CN116515994A - 用于心血管疾病用药基因检测的引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及用于心血管疾病用药基因检测的引物组和试剂盒。本发明的引物组包含序列如SEQ ID NO.1‑56所示的多重PCR扩增引物。本发明提供的用于心血管疾病用药基因检测的引物组可实现28个心血管药物相关基因SNP位点的单管反应和同时检测，极大地提高了检测效率，显著降低了检测成本，具有较高的特异性、灵敏度和准确度，可用于心血管个体化用药基因检测，对于指导心血管个体化用药具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及用于心血管疾病用药基因检测的引物组和试剂盒。
背景技术
心血管疾病主要包括高血压、心力衰竭、心绞痛等。目前临床上常规使用的抗凝药、抗血小板药、降脂药、血管扩张药、他汀类、β受体阻滞剂及血管紧张素转换酶抑制剂等药物能够明显降低患者不良心血管事件风险，对改善患者预后具有重要意义。但是，心血管疾病患者对上述药物的治疗效果存在较大的个体差异。个体差异由多种原因造成，其中基因变异对药物个体差异有重要影响。药物基因组学研究以及药物疗效相关的基因多态性检测可以为临床选择合适的药物种类及药物剂量提供遗传证据，能够极大地提高心血管药物使用的安全有效性。
基因检测指导用药是现阶段尤为有效的基因诊断手段，可以精准定位于遗传物质的特殊性，实现个体化用药，联合使用药物基因库达到高效治愈的效果，但是目前出现的心血管基因诊断平台普遍存在局限性。
目前，已有的在心血管个体化用药检测方面的试剂盒大多是针对其他平台来开发和设计，现阶段主要采用的是PCR技术，PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速、对样本的纯度要求低等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术，但是以PCR为代表的低通量检测技术，尚存在检测位点数少，灵敏度不高，应用范围局限的缺陷，所检测的位点较少、通量低，无法满足复杂的基因指导用药检测。以NGS为代表的高通量测序技术尽管有可发现未知突变和致病基因的优势，但其检测成本高、周期长、质控难、操作复杂、可重复性不高，难以实现大规模临床应用，该方法虽然满足高通量检测基因位点的要求，但是存在报告周期长（通常需要7-9个工作日），对样本要求较高，需10ml外周血，应用局限性大。核酸质谱技术可检测的位点相对较少，检测时间也相对较长，无法满足目前的诊断需求。
上述心血管个体化用药检测试剂盒不能够满足现阶段人类个体化用药基因检测的需求，尤其是在现阶段越来越多的心血管相关疾病位点被发现的情况下，需要开发新的平台检测试剂盒进行多基因位点检测。
飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MASS）目前可检测35个左右基因型（例如AgenaBioscience公司的MassARRAY DNA飞行质谱分析系统可实现一次性扫描384个样本多达35-40个SNP位点），但目前该平台存在各个反应需要进行繁琐的体系配制问题，极大地增加了检测操作的繁琐性。因此，亟需开发能够满足大样本检测的应用需求、全自动分析数据、操作简单、检测结果准确性高、耗材成本和样本用量低的心血管个体化用药检测试剂盒。
发明内容
本发明提供用于心血管疾病用药基因检测的引物组和试剂盒。
本发明基于飞行时间质谱技术开发用于心血管疾病用药基因检测的引物组和试剂盒，该技术系统地整合了PCR技术的高特异性、芯片技术的高通量和质谱技术的高灵敏度，其通量能力能够满足大量检测的需求，检测时间短、具有低成本检测几百个基因突变的能力。本发明通过大量的筛选、优化和验证，获得了用于检测28个心血管药物相关基因SNP位点的引物组。本发明提供的引物组中的多重PCR扩增引物可实现在同一反应体系（单管反应）中对28个心血管药物相关基因SNP位点进行靶序列扩增。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供用于心血管疾病用药基因检测的引物组，所述引物组包含序列如SEQID NO.1-56所示的多重PCR扩增引物。
序列如SEQ ID NO.1-56所示的多重PCR扩增引物可在同一反应体系中对28个心血管药物相关基因SNP位点靶序列进行扩增，且具有较高的特异性、灵敏度和准确度。
单管反应能够极大地提高检测效率，但若有需要，本发明的上述多重PCR扩增引物也能够进行分管反应。
上述28个心血管药物相关基因SNP位点包括c.100C>T、C677T、c.482C>T、c.430C>T、c.1166A>C、c.-842A>G、c.1165G>C、c.388T>C、c.1510G>A、c.176T>C、c.1075A>C、c.1378G>T、c.-1639G>A、c.681G>A、c.1173C>T、c.636G>A、c.175-5285G>T、c.-806C>T、c.388A>G、g.32289560A>G、c.806-4288C>T、c.526C>T、c.1297G>A、c.521T>C、c.-444A>C、c.67A>G、I/D、g.31312326T>G。这些位点较为全面地覆盖了常用的心血管药物相关基因SNP位点，对于心血管个体化用药具有重要的指导意义。
以上所述的用于心血管疾病用药基因检测的引物组还包含序列如SEQ ID NO.57-84所示的单碱基延伸引物。
序列如SEQ ID NO.57-84所示的单碱基延伸引物可实现在同一反应体系中对28个心血管药物相关基因SNP位点进行单碱基延伸反应，具有较高的特异性和准确性。
