CN113943727A

CN113943727A - 一种组合物及其试剂盒与纯化方法

Info

Publication number: CN113943727A
Application number: CN202111266353.2A
Authority: CN
Inventors: 吴炜; 刘佳慧; 赵美茹; 沈璐; 钟文星; 易鑫; 伍佳豪
Original assignee: Shenzhen Guiinga Medical Laboratory
Current assignee: Shenzhen Guiinga Medical Laboratory
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2022-01-18
Also published as: CN115992128A

Abstract

一种组合物及其试剂盒与纯化方法，组合物包含磁珠以及聚乙二醇。该组合物可用于纯化经过酸性还原试剂还原后的核酸分子，聚乙二醇的加入，可以显著提升核酸的还原回收率，而且使得回收率更稳定。该组合物作为纯化体系，可以更方便地匹配自动化仪器，提升样本通量，纯化回收的产物不影响后续文库扩增以及修饰碱基的检测过程，并有效降低试剂成本，无需高速离心机等特殊设备。

Description

一种组合物及其试剂盒与纯化方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种组合物及其试剂盒与纯化方法。

背景技术

早在1925年，在DNA双螺旋结构鉴定之前，DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰最主要的形式是5mC及其衍生修饰，被认为是DNA的“第五种碱基”。DNA甲基化在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。最近研究表明，cell-free DNA(以下简称cfDNA)甲基化特征是肿瘤早期筛查的重要标志物。

重亚硫酸盐可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后的PCR过程中，采用U耐受的聚合酶，将U识别为胸腺嘧啶(T)，实现C到T的转化，从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing， WGBS)将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95％的C会被转化为T)，可覆盖全基因组 70～99％的胞嘧啶，实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是重亚硫酸盐处理会使DNA大量降解，需要较高的D NA投入量，对于DNA含量较少的样本不友善，例如血浆游离DNA。另外，重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T，而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95％以上，因此，使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库，碱基平衡性差(AT占比>80％)，测序时需要添加15％的噬菌体PhiX DNA平衡，造成测序数据大量浪费。最后，WGBS产生的数据测序质量差，而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismark)，比对率较差，通常只有70％左右，进一步造成数据的浪费。

公开号为CN 110820050 A的中国专利《全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建》表明，在一定条件下，甲基化C可以被10-11转位酶(TET酶)转为羧基化C，通过有机硼烷(例如吡啶硼烷)可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶，经过测序，可以识别为T，进而区分甲基化C与未甲基化C。基于此原理发明的全基因组甲基化非亚硫酸盐文库构建技术，有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷，同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。

使用此非亚硫酸盐方法构建的文库，不仅能在全基因组水平检测甲基化，而且能同时检测碱基突变，具有检测基因组多种特征的能力，因此具有重要的临床引用价值。近来研究发现，血浆cfDNA甲基化、突变和片段特征在肿瘤早期筛查方面具有重要的价值。但血浆cfDNA是不同组织释放的，而且绝大多数cfDNA来源于正常血细胞，对于早期癌症患者来说，肿瘤组织释放的循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)在血浆中占比极低，因此，在构建cfDNA二代测序文库过程中，需要最大限度减少DNA模板损失，提升ctDNA各特征检测的灵敏度。

现有的非重亚硫酸盐测序过程中，吡啶硼烷还原后的产物由于含有高浓度的NaAC(约600mM)和吡啶硼烷(约1M)，再加上较低的pH(约4.3)，NGS磁珠在常规纯化操作条件下不能回收还原后DNA。现有技术采用商业化的离心柱纯化方法纯化还原后DNA，例如 zymo公司的IC-Spin柱、Bio-rad公司的Micro Bio-Spin 6柱，回收率中位仅45％左右，且非常不稳定，范围宽至30～70％，波动很大。另外，柱法纯化需要高速离心设备，样本通量被离心机通量所限制，当样本量较大时，无法匹配自动化仪器，非常耗时耗力。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种组合物，包含磁珠以及聚乙二醇。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述组合物和/或用于制备所述组合物的组分。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种纯化方法，包括：将核酸分子与第一方面所述组合物混合，然后回收核酸分子，得到纯化后的核酸分子。

依据上述实施例的组合物及其试剂盒与纯化方法，该组合物可用于纯化经过酸性还原试剂还原后的核酸分子，聚乙二醇的加入，可以显著提升核酸的还原回收率，而且使得回收率更稳定。

在一实施例中，该组合物作为纯化体系，可以更方便地匹配自动化仪器，提升样本通量，纯化回收的产物不影响后续文库扩增以及修饰碱基的检测过程，并有效降低试剂成本，无需高速离心机等特殊设备。

