CN111718986A

CN111718986A - Ptgs1基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN111718986A
Application number: CN201910208998.7A
Authority: CN
Inventors: 段朝晖; 盛司潼
Original assignee: Shenzhen China Gene Technologies Co ltd; Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Shenzhen China Gene Technologies Co ltd; Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2020-09-29

Abstract

本发明提供了PTGS1基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法，包括rs10306114位点的扩增引物对SEQ ID NO.1‑2；其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。本发明通过设计引物组，直接高通量测序方法直接检测待检SNP位点，避免测序后的复杂分析，提供一种简便的二代测序检测该位点的方法。

Description

PTGS1基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种PTGS1基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

PTGS1基因c.-842A>G(rs10306114)与阿司匹林治疗的效果密切相关。1)基因型为AA的患者使用阿司匹林治疗发生抵抗的风险比基因型为AG或GG的患者低。2)基因型为AG的患者使用阿司匹林治疗发生抵抗的风险比基因型为AA的患者高；3)基因型为GG的患者使用阿司匹林治疗发生抵抗的风险比基因型为AA的患者高。因此，对于基因型为AG或GG的患者，应调整阿司匹林的标准治疗方案，增加给药剂量或者换用其他药物，以达到较好的治疗效果。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有Sanger测序法、基因芯片杂交法、Taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法(Amplification Refractory MutationSystem Real Time PCR，ARMS-RT PCR)等。

sanger测序法结果准确，但检测步骤较多、操作繁琐、检测灵敏度较低；基因芯片杂交法的检测步骤较多、操作繁琐、检测灵敏度较低，还会存在假阳性的问题；Taqman荧光探针法，ARMS-RT PCR方法检测通量低。

CN106434943A公开了一种用于阿司匹林个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括检测PTGS1基因rs10306114位点的两条正向引物及一条反向引物，和检测CYP2C9基因rs1057910位点的两条正向引物和一条反向引物，和检测CYP2D6基因rs28360521位点的两条正向引物和一条反向引物，和检测CYP2C19基因rs12248560位点的两条正向引物和一条反向引物。该发明的试剂盒，可以对上述四个位点进行高通量检测，基因分型的结果可以通过软件直观的进行分辨，从而达到对阿司匹林计量量化的控制，最大程度的降低副作用的目的。

CN109207583A公开了一种检测阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒，包括以下成分:PTGS1(-842A>G)、ITGA2(759C>T)、ITGB3(176T>C)和PEAR1(-9-3996G>A)位点扩增和测序引物4对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂，各引物的核苷酸序列如SEQNO.5-12所示。本发明具有如下技术效果：提供了一种针对中国人群阿司匹林个体化用药的基因检测试剂盒，且灵敏度高准确率高。所述的试剂盒用于PTGS1(-842A>G)、ITGA2(759C>T)、ITGB3(176T>C)和PEAR1(-9-3996G>A)基因分型检测，通过该项目检测可以发现个体间的遗传差异，提前判断阿司匹林抵抗的风险情况，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗和预防心血管事件的发生。

因此，提供一种灵敏度高、检测周期短、检测通量高、成本低且假阳性率低的用于检测PTGS1多态性的方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种PTGS1基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法，针对PTGS1基因rs10306114位点基因型灵敏度高、且检测周期短、检测通量高、成本低的检测方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种PTGS1基因检测的引物组，包括rs10306114位点的扩增引物对SEQ ID NO.1-2；其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。

扩增引物上游引物序列SEQ ID NO.1：

5’-ACGGUCCACCTGGCATAATTTCTACCCT-3’.

扩增引物下游引物序列SEQ ID NO.2：

5’-TCCCCTTCTGTAAAATGGGTC-3’.

二代测序(高通量测序)通过随机打断基因/基因组序列构建测序文库，然后对文库进行测序得到序列。对深度测序序列进行比对/拼接、与参考基因组比对分析等等生物信息学分析后得到待测位点的基因型别。测序后的分析难度较高，存在假阴性/假阳性问题。本发明通过设计引物组，直接高通量测序方法直接检测待检SNP位点，避免测序后的复杂分析，提供一种简便的二代测序检测该位点的方法。

第二方面，本发明提供一种PTGS1基因检测试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物组。

优选地，所述试剂盒还包括接头、断裂剂、连接酶和连接酶缓冲液，所述断裂剂对扩增引物的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割。

优选地，所述接头上还有标签序列。

本发明中，为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源，本具体实施例在接头上设计了标签序列，可以由1-14个碱基(A、T、C或G)组成，根据样本的数量进行选择，便于分析检测结果对应的样本来源。

优选地，所述接头直接与含有rs10306114位点的扩增产物连接。

本发明中，使用位点扩增引物扩增得到的产物经酶或化学试剂断裂后，与接头直接相连。

优选地，所述接头为双链双突出末端接头。

优选地，所述双链双突出末端接头的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体序列如下所示：

SEQ ID NO.3：

CCTCCCTGCAGTCTCTATGGGCNNNNCTGCTAGTCGCTGAAGTAGTCGGT.

