CN114657247B - 用于早期肝癌检测的dna甲基化生物标记物或组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于早期肝癌检测的DNA甲基化生物标记物或组合，包括以下至少一种甲基化标记物：cg20884887，cg06437004，cg10483825，cg18233405，cg18766755，cg21769702，cg27134730，cg01578265，cg18842353，cg06613738，本发明公开了十个与肝癌发生相关的特异性甲基化标记物，能够显著提高早期肝癌的检出率。甲基化标记物进一步与年龄、性别信息结合后所训练出的模型在区分良性肝病(肝炎、肝硬化)和早期肝癌时的预测AUC值可达0.917，并鉴于血浆检测的无创性，适于大规模推广应用。

Description

用于早期肝癌检测的DNA甲基化生物标记物或组合及其应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种用于早期肝癌检测的DNA 甲基化生物标记物或组合及其应用。
背景技术
众所周知的是，癌症的早发现早治疗可以极大的提高患者的成活率。肝癌 5年相对生存率仅为12.1％，但是，如果早期诊断经过有效治疗，可达到相对较好的预后，尤其是5公分以内的小肝癌，5年生存率可达到80％以上。目前，肝癌筛查效果不理想，检出率和早期诊断率相对偏低，如何早期发现癌症，已经成为医学界的关注重点，因此开发出一种新的便捷的早期癌症筛查方法对于个人，对于社会都有非常重要的意义。
DNA甲基化与肿瘤的发生紧密相关，在肿瘤细胞中普遍存在着DNA甲基化状态的改变，特点是总体甲基化水平降低和局部甲基化水平的升高。而且对于早期肿瘤的发生，甲基化的修饰也起着至关重要的作用。同时相对于其他血液肿瘤标记物来说，血液cfDNA甲基化稳定性更好，可以被稳定检出。因此，检测特定位点血液cfDNA甲基化，可以用于推测肝脏是否存在癌变，从而实现对肝癌早筛早诊的目标。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的主要目的是提供了与肝癌发生相关的DNA甲基化标记物及其组合，该甲基记标记物可用于诊断肝癌的发病情况，其技术方案如下所述：
一种用于早期肝癌检测的DNA甲基化生物标记物或组合，包括以下至少一种甲基化标记物：cg20884887，cg06437004，cg10483825，cg18233405， cg18766755，cg21769702，cg27134730，cg01578265，cg18842353，cg06613738。
进一步的，包括cg20884887，cg06437004，cg10483825，cg18233405。
进一步的，包括cg18766755，cg21769702，cg27134730，cg01578265， cg18842353，cg06613738。
进一步的，所述cg20884887的DNA甲基化标记物为hg19人类基因组中 chr7:27208285-27208286之间的CpG位点；
进一步的，所述cg06437004的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr12:21810458-21810459之间的CpG位点；
进一步的，所述cg10483825的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr12:21810450-21810451之间的CpG位点；
进一步的，所述cg18233405的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr8:98290148-98290149之间的CpG位点。
进一步的，所述cg18766755的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr1:153029939-153029940之间的CpG位点；
进一步的，所述cg21769702的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr11:127811589-127811590之间的CpG位点；
进一步的，所述cg27134730的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr2:124633001-124633002之间的CpG位点；
进一步的，所述cg01578265的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr85:114110567-114110568之间的CpG位点；
进一步的，所述cg18842353的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr13:697794052-97794053之间的CpG位点；
进一步的，所述cg06613738的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中 chr16:15596423-15596424之间的CpG位点。
一种用于早期肝癌检测的DNA甲基化生物标记物或组合在肝癌检测中的应用其特征在于，所述的甲基化生物标记物或其组合物用于结合年龄和性别进行检测。