附图说明

图1为常规磁珠纯化、柱纯化、增强型磁珠纯化还原后产物回收率评估结果图。

图2为柱纯化和增强型磁珠纯化还原后产物扩增效率评估图。

图3为柱纯化和增强型磁珠纯化还原后产物转化率评估。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

为了提升还原后纯化回收率，同时使回收率更稳定，且可匹配自动化纯化仪器，在一实施例中，本发明提供了一种磁珠纯化的缓冲液和纯化流程(命名为“增强型磁珠纯化”)，能显著提升还原后回收率并保持稳定，纯化步骤不需要高速离心机等设备，操作简单，与柱纯化相比成本低廉，同时本方法回收的还原产物不影响后续PCR扩增效率和5mC到T的转化率。由于本方法是基于磁珠法原理，因此很容易转换为自动化流程，适配自动化仪器，从而极大地提升样本通量，减少人力成本。

根据第一方面，在一实施例中，提供一种组合物，包含磁珠以及聚乙二醇(简称PEG)。该组合物可用于纯化经过有机硼烷还原后的核酸分子，聚乙二醇的加入，可以显著提升核酸的还原回收率，而且使得回收率更稳定。该组合物作为纯化体系，可以更方便地匹配自动化仪器，提升样本通量，纯化回收的产物不影响后续文库扩增以及修饰碱基的检测过程，并有效降低试剂成本，无需高速离心机等特殊设备。

在对核酸进行还原时，还原试剂含有有机硼烷和醋酸钠，通常加入3M醋酸钠(pH＝4.3)，发明人发现，加入有机硼烷以及醋酸钠后，形成的酸性环境和高盐环境导致传统磁珠不能实现核酸回收。在一实施例中，本发明通过在市售的磁珠中加入聚乙二醇，有效解决了现有的磁珠无法回收还原后的核酸的问题。

在一实施例中，所述磁珠为干粉状或悬浮液。可以从市场购买得到磁珠。

在一实施例中，所述磁珠为悬浮液时，所述磁珠的体积与聚乙二醇的质量之比为1:(0.2 5～0.75)。磁珠可以为干粉或悬浮液。

在一实施例中，所述组合物包含磁珠以及聚乙二醇水溶液，所述磁珠为悬浮液时，所述磁珠与聚乙二醇水溶液的体积比为1：(0.5～1.5)，具体可以包括但不限于1:0.5、1:0.6、1:0.7、 1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5。聚乙二醇在常温下固体，且高浓度的聚乙二醇不易溶解，因此，在配制时，预先使用水对聚乙二醇进行溶解。

在一实施例中，所述聚乙二醇水溶液中聚乙二醇的质量体积百分比为50％，即每100mL 聚乙二醇水溶液中含有50g聚乙二醇。此处的50％为母液中聚乙二醇浓度，使用时，根据终反应液中PEG的终浓度，计算出组合物的添加体积。

在一实施例中，所述聚乙二醇的分子量为200～20000，包括但不限于200、300、400、6 00、800、1000、1500、2000、3350、4000、6000、8000、10000、20000等等，优选为2000 ～20000，更优选为2000～10000，更优选为4000～10000，更优选为6000～10000。

在一实施例中，所述磁珠用于纯化核酸分子。

在一实施例中，所述核酸分子包含DNA、RNA中的至少一种。

在一实施例中，所述核酸分子来源于组织样本、体液样本中的至少一种。样本类型不受限制，可以是各种组织、体液样本。

在一实施例中，所述核酸分子包含来源于体液样本的cfDNA。

在一实施例中，所述磁珠包括但不限于Axygen磁珠。磁珠可以从市场上购买得到。

在一实施例中，所述组合物用于纯化经过还原试剂处理后的核酸分子。

在一实施例中，所述还原试剂的pH＜7。通常是在酸性环境下对核酸分子进行还原处理。

在一实施例中，所述还原试剂的pH为4.0～4.5，优选为4.3。

在一实施例中，所述还原试剂包含有机硼烷以及有机酸盐。

在一实施例中，所述有机硼烷用于将核酸分子中氧化的5-甲基胞嘧啶(5mC)残基转化为二氢尿嘧啶(DHU)残基。5-甲基胞嘧啶残基(5mC)主要位于CpG位点。有机酸盐主要是为有机硼烷提供酸性环境，促进还原反应的进行。

在一实施例中，氧化的5-甲基胞嘧啶残基可以包含5-羧基胞嘧啶(5caC)残基、5-醛基胞嘧啶(5fC，亦称5-甲酰基胞嘧啶)残基中的至少一种。通常可以使用TET酶对核酸分子中的5-甲基胞嘧啶残基进行氧化。

在一实施例中，所述有机硼烷包括硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。

在一实施例中，所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物。

在一实施例中，所述氮杂环包含任选经1～4个低级烷基取代的吡啶。

在一实施例中，所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶。

在一实施例中，所述有机硼烷包括但不限于吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷中的至少一种。

