CN109868314B

CN109868314B - 一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒及检测方法

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Publication number: CN109868314B
Application number: CN201811634897.8A
Authority: CN
Inventors: 郭惠民; 张郁; 陈琦; 张盼; 胡志刚
Original assignee: Zhejiang Dispect Diagnosis Technology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Dispect Diagnosis Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2020-03-03
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109868314A

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒及检测方法，试剂盒包括11种基因17个突变位点的检测试剂，针对11种基因出现的异常的基因变异位点，设计每个位点的扩增引物和单碱基延伸引物，通过多重PCR和多重单碱基延伸反应，进而进行质谱分析其特异性的产物，判定每一个位点的基因型，其检测特异性强、灵敏度高，可应用于科研、药物疗效研究、心血管疾病相关调查、以及心血管临床用药指导。

Description

一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，具体涉及人类样本中心血管疾病用药相关的11种基因17个突变位点的检测。针对十一种基因出现的异常的基因变异位点，设计每个位点的扩增引物和单碱基延伸引物，通过多重PCR和多重单碱基延伸反应，进而进行质谱分析其特异性的产物，判定每一个位点的基因型。

背景技术

心血管疾病严重威胁着中国人的健康，具有患者基数大，死亡率高的特点。根据《中国心血管病报告2017》数据，我国心血管疾病患者约有2.9亿人，其中脑卒中1300万人，冠心病1100万人，心力衰竭450万人，先天性心脏病200万人，高血压2.7亿人。心血管疾病是居民因病死亡的首要因素，占居民疾病死亡总数的40％以上，高于肿瘤及其他疾病致死人数。而在心血管临床治疗过程中发现，不同的心血管疾病患者对于药物治疗存在明显差异。导致个体差异的原因有很多，而遗传因素是引起个体差异的重要原因。

临床用药经历了经验用药阶段，询证用药阶段，到现在逐渐发展为个性化用药阶段。药物基因组学正是通过研究药物代谢酶基因、药物受体基因、药物转运蛋白基因等影响药物作用的遗传因素，阐明不同基因型对药物药效和毒性的不同反应，进而为携带不同基因型的个体临床用药提供指导。通过差异化的用药指导，可以降低患者不良心血管事件发生的风险，以期达到“精准医疗”、“个性化用药”、“合理用药”的目标。

心血管疾病药物基因组学是当前热点领域。一些主要的基因变异对华法林、氯吡格雷、硝酸甘油、高血压治疗相关、他汀类等药物的代谢、药动学、药效学有重要影响。许多基因变异由全基因组关联性研究发现，并经大型临床队列研究或随机对照研究验证，具有比较明确的循证医学证据。

华法林是香豆素类抗凝剂的一种，主要用于血栓栓塞性疾病的防治。华法林在临床上较为常用，但是其治疗窗窄、个体用药差异大，血药浓度过高或敏感性增加可导致严重出血事件，因此使用准确的剂量对于患者安全而言至关重要。氯吡格雷是一种抗血小板药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。心脏支架手术后的患者需长期服用氯吡格雷以防止支架内再梗。氯吡格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。氯吡格雷对血小板聚集的抑制作用存在很大的个体差异，血小板抑制程度不足增加主要不良心血管事件风险，而过度抑制可增加出血风险。诸多证据表明 CYP2C19基因型与接受氯吡格雷治疗的冠心病患者的临床终点事件有相关性。自2009年《新英格兰医学杂志》等权威杂志发表了包括全基因组关联性研究在内的多篇文章，研究结果表明氯吡格雷活化关键酶基因CYP2C19*2功能性等位基因丢失影响抗血小板效应和心血管不良事件发生率。基于此，美国FDA在2010年3月发布了氯吡格雷抵抗的“黑框警告”：应用氯吡格雷后出现主要心血管不良事件与CYP2C19无功能的等位基因有关。氯吡格雷在体内先是转化成无活性的二氧基氯吡格雷，再经第二步转化成活性产物，CYP3A4/5、CYP2C19、CYP2B6 和CYP2B9等酶可能参与其代谢过程。其中，除CYP2C19酶在代谢中的作用得到明确证实外，其余3种酶对氯吡格雷的活化是否有影响尚缺乏明确的理论依据。CYP2C19基因多态性较复杂，其中*1为野生型，携带者酶功能正常，属于快代谢型；CYP2C19*2、*3、*4、*5、*6、 *7、*8为缺失型，携带者酶功能异常，属于慢代谢型；CYP2C19*17可增加酶的表达量，属于超快代谢型。携带上述任何2个慢代谢型等位基因的患者服用氯吡格雷后，体内活性代谢产物的血浆浓度较低，血小板抑制率也较低，主要心血管不良事件发生率将明显增加。

