的症状，检测该4份样本是否存在NF1基因突变。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。
样品1的第31号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出NF1突变。
样品2的第32号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出NF1突变。
样品3的第33号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出NF1突变。
样品4的第34号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出NF1突变。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出NF1基因第31-34号全外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出NF1基因第31-34号全外显子，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出NF1基因突变。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  济南艾迪康医学检验中心有限公司
 
<120>  检测NF1基因第31-34号全外显子的方法和引物
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
cctcaaattc acttggagag agtt                                            24
 
 
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gggataaatc aaaccaaagg aacac                                           25
 
 
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
atgaggactg attgattcag agtt                                            24
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
aacagagcaa ctgagtaagt gg                                              22
 
 
<210>  5
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
gtgtgaacaa gccctccat                                                  19
 
 
<210>  6
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
cttagtccaa gaagatgcaa ag                                              22
 
 

Claims (5)

1.检测NF1基因第31-34号全外显子的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的正、反向引物；其碱基序列为：
NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_R31；GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_R34；CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括3对测序引物，其碱基序列为：
NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_S-R31；GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_S-R34；CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。
3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述3对正、反向引物的使用浓度比为：NF1_F31:NF1_R31＝1:1；NF1_F32-33：NF1_R32-33＝1:1；NF1_F34：NF1_R34＝1:1。
4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述3对测序引物的使用浓度比为：NF1_S-F31:NF1_S-R31＝1:1；NF1_S-F32-33：NF1_S-R32-33＝1:1；NF1_S-F34：NF1_S-R34＝1:1。
5.一种检测NF1基因第31-34号全外显子序列的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用3对扩增引物NF1_F31与NF1_R31，NF1_F32-33与NF1_R32-33，及NF1_F34与NF1_R34对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的扩增产物；
(3)利用3对测序引物NF1_S-F31与NF1_S-R31，NF1_S-F32-33与NF1_S-R32-33，及NF1_S-F34与NF1_S-R34对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型NF1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；
其中所述引物序列为：
NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_R31；GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_R34；CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG
NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT
NF1_S-R31；GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC
NF1_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT
NF1_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG
NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT
NF1_S-R34；CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。
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