CN103555826B - 检测mlh1基因第12外显子突变的引物、方法和试剂盒 - Google Patents
检测mlh1基因第12外显子突变的引物、方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测MLH1基因突变的引物，包括用于扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的引物。利用本发明的引物，通过PCR扩增，将MLH1基因第12外显子编码区完全扩增，然后进行直接测序，通过测序可检测是否发生突变。本发明还提供了检测MLH1基因突变的方法和试剂盒。通过对临床受检样本用所设计的MLH1引物对MLH1基因第12外显子进行扩增，本发明所述引物、方法和试剂盒具有较高的扩增稳定性、特异性；同时作为测序引物，无论是正向还是反向均一次性读完MLH1ORF和侧翼序列。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是针对MLH1基因第12外显子突变的引物、方法和试剂盒。可用于MLH1基因突变与遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC）相关性检测。
背景技术
大肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，也是肿瘤病因性死亡率的较高的癌症。遗传性非息肉病性大肠癌(herediary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)，又称Lynch综合症，是一种常染色体显性遗传性疾病，其特征为发病较早，具有家族聚集性，并可能伴发其他肿瘤。其发生与家族中存在错配修复基因遗传性突变直接相关，且主要发生在MLH1基因，以及其他相关基因，如MSH2、MSH6、APC、MYH和PMS2等。
筛查是早期发现大肠癌、降低致死率的有效方法。Lynch等对HNPCC监测处理的经验是：(1)突变基因携带者从20～25岁起进行结肠镜检查，每1～2年1次，35岁以后1年1次；(2)HNPCC患者应进行结肠次全切除术，并且在结肠次全切除后，还应对其随防终生；(3)女性患者应预防性切除子宫、卵巢、输卵管。
MLH1基因位于染色体3p21-23上，其DNA全长约58kb(不包括启动子),含19个外显子,它的cDNA为长2268bp的开放阅读框(ORF),编码长为756个氨基酸的蛋白。MLH1的突变是另一个研究热点,主要为错义突变和碱基的缺失或插入造成的移码突变和杂合性缺失，导致MLH1蛋白序列改变而使肿瘤发生。目前国内已有关于MLH1基因第1外显子、第2外显子、第19外显子若干碱基突变的报道及相关专利。MLH1第12外显子1151处的T→A突变在东亚正常人群中有一定的发生率，对于HNPCC风险评估具有重要的指导意义。
另外，所有HNPCC患者均应接受遗传咨询：不仅对HNPCC家族先证者进行错配修复基因遗传性突变筛查，而且可以对患者家族其他成员进行遗传咨询，此外也可以对尚未出现肿瘤的年轻成员进行风险评估和早期诊断，对其中的基因突变携带者做到早诊断早治疗早干预。
检测样品中是否存在MLH1基因突变的引物，可用于对个体的HNPCC易感性进行诊断，通过对检测样本的MLH1基因第12外显子进行检测，以此来判断是否与普通人群存有差异，进而判断该个体患HNPCC的风险是否高于普通人群。携带突变基因型的个体患HNPCC的风险显著高于普通人群，应当进一步对其家族进行检测。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种检测检测MLH1基因突变的引物，其特征在于，包括用于扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的PCR引物，其序列为：
EXON12F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
EXON12R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC。
进一步地，测序的通用引物M13为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述的MLH1基因突变是MLH1基因第12外显子1151处T→A突变。
本发明还提供，一种检测MLH1基因突变的方法，包括如下步骤：
1）采集待测血液样本，提取DNA；
2）以步骤1中所提取的DNA为模板，利用扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的PCR引物进行扩增，得到PCR扩增产物，所述扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的PCR引物为：
EXON12F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
EXON12R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC。
3）对步骤2中所得PCR扩增产物进行测序，与MLH1基因野生序列进行比较，确定是否存在MLH1基因第12外显子1151处的T→A突变，测序的通用引物M13为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，PCR扩增反应条件如下：步骤1：94℃，2min；步骤2：98℃10sec,66℃30sec,68℃40sec，共16个循环，而且每循环一次，Tm温度会递减0.5℃，16个循环后最终Tm为58℃；步骤3：98℃10sec，58℃30sec,68℃40sec，共20个循环；步骤4：68℃6min；步骤5：4℃保存。
进一步地，所述的MLH1基因突变是MLH1基因第12外显子1151处的T→A突变。
本发明还提供一种检测MLH1基因突变的试剂盒，包括
(i)核酸提取试剂；
(ii)PCR扩增反应试剂，其包括用于扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的PCR上游引物（EXON12F）和下游引物（EXON12R）分别是：
EXON12F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
EXON12R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC
(iii)DNA测序试剂，其包括用于测序的通用引物M13为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述的MLH1基因突变是MLH1基因第12外显子1151处的T→A突变。