SEQ ID NO.4：

CTACTTCAGCGACTAGCAGNNNNGCCCATAGAGACTGCAGGG.

优选地，所述断裂剂包括USER酶。

优选地，所述试剂盒还包括位点锚定序列SEQ ID NO.5和标签锚定序列SEQ IDNO.6。

SEQ ID NO.5：5’-CCAGCATGTAGTAGGTGCTC-3’.

SEQ ID NO.6：GCCCATAGAGACT.

第三方面，本发明提供一种用于非疾病诊断治疗目的的PTGS1基因检测方法，使用如第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：

(1)用扩增引物扩增包含PTGS1基因rs10306114位点的基因片段，扩增产物与接头连接，构建待测文库，并将文库分子可寻址固定在固相载体上，将待测片段变性为单链；

(2)将位点锚定序列连接于固相载体上的待测文库分子上，加入荧光标记的寡核苷酸探针进行连接反应，变性去除连接测序产物；

(3)加入检测接头上标签锚定序列，加入荧光标记的寡核苷酸探针，进行连接反应，对文库进行定位寻址，变性去除连接测序产物。

优选地，步骤(1)所述固定在固相载体上的方法包括：将扩增产物与接头连接，所述接头固定于磁珠表面，将磁珠点样至载玻片固定。

优选地，所述接头一端带有生物素修饰。

优选地，所述磁珠带有链霉亲和素修饰。

优选地，所述载玻片经异硫氰基修饰。

优选地，所述固定的时间为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃。

优选地，所述固定的时间为0.5-1.5h，例如可以是0.5、0.8、1、1.2、1.5h，优选为1h。

优选地，具体包括如下步骤：

(1)用扩增引物扩增包含PTGS1基因rs10306114位点的基因片段，断裂扩增产物，然后将扩增产物与接头连接，所述接头固定于磁珠表面，构建待测文库，并将文库分子可寻址固定在固相载体上，将待测片段变性为单链；

(2)将位点锚定序列连接于固相载体上的待测文库分子上，加入荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及连接酶缓冲液，进行连接反应，变性去除连接测序产物；

(3)加入检测接头上标签锚定序列，加入荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及连接酶缓冲液，进行连接反应，对文库进行定位寻址，变性去除连接测序产物。

本发明检测流程如下：

1、利用含断裂位点扩增引物PCR扩增包含待测位点的片段(扩增产物包含rs10306114位点)；

2、用酶切方式从断裂位点断裂PCR产物，并将PCR产物连接上接头构建文库；

3、文库扩增；

4、通过微滴PCR单分子扩增，将待测片段固定到固相载体上；

5、将检测rs10306114位点的锚定引物锚定在连接于固相载体上的待测文库分子上；加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；变性去除连接测序产物；

6、加入检测接头上Barcode的锚定引物锚定在上述待测文库接头上；加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；对文库进行定位寻址。变性去除连接测序产物。

本发明针对PTGS1基因rs10306114位点基因型灵敏度高、且检测周期短、检测通量高、成本低。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的PTGS1基因检测引物组特异性好，灵敏度高，能有效对PTGS1基因进行分型；

(2)本发明提供的试剂盒特异性针对PTGS1基因分型进行检测，特异性高，灵敏度好，显著提高检测通量，区别于现有二代测序方法，直接对目标位点进行检测，目标位点SNP测序深度高(10000成的测序深度)，准确性高，灵敏度高，不需要生物信息学分析，只测目标位点。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1PTGS1基因分型检测

1、PCR扩增

以人的血液基因组DNA为模板，利用位点扩增引物对SEQ ID NO.1-2，对SNP位点所在序列进行扩增，反应体系为：F引物(10μM)，1μL；R引物(10μM)，1μL；dNTP(各2.5mM)，4μL；血液基因组DNA，50ng；HotStartTaq(5U/μL)，0.5μL；10×HotStart Taq Buffer，5μL；ddH₂O加至50μL。