本发明提供以上所述的用于心血管疾病用药基因检测的引物组在制备用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒中的应用。
本发明提供用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的用于心血管疾病用药基因检测的引物组。
上述引物组中，序列如SEQ ID NO.1-56所示的多重PCR扩增引物等浓度混合后得到多重PCR扩增引物混合液，序列如SEQ ID NO.57-84所示的单碱基延伸引物等浓度混合后得到单碱基延伸引物混合液。
所述试剂盒包含多重PCR扩增引物混合液和单碱基延伸引物混合液。
优选地，所述试剂盒还包含选自PCR反应试剂、SAP（虾碱性磷酸酶）反应试剂、UEP反应试剂、飞行时间质谱检测试剂、阴性质控品和阳性质控品中的一种或多种。
其中，PCR反应试剂包括PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶、水等。
SAP反应试剂包括SAP反应缓冲液、SAP酶、水等。
UEP反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水等。
飞行时间质谱检测试剂包括质谱芯片等。
以上所述的用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒基于飞行时间质谱技术对心血管疾病用药基因进行检测，所述检测包括：
以待测样本的基因组DNA为模板，采用多重PCR扩增引物进行多重PCR扩增，得到靶序列扩增产物；
将所述靶序列扩增产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物；
将所述SAP反应产物与UEP反应试剂和单碱基延伸引物混合进行UEP反应得到UEP反应产物；
采用飞行时间质谱对所述UEP反应产物的分子量进行检测，根据分子量标记确定待测样本中心血管疾病用药基因的基因型。
优选地，多重PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.15、16、35、36、41、42所示的各扩增引物的浓度均为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.43、44所示的各扩增引物的浓度均为0.18μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.51、52所示的各扩增引物的浓度均为0.2μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-14、17-34、37-40、45-50、53-56所示的各扩增引物的浓度均为0.1μmol/L。
优选地，UEP反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示的单碱基延伸引物的浓度为0.89μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.57-81、83-84所示的各单碱基延伸引物的浓度均为1μmol/L。
上述检测中，多重PCR的扩增反应程序包括：（1）95℃，2min；（2）95℃、30sec，60℃、30sec，72℃、1min，45个循环；（3）72℃，5min。
上述检测中，UEP反应程序包括：（1）95℃、30 sec；（2）以下程序40个循环：①95℃、5sec，②52℃、5sec，80℃、5sec，5个循环；（3）72℃、3min。
在获得UEP反应产物后还包括纯化所述UEP反应产物的步骤，将纯化后的UEP反应产物采用飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否存在某位点基因。
在本发明的一些实施方式中，所述飞行时间质谱系统为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统。
本发明提供一种基于飞行时间质谱法对心血管疾病用药基因进行检测的方法，所述方法包括：以待测样本的基因组DNA为模板，采用序列如SEQ ID NO.1-56所示的多重PCR扩增引物进行多重PCR扩增，得到靶序列扩增产物；
将所述靶序列扩增产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物；
将所述SAP反应产物与UEP反应试剂和序列如SEQ ID NO.57-84所示的单碱基延伸引物混合进行UEP反应得到UEP反应产物；
采用飞行时间质谱对所述UEP反应产物的分子量进行检测，根据分子量标记确定待测样本中心血管疾病用药基因的基因型。
上述方法中，多重PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.15、16、35、36、41、42所示的各扩增引物的浓度均为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.43、44所示的各扩增引物的浓度均为0.18μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.51、52所示的各扩增引物的浓度均为0.2μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-14、17-34、37-40、45-50、53-56所示的各扩增引物的浓度均为0.1μmol/L。