在一实施例中，所述有机酸盐包含醋酸钠。

在一实施例中，所述水可以为无核酸酶水。无核酸酶水可以从市场上购买得到。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述组合物或用于制备所述组合物的组分。该组合物可以预先配制后，独立存放于容器中，作为产品，单独售卖。也可以将用于制备所述组合物的各组分分装于不同的容器中，用户购买后，按说明书进行配制。

在一实施例中，用于制备所述组合物的组分包括磁珠、聚乙二醇中的至少一种。

在一实施例中，所述试剂盒还包含还原试剂。还原试剂可以独立存放于另一容器中，与装有第一方面组合物的容器形成套装产品。

在一实施例中，所述还原试剂包含有机硼烷。

在一实施例中，所述还原试剂还包含醋酸钠。

在一实施例中，所述试剂盒还包含氧化试剂。

在一实施例中，所述氧化试剂包含TET酶。

在一实施例中，所述氧化试剂还包含缓冲剂、金属盐、α-酮戊二酸盐(英文名α-ketoglut arate，亦称α-KG)、抗坏血酸(英文名ascorbate)、三磷酸腺苷(ATP)、二硫苏糖醇(DT T)中的至少一种。

在一实施例中，所述金属盐包括但不限于氯化钠(NaCl)。

在一实施例中，所述氧化试剂还包含Fe²⁺。

在一实施例中，含有Fe²⁺的化合物包括但不限于Fe(NH₄)₂(SO₄)₂、Fe₂SO₄中的至少一种。

在一实施例中，所述试剂盒还包含说明书，用于指导用户使用。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种纯化方法，包括：将核酸分子与第一方面所述组合物混合，然后回收核酸分子，得到纯化后的核酸分子。本文将该纯化方法称为增强型磁珠纯化法。

在一实施例中，核酸分子与第一方面所述组合物混合后，磁珠与核酸分子结合，将装有混合液的容器(例如EP管)置于磁力架上，通过磁性作用，核酸分子随磁珠附着于容器底部，弃去容器中的上清液，即可得到结合有核酸分子的磁珠。

在一实施例中，含有核酸分子的样本体积与所述组合物的体积之比为1：(2～8)。

在一实施例中，将核酸分子与第一方面所述组合物混合后，混匀，使用洗脱剂从磁珠表面洗脱核酸分子，得到纯化后的核酸分子。

在一实施例中，所述混匀是在室温下进行。

在一实施例中，将核酸分子与第一方面所述组合物混合后，混匀的时间为5～15min。可以置于恒温混匀仪中混匀。

在一实施例中，所述洗脱剂包括但不限于TE缓冲液。

在一实施例中，混匀后，将混匀液置于磁力架上，静置至溶液澄清，然后弃去上清液，使用洗涤剂洗涤保留物，然后使用洗脱剂进行洗脱。

在一实施例中，所述洗涤剂包括但不限于乙醇、乙醇水溶液中的至少一种。

在一实施例中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为80％～90％。体积百分比包括但不限于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％等等。

在一实施例中，弃去上清液后，洗涤保留物的次数≥1。每次洗涤后，弃去上清，然后加入新的洗涤剂对保留物进行下一次洗涤。

在一实施例中，弃去上清液后，洗涤保留物的次数≥2。

在一实施例中，每次洗涤时，使用的洗涤剂体积为0.1～1.5mL，包括但不限于0.1mL、0. 2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL、1.4mL、1.5mL等等。

在一实施例中，每次洗涤结束后，在磁力架上的静置时间≥10s，优选为10～60s，包括但不限于10s、20s、30s、40s、50s、60s等等。

在一实施例中，所述核酸分子包含经过还原试剂处理后的核酸分子。

在一实施例中，所述还原试剂的pH为4.0～4.5，优选为4.3。

在一实施例中，所述还原试剂包含有机硼烷以及有机酸盐。

在一实施例中，所述有机硼烷用于将核酸分子中氧化的5-甲基胞嘧啶(5mC)残基转化为二氢尿嘧啶(DHU)残基。

在一实施例中，提供一种用于非重亚硫酸盐DNA甲基化检测的还原后产物磁珠纯化方法，包括：

步骤A：取30ng人源cfDNA，添加适当比例的140～160bp甲基化(methylated)DN A标准品和140-160bp非甲基化(unmethylated)DNA标准品；

