CN102140510A - 一种检测人细胞色素p450 cyp2c19基因突变的方法及试剂盒 - Google Patents
一种检测人细胞色素p450 cyp2c19基因突变的方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102140510A CN102140510A CN2010106092174A CN201010609217A CN102140510A CN 102140510 A CN102140510 A CN 102140510A CN 2010106092174 A CN2010106092174 A CN 2010106092174A CN 201010609217 A CN201010609217 A CN 201010609217A CN 102140510 A CN102140510 A CN 102140510A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- quality control
- primer
- control reference
- nucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学领域，公开了一种检测人细胞色素P450 CYP2C19基因突变的方法，包含用引物对样品基因组进行扩增，所述引物包含：检测M1突变的上下游引物，其核苷酸分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示；检测M2突变的上下游引物，其核苷酸分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；设立质控参照，取扩增产物用核苷酸如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示的测序引物进行测序。本发明还提供检测人细胞色素P450 CYP2C19基因突变的试剂盒。依据本发明所述方法的检测结果，进行临床用药方案指导和调整，为临床个体化用药提供依据，可提高疗效，降低毒副作用风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测人细胞色素P450CYP2C19基因突变的方法及试剂盒。
背景技术
细胞色素P450CYP2C19基因编码S-美芬妥英羟化酶，主要存在于人类肝脏细胞，催化羟化、氧化、环化等I相代谢反应，参与多种药物的代谢。CYP2C19酶活性在人群中存在遗传差异，以美芬妥英或类似底物作为表型探针，可将CYP2C19分为不同表型：羟化反应速度快者为强代谢表型(Extensive Metabolism，EM)，羟化反应速度慢者为弱代谢型(Poor Metabolism，PM)。白种人PM的发生率较低(1-2％)，而亚洲人群中PM表型频率较高，中国汉族人群的PM的发生率为13～18％，维吾尔族人群PM频率则低于汉族。
CYP2C19基因含9个外显子，全长约55kb。cDNA全长1940bp，编码区1473bp共编码490个氨基酸，第421至432位氨基酸是血红素结合位点。系列研究发现代谢表型差异源于CYP2C19基因突变，最主要为M1和M2两种单核苷酸多态性突变。
M1突变为外显子5上第681位碱基G→A突变，产生异常拼接位点，导致转录过程中外显子5’端40bp(643-682bp)缺失，翻译过程中丢失215-227位氨基酸，并从215位氨基酸处发生移码，在其下游第20个氨基酸处产生异常终止密码，蛋白合成过早被终止，合成仅含234个氨基酸的截短蛋白，为缺失血红素结合区的无功能蛋白。M1突变决定是PM表型的最主要基因型，73-83％的PM表型个体携带M1突变。
M2突变是外显子4第636位碱基G→A突变，编码色氨酸的密码子突变为终止密码子，导致蛋白合成提前终止，形成无血红素及底 物结合区的无功能蛋白。在中国人群中，M2突变的发生频率为M1突变的1/9～1/10，M1和M2突变几乎可以解释所有的PM表型。
CYP2C19等位基因呈独立遗传特性，在M1纯合基因型个体，未发现M2突变等位基因；同样在M2纯合基因型个体，也不含有M1突变等位基因。就是说，M1和M2等位基因在同一基因位点上可独立地进行分离，并遗传给下一代，在同一条染色体上尚未发现两个突变等位基因同时存在的状况。
质子泵抑制剂是目前临床最常用的抑酸药物，包括奥美拉唑、兰索拉唑、潘托拉唑、埃索美拉唑和雷贝拉唑等。主用于治疗消化道溃疡、食管反流症等疾病。此类药物化学结构相似，均包含有非对称性硫原子和苯并咪唑主链，并主要经肝脏CYP2C19酶代谢。CYP2C19基因多态性分析有助于预测质子泵抑制剂药物的疗效，临床医师据此可决定适合患者的药物、剂量及经济的治疗方案，为临床合理用药、个体化用药和治疗提供指导。
以奥美拉唑为例。奥美拉唑是目前应用最多的质子泵抑制剂药物，也最先被证实为CYP2C19代谢底物。奥美拉唑主要代谢途径是5-甲基经CYP2C19羟化，再经CYP3A硫化氧化生成奥美拉唑砜。次要代谢途径包括CYP3A催化3-羟化反应和CYP2C19催化5-O-脱甲基化，代谢产物进一步经CYP3A和CYP2C19代谢生成羟基砜衍生物。
临床研究发现PM表型个体服用奥美拉唑后的血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)比EM表型个体高5倍。长期服用奥美拉唑等质子泵抑制剂药物，高胃泌素血症副作用多数发生于PM表型患者，EM表型患者则很少发生。长期持续用质子泵抑制剂药物治疗致Zollinger-Ellison综合征，血浆维生素B12浓度降低，PM表型患者血浆维生素B12降低程度较EM表型患者更为严重。以奥美拉唑为基础的胃、十二指肠溃疡联合治疗及幽门螺杆菌根治的临床研究发现：在相同用药剂量和给药方案时，PM表型患者治愈率显著优于EM表型患者，EM表型患者需增大药物剂量方可达到相同疗效。