上述方法中，UEP反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示的单碱基延伸引物的浓度为0.89μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.57-81、83-84所示的各单碱基延伸引物的浓度均为1μmol/L。
上述方法中，多重PCR扩增的反应程序包括：（1）95℃，2min；（2）95℃、30sec，60℃、30sec，72℃、1min，45个循环；（3）72℃，5min。
上述方法中，UEP反应程序包括：（1）95℃，30 sec；（2）以下程序40个循环：①95℃、5sec，②52℃、5sec，80℃、5sec，5个循环；（3）72℃，3min。
本发明的有益效果至少包括：
（1）本发明提供的引物组能够检测28个心血管药物相关基因SNP位点，较为全面地覆盖了常用心血管药物相关基因SNP位点。
（2）本发明提供的引物组中的多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物均能够实现在同一反应体系中进行单管反应，实现28个心血管药物相关基因SNP位点的同时检测，极大地提高了检测效率，显著降低了检测成本。
（3）本发明提供的引物组中的多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物具有较高的特异性和准确度，配合飞行时间质谱技术能够高灵敏度地进行心血管药物相关基因检测，检测浓度可低至1000拷贝/mL。
（4）本发明提供的引物组配合飞行时间质谱技术进行基因检测，具有操作简单、检测效率高、检测成本低、检测结果稳定可靠、通量高等优势，可用于心血管个体化用药基因检测，对于指导心血管用药具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3中c.100C>T基因位点检测质谱峰图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中使用的飞行时间质谱 （DP-TOF）系统购于浙江迪谱公司，封口膜购于美国Thermo公司，脱盐树脂购于Agena公司。
实施例1 用于心血管疾病用药基因检测的引物组
针对28个心血管药物相关基因SNP位点设计多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物，经不断筛选、验证和优化，最终确定了28对多重PCR扩增引物和28条单碱基延伸引物，这些引物具有较高的扩增效率和特异性，在用于28个心血管药物相关基因SNP位点的单管反应检测时具有较高的特异性、灵敏度和准确度。上述28对多重PCR扩增引物的序列信息如表1所示，28条单碱基延伸引物的序列信息如表2所示。
表1
表2
实施例2 用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒
本实施例提供一种用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，其包括如下组分：
1、PCR混合液：包括10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP预混液、PCR酶，具体配置如表3所示。
表3
每个试剂盒配置450人份 PCR 混合液，900mL。
2、SAP混合液，包括SAP缓冲液、虾碱性磷酸酶，具体配置如表4所示。
表4
每个试剂盒配置450人份SAP混合液，为900mL。
3、UEP混合液：包括iPLEX缓冲液、iPLEX 延伸终止液、iPLEX酶，具体配置如表5所示。
表5
以上成分均来自Agena公司。
上述1-3中的各混合液在-15℃以下能够稳定保存12个月。
4、多重PCR扩增引物混合液：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-56所示的引物和超纯水，各引物投料初始浓度为100μmol/L；SEQ ID NO.15、16、35、36、41、42所示的各引物的投料终浓度为0.7μmol/L，每管加入体积为3.15μL，每个反应加入体积为0.007μL，SEQ IDNO.43、44所示的各引物的投料终浓度为0.9μmol/L，每管加入体积为4.05μL，每个反应加入体积为0.009μL，SEQ ID NO.51、52所示的各引物的投料终浓度为1.0μmol/L，每管加入体积为5.0μL，每个反应加入体积为0.010μL；其余各引物的投料终浓度均为0.5μmol/L，每管加入体积为2.25μL，每个反应加入体积为0.005μL；超纯水每管加入体积为255.6μL，每个反应加入体积为0.568μL；每个试剂盒配置多重PCR扩增引物混合液总体积为450μL（450人份），每个反应加入1μL。
5、单碱基延伸引物混合液：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.57-84所示的单碱基延伸引物，各条引物的投料初始浓度为500μmol/L，SEQ ID NO.82所示引物的终浓度为8μmol/L，每管加入体积为7.2μL，每个反应加入体积为0.016μL，其余各引物的终浓度均为9μmol/L，每管加入体积为8.1μL，每个反应加入体积为0.018μL；超纯水每管加入体积为214.2μL，每个反应加入体积为0.476μL；每管总体积为450μL，每个反应加入1μL。