步骤B:对上步DNA进行末端修复和加“A”；

步骤C：使用连接酶连接修复-加A产物和接头以及分子条形码，得到加接头的dsDNA (双链DNA)；

步骤D：对上述加接头DNA片段进行TET酶氧化，得到TET酶氧化后的DNA片段；

步骤E：将所述TET酶处理的DNA加入还原体系(还原体系含有有机硼烷、有机酸盐，pH为4.0～4.5)中，还原处理，得有机硼烷还原产物；

步骤F:对还原体系还原后的产物进行增强型磁珠纯化操作，获得可用于扩增的模板DN A；

步骤G：对上述DNA模板进行PCR扩增，完成文库构建；

步骤H：使用Taq酶，对构建好的文库进行PCR扩增外源性甲基化标准品，对PCR扩增产物进行TaqI-V2酶切，并使用凝胶电泳验证转化效率。

在一实施例中，所述步骤B和C中的反应条件，可按照传统的dsDNA末端修复和加A，以及接头连接反应进行，例如可采用

Μltra^TM II DNA Library Prep Kit(NEB)中的试剂进行。

在一实施例中，所述步骤D中使用的TET酶反应液组成如下：50mM HEPES(pH＝4.3～ 7.5)、100mM NaCl、1mMα-酮戊二酸盐(英文名α-ketoglutarate，亦称α-KG)、2mM抗坏血酸(英文名ascorbate)、1.2mM三磷酸腺苷(ATP)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、100μ M Fe(NH₄)₂(SO₄)₂。

HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)为缓冲剂。α-酮戊二酸盐和Fe(NH₄)₂(SO₄)₂盐为TET的辅酶。

在一实施例中，所述步骤E中，还原体系组成如下：35μL DNA、600mM醋酸钠(pH ＝4.3)缓冲液和1M吡啶硼烷。

在一实施例中，所述步骤G中的PCR反应，需要扩增酶，例如，可使用KAPA HIFI Urail聚合酶。扩增酶可以从市场上购买得到。

在一实施例中，步骤H所述文库的二代测序，依据步骤C和G中使用的接头和index，可采用相应的Illumina平台或者MGI、Gene+Seq平台进行。

在一实施例中，所述步骤H中的Taq酶PCR扩增反应体系中含有Taq酶、甲基化内参的引物、步骤G中的文库DNA、Taq酶反应缓冲液。所述的TaqI酶切反应体系包含了甲基化内参的PCR产物、TaqI-V2酶、TaqI-V2酶缓冲液。所述的凝胶电泳按照常规的dsDNA电泳条件进行。

在一实施例中，所述步骤C、D、G完成后，还包括纯化步骤。可采用磁珠(例如Axygen磁珠)进行纯化。

实施例1

本实施例中，如无特别说明，所使用的磁珠为购自美国Axygen公司的磁珠，亦称Axyg en磁珠，产品名称为

AxyPrep Magnetic Bead Purification Kits，货号为MAG-PCR -CL-250。该磁珠为悬浮液。

本实施例中，如无特别说明，“室温”是指23℃±2℃。

本实施例中，如无特别说明，“80％乙醇”均是指体积百分浓度为80％的乙醇，亦称“80％ V/V乙醇”，是由乙醇与NF-H₂O(无核酸酶水，亦称Nuclease-Free Water)按照80:20的体积比配制而成。

本实施例中，TE缓冲液(TE Buffer)购自Invitrogen，货号12090015。组成如下：10mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA。

本实施例的操作步骤如下：

(1)取90例人源cfDNA样本，每例样本的质量为30ng(编号分别为1到90号)，每例样本中分别加入适当比例的140～160bp methylated DNA标准品(甲基化DNA标准品) 和140～160bp unmethylated DNA标准品(非甲基化DNA标准品)。

甲基化标准品、非甲基化标准品的加入质量均为每例样本质量的0.5％。

甲基化标准品、非甲基化标准品的制备方法参照申请号为202111145944.4的中国专利《一种多核苷酸及其标准品、试剂盒与用途》(申请人：深圳吉因加医学检验实验室)说明书实施例1的步骤一进行。

甲基化DNA标准品序列如下：

sequence1：

ATATCTGATGATGCAAATTCCCTACCGGATCATTGACTTATGACATAGGCGGGAATT TTGCATCGCATCTGTTCAAGGGACGAGCATATGTACACTGCTGCATGCCCAACCTGGA CGTTCGAGACATCATGCGGCACGAAGGCCAGAAAGACAGTATTGAAC(SEQ ID NO. 1)。

sequence2：

GTGATGTACAATGCACTTTCAGAGTTATCCGGTGTTAAGGGAGTCTGACAAATTCGATGTTGATGTTTTTTCCCAGATGTGCCAATCTTTGGAAGTTGACCCAATGACGGCAGCGAAGGTTATAGTCGCGGTCATGAGCAATGAGAGCGGTCTGACTCTCACATTTGAAC(S EQ ID NO.2)。

sequence3：

TAGCTGGTCTTGCTGGAGATCATCCGGTCGATCGTCCGTACGAACGAACGAGCGA ACGAACGAACGTTCGTTAGAGTTTCATATGGCAAGGCAGATTGTTAATTGTAAGCAGA TGAGCTTGTGTACAGGGTCGGATTAAAGTTCAGCAAATGAAAAAC(SEQ ID NO.3)。

sequence4：

GAGTAGCTGTCAGCTCTGAGTCTGTTGTTATGTAACTCAGAACTCATTCCGAACGA TGCGCTTCGAACGGACCGCAGCGCAACGAAACGTCACGTTACGACTGCAGGTTGTTC TTGTCCCGGAGAGTTCGGCTGTGGGAAAACCAAAG(SEQ ID NO.4)。