一种用于检测早期肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含检查上述DNA甲基化标记物或其组合的甲基化水平的试剂。
进一步的，所述试剂盒使用下述平台：PCR扩增法，数字PCR，荧光定量 PCR，甲基化芯片法，液相芯片法，重亚硫酸盐测序，一代测序，二代测序，三代测序或者它们的组合所使用的试剂；
优选的，采用二代测序的方法。
进一步的，所述早期肝癌为I期肝癌。
一种探针，所述探针用于检测所述DNA甲基化标记物或其组合。
一种DNA甲基化生物标记物或组合检测方法，包括以下步骤：
步骤1，提取检测样本的cfDNA，NEB EM-seq试剂盒酶转化处理，甲基化 DNA建库；
步骤2，使用肝癌预测panel进行靶向杂交捕获文库；
步骤3，文库定量后进行二代测序；
步骤4，数据下机，对测序数据进行质量控制以及预处理后，得到真实数据；
步骤5，对所述的甲基化生物标记物及组合进行数据分析。
本发明的有益效果为：
本发明通过研究血浆cfDNA特定CpG位点上的DNA甲基化修饰在不同时期肝癌患者疾病的人群中的甲基化差异，发现所述DNA甲基化标记物及其组合能够作为早期肝癌诊断标记物。本发明公开了十个与肝癌发生相关的特异性甲基化标记物，能够显著提高早期肝癌的检出率。本申请的方案使用年龄以及性别来作为标记物结合甲基化标记物来进行早期肝癌的预测，进一步提高早期肝癌的预测准确性，适于大规模推广应用。
附图说明
图1是本发明所公开的10个检测肝癌的甲基化标记物的研发流程图；
图2是甲基化上升的4个生物标记物在TCGA肝癌样本中独立预测的ROAUC 示意图；
图3是甲基化下降的6个生物标记物在TCGA肝癌样本中独立预测的ROAUC 示意图；
图4是10个甲基化标记物组合在TCGA肝癌样本中预测的ROAUC示意图；
图5是甲基化上升的4个生物标记物在血浆样本中独立预测肝癌的ROAUC 示意图；
图6是甲基化下降的6个生物标记物在血浆样本中独立预测肝癌的ROAUC 示意图；
图7是10个甲基化标记物组合在血浆样本中预测肝癌的ROAUC示意图，图中展示的使用晚期癌症样本训练的模型在预测早期癌症样本的验证结果，A中表示10个甲基化标记物组合所训练出的模型；B中表示为年龄，性别结合10 个甲基化标记物组合所训练出的模型。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中使用的技术科学术语与本发明所属的技术领域的技术人员的通常理解相同。本发明的说明书中使用到的术语其目的是描述具体实施例，并非用于限制本发明。
本发明的一个实施例公开了用于肝癌检测的血浆cfDNA基因甲基化标记物 10种的至少一种或者组合及应用。具体包含以下肝癌患者血浆中具有显著差异甲基化的基因片段：cg19419054，cg10566012，cg02088996，cg05413061， cg10514097，cg10406295，cg21517947，cg20675505，cg18412834，cg03734437。
为了解决血浆游离cfDNA含量较低以及重亚硫酸盐对DNA的损伤问题，该发明采用NEBNext Enzymatic Methyl-seq kit进行胞嘧啶到尿嘧啶的转化。
肝癌根据AJCC TNM国际标准分期系统分为I-IV期，所述肝癌早期包括I 期。
本发明的一个实施例中，cfDNA甲基化肝癌标记物的筛选以及肝癌的检测包含以下步骤(见图1)：
步骤1，根据TCGA公共数据库挖掘肝癌特异性的DNA甲基化标记物；
步骤2，肝癌特异性甲基化标记物的捕获探针的设计以及合成；
步骤3，血浆cfDNA的提取，酶转化以及甲基化DNA建库；
步骤4，肝癌特异性panel靶向捕获甲基化DNA文库；
步骤5，文库定量后进行二代测序；
步骤6，测序数据进行质量控制以及预处理后，计算目标位点的甲基化水平；
步骤7，分析筛选出在肝癌的组织与血浆中具有一致性甲基化差异的甲基化标记物并用于构建肝癌检测的算法模型并验证。
实施例1用于肝癌检测的血浆cfDNA甲基化标记物的检测方
1、血浆cf DNA提取：血浆cf DNA提取具体操作步骤按照“游离DNA提取试剂盒(抽滤法)操作说明书”结合真空抽滤泵进行：将血浆用蛋白酶K和裂解液裂解，使用真空抽滤泵和DNA结合柱结合DNA，并用洗涤液和无水乙醇洗涤，最后用洗脱缓冲液洗脱。
2、使用磁珠对cfDNA进行片段筛选：
①往cfDNA中加入0.75倍于cfDNA产物的SPRIselect磁珠，涡旋混匀，室温孵育5分钟；置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液到新的1.5mL离心管中，备用；
②往上一步的上清液中加入1.05倍于cfDNA产物的SPRIselect磁珠，吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清液；
③用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清液，重复该步骤一次；晾干，用洗脱缓冲液洗脱。
3、质控品准备：每个样本中需加入10μL的0.1ng/μL CpG甲基化的pUC19 和10μL的2ng/μL非甲基化的λDNA；两种质控品需提前使用Covaris M220 超声波打断仪打断并片段筛选至200bp左右。
4、cfDNA的文库构建：使用NEBNext Enzymatic Methyl-Seq试剂盒进行建库
4.1末端修复和3′端加“A”
4.1.1取50ng待测样本，用NF水稀释至50μL，然后加入以下试剂进行反应。
