CN107236794A - 检测fbxw7基因突变的方法、寡核苷酸及其应用 - Google Patents

检测fbxw7基因突变的方法、寡核苷酸及其应用 Download PDF

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王淑
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Abstract

本发明公开了一种检测急性T淋巴细胞白血病患者的FBXW7基因突变的寡核苷酸及其应用，其包括(i)扩增FBXW7基因全外显子序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可快速地将急性T淋巴细胞白血病患者体内FBXW7基因全外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断急性T淋巴细胞白血病，对疾病的风险预测及治疗方案的针对性定制有重要的参考意义。

Description

检测FBXW7基因突变的方法、寡核苷酸及其应用
背景技术
恶性肿瘤的发病是由多种外源性致癌物诱导和内源性基因表达失控共同作用的结果，其中基因的异常表达包括多种癌基因的活化和/或多种抑癌基因的失活。FBXW7基因(F框/WD40域蛋白基因)又称hCDC4，其表达的蛋白属于F-box蛋白，是SCF(SKP1-CUL1-Fbox)泛素连接酶的靶蛋白识别组分，参与降解周期蛋白Myc，Notch1等，在人体细胞周期的进程、细胞的生长和分化中发挥着重要的调节作用，其缺失能引起和/或加快癌细胞增殖，是近年来发现的重要的抑癌基因。
FBXW7基因共有12个外显子，在人类基因组中高度保守，其表达的蛋白有3个结构域，包括F-box，WD40重复序列和D结构域。其中N末端的WD40重复序列为底物结合域。FBXW7基因在癌症中的整体突变率约为6％，而在急性T淋巴细胞白血病中的突变率高达31％，且43％的突变发生在两个突变热点：Arg465和Arg479，频率约为29％和14％。FBXW7的突变将影响自身功能，进而对下游参与细胞周期的蛋白产生影响，使血液中的白细胞上升，导致疾病发生。Akhoondi等发现FBXW7突变体可上调Cyclin E的水平并且延长其半衰期。ONeil等现FBXW 7突变体和野生型共同形成的异二聚体虽然能和作为靶标的Myc结合，但却不能正常地使其降解。2013年，King等将FBXW7突变体转入小鼠的白血病造血干细胞中，发现癌细胞大量扩增，说明该基因突变使得白血病干细胞更具侵染性。
目前，FBXW7突变对于预后的意义存在差异，主要原因是：不同的治疗方案对预后有不同的影响；白血病的成因复杂，有其他的不良因素同时干扰等。但是检测FBXW7的突变是否存在，对于白血病风险预测以及针对性制定治疗方案无疑有积极意义。
发明内容
本发明的目的在于提供检测FBXW7基因突变的寡核苷酸，采用PCR技术，可用于快速检测急性T淋巴细胞白血病患者体内的FBXW7基因外显子突变情况。所述寡核苷酸包括至少一对扩增FBXW7基因外显子的引物，所述至少一对扩增引物选自FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R，其碱基序列为：
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FBXW7-7/8F:
TGTAAAACGACGGCCAGTGAAGGCAATTTACTCTTGAACTG；
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FBXW7-12R:AACAGCTATGACCATGAAAAAAAAAGCTTTTCATGATAA。
进一步地，所述寡核苷酸还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，FBXW7-1F：FBXW7-1R、FBXW7-2F：FBXW7-2R、FBXW7-3F：FBXW7-3R、FBXW7-4F：FBXW7-4R、FBXW7-5F：FBXW7-5R、FBXW7-6F：FBXW7-6R、FBXW7-7/8F：FBXW7-7/8R、FBXW7-9F：FBXW7-9R、FBXW7-10F：FBXW7-10R、FBXW7-11F：FBXW7-11R、FBXW7-12F：FBXW7-12R的比值均为1。
进一步地，M13F：M13R的比值为1。
进一步地，所述寡核苷酸在辅助检测急性T淋巴细胞白血病中的应用。
本发明的目的还在于提供一种检测FBXW7基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)抽提样本中的基因组DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物M13F和M13R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；
(4)将(3)中的碱基序列与FBXW7基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其中，所述至少一对扩增引物选自FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R，其碱基序列为：
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FBXW7-12R:AACAGCTATGACCATGAAAAAAAAAGCTTTTCATGATAA；
所示
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，FBXW7-1F：FBXW7-1R、FBXW7-2F：FBXW7-2R、FBXW7-3F：FBXW7-3R、FBXW7-4F：FBXW7-4R、FBXW7-5F：FBXW7-5R、FBXW7-6F：FBXW7-6R、FBXW7-7/8F：FBXW7-7/8R、FBXW7-9F：FBXW7-9R、FBXW7-10F：FBXW7-10R、FBXW7-11F：FBXW7-11R、FBXW7-12F：FBXW7-12R的比值均为1。
进一步地，M13F：M13R的比值为1。
进一步地，所述方法在辅助检测急性T淋巴细胞白血病中的应用。
本发明的目的还在于提供一种检测FBXW7基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其中，检测体系PCR扩增反应液包括至少一对扩增引物，所述测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，所述至少一对扩增引物选自FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R，其碱基序列为：
