CN102046811A - 捕获核酸的方法和测定 - Google Patents

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Abstract

本发明的公开内容提供了用于序列特异性的核酸靶物捕获的方法和系统，其包含酶促反应。本发明的公开内容涉及使用帽缘内切核酸酶、连接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕获和随后检测靶核酸序列的基质（例如微阵列载玻片）上和溶液形式中的复数种寡核苷酸探针。

Description

捕获核酸的方法和测定
发明领域
本发明提供了包含酶促反应的序列特异性的核酸靶物捕获方法和系统。更具体地，本发明包含，使用帽缘内切核酸酶、连接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕获和随后检测靶核酸序列的基质（例如微阵列载玻片）上和溶液形式中的复数种寡核苷酸探针。
发明背景
核酸微阵列技术的出现，使得在非常小的区域、例如在显微镜载玻片上建立数百万核酸序列的阵列成为可能(例如，US 6,375,903和US 5,143,854)。最初，通过把预先合成的DNA序列印迹到载玻片上来建立这样的阵列。但是，在US 6,375,903中所述的无掩膜阵列合成仪(MAS)的构建，现在允许直接在载玻片本身上原位合成寡核苷酸序列。
使用MAS仪器，要在微阵列上构建的寡核苷酸序列的选择是处于软件控制之下，使得现在可能基于研究人员的特定需要，建立个别地定制的阵列。一般而言，基于MAS的寡核苷酸微阵列合成技术允许在标准显微镜载玻片的非常小的区域内平行合成超过400万独特寡核苷酸特征。由于可以利用数百生物的完整基因组（它们的参照序列已经普遍地储存在公开数据库中），已经将微阵列用于执行从无数生物分离的核酸的序列分析。
核酸微阵列技术已经应用于许多研究和诊断领域，诸如基因表达和发现、突变检测、等位基因的和进化的序列对比、基因组绘图、药物发现和其它。许多应用需要跨整个人基因组搜索遗传性变体和突变；例如可能成为人疾病的根源的变体和突变。在复杂疾病的情况下，这些搜索通常导致与一种或更多种疾病有关的单核苷酸多态性(SNP)或SNP集合。已经证实，鉴别这样的SNP是一项费力、费时且费用巨大的任务，其中经常需要重新排序来自受影响的个体和/或组织样品的基因组DNA大区域、通常大于100千碱基(Kb)，以发现单碱基变化或鉴别所有序列变体。
基因组通常因过于复杂而难以整体研究，且必须使用技术来降低基因组的复杂性。为了解决该问题，一种方案是，减少来自DNA样品的某些类型的丰富序列，参见US 6,013,440。替代方案采用富集基因组序列的方法和组合物，参见例如，Albert, T.J., 等人, Nat. Meth., 4 (2007) 903-5（其通过援引整体并入本文）和Okou, D.T., 等人, Nat. Meth. 4(11) (2007) 907-9（其通过援引整体并入本文）和美国专利申请号11/789,135、11/970,949、61/032,594和61/026,592（它们都通过援引整体并入本文），它们公开了节省成本地、快速地、有效地以使用者确定的方式减少基因组样品的复杂性、允许进一步处理和分析的替代方案。
但是，使用的方法具有低信噪比和再现性问题。这样，需要实现例如信噪比的提高、测定之间再现性的增加、特异性的序列捕获、与此同时保持定量的方法和系统。在研究人员理解和鉴别疾病的原因和有关的治疗性处理的努力中，这些方法会为他们提供极大的数据效用。
发明概述
本发明提供了包含酶促反应的序列特异性的核酸靶物捕获方法和系统。更具体地，本发明包含，使用帽缘内切核酸酶、连接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕获和随后检测靶核酸序列的基质（例如微阵列载玻片）上和溶液形式中的复数种寡核苷酸探针。
下面描述本发明的某些例证性的实施方案。本发明不限于这些实施方案。
在本发明的实施方案中，在原位合成寡核苷酸探针，或合成并印迹到基质上，其中所述探针固定在基质(例如，微阵列载玻片、珠子、微球)上，且包含与靶序列互补的单链5’末端、和包含发夹结构和与靶核苷酸互补的末端碱基的3’末端。在本发明的其它实施方案中，合成的探针除了包含单链5’末端以外，另外包含结合到探针5’末端的结合部分（例如生物素）、和包含发夹结构和与靶序列互补的末端碱基的3’末端，且所述探针保持在溶液中。在某些实施方案中，在探针中发现的发夹结构包含由限制性内切核酸酶(RE)识别和切割的序列。在本发明的某些实施方案中，靶核酸包括例如基因组DNA或其衍生物、RNA、cDNA、微RNA(miRNA)、非编码RNA(ncRNA)、启动子-相关的小RNA(PASR)等，加入它们，以与探针相互作用。
在某些实施方案中，通过例如剪切，使核酸碎裂，而在其它实施方案中，通过例如PCR或通过克列诺酶（Klenow），扩增核酸靶物。在优选的实施方案中，在碎裂或扩增后，用可检测的部分（例如荧光、生物素、地高辛配基等部分）在3’末端标记靶核酸。本发明不受使用的检测部分和/或方法的限制，且预见到，熟练的技术人员会理解为了检测目的可以结合到核酸的3’末端的检测部分的众多选项。在某些实施方案中，所述靶核酸序列的长度是至少100碱基对、至少200碱基对、至少300碱基对、至少400碱基对、至少500碱基对、至少600碱基对。但是，本发明不限于靶核酸序列的大小，且预见到未碎裂的以及碎裂的和衍生的核酸样品(例如，PCR 扩增子、克列诺酶随机引发的扩增子等)与本发明的方法和测定一起使用。在某些实施方案中，所述靶核酸序列包含单核苷酸多态性或拷贝数目变化。
在某些实施方案中，查询核苷酸放置在探针的发夹结构之后，且在3’末端。在某些实施方案中，查询核苷酸放置在例如5’侧的发夹结构之前且与其紧邻，且探针的3’末端设计成与已知的靶序列互补。在某些实施方案中，近端核苷酸是5’侧双链发夹结构上游2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。在某些实施方案中，通过将查询核苷酸放置在探针序列的5’侧或臂上，实现切割酶和连接酶的双特异性（与单独的切割酶特异性相比）。在某些实施方案中，当如所述将查询核苷酸放置在5’侧时，切割酶特异性取决于三部分（tripartite）结构、和用于连接发夹的3’末端和切割的靶物的5’末端的碱基特异性的底物。
在某些实施方案中，在适合发生杂交的条件下，将标记的靶核酸与在基质上或在溶液中的探针一起温育。杂交后，与探针的3’末端核苷酸互补的靶序列产生序列特异性的结构，其被帽缘内切核酸酶(FEN)识别和切割。在优选的实施方案中，向反应物中加入连接酶（热稳定的连接酶），用于将探针的3’末端连接到切割的靶核酸的5’末端，从而将靶核酸共价连接到探针上。如果靶序列不与探针上的3’末端核苷酸互补，则不会形成切割结构，不会发生帽缘内切核酸酶的切割，也不会进行连接。在某些实施方案中，通过将FEN加入杂交的探针/靶物复合物，随后单独加入连接酶，依次发生酶促反应。在其它实施方案中，同时加入FEN和连接酶，使得反应几乎同时发生。在某些实施方案中，将RecJ外切核酸酶与切割酶组合地加入反应。在某些实施方案中，将ssDNA结合蛋白额外加入反应。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，预见到与FEN组合地加入RecJ和/或ssDNA结合蛋白，会提供增强的切割酶活性，因为与缺少RecJ和/或ssDNA结合时的反应相比，RecJ在降解杂交的靶物片段的长突出端中的外切核酸酶活性，会提供更适合最佳切割酶活性的底物。
在某些其中探针固定在基质（例如微阵列载玻片）上的实施方案中，从共价结合的靶分子洗掉非特异性地结合的核酸分子。在某些其中标记的探针保持在溶液中的实施方案中，含有共价结合的靶分子的标记的探针被用捕获分子包被的基质（例如珠子、载玻片、平板等）捕获。例如，如果探针是生物素标记的，则用抗生蛋白链菌素包被的珠子会捕获探针/靶物复合物，从而使结合的靶分子与未结合的分子分离。在某些实施方案中，洗涤基质，以进一步将捕获的靶分子，从非特异性地结合的核酸分子纯化。
在某些实施方案中，使用荧光扫描仪，扫描包含共价结合的靶物的基质，例如，以检测在靶序列上发现的荧光部分，且将含有序列信息的数据与使用者交流，例如 通过计算机或其它可视方式。
在某些实施方案中，从基质释放结合的靶核酸，用于下游应用，例如测序。例如，在某些实施方案中，探针的发夹结构包含一个或更多个限制性内切核酸酶位点或尿嘧啶。本发明不限于任何特定可切割的序列，熟练的技术人员会认识到适合本发明的方法和测定的众多选项。一旦靶核酸如本文所述被捕获、共价结合到探针上、并与非特异性地结合的核酸分子分离，通过用RE或尿嘧啶-DNA-糖基化酶消化探针/靶物复合物、随后进行内切核酸酶VIII消化，从探针释放靶序列，其中在探针发夹结构中发现了由RE识别的序列，或尿嘧啶被合成进探针发夹中。释放后，使用本领域技术人员已知的方法，例如通过在水或低溶质溶液中温育靶序列/探针复合物，从探针洗脱靶序列。将洗脱的靶分子应用于下游用途，例如测序反应。
本文所述的本发明的方法和测定可以用于，例如，检测单核苷酸多态性、基因组拷贝数变化等。可以研究基因组异常与疾病和病症的关联，从而为研究和诊断目的提供关于疾病和病症的原因的洞察，以及在鉴别这样的疾病和病症的治疗性处理中，提供用于药物发现的潜在靶物。
在某些实施方案中，本发明提供了捕获靶核酸序列的方法，其包含，提供核酸样品，其中所述样品包含检测部分（优选荧光部分诸如Cy-3），且可以包含或不包含靶序列、至少一种帽缘内切核酸酶、至少一种连接酶（优选热稳定的连接酶）和复数种寡核苷酸探针，其中所述探针包含靶序列和发夹结构，在发生杂交的条件下将所述核酸样品应用于所述寡核苷酸探针，在允许发生酶促反应的条件下将所述帽缘酶和连接酶应用于所述杂交的核酸/探针复合物，从而捕获所述靶核酸序列。在优选的实施方案中，与帽缘内切核酸酶组合地，在反应中包括RecJ外切核酸酶和ssDNA结合蛋白。在某些实施方案中，所述核酸样品是基因组DNA样品或其衍生物，其中所述样品来自哺乳动物、优选人。在某些实施方案中，至少一种所述靶序列包括单核苷酸多态性，而在其它实施方案中，所述靶序列是基因组拷贝数变体。在某些实施方案中，所述发夹结构包含SEQ ID NO: 1。在某些实施方案中，进一步检测捕获的靶核酸，例如利用荧光扫描仪。在某些实施方案中，所述探针固定在基质（例如微阵列载玻片）上，而在其它实施方案中，所述探针保持在溶液中。在某些实施方案中，所述探针与凝胶垫结合。
在某些实施方案中，本发明提供了捕获靶核酸序列的方法，其包含，提供核酸样品，其中所述样品包含检测部分（优选荧光部分诸如Cy-3），且可以包含或不包含靶序列、至少一种帽缘内切核酸酶、至少一种连接酶（优选热稳定的连接酶）和复数种寡核苷酸探针，其中所述探针包含靶序列和发夹结构，其中所述发夹结构包含可切割的序列，提供使探针和靶核酸之间发生杂交的条件，在允许发生酶促反应的条件下将所述帽缘酶和连接酶应用于所述杂交的核酸/探针复合物，从而捕获所述靶核酸序列。在优选的实施方案中，与帽缘内切核酸酶组合地，在反应中包括RecJ外切核酸酶和ssDNA结合蛋白。在某些实施方案中，所述可切割的序列包含可被限制性内切核酸酶识别和切割的限制性内切核酸酶位点。在某些实施方案中，通过限制性内切核酸酶消化，从探针释放靶核酸，随后测序，以检测靶序列。
