CN116515993A - 用于抑郁症用药基因检测的引物组和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及用于抑郁症用药基因检测的引物组和试剂盒。本发明的引物组包含序列如SEQ ID NO.1‑42所示的多重PCR扩增引物。本发明提供的用于抑郁症用药基因检测的引物组能够实现21个抑郁症用药相关基因位点的单管反应和同时检测，极大地提高了检测效率，显著降低了检测成本，具有较高的特异性、灵敏度和准确度，对于指导抑郁症个体化用药具有重要意义。

Description

用于抑郁症用药基因检测的引物组和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及用于抑郁症用药基因检测的引物组和试剂盒。
背景技术
抑郁障碍也称抑郁症(depression)，是世界范围内主要的精神疾病之一。药物治疗是治疗抑郁症的主要临床手段，目前临床应用最多的抗抑郁药物主要是三环类（TCAs）抗抑郁药物和选择性5-羟色胺（5-HT）回收抑制剂。尽管药物是治疗抑郁症最有效的方法，但由于个体对药物的敏感性和不良反应的耐受差异，仍存在药物有效率低和不良反应严重等问题，如在精神分裂症患者中，40％的患者对典型和非典型的抗精神药物的反应不佳。在抑郁症患者中，有38％的患者对抗抑郁药物无应答。
近年来，随着药物基因组学的深入研究发现，遗传差异是造成个体对药物反应差异较大的重要因素之一，而且临床上常用的抗抑郁药物的服用或剂量均与基因多态性相关。通过药物代谢、转运及靶向相关基因的位点进行检测，可为患者提供更多的信息用于个性化用药指导，达到提高药效、降低毒性、避免不良反应的目的。
常见的基因检测技术，如Sanger测序、探针法、基因芯片法、ARMA法等，存在通量低、检测位点较少及价格昂贵的问题；而且目前市场上的基因检测产品在结果解读方面也存在不足，主要表现在：（1）循证医学证据等级不规范；（2）抗抑郁药物覆盖不全面。基于PCR及飞行时间质谱检测系统原理的基因多态性定性分型检测技术系统地整合了PCR技术的高特异性、芯片技术的高通量和质谱技术的高灵敏度，其通量能力能够满足大量检测的需求，能够快速提供结果、具有低成本检测几百个基因突变的能力，可实现一次性扫描384个样本，每个样本多达40-50个SNP位点。然而，目前基于多重PCR的核酸质谱平台产品需要多管反应体系，无法将多个基因位点在同一反应体系中进行扩增和检测，各个反应体系分别配置极大地增加了操作的繁琐性，同时增加了检测成本。此外，目前针对抑郁症用药基因的检测产品对于临床上常用的抗抑郁药物的基因多态性覆盖不全面，对于某些抑郁症用药基因尚缺乏有效的检测产品。
发明内容
本发明提供用于抑郁症用药基因检测的引物组和试剂盒。
本发明基于飞行时间质谱技术开发用于抑郁症用药基因检测的引物组和试剂盒，通过大量的筛选、优化和验证，获得了用于临床上常用抗抑郁药物相关的21个基因多态性位点基因分型的引物组。本发明的引物组所针对的21个基因多态性位点是基于中国人基因分布特征的药物基因组数据库所开发的检测组合。本发明提供的引物组中的多重PCR扩增引物可实现在同一反应体系（单管反应）中对21个抑郁症用药相关基因位点进行靶序列扩增。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供用于抑郁症用药基因检测的引物组，所述引物组包含序列如SEQ IDNO.1-42所示的多重PCR扩增引物。
序列如SEQ ID NO.1-42所示的多重PCR扩增引物可在同一反应体系中对21个抑郁症用药相关基因位点靶序列进行扩增，且具有较高的特异性、灵敏度和准确度。
单管反应能够极大地提高检测效率，但若有需要，本发明的上述多重PCR扩增引物也能够进行分管反应。
本发明的引物组所针对的抑郁症用药基因位点主要为抗抑郁药物发挥作用相关的药物代谢酶、转运体及受体相关的10个基因（ABCB1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、DRD3、FKBP5、HTR1A、HTR2A）的21个SNP位点，这些基因位点组成的检测组合能够更好地指导药物剂量与药物种类的合理选择，从而提高药物疗效、避免副反应。
上述21个抑郁症用药相关基因位点信息如表1所示。
表1
以上所述的用于抑郁症用药基因检测的引物组还包含序列如SEQ ID NO.43-63所示的单碱基延伸引物。
序列如SEQ ID NO.43-63所示的单碱基延伸引物可实现在同一反应体系中对21个抑郁症用药相关基因位点进行单碱基延伸反应，具有较高的特异性和准确度。
本发明提供以上所述的用于抑郁症用药基因检测的引物组在制备用于抑郁症用药基因检测的试剂盒中的应用。
本发明提供用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的用于抑郁症用药基因检测的引物组。
上述试剂盒包含多重PCR扩增引物混合液和单碱基延伸引物混合液。其中，多重PCR扩增引物混合液由序列如SEQ ID NO.1-42所示的多重PCR扩增引物混合得到，单碱基延伸引物混合液由序列如SEQ ID NO.43-63所示的单碱基延伸引物混合得到。
优选地，所述多重PCR扩增引物混合液中，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的浓度为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物的浓度为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4、7-42所示的引物的浓度均为0.1μmol/L。