每个试剂盒配置450人份延伸引物混合液，为450mL。
6、阴性质控品。
7、阳性质控品。
8、质谱芯片。
实施例3 基于飞行时间质谱技术检测心血管疾病用药基因的方法
本实施例提供一种基于飞行时间质谱技术检测心血管疾病用药基因的方法，该方法利用实施例2的试剂盒进行检测，包括如下步骤：
1、多重PCR扩增：通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列的扩增产物。
以待测样本DNA为模板，待测样本DNA可为口腔拭子、EDTA抗凝全血和干血片中提取的基因组DNA，要求DNA A260/A280比值应介于1.7~2.0之间。冷冻DNA样本应在-20℃以下，并且避免反复冻融。
在试剂准备区，从-20℃冰箱中取出PCR混合液、多重PCR扩增引物混合液，分别在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10s，充分混匀后，按表6的 PCR反应体系配制，分装至384 PCR反应板，3μL/孔，转移至样本处理区。
表6
在样本制备区，向PCR反应板中每孔加入2μL DNA模板，盖上PCR膜，涡旋震荡10s后简短离心，传至扩增区，每次实验时必须设定空白对照（2μL，ddH2O）、阴性对照（2μL，DNA提取洗脱液）和阳性对照。
将PCR反应板放入PCR仪，运行程序：PCR，具体程序如表7所示，反应结束后4℃保存。
表7
2、虾碱性磷酸酶（SAP）处理：使未结合的剩余核酸脱磷酸（dNTPs）失活，防止干扰下一步碱基延伸反应。
将SAP混合液2μL/孔分装至含PCR扩增产物（5μL）的反应板中（总体积7μL），用PCR膜封住，涡旋震荡10s后简短离心。
将反应板转移至PCR扩增仪进行反应，反应程序如下：37℃，40min；80℃，5min。反应结束后4℃保存。
3、单碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与延伸探针及其它延伸产物之间的分子量差异不小于16Da。
取出上一步反应结束的反应板离心，配制iPLEX延伸反应液（UEP混合液1μL，单碱基延伸引物混合液1μL，总体积9μL），加入反应板中，2μL/孔，用PCR膜封住，涡旋震荡10s后简短离心。
将反应板转移至PCR扩增仪进行反应，反应程序如表8所示，反应结束后4℃保存。
表8
反应结束后，瞬时离心，每孔加入16μL的灭菌注射用水（此时每孔内的总体积为25μL），换新的封板膜将反应板封住，震荡混匀后瞬时离心。
4、质谱检测
将纯化后的单碱基延伸反应产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，于迪谱诊断飞行时间质谱检测系统上，用脱盐树脂去除体系中的盐离子，后将延伸产物点样至质谱芯片，进行质谱检测。
5、结果判读
飞行时间质谱检测系统通过对离子捕获仪收集并储存脉冲信号，并对其进行质谱分析，通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异（ddATP=271.2，ddCTP=247.2，ddGTP=287.2，ddTTP=327.1）可得出模板序列的信息，从而实现基因位点的检测。
由于飞行时间质谱检测是通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异来对基因位点进行分型，当分析的基因位点结果为野生型或者纯合型时，模板序列的质量差异为0，因此显示的质谱峰图只出现单一的峰，若分析的基因位点结果为杂合型时，模板序列的质量有差异，因此显示的质谱峰图出现两个峰。
28个心血管药物相关基因SNP位点的基因型结果如表9所示。
表9
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作为示例，c.100C>T基因位点检测质谱峰图如图1所示。
实施例4 用于心血管疾病用药基因检测的引物组和试剂盒的性能分析
一、试剂盒的准确性与稳定性评价
1、实验方法
1.1样本选择
样本来源：选取已知基因型的心血管疾病临床样本进行检测，样本1的c.100T>C、c.176T>C位点基因结果为CT，样本2的基因型结果均为阴性。
1.2样本检测
按照实施例3的检测方法用实施例2的3批不同批次试剂盒检测以上1.1样本，每个样本设置3个副孔，样本1编号为1-3，样本2编号为4-6，每天测一次，连续测3天。
2、实验结果
结果如表10、表11所示，结果显示，18个质控品批内准确性评价检测结果中每个样本3次准确性试验结果均一致，表明实施例2的试剂盒的检测体系具有良好的准确性。18个质控品批间稳定性评价检测结果中每个样本3次检测结果均一致，表明本试剂盒的检测体系具有良好的稳定性。
表10
表11
二、试剂盒灵敏度评价
1、实验方法
1.1样本选择
样本来源：选取已知基因型的临床样本进行检测，临床样本的c.100T>C、c.176T>C位点基因结果为CT。用灭菌双蒸水将临床样本稀释5个梯度(5ng/μL、7.5ng/μL、10ng/μL、12.5ng/μL、15ng/μL)备用。
1.2样本检测
按照实施例3的检测方法用实施例2的3批不同批次试剂盒检测以上1.1的样本，每个批次及浓度设置3个副孔。
2、实验结果
结果如表12所示，在不同浓度梯度下样本的检测结果一致（+代表1个副孔结果可检出），试剂盒最低检测浓度在5ng/μL，说明试剂盒的准确性良好，灵敏度可达到5ng/μL。
表12
三、试剂盒分析特异性评价
1、实验方法
1.1样本选择
1.1.1抗干扰性样本选择