本发明的有益效果：MLH1第12外显子1151处的T→A突变在东亚正常人群中有一定的发生率。本发明所设计的引物除了用于扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的PCR上游引物（EXON12F）和下游引物（EXON12R）之外，还包括测序的通用引物M13的碱基序列，即PCR扩增引物中的“TGTAAAACGACGGCCAGT”和“AACAGCTATGACCATG”是测序通用引物的碱基序列，而不是MLH1基因第12外显子中序列。“GCTCCATTTGGGGACCTGTA”和“AATGGTCCTGTGGCCTTGTC”是MLH1基因第12外显子中的部分碱基序列。这样在PCR测序时使用通用引物就可以克服针对MLH1基因第12外显子设计的引物中GC含量偏高导致的Tm值偏高的问题。因为Tm值偏高，其测序结果会有很多杂带或双峰，会影响测序仪对碱基的判读。而本发明的引物设计有效克服传统的检测MLH1基因第12外显子引物中GC含量偏高引起的Tm值升高的问题，使得测序所得图谱清晰，无杂带和双峰。因而在测序中可以不受扩增引物的影响，准确方便地检测出整个MLH1基因第12外显子。因为通用引物M13并不属于MLH1基因第12外显子，因此这样的引物设计方式不是引物设计软件所能完成的。利用EXON12F和EXON12R进行PCR反应，将MLH1基因第12外显子编码区完全扩增，然后用测序通用引物进行直接测序，通过测序可检测是否发生突变。引物EXON12F和EXON12R具有较高的扩增稳定性、特异性，无论是正向还是反向均一次性读完MLH1ORF和侧翼序列。
附图说明
图1是本发明对样本3的测序图。
图2是对照组1对样本3的测序图。
图3是本发明和对照组2扩增样本3的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测MLH1基因第12外显子基因突变的试剂盒，包括：
(i)核酸提取试剂（天根血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒）；
(ii)PCR扩增反应试剂：PCR Buffer，dNTP，Taq酶，ddH2O，用于扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的PCR上游引物（EXON12F）和下游引物（EXON12R）分别是：
EXON12F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
EXON12R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC
其中PCR扩增引物中的“TGTAAAACGACGGCCAGT”和“AACAGCTATGACCATG”是测序通用引物的碱基序列，而不是MLH1基因第12外显子中序列。“GCTCCATTTGGGGACCTGTA”和“AATGGTCCTGTGGCCTTGTC”是MLH1基因第12外显子中的部分碱基序列。
(iii)测序反应试剂：Bigdye Terminator V3.1（购买自ABI公司），无水乙醇，75%乙醇，EDTA，HiDi(highly deionized-formamide)，用于测序的通用引物M13为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
该试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(i)采集待测血液样本，提取DNA；
(ii)以该DNA为模板，利用本发明所述试剂盒中的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(iii)利用本发明所述的PCR测序引物对PCR扩增产物测序，与MLH1基因野生序列进行比较，确定是否存在第1151碱基T→A突变。
实施例2
（1）样本抽提（根据天根血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒说明书）：
1.1抽取300μL血液加入900μL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟（若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
1.2加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
1.3加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.4加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
1.6向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.7向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.8向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
1.9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
1.10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
（2）实验过程
2.1按样品数n（样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个）取预混PCR反应液每管20μl分装于反应管中。
2.2将上述步骤（1）中处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2μl分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下：
2.3PCR条件：如表1所示。
表1
2.4电泳鉴定
1.5%琼脂糖凝胶电泳，140V，20min，凝胶成像系统观察。其中目的片段MLH1第12外显子为622bp。
2.5PCR产物纯化
被检测样本PCR扩增产物按下述条件进行第一步纯化：
加入0.5倍体积醋酸钠（pH5.2）、3倍体积100%酒精，室温放置30分钟，12000rpm离心30min，弃上清；
加入75%酒精200μl，12000rpm离心20min，弃上清，95℃烘干1min；
加入20μl ddH2O溶解；经NANO drop定量后，将其稀释至2-5ng/μl的浓度。
2.6测序反应
试剂：Bigdye Terminator V3.1（购买自ABI公司）。
每个样本取0.2ml PCR反应管2个进行双向测序，在其中一个管子上标记上游的标记，在另一个管子上标记下游的标记，每管分别加入1μl Bigdye Terminator，1μl水，酶纯化产物2μl，及上游引物（放在标记了上游的管子中）或下游引物（放入标记了下游的管子中）1μl，每管共5μl体系。反应条件为：95℃4分钟，95℃15秒；50℃20秒；60℃2分钟，25个循环。
2.7酒精纯化
测序反应结束，打开管盖，每管先加入2μl EDTA，静置5分钟，终止测序反应，随后加入15μl无水乙醇，13500rpm离心30分钟，离心结束倒去液体，并甩干，加入50μl75%乙醇，13500rpm离心15分钟，离心结束倒去液体，甩干，为了避免剩余酒精对后续实验的影响，需烘干。
2.83130基因测序仪测序（来自于ABI：美国应用生物系统公司）
在烘干的离心管中加入10μl HiDi，振荡混匀，离心收集，将液体全部转移至96孔板上上机。
2.9实验结果：将测序结果同MLH1基因野生序列进行比对确认
3）数据分析
