CN111718981A - Ace基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法,所述引物组包括rs1799752位点的扩增引物对SEQ ID NO.1‑2、插入型锚定引物SEQ ID NO.3和缺失型锚定引物SEQ ID NO.4;其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。本发明设计两对位点检测锚定引物和特异测序探针实现该位点检测,一组位点测序锚定引物和特异探针检测插入型,一组位点测序锚定引物和特异探针检测缺失型。通过分型两个检测信号来判定检测结果,提高检测准确性,只对目标序列进行测序分析,降低测序结果分析难度。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法,具体涉及一种ACE基因插入/缺失检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
血管紧张素转化酶基因(angiotensin converting enzyme,ACE)基因内含子16(rs1799752位点)存在288bp的Alu插入/缺失(I/D)多态性导致三种基因型:II、ID、DD,亚洲人群中D等位基因的频率为39%。ACE I/D多态性可影响ACE的水平,DD基因型个体血浆ACE的活性升高,依那普利治疗后ACE活性下降更明显;在初治的高血压患者中,DD型患者福辛普利的降压疗效增强;在高血压合并左心室肥大患者中,DD基因型患者服用依那普利和赖诺普利后心功能改善程度优于ID和II基因型患者;II基因型患者应用赖诺普利或卡托普利时肾功能下降更明显。ACE基因多态性研究具有重要意义,现有针对ACE基因多态性I/D分型的方法包括Sanger测序、基因芯片杂交法、Taqman荧光探针法、变性高效液相色谱(dHPLC)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)和等位基因特异性扩增法(Amplification RefractoryMutation System Real Time PCR,ARMS-RT PCR)等。Sanger测序法结果准确,但但检测步骤较多、操作繁琐、检测灵敏度较低;基因芯片杂交法的检测步骤较多、操作繁琐、检测灵敏度较低,还会存在假阳性的问题;Taqman荧光探针法,ARMS-RT PCR方法检测通量低。且针对插入/缺失型设计不同的探针难度较大。其他各种方法也均有优劣,例如检测错误信息比例高、灵敏度低、假阳性率高、耗时较长、通量小等问题。
CN108690876A公开了一种检测ACE基因多态性的引物、探针及应用、试剂盒和检测方法。包括检测ACE(rs4646994)多态性的引物、探针及其应用。所述引物和探针能在荧光定量PCR平台上有效地检测出插入/缺失突变型的ACE(rs4646994)基因,操作方法简单易行,即降低污染风险,又提高效率,但通量小,面临多样本时处理周期较长。
CN108410966A公开了一种用于检测ACE基因插入与缺失的方法,该方法包括以下步骤:步骤S10,在待测试样品中添加具有HEX标记的探针和1对引物进行试剂配制;步骤S20,将试剂进行不等位PCR扩增;步骤S30,借助LC480平台进行溶解曲线,并收集相应的荧光信号。该发明的优势在于利用成熟的荧光定量PCR技术,只需1条HEX标记的探针和1对普通引物,先通过普通的不等位PCR,再在多种不同荧光定量PCR仪上运行熔解曲线,只需90分钟左右,即可完成ACE基因多态性II,ID和DD的3种基因分型。
CN108018356A公开了一种ACE检测试剂盒及检测方法,包括用于对含rs4646994位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组,所述引物组包括上游引物,以及下游引物。该发明的试剂盒通过采用特异性扩增引物组对含上述rs4646994位点的核酸片段进行扩增,使得对ACE基因突变的检测灵敏度高、假阳性率低;该发明的试剂盒采用第二代高通量基因测序技术进行检测,使得检测周期短,通量高。但二代测序方法涉及序列比对/拼接,比对分析等生物信息学分析步骤,测序后的分析难度较高,存在假阴性/假阳性问题。
因此,提供一种灵敏度高、检测周期短、检测通量高、成本低且假阳性率低的用于检测ACE(I/D)多态性的方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求,本发明提供一种ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法,针对ACE基因rs1799752位点插入/缺失基因型灵敏度高、且检测周期短、检测通量高、成本低的检测方法。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种ACE基因插入/缺失检测的引物组,包括rs1799752位点的扩增引物对SEQ ID NO.1-2、插入型锚定引物SEQ ID NO.3和缺失型锚定引物SEQ IDNO.4;其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。
扩增引物上游引物序列SEQ ID NO.1:
5’-ACGGUATGCCTGTAGTCCTAGCTGC-3’.
扩增引物下游引物序列SEQ ID NO.2:
5’-GGATCTACCTTTTCCTAGGCTT-3’.
插入型锚定引物SEQ ID NO.3:5’-AAAAAAAAAAGTGACTG-3’.