样本来源：选取已知基因型的临床样本进行检测，临床样本的c.100T>C、c.176T>C位点基因结果为CT，稀释好的内源性干扰物质血红素20.0 g/L，甘油三酯11.0 mmol/L，总胆红素60.0μmol/L；外源性干扰物质氯吡格雷300ng/mL、替格瑞洛627ng/mL、阿司匹林300ng/mL。
1.1.2交叉反应样本选择
样本来源：临床样本、混合大肠肝菌DNA的临床样本、具有c.100T>C、c.176T>C位点的其他突变序列混合的样本、CYP3A4基因等同源序列的混合样本。
1.2样本检测
1.2.1抗干扰性样本检测
按照实施例3的检测方法用实施例2的3批不同批次试剂盒检测以上1.1.1的样本。每个批次及干扰项设置3个副孔，共计54个循环。
1.2.2交叉反应样本检测
按照实施例3的检测方法用实施例2的3批不同批次试剂盒检测以上1.1.2的样本。每个批次及交叉反应项设置3个副孔，共计36个循环。
2、实验结果
2.1抗干扰性实验结果
如表13、表14所示，不同干扰物质对试剂盒检测结果无影响，说明该试剂盒具有良好的抗干扰能力。
表13
表14
2.2交叉反应实验结果
如表15所示，在不同的实验项目下，结果显示检测靶点之间不产生交叉反应，上述外源DNA、同源序列与检测靶点之间均不产生交叉反应，试剂盒的实验结果均符合要求。
表15
综上所述，该试剂盒具有良好的特异性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.用于心血管疾病用药基因检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含序列如SEQID NO.1-56所示的多重PCR扩增引物。
2.根据权利要求1所述的用于心血管疾病用药基因检测的引物组，其特征在于，所述引物组还包含序列如SEQ ID NO.57-84所示的单碱基延伸引物。
3.权利要求1或2所述的用于心血管疾病用药基因检测的引物组在制备用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒中的应用。
4.用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的用于心血管疾病用药基因检测的引物组。
5.根据权利要求4所述的用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含选自PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂、飞行时间质谱检测试剂、阴性质控品和阳性质控品中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒基于飞行时间质谱技术对心血管疾病用药基因进行检测，所述检测包括：
以待测样本的基因组DNA为模板，采用多重PCR扩增引物进行多重PCR扩增，得到靶序列扩增产物；
将所述靶序列扩增产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物；
将所述SAP反应产物与UEP反应试剂和单碱基延伸引物混合进行UEP反应得到UEP反应产物；
采用飞行时间质谱对所述UEP反应产物的分子量进行检测，根据分子量标记确定待测样本中心血管疾病用药基因的基因型。
7.根据权利要求6所述的用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，其特征在于，多重PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.15、16、35、36、41、42所示的各扩增引物的浓度均为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.43、44所示的各扩增引物的浓度均为0.18μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.51、52所示的各扩增引物的浓度均为0.2μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-14、17-34、37-40、45-50、53-56所示的各扩增引物的浓度均为0.1μmol/L。
8.根据权利要求6所述的用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，其特征在于，UEP反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示的单碱基延伸引物的浓度为0.89μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.57-81、83-84所示的各单碱基延伸引物的浓度均为1μmol/L。
9.根据权利要求6~8任一项所述的用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，其特征在于，多重PCR扩增的反应程序包括：（1）95℃，2min；（2）95℃、30sec，60℃、30sec，72℃、1min，45个循环；（3）72℃，5min。
10.根据权利要求6~8任一项所述的用于心血管疾病用药基因检测的试剂盒，其特征在于，UEP反应程序包括：（1）95℃，30 sec；（2）以下程序40个循环：①95℃、5sec，②52℃、5sec，80℃、5sec，5个循环；（3）72℃，3min。
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