硝酸甘油在医药上用作血管扩张剂，其作用机理为扩张小动脉和小静脉，但扩张小静脉的作用超过小动脉。制成0.3％硝酸甘油片剂，舌下给药，吞服无效，作用迅速而短暂，效果极强。用于治疗冠状动脉狭窄引起的急性心绞痛，如多次服用会降低药效，血压过低及有服用威而钢等会使血管扩张的药物时，可能引发昏倒甚至休克。对于冠状动脉堵塞无效。线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)同时具有乙醛脱氢酶和酯酶活性，参与乙醇、硝酸甘油等药物的代谢。ALDH2代谢活化硝酸甘油成其活性代谢产物一氧化氮，ALDH2*2(Glu504Lys，rs671) 多态导致所编码蛋白质504位谷氨酸被赖氨酸所取代，携带突变等位基因(ALDH2*2)的个体ALDH2酶活性下降，杂合子个体酶活性仅为野生型个体的10％，突变纯合子个体酶活性缺失。因此，携带ALDH2*2等位基因的个体酒精代谢能力下降，少量饮酒即出现脸红、心跳加速等不适；代谢硝酸甘油的能力下降，硝酸甘油抗心肌缺血的效应减弱。亚洲人群中 ALDH2*2等位基因的携带率为30～50％。携带ALDH2*2等位基因的心绞痛患者应尽可能改用其他急救药物，避免硝酸甘油含服无效。

目前治疗高血压相关的药物有β受体阻滞剂，血管紧张素转换酶抑制剂，血管紧张素II 受体拮抗剂，以及补充叶酸用于治疗H型高血压的患者。

β受体阻滞剂常用于治疗冠心病、心力衰竭和高血压等心血管疾病，在降低心力衰竭患者改善心功能和死亡率方面发挥重要作用。β受体阻滞剂的有效性和不良反应个体差异较大，如仅有约50％的高血压患者对其治疗有反应。基因变异是影响β受体阻滞剂个体差异的重要因素，相关基因主要为CYP2D6，CYP2D6*10(100C>T)在中国人中突变频率为50％～70％，而CYP2D6*3、*4、*5较少见，突变频率小于3％。导致CYP2D6酶活性缺失的多态性可影响β受体阻滞剂如美托洛尔和卡维地洛等的体内代谢，从而影响这些药物的疗效和不良反应的发生，临床需根据个体的基因型进行剂量的调整。

血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是肾素-血管紧张素系统的关键酶，也是ACE抑制剂(ACE inhibitor，ACEI)的作用靶点。ACE基因位于17号染色体 17q23，其内含子16存在288bp的Alu插入(Insertion)/缺失(Deletion)多态性导致三种基因型：II(插入纯合子)、ID(插入缺失杂合子)和DD(缺失纯合子)，白种人、黑中人和亚洲人群中D等位基因频率分别为56.2％、60.3％和39.0％。ACE I/D多态性可影响血浆 ACE的水平，DD基因型个体血浆ACE的活性升高，血管紧张素转化酶抑制剂如依那普利治疗后ACE活性下降更明显；在初治的高血压患者中，DD型患者福辛普利的降压疗效增强；在高血压合并左心室肥大和舒张期充盈障碍的患者中，DD基因型患者服用依那普利和赖诺普利后心功能改善程度优于ID和II基因型患者；II基因型患者应用赖诺普利或卡托普利时肾功能下降更明显。

氯沙坦是一种常用的血管紧张素II受体拮抗剂类抗高血压药物，在体内主要经CYP2C9 代谢活化为具有降压作用的代谢产物E-3174。携带CYP2C9*3等位基因的个体服用洛沙坦后 E-3174的生成减少，氯沙坦的代谢率降低。口服单剂量氯沙坦后1h～6h后，CYP2C9*1/*3基因型个体中氯沙坦的降压作用下降，需适当增加用药剂量以增强降压疗效。在药效学方面，有2项研究发现在肝硬化和门静脉高压患者中，携带AGTR1 1166AA基因型患者对氯沙坦治疗的降压效果比CC型更好。中国科技大学的研究显示，在中国人群中，CYP2C9*3的携带者对厄贝沙坦的代谢明显减慢。