优选地，所述单碱基延伸引物混合液中，核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示的引物的浓度为0.89μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示的引物的浓度为1.11μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示的引物的浓度为0.78μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.43-52、55-59、61-63所示的引物的浓度均为1μmol/L。
以上所述的试剂盒还包含选自PCR反应试剂、SAP（虾碱性磷酸酶）反应试剂、UEP反应试剂、飞行时间质谱检测试剂、阴性质控品和阳性质控品中的一种或多种。
其中，PCR反应试剂包括PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶、水等。
SAP反应试剂包括SAP反应缓冲液、SAP酶、水等。
UEP反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水等。
飞行时间质谱检测试剂包括质谱芯片等。
以上所述的试剂盒基于飞行时间质谱技术对抑郁症用药基因进行检测，所述检测包括：
以待测样本的基因组DNA为模板，采用多重PCR扩增引物进行多重PCR扩增，得到靶序列扩增产物；
将所述靶序列扩增产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物；
将所述SAP反应产物与UEP反应试剂和单碱基延伸引物混合进行UEP反应得到UEP反应产物；
采用飞行时间质谱对所述UEP反应产物的分子量进行检测，根据分子量标记确定待测样本中抑郁症用药基因的基因型。
优选地，多重PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的终浓度为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物的终浓度为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4、7-42所示的引物的终浓度为0.1μmol/L。
优选地，UEP反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示的单碱基延伸引物的终浓度为0.89μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示的单碱基延伸引物的终浓度为1.11μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示的单碱基延伸引物的终浓度为0.78μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.43-52、55-59、61-63所示的各单碱基延伸引物的终浓度均为1μmol/L。
上述试剂盒在进行检测时，多重PCR扩增的反应程序包括：（1）95℃，2min；（2）95℃、30sec，60℃、30sec，72℃、1min，45个循环；（3）72℃，5min。
上述试剂盒在进行检测时，UEP反应程序包括：（1）95℃，30 sec；（2）以下程序40个循环：①95℃、5sec，②52℃、5sec，80℃、5sec，5个循环；（3）72℃，3min。
在获得UEP反应产物后还包括纯化所述UEP反应产物的步骤，将纯化后的UEP反应产物采用飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否存在某位点基因。
在本发明的一些实施方式中，所述飞行时间质谱系统为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统。
本发明提供一种基于飞行时间质谱法对抑郁症用药基因进行检测的方法，所述方法包括：以待测样本的基因组DNA为模板，采用序列如SEQ ID NO.1-42所示的多重PCR扩增引物进行多重PCR扩增，得到靶序列扩增产物；
将所述靶序列扩增产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物；
将所述SAP反应产物与UEP反应试剂和序列如SEQ ID NO.43-63所示的单碱基延伸引物混合进行UEP反应得到UEP反应产物；
采用飞行时间质谱对所述UEP反应产物的分子量进行检测，根据分子量标记确定待测样本中抑郁症用药基因的基因型。
优选地，多重PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的终浓度为0.0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物的终浓度为0.0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4、7-42所示的引物的终浓度为0.1μmol/L。