在某些实施方案中，本发明提供了用于在基质上或在溶液中实现序列特异性的核酸捕获的组合物，其包含帽缘内切核酸酶、连接酶和寡核苷酸探针，其中所述探针包含发夹结构和互补的靶核酸序列。在某些实施方案中，所述寡核苷酸探针固定在基质（例如微阵列载玻片或珠子）上。
在某些实施方案中，本发明包括试剂盒，其中所述试剂盒用于捕获核酸靶序列，其包含至少一种帽缘内切核酸酶、至少一种热稳定的连接酶、固定在基质上或处于纯化状态的复数种寡核苷酸探针、和至少一种缓冲液。在优选的实施方案中，在试剂盒中另外包括RecJ外切核酸酶和ssDNA结合蛋白。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸探针基本上由与靶序列互补的单链5’末端和3’末端（其基本上由发夹结构和与靶核苷酸互补的末端碱基组成）组成。在某些实施方案中，查询核苷酸放置在探针的5’侧。
在某些实施方案中，本发明包括试剂盒，其中所述试剂盒用于捕获核酸靶序列，且基本上由至少一种帽缘内切核酸酶、至少一种热稳定的连接酶、固定在基质上或处于纯化状态的复数种寡核苷酸探针、RecJ外切核酸酶、ssDNA结合蛋白和至少一种缓冲液组成。
本文使用的术语“样品”以它最广的含义使用。在一种含义中，它包括从任意来源得到的核酸试样。生物核酸样品可以从动物(包括人)得到，且包括从流体、固体、组织等分离的核酸。生物核酸样品也可以来自非人动物，包括、但不限于，脊椎动物诸如啮齿动物、非人灵长动物、绵羊、牛科动物、反刍动物、兔类动物、猪、山羊、马科动物、犬、猫科动物、鸟类等。生物核酸也可以从原核生物（如细菌）和其它非动物真核生物（诸如植物）得到。预见到，本发明不受核酸样品来源的限制，来自任何生物界的任何核酸都可以用于本文所述的方法中。
本文使用的术语“核酸分子”是指含有来自任意样品来源的分子的任意核酸，包括但不限于, DNA或RNA。该术语包括含有DNA和RNA的任意已知碱基类似物的序列，所述碱基类似物包括、但不限于：4-乙酰基胞嘧啶, 8-羟基-N6-甲基腺苷, 氮丙啶基胞嘧啶, 假异胞嘧啶, 5-(羧基羟基­甲基) 尿嘧啶, 5-氟尿嘧啶, 5-溴尿嘧啶, 5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶, 5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶, 二氢尿嘧啶, 肌苷, N6-异戊烯基腺嘌呤, 1-甲基腺嘌呤, 1-甲基假­尿嘧啶, 1-甲基鸟嘌呤, 1-甲基肌苷, 2,2-二甲基­鸟嘌呤, 2-甲基腺嘌呤, 2-甲基鸟嘌呤, 3-甲基­胞嘧啶, 5-甲基胞嘧啶, N6-甲基腺嘌呤, 7-甲基鸟嘌呤, 5-甲氨基甲基尿嘧啶, 5-甲氧基­氨基­甲基-2-硫尿嘧啶, β-D-甘露糖基queosine, 5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶, 5-甲氧基尿嘧啶, 2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤, 尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯, 尿嘧啶-5-氧醋酸, oxybutoxosine, 假尿嘧啶, queosine, 2-硫胞嘧啶, 5-甲基-2-硫尿嘧啶, 2-硫尿嘧啶, 4-硫尿嘧啶, 5-甲基尿嘧啶, N-尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯, 尿嘧啶-5-氧醋酸, 假尿嘧啶, queosine, 2-硫胞嘧啶,和2,6-二氨基嘌呤。
本文使用的术语“寡核苷酸”是指包含2个或更多个、优选超过3个、且通常超过10个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。精确大小取决于许多因素，又取决于寡核苷酸的最终功能和用途。可以以任意方式制备寡核苷酸，包括化学合成、DNA复制、反转录、或其组合。术语寡核苷酸也可以与术语“多核苷酸”互换使用。
本文使用的术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”是互补的。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则相匹配。或者，核酸之间可以存在“完全的”或“全部”的互补性。核酸链之间互补性的程度，对例如核酸链之间杂交的效率和强度、扩增特异性等有显著影响。
本文使用的术语“杂交”用于指互补核酸的配对。杂交和杂交的强度(即，核酸之间缔合的强度)，受到诸如核酸之间的互补程度、包含的条件的严格性、形成的杂合体的Tm、和核酸内G:C比等因素的影响。本发明不限于杂交条件的特定集合，优选地采用严格的杂交条件。严格的杂交条件是序列依赖性的，且随不同的环境参数(例如，盐浓度和有机试剂的存在)而异。通常，选择的“严格的”条件比特定核酸序列在确定的离子强度和pH下的热解链点(Tm)低约5℃至20℃。优选地，严格的条件比结合互补核酸的特定核酸的热解链点低约5℃至10℃。所述Tm是50%的核酸与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。
本文使用的术语“严格性”用于指进行核酸杂交的温度、离子强度和诸如有机溶剂等其它化合物的存在的条件。在“低严格性条件”下，目标核酸序列会与它的精确互补物，具有单碱基错配的序列、密切相关的序列(例如，具有90%或更高同源性的序列)和仅具有部分同源性的序列(例如，具有50-90%同源性的序列)杂交。在“中等严格性条件”下，目标核酸序列仅与它的精确互补物，具有单碱基错配的序列和密切相关的序列(例如，具有90%或更高同源性)杂交。在“高严格性条件”下，目标核酸序列仅与它的精确互补物，和(取决于诸如温度等条件)具有单碱基错配的序列杂交。换而言之，在高严格性条件下，可以升高温度，从而排除与具有单碱基错配的序列杂交。
作为实例，“严格的条件”或“高严格性条件”包含，在42℃在50%甲酰胺、5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x登哈特溶液、超声处理过的鲑精DNA(50mg/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖中杂交，在42℃在0.2x SSC (氯化钠/柠檬酸钠)中和在55℃在50%甲酰胺中洗涤，然后在55℃在含有EDTA的0.1 x SSC中洗涤。对于中等严格的条件，预见到含有35%甲酰胺、5xSSC和0.1% (w/v) 十二烷基硫酸钠的缓冲液适用于在45℃杂交16-72小时。此外，预见到，根据探针长度和希望的严格性水平，在0-45%的范围内适当调节甲酰胺浓度。在本发明的某些实施方案中，通过升高杂交温度或甲酰胺浓度来补偿探针长度的变化，实现更长探针(例如，大于50聚体)的探针优化。在许多参考手册中，例如在本文援引的和并入的“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”中，提供了杂交条件的其它实例。
类似地，通常为靶序列与对应的探针阵列的杂交以经验为主地确定“严格的”洗涤条件。例如，首先杂交阵列，然后用含有连续更低浓度的盐或更高浓度的去污剂的洗涤缓冲液或在递增的温度洗涤，直到特异性与非特异性杂交的信噪比高得足以便利特异性杂交的检测。作为实例，严格的温度条件通常包括，超过约30℃、更通常超过约37℃、且偶尔超过约45℃的温度。严格的盐条件通常小于约1000 mM、通常小于约500 mM、更通常小于约150 mM。严格的洗涤和杂交条件是本领域技术人员已知的，且可以参见，例如，Wetmur, J.G.,和Davidson, M., J Mol Biol 31 (1968) 349-70和Wetmur, J.G., Crit Rev Bio Mol Biol 26(3/4) (1991) 227-59; 它们通过援引整体并入本文。
本领域众所周知，可以采用多种等效条件来调节和调整严格性条件；考虑诸如下述因素：探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)，和靶物的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或被固定化等)，和盐和其它组分的浓度(例如，是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)。这样，杂交和洗涤溶液的组分和浓度会改变，以产生严格性条件。在本发明的优选实施方案中，利用通过Roche- NimbleGen (例如，NimbleChip™ CGH阵列, NimbleGen杂交试剂盒, 等) 可商业得到的杂交和洗涤溶液。
本文使用的术语“引物”是指，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件(即，在有核苷酸和诸如DNA聚合酶等诱导剂存在下，且在合适的温度和pH)下时，能起合成起始点的作用的寡核苷酸，无论是它在纯化的限制酶切消化中天然存在的，还是合成生产的。引物优选地是单链的（为了扩增中的最高效率），但是可以备选地是双链的。如果是双链的，首先处理引物，以分离它的链，然后用于制备延伸产物。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在有诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度取决于多种因素，包括温度、引物的来源和方法的用途。
本文使用的术语“探针”是指，能与另一个目标寡核苷酸的至少一部分杂交的寡核苷酸(即，核苷酸序列)，无论是它在纯化的限制酶切消化中天然存在的，还是合成地、重组地或通过PCR扩增生产的。探针可以是单链的或双链的，但是在本发明中，预期探针是单链的。探针可用于检测、鉴别和分离特定基因序列。在本发明的实施方案中，探针包含5’单链末端和含有发夹结构的3’末端。在发夹结构中可以存在或不存在限制性内切核酸酶位点。
当提及核苷酸序列时，本文使用的术语“其衍生物”、“部分”或“片段” (如在“给定核苷酸序列的衍生物”中)是指该序列的片段。所述片段的大小可以是从4个核苷酸至整个核苷酸序列减去1个核苷酸(10、20、30、40、50、100、200个核苷酸等)。通过例如超声处理、PCR扩增、克列诺扩增、或本领域已知的将核苷酸序列减小成其更小的序列的任意其它方式，可以得到片段。在本发明中，核酸序列的片段、衍生物优选地是至少200碱基对、至少300碱基对、至少400碱基对、至少500碱基对、至少600碱基对。但是，本发明不受限于靶核酸序列的大小。
本文使用的术语“纯化的”或“纯化”是指，从样品去除组分(例如，污染物)和/或污染物。术语“纯化的”是指，隔离的或分离的分子，从它们的天然环境取出的核酸或氨基酸序列。“分离的核酸序列或样品”因此是纯化的核酸序列或样品。“基本上纯化的”分子不含有至少60%、优选至少75%、更优选至少90%的它们天然伴随的其它组分。在本发明的某些实施方案中，“纯化的”涉及未结合的样品核酸分子和反应组分(例如，酶等)与探针/靶物复合物的分离，通常通过用一个或更多个严格性的洗涤缓冲液洗涤，从而从其它反应组分中“纯化”探针/靶核酸复合物。