FBXW7-1F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGTTGCCGCCTGGTTTAG；
FBXW7-1R:AACAGCTATGACCATGTCCCTTTGCCAACTGCTG；
FBXW7-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTTTTTACCCTATTTTCCCC；
FBXW7-2R:AACAGCTATGACCATGCCTCTACACCCCACACAAGC；
FBXW7-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTATCATCACACACTGTTCTTCTGG；
FBXW7-3R:AACAGCTATGACCATGGTAACAAGACACAGGGGCTCATA；
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TGTAAAACGACGGCCAGTGAAGGCAATTTACTCTTGAACTG；
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FBXW7-12F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTAAAATACTGAGGACATGGG；
FBXW7-12R:AACAGCTATGACCATGAAAAAAAAAGCTTTTCATGATAA；
所述一对测序引物的碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，FBXW7-1F：FBXW7-1R、FBXW7-2F：FBXW7-2R、FBXW7-3F：FBXW7-3R、FBXW7-4F：FBXW7-4R、FBXW7-5F：FBXW7-5R、FBXW7-6F：FBXW7-6R、FBXW7-7/8F：FBXW7-7/8R、FBXW7-9F：FBXW7-9R、FBXW7-10F：FBXW7-10R、FBXW7-11F：FBXW7-11R、FBXW7-12F：FBXW7-12R的比值均为1。
进一步地，M13F：M13R的比值为1。
进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FXDNA Polymerase。
进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、牛小肠碱性磷酸酶、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括核酸外切酶I、牛小肠碱性磷酸酶。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
进一步地，所述试剂盒在辅助检测急性T淋巴细胞白血病中的应用。
进一步地，引物序列FBXW7-1F和FBXW7-1R是扩增FBXW7基因第1号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-2F和FBXW7-2R是扩增FBXW7基因第2号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-3F和FBXW7-3R是扩增FBXW7基因第3号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-4F和FBXW7-4R是扩增FBXW7基因第4号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-5F和FBXW7-5R是扩增FBXW7基因第5号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-6F和FBXW7-6R是扩增FBXW7基因第6号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-7/8F和FBXW7-7/8R是扩增FBXW7基因第7和8号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-9F和FBXW7-9R是扩增FBXW7基因第9号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-10F和FBXW7-10R是扩增FBXW7基因第10号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-11F和FBXW7-11R是扩增FBXW7基因第11号外显子序列的引物，引物序列FBXW7-12F和FBXW7-12R是扩增FBXW7基因第12号外显子序列的引物。
有益效果：(1)本发明设计了扩增FBXW7基因全部12个外显子序列的引物，通过加接头，使所有11对引物的PCR产物均可以用一对测序引物进行测序，而现有的测序技术要对每种扩增产物设计特异性的测序引物，这就需要设计11条测序引物(单向测序)或22条测序引物(双向测序)，因此，本发明提供的扩增引物既能将所述FBXW7全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况；(2)在设计引物时，通过让FBXW7基因的第7和8号外显子共用一对引物，让FBXW7基因的第7和8号外显子共用一对引物，降低扩增引物的数量，这也会降低扩增产物的数量，从而降低测序引物的数量，因而极大地降低检测成本；(3)本发明采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳；(4)常用的荧光定量PCR法要针对FBXW7基因全部12个外显子可能发生突变的众多突变位点设计多个探针，因此，在12个外显子中，假设每个外显子存在3个突变位点，则要设计36个探针，检测成本显著增加，而本发明通过给设计的扩增引物添加接头，仅需使用一对测序引物就可检测这36个突变位点以及还未被发现的其他突变类型，从而使得检测成本显著降低。
附图说明
图1为FBXW7基因在染色体上的定位图。
图2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12为FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R的电泳图。
图13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23分别为样本1的FBXW7基因第1、2、3、4、5、6、7/8、9、10、11、12号外显子野生型测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测FBXW7基因多态突变位点的寡核苷酸，该寡核苷酸是针对FBXW7基因至少一个外显子所设计的，包括至少一对扩增引物，所述至少一对扩增引物选自FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R，其碱基序列为：