优选地，UEP反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示的单碱基延伸引物的终浓度为0.89μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示的单碱基延伸引物的终浓度为1.11μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示的单碱基延伸引物的终浓度为0.78μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.43-52、55-59、61-63所示的各单碱基延伸引物的终浓度均为1μmol/L。
优选地，多重PCR扩增的反应程序包括：（1）95℃，2min；（2）95℃、30sec，60℃、30sec，72℃、1min，45个循环；（3）72℃，5min。
优选地，UEP反应程序包括：（1）95℃，30 sec；（2）以下程序40个循环：①95℃、5sec，②52℃、5sec，80℃、5sec，5个循环；（3）72℃，3min。
本发明的有益效果至少包括：
（1）本发明提供的引物组和试剂盒能够覆盖临床上常用抗抑郁药物疗效相关的基因，涉及药物代谢、受体、转运基因位点，检测较为全面准确。
（2）本发明提供的多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物均能够实现在同一反应体系中进行单管反应，实现21个抑郁症用药相关基因位点的同时检测，避免了各基因位点单独检测需要配制多个反应体系所带来的复杂操作，极大地提高了检测效率，显著降低了检测成本。
（3）本发明提供的多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物具有较高的特异性和准确度，配合飞行时间质谱技术能够高灵敏度地进行抑郁症用药基因的检测，且具有较好的重复性。
（4）本发明提供的引物组配合飞行时间质谱技术进行基因检测，具有操作简单快速、检测效率高、检测成本低、检测结果稳定可靠、通量高等优势，可用于抑郁症用药基因检测，从基因和遗传的角度对精神类疾病的治疗提供准确的指导和及时的反馈，为抑郁症的合理用药提供了有效方法，对于指导抑郁症个体化用药具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3中rs28371725基因位点检测质谱峰图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 用于抑郁症用药基因检测的引物组
针对临床上常用抗抑郁药物的21个基因多态性位点设计多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物，经不断筛选、验证和优化，最终确定了21对多重PCR扩增引物和21条单碱基延伸引物，这些引物具有较高的扩增效率和特异性，在用于21个抑郁症用药基因的单管反应检测时具有较高的特异性、灵敏度和准确度。上述21对多重PCR扩增引物的序列信息如表2所示，21条单碱基延伸引物的序列信息如表3所示。
表2
表3
实施例2 用于抑郁症用药基因检测的试剂盒
本实施例提供一种用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，其包括如下组分：
1、多重PCR扩增引物混合液：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-42所示的引物；多重PCR扩增引物混合液中，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的浓度为0.7μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物的浓度为0.7μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4、7-42所示的引物的浓度均为0.5μmol/L。
多重PCR扩增引物混合液的具体配制如表4所示。
表4
每个试剂盒设置450人份多重PCR扩增引物混合液，为450mL。
2、单碱基延伸引物混合液：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.43-63所示的单碱基延伸引物；单碱基延伸引物混合液中，核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示的引物的浓度为8μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示的引物的浓度为10μmol/L，核苷酸序列如SEQ IDNO.60所示的引物的浓度为7μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.43-52、55-59、61-63所示的引物的浓度均为9μmol/L。
单碱基延伸引物混合液具体配制如表5所示。
表5
每个试剂盒设置450人份单碱基延伸引物混合液，为450mL。
3、PCR混合液：包括10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP预混液、PCR酶，具体配制如表6所示。
表6
/>
每个试剂盒配制450人份 PCR 混合液，900mL。
4、SAP混合液：包括：SAP缓冲液、虾碱性磷酸酶，具体配制如表7所示。
表7