除质子泵抑制剂外，CYP2C19还参与多种药物的代谢。例如新型 抗抑郁药西酞普兰(Citalopram，CIT)主要在肝脏中经N位去甲基化，转化成去甲西酞普兰(desmethylcitalopram，DCIT)和去二甲西酞普兰(didesmethylcitalopram，DDCIT)。CYP2C 19、CYP3A4和CYP2D6三种酶参与N位去甲基化反应，CYP2C19是催化CIT体内N位去甲基代谢的主要酶，对西酞普兰代谢起决定作用。镇静催眠抗惊厥地西泮主要有两条代谢途径：N-位去甲基化生成去甲地西泮和G3位羟化生成羟地西泮。CYP2C19和CYP3A参与N-位去甲基化代谢，CYP2C19与底物亲和力高，在治疗剂量下起主要作用。研究发现M1/M1纯合基因型患者对地西泮代谢速度显著低于M1/W1杂合和W1/W1纯合基因型患者。
治疗抑郁症以及强迫观念行为的首选药物氟西汀，通过选择性抑制中枢神经系统5-羟色胺重摄取而发挥药理作用。CYP2CI9参与氟西汀N-去甲基和O-脱烷基两条主要代谢途径，CYP2C 19活性差异导致个体间氟西汀和去氧氟四汀血药浓度差异，CYP2C19对氟西汀的去甲基代谢呈基因-剂量依赖性。因此专家建议在临床应用氟四汀时，应根据个体CYP2CI9的基因型调整给药剂量。
CYP2C19功能状态对于联合用药也十分重要。例如抗癫痫药苯妥英(PHT)与丙戊酸(VPA)均经CYP2C19代谢，大部分PM表型患者给予较小剂量的VPA，即可达到有效血药浓度并控制症状。既可减少药品资源浪费，又可降低药品不良反应风险。由于PM表型患者对药物敏感，即便增加很小的剂量，都可能引起血药浓度的较大变化，甚至会导致药物中毒。因此，PM型患者在服用VPA时，应从比低于常规剂量的更小剂量开始，同时密切观察症状及血药浓度变化。VPA和PHT间存在竞争性抑制，由于VPA与CYP2C19的亲和力高于PHT，可取代PHT的蛋白结合位点，而首先经CYP2C19酶代谢，同时抑制了PHT的代谢而增加游离PHT水平。而PHT又是肝脏酶表达的诱导剂，可刺激CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5及CYP2C19等多种酶合成，增高酶水平促进VPA的代谢，进一步降低VPA血药浓度。PM表型患者对PHT的酶活性诱导作用不敏感，稳态后VPA血药浓度与单 用VPA的血药浓度接近。联合用药时PM表型患者VPA血药浓度变化较为理想，不易产生因VPA血药浓度过高而引起的药物毒副作用。而EM型患者受PHT酶活性诱导作用较强，稳态后血药浓度约为单用VPA正常代谢者的3/5，使得VPA与PHT联合用药时，EM者的血药浓度显著低于PM者，达不到有效血药浓度。相反服用同等剂量VPA时，PM表型患者血药浓度却异常增高，易出现药物副作用。因而PM表型患者应减少VPA的剂量，避免毒副作用发生。
CYP2C19基因除参与代谢药物外，也参与多种致癌物清除代谢或前致癌物活化代谢等生物转化过程激活。因而CYP2C19基因多态性也与癌症发生风险相关。例如CYP2C19基因多态性与膀胱癌、乳腺癌、急性白血病、肺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、肝硬化及肝癌等肿瘤风险相关。在人群中进行人细胞色素P450CYP2C19基因突变检测，进行CYP2C19基因分型，提高对某些肿瘤易感性的预测水平，有助于肿瘤的预防。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种检测人细胞色素P450CYP2C19基因突变的方法，包含以下步骤：
用引物对样品基因组进行扩增，所述引物包含：检测M1突变的上下游引物，其核苷酸分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示；以及检测M2突变的上下游引物，其核苷酸分别如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6所示；
设立质控参照，取扩增产物用核苷酸如SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10所示的测序引物进行测序。
本发明所述人细胞色素P450CYP2C 19基因突变方法检测CYP2C19的M1和M2突变：野生型及变异性等位基因的外显子及突变位点序列分别为：
M1突变：外显子5第681位碱基G→A
W1等位基因序列(Exon5)
atatgcaataattttcccactatcattgattatttccc ggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggactttattgattgcttcctgatcaaaatggagaag
M1等位基因序列(Exon5)
atatgcaataattttcccactatcattgattatttccc 
ggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggactttattgattgcttcctgatcaaaatggagaag
M2突变：外显子4第636位碱基G→A
W2等位基因序列(Exon4)
cttcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttccagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaagcaccccctg 
atccag
M2等位基因序列(Exon4)
Cttcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttccagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaagcaccccctg atccag
所述检测M1、M2突变的上下游引物指扩增M1和M2突变所在区域的上游和下游引物。所述测序引物为识别PCR产物并通过DNA测序反应检测M1和M2突变的通用测序引物。
所述检测M1、M2突变的上下游引物，与其他人所有的序列不同，为了方便测序，在所述引物的末端添加了便于测序反应的特殊序列，简化了后续的测序反应，增加了通用性和标准化，且经实验验证其特异性强。