FBXW7-1F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGTTGCCGCCTGGTTTAG
FBXW7-1R:AACAGCTATGACCATGTCCCTTTGCCAACTGCTG
FBXW7-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTTTTTACCCTATTTTCCCC
FBXW7-2R:AACAGCTATGACCATGCCTCTACACCCCACACAAGC
FBXW7-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTATCATCACACACTGTTCTTCTGG
FBXW7-3R:AACAGCTATGACCATGGTAACAAGACACAGGGGCTCATA
FBXW7-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTACAGGCGTTATATAGGAGGGAG
FBXW7-4R:AACAGCTATGACCATGTTTGCAGCAATTAAGTGAGGC
FBXW7-5F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGATCAACTATGGTTGTGTG
FBXW7-5R:AACAGCTATGACCATGCAATGTTTAAAGGTGGTAGCTGT
FBXW7-6F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAGAGCAGAGACAGAGAGGTTTA
FBXW7-6R:AACAGCTATGACCATGATTCGGCTCATCTGAATGTGTAG
FBXW7-7/8F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAAGGCAATTTACTCTTGAACTG
FBXW7-7/8R:AACAGCTATGACCATGTGAGCTCTGATATTTGCTATCCA
FBXW7-9F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTGATGGGATCATTTTATACGG
FBXW7-9R:AACAGCTATGACCATGAATAGAGGAAGAAGTCCCAACC
FBXW7-10F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTTTTCTGTTTCTCCCTCTG
FBXW7-10R:AACAGCTATGACCATGCTGGATCAGCAATTTGACAGTG
FBXW7-11F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCCCCTTTCCTACTAGGATTAA
FBXW7-11R:AACAGCTATGACCATGTGCTAAGGCTCCATATTTCTCT
FBXW7-12F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTAAAATACTGAGGACATGGG
FBXW7-12R:AACAGCTATGACCATGAAAAAAAAAGCTTTTCATGATAA
所述寡核苷酸还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
一种检测FBXW7基因突变的试剂盒，包括检测体系PCR扩增反应液和测序体系反应液，其中，
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer(10.0μL)；dNTPs(2mM)；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；FBXW7基因12个外显子的上、下游引物FBXW7-1F(10μM)、FBXW7-1R(10μM)、FBXW7-2F(10μM)、FBXW7-2R(10μM)、FBXW7-3F(10μM)、FBXW7-3R(10μM)、FBXW7-4F(10μM)、FBXW7-4R(10μM)、FBXW7-5F(10μM)、FBXW7-5R(10μM)、FBXW7-6F(10μM)、FBXW7-6R(10μM)、FBXW7-7/8F(10μM)、FBXW7-7/8R(10μM)、FBXW7-9F(10μM)、FBXW7-9R(10μM)、FBXW7-10F(10μM)、FBXW7-10R(10μM)、FBXW7-11F(10μM)、FBXW7-11R(10μM)、FBXW7-12F(10μM)、FBXW7-12R(10μM)。
测序体系反应液包括：测序纯化液(核酸外切酶I:0.6U，牛小肠碱性磷酸酶:1.2U)；EDTA(125mM)；无水乙醇；75％乙醇；HIDI(高度去离子甲酰胺)；一对测序引物M13F(3.2μM)、M13R(3.2μM)；Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。
优选地，该试剂盒还包括血液DNA抽提试剂。
优选地，该试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。阳性对照品为含有人FBXW7基因外显子DNA的溶液，严禁反复冻融。阴性对照品为ddH2O。空白对照品为2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2血液样本DNA抽提
血液样本DNA抽提(根据天根生物血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒说明书)：抽提人血液样本DNA，具体抽提方法如下：
(1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀；
(2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；
(3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
实施例3样本DNA扩增
按照实施例2抽提的血液样本DNA，然后利用实施例1中的扩增引物扩增人FBXW7基因外显子，获得扩增产物。扩增时在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。详情如下所示：
(i)按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个+空白对照1个)取测体系PCR扩增反应液，每管19μl分装于反应管中；