本文使用的术语“查询核苷酸”是指探针中的核苷酸，其与靶序列相互作用(例如，匹配的碱基对形成或错配)以测定特定突变诸如单核苷酸多态性，或使用复数种寡核苷酸探针从样品序列特异性地捕获靶核苷酸。在某些实施方案中，查询核苷酸放置为探针3’末端处的末端碱基。在某些实施方案中，查询核苷酸放置在探针的5’侧或臂上(即，探针的单链区域)，在发夹茎结构的近端。在某些实施方案中，查询核苷酸放置在发夹茎结构的上游，且与其紧邻。在某些实施方案中，近端核苷酸是5’侧双链发夹结构上游2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。查询核苷酸也可以称作“等位基因特异性的核苷酸”。在某些实施方案中，如果在靶物中存在对应的互补核苷酸，查询核苷酸会与切割酶识别的靶分子建立重叠的三部分结构。
附图说明
图1显示了使用帽缘内切核酸酶和连接酶切割和连接靶分子到固定在微阵列固体支持物上的探针上的一个示例性实施方案；A) 与潜在靶DNA序列缔合的靶DNA分子的一条链的4种探针的集合，B) 帽缘内切核酸酶切割与互补探针缔合的正确靶核酸序列，不切割不正确的靶序列，和C) 正确靶序列的5’末端与探针的3’末端连接，不正确的靶序列不连接探针。
图2显示了使用帽缘内切核酸酶和连接酶切割和连接靶分子到溶液中的标记的探针上的一个示例性实施方案；A) 当形成侵入性复合物时，进行序列特异性的切割，随后把靶分子 (SEQ ID NO: 33)连接到生物素化的探针(SEQ ID NO: 32)上，和B) 将含有共价结合的靶分子的标记的探针捕获到用抗生蛋白链菌素包被的珠子上。
图3显示了本文所述寡核苷酸探针(SEQ ID NO: 1)的一个示例性发夹序列。
图4显示了使用本发明的方法捕获CPK6 靶序列的实验数据; 靶序列被含有发夹的探针捕获，被FEN切割，并连接到探针上，而对照序列则不然。
图5显示的实验数据证实了本发明的方法在捕获靶序列中的效率(正确的对比不正确的碱基调用)，和捕获正确的对比不正确的靶序列的差异倍数。
图6显示了用于产生的碎裂的实验DNA 的3种不同的大肠杆菌扩增和限制酶切消化图谱。
图7例证了本发明在鉴别基因组突变中的应用。
图8证实了5’ 帽缘长度对不同切割酶分子活性在正确执行碱基调用的能力方面的影响，通过低辨别评分来指示(<0.5 D评分)。
图9例证了RecJ的增强切割酶活性的作用; A) 显示了没有RecJ时的切割酶反应，B) 显示了在有RecJ存在下增强的切割酶活性。
图10解释了在切割酶和连接酶反应中单对比双酶特异性的发夹构型的对比。A, C) 发夹构型具有例如从5’至3’合成的寡聚体探针(SEQ ID NO: 11-14, 34-37)，其含有茎-长度(6碱基对–12碱基对)的发夹，且含有在3’末端的1碱基对突出端。B, D) 发夹构型具有例如从5’至3’合成的寡聚体探针(SEQ ID NO: 16-19, 38-41)，其含有茎-长度(6碱基对–12碱基对)的发夹。它们产生碱基特异性的底物，用于连接发夹的3’末端和切割的靶物的5’末端(SEQ ID NO: 15, 42)。OL是指在查询位点处的重叠。因此，OL1是指1个核苷酸的重叠，OL0是指在查询位点处的0个或没有重叠。
图11显示了使用不同发夹构型，跨83碱基对 PCR片段，对碱基调用的特异性的评价。跨83碱基对片段，为每个碱基计算辨别评分，并相对于2类发夹构型绘图；1) 双 (OL0)和2) 单(OL1) 酶特异性。在每类中，对比了几个茎和环序列。没有发夹(No_HP)的对照探针集合具有最低的辨别，而双酶发夹构型具有最高的辨别。
图12显示了使用不同发夹构型，跨83碱基对 PCR片段，对碱基调用的特异性的评价。跨83碱基对片段，为每个碱基计算辨别评分，并相对于2类发夹构型绘图；1) 双(OL0) (SEQ ID NO: 20-25)和2) 单(OL1) (SEQ ID NO: 26-31)酶特异性。在每类中，对比了几个茎和环序列。
发明详述
本发明提供了使用帽缘内切核酸酶和连接酶的方法和测定，它们用于在固体基质上和在溶液中靶向捕获核酸的方法和测定中。下面描述了本发明的某些例证性的实施方案。本发明不限于这些实施方案。
帽缘内切核酸酶(FEN)（也称作切割酶）是能以序列特异性的方式切割核酸的结构特异性的酶。所述酶已经用作来自Third Wave Technologies的Invader®基因分型和核酸检测技术的开发中的组分，参见例如美国专利和公开的专利申请5,843,669、5,888,780、6,090,606、6,562,611、7,122,364、2007/0003942、2007/0292856、2006/0292580、2006/0183207、2006/0177835、2006/0154269和2006/0040294，它们都通过援引整体并入本文。帽缘内切核酸酶组成和方法的其它实例参见美国专利和公开的专利申请6,255,081、6,251,649、6,979,725、5,874,283、2007/0292934、2007/0292864、2007/0231815和2007/0105138，它们都通过援引整体并入本文。FEN的内切核酸酶活性包括，识别具有在一条链上的5’突出端(帽缘)的DNA双链体，其称作侵入性复合物 (如图1和2所示)。FEN会催化在单链和双链DNA的接头处的磷酸二酯键的水解切割(Harrington, J.J.,和Lieber, M.R., EMBO J 13(5) (1994) 1235-46; Harrington, J.J.,和Lieber, M.R., J Biol Chem 270(9) (1995) 4503-8; 通过援引整体并入本文)。FEN的识别和切割特定二级结构的能力，允许在没有核酸的具体序列的现有知识的情况下，将这些酶用于检测核酸内部序列差异。在本发明的某些实施方案中，当探针的3’末端核苷酸存在于靶核酸样品中时，产生由FEN识别的特定结构，并发生FEN切割。但是，当探针中的序列与靶序列不互补时，不会形成结构，也不会发生FEN切割。这样，实现靶核酸的序列特异性识别。
另外预见到连接酶（尤其是热稳定的连接酶）用于本发明的方法和测定中。如果FEN识别的结构存在，在FEN切割靶分子之后，进行探针3’末端与靶分子5’末端的连接。如熟练的技术人员已知的，连接酶会催化双链体 DNA或RNA中并置的3’羟基和5’磷酸酯末端之间共价磷酸二酯键的形成(如图1和2所示)。在本发明的优选实施方案中，预见到热稳定的连接酶。热不稳定的连接酶，诸如T4 DNA连接酶，在室温表现出最佳酶活性。热稳定的连接酶，例如在细菌嗜热水生菌（Thermus aquaticus）和激烈热球菌（Pyrococcus furiosus）中发现的那些，在高得多的温度、例如大于45℃表现出最佳酶活性，当应用于本文所述的本发明的方法和测定中时，允许温度条件的更大柔性。热稳定的连接酶的实例参见，例如，美国专利和公开的专利申请6,949,370、6,576,453、6,280,998、6,444,429、5,700,672、2007/0037190、2005/0266487和欧洲专利公开WO 07/035439，它们都通过援引整体并入本文。一旦FEN已经切割靶核酸，通过连接酶的连接会将靶序列共价连接至探针上，其中所述探针是固定在固体支持物（例如微阵列载玻片）上，或保持在溶液中。这样，实现靶核酸的序列特异性的捕获。
另外预见到，一旦所述杂交反应中的侵入性复合物被切割酶识别，在有或没有ssDNA结合蛋白(SSBP)的情况下，包含RecJ，会增强切割酶的功效。Rec J外切核酸酶(RecJ)会以5’-3’方向降解单链DNA，并另外参与错配修复和同源重组(Lovett, S.T.,和Kolodner, R.D., Proc Natl Acad Sci 86 (1989) 2627-2631; Yamagata, A., 等人, Nucl Acids Res 29(22) (2001) 4617-4624; Han, E.S., 等人, Nucl Acids Res 34(4) (2006) 1084-1091; 通过援引整体并入本文)。Rec J 会以同等的亲和力降解磷酸化的和未磷酸化的DNA末端，但是要求单链末端的长度是至少7个核苷酸。Rec J是一种渐进的外切核酸酶，在它结合单链末端后，会降解大约1000个核苷酸，通常在它到达双链DNA接头时停止。但是，RecJ核酸酶活性不是精确的，它可能在接头之前几个核苷酸或在接头之后几个碱基对停止降解活性。已经提出，通过将单链DNA结合蛋白加入降解反应物中，可以增强Rec J向单链DNA 的募集 (Han, E.S., 等人, Nucl Acids Res 34(4) (2006) 1084-1091)。这样，预见到包含RecJ外切核酸酶和SSBP中的一种或更多种，以增强切割酶活性，在本文所述的靶核酸的序列特异性捕获中实现更高的效率。
在某些实施方案中，将寡核苷酸探针在它们的5’末端或5’侧或5’臂处连接到固体支持物（诸如微阵列载玻片）上，其中所述探针包含单链的、且与靶序列互补的中枢部分，和包含发夹结构（其包含被互补核酸的双链区域结合的单核苷酸环）的3’末端区域，且在末端是对目标靶序列特异性的3’末端碱基(例如，用于测定基因组突变诸如单核苷酸多态性的查询核苷酸)。在某些实施方案中，所述对靶序列特异性的碱基（例如，用于测定突变或多态性）的位置紧挨着探针5’-侧的发夹环结构。在优选的实施方案中，双链发夹区域是至少3个碱基对、至少5个碱基对、至少6个碱基对、至少8个碱基对、至少10个碱基对、至少16个碱基对。在有利于互补DNA链的杂交的条件下，将核酸探针与核酸链(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA、mRNA、tRNA等)的复合靶群体、例如人基因组 DNA (gDNA) (例如，完整的或碎裂的)一起温育，使得与核酸探针5’末端的单链部分和探针3’末端碱基互补的核酸序列与探针特异性地杂交。在某些实施方案中，用例如可检测的部分 (例如，荧光团、生色团、放射性同位素等)在3’末端标记靶核酸。
在某些实施方案中，本发明提供了在它们的5’末端连接到固体支持物（诸如微阵列载玻片）上的寡核苷酸探针，其中所述探针包含单链的、且与靶序列部分互补的中枢部分，和包含发夹结构（其包含被互补核酸的双链区域结合的单核苷酸环）的3’末端区域，且在末端是与靶序列互补的3’末端碱基，其中在包含发夹结构的互补核酸的双链区域的5’末端近端的核苷酸包括与目标靶序列互补的序列 (例如，用于测定基因组突变诸如单核苷酸多态性的查询核苷酸)。在优选的实施方案中，近端核苷酸紧邻双链发夹结构。在某些实施方案中，近端核苷酸是在5’侧双链发夹结构上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。在优选的实施方案中，双链发夹区域是至少3个碱基对、至少10个碱基对、至少16个碱基对。在有利于互补DNA链的杂交的条件下，将核酸探针与核酸链(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA、mRNA、tRNA等)的复合靶群体、例如人基因组 DNA (gDNA) (例如，完整的或碎裂的)一起温育，使得与核酸探针5’末端的单链部分和探针3’末端碱基互补的核酸序列与探针特异性地杂交。在某些实施方案中，用例如可检测的部分 (例如，荧光团、生色团、放射性同位素等)在3’末端标记靶核酸。