作为优选，所述质控参照包含W1/W1纯合基因型质控参照、M1/M1纯合基因型质控参照、W1/M1杂合基因型质控参照、M2/M2纯合基因型质控参照、W2/W2纯合基因型质控参照、W2/M2杂合基因型质控参照。
作为优选，所述质控参照为分别重组了核苷酸如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示序列的重组质粒的一 种，分别作为W1/W1纯合基因型质控参照、M1/M1纯合基因型质控参照、W2/W2纯合基因型质控参照、M2/M2纯合基因型质控参照。
更优选地，所述质控参照为分别重组了核苷酸如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4的重组质粒的混合物、分别重组了核苷酸如SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示序列的重组质粒的混合物，分别作为W1/M1杂合基因型质控参照、W2/M2杂合基因型质控参照。
本发明还提供一种人细胞色素P450CYP2C19基因突变的试剂盒，包含PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序反应试剂、质控参照品和测序产物纯化试剂，其特征在于，PCR扩增引物为检测M1突变引物和检测M2突变引物，所述检测M1突变引物核苷酸分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述检测M2突变引物核苷酸分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；测序引物核苷酸如SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10所示。
作为优选，所述质控参照品包含W1/W1纯合基因型质控参照、M1/M1纯合基因型质控参照、W1/M1杂合基因型质控参照、M2/M2纯合基因型质控参照、W2/W2纯合基因型质控参照、W2/M2杂合基因型质控参照。
作为优选，所述质控参照为分别重组了核苷酸如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4的重组质粒的混合物、分别重组了核苷酸如SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示序列的重组质粒的混合物或任一种重组质粒。
在本发明的具体实施例中，所述PCR扩增试剂含pH8.3-8.8的Tris.Cl、DCl、MgCl2、二硫苏糖醇、Triton X-100、dNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)、正向和反向引物对、Taq DNA聚合酶、DMSO和甘油。
在本发明的具体实施例中，所述PCR纯化试剂包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶。
在本发明的具体实施例中，所述DNA测序反应试剂包含BigDye染料、ddNTP和dNTP混合液、测序酶、测序引物。
CYP2C19为肝脏重要的I相代谢酶，催化氧化还原、羟化、等多 种代谢反应，几十种临床常用药物经CYP2C19代谢，M1和M2基因突变决定中国人群几乎全部的弱代谢表型。CYP2C19酶活性影响多种药物的代谢，检测M1和M2突变型可判断酶活性并预测相关药物的体内代谢及毒副反应。通过检测重要的代谢酶CYP2C19基因型，推断酶活性和药物代谢状况，从而指导多种药物的个体化应用。
附图说明
图1为本发明M1突变PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；
1-5：待测标本；+：阳性对照；-：阴性对照；
图2为实施例3的M1/M1纯合基因型测序峰图部分截图。
具体实施方式
本发明公开了一种检测人体细胞色素氧化酶P4502C19基因突变的方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法、产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：本发明所述检测人细胞色素P450CYP2C19基因突变试剂盒
本发明所述CYP2C19基因分型试剂盒包括PCR扩增反应、扩增产物纯化、测序反应和测序产物纯合及上样四个单元。
PCR扩增反应单元
检测M1和M2的PCR扩增单元均含一管反应试剂和一管阳性参 照品。
1、PCR反应试剂
由特异性引物对、PCR缓冲液、dNTP混合液和Taq DNA聚合酶等按照优化的反应浓度配制而成。
1)特异性引物：正反向引物各50-100nmol/L。
采用Oligo6软件设计扩增含M1或M2突变位点基因片段的特异性PCR引物，序列分别为：
检测M1突变正向引物(M1-F)为：
5’-TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGCAGGTATAAGTCTAGGA-3’，(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)
检测M1突变反向引物(M1-R)为：
5’-AACAGCTATGACCATGCACAAATACGCAAGCAGTC-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)
PCR产物为461bp：
AAAGCAGGTATAAGTCTAGGAAATGATTATCATCTTTGATTCTCTTGTCAGAATTTTCTTTCTCAAATCTTGTATAATCAGAGAATTACTACACATGTACAATAAAAATTTCCCCATCAAGATATACAATATATTTTATTTATATTTATAGTTTTAAATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC[G/A]GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCTTAGTTATGTGACTGCTTGCGTATTTGTG(CYP2C19基因野生型、M1突变型PCR产物核苷酸序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示)