突变分析：应用DNAStar7.0软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI中检索到的MLH1基因野生序列进行比对，找出突变序列，确认是否发现1151T→A突变位点。
实施例3
采用本发明检测临床标本10例。
取送检肠癌患者抗凝血标本10例，经过焦磷酸测序其中的3、6、9号标本发生了MLH1基因第12外显子1151处T→A突变。
按实施例2所述方法提取基因组DNA、配制试剂并检测。
每份标本加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照，一台96孔的普通PCR仪可同时检测46份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间为160分钟。
每个样本经2次测序后，比对突变的情况，对于结果不统一的样本将进行第三次测序。最后，根据测序结果对于预后进行判断。
检测结果如表2所示：
表2：
图1是样本3的测序图，从图中可以看出该样本发生了1151T→A突变（图中画横线处）。样本6和9的测序图也表明了这些样本发生了1151T→A突变。
从上表可以看出，10例样本中检测出3例突变，并根据突变结果给出了预后指导，说明本发明检测结果准确性高，而且缩短了检测时间，提高了检测效率。
实施例4
使用本发明所述引物和使用对照组1所述引物对样本3进行检测的比较实验。
对照组1的扩增引物为：
EXON12F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
EXON12R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC。
对照组1所使用的测序引物为：
DF：GCTCCATTTGGGGACCTGTA
DR：AATGGTCCTGTGGCCTTGTC
对照组1检测样本3中MLH1基因第12外显子突变的方法和本发明相同。
图1和图2所示是本发明和对照组1对样本3测序结果。图1是本发明所述的引物和方法测序的结果，在测序图谱中几乎没有杂带和双峰的干扰，测序结果准确，因而对突变位点的判读是准确可靠的。而对照组1的测序图谱（图2）中有明显的杂带和双峰，而且数量很大，这直接影响了测序仪对碱基的判读，从图2的测序结果看出现了连续的A，这明显与实际情况不相符合，因此对突变位点的判读并不让人信服，测序结果变得几乎没有参考价值。
因此从该对比实验我们可以看出，在PCR扩增引物中增加测序用的通用引物后，在测序中可以不受扩增引物的影响，准确方便地检测出整个MLH1基因第12外显子，对样本MLH1基因第12外显子突变位点的检测准确性好，特异性高。
实施例5
采用本发明所述touchdownPCR方法（本发明）和不采用touchdownPCR方法（对照组2）比较实验，上述两种方法分别对样本3进行扩增，扩增后按实施例2中2.4电泳鉴定的方法比较两者的扩增结果。其中对照组2的所有试剂均与本发明一致。对照组2的扩增方式如表3所示：
表3
| 步骤1 | 步骤2 | 步骤3 | 步骤4 |
| 循环数1 | 循环数：36 | 循环数：1 | 循环数：1 |
| 94℃，2min | 98℃，10sec | 68℃，6min | 4℃，∞ |
| 60℃，30sec | |||
| 68℃，40sec |
图3是实施例5所述的电泳图，其中11-1是利用本发明的引物和touchdownPCR方法获得的扩增结果，本发明所得到的扩增产物的电泳条带清晰，说明扩增特异性好。这是因为通过touchdownPCR扩增，一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率，而此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争了。因此本发明利用touchdownPCR扩增所得结果好。图3中的11-2是对照组2扩增产物，从结果看目标产物虽有扩增，但电泳条带没有本发明的结果清晰明亮。因此采用本发明所述的引物，可优选touchdownPCR扩增。
SEQUENCE LISTING
<110> 合肥艾迪康临床检验所有限公司
<120> 检测MLH1基因第12外显子突变的引物、方法和试剂盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgc tccatttggg gacctgta 38
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacagctatg accatgaatg gtcctgtggc cttgtc 36
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacagctatg accatg 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctccatttg gggacctgta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatggtcctg tggccttgtc 20
Claims (4)
1.检测MLH1基因突变的引物，其特征在于，包括用于扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的PCR引物，其序列为：
EXON12 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
EXON12 R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC；
测序的通用引物M13为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的扩增引物在如下的PCR扩增反应条件中使用：步骤1：94℃，2min；步骤2：98℃10sec,66℃30sec,68℃40sec，共16个循环，而且每循环一次，Tm温度会递减0.5℃，16个循环后最终Tm为58℃；步骤3：98℃10sec，58℃30sec,68℃40sec，共20个循环；步骤4：68℃6min；步骤5：4℃保存。
3.检测MLH1基因突变的试剂盒，包括：
(i)核酸提取试剂；
(ii)PCR扩增反应试剂，其包括用于扩增样本DNA中MLH1基因第12外显子的PCR上游引物(EXON12F)和下游引物(EXON12R)分别是：
EXON12 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
EXON12 R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC
(iii)DNA测序试剂，其包括用于测序的通用引物M13为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增引物在如下的PCR扩增反应条件中使用：步骤1：94℃，2min；步骤2：98℃10sec,66℃30sec,68℃40sec，共16个循环，而且每循环一次，Tm温度会递减0.5℃，16个循环后最终Tm为58℃；步骤3：98℃10sec，58℃30sec,68℃40sec，共20个循环；步骤4：68℃6min；步骤5：4℃保存。
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