叶酸，即维生素B9，在人体内可以通过5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)进行代谢，为核苷酸合成和DNA甲基化等重要生物学反应提供甲基，并参与维持正常的同型半胱氨酸水平。其代谢酶的编码基因MTHFR的不同基因型影响了酶活性的高低，进而影响叶酸的代谢及发生高同型半胱氨酸血症的风险。中国高血压人群中75％伴高同型半胱氨酸(Hcy)。 Hcy与卒中发生显著相关，并显著影响降压药物的疗效。Hcy水平平均升高1.93μmol/L，卒中的发生率增减26％，降低Hcy水平可显著降低高血压人群卒中的发生率。

他汀类药物能够竞争性抑制HMG-CoA还原酶，是降血脂的一线治疗药物。一般认为他汀类药物安全性较高、耐受性好，在临床应用广泛，能够显著降低死亡率。但是，他汀类药物的有效性和毒性反应存在较大个体差异。服用他汀类药物最常出现的毒副作用是肌毒性， 5％～15％的患者表现为肌痛等症状，极少数(0.1％)出现严重危害生命的横纹肌溶解。大量研究表明SLCO1B1基因变异与他汀引起的肌肉毒性有显著关联，SLCO1B1外显子6的T>C 突变(rs4149056)可导致蛋白质174位缬氨酸被丙氨酸代替，与服用辛伐他汀的患者发生肌痛显著相关。早期对辛伐他汀导致严重肌病的GWAS发现，*5变异使患者发生严重肌病的风险增加了4.4倍，结果在独立的12,000例患者中得到验证。随后，大量研究证实了SLCO1B1*5可增加辛伐他汀引起的肌毒性。美国FDA和美国临床药物基因组学实施联盟(CPIC)指南指出，SLCO1B1位点rs4149056T>C基因变异可增加辛伐他汀肌肉毒性，使用辛伐他汀前推荐作基因型检测。中国冠心病患者中，SLCO1B1(rs4149056，521T>C)与他汀类药物诱导的肌肉毒性有关，且SLCO1B1 521C突变等位基因增加了瑞舒伐他汀相关肌毒性的风险。DeGorter MKel的研究指出，阿托伐他汀的血药浓度跟SLCO1B1c.388A>G相关。在药效学通路，他汀类药物对携带APOE E2基因型的患者降低LDL作用较携带E3和E4 的患者强，而E4基因型患者死亡风险和不良反应发生率较低。基因中研究最多的2个变异体是rs7412和rs429358。在对38,000例接受他汀治疗的患者进行的荟萃分析中，与rs7412 连锁不平衡的APOE变异在全基因组关联研究中出现最为显著，与非携带者相比，其LDL-C 降低了5％。对18,705人进行的大规模候选基因研究也显示，每个rs7412等位基因引起LDL-C 降低近3％。

在心血管药物相关基因分型检测方面，目前国内市场主要针对FDA明确规定的基因、 CIPC指南中的基因以及国家卫计委指南中的部分基因进行的检测，主要包括CYP2C19、CYP2C9、VKORC1、APOE、SLCO1B1等基因。而用药相关基因分型检测的技术手段，目前有很多，如直接测序法、荧光定量PCR法、基因芯片法、高通量测序等。这些检测方法均存在各种不同程度的缺陷，如操作过程繁琐、重复性差、结果不易判读、检测位点少、检测通量低、检测周期长、检测费用高等。急需一种快速、稳定、通量合适、价格低廉且操作简便的检测方法，方便检测技术人员，免除患者多次重复检测的经济和精神负担。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种高效的心血管疾病用药相关基因位点变异的试剂盒和检测方法，在单个反应体系中，通过扩增17个心血管疾病用药相关的变异位点，再在变异位点处进行单碱基延伸，使用ddNTP作为延伸原料，使在变异位点处延伸一个碱基。延伸的产物经过脱盐纯化后进一步通过飞行时间质谱检测，不同位点、不同变异所延伸的产物分子质量不同，其在真空管中飞行的速度不同，借以来判断产物分子质量的大小，从而判断位点的基因型。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的目的之一在于提供一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，包括11种基因17 个突变位点的检测试剂，所述11种基因17个突变位点为VKORC1基因c.1173C>T和 c.-1639G>A位点，CYP2C9基因c.430C>T和c.1075A>C位点；CYP2D6基因c.100C>T位点， ADRB1基因c.1165G>C位点，ACE基因I/D位点，AGTR1基因c.1166A>C位点，MTHFR 基因C677T位点，SLCO1B1基因c.388A>G和c.521T>C位点，APOE基因c.388T>C和 c.526C>T位点，CYP2C19基因c.681G>A、c.636G>A和c.-806C>T位点，ALDH2基因 c.1510G>A位点。