检测M2突变正向引物(M2-F)为：
5’-TGTAAAACGACGGCCAGTAGGGAATTCATAGGTAAGATA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)
检测M2突变反向引物(M2-R)为：
5’-AACAGCTATGACCATGGAAGCCTGATCTATATTGG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)
设计PCR产物为485bp：
AGGGAATTCATAGGTAAGATATTACTTAAAATTTCTAAACTATTATTATCTGTTAACAAATATGAAGTGTTTTATATCTAATGTTTACTCATATTTTAAAATTGTTTCCAATCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCCTGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTG[G/A]ATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACATTTTTGAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCATGGGGTGAATATCTGGAAAAGATGGCAAAGTTCTTTATTTTATGCACAGGAAATGAATATCCCAATATAGATCAGGCTTC(CYP2C 19基因野生型、M2突变型PCR产物核苷酸序列分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示)
2)PCR缓冲液
10-50mmol/L Tris.Cl(pH8.3-8.8)、50mmol/L NaCl、2-5mmol/LMgCl2、5mmol/L-二硫苏糖醇、0.1-0.5mmol/L Triton X-100、0.01％明胶、5-10％DMSO、10％甘油等。
3)dNTP混合液
4种三磷酸核苷酸dATPPI、dCTP、dGTP、dTTP等比例混合，每种dNTP终浓度为100-200nmol/L。
4)DNA聚合酶
25μl反应体系含0.5-2.5单位Taq DNA聚合酶。
PCR产物纯化单元
PCR产物纯化单位主要目的是清除PCR产物中残余的引物和dNTP，这些可能干扰后续DNA测序反应的特异性和效率。主要包括两种酶：核酸外切酶将引物切割为单个碱基；虾碱性磷酸酶降解dNTP。核酸外切酶0.2units/μl，虾碱性磷酸酶0.05units/μl，用酶储存液制备成5倍浓度的纯化试剂。
DNA测序单元
含一管DNA测序试剂和6管基因分型质控参照品。
1、DNA测序试剂包括：通用测序引物、BigDye混合液、测序酶。
1)通用测序引物
Seq-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(核苷酸序列如SEQID No.9所示)
Seq-R：5’-AACAGCTATGACCATG-3’(核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示)
浓度：200-nmol/L
2)、BigDye混合液
含4荧光标记的双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)和4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)混合液。
3)、测序酶
上述试剂加酶稳定剂混合为5倍浓度备用。
2、质控参照品
质控参照为含有扩增片段的重组质粒。经测序鉴定正确的各等位基因型PCR产物克隆到pMD载体(购自北京天根公司的克隆载体，名称：pGM-T克隆试剂盒，货号VT302-02)中，分别构建突变型质粒pMD/M1和pMD/M2及野生型重组质粒pMD/W1和pMD/W2，转化大肠杆菌后，采用商品化质粒DNA提取试剂盒提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒质量，紫外分光光度计测定质粒DNA浓度，用 TE稀释为2ng/μl浓度，作为PCR扩增的质控标准品。
构建4种质粒说明如下：
pMD/W1：野生型W1质粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，外显子5第681位碱基为G(681G)
pMD/M1：变异型M1质粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，外显子5第681位碱基为A(681A)
pMD/W2：野生型W2质粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，外显子4第636位碱基为G(636G)
pMD/M2：变异型M2质粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，外显子4第636位碱基为A(636A)
pMD/W1质粒作为W1/W1纯合基因型的标准参照品，浓度为2ng/μl。
pMD/M1质粒作为M1/M1纯合基因型的标准参照品，浓度为2ng/μl。
pMD/W1与pMD/M1两种质粒0.5∶0.5比例混合，作为W1/M1杂合基因型标准参照品，浓度为2ng/μl(含pMD/W1与pMD/M1各1ng/μl)。
pMD/W2质粒作为W2/W2纯合基因型的标准参照品，浓度为2ng/μl。
pMD/M2质粒作为M2/M2纯合基因型的标准参照品，浓度为2ng/μl。