缺失型锚定引物SEQ ID NO.4:5’-GCTGCCTATACAGTCACTTT-3’.
优选地,所述引物组还包括插入型探针SEQ ID NO.5和缺失型探针SEQ ID NO.6。
插入型探针SEQ ID NO.5:5’-CTCCGTCTCAAAAA-3’.
缺失型探针SEQ ID NO.6:5’-TATGTGGTTTCGCCA-3’
第二方面,本发明提供一种ACE基因插入/缺失检测试剂盒,所述试剂盒包括如第一方面所述的引物组。
优选地,所述试剂盒还包括接头、断裂剂、连接酶和连接酶缓冲液,所述断裂剂对扩增引物的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割。
优选地,所述接头上还有标签序列。
本发明中,为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源,本具体实施例在接头上设计了标签序列,可以由1-14个碱基(A、T、C或G)组成,根据样本的数量进行选择,便于分析检测结果对应的样本来源。
优选地,所述接头与经过断裂处理的含有rs1799752位点的扩增产物连接。
优选地,所述接头为双链双突出末端接头。
本发明中,双链双突出末端接头的一端与断裂后的引物匹配连接,另一端有利于和固相载体连接。
优选地,所述接头的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,具体序列如下所示:
SEQ ID NO.7:CCTCCCTGCAGTCTCTATGGGCNNNNCTGCTAGTCGCTGAAGTAGTCGGT.
SEQ ID NO.8:CTACTTCAGCGACTAGCAGNNNNGCCCATAGAGACTGCAGGG.
优选地,所述断裂剂包括USER酶。
优选地,所述试剂盒还包括标签锚定序列SEQ ID NO.9,具体序列如下所示:
SEQ ID NO.9:GCCCATAGAGACT.
第三方面,本发明提供一种用于非疾病诊断治疗目的的ACE基因插入/缺失检测方法,使用如第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂盒进行检测,检测方法包括以下步骤:
(1)用扩增引物扩增包含ACE基因rs1799752位点的基因片段,扩增产物与接头连接,构建待测文库,并将文库分子可寻址固定在固相载体上,将待测片段变性为单链;
(2)加入插入型锚定引物、插入型探针,检测信号,变性去除连接测序产物;
(3)加入缺失型锚定引物、缺失型探针,检测信号,变性去除连接测序产物;
(4)加入检测接头上标签的锚定引物,加入荧光标记的寡核苷酸探针,进行连接反应,对文库进行定位寻址,变性去除连接测序产物;
其中,步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)不分先后顺序。
本发明中,文库分子可寻址固定在固相载体上之后,先后对插入型和缺失型进行信号检测,具体顺序可颠倒。
本发明采用PSTAR II2A测序平台对待检测位点直接测序的方法,较现有的新一代测序方法(如Illumina仪器平台的测序方法)有很大优势,二代测序(高通量测序)通过随机打断基因/基因组序列构建测序文库,然后对文库进行测序得到序列。对深度测序序列进行比对/拼接、与参考基因组比对分析等等生物信息学分析后得到待测位点的基因型别,测序后的分析难度较高,存在假阴性/假阳性问题。本发明通过PSTAR II2A测序平台进行分型检测,简单高效。
针对具体基因的不同,测序方法设计也不同,ACE插入/缺失位点结构特殊,插入和缺失两种型分别有ACAGTCACTTTT序列存在,用现有的位点测序锚定引物加通用测序探针无法辨别该位点型别,设计两对位点检测锚定引物和特异测序探针实现该位点检测。一组位点测序锚定引物和特异探针检测插入型,一组点测序锚定引物和特异探针检测缺失型。通过分型两个检测信号来判定检测结果,提高检测准确性,只对目标序列进行测序分析,降低测序结果分析难度。
优选地,步骤(1)所述固定在固相载体上的方法包括:将扩增产物与磁珠上的接头结合,将磁珠点样至载玻片固定。
优选地,所述接头一端有生物素修饰修饰。
优选地,所述磁珠带有链霉亲和素修饰。
优选地,所述载玻片经异硫氰基修饰。
优选地,所述固定的时间为35-40℃,例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃,优选为37℃。
优选地,所述固定的时间为0.5-1.5h,例如可以是0.5、0.8、1、1.2、1.5h,优选为1h。
优选地,具体包括如下步骤:
(1)用扩增引物扩增包含ACE基因rs1799752位点的基因片段,扩增产物与接头连接,将扩增产物与接头连接,所述接头固定在带有链霉亲和素的磁珠上,构建待测文库,并将文库分子通过磁珠可寻址固定在固相载体上,将待测片段变性为单链;
(2)将插入型锚定引物锚定在连接于固相载体上的待测文库分子,加入荧光标记的插入型探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应,检测信号,变性去除连接测序产物;
(3)将缺失型锚定引物锚定在连接于固相载体上的待测文库分子上,记入荧光标记的缺失型探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应,检测信号,变性去除连接测序产物;
(4)加入检测接头上标签的锚定引物,锚定在上述待测文库接头上,加入荧光标记的探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应,对文库进行定位寻址,变性去除连接测序产物;
其中,步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)不分先后顺序。
本发明检测流程如下:
1、用引物扩增基因组DNA(扩增产物包含rs1799752位点),所用扩增引物含有可断裂位点(用于将PCR扩增产物在此处断裂,然后与接头连接);
2、通过酶切或化学处理的方法,将PCR产物在上述引物断点处断裂;
3、断裂后的扩增产物与接头连接,构建测序文库;
4、将测序文库连接到固相载体上;
5、将检测rs1799752位点插入型的锚定引物锚定在连接于固相载体上的待测文库分子上;加入荧光标记的插入型寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应;检测信号;变性去除连接测序产物;