PCR反应条件如下：95℃10min；95℃15s，56℃30s，72℃50s；重复30个循环；72℃3min。所得产物即为PCR扩增产物。

经琼脂糖凝胶电泳检测，所有样本的第扩增产物中均含有目标分子，且凝胶电泳图显示无杂带，条带单一；说明PCR扩增成功获得了所需的PCR扩增产物。

2、文库分子构建

为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源，本具体实施例在接头上设计了标签序列。

将双链双突出末端接头SEQ ID NO.3-4与带有链霉亲和素修饰的Myone磁珠(Invitrogen)结合，使得上述各接头被分别固定在磁珠表面，反应体系及反应过程为：将200ng接头与4μL(约4×10⁷个磁珠)Myone磁珠螺旋振荡混匀，反应30min，以适量TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA)清洗两次，离心分离，将得到的磁珠以4μL结合缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5；1mM EDTA；1M NaCl；0.01％Triton X-100)重悬保存，得固定有双链双突出末端接头的磁珠。

3、PCR产物与接头连接

PCR扩增产物20μL；USER酶(1U/μL，NEB，Cat#M5505S)，10μL；缓冲液，8μL；T4DNA连接酶，2μL；固定有双链双突出末端接头的磁珠，0.4μL；加ddH₂O至40μL。

其中，所述缓冲液为含400mM Tris、100mM MgCl₂、100mM DTT、5mMATP、25％PEG6000，pH值7.8的溶液。

25℃反应20分钟，得连接产物，即待测序文库分子。

反应结束后，将50管连接产物合并成1管，2500g离心3min，磁铁吸附磁珠，去上清，用50μL TE洗涤二次，并最终悬浮于50μL TE中，从而将待测序文库分子固定在磁珠上。

任选地，本发明提供另一种将待测片段固定到固相载体的方式。具体为通过油包水微滴单分子扩增，将待测片段连接到固相载体上，可以在一次微滴PCR扩增过程将多个样本片段单一地分别连接到固相载体上，提高检测通量，降低成本。

4、固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。

将步骤3所得产物点样至异硫氰基修饰的载样片(玻片)，于37℃固定1h，即完成固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。

其中，测序平台：深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪PstarII A测序仪，并采用连接测序法进行测序。

测序过程：将固定于磁珠上的测序文库加入测序芯片中，并装载入测序仪，将待测片段变性为单链。

固定位点锚定序列，通过加入测序探针测定位点基因型。

固定标签锚定序列，通过加入测序探针测定标签信息。

综上所述，本发明的检测试剂盒及检测方法通过特异性设计的引物组实现高特异性、高灵敏度的检测，有效针对PTGS1基因进行分型，检测通量高、成本低，周期短，区别于现有二代测序方法，直接对目标位点进行检测，目标位点SNP测序深度高(10000成的测序深度)，准确性高，灵敏度高，不需要生物信息学分析，只测目标位点。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院；深圳华因康基因科技有限公司

<120> PTGS1基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法

<130> 2019

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

acgguccacc tggcataatt tctaccct 28

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

tccccttctg taaaatgggt c 21

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

cctccctgca gtctctatgg gcnnnnctgc tagtcgctga agtagtcggt 50

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

ctacttcagc gactagcagn nnngcccata gagactgcag gg 42

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

ccagcatgta gtaggtgctc 20

<210> 6

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

gcccatagag act 13

Claims

1.一种PTGS1基因检测的引物组，其特征在于，包括rs10306114位点的扩增引物对SEQID NO.1-2；其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。

2.一种PTGS1基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括接头、断裂剂、连接酶和连接酶缓冲液，所述断裂剂对扩增引物的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述接头上还有标签序列；

优选地，所述接头直接与含有rs10306114位点的扩增产物连接。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述接头为双链双突出末端接头。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述双链双突出末端接头其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求3-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述断裂剂包括USER酶；

优选地，所述试剂盒还包括位点锚定序列SEQ ID NO.5和标签锚定序列SEQ ID NO.6。

8.一种用于非疾病诊断治疗目的的PTGS1基因检测方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的引物组或权利要求2-7任一项所述的试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述固定在固相载体上的方法包括：将扩增产物的接头连接，所述接头固定于磁珠表面，将磁珠点样至载玻片固定；

优选地，所述接头一端带有生物素修饰；

优选地，所述磁珠带有链霉亲和素修饰；

优选地，所述载玻片经异硫氰基修饰；

优选地，所述固定的时间为35-40℃，优选为37℃；

优选地，所述固定的时间为0.5-1.5h，优选为1h。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：