(ii)将上述处理好的待测样本和阴性对照品、阳性对照品各取1μl分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，获得扩增产物。测体系PCR扩增反应液配制方法如表1所示。PCR扩增扩增反应条件如表2所示。每对扩增引物的详细信息如表3所示。
表1.测体系PCR扩增反应液配制
注：表中的PrimerF和PrimerR选自FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R。
表2.PCR扩增扩增反应条件
表3.每对扩增引物信息
实施例4Sanger测序
取9μl实施例3中的扩增产物和2μl实施例1中的测序纯化液按照表4中所述的程序进行纯化，从而获得纯化产物。
表4纯化程序
将1μl所获得的纯化产物分别与实施例1中的测序引物M13F(3.2μM)、M13R(3.2μM)按照表5中的体系进行混合，然后按照表6中的测序反应程序进行测序。
表5
表6.测序反应程序
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mM的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性试验步骤为：95℃，5min；接着在-30℃2min，然后在4℃保存。
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
结果判断：
分别将测序结果与FBXW7野生型参考序列(Genbank accn：NC_000004.12)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例5临床样本检测
取16例临床血液样本(样本编号为1～16)先后按照实施例1、实施例2、实施例3和实施例4，配制试剂、抽提样本DNA、扩增(获得扩增产物)和测序。每份样本往检测体系PCR反应液中加入1μl。
利用所获得的扩增产物，开展DNA电泳，电泳条件为1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。电泳结果如图2～12所示。
图2～12为这16例血液样本以FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R等11对扩增引物扩增后所得扩增产物的电泳图谱，M为Marker DL 2000，1～16为送检的血液样本编号1～16号。这11对引物扩增的片段长度分别为411bp、907bp、639bp、410bp、312bp、533bp、1361bp、376bp、340bp、368bp、970bp，通过电泳图的分析表明这11对引物扩增有效，且条带单一。
在这16例样品中，以样本1为例进行详细说明。样本1的测序结果如图13～23所示。
图13显示是样本1的FBXW7基因第1号外显子野生型测序截图，说明样本1的1号外显子未发生突变。
图14显示是样本1的FBXW7基因第2号外显子野生型测序截图，说明样本1的2号外显子未发生突变。
图15显示是样本1的FBXW7基因第3号外显子野生型测序截图，说明样本1的3号外显子未发生突变。
图16显示是样本1的FBXW7基因第4号外显子野生型测序截图，说明样本1的4号外显子未发生突变。
图17显示是样本1的FBXW7基因第5号外显子野生型测序截图，说明样本1的5号外显子未发生突变。
图18显示是样本1的FBXW7基因第6号外显子野生型测序截图，说明样本1的6号外显子未发生突变。
图19显示是样本1的FBXW7基因第7/8号外显子野生型测序截图，说明样本1的7、8号外显子未发生突变。
图20显示是样本1的FBXW7基因第9号外显子野生型测序截图，说明样本1的9号外显子未发生突变。
图21显示是样本1的FBXW7基因第10号外显子野生型测序截图，说明样本1的10号外显子未发生突变。
图22显示是样本1的FBXW7基因第11号外显子野生型测序截图，说明样本1的11号外显子未发生突变。
图23显示是样本1的FBXW7基因第12号外显子野生型测序截图，说明样本1的12号外显子未发生突变。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把FBXW7基因共12个外显子序列包括在内了，能够扩展出FBXW7基因全部12个外显子，并且测序结果完全准确。由检测结果可知，样本1的12个外显子均为野生型。另外，对FBXW7基因外显子突变阳性样本的检测也表明本发明的寡核苷酸、方法和试剂盒能够检测出FBXW7基因外显子突变的突变情况。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测FBXW7基因突变的方法、寡核苷酸及其应用
<130>
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgg ttgccgcctg gtttag 36
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacagctatg accatgtccc tttgccaact gctg 34
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagttg ttttttaccc tattttcccc 40
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacagctatg accatgcctc tacaccccac acaagc 36
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtat catcacacac tgttcttctg g 41
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacagctatg accatggtaa caagacacag gggctcata 39
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtac aggcgttata taggagggag 40
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aacagctatg accatgtttg cagcaattaa gtgaggc 37
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtcc tgatcaacta tggttgtgtg 40
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aacagctatg accatgcaat gtttaaaggt ggtagctgt 39