6、将检测rs1799752位点缺失型的锚定引物锚定在连接于固相载体上的待测文库分子上;加入荧光标记的缺失型寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应;检测信号;变性去除连接测序产物;
7、加入检测接头上标签的锚定引物锚定在上述待测文库接头上;加入荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应;对文库进行定位寻址。变性去除连接测序产物。
本发明针对ACE基因rs1799752位点插入/缺失基因型灵敏度高、且检测周期短、检测通量高、成本低。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明的ACE基因插入/缺失检测引物组特异性好,灵敏度高,能有效对ACE基因插入/缺失进行分型;
(2)本发明提供的试剂盒特异性针对ACE基因插入/缺失分型进行检测,特异性高,灵敏度好,显著提高检测通量,可以避免未知突变对检测结果的影响,检测准确性高;
(3)本发明通过设计两对位点检测锚定引物和特异测序探针实现rs1799752检测。一组位点测序锚定引物和特异探针检测插入型,一组点测序锚定引物和特异探针检测缺失型。通过分型两个检测信号来判定检测结果,解决现有技术中测序结果中存在较高比例的错误信号的技术问题。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1ACE基因插入/缺失分型检测
1、PCR扩增
以人的血液基因组DNA为模板,利用位点扩增引物对SEQ ID NO.1-2,对SNP位点所在序列进行扩增,反应体系为:F引物(10μM),1μL;R引物(10μM),1μL;dNTP(各2.5mM),4μL;血液基因组DNA,50ng;HotStart Taq(5U/μL),0.5μL;10×HotStart Taq Buffer,5μL;ddH2O加至50μL。
PCR反应条件如下:95℃10min;95℃15s,58℃30s,72℃40s;重复30个循环;72℃3min。所得产物即为PCR扩增产物。
经琼脂糖凝胶电泳检测,所有样本的第扩增产物中均含有目标分子,且凝胶电泳图显示无杂带,条带单一;说明PCR扩增成功获得了所需的PCR扩增产物。
2、文库分子构建
为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源,本具体实施例在接头上设计了标签序列,具体序列如下述序列所示。
将上述各接头分别与带有链霉亲和素修饰的Myone磁珠(Invitrogen)结合,使得上述双链双突出末端接头SEQ ID NO.7-8分别固定在磁珠表面,反应体系及反应过程为:将200ng接头与4μL(约4×107个磁珠)Myone磁珠螺旋振荡混匀,反应30min,以适量TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0;1mM EDTA)清洗两次,离心分离,将得到的磁珠以4μL结合缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5;1mM EDTA;1M NaCl;0.01%Triton X-100)重悬保存,得固定有接头的磁珠。
3、PCR产物与接头连接
PCR扩增产物20μL;USER酶(1U/μL,NEB,Cat#M5505S),10μL;缓冲液,8μL;T4DNA连接酶,2μL;固定有接头的磁珠,0.4μL;加ddH2O至40μL。
其中,所述缓冲液为含400mM Tris、100mM MgCl2、100mM DTT、5mM ATP、25%PEG6000,pH值7.8的溶液。
25℃反应20分钟,得连接产物,即待测序文库分子。
反应结束后,将50管连接产物合并成1管,2500g离心3min,磁铁吸附磁珠,去上清,用50μL TE洗涤二次,并最终悬浮于50μL TE中,从而将待测序文库分子固定在磁珠上。
4、固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。
将步骤3所得产物点样至异硫氰基修饰的载样片(玻片),于37℃固定1h,即完成固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。
其中,测序平台:深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪Pstar II A测序仪,并采用连接测序法进行测序。
测序过程:将固定于磁珠上的测序文库加入测序芯片中,并装载入测序仪。
固定位点插入型锚定序列,通过加入插入型探针测定位点基因型。
固定位点缺失型锚定序列,通过加入缺失型探针测定位点基因型。
固定标签锚定序列,通过加入测序探针测定标签信息。
5、结果与分析
若仅出现插入型检测信号,则对应样本为纯合插入型(II);若仅出现缺失型检测信号,则对应样本为纯合缺失型(DD);若插入型和缺失型均出现检测信号,则为插入/缺失型(I/D)。
综上所述,本发明的检测试剂盒及检测方法通过特异性设计的引物组实现高特异性、高灵敏度的检测,有效针对ACE基因进行分型,检测通量高、成本低,周期短,降低检测错误信息的比例,显著降低测序后生物信息学分析的难度。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院;深圳华因康基因科技有限公司
<120> ACE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法
<130> 2019
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
acgguatgcc tgtagtccta gctgc 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
ggatctacct tttcctaggc tt 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
aaaaaaaaaa gtgactg 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
gctgcctata cagtcacttt 20
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