优选的，所述11种基因17个突变位点的检测试剂含有SEQ ID NO.1与SEQ IDNO.2， SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7与SEQ IDNO.8， SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13与SEQID NO.14，SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24，SEQ IDNO.25与SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30 或SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32与SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.34与SEQ ID NO.35所示的引物对。

优选的，所述11种基因17个突变位点的检测试剂还包括单碱基核酸引物，所述单碱基核酸引物如SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.52所示。

优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包含10×PCR Bufferwith 20mM，25mM MgCl₂，25mM dNTP Mix，0.5μM Primer Mix和5U/μl PCR Enzyme。

优选的，所述试剂盒还包括SAP酶消化处理试剂，所述SAP酶消化处理包括SAPBuffer 和SAP Enzyme。

优选的，所述试剂盒还包括单碱基延伸反应试剂，所述单碱基延伸反应试剂包括iPLEX Buffer、iPLEX Termination mix、Extend Primer Mix和iPLEX Enzyme。

本发明的目的之二在于提供所述试剂盒用于检测心血管疾病用药相关基因的方法，包括如下步骤：

所述试剂盒用于检测心血管疾病用药相关基因的方法，包括如下步骤：

1)制备待测样本基因组DNA，所以样本为来源于人的，血液、唾液、口腔拭子、发根；

2)以提取的基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.35所示引物混合一管后进行多重PCR扩增，扩增产物进行SAP酶消化处理，再使用SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.52所示单碱基延伸引物混合一管后进行单碱基延伸反应，反应结束后使用基质辅助激光解离吸附电离飞行时间质谱，最后Typer软件分析检测位点的基因型。

优选的，步骤2)中，所述PCR扩增的条件为95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃后延伸5min。

优选的，所述SAP酶消化处理的条件为37℃保温40min；85℃保温5min。

优选的，所述单碱基延伸反应的条件为95℃预变性30s；95℃变性5sec，52℃退火5sec， 80℃延伸5sec，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。

本发明的有益效果在于：本发明通过大量文献以及国内心血管疾病用药的市场调研，选取了覆盖目前一线心血管疾病治疗的药物代谢与药物靶点基因。通过设计多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物，结合基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术，实现了在一个孔里进行17 个多态性位点的同时检测，并且其检测特异性强、灵敏度高，可应用于科研、药物疗效研究、心血管疾病相关调查、以及心血管临床用药指导。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为ACE I/D位点引物优化前后杂合样本的质谱分析图(A：ACE I/D引物优化前；B： ACE I/D引物优化后)。

图2为APOE c.388T>C位点引物优化前后纯合突变样本的质谱分析图(A：c.388T>C引物优化前；B：c.388T>C引物优化后)。

图3为华法林用药相关位点质谱分析图(A：c.1173C>T；B：c.-1639G>A；C：c.430C>T； D：c.1075A>C)。

图4为高血压疾病药物代谢相关基因位点质谱分析图(A:c.100C>T；B：I/D；C：c.1165G>C；D：1075A>C；E：c.430C>T；F：c.1166A>C；G：C677T)。

图5为他汀类药物代谢相关基因位点质谱分析图(A：c.521T>C；B：c.388T>C；C：c.526C>T； D：c.388A>G；)。

图6为氯吡格雷药物代谢相关的位点质谱分析图(A：c.681G>A；B：c.636G>A；C：c.-806C>T)。

图7为硝酸甘油药物代谢相关的位点质谱分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

基于大量研究和实验，最终选择了11个基因的17个变异位点：VKORC1(c.1173C>T、c.-1639G>A)，CYP2C9(c.430C＞T、c.1075A＞C)，CYP2C19(c.681G>A、c.636G>A、 c.-806C>T)，ALDH2(c.1510G＞A)，CYP2D6(c.100C>T)，ADRB1(c.1165G>C)，AGTR1 (c.1166A>C)，ACE(289bp deletion)，MTHFR(c.665C>T)，APOE(c.388T＞C、c.526C>T)， SLCO1B1(c.388A>G、c.521T>C)。这些位点覆盖了对华法林、氯吡格雷、高血压治疗药物、硝酸甘油、他汀类五大类一线心血管用药基因的常见变异位点。