组分 体积(μL)
工作液Control DNA 20
末端修复反应液 5
末端修复酶混合液 5
4.1.2置于PCR仪中按以下程序进行反应
Figure BDA0003524465700000071
4.2接头连接
4.2.1往末端修复产物中加入以下试剂进行反应
组分 体积(μL)
EM-seq连接接头 5
连接增强液 5
连接混合液 50
4.2.2置于PCR仪中，按下表条件设置PCR反应程序：
60℃，60min，热盖关闭。
4.2.3接头连接产物纯化
A、将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠。
B、按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例配制80％乙醇，备用。
C、分别向连接产物中加入55μL纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用15μL洗脱缓冲液洗脱，吸取14μL上清进行下一步反应。
4.3甲基化：氧化反应
4.3.1配制buffer：
a.往E1反应缓冲液中加入100μL E1反应缓冲液；往E1反应缓冲液中加入400μL E1反应缓冲液振荡混匀，标记配制日期。
b取10μL 500mM的Fe(Ⅱ)加入到1249μL的无核酸酶水中，稀释后的溶液立即使用，现配现用，不可保存。
c使用无核酸酶水按1:10的比例稀释终止缓冲液。
4.3.2往14μL纯化后的连接产物中加入以下试剂并混匀，然后再往已加入氧化酶的纯化后连接产物中加入10μL稀释后的Fe(Ⅱ)并混匀离心。
组分 体积(μL) 备注
配制好的TET2反应液 5 溶解后的E1补充液
氧化补充反应液 0.5 -
二硫苏糖醇 0.5 -
氧化增强液 10 -
E1 2 -
4.3.3置于PCR仪上，按照以下条件反应：37℃，1h，热盖温度≧45℃。
4.3.4反应完成后往产物中加入1μL稀释后的反应终止液，并置于PCR仪上，按以下条件反应：37℃，30min，热盖温度≧45℃。
4.3.5氧化反应产物纯化
A、将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；
B、按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例配制80％乙醇，备用；
C、分别向连接产物中加入45μL NEB Next Sample纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用9.5μL洗脱缓冲液洗脱,吸取8μL上清进行下一步反应。
4.4甲基化：胞嘧啶脱氨基
4.4.1变性：
a PCR仪提前预热至85℃，热盖开启；
b向8μL纯化后的氧化反应产物中加入2μL甲酰胺，涡旋振荡混匀，瞬时离心。
4.4.2往变性后产物中加入以下试剂进行反应
组分 体积(μL)
无核酸酶水 34
E2反应液 5
牛血清蛋白 0.5
E2 0.5
4.4.3置于PCR仪上，按以下条件反应：37℃，3h，热盖温度≧45℃。
4.4.4胞嘧啶脱氨基反应产物纯化
a将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；
b按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例配制80％乙醇，备用；
c分别向连接产物中加入50μL NEB Next Sample纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用11μL洗脱缓冲液洗脱,吸取10μL上清进行下一步反应。
4.5 PCR扩增及纯化
4.5.1向以上纯化产物中加入以下试剂进行反应
组分 体积(μL)
引物 2.5
酶混合液 12.5
4.5.2置于PCR仪上，按以下条件反应
Figure BDA0003524465700000101
4.5.3 PCR扩增产物纯化
a将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；
b按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例配制80％乙醇，备用；
c分别向连接产物中加入22.5μL NEB纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用15μL洗脱缓冲液洗脱，吸取14μL上清，进行质检。
5、杂交洗脱
5.1杂交：
a每个待杂交文库取10ng，计算合并杂交所需的文库体积，并将12个文库混在一起；
b向文库混合液中加入以下试剂进行反应；
c打开真空浓缩仪，设置V-AQ模式，常温下浓缩成干粉；
d立即取20μL杂交混合液加入到浓缩完成的干粉中，混匀并室温静置5 分钟后，加入30μL杂交增强液混匀离心；
e置于PCR仪上，按以下条件进行反应。
表1试剂组分表
Figure BDA0003524465700000111
Figure BDA0003524465700000121
表2 PCR反应条件表
Figure BDA0003524465700000122
5.2捕获洗脱
5.2.1 buffer预热：
将快速结合液、快速洗涤液2在48℃预热至沉淀溶解，快速洗涤液1在63 ℃预热至沉淀溶解，链霉亲和素磁珠室温平衡至少30min。
5.2.2磁珠捕获