pMD/W2与pMD/M2两种质粒0.5∶0.5比例混合，作为W2/M2杂合基因型标准参照品，浓度为2ng/μl(含pMD/W2与pMD/M2各1ng/μl)。
测序产物纯化及上样单元
含100％乙醇1瓶、70％乙醇1瓶、HIDI上样缓冲液1管。
上述四个单元的试剂组合为完整试剂盒，另附超纯灭菌的去离子水100ml，上述试剂盒于-20℃保存备用。
实施例2：应用本发明所述方法及试剂盒进行CYP2C19突变检测仪器设备：
PCR扩增仪、ABI 3130遗传分析仪，超净工作台、高速台式离心机、水浴锅、电泳仪等。
提取基因组DNA：
柠檬酸钠或枸橼酸钠抗凝外周静脉血100μl，加入2-5倍体积人红细胞裂解液，混匀后冰浴10-15分钟，2000rmp离心5分钟，弃上清收集淋巴细胞，用全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。全血基因组DNA提取可采用多种方法如碱裂解法、硅胶法、二氧化硅吸附法、磁珠吸附法、层析柱法等，目前有多种商品化试剂盒供选择，推荐采用柱层析试剂盒。
PCR反应
1)从实施例1所述试剂盒中取出PCR反应试剂和去离子水，在室温下融化，30μL反应体系配置如下：
PCR反应试剂(特异性引物对2对、PCR缓冲液、dNTP混合液和Taq DNA聚合酶) 16μl
基因组DNA 4μl
ddH2O 10μl
总体积 30μL
每批次实验中设立阳性和阴性对照反应
阳性对照反应：用质控参照质粒4μl代替基因组DNA。
阴性对照反应：用ddH2O代替基因组DNA。
充分混匀，2000rpm离心10sec，放置到PCR仪进行反应。
2)PCR反应参数设置
95℃5min(预变性)
95℃ 30sec
72℃ 45sec
72℃ 10min
4℃保持
3)取3μlPCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像仪下观察PCR反应产量及特异性，本发明检测M1突变引物扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1，其中泳道1-5：待测标本；+：阳性对照；-：阴性对照；
PCR产物纯化
将上述25μlPCR产物中加入1μlPCR产物纯化试剂、去离子水4μl，混匀后短暂离心，置PCR仪进行消化，37℃反应20min。之后80℃灭活20min。
测序反应
1)冰上配制测序反应体系：DNA测序试剂包含通用测序引物、BigDye混合液、测序酶
DNA测序试剂 2μl
PCR产物 3μl
ddH2O 5μl
10μl
充分混匀，2000rpm离心10sec，放置到PCR仪进行反应。
2)测序反应参数：
4℃ 保持
测序反应产物纯化及上机分析：
1)测序反应结束后，加入20μl无水乙醇和2μl EDTA溶液，室温下沉淀30min，4℃下12000rpm离心10min，弃上清；加入70％乙醇30μl，4℃下12000rpm离心15min，弃上清，室温下干燥。
2)加入HIDI溶液8μl，上样到ABI3130测序仪进行测序。
实施例3：进行基因型分析
基于生物信息分析测序序列及变异位点，确定判断M1和M2野生型和变异型等位基因的序列特征：
按实施例1、实施例2所述方法进行扩增及分析，以检测M1突变为例，对生物信息学分析说明如下：
检测M1突变引物的扩增产物正向测序预期序列为：
AAAGCAGGTATAAGTCTAGGAAATGATTATCATCTTTGATTCTCTTGTCAGAATTTTCTTTCTCAAATCTTGTATAATCAGAGAATTACTACACATGTACAATAAAAATTTCCCCATCAAGATATACAATATATTTTATTTATATTTATAGTTTTAAATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC 
GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCTTAGTTATGTGACTGCTTGCGTATTTGTG(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)
检测M1突变引物的扩增产物的反向测序预期序列为：
CACAAATACGCAAGCAGTCACATAACTAAGCTTTTGTTAACATTTTACCTTCTCCATTTTGATCAGGAAGCAATCAATAAAGTCCCGAGGGTTGTTGATGTCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCC 
GGGAAATAATCAATGATAGTGGGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATTAAATTAAAAGCATTTAATAAAGGT ATAGATACAATATGCCAAGCTCTGGTTGTAATTTAAAACTATAAATATAAATAAAATATATTGTATATCTTGATGGGGAAATTTTTATTGTACATGTGTAGTAATTCTCTGATTATACAAGATTTGAGAAAGAAAATTCTGACAAGAGAATCAAAGATGATAATCATTTCCTAGACTTATACCTGCTTT
测序结果分析
采用每个标本均正反向测序引物进行双向测序，根据测序峰图和转换的对应序列与质控参照品的标准序列进行比对，判断测序结果。
测序峰图部分截图如图2所示，将测序结果与软件中存储序列自动比对，如外显子5第681位碱基位点为G则为W1等位基因，如该位点为A则为M1等位基因，本实施例测得的基因为M1/M1纯合基因型。
参照上述方法，对M1/M1纯合基因型、M2/M2纯合基因型、W1/W1纯合基因型、W2/W2纯合基因型、M1/W1杂合基因型、M2/W2杂合基因型测序结果与软件中存储序列自动比对，测得的结果经验证无误。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测人细胞色素P450 CYP2C19基因突变的方法，包含以下步骤：