通过设计覆盖以上位点的多重PCR引物和单碱基延伸引物，结合基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱技术，进行位点的高效、准确、低成本、快速的检测，设计的引物序列如表1 所示，单碱基延伸引物如表2所示：

表1、多重PCR引物

表2、单碱基延伸引物

本实施例中所用到的试剂：天根全血抽提试剂盒(DP348-02)、

Pro，PCRReagent And

Kit CPM(10x384)。多重PCR和延伸引物合成自上海百力格生物技术有限公司，每管5 OD。

样本制备：

a)标本采集：全血标本为常规取5ml静脉血于EDTA抗凝管中，取血后可立即检测，也可于4℃保存后续使用。

b)全血基因组DNA的提取：参考天根全血抽提试剂盒(DP348-02)提取说明书步骤，提取后DNA的吸光度OD260/280在1.7-2.0之间，然后将样本稀释至10ng/μL，以用于下一步PCR反应。

引物稀释：

a)多重扩增的引物干粉后用超纯水溶解制备成100μM贮存液，混合使每一条扩增引物的终浓度为0.5μM。

b)延伸引物的干粉用超纯水溶解制备成500μM的贮存液，混合配制后在质谱仪上调整至每一个引物峰高相对均一为止，即最低峰高大于最高峰高的二分之一。

检测方法：

a)PCR扩增：

配制如下反应体系：

PCR扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，42个循环；72℃后延伸5min。

SAP酶消化处理，酶切反应体系如下：

将其加入至第一轮5μL的反应产物中，共7μL，进行如下反应：37℃保温40min；85℃保温5min；

单碱基延伸反应，配制如下反应体系：

将其加入至上一轮7μL的反应产物中，共9μL，进行如下反应：95℃预变性30s；95℃变性5sec，52℃退火5sec，80℃延伸5sec，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。

延伸反应结束后，往产物里加入12μL超纯水。本次实验使用的是带有芯片准备模块的全自动384孔模块系统(CPM384)。将其转移到核酸质谱仪的芯片准备模块，将一块芯片也放入模块，设置好程序，机器自动进行产物脱盐、点样芯片，和产物飞行步骤。飞行结束后，在机器自带的Typer软件分析数据。

两个优化实验的案例：

1、ACE I/D位点为289bp的缺失，引物设计难度高，最初设计的单对引物效果如图1中 A所示，采用I/D的杂合样本做实验，上图为引物优化前，I型(插入型)位点的峰值很低，难以判断杂合型，做了引物的优化并且使用了双R端引物策略，优化后结果清晰可辨，如图1中B所示。

2、APOE c.388T>C位点处序列GC含量在75％以上，引物设计难度大，用纯合突变CC型的DNA作为样本，最初的引物测试得到的结果如下图2中A所示，无法得到C的阳性峰，通过多次设计优化，最终得到了理想的结果，如下图2中B所示。

实施例1、检测华法林用药相关的解读

打开Typer4.0软件，分析华法林用药相关位点，如图3，得到判读结果如表3所示。

表3、华法林用药相关的位点结果解读

表4、华法林用药相关位点分析

根据VKORC1和CYP2C9联合基因型建议的华法林初始用药剂量(mg)¹

华法林稳定剂量D(mg/day)＝[1.432+0.338×(VKORC1-1639AG)+0.579×(VKORC1-1639GG)–0.263×(CYP2C9*1*3)–0.852×(CYP2C9*3*3)-0.004 Age+0.264×BSA+0.057×AVR+0.065×Sex+0.085×Smoking habit+0.057×Atrial fibrillation+0.132×Aspirin-0.0592× Amiodarone]