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtaaaacga cggccagtaa gagcagagac agagaggttt a 41
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aacagctatg accatgattc ggctcatctg aatgtgtag 39
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgtaaaacga cggccagtga aggcaattta ctcttgaact g 41
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacagctatg accatgtgag ctctgatatt tgctatcca 39
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgtaaaacga cggccagtgt gatgggatca ttttatacgg 40
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aacagctatg accatgaata gaggaagaag tcccaacc 38
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgtaaaacga cggccagttg tttttctgtt tctccctctg 40
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aacagctatg accatgctgg atcagcaatt tgacagtg 38
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人共序列
<400> 19
tgtaaaacga cggccagtcc ccctttccta ctaggattaa 40
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aacagctatg accatgtgct aaggctccat atttctct 38
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgtaaaacga cggccagttc ctaaaatact gaggacatgg g 41
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aacagctatg accatgaaaa aaaaagcttt tcatgataa 39
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aacagctatg accatg 16

Claims (8)

1.检测FBXW7基因突变的寡核苷酸，其特征在于，包括：至少一对扩增FBXW7基因外显子的引物，所述至少一对扩增引物选自FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R，其碱基序列为：
FBXW7-1F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGTTGCCGCCTGGTTTAG；
FBXW7-1R:AACAGCTATGACCATGTCCCTTTGCCAACTGCTG；
FBXW7-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTTTTTACCCTATTTTCCCC；
FBXW7-2R:AACAGCTATGACCATGCCTCTACACCCCACACAAGC；
FBXW7-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTATCATCACACACTGTTCTTCTGG；
FBXW7-3R:AACAGCTATGACCATGGTAACAAGACACAGGGGCTCATA；
FBXW7-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTACAGGCGTTATATAGGAGGGAG；
FBXW7-4R:AACAGCTATGACCATGTTTGCAGCAATTAAGTGAGGC；
FBXW7-5F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGATCAACTATGGTTGTGTG；
FBXW7-5R:AACAGCTATGACCATGCAATGTTTAAAGGTGGTAGCTGT；
FBXW7-6F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAGAGCAGAGACAGAGAGGTTTA；
FBXW7-6R:AACAGCTATGACCATGATTCGGCTCATCTGAATGTGTAG；
FBXW7-7/8F:
TGTAAAACGACGGCCAGTGAAGGCAATTTACTCTTGAACTG；
FBXW7-7/8R:AACAGCTATGACCATGTGAGCTCTGATATTTGCTATCCA；
FBXW7-9F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTGATGGGATCATTTTATACGG；
FBXW7-9R:AACAGCTATGACCATGAATAGAGGAAGAAGTCCCAACC；
FBXW7-10F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTTTTCTGTTTCTCCCTCTG；
FBXW7-10R:AACAGCTATGACCATGCTGGATCAGCAATTTGACAGTG；
FBXW7-11F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCCCCTTTCCTACTAGGATTAA；
FBXW7-11R:AACAGCTATGACCATGTGCTAAGGCTCCATATTTCTCT；
FBXW7-12F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTAAAATACTGAGGACATGGG；
FBXW7-12R:AACAGCTATGACCATGAAAAAAAAAGCTTTTCATGATAA。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所说寡核苷酸还包括一对测序引物，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，FBXW7-1F：FBXW7-1R、