每个试剂盒设置450人份SAP混合液，为900mL。
5、UEP混合液：包括：iPLEX缓冲液、iPLEX延伸终止液、iPLEX 酶，具体配制如表8所示。
表8
以上成分均来自Agena公司。
上述混合液在-15℃以下能够稳定保存12个月。
6、质谱检测用芯片。
实施例3 基于飞行时间质谱技术检测抑郁症用药基因的方法
本实施例提供一种基于飞行时间质谱技术检测抑郁症用药基因的方法，该方法利用实施例2的试剂盒进行检测，包括如下步骤：
1、多重PCR扩增：以待测样本的DNA为模板，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-42所示的特异性扩增引物，在一个反应体系内，对抑郁症常用药物相关的21个SNP位点所在DNA区域进行扩增，得到含21个SNP位点的PCR产物。
待测样本可为口腔拭子、EDTA抗凝全血和干血片中提取的基因组DNA，要求DNA的A260/A280比值应介于1.7~2.0之间。冷冻DNA样本应在-20℃以下，并且避免反复冻融。
在试剂准备区，从-20℃冰箱中取出PCR混合液、多重PCR扩增引物混合液，分别在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10s，充分混匀后，按表9中的PCR反应体系配制，分装至384 孔板，3μL/孔，转移至样本处理区。
表9
/>
在样本制备区，向384孔板中每孔加入2μL DNA模板，盖上PCR膜，涡旋震荡10s后简短离心，传至扩增区，每次实验时必须设定空白对照（2μL，ddH2O）、阴性对照（2μL，DNA提取洗脱液）和阳性对照。
将384孔板放至PCR扩增仪进行扩增，具体程序如表10所示。
表10
2、虾碱性磷酸酶（SAP）处理：采用SAP处理步骤1得到的PCR产物，使步骤1中未结合的剩余核酸脱磷酸（dNTPs）失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。
将SAP混合液2μL/孔分装至含PCR扩增产物（5μL）的反应板中（总体积7μL），用PCR膜封住，涡旋震荡10s后简短离心。
将384孔板转移至PCR扩增仪进行反应，反应程序如下：37℃，40min；80℃，5min。反应结束后4℃保存。
3、单碱基延伸反应：使用核苷酸序列如SEQ ID NO.43-63所示的单碱基延伸反应引物（延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对），在前述反应体系中，对步骤2中所得的SAP 处理后的PCR产物进行多重单碱基延伸反应以获得延伸产物。
取出上一步反应结束的384孔板离心，配制iPLEX延伸反应液（UEP混合液1μL，单碱基延伸引物混合液1μL，总体积9μL），加入384孔板中，2μL/孔，用PCR膜封住，涡旋震荡10s后简短离心。
将384孔板转移至PCR扩增仪进行反应，反应程序如表11所示，反应结束后4℃保存。
表11
反应结束后，瞬时离心，每孔加入16μL的灭菌注射用水（此时每孔内的总体积为25μL），换新的封板膜将384孔板封住，震荡混匀后瞬时离心。
4、树脂脱盐：将步骤3中所得延伸产物进行树脂脱盐处理，以获得高纯度的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
5、质谱检测：将步骤4中所得高纯度的延伸产物点在含有基质的芯片上，放入MALDI-TOF质谱检测系统进行检测；
6、结果判读
飞行时间质谱检测系统通过对离子捕获仪收集并储存脉冲信号，并对其进行质谱分析，通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异（ddATP=271.2，ddCTP=247.2，ddGTP=287.2，ddTTP=327.1）可得出模板序列的信息，从而获得基因位点的检测结果。
由于飞行时间质谱检测是通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异来对基因位点进行分型，当分析的基因位点结果为野生型或者纯合型时，模板序列的质量差异为0，因此显示的质谱峰图只出现单一的峰，若分析的基因位点结果为杂合型时，模板序列的质量有差异，因此显示的质谱峰图出现两个峰。
21个抑郁症用药相关基因SNP位点的基因型结果如表12所示。
表12
/>
作为示例，rs28371725基因位点检测质谱峰图如图1所示。
实施例4 用于抑郁症用药基因检测的引物组和试剂盒的性能分析
1、试剂盒的准确性与稳定性评价
1.1样本选择
样本来源：选择分型参考品（rs1065852 GG、rs1135840 GC，样本编号P1）和阴性参考品（样本编号P2），其中分型参考品的检测结果应符合rs1065852为野生型（G），rs1135840为杂合型（G/C），阴性参考品的检测结果应为NA。
1.2样本检测
按照实施例3的方法使用实施例2的三个批次试剂盒检测以上样本，每个参考品各进行3次重复，每天测一次，连续测3天。
1.3实验结果
结果如表13和表14所示，结果显示，在批内准确性检测结果中每个样本3次准确性结果均一致，表明实施例2的试剂盒的检测体系具有良好的准确性。在批间准确性检测结果中每个样本3次检测结果均一致，表明该试剂盒的检测体系具有良好的稳定性。
表13
表14
2、试剂盒的灵敏度评价
2.1样本选择