在某些实施方案中，本发明提供了在它们的5’末端连接到固体支持物（诸如微阵列载玻片）上的寡核苷酸探针，其中所述探针包含单链的、且与靶序列互补的中枢部分，和包含发夹结构（其包含被互补核酸的双链区域结合的单核苷酸环）的3’末端区域，且在末端是与靶序列互补的3’末端碱基。在优选的实施方案中，双链发夹区域是至少3个碱基对、至少10个碱基对、至少16个碱基对。在有利于互补DNA链的杂交的条件下，将核酸探针与核酸链(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA、mRNA、tRNA等)的复合靶群体、例如人基因组 DNA (gDNA) (例如，完整的或碎裂的)一起温育，使得与核酸探针5’末端的单链部分和探针3’末端碱基互补的核酸序列与探针特异性地杂交。在某些实施方案中，用例如可检测的部分 (例如，荧光团、生色团、放射性同位素等)在3’末端标记靶核酸。在某些实施方案中，寡核苷酸探针可以用于杂交测定中，用于测定基因异常诸如缺失、易位等，所述寡核苷酸探针包含单链的、且与靶序列互补的中枢部分，和包含发夹结构（其包含被互补核酸的双链区域结合的单核苷酸环）的3’末端区域，且在末端是与靶序列互补的3’末端碱基。
在某些实施方案中，如在DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual, 2003, Bowtell和Sambrook编, Cold Spring Harbor Laboratory Press（通过援引整体并入本文）中所述，合成寡核苷酸探针，并固定在基质（例如微阵列载玻片或芯片）上。在优选的实施方案中，使用例如在美国专利和专利公开7,157,229、7,083,975、6,444,175、6,375,903、6,315,958、6,295,153、5,143,854、2007/0037274、2007/0140906、2004/0126757、2004/0110212、2004/0110211、2003/0143550、2003/0003032和2002/0041420（它们都通过援引整体并入本文）中所述的无掩膜阵列合成仪(MAS)，直接在基质（诸如微阵列载玻片）上合成捕获寡核苷酸探针。当使用MAS仪器来印迹微阵列时，在软件控制下，直接在微阵列载玻片上原位构建寡核苷酸探针序列的选择，从而建立基于研究人员的特定需要的个别地定制的阵列。这样的阵列包含数百、数千和数百万的探针。
通常从3’至5’合成寡核苷酸探针，无论是在基质(例如，微阵列载玻片)上原位合成(例如，MAS 合成)，还是先合成再印迹到基质上。但是，由于大多数核酸酶(例如，限制性内切核酸酶、聚合酶、末端转移酶、连接酶、激酶、磷酸酶等)具有从5’至3’的活性，酶促反应要求使用反向化学方法(例如，从5’至3’)合成探针。这样，本发明的方法和测定实施方案包含使用在例如Albert, T.J., 等人, Nucl Acids Res 31(7) (2003) e35（其通过援引整体并入本文）中所述的MAS仪器原位合成优先从5’至3’合成的寡核苷酸探针。
本发明提供了用于检测核酸序列中的差异（例如单核苷酸多态性、基因组拷贝数变体、甲基化状态等）的方法和测定。在本发明的方法和测定中，使靶核酸与探针杂交，其中所述探针固定在基质上(例如，通过原位合成或其它方法)或在溶液中。在某些实施方案中，探针的长度是至少15个核苷酸(nts)、至少20 nts、至少25 nts、至少30 nts、至少35 nts、至少40 nts、至少45 nts、至少50 nts、至少55 nts、至少60个核苷酸。在某些实施方案中，在基质（例如微阵列载玻片、微阵列芯片、珠子、平板等）上原位合成本发明的探针。在优选的实施方案中，使用MAS仪器原位合成探针，其中探针的5’末端固定在基质上。在某些实施方案中，在溶液中合成探针，并保持在溶液中。
本发明的探针包含与靶序列互补的单链5’末端，包含发夹结构（其包含一系列产生双链区域的互补碱基和在双链区域中产生单链区域(例如，发夹结构)的不互补的序列）的3’末端，和与特定靶序列互补的3’末端碱基。在某些实施方案中，所述发夹结构的长度是至少5个碱基、10个碱基、至少12个碱基、至少14个碱基、至少16个碱基、至少18个碱基。在某些实施方案中，所述发夹结构优选是16个碱基。在某些实施方案中，所述发夹结构包含如图3所示的SEQ ID NO: 1。但是，本发明不受发夹结构序列的限制，发夹结构的其它实例和它们的设计参见，Varani, G., Ann Rev Biophys Biomol Struct 24 (1995) 379-404和Antao, V.P., 等人, Nucl Acids Res 19(21) (1991) 5901-5，它们二者通过援引整体并入本文。如图1和2所示，探针上与探针发夹的3’末端碱基互补的核苷酸碱基决定了测定特异性，且有时称作“等位基因特异性的碱基”。如图10所示，在发夹结构近端的探针5’-侧或臂上的核苷酸碱基也决定了测定特异性。当等位基因特异性的碱基与靶链的对应碱基互补时，发夹和靶分子形成特定结构，称作“侵入性复合物”，其被FEN酶识别。当碱基特异性的核苷酸存在于靶链中时，FEN会在该碱基的3’侧切割靶链，从而释放未杂交的或帽缘的靶链5’末端。如果碱基不与等位基因特异性的碱基互补，则侵入性复合物不会形成，FEN也不会切割靶分子。
在某些实施方案中，在探针与靶核酸杂交后，将探针/靶物复合物与混合液一起温育，所述混合液包含下述的一种或更多种：帽缘内切核酸酶(FEN)、连接酶、RecJ、ssDNA结合蛋白和发生酶促反应所需的适当缓冲液和辅因子 (ATP或NAD+)。FEN会切割形成侵入性复合物的靶分子，在核酸探针发夹和靶核酸分子之间产生间隙。预见到，在有或没有ssDNA结合蛋白的情况下，包含RecJ，会提高切割酶反应的效率，从而提高在侵入性复合物的切割中的敏感性。连接酶会修复间隙，将靶分子共价连接到探针上。如果侵入性复合物没有形成，则FEN不会切割，靶分子也不会连接到探针上。随后通过洗涤，将未结合的分子与结合的靶物分离。由于靶分子共价结合到在基质上的探针上，可以用比应用于非共价结合的杂交方法的那些高得多的严格性进行洗涤，从而增强非特异性地结合的非靶分子的去除，并极大提高捕获特异性和信噪比。
在某些实施方案中，使用本文所述的和熟练的技术人员已知的数据分析仪器和软件，通过可检测的方式(例如比色法、放射测量术、荧光分析法、凝胶电泳等)，鉴别结合探针的靶分子。
由于靶分子共价结合到探针上，阵列能够用高严格性洗涤，以去除未结合的非靶分子，从而更大地减少背景信号，并提高测定的信噪比。本发明的用途包括、但不限于：比较基因组杂交(CGH)、单核苷酸多态性基因分型、基因转录描绘、基因组甲基化分析、染色质免疫沉淀绘图等。
在某些实施方案中，本发明提供了用于DNA的靶物捕获的测定和方法，例如，用于高流通量测序应用和其它下游应用。
在某些实施方案中，核酸探针是在溶液中，且在它们的5’末端结合到可捕获的部分（例如生物素部分）上(图2)。核酸探针另外包含如前所述的单链的、且与靶序列互补的5’ 区域，和包含发夹结构（其包含被互补核酸的双链区域结合的单核苷酸环）的3’末端区域。在某些实施方案中，所述发夹结构的长度是至少5个碱基、10个碱基、至少12个碱基、至少14个碱基、至少16个碱基、至少18个碱基。在某些实施方案中，所述探针的长度是至少15个核苷酸(nts)、至少20 nts、至少25 nts、至少30 nts、至少35 nts、至少40 nts、至少45 nts、至少50 nts、至少55 nts、至少60个核苷酸。预见到，所述探针优选小于100个碱基。在某些实施方案中，所述发夹序列包含可切割的序列，用于在连接后从探针释放结合的靶序列。例如，所述发夹序列包含限制性内切核酸酶(RE)位点或一个或更多个尿嘧啶。在有利于互补DNA链的杂交的条件下，将核酸探针与核酸链(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA、mRNA、tRNA等)的复合靶群体、例如碎裂的人基因组 DNA (gDNA)一起温育，使得与核酸探针5’末端的单链部分互补的基因组片段与探针特异性地杂交。在某些实施方案中，用例如可检测的部分 (例如，荧光团、生色团、放射性同位素等)在3’末端标记靶核酸。
当等位基因特异性的碱基与靶链的对应碱基互补时，如图2所示，发夹和靶分子杂交，并形成被FEN酶识别的特定结构。当碱基特异性的核苷酸存在于靶链中时(图2)，FEN会在该碱基的3’侧切割靶链，从而释放未杂交的或帽缘，靶链5’末端。如果碱基不与等位基因特异性的碱基互补，则侵入性复合物不会形成，FEN也不会切割靶分子。预见到，在有或没有ssDNA结合蛋白的情况下，与FEN组合地包含RecJ，会提高切割酶的效率。
在某些实施方案中，在杂交后，将探针复合物与混合液一起温育，所述混合液包含下述的一种或更多种：FEN酶、连接酶、RecJ、ssDNA结合蛋白、发生需要的酶促反应所需的适当缓冲液和辅因子 (ATP或NAD+)。FEN会切割形成侵入性复合物的靶分子，在核酸探针发夹和靶核酸分子之间产生间隙。如前所述，通过将靶分子共价连接到探针上，连接酶会修复间隙。如果侵入性复合物没有形成，则FEN不会切割，靶分子也不会连接到探针上。在某些实施方案中，如图2B所示，共价结合到在溶液中的标记的探针（在该情况下，生物素标记的探针）上的靶分子，被抗生蛋白链菌素(SA)包被的珠子捕获（例如，结合），其中抗生蛋白链菌素结合标记的探针的生物素，正如本领域技术人员已知的。在抗生蛋白链菌素结合后，从溶液中取出珠子，并洗涤，从而从捕获珠子上的结合的靶分子去除未结合的、未靶向的分子，并从不希望的反应组分将靶分子/探针复合物纯化出来。由于靶分子共价结合到SA结合的生物素标记的探针上，可以用比应用于非共价结合的杂交方法的那些高得多的严格性进行洗涤，从而增强非特异性地结合的非靶分子的去除，并极大提高捕获特异性和信噪比。
在某些实施方案中，通过将包含靶分子的珠子暴露于限制性内切核酸酶，从SA结合的探针释放靶分子，例如当RE的识别位点在合成过程中掺入探针的发夹序列中时。在某些实施方案中，如果一个或更多个尿嘧啶在合成过程中掺入发夹中，通过与尿嘧啶-DNA-转葡糖基酶(UDG)一起温育，随后用内切核酸酶VIII消化受损的位点，从SA结合的探针释放靶分子。本发明不限于从结合的探针释放靶分子的方法，预见到本领域已知的切割DNA的其它方法用于本发明的方法和测定中。
释放后，将靶向的分子应用于下游用途，诸如使用例如高流通量测序仪测序。本发明的方法和测定另外为研究人员提供了精确确定每个捕获的靶核酸分子的终点和方向性的能力，且作为结果，每次测序都读出。预见到，使用本文所述的酶方法释放靶序列，适合从探针释放靶序列，其中所述探针如本文所述在固体支持物（诸如微阵列载玻片）上合成。
在某些实施方案中，本发明的方法和测定提供了单核苷酸多态性(SNP)的分析。在某些实施方案中，本发明提供了用于分析DNA样品（例如基因组DNA样品）中的拷贝数变化(CNV)的方法和测定。SNP和CNV分析可用于关联研究中，例如在不同物种之间和在与疾病和病症有关的SNP和CNV之间。这样，本发明的方法和测定提供了基因组变化和它们与特定受试者（例如人受试者）中的疾病的关联的分析。但是，预见到，本发明不限于来自任何特定属和/或种的基因组序列的分析，例如认为任意原核生物或真核生物序列适合使用本发明，用于研究、诊断或治疗用途。