Sequence5：

GACCCTGAGGAACTCATCAAGGAAGTCGAGGAAGTCCGGACAGCAAAAGAAAT TGACCGCGCGTAACTAAGGCCAGAACGCGCGCGCAGAAGGGGTTCAAACGCGCGTC ACAACCTTCATAGAGGCAAGGCACGTAAAGCACACAAAGCTAAGC(SEQ ID NO.5)。

非甲基化DNA标准品序列如下：

Sequence6：

TTGCATCTGGTATCAAAGAAAGAGCGGGGACCGGTCACGACGTTCATTGGAAAC ACTGTGATCATTGCTGCATGTTTGGCCTCGATGCTTCCGATGGAGAAAATAATCAAAGG AGCCTTTTGCGGTGACGATAGTCTGCTGTACTTTCCAAAGG(SEQ ID NO.6)。

Sequence7：

TTATATGCCCAATGGCACACTATACGCTGCAAATCCGGCGAATAGTGAGAACTTGG CGAGAGAACAACCTCGAACGCCGCAAGGACAAGAGAGGGCGGCGTGGCATAGACGA AAGGAAAAGGTTAAAGCCAAGAAACTCGCC GCACTTGAACAGGCACTAGCCAACA(S EQ ID NO.7)。

sequence8：

ACTGGAAGAGGCACTAAATGAACACGATTAACATCCGGCTAAGAACGACTTCTCT GACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTT AGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGT(SEQ ID NO.8)。

sequence9：

TGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCCGGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCT CTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCA T(SEQ ID NO.9)。

sequence10：

GTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCCGGGGTGT CGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATC ATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGC(SEQ ID NO.10)。

下划线标记的碱基为CpG位点。

(2)末端修复和加“A”

1)末端修复和加“A”反应体系如下：

表1

修复反应条件如下：

表2

步骤	温度	时间
			末端修复	20℃	30min
加“A”反应	65℃	30min
			HOLD	4℃	∞

注：热盖温度为85℃。

2)连接反应体系如下：

表3

组分	体积
		末端修复&加“A”产物	60μL
接头储液(15μM)	3μL
		PCR级水	16μL
连接增强液	1μL
		DNA连接酶预混液	30μL
总体积	110μL

连接增强液、DNA连接酶预混液为NEBNext末端修复/加dA尾模块中自带的试剂。接头购自华大智造，MGIEasy DNA Adapters-96(Plate)kit，货号：1000005282。孵育条件：20℃，时间30min。

3)连接后纯化反应体系如下：

表4

组分	体积
		接头连接产物	110μL
磁珠	88μL
		总体积	198μL

纯化步骤如下：

a)震荡混匀，离心。

b)室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

c)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

d)吸去上清。

e)加入200μL 80％乙醇。

f)静置30s。

g)吸掉乙醇。重复使用80％乙醇漂洗一次。

h)室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

i)加入22μL无酶水洗脱DNA。

(3)TET酶氧化反应

1)冰上配制如下TET酶氧化反应体系：

表5

反应混合物	体积	终浓度
			接头连接的DNA	20μL	0.6ng/μL
TET氧化缓冲液(pH为6)	15μL	1X
			1.5mM Fe(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>	3.33μL	100μM
TET酶	4μL	-
			无酶水	补足至50μL	-
总体积	50μL	-

注：TET酶购自NEB公司。

“-”表示无对应数据。

TET酶氧化缓冲液的组成如下：167mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH6.0)、333mM NaCl、3.3mMα-KG(α-酮戊二酸盐)、6.67mM抗坏血酸、4mM三磷酸腺苷(ATP)、 8.33mM二硫苏糖醇(DTT)。此为TET酶氧化缓冲液加入反应体系前，各组分的初始浓度。

TET酶氧化缓冲液与其他组分混合，形成的TET酶氧化反应体系中，各组分的浓度如下：

50mM HEPES(pH＝6.0)、100mM NaCl、1mMα-酮戊二酸盐、2mM抗坏血酸(as corbicacid)、1.2mM ATP、1mM DTT、100μM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂。