FBXW7-2F：FBXW7-2R、FBXW7-3F：FBXW7-3R、FBXW7-4F：FBXW7-4R、FBXW7-5F：FBXW7-5R、FBXW7-6F：FBXW7-6R、FBXW7-7/8F：FBXW7-7/8R、FBXW7-9F：FBXW7-9R、FBXW7-10F：FBXW7-10R、FBXW7-11F：FBXW7-11R、FBXW7-12F：FBXW7-12R的比值均为1。
4.如权利要求2所述的寡核苷酸，其特征在于，M13F：M13R的比值为1。
5.如权利要求1～4之一所示的寡核苷酸在辅助检测急性T淋巴细胞白血病中的应用。
6.一种检测FBXW7基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)抽提样本中的基因组DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物M13F和M13R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；
(4)将(3)中的碱基序列与FBXW7基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，所述至少一对扩增引物选自FBXW7-1F/FBXW7-1R、FBXW7-2F/FBXW7-2R、FBXW7-3F/FBXW7-3R、FBXW7-4F/FBXW7-4R、FBXW7-5F/FBXW7-5R、FBXW7-6F/FBXW7-6R、FBXW7-7/8F/FBXW7-7/8R、FBXW7-9F/FBXW7-9R、FBXW7-10F/FBXW7-10R、FBXW7-11F/FBXW7-11R、FBXW7-12F/FBXW7-12R，其碱基序列为：
FBXW7-1F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGTTGCCGCCTGGTTTAG；
FBXW7-1R:AACAGCTATGACCATGTCCCTTTGCCAACTGCTG；
FBXW7-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTTTTTACCCTATTTTCCCC；
FBXW7-2R:AACAGCTATGACCATGCCTCTACACCCCACACAAGC；
FBXW7-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTATCATCACACACTGTTCTTCTGG；
FBXW7-3R:AACAGCTATGACCATGGTAACAAGACACAGGGGCTCATA；
FBXW7-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTACAGGCGTTATATAGGAGGGAG；
FBXW7-4R:AACAGCTATGACCATGTTTGCAGCAATTAAGTGAGGC；
FBXW7-5F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGATCAACTATGGTTGTGTG；
FBXW7-5R:AACAGCTATGACCATGCAATGTTTAAAGGTGGTAGCTGT；
FBXW7-6F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAGAGCAGAGACAGAGAGGTTTA；
FBXW7-6R:AACAGCTATGACCATGATTCGGCTCATCTGAATGTGTAG；
FBXW7-7/8F:
TGTAAAACGACGGCCAGTGAAGGCAATTTACTCTTGAACTG；
FBXW7-7/8R:AACAGCTATGACCATGTGAGCTCTGATATTTGCTATCCA；
FBXW7-9F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTGATGGGATCATTTTATACGG；
FBXW7-9R:AACAGCTATGACCATGAATAGAGGAAGAAGTCCCAACC；
FBXW7-10F:TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTTTTCTGTTTCTCCCTCTG；
FBXW7-10R:AACAGCTATGACCATGCTGGATCAGCAATTTGACAGTG；
FBXW7-11F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCCCCTTTCCTACTAGGATTAA；
FBXW7-11R:AACAGCTATGACCATGTGCTAAGGCTCCATATTTCTCT；
FBXW7-12F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTAAAATACTGAGGACATGGG；
FBXW7-12R:AACAGCTATGACCATGAAAAAAAAAGCTTTTCATGATAA；
所述一对测序引物的碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
7.如权利要求6述的寡核苷酸，其特征在于，FBXW7-1F：FBXW7-1R、FBXW7-2F：FBXW7-2R、FBXW7-3F：FBXW7-3R、FBXW7-4F：FBXW7-4R、FBXW7-5F：FBXW7-5R、FBXW7-6F：FBXW7-6R、FBXW7-7/8F：FBXW7-7/8R、FBXW7-9F：FBXW7-9R、FBXW7-10F：FBXW7-10R、FBXW7-11F：FBXW7-11R、FBXW7-12F：FBXW7-12R的比值均为1。
8.如权利要求6的寡核苷酸，其特征在于，M13F：M13R的比值为1。
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JEE HOON SONG等: "FBXW7 Mutation in Adult T-cell and B-cell Acute Lymphocytic Leukemias", 《LEUKEMIA RESEARCH》 *
KATE T. MONTGOMERY等: "Mutation Detection Using Automated Fluorescence-Based Sequencing", 《CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS》 *
RA´UL CASSIA等: "Cyclin E gene (CCNE) amplification and hCDC4 mutations", 《JOURNAL OF PATHOLOGY》 *

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