在某些实施方案中，本发明不限于杂交条件的特定集合。但是，优选采用本领域技术人员已知的严格杂交条件。本发明使用的杂交溶液包括、但不限于：在NimbleGen 杂交试剂盒 (Roche NimbleGen, Madison WI)中发现的那些。在某些实施方案中，本发明提供了在酶切割和连接反应后洗涤探针/靶物复合物，从而去除未结合的和非特异性地结合的核酸分子。在某些实施方案中，本发明提供了差别严格性的洗涤，例如包含0.2x SSC、0.2%(v/v)SDS和0.1 mM DTT的洗涤缓冲液I，包含0.2x SSC和0.1 mM DTT的洗涤缓冲液II，和包含0.5x SSC和0.1 mM DTT的洗涤缓冲液III。在某些实施方案中，用于洗涤、杂交和酶促反应的溶液和缓冲液包含锂。本发明不受杂交和/或洗涤缓冲液的组成的限制。在某些实施方案中，在例如 RE消化后，使用例如水或本领域技术人员已知的类似的低溶质溶液，从探针洗脱靶序列。
在某些实施方案中，本发明提供了靶核酸序列的捕获，其随后用于靶向的基于阵列的、基于鸟枪法的、基于毛细管的或本领域已知的其它测序方法中。如熟练的技术人员已知的，通过合成的测序被理解为一种测序方法，其监视特定脱氧核苷-三磷酸在测序反应中掺入后副产物的产生（Ronaghi, M., 等人, Science 281 (1998) 363-65，其通过援引整体并入本文）。例如，一个或更突出的通过合成反应测序的实施方案是焦磷酸测序方法。在焦磷酸测序中，通过导致化学发光信号产生的酶级联，监视在核苷酸掺入过程中焦磷酸的产生。454 基因组测序仪系统(Roche Applied Science 目录号04760085001)是基于焦磷酸测序技术。为了在454 GS20或454 FLX仪器上测序，平均基因组DNA片段大小优选地分别是200或600碱基对。通过合成反应的测序，也可以包含终止子染料类型测序反应。在该情况下，掺入的dNTP构件块包含可检测的标记诸如荧光标记，其阻止新生DNA链的进一步延伸。在dNTP构件块掺入模板/引物延伸杂合体后，通过例如使用具有3'-5'外切核酸酶或校正活性的DNA 聚合酶，去除并检测标记。但是，本发明不受可与本发明组合使用的下游用途的类型的限制。
在某些实施方案中，通过酶消化(例如，限制性内切核酸酶、UDG和Endo VIII等)，从寡核苷酸探针释放靶序列，从探针洗脱，并测序。在某些实施方案中，使用454 Life Sciences Corporation测序仪进行测序。在某些实施方案中，本发明提供了根据生产商的方案，通过乳状液PCR (emPCR)洗脱后，进行靶序列扩增。根据生产商的方案，将包含来自emPCR的克隆地扩增的靶核酸的珠子转移进picotiter平板，并进行焦磷酸测序反应，用于序列测定。
在某些实施方案中，本发明提供了方法和测定，其中预见到复数种不同靶序列用于在一个阵列上或在一种溶液中的检测，例如用于同时捕获和检测多种靶序列。在这样的实施方案中，预见到双色标记(例如，双通道荧光、荧光/非荧光等)。例如，一种靶序列用一种可检测的部分标记，另一种靶序列用第二种可检测的部分标记。例如，一种靶序列用荧光素部分(例如，荧光素、Cy-3、Cy-5等)标记，第二种靶序列用非荧光部分(例如，生物素、地高辛配基)或波长检测不同于第一种荧光部分的荧光部分标记。末端转移酶可以用于3’末端标记靶序列，其中使用例如，荧光团(例如，荧光素-12-ddCTP)和第二种部分(例如，生物素-11-ddCTP)的ddCTP缀合物。这样，双通道检测或差别部分检测允许区分2种不同的捕获靶序列。
在某些实施方案中，进一步放大实践本文所述的本发明的方法和测定结束后检测到的信号。信号放大方法的实例包括、但不限于：在通过例如 NEN® Life Sciences Products, Inc. (Boston MA) 可商业得到的Tyramide信号放大试剂盒中发现的那些。
在某些实施方案中，在结合的靶序列上进行数据分析。进行数据分析，例如，以鉴别在捕获的靶序列中发现的SNP或CNV。使用任意阵列扫描仪，例如Axon GenePix 4000B 荧光扫描仪，进行数据分析。通过扫描仪捕获到数据后，使用生物信息学程序分析捕获的数据。可用于来自荧光微阵列形式的数据分析的生物信息学程序包括、但不限于，SignalMap™ (NimbleGen)和NimbleScan™ (NimbleGen)。但是，能捕获和分析通过本发明方法产生的数据的任意扫描仪和生物信息学程序同样适用。数据输出显示在例如任意计算机屏幕或能显示实践本发明时产生的数据的其它装置上。
在某些实施方案中，本发明提供了用于实践本文所述的方法和测定的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含试剂和/或其它组分(例如，缓冲液、说明书、固体表面、容器、软件等)，它们足以执行本文所述的靶核酸分子的靶核酸捕获，或是执行本文所述的靶核酸分子的靶核酸捕获所必需的。试剂盒在一个或更多个容器(另外包含一个或更多个试管、包装等)中提供给使用者，所述容器可能需要差别储存，例如由于每种试剂盒组分/试剂对光、温度等的具体要求，将试剂盒组分/试剂差别储存。在某些实施方案中，试剂盒包含一种或更多种固体支持物，其中所述固体支持物是微阵列载玻片或复数个珠子，它们上面固定有复数种寡核苷酸捕获探针。在某些实施方案中，试剂盒包含在溶液中的寡核苷酸探针（其中所述探针包含捕获部分）和珠子，其中所述珠子设计成结合固定在寡核苷酸探针上的捕获部分。例如，这样的部分是生物素标记，其可以用于固定到抗生蛋白链菌素包被的固体支持物上。或者，这样的修饰是半抗原如地高辛配基，其可以用于固定到用半抗原识别抗体包被的固体支持物上。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒包含至少一种或更多种用于执行酶促反应的化合物和试剂，例如下述的一种或更多种：帽缘内切核酸酶、DNA连接酶、RecJ外切核酸酶、ssDNA结合蛋白、T4多核苷酸激酶、限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、末端转移酶、克列诺酶等。在某些实施方案中，试剂盒包含杂交溶液、洗涤溶液和/或洗脱试剂中的一种或更多种。在试剂盒中发现的洗涤溶液的实例包括、但不限于：洗涤缓冲液I (0.2x SSC, 0.2% (v/v) SDS, 0.1 mM DTT)和/或洗涤缓冲液II (0.2x SSC, 0.1 mM DTT)和/或洗涤缓冲液III (0.5x SSC, 0.1 mM DTT)。在某些实施方案中，在试剂盒中发现的一种或更多种缓冲液或溶液包含锂。在某些实施方案中，试剂盒包含一种或更多种洗脱溶液，其中所述洗脱溶液包含纯水和/或含有TRIS 缓冲液和/或EDTA的溶液或其它低溶质溶液。
提供下面的实施例来证实和进一步解释本发明的某些实施方案和方面，不应理解为限制其范围。
实施例 1
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和限制酶切碎的PCR 扩增子的靶物捕获
设计实验来测试在本发明的方法和测定中的连接效率。利用3’标记的CPK6寡核苷酸(Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville IA)和从大肠杆菌基因组DNA (ATCC号700926D-5)扩增的PCR片段设计实验，得到从约1100至约1500碱基对的扩增子 (SEQ ID NO: 2, 3和4)。设计了50和60聚体的寡核苷酸探针，其包含16碱基对发夹。使用的发夹序列是5’-CCGGAGGATACTCCG G-3’ (SEQ ID NO: 1)，如图3所示。合成了对照探针，其不含有发夹结构。设计了探针的四集体，其代表每条链的所有4种碱基，这样为查询序列内的靶核苷酸设计了共8个探针(例如，4个/DNA靶物的每条链)。除了在50/60聚体探针的3’末端上的末端碱基以外，每条链的每个四集体含有相同的探针序列。在Roche NimbleGen (Madison, WI)在阵列上原位合成探针，密度是210万探针/阵列 (HD2)。
使用PCR引物，从大肠杆菌基因组DNA扩增了3个PCR片段;
Figure 776939DEST_PATH_IMAGE002
PCR扩增条件包括，在94℃初期变性2 min，然后是30个94℃/30秒、55℃/60秒、72℃/60秒的循环，最后在72℃延伸7 分钟。用2种限制酶 (HhaI和NlaIII)消化片段，得到具有3’突出端的不同大小的片段。以等摩尔浓度合并限制酶切碎的扩增子，并用南极磷酸酶(antarctic phosphatase)(NEB)进一步处理，将5’末端脱磷酸。这会防止自身-自身连接，并指导与在阵列上合成的探针的非特异性连接。使用末端转移酶 (TdT, Roche)，用Cy3-ddCTP在它们的3’末端标记碎裂的和脱磷酸的扩增子，并使用本领域技术人员已知的方法，例如参见Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人编, Cold Spring Harbor Press (通过援引整体并入本文)，从未标记的片段中沉淀出来。将标记的片段与在3’末端用Cy3 (IDT)标记的磷酸化的CPK6寡核苷酸相组合。
用NimbleChip HX3混合器(Roche NimbleGen, Madison WI)密封微阵列载玻片。将变性的和标记的靶扩增子应用于微阵列。在微阵列上发现的探针包括含有和没有发夹的探针。在MAUI 杂交系统(BioMicro)中，在严格的条件下，使微阵列载玻片与靶序列一起在42℃杂交过夜，用洗涤缓冲液洗涤3次，并扫描。使用在适当缓冲液中的Ampligase® (Epicentre, Madison WI)进行连接，并在45℃温育4小时。将载玻片洗涤3次，在恒定搅拌下在水中煮沸阵列大约2 分钟。煮沸后，洗涤微阵列载玻片，并扫描。使用Axon GenePix 4000B 荧光扫描仪进行扫描。为每次扫描捕获数据，并使用SignalMap™ (NimbleGen)和NimbleScan™ (NimbleGen) 软件应用程序进行数据分析。
结果表明，对于没有发夹的探针(CPK6对照)，没有靶物捕获 (图4)。但是，当探针包含发夹且靶片段序列包含互补的靶碱基时，连接酶会将靶序列连接到探针上。靶序列捕获对于每个限制片段5’末端的末端碱基的身份是特异性的，使得对于代表序列的部分片段的查询碱基的每个探针四集体，4个探针中仅有一个具有连接的标记的片段。这导致与每条链的四集体中的其它3个碱基的背景强度相比正确连接探针的高信号强度。与含有正确碱基的探针有关的信号强度，完美地鉴别出了HhaI和NlaIII的限制位点位置的基于序列的预测。
实施例 2
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和PCR 扩增子的靶物捕获