a涡旋振荡混匀已平衡至室温的链霉亲和素磁珠；
b取70μL链霉亲和素磁珠加入到1.5mL离心管中；
c加入20μL结合缓冲液，吹打混匀，瞬时离心后置于磁力架上，静置1min，弃上清液；
d重复b和c步骤两次，共进行三次链霉亲和素磁珠清洗；
e加入20μL结合缓冲液重悬链霉亲和素磁珠；
f转移20μL重悬的链霉亲和素磁珠到杂交反应管中，然后全部液体转移到 1.5mL离心管中。
g室温条件下，在混匀仪上混匀30分钟，不可涡旋；
h混匀完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1分钟，弃上清。
5.2.3洗脱
a加入200μL 54℃预热的快速清洗缓冲液1，吹打混匀，置于恒温金属浴中54℃孵育5min；
b孵育完成后，瞬时离心，转移所有液体至新的1.5mL离心管中，去除结合在离心管表面的非特异性捕获片段；
c置于磁力架上，静置1分钟，弃上清；
d加入200μL 63℃预热的清洗缓冲液1，吹打混匀，置于恒温金属浴中54 ℃孵育5分钟；
e孵育完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min，弃上清；
f加入200μL 54℃预热的清洗缓冲液2，吹打混匀，置于恒温金属浴中54 ℃孵育5分钟；
g孵育完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1分钟，弃上清；
h重复a到g步骤两次，共进行三次清洗；
i瞬时离心，用10μL吸头弃掉残留的上清，立即加入45μL无核酸酶水，吹打混匀，冰上孵育。
5.3捕获产物PCR富集
5.3.1取22.5μL捕获产物(链霉亲和素磁珠悬浮液)加入以下试剂，进行反应。
Figure BDA0003524465700000131
Figure BDA0003524465700000141
置于PCR仪上，按以下条件进行反应
Figure BDA0003524465700000142
5.3.2 PCR产物纯化
a将DNA纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀；
b按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例配制80％乙醇，备用；
c分别向连接产物中加入90μL DNA纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用32μL洗脱缓冲液洗脱,吸取30μL上清进行质控，并上机测序。
6测序数据的分析：
下机的原始数据首先使用fastQC过滤低质量的序列(phred33 score<＝20)以及read中的接头序列和polyA/T序列。过滤后的高质量reads使用BSMAP回帖到hg19人类基因组，并筛选出回帖质量较高的reads。使用picard去除PCR重复后再通过samtools选择回帖到目标基因组区域(DNA甲基化标记物所对应的区域)的reads并计算各个DNA甲基化标记物的甲基化水平。
实施例2
本实施例公开了用于检测肝癌的DNA甲基化特异性标记物。基于TCGA公共数据库中51例肝癌癌旁样本和379例肝癌样本，挖掘出10个在肝癌中发生特异性显著甲基化差异的DNA甲基化位点，包括4个在肝癌中发生特异性甲基化上升的位点和6个在肝癌中发生特异性甲基化下降的位点。这些位点在区分正常肝样本和肝癌样本时均有很高的AUC值，见图2和图3。其中，cg18233405 和cg18842353表现最好，AUC分别为0.914和0.960。使用10个甲基化生物标记物构建出的模型能够准确区分正常肝样本和早期肝癌样本，见图4。
实施例3
本实施例基于125例良性肝病血浆和122例肝癌血浆样本，验证本发明公开的用于肝癌检测的10个DNA甲基化标记物。每个甲基化标记物独立区分肝癌血浆的AUC值见图5和图6。
使用甲基化上升的4个标记物和甲基化下降的6个标记物相结合构建出的模型区分良性肝疾病血浆和肝癌血浆的AUC值为0.899，见图7中的A,说明10 甲基化标记物都具有一定预测肝癌的效力，结合在一起所构建的模型则具有最好的预测性能。由于研究表明肝癌的发生与年龄和性别具有显著的相关性，本发明进一步将年龄、性别与甲基化标记物相结合构建早期肝癌预测模型，并在早期肝癌血浆样本中进行验证，模型的AUC值可提升至0.917，见图7中的B。
综上所述，本发明公开了十个与肝癌发生相关的特异性甲基化标记物并结合年龄、性别信息进行早期肝癌的检测。在早期肝癌血浆样本验证中显示出很高的预测性能，适于大规模推广应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测DNA甲基化标记物组合甲基化水平试剂，所述DNA甲基化标记物组合包括：cg20884887，cg06437004，cg10483825，cg18233405，cg18766755，cg21769702，cg27134730，cg01578265，cg18842353和cg06613738。
2.一种用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测DNA甲基化标记物组合甲基化水平试剂，所述DNA甲基化标记物组合包括：cg20884887，cg06437004，cg10483825和cg18233405。