样本来源及类型：选取分型参考品（rs1065852 GG、rs1135840 GC，样本编号L1）和阴性参考品（样本编号L2），用灭菌双蒸水将参考品稀释5个浓度梯度（2.5ng/μL、5ng/μL、7.5ng/μL、10ng/μL、12.5ng/μL）备用。
2.2样本检测
按照实施例3的方法使用实施例2的三个批次试剂盒检测以上样本，每个浓度样本进行3次重复检测。
2.3实验结果
表15
结果如表15所示，结果显示，按照实施例3的方法使用实施例2的三个批次试剂盒检测分型参考品和阴性参考品的检测结果对应的基因型结果一致，浓度在2.5ng/μL时均可检出相应的基因型别，因此说明实施例2的试剂盒准确性良好，灵敏度可达2.5ng/μL。
3、试剂盒的检测特异性评价
3.1干扰性实验
3.1.1样本选择
样本来源：选取已知基因型别的临床样本5例，各加入内源性干扰物质血红蛋白（60mg、200g/L、样本编号S1）、白蛋白（18mg、60g/L、样本编号S2）及外源性干扰物质帕罗西汀（90ng、300ng/mL、样本编号S3）、西酞普兰（120ng、400ng/mL、样本编号S4）、舍曲林（90ng、300ng/mL、样本编号S5）。
3.1.2样本检测
按照实施例3的方法使用实施例2的三个批次试剂盒检测以上样本，每个样本进行3次重复检测。
3.1.3实验结果
结果如表16所示，结果显示，不同干扰物质对实施例2的试剂盒的检测结果不会产生干扰。
表16
3.2交叉反应实验
3.2.1样本选择
样本来源：选取已知基因型别的临床样本（样本编号N1）、混合大肠杆菌DNA的临床样本（样本编号N2）以及具有CYP2D6的其他突变位点序列（样本编号N3）、CYP2C9基因序列（样本编号N4）等同源序列的混合样本。
3.2.2样本检测
按照实施例3的方法使用实施例2的三个批次试剂盒检测以上样本，每个样本进行3次重复检测。
3.2.3实验结果
结果如表17所示，结果显示，检测靶点之间不产生交叉反应，上述外源DNA，同源序列与靶点之间均不产生交叉反应。
表17
综上所述，该试剂盒具有良好的分析特异性。
上述使用的检验用参考品信息如表18所示。
表18
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.用于抑郁症用药基因检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含序列如SEQ IDNO.1-42所示的多重PCR扩增引物。
2.根据权利要求1所述的用于抑郁症用药基因检测的引物组，其特征在于，所述引物组还包含序列如SEQ ID NO.43-63所示的单碱基延伸引物。
3.权利要求1或2所述的用于抑郁症用药基因检测的引物组在制备用于抑郁症用药基因检测的试剂盒中的应用。
4.用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的用于抑郁症用药基因检测的引物组。
5.根据权利要求4所述的用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含选自PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂、飞行时间质谱检测试剂、阴性质控品和阳性质控品中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒基于飞行时间质谱技术对抑郁症用药基因进行检测，所述检测包括：
以待测样本的基因组DNA为模板，采用多重PCR扩增引物进行多重PCR扩增，得到靶序列扩增产物；
将所述靶序列扩增产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物；
将所述SAP反应产物与UEP反应试剂和单碱基延伸引物混合进行UEP反应得到UEP反应产物；
采用飞行时间质谱对所述UEP反应产物的分子量进行检测，根据分子量标记确定待测样本中抑郁症用药基因的基因型。
7.根据权利要求6所述的用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，其特征在于，多重PCR扩增的反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的终浓度为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物的终浓度为0.14μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4、7-42所示的引物的终浓度为0.1μmol/L。
8.根据权利要求6所述的用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，其特征在于，UEP反应体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示的引物的终浓度为0.89μmol/L，核苷酸序列如SEQID NO.54所示的引物的终浓度为1.11μmol/L、核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示的引物的终浓度为0.78μmol/L，核苷酸序列如SEQ ID NO.43-52、55-59、61-63所示的各引物的终浓度均为1μmol/L。
9.根据权利要求6~8任一项所述的用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，其特征在于，多重PCR扩增的反应程序包括：（1）95℃，2min；（2）95℃、30sec，60℃、30sec，72℃、1min，45个循环；（3）72℃，5min。