注解：VKORC1-1639AG表示患者为-1639AG基因型时取值为1，为-1639AA或 -1639GG基因型取值为0；VKORC1-1639GG表示患者为-1639GG基因型时取值为1，为 -1639AA或-1639AG基因型取值为0；CYP2C9*1*3表示患者为CYP2C9*1*3基因型是取值为1，为CYP2C9*1*1或CYP2C9*3*3基因型是取值为0；CYP2C9*3*3表示患者为 CYP2C9*3*3基因型是取值为1，为CYP2C9*1*1或CYP2C9*1*3基因型是取值为0；Age 表示年龄，取整岁；BSA表示体表面积，BSA＝0.0061×身高+0.0128×体重-0.1529；AVR表示当患者置换了主动脉瓣膜时取1；Sex表示当患者性别为男时取1，为女时取0；Smoking habit表示有吸烟史时取值为1，不吸烟时取值为0；Atrial fibrillation表示患者合并有房颤时取值为1，不合并有房颤患者取值为0；Aspirin表示患者同时服用阿司匹林时取值为1，不服用时取值为0；Amiodarone表示患者同时服用胺碘酮时取值为1，不服用时取值为0。

此类型患者，使用标准剂量华法林，由于过度抗凝引起的出血危险很高，需要需适当降低用量或监控出血事件。

实施例2、高血压疾病药物代谢相关基因的位点解读

用Typer 4.0软件分析高血压疾病药物代谢相关基因的位点，如图4，解读结果见表5。

表5、高血压疾病药物代谢相关基因结果解读

实施例3、他汀类药物代谢相关基因的位点解析

用Typer 4.0软件分析他汀类药物代谢代谢相关基因的位点，如图5，结果见表6。

表6、他汀类药物代谢相关基因的位点结果解读

实施例4：检测氯吡格雷药物代谢相关的位点

用Typer 4.0软件分析氯吡格雷药物代谢代谢相关基因的位点，如图6，结果见表7。

表7、氯吡格雷药物代谢相关的位点结果解读

实施例5、检硝酸甘油药物代谢相关的位点

用Typer 4.0软件分析硝酸甘油药物代谢代谢相关基因的位点，如图7，结果见表8。

表5、硝酸甘油药物代谢相关的位点结果解读

实施例6、特异性实例

该实施例选用10例全血标本，分别用本研究的方法测试，以及sanger测序的方法进行验证，验证结果与本方法100％一致。

以一例结果为例，质谱法检测的结果如下表6所示：

表6、质谱法检测结果

同时用测序的金标准方法如下：

1)样本制备操作方法与上述相同

2)PCR扩增试剂使用：Promega的Go Taq Hot Start Polymerase

3)引物制备

A)针对每一个位点设计相应的特异性引物

B)17对引物合成自上海百力格生物技术有限公司，每管5OD。

C)每管引物稀释至10μM

针对每个位点分别进行PCR扩增

4)将PCR产物送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果分析见下表7。

表7、测序结果

结论：Sanger测序法检测结果与核酸飞行质谱结果完全一致。

本方法优势：一孔反应检测所有17个位点，而测序方法需要17孔反应，工作量成本远高于本方法。

实施例7、灵敏度检测

本实施例选取了三份DNA样本,进行梯度稀释，起始DNA上样量分别为10ng、5ng、2.5ng、1ng、0.5ng、0.2ng、0.1ng，进行后续的PCR、消化、延伸和上机测试，三个样本的结果统计见下表8～10：

表8、样本1灵敏度检测结果

表9、样本2灵敏度检测结果

表10、样本3灵敏度检测结果

结果显示，在上样量低至0.2ng时，三个样本的所有位点均能正确检出，在上样量0.1ng 时，个别位点未能检出。说明本试剂盒在低至0.2ng的基因组DNA的情况下，可以将11个基因的17个位点一次性全部检出，具有非常高的灵敏度，也适合复杂样本或稀有样本的研究。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 浙江迪谱诊断技术有限公司

<120> 一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒及检测方法

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg tcctctgtgc ctggtgggg 29

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg gccatgtata aatgcccttc tc 32

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgttggatg aactgacccc ggtggcgga 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg cccggcctgg tacactgcca 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttggatg cagcaatgga aagaaatgga 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgttggatg cagtgatatg gagtagggtc 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgttggatg caagaagcct gcaccatgtt t 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgttggatg tcagagcttt agaaaagtcg 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgttggatg ggagtagcca cgtccgggcc 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgttggatg acctgggcta tcctctgttc 30

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgttggatg acatcgtcgt cgtcgtcgtc c 31

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgttggatg aaccccatca tctactgccg 30

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgttggatg ggcgctgatg gacgagacca tg 32

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgttggatg gagcatggcc tgcacctcg 29

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acgttggatg ctgagtcccc ggcaggtcct gaa 33