用引物对样品基因组进行扩增，所述引物包含：检测M1突变的上下游引物，其核苷酸分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示；以及检测M2突变的上下游引物，其核苷酸分别如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6所示；
设立质控参照，取扩增产物用核苷酸如SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10所示的测序引物进行测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质控参照包含W1/W1纯合基因型质控参照、M1/M1纯合基因型质控参照、W1/M1杂合基因型质控参照、M2/M2纯合基因型质控参照、W2/W2纯合基因型质控参照、W2/M2杂合基因型质控参照。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质控参照为分别重组了核苷酸如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7或SEQ IDNo.8所示序列的重组质粒的一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质控参照为分别重组了核苷酸如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4的重组质粒的混合物、分别重组了核苷酸如SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示序列的重组质粒的混合物。
5.一种检测人细胞色素P450CYP2C19基因突变的试剂盒，包含PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序反应试剂、质控参照品和测序产物纯化试剂，其特征在于，PCR扩增引物为检测M1突变引物和检测M2突变引物，所述检测M1突变引物核苷酸分别如SEQID No.1、SEQ ID No.2所示，所述检测M2突变引物核苷酸分别如SEQID No.5、SEQ ID No.6所示；测序引物核苷酸如SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10所示。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述质控参照品包含W1/W1纯合基因型质控参照、M1/M1纯合基因型质控参照、W1/M1杂合基因型质控参照、M2/M2纯合基因型质控参照、W2/W2纯合基因型质控参照、W2/M2杂合基因型质控参照。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述质控参照为分别重组了核苷酸如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4的重组质粒的混合物或分别重组了核苷酸如SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示序列的重组质粒的混合物或任一种重组质粒。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂含pH8.3-8.8的Tris.Cl、DCl、MgCl2、二硫苏糖醇、Triton X-100、dNTP混合液、正向和反向引物对、Taq DNA聚合酶、DMSO和甘油。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR纯化试剂包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA测序反应试剂包含BigDye染料、ddNTP和dNTP混合液、测序酶、测序引物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010106092174A CN102140510A (zh) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | 一种检测人细胞色素p450 cyp2c19基因突变的方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010106092174A CN102140510A (zh) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | 一种检测人细胞色素p450 cyp2c19基因突变的方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102140510A true CN102140510A (zh) | 2011-08-03 |
Family
ID=44408304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010106092174A Pending CN102140510A (zh) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | 一种检测人细胞色素p450 cyp2c19基因突变的方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102140510A (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102534005A (zh) * | 2012-01-14 | 2012-07-04 | 长沙三济生物科技有限公司 | 一种检测cyp2c19基因分型的荧光pcr试剂盒 |
| CN103555826A (zh) * | 2013-09-27 | 2014-02-05 | 合肥艾迪康临床检验所有限公司 | 检测mlh1基因第12外显子突变的引物、方法和试剂盒 |