ctccgtctca aaaa 14
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
tatgtggttt cgcca 15
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
cctccctgca gtctctatgg gcnnnnctgc tagtcgctga agtagtcggt 50
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(23)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
ctacttcagc gactagcagn nnngcccata gagactgcag gg 42
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 9
gcccatagag act 13
Claims (10)
1.一种ACE基因插入/缺失检测的引物组,其特征在于,包括rs1799752位点的扩增引物对SEQ ID NO.1-2、插入型锚定引物SEQ ID NO.3和缺失型锚定引物SEQ ID NO.4;
其中所述扩增引物包含可断裂位点或可切除序列。
2.根据权利要求1所述的引物组,其特征在于,还包括插入型探针SEQ ID NO.5和缺失型探针SEQ ID NO.6。
3.一种ACE基因插入/缺失检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括接头、断裂剂、连接酶和连接酶缓冲液,所述断裂剂对扩增引物的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述接头上还有标签序列;
优选地,所述接头直接与含有rs1799752位点的扩增产物连接。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒,其特征在于,所述接头为双链双突出末端接头;
优选地,所述接头其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
7.根据权利要求4-6任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述断裂剂包括USER酶;
优选地,所述试剂盒还包括标签锚定序列SEQ ID NO.9。
8.一种用于非疾病诊断治疗目的的ACE基因插入/缺失检测方法,其特征在于,使用如权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-7任一项所述的试剂盒进行检测,检测方法包括以下步骤:
(1)用扩增引物扩增包含ACE基因rs1799752位点的基因片段,扩增产物与接头连接,构建待测文库,并将文库分子可寻址固定在固相载体上,将待测片段变性为单链;
(2)加入插入型锚定引物、插入型探针,检测信号,变性去除连接测序产物;
(3)加入缺失型锚定引物、缺失型探针,检测信号,变性去除连接测序产物;
(4)加入检测接头上标签的锚定引物,加入荧光标记的寡核苷酸探针,进行连接反应,对文库进行定位寻址,变性去除连接测序产物;
其中,步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)不分先后顺序。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述固定在固相载体上的方法包括:将扩增产物与磁珠上的接头结合,将磁珠点样至载玻片固定;
优选地,所述接头一端有生物素修饰修饰;
优选地,所述磁珠带有链霉亲和素修饰;
优选地,所述载玻片经异硫氰基修饰;
优选地,所述固定的时间为35-40℃,优选为37℃;
优选地,所述固定的时间为0.5-1.5h,优选为1h。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
(1)用扩增引物扩增包含ACE基因rs1799752位点的基因片段,扩增产物与接头连接,将扩增产物与接头结合,所述接头固定在带有链霉亲和素的磁珠上,构建待测文库,并将文库分子通过磁珠可寻址固定在固相载体上,将待测片段变性为单链;
(2)将插入型锚定引物锚定在连接于固相载体上的待测文库分子,加入荧光标记的插入型探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应,检测信号,变性去除连接测序产物;
(3)将缺失型锚定引物锚定在连接于固相载体上的待测文库分子上,记入荧光标记的缺失型探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应,检测信号,变性去除连接测序产物;
(4)加入检测接头上标签的锚定引物,锚定在上述待测文库接头上,加入荧光标记的探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应,对文库进行定位寻址,变性去除连接测序产物;
其中,步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)不分先后顺序。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN108690876A (zh) * | 2016-08-25 | 2018-10-23 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 检测ace基因多态性的引物、探针及应用、试剂盒和检测方法 |
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2019
- 2019-03-19 CN CN201910209197.2A patent/CN111718981A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108690876A (zh) * | 2016-08-25 | 2018-10-23 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 检测ace基因多态性的引物、探针及应用、试剂盒和检测方法 |
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