2)反应条件：37℃，80min。

3)加入1μL蛋白酶K(0.8U)到氧化反应体系中，50℃孵育1h。

4)产物加入1.8X磁珠。

5)震荡混匀，离心。

6)室温孵育5～10min，使DNA与磁珠结合。

7)将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

8)吸去上清。

9)加入200μL的80％乙醇。

10)静置30s。

11)吸掉乙醇。重复使用80％乙醇漂洗一次。

12)室温下挥发乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

13)37μL的无酶水洗脱。并取1μL，使用life Qubit dsDNA HS定量。

(4)吡啶硼烷还原反应

1)配制如下还原反应体系。

表6

反应混合物	体积
		3M醋酸钠(pH＝4.3)	10μL
10M吡啶硼烷	5μL
		DNA	35μL
总体积	50μL

2)反应条件：37℃，1200rpm孵育16h。

(5)常规磁珠纯化

对于第1～30号样品，分别使用常规磁珠法纯化还原产物，纯化步骤如下：

1)Axygen磁珠室温平衡半小时。

2)加入110μL磁珠(2.2x)，涡旋混匀，室温放置10min。

3)瞬时离心，将EP管置于磁力架，室温放置5min，待溶液澄清。

4)弃上清。加入200μL 80％乙醇，静置30s。

5)去除上清，重复使用200μL 80％乙醇漂洗一次。

6)加入25μL TE缓冲液至磁珠表面，使得核酸分子从磁珠上洗脱，涡旋震荡15s，室温孵育5min。

7)瞬离(瞬时离心)，上架3min，取1μL life Qubit dsDNA HS定量，计算还原回收率，还原回收率＝(还原后DNA总量/还原前投入量)*100％。

8)30个样品还原回收率中位值为0％，变异系数为0％(见图1)。

(6)离心柱纯化还原产物

对于第31～60号样品，分别使用Zymo-IC spin column和DNA binding buffer(Zymo)，按照说明书的要求回收DNA，最终洗脱体积25μL。取1μL，使用life Qubit dsDNA HS定量，计算还原回收率。30个样品还原回收率中位值为45.72％，变异系数为32.48％(见图1)。

(7)增强型磁珠纯化法纯化还原产物

对于第61～90号样品，分别使用增强型磁珠纯化法纯化还原产物。

1)配制RPB溶液：将Axygen磁珠与质量体积百分比为50％的PEG水溶液(本实施例的PEG具体为PEG8000)按照1：1体积混合，制得RPB溶液，配制完成后，2～8℃保存。

2)新鲜配制80％乙醇。

3)RPB涡旋混匀震荡，室温平衡半小时。

4)步骤(3)结束后，取下EP管，瞬离30s，然后向EP管中加入100μL RPB溶液。

5)放入Eppendorf ThermoMixer C恒温混匀仪中，25℃，1000rpm，15min。

6)瞬时离心，将EP管置于磁力架，室温放置15min，待溶液澄清。

7)弃上清。加入200μL预冷的80％乙醇，静置30s。

8)去除上清，重复使用200μL预冷的80％乙醇漂洗一次，弃净上清。室温下晾干乙醇。

9)加入25μL TE缓冲液至磁珠表面，涡旋震荡15s，直至所有磁珠都从管壁表面分离至液体中，瞬离收集液体，37℃孵育5min。

10)瞬离，上架3min，取1μL life Qubit dsDNA HS定量，计算还原回收率。 11)30个样品的还原回收率中位值为70.91％，变异系数为14.5％(见图1)。

(8)文库扩增

1)配制如下PCR扩增反应体系：

表7

组分	体积
		KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2X)	25μL
MGI的引物*	2.5μL
		吡啶硼烷处理后的DNA	22.5μL
总体积	50μL

注：*体系中的引物最终浓度为0.75μM。

2)反应条件如下：

表8

3)取上述PCR反应的产物，用0.9X Axygen磁珠纯化，纯化体系如下：

表9

组分	体积
		上步扩增产物	50μL
Axygen磁珠	45μL
		总体积	95μL

纯化步骤如下：

A.震荡混匀，离心。

B.室温孵育5min，使DNA与磁珠结合。

C.将EP管置于磁力架2min，溶液澄清。

D.吸去上清。

E.加入200μL 80％乙醇。

F.静置30s。

G.吸掉乙醇。重复使用80％乙醇漂洗一次。

H.室温下或37℃挥干乙醇，磁珠没有明显的发亮或干裂。

I.加入25μL TE缓冲液洗脱文库DNA。并使用life Qubit HS检测浓度。并计算扩增效率，如图2所示，增强型磁珠纯化不影响PCR扩增效率。

J.使用Qsep 100(中国台湾光鼎)检测文库片段分布。

(9)转化率验证

1)140～160bp methylated DNA Taq酶扩增反应

取0.5μL步骤(5)得到的纯化后PCR产物，进行PCR扩增。设置如下对照组：取0. 5μL浓度为1ng/μL的140～160bp甲基化DNA标准品作为对照组。

表10

试剂	体积	终浓度
			PCR产物DNA模板	0.5μL	-
10X Taq缓冲液	2.5μL	1X
			dNTP[10mM each]	0.5μL	0.2mM
Sequence1-F[10μM]	0.5μL	0.2μM
			Sequence1-R[10μM]	0.5μL	0.2μM
Taq DNA聚合酶	0.125μL	0.625U
			无酶水	补足至25μL	-
总体积	25μL	-