设计实验来测试帽缘内切核酸酶和在本发明的方法和测定中的连接效率。如实施例1所述，利用3’标记的CPK6寡核苷酸(IDT)和从大肠杆菌基因组DNA扩增的PCR片段设计实验。设计了50和60聚体的寡核苷酸探针，其包含在末端3’末端的16碱基对发夹和互补碱基。使用的发夹序列是
Figure 886639DEST_PATH_IMAGE004
。合成了对照探针，其不含有发夹结构。设计了探针的四集体，如图1A所示，其代表每条链的所有4种碱基，这样为查询序列内的靶核苷酸设计了共8个探针(例如，4个/DNA靶物的每条链)。在Roche NimbleGen (Madison, WI)在阵列上原位合成探针，密度是210万探针/阵列 (HD2)。
使用如前所述的PCR引物和条件，从大肠杆菌基因组DNA扩增了3个PCR片段。用2种限制酶 (HhaI和NlaIII)消化片段，得到具有3’突出端的不同大小的片段。以等摩尔浓度合并限制酶切碎的扩增子，并用南极磷酸酶(NEB)进一步处理，将5’末端脱磷酸。这会防止自身-自身连接，并指导与在阵列上合成的探针的非特异性连接。使用末端转移酶 (TdT, Roche)，用Cy3-ddCTP在它们的3’末端标记碎裂的和脱磷酸的扩增子，并使用本领域技术人员已知的方法，例如参见Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人编, Cold Spring Harbor Press (通过援引整体并入本文)，从未标记的片段中沉淀出来。将标记的片段与在3’末端用Cy3 (IDT)标记的脱磷酸化的CPK6寡核苷酸相组合。
用NimbleChip HX3混合器(Roche NimbleGen, Madison WI)密封微阵列载玻片，并将变性的、标记的靶扩增子应用于微阵列。在微阵列上发现的探针包括含有和没有发夹的探针。在MAUI 杂交系统(BioMicro)中，在严格的条件下，使微阵列载玻片与靶序列一起在42℃杂交过夜，用洗涤缓冲液洗涤3次，并扫描。将在适当缓冲液(10 mM MOPs: pH 7.5, 100 mM LiCl, 4 mM MgCl2 )中的切割酶加到含有结合的靶序列的微阵列载玻片上，将反应物在45℃温育1小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，并扫描。使用在适当缓冲液中的Ampligase® (Epicentre, Madison WI)进行连接，并在45℃温育4小时。将载玻片洗涤3次，在恒定搅拌下在水中煮沸阵列大约2 分钟。煮沸后，洗涤微阵列载玻片，并扫描。使用Axon GenePix 4000B 荧光扫描仪进行扫描。为每次扫描捕获数据，并使用SignalMap™ (NimbleGen)和NimbleScan™ (NimbleGen) 软件应用程序进行数据分析。
结果表明，对于没有发夹的探针(CPK6对照)，没有靶物捕获。但是，当探针包含发夹（其含有与靶序列互补的碱基）且靶序列包含靶碱基时，FEN和连接酶会切割靶序列，并将靶物连接到探针上（分别地）。靶序列捕获对于互补碱基的身份是特异性的，使得对于代表序列的部分片段的查询碱基的探针四集体，在切割酶反应后，4个探针中仅有一个具有连接的标记的片段。这导致与每条链的四集体中的其它3个碱基的背景强度相比正确碱基调用的高信号强度(图5)。将四集体内正确的和不正确的碱基之间的差异倍数计算为正确碱基调用的信号强度除以3个不正确的碱基的平均值的比率。如图5所示，在探针之间检测到高达35倍的变化倍数，所述探针在阵列上合成，用于查询PCR 扩增子的所有片段。
实施例 3
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和随机碎裂的基因组DNA的靶物捕获
利用人和大肠杆菌基因组DNA (gDNA)设计实验。如实施例1所述，设计寡核苷酸探针，从而在Roche NimbleGen (Madison, WI)上原位合成探针，密度是210万探针/阵列 (HD2)。通过超声处理碎裂基因组DNA (gDNA)，或使用不同长度的随机引物(9聚体、10聚体、12聚体和15聚体)，使用克列诺片段，随机扩增基因组DNA (gDNA)，得到不同长度的扩增的靶序列。用南极磷酸酶处理片段，使用末端转移酶(TdT)，用Cy3-ddCTP在它们的3’末端进行标记，并使用本领域技术人员已知的方法，从未标记的片段中沉淀出来。用HX3混合器(NimbleGen Roche)密封微阵列载玻片，并将变性的、标记的靶序列应用于微阵列(5-30 µg样品/子阵列)。在微阵列上发现的探针包括含有和没有在它们的3’末端发夹之后且紧邻的互补碱基的探针，以及没有发夹的探针。使微阵列载玻片与靶序列一起在42℃杂交过夜，用洗涤缓冲液洗涤3次，并扫描。将在适当缓冲液中的切割酶加到含有结合的靶序列的微阵列载玻片上，将反应物在42℃温育1-2小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，并扫描。使用在适当缓冲液中的Ampligase® (Epicentre, Madison WI)进行连接，并在45℃温育4小时。将载玻片洗涤3次，在恒定搅拌下在水中煮沸阵列大约2 分钟。煮沸后，洗涤微阵列载玻片，并使用Axon GenePix 4000B 荧光扫描仪扫描。通过扫描仪捕获数据，使用SignalMap™ (Roche NimbleGen Inc.)和NimbleScan™ (Roche NimbleGen Inc.) 软件应用程序进行数据分析。
结果表明，对于没有发夹的探针(对照)，没有靶物捕获。但是，当探针包含发夹（其含有互补碱基）且靶序列包含靶碱基时，FEN和连接酶会在鉴定靶物捕获的序列中提供测定特异性，正如通过荧光检测方法所测得的。
实施例 4
具有递增ssDNA帽缘长度的切割酶的评价
评价了20种切割酶在切割酶反应中的功效；任意地命名为C1-C5、P1-P3和F1-F12。切割酶由Third Wave Technologies (Madison, WI 53719)提供。Ampligase® (Epicentre, Madison WI)。每个实验使用2个微阵列载玻片（各自含有12个相同的子阵列），以覆盖测定的所有20种切割酶，使用反向化学方法(在探针5’末端是在基质近端时，5’-3’合成)，通过MAS合成它们的探针，12个子阵列中的每一个含有大约120,0000个探针。将探针设计成代表3种不同的PCR片段，3种片段中每一种的有义和反义链。将每个探针设计成具有与靶扩增子序列和16碱基对发夹(序列5’-CCGGAG GATACTCCGG-3’(SEQ ID NO: 1 ，如图3所示)相关的序列特异性，3’突出端代表查询序列内靶核苷酸的有义和反义链 (因此，8个探针/ PCR片段)的A、C、T或G。合成了不包含发夹结构的对照探针。
扩增了大肠杆菌的3种不同的片段，得到1277、2205和2825碱基对扩增子。通过限制酶切消化，进一步碎裂每个扩增子；用NlaIII消化1277碱基对和2825碱基对扩增子，并用MboI消化2205碱基对扩增子，得到不同长度的消化的片段(图6)。用南极磷酸酶(NEB) 处理片段，以将5’末端脱磷酸。这会防止自身-自身连接，并指导与在阵列上合成的探针的非特异性连接。使用末端转移酶 (TdT, Roche)，用Cy3-ddCTP在它们的3’末端标记碎裂的和脱磷酸的扩增子，并使用本领域技术人员已知的方法，例如参见Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人编, Cold Spring Harbor Press (通过援引整体并入本文)，从未标记的片段中沉淀出来。
将标记的靶核酸变性，并应用到微阵列载玻片上的子阵列上。在MAUI 杂交系统(BioMicro)中，在严格的条件下，使微阵列载玻片与靶序列一起在42℃杂交过夜，用洗涤缓冲液洗涤3次，并扫描。将在切割酶缓冲液(10 mM MOPs的终浓度: pH 7.4, 100 mM LiCl, 4 mM MgCl2, 1X NAD)中的20种实验切割酶和Ampligase®之一加入含有结合的靶序列的微阵列载玻片上的每个子阵列，在45℃温育反应物2小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，并扫描。将另一轮Ampligase®（这次在它的适当缓冲液中）加入每个子阵列，在45℃温育另外4小时。将载玻片洗涤3次，在恒定搅拌下在水中煮沸阵列大约2 分钟。煮沸后，再次洗涤微阵列载玻片，并扫描。使用Axon GenePix 4000B 荧光扫描仪进行扫描。为每次扫描捕获数据，并使用SignalMap™ (Roche NimbleGen Inc.)和NimbleScan™ (Roche NimbleGen Inc.) 软件应用程序进行数据分析。
图7证实了切割酶/连接酶组合在测定遗传序列（在该情况下，PCR片段，其中靶序列在查询位置具有“C”）中的功效。过夜杂交后，探针序列的结合的靶物之间没有差别，而切割酶和连接酶的掺入急剧增加了差别，导致在该位置的正确碱基调用。此外，图8 证实，随着结合的靶片段的5’末端长度的增加(例如，帽缘长度增加)，不正确碱基调用增加。碱基调用或在单核苷酸处的辨别，可以通过计算来确定：
Figure 701011DEST_PATH_IMAGE005
低辨别评分表示正确碱基调用的可靠性增加，且通常随着帽缘长度增加，辨别评分也增加，不正确碱基调用的发生率也是如此。图8证实了该现象，正如使用50碱基对帽缘长度作为参照点并使用<0.5D评分作为正确碱基调用评价的12种不同切割酶分子所例证的。
实施例 5
RecJ对切割酶活性的影响的评价
使用如实施例4所述的3种PCR片段，评价RecJ的增加切割酶的消化更长5’靶帽缘末端的活性的能力。除了下述例外以外，使用实施例4所述的实验参数。杂交过夜和严格性洗涤后，将在RecJ 缓冲液中的大约120单位的RecJf (New England Biolabs, Ipswitch MA; RecJ和麦芽糖结合蛋白(MBP)的重组融合蛋白，它保留了与野生型RecJ相同的酶性质(加入MBP来提高RecJ溶解度))加入阵列中，随后在37℃温育1小时。如前所述加入切割酶和热稳定的连接酶。如前所述分析阵列。
与切割酶组合地加入RecJ，极大提高了切割酶的活性。如图9B所示，与用没有RecJ的切割酶处理(图9A)相比，用与RecJ组合的切割酶处理杂交的复合物，提高了切割酶的活性。如前面证实的，在没有RecJ时，随着帽缘长度增加，不正确碱基调用的发生率增加，使得大于大约45碱基对的帽缘长度导致增加的D评分。相反，在有RecJ存在下，由于RecJ对靶帽缘突出端的活性，切割酶活性得到维持，得到的D评分是约0.5或更低，导致正确碱基调用的增加。这样，与切割酶组合地包含RecJ，会极大提高靶样品中正确碱基调用的发生率，无论靶帽缘突出端的长度。
实施例 6
查询核苷酸在探针的5’-侧定位
进行实验来评价查询核苷酸在探针上重新定位的结果和它对用于基因组突变检测的正确碱基调用的影响。不是将查询核苷酸放置在发夹结构之后和探针的3’末端(如图1、2A和3所示)，而是将查询核苷酸放置在5’侧 (或5’臂)上的发夹结构之前且紧邻(图10)，并将探针的3’末端设计成与已知的靶序列互补。预见到，通过将查询核苷酸放置在发夹结构邻近，实现切割酶和连接酶的双特异性（与仅切割酶相比），导致检测突变（包括SNP）的特异性。通过如所述地放置查询核苷酸，切割酶产生特异性，因为它的检测和切割三部分结构的活性，且连接酶会连接那些切割的产物（在查询核苷酸与它的互补物杂交的情况下）。这样，预见到，提供了双特异性，导致样品的假阳性碱基调用的减少。