| CN103923988A (zh) * | 2014-04-04 | 2014-07-16 | 宋竞岩 | 用于检测等位基因cyp2c19*2的引物组合及检测试剂盒 |
| CN104711345A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-17 | 重庆京因生物科技有限责任公司 | Cyp2c19*2基因型快速检测试剂盒及其方法 |
| CN105039532A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-11-11 | 南昌艾迪康临床检验所有限公司 | 一种检测etv6基因cds区域的引物和方法 |
| CN105506107A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-20 | 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 | 检测dock2基因多态热点突变情况的引物和方法 |
| CN109706234A (zh) * | 2017-10-26 | 2019-05-03 | 山东中科翰康医学检验有限公司 | 解热镇痛类药物个性化基因检测试剂盒 |
| CN110564827A (zh) * | 2019-09-19 | 2019-12-13 | 合肥艾迪康医学检验实验室有限公司 | 检测dnmt3a基因突变的引物、试剂盒和方法 |
| CN110669829A (zh) * | 2019-10-19 | 2020-01-10 | 南京艾迪康医学检验所有限公司 | 检测FANCA基因第14号外显子突变位点c.1235C＞T的引物和方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101525654A (zh) * | 2008-03-07 | 2009-09-09 | 樊世斌 | Cyp2c19基因分型荧光定量检测方法 |
| CN101851652A (zh) * | 2010-04-27 | 2010-10-06 | 上海交通大学 | 基于微阵列芯片的通用多重聚合酶链式反应的实现方法 |
-
2010
- 2010-12-27 CN CN2010106092174A patent/CN102140510A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101525654A (zh) * | 2008-03-07 | 2009-09-09 | 樊世斌 | Cyp2c19基因分型荧光定量检测方法 |
| CN101851652A (zh) * | 2010-04-27 | 2010-10-06 | 上海交通大学 | 基于微阵列芯片的通用多重聚合酶链式反应的实现方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 薛丽等: "AS-PCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性", 《海南医学院学报》, vol. 16, no. 9, 28 September 2010 (2010-09-28) * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102534005A (zh) * | 2012-01-14 | 2012-07-04 | 长沙三济生物科技有限公司 | 一种检测cyp2c19基因分型的荧光pcr试剂盒 |
| CN103555826A (zh) * | 2013-09-27 | 2014-02-05 | 合肥艾迪康临床检验所有限公司 | 检测mlh1基因第12外显子突变的引物、方法和试剂盒 |
| CN103923988A (zh) * | 2014-04-04 | 2014-07-16 | 宋竞岩 | 用于检测等位基因cyp2c19*2的引物组合及检测试剂盒 |
| CN103923988B (zh) * | 2014-04-04 | 2016-08-24 | 宋竞岩 | 用于检测等位基因cyp2c19*2的引物组合及检测试剂盒 |
| CN104711345A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-17 | 重庆京因生物科技有限责任公司 | Cyp2c19*2基因型快速检测试剂盒及其方法 |
| CN105039532A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-11-11 | 南昌艾迪康临床检验所有限公司 | 一种检测etv6基因cds区域的引物和方法 |
| CN105506107A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-20 | 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 | 检测dock2基因多态热点突变情况的引物和方法 |
| CN109706234A (zh) * | 2017-10-26 | 2019-05-03 | 山东中科翰康医学检验有限公司 | 解热镇痛类药物个性化基因检测试剂盒 |
| CN110564827A (zh) * | 2019-09-19 | 2019-12-13 | 合肥艾迪康医学检验实验室有限公司 | 检测dnmt3a基因突变的引物、试剂盒和方法 |
| CN110669829A (zh) * | 2019-10-19 | 2020-01-10 | 南京艾迪康医学检验所有限公司 | 检测FANCA基因第14号外显子突变位点c.1235C＞T的引物和方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102140510A (zh) | 一种检测人细胞色素p450 cyp2c19基因突变的方法及试剂盒 | |