引物序列如下：

sequence1-F：ATATCTGATGATGCAAATTCCCTA(SEQ ID NO.11)；

sequence1-R：GTTCAATACTGTCTTTCTGGCCTT(SEQ ID NO.12)。

PCR扩增条件如下：

表11

2)取>100ng PCR扩增产物(此处具体为15μL)，进行TaqI-V2酶切反应，配制如下反应体系：

表12

TaqI-V2购自NEB，货号R0149L。

反应条件：65℃孵育0.5～1h。

3)取10μL步骤2)制得的酶切产物和10μL步骤1)制得的PCR产物，加入6X荧光黄、3％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结果显示，140～160bp甲基化DNA成功文转化为库扩增产物，酶切后仅能看到一条带(162bp)，未发生转化的阴性对照，可见清晰的两条带(43bp和118bp)，未经酶切的PCR产物仅可见一条带。使用Image J计算5mC到T的转化率。如图3 所示，增强型磁珠纯化不影响5mC到T的转化率。

常规的磁珠由于不能回收DNA，所以没有建库的价值，一般也不会产生出文库，因此，没有文库扩增效率和转化率的数据。

在一实施例中，本发明提供的增强型磁珠纯化法能显著提升还原回收率，且回收率更稳定。

在一实施例中，基于增强型磁珠纯化原理的方法可更方便的匹配自动化仪器，提升样本通量。

在一实施例中，增强型磁珠纯化法回收产物不影响后续文库扩增以及修饰碱基的检测过程。

在一实施例中，自配试剂成本远低于商业柱纯化(约五分之一)。

在一实施例中，操作简便，无需高速离心机等特殊设备。

在一实施例中，本发明创造性地制备了用于纯化核酸的磁珠溶液，建立了纯化流程，能够使用磁珠法回收成分复杂的还原产物。该方法可适配自动化仪器。

在一实施例中，使用本发明提供的方法回收的还原产物，回收率高且稳定。不需要离心机等设备，操作简单，自配试剂成本低廉。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳吉因加医学检验实验室

<120> 一种组合物及其试剂盒与纯化方法

<130> 21I32193

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atatctgatg atgcaaattc cctaccggat cattgactta tgacataggc gggaattttg 60

catcgcatct gttcaaggga cgagcatatg tacactgctg catgcccaac ctggacgttc 120

gagacatcat gcggcacgaa ggccagaaag acagtattga ac 162

<210> 2

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagctggtct tgctggagat catccggtcg atcgtccgta cgaacgaacg agcgaacgaa 60

cgaacgttcg ttagagtttc atatggcaag gcagattgtt aattgtaagc agatgagctt 120

gtgtacaggg tcggattaaa gttcagcaaa tgaaaaac 158

<210> 3

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagctggtct tgctggagat catccggtcg atcgtccgta cgaacgaacg agcgaacgaa 60

cgaacgttcg ttagagtttc atatggcaag gcagattgtt aattgtaagc agatgagctt 120

gtgtacaggg tcggattaaa gttcagcaaa tgaaaaac 158

<210> 4

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagtagctgt cagctctgag tctgttgtta tgtaactcag aactcattcc gaacgatgcg 60

cttcgaacgg accgcagcgc aacgaaacgt cacgttacga ctgcaggttg ttcttgtccc 120

ggagagttcg gctgtgggaa aaccaaag 148

<210> 5

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaccctgagg aactcatcaa ggaagtcgag gaagtccgga cagcaaaaga aattgaccgc 60

gcgtaactaa ggccagaacg cgcgcgcaga aggggttcaa acgcgcgtca caaccttcat 120

agaggcaagg cacgtaaagc acacaaagct aagc 154

<210> 6

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgcatctgg tatcaaagaa agagcgggga ccggtcacga cgttcattgg aaacactgtg 60

atcattgctg catgtttggc ctcgatgctt ccgatggaga aaataatcaa aggagccttt 120

tgcggtgacg atagtctgct gtactttcca aagg 154

<210> 7

<211> 167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttatatgccc aatggcacac tatacgctgc aaatccggcg aatagtgaga acttggcgag 60

agaacaacct cgaacgccgc aaggacaaga gagggcggcg tggcatagac gaaaggaaaa 120

ggttaaagcc aagaaactcg ccgcacttga acaggcacta gccaaca 167

<210> 8

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actggaagag gcactaaatg aacacgatta acatccggct aagaacgact tctctgacat 60