10.根据权利要求6~8任一项所述的用于抑郁症用药基因检测的试剂盒，其特征在于，UEP反应程序包括：（1）95℃，30 sec；（2）以下程序40个循环：①95℃、5sec，②52℃、5sec，80℃、5sec，5个循环；（3）72℃，3min。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004108899A2 (en) * 2003-06-04 2004-12-16 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Pni microarray and uses
US20090253585A1 (en) * 2005-11-30 2009-10-08 Luda Diatchenko Identification of Genetic Polymorphic Variants Associated With Somatosensory Disorders and Methods of Using the Same
WO2010111600A1 (en) * 2009-03-26 2010-09-30 The Ohio State University Research Foundation Polymorphism in cyp3a4 gene affecting drug metabolizing and uses thereof
US20140274764A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Pathway Genomics Corporation Method and system to predict response to treatments for mental disorders
CN105779601A (zh) * 2016-04-07 2016-07-20 江苏苏博生物医学科技有限公司 一种药物代谢酶相关基因snp荧光标记复合扩增试剂盒
CN109234383A (zh) * 2018-11-07 2019-01-18 上海康黎医学检验所有限公司 与抗精神疾病药相关的试剂盒、目标基因及其制备、snp标记、snp识别和应用
CN111321214A (zh) * 2020-03-04 2020-06-23 上海康黎医学检验所有限公司 一种用于指导人抑郁症用药的试剂盒及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004108899A2 (en) * 2003-06-04 2004-12-16 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Pni microarray and uses
US20090253585A1 (en) * 2005-11-30 2009-10-08 Luda Diatchenko Identification of Genetic Polymorphic Variants Associated With Somatosensory Disorders and Methods of Using the Same
WO2010111600A1 (en) * 2009-03-26 2010-09-30 The Ohio State University Research Foundation Polymorphism in cyp3a4 gene affecting drug metabolizing and uses thereof
US20140274764A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Pathway Genomics Corporation Method and system to predict response to treatments for mental disorders
CN105779601A (zh) * 2016-04-07 2016-07-20 江苏苏博生物医学科技有限公司 一种药物代谢酶相关基因snp荧光标记复合扩增试剂盒
CN109234383A (zh) * 2018-11-07 2019-01-18 上海康黎医学检验所有限公司 与抗精神疾病药相关的试剂盒、目标基因及其制备、snp标记、snp识别和应用
CN111321214A (zh) * 2020-03-04 2020-06-23 上海康黎医学检验所有限公司 一种用于指导人抑郁症用药的试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N.MULLINS等: "Genetics of depression：progress at last", 《CURRENT PSYCHIATRY REPORTS》, vol. 19, no. 43, pages 1 - 7 *
于莹等: "常用抗抑郁药的疗效与安全性的网状Meta分析", 中华中医药学刊, no. 10, pages 191 - 197 *

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