| Seino et al. | Human insulin-receptor gene: partial sequence and amplification of exons by polymerase chain reaction | |
| Crabb et al. | Overview of the role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase and their variants in the genesis of alcohol-related pathology | |
| Guan et al. | Genome structure variation analyses of peach reveal population dynamics and a 1.67 Mb causal inversion for fruit shape | |
| Trivier et al. | Mutations in the kinase Rsk-2 associated with Coffin-Lowry syndrome | |
| Fukushima-Uesaka et al. | Genetic variations and haplotypes of CYP2C19 in a Japanese population | |
| Agrawal et al. | The genetics of addiction—a translational perspective | |
| Iida et al. | Catalog of 320 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in 20 quinone oxidoreductase and sulfotransferase genes | |
| CN101525654A (zh) | Cyp2c19基因分型荧光定量检测方法 | |
| CN109868314B (zh) | 一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒及检测方法 | |
| CN110679548B (zh) | 一种自闭症小鼠模型的构建方法 | |
| CN112852976B (zh) | 蛋鸡ncs1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记及其应用 | |
| CN110205388B (zh) | 鸡mmp-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状选育中的应用 | |
| Liu et al. | NCAPG is differentially expressed during longissimus muscle development and is associated with growth traits in Chinese Qinchuan beef cattle | |
| Galavi et al. | Association study of SREBF-2 gene polymorphisms and the risk of type 2 diabetes in a sample of Iranian population | |
| Saeki et al. | Genetic polymorphisms of UGT1A6 in a Japanese population | |
| Zhao et al. | Association between MYH9 and APOL1 gene polymorphisms and the risk of diabetic kidney disease in patients with type 2 diabetes in a Chinese Han population | |
| JP2010519895A (ja) | クローン病座位における遺伝子型を決定する方法 | |
| TW200401035A (en) | The IL-1 gene cluster and associated inflammatory polymorphisms and haplotypes | |
| Kinoshita et al. | No association with the calcineurin A gamma subunit gene (PPP3CC) haplotype to Japanese schizophrenia | |
| Alvarez et al. | Growth hormone locus expands and diverges after the separation of New and Old World Monkeys | |
| AU2005264056A1 (en) | Novel allelic variant of CYP2C19 associated with drug metabolism | |
| Leh et al. | Cloning and expression of a novel type (III) of human γ-glutamyltransferase truncated mRNA | |
| Wang et al. | Identification of polymorphism on leptin receptor gene of goats in southwest China | |
| Li et al. | Relationship between the polymorphisms of 5'regulation region of prolactin gene and milk traits in Chinese Holstein dairy cows |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110803 |