cgaactggct gctatcccgt tcaacactct ggctgaccat tacggtgagc gtttagctcg 120

cgaacagttg gcccttgagc atgagt 146

<210> 9

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgaccttgaa gctaagcact tcaagaaaaa cgttgaggaa caactcaaca agccggcgta 60

gggcacgtct acaagaaagc atttatgcaa gttgtcgagg ctgacatgct ctctaagggt 120

ctactcggtg gcgaggcgtg gtcttcgtgg cataaggaag actctattca t 171

<210> 10

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtaaggaagg ttactactgg ctgaaaatcc acggtgcaaa ctgtgccggg gtgtcgataa 60

ggttccgttc cctgagcgca tcaagttcat tgaggaaaac cacgagaaca tcatggcttg 120

cgctaagtct ccactggaga acacttggtg ggctgagc 158

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atatctgatg atgcaaattc ccta 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gttcaatact gtctttctgg cctt 24

Claims

1.一种组合物，其特征在于，包含磁珠以及聚乙二醇。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述磁珠为干粉状或悬浮液；

和/或，所述磁珠为悬浮液时，所述磁珠的体积与聚乙二醇的质量之比为1:(0.25～0.75)。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含磁珠以及聚乙二醇水溶液，所述磁珠为悬浮液时，所述磁珠与聚乙二醇水溶液的体积比为1：(0.5～1.5)；

和/或，所述聚乙二醇水溶液中聚乙二醇的质量体积百分比为50％。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为200～20000。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述磁珠用于纯化核酸分子；

所述核酸分子包含DNA、RNA中的至少一种；

所述核酸分子来源于组织样本、体液样本中的至少一种；

所述核酸分子包含来源于体液样本的cfDNA。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于纯化经过还原试剂处理后的核酸分子；

和/或，所述还原试剂的pH＜7；

和/或，所述还原试剂的pH为4.0～4.5，优选为4.3；

和/或，所述还原试剂包含有机硼烷以及有机酸盐；

和/或，所述有机硼烷用于将核酸分子中氧化的5-甲基胞嘧啶(5mC)残基转化为二氢尿嘧啶(DHU)残基；

和/或，氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧基胞嘧啶(5caC)残基、5-醛基胞嘧啶(5fC)残基中的至少一种；

和/或，所述有机硼烷包括硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物；

和/或，所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物；

和/或，所述氮杂环包含任选经1～4个低级烷基取代的吡啶；

和/或，所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶；

和/或，所述有机硼烷包括吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷中的至少一种；

和/或，所述有机酸盐包含醋酸钠。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～6任意一项所述组合物和/或用于制备所述组合物的组分。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含还原试剂；

和/或，所述还原试剂包含有机硼烷；

和/或，所述还原试剂还包含醋酸钠；

和/或，所述试剂盒还包含氧化试剂；

和/或，所述氧化试剂包含TET酶；

和/或，所述氧化试剂还包含缓冲剂、金属盐、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸、三磷酸腺苷、二硫苏糖醇中的至少一种；

和/或，所述金属盐包含氯化钠；

和/或，所述氧化试剂还包含Fe²⁺；

和/或，含有Fe²⁺的化合物包括Fe(NH₄)₂(SO₄)₂、Fe₂SO₄中的至少一种；

和/或，所述试剂盒还包含说明书，用于指导用户使用。

9.一种纯化方法，其特征在于，包括：将核酸分子与权利要求1～6任意一项所述组合物混合，然后回收核酸分子，得到纯化后的核酸分子。

10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，将核酸分子与所述组合物混合后，混匀，使用洗脱剂从磁珠表面洗脱核酸分子，得到纯化后的核酸分子；

和/或，含有核酸分子的样本体积与所述组合物的体积之比为1：(2～8)；

和/或，所述混匀是在室温下进行；

和/或，混匀的时间为5～15min；

和/或，混匀后，将混匀液置于磁力架上，静置至溶液澄清，然后弃去上清液，使用洗涤剂洗涤，然后使用洗脱剂进行洗脱；

和/或，所述洗脱剂包括TE缓冲液；

和/或，所述洗涤剂包括乙醇、乙醇水溶液中的至少一种；

和/或，所述乙醇水溶液中乙醇的质量体积百分比为80％～90％；

和/或，弃去上清液后，洗涤保留物的次数≥1；

和/或，弃去上清液后，洗涤保留物的次数≥2；

和/或，每次洗涤时，使用的洗涤剂体积为0.1～1.5mL；

和/或，每次洗涤结束后，在磁力架上的静置时间≥10s，优选为10～60s；

和/或，所述核酸分子包含经过还原试剂处理后的核酸分子；

和/或，所述还原试剂的pH为4.0～4.5，优选为4.3；

和/或，所述还原试剂包含有机硼烷以及有机酸盐；

和/或，所述有机硼烷用于将核酸分子中氧化的5-甲基胞嘧啶(5mC)残基转化为二氢尿嘧啶(DHU)残基。