图10解释了在切割酶和连接酶反应中单对比双酶特异性的发夹构型的对比。发夹构型具有从5’至3’合成的寡聚体探针，其含有茎-长度(例如，6碱基对 – 12碱基对)的发夹，且含有在3’末端的1碱基对突出端(图10A, C)。对于每个查询碱基，合成了4个含有发夹的探针，所述发夹含有单碱基对突出端，各自代表A、C、T和G。探针序列的3’末端也与发夹3’末端上的突出端互补。在图10B、D中的发夹构型具有从5’至3’合成的寡聚体探针，其含有茎-长度(例如，6碱基对 – 12碱基对)的发夹。对于每个查询碱基，合成了4个探针，其中发夹序列的最后一个碱基对设计成，它与已知靶序列的(查询碱基+1)互补。对于每个查询碱基，所有4个探针具有相同的发夹序列，但是在寡聚体探针的末端3’末端碱基处不同，且在合成发夹之前合成，代表A、C、T和G。它们产生碱基特异性的底物，用于连接发夹的3’末端和切割的靶物的5’末端。在图10所示的解释的实施方案中，将查询核苷酸放置在探针的5’-侧或臂上的发夹结构之前且紧邻。在某些实施方案中，近端核苷酸是在5’侧双链发夹结构上游约2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。
在本申请中提及的所有出版物和专利，都通过援引整体并入。本发明的所述方法和组合物的不脱离本发明的范围和精神的不同修改和变化，是本领域技术人员显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，应当理解，要求保护的本发明不应当不适当地限制为这些具体的实施方案。实际上，相关领域的技术人员显而易见的所述实现本发明的方式的各种修改，都在下面的权利要求书的范围内。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 捕获核酸的方法和测定
<130> 25832 WO
<150> US 61/041,290
<151> 2008-04-01
<160> 42
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 1
ccggaggata ctccgg 16
<210> 2
<211> 1492
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 2
atgtctgaac aacacgcaca gggcgctgac gcggtagtcg atcttaacaa tgaactgaaa 60
acgcgtcgtg agaagctggc gaacctgcgc gagcagggga ttgccttccc gaacgatttc 120
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cgcaacacct ttaaagtgcg ctcgcagatc ctctctggta ttcgccagtt catggtgaac 600
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aacttccgta acgaaggtat ttccgtacgt cataacccag agttcaccat gatggaactc 840
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tacgtcaccg cactggaaca tggcttaccg ccgacagcag gtctgggaat tggtatcgac 1440
cgtatggtaa tgctgttcac caacagccat accatccgcg acgttattct gt 1492
<210> 3
<211> 1206
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 3
gagcaacaat gaattccatc agcgtcgtct ttctgccact ccgcgcgggg ttggcgtgat 60
gtgtaacttc ttcgcccagt cggctgaaaa cgccacgctg aaggatgttg agggcaacga 120
gtacatcgat ttcgccgcag gcattgcggt gctgaatacc ggacatcgcc accctgatct 180
ggtcgcggcg gtggagcagc aactgcaaca gtttacccac accgcgtatc agattgtgcc 240
gtatgaaagc tacgtcaccc tggcggagaa aatcaacgcc cttgccccgg tgagcgggca 300
ggccaaaacc gcgttcttca ccaccggtgc ggaagcggtg gaaaacgcgg tgaaaattgc 360
tcgcgcccat accggacgcc ctggcgtgat tgcgtttagc ggcggctttc acggtcgtac 420
gtatatgacc atggcgctga ccggaaaagt tgcgccgtac aaaatcggct tcggcccgtt 480
ccctggttcg gtgtatcacg taccttatcc gtcagattta cacggcattt caacacagga 540
ctccctcgac gccatcgaac gcttgtttaa atcagacatc gaagcgaagc aggtggcggc 600
gattattttc gaaccggtgc agggcgaggg cggtttcaac gttgcgccaa aagagctggt 660
tgccgctatt cgccgcctgt gcgacgagca cggtattgtg atgattgctg atgaagtgca 720
aagcggcttt gcgcgtaccg gtaagctgtt tgccatggat cattacgccg ataagccgga 780
tttaatgacg atggcgaaaa gcctcgcggg cgggatgccg ctttcgggcg tggtcggtaa 840
cgcgaatatt atggacgcac ccgcgccggg cgggcttggc ggcacctacg ccggtaaccc 900
gctggcggtg gctgccgcgc acgcggtgct caacattatc gacaaagaat cactctgcga 960
acgcgcgaat caactgggcc agcgtctcaa aaacacgttg attgatgcca aagaaagcgt 1020
tccggccatt gctgcggtac gcggcctggg gtcgatgatt gcggtagagt ttaacgatcc 1080
gcaaacgggc gagccgtcag cggcgattgc acagaaaatc cagcaacgcg cgctggcgca 1140
ggggctgctc ctgctgacct gtggcgcata cggcaacgtg attcgcttcc tgtatccgct 1200
gaccat 1206
<210> 4
<211> 1175
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 4
atgaatgaca ccagcttcga aaactgcatt aagtgcaccg tctgcaccac cgcctgcccg 60
gtgagccggg tgaatcccgg ttatccaggg ccaaaacaag ccgggccgga tggcgagcgt 120
ctgcgtttga aagatggcgc actgtatgac gaggcgctga aatattgcat caactgcaaa 180
cgttgtgaag tcgcctgccc gtccgatgtg aagattggcg atattatcca gcgcgcgcgg 240
gcgaaatatg acaccacgcg cccgtcgctg cgtaattttg tgttgagtca taccgacctg 300
atgggtagcg tttccacgcc gttcgcacca atcgtcaaca ccgctacctc gctgaaaccg 360
gtgcggcagc tgcttgatgc ggcgttaaaa atcgatcatc gccgcacgct accgaaatac 420
tccttcggca cgttccgtcg ctggtatcgc agcgtggcgg ctcagcaagc acaatataaa 480
gaccaggtcg ctttctttca cggctgcttc gttaactaca accatccgca gttaggtaaa 540
gatttaatta aagtgctcaa cgcaatgggt accggtgtac aactgctcag caaagaaaaa 600
tgctgcggcg taccgctaat cgccaacggc tttaccgata aagcacgcaa acaggcaatt 660
acgaatgtag agtcgatccg cgaagctgtg ggagtaaaag gcattccggt gattgccacc 720
tcctcaacct gtacatttgc cctgcgcgac gaatacccgg aagtgctgaa tgtcgacaac 780
aaaggcttgc gcgatcatat cgaactggca acccgctggc tgtggcgcaa gctggacgaa 840
ggcaaaacgt taccgctgaa accgctgccg ctgaaagtgg tttatcacac tccgtgccat 900
atggaaaaaa tgggctggac gctctacacc ctggagctgt tgcgtaacat cccggggctt 960
gagttaacgg tgctggattc ccagtgctgc ggtattgcgg gtacttacgg tttcaaaaaa 1020
gagaactacc ccacctcaca agccatcggc gcaccactgt tccgccagat agaagaaagc 1080
ggcgcagatc tggtggtcac cgactgcgaa acctgtaaat ggcagattga gatgtccaca 1140
agtcttcgct gcgaacatcc gattacgcta ctggc 1175
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 5
atgagcaaca atgaattcca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 6
atggtcagcg gatacaggaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 7