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgttggatg ttggtggcta caagatgtcg 30

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgttggatg tttggatacc ttcatgattc atata 35

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acgttggatg cggtgatggt agaggtttaa 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgttggatg gtcaagcaag agaagacctg 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acgttggatg gtcaagcaag agaagacctg 30

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acgttggatg cattttacct tctccatttt gatca 35

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgttggatg gatatgcaat aattttccca c 31

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgttggatg tccagatatt caccccatgg ctgtc 35

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

acgttggatg aacatcagga ttgtaagcac 30

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acgttggatg tggttctatt taatgtgaag cctgt 35

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgttggatg cgtggcgcat tatctcttac 30

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

acgttggatg taattaaatg tatacatttt agaag 35

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

acgttggatg gatgttctta cagttacagg 30

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acgttggatg cacgcccctc acaggactgc tga 33

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acgttgatgt ggccatcaca ttcgtcagat 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acgttgattg agaccatccc ggctaaaacg 30

<210> 32

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acgttggatg ttgtaaatta aaaaaaaata agta 34

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acgttggatg tatgggagtc tcccctattc 30

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

acgttggatg tgtggtctct tcatccctcg ccttg 35

<210> 35

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acgttggatg cacaaagcgg aagaatgtgt c 31

<210> 36

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tgggtacgag ctac 14

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gcgaccgtga tgacctgcag aag 23

<210> 38

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gaggagtatt gaggac 16

<210> 39

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tccacgccca aatgagc 17

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gccaggaaac catcgac 17

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ctcgcgcagc agagcagtc 19

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ctgacatgga ggacgtg 17

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ccacactcac agttttcact t 21

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

ctaacgaggt ccagagatac 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ccctcgtgag ccaccgcacc 20

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ccagtaattt gttatgggtt cc 22

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

acacttggcc ttacctggat 20

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ccgtgtcttc tgttctcaaa g 21

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gatgttgaat tttctgatga at 22

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gctgcctata cagtcacttt t 21

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

cttggtcata catgtggata tatg 24

<210> 52

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

aggtgtctgc gggag 15

Claims

1.一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，其特征在于：包括11种基因17个突变位点的检测试剂，所述11种基因17个突变位点为VKORC1基因c.1173C>T和c.-1639G>A位点，CYP2C9基因c.430C>T和c.1075A>C位点；CYP2D6基因c.100C>T位点，ADRB1基因c.1165G>C位点，ACE基因I/D位点，AGTR1基因c.1166A>C位点，MTHFR基因C677T位点，SLCO1B1基因c.388A>G和c.521T>C位点，APOE基因c.388T>C和c.526C>T位点，CYP2C19基因c.681G>A、c.636G>A和c.-806C>T位点，ALDH2基因c.1510G>A位点；检测所述11种基因17个突变位点的检测试剂含有SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5与SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11与SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17与SEQID NO.18，SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28，SEQ IDNO.29与SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32与SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.34与SEQ ID NO.35所示的引物对。

2.根据权利要求1所述一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，其特征在于：所述11种基因17个突变位点的检测试剂还包括单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物如SEQ IDNO.36～SEQ ID NO.52所示。

3.根据权利要求1所述一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包含10×PCR Buffer with 20mM，25mM MgCl₂，25mM dNTP Mix，0.5μM Primer Mix和5U/μl PCR Enzyme。

4.根据权利要求1所述一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SAP酶消化处理试剂，所述SAP酶消化处理包括SAP Buffer和SAP Enzyme。

5.根据权利要求1所述一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括单碱基延伸反应试剂，所述单碱基延伸反应试剂包括iPLEX Buffer、iPLEXTermination mix、Extend Primer Mix和iPLEX Enzyme。

6.权利要求1～5任一项所述试剂盒在制备用于检测心血管疾病用药相关基因的试剂中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

2)以提取的基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.35所示引物混合一管后进行多重PCR扩增，扩增产物进行SAP酶消化处理，再使用SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.52所示单碱基延伸引物混合一管后进行单碱基延伸反应，反应结束后使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，最后Typer软件分析检测位点的基因型。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤2)中，所述PCR扩增的条件为95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃后延伸5min。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述SAP酶消化处理的条件为37℃保温40min；85℃保温5min。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述单碱基延伸反应的条件为95℃预变性30s；95℃变性5sec，52℃退火5sec，80℃延伸5sec，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。