3.根据权利要求2所述的用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述cg20884887的DNA甲基化标记物为hg19人类基因组中chr7:27208285-27208286之间的CpG位点；所述cg06437004的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr12:21810458-21810459之间的CpG位点；所述cg10483825的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr12:21810450-21810451之间的CpG位点；所述cg18233405的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr8:98290148-98290149之间的CpG位点。
4.一种用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测DNA甲基化标记物组合甲基化水平试剂，所述DNA甲基化标记物组合包括：cg18766755，cg21769702，cg27134730，cg01578265，cg18842353，cg06613738。
5.根据权利要求4所述的用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述cg18766755的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr1:153029939-153029940之间的CpG位点；所述cg21769702的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr11:127811589-127811590之间的CpG位点；所述cg27134730的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr2:124633001-124633002之间的CpG位点；所述cg01578265的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr85:114110567-114110568之间的CpG位点；所述cg18842353的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr13:697794052-97794053之间的CpG位点；所述cg06613738的DNA甲基化标记物是指hg19人类基因组中chr16:15596423-15596424之间的CpG位点。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用下述检测方法进行检测：PCR扩增法，甲基化芯片法，液相芯片法，重亚硫酸盐测序，一代测序，二代测序，三代测序。
7.根据权利要求6所述的用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增法为数字PCR或荧光定量PCR。
8.根据权利要求6所述的用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用二代测序的检测方法。
9.根据权利要求6所述的用于早期肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述早期肝癌为I期肝癌。
10.一种探针，所述探针用于检测权利要求1-5任一项所述的DNA甲基化标记物组合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108064314A (zh) * 2015-01-18 2018-05-22 加利福尼亚大学董事会 判定癌症状态之方法及系统
CN109825583A (zh) * 2019-03-01 2019-05-31 清华大学 人重复元件dna甲基化作为肝癌早期诊断的标记物及其应用
WO2022032429A1 (zh) * 2020-08-10 2022-02-17 华大数极生物科技(深圳)有限公司 用于肝癌检测和诊断的甲基化标志物

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3589371A4 (en) * 2017-03-02 2020-11-25 Youhealth Oncotech, Limited METHYLATION MARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF HEPER CELL CARCINOMA AND LUNG CANCER

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108064314A (zh) * 2015-01-18 2018-05-22 加利福尼亚大学董事会 判定癌症状态之方法及系统
CN109825583A (zh) * 2019-03-01 2019-05-31 清华大学 人重复元件dna甲基化作为肝癌早期诊断的标记物及其应用
WO2022032429A1 (zh) * 2020-08-10 2022-02-17 华大数极生物科技(深圳)有限公司 用于肝癌检测和诊断的甲基化标志物

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