atgaatgaca ccagcttcga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 8
gccagtagcg taatcggatg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 9
atgtctgaac aacacgcaca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 10
acagaataac gtcgcggatg 20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 11
acaggcaatt acgaatgccg gacgtccggc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 12
acaggcaatt acgaatcccg gacgtccggg 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 13
acaggcaatt acgaataccg gacgtccggt 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 14
acaggcaatt acgaattccg gacgtccgga 30
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 15
tgtccgttaa tgcttacatc tcagc 25
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 16
acaggcaatt acgaatgccg gacgtccgg 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 17
acaggcaatt acgaatcccg gacgtccgg 29
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 18
acaggcaatt acgaataccg gacgtccgg 29
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 19
acaggcaatt acgaattccg gacgtccgg 29
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> (n), 可以是A或G或C或T
<400> 20
ncggaggata ctccgn 16
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> (n'), 可以是A或G或C或T
<400> 21
ngagctcgat agagctcn 18
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> (n'), 可以是A或G或C或T
<400> 22
ngagctgcga tagcagctcn 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> (n'), 可以是A或G或C或T
<400> 23
ngagactgcg atagcagtct cn 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> (n'), 可以是A或G或C或T
<400> 24
ngagactgct tttgcagtct cn 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> (n'), 可以是A或G或C或T
<400> 25
nacgtctgct tttgcagacg tn 22
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<400> 26
ccggaggata ctccggn 17
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<400> 27
gagctcgata gagctcn 17
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<400> 28
gagctgcgat agcagctcn 19
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<400> 29
gagactgcga tagcagtctc n 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<400> 30
gagactgctt ttgcagtctc n 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> (N), 可以是A或G或C或T
<400> 31
acgtctgctt ttgcagacgt n 21
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 32
tttttcggtt catgcatgtc tctgcatttt tgcagagac 39
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 33
ctgaatacct tgtccatgca tgaaccgtag cgtctgaaat aa 42
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 34
acaggcaatt acgaatgcga gctacgtagc tcgc 34
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 35
acaggcaatt acgaatccga gctacgtagc tcgg 34
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 36
acaggcaatt acgaatacga gctacgtagc tcgt 34
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 37
acaggcaatt acgaattcga gctacgtagc tcga 34
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 38
acaggcaatt acgaatgtga gctacgtagc tca 33
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 39
acaggcaatt acgaatctga gctacgtagc tca 33
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 40
acaggcaatt acgaatatga gctacgtagc tca 33
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 41
acaggcaatt acgaatttga gctacgtagc tca 33
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 42
tgtccgttaa tgcttacgtc tcagc 25

Claims (28)

1.捕获靶核酸序列的方法，其包含:
a) 提供:
i) 核酸样品，其中所述核酸样品可以包含或不包含靶序列，
ii) 至少一种帽缘内切核酸酶和至少一种连接酶，和
iii) 复数种寡核苷酸探针，其中所述探针包含靶序列和发夹结构，
b) 在允许靶序列和探针之间发生杂交的条件下，将所述核酸样品应用于所述寡核苷酸探针，和
c) 在允许发生酶促反应的条件下，将至少一种帽缘内切核酸酶和至少一种连接酶应用于杂交的核酸/探针复合物，从而捕获核酸靶序列。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸样品另外包含检测部分。
3.权利要求2的方法，其中所述检测部分包含荧光部分。
4.权利要求3的方法，其中所述荧光检测部分是Cy3。
5.权利要求2的方法，其中使用荧光扫描仪检测检测部分。
6.权利要求5的方法，另外包含检测的靶核酸的数据分析。
7.权利要求1的方法，其中所述核酸样品包含基因组DNA或其衍生物。
8.权利要求1的方法，其中所述核酸样品是来自哺乳动物。
9.权利要求1的方法，其中所述核酸样品是来自人。
10.权利要求1的方法，其中至少一种所述靶序列包含单核苷酸多态性。
11.权利要求1的方法，其中至少一种所述靶序列包含基因组拷贝数变体。
12.权利要求1的方法，其中所述发夹结构包含SEQ ID NO: 1。
13.权利要求1的方法，其中所述连接酶是热稳定的连接酶。
14.权利要求1的方法，其中所述探针固定在基质上。
15.权利要求14的方法，其中所述基质是微阵列载玻片。
16.权利要求1的方法，其中所述复数种寡核苷酸探针包含查询核苷酸。
17.权利要求16的方法，其中所述查询核苷酸放置在探针的末端3’末端处。
18.权利要求16的方法，其中所述查询核苷酸放置在探针5’-侧上的发夹结构的近端。
19.权利要求16的方法，其中所述查询核苷酸放置在探针5’-侧上的发夹结构的上游约2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基处。
20.权利要求1的方法，另外包含，提供选自RecJ和单链结合蛋白的组分。
21.权利要求1的方法，其中所述探针提供双特异性。
22.捕获靶核酸的方法，其包含:
a) 提供:
i) 核酸样品，其中所述核酸样品包含检测部分，且可以包含或不包含靶序列，和
ii) 至少一种帽缘内切核酸酶、至少一种连接酶，和
iii) 复数种寡核苷酸探针，其中所述探针包含靶序列和发夹结构，其中所述发夹结构包含至少一种可切割的序列，
b) 在允许靶序列和探针之间发生杂交的条件下，将所述核酸样品应用于所述寡核苷酸探针，和
c) 在允许发生酶促反应的条件下，将至少一种帽缘内切核酸酶和至少一种连接酶应用于杂交的核酸/探针复合物，从而捕获核酸靶序列。
23.权利要求22的方法，其中所述至少一种可切割的序列包含限制性内切核酸酶位点。
24.权利要求22的方法，另外包含，通过限制性内切核酸酶消化，从探针释放核酸靶序列。
25.权利要求24的方法，另外包含，通过测序，检测所述释放的靶核酸序列。
26.用于序列特异性的核酸捕获的组合物，其包含帽缘内切核酸酶、连接酶和寡核苷酸探针，其中所述探针包含发夹结构和互补的靶核酸序列。
27.用于捕获和检测核酸序列的试剂盒，其包含：
a) 至少一种帽缘内切核酸酶,
b) 至少一种热稳定的连接酶,
c) 固定在基质上的复数种寡核苷酸探针，和
d) 至少一种缓冲液。
28.权利要求27的试剂盒，另外包含，选自RecJ和单链结合蛋白的组分。
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