CN110592209A - 心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法和试剂盒,属于分子生物学技术领域,试剂盒包括PCR扩增引物、质谱延伸引物。采用本发明的检测方法和检测试剂盒,与一代测序相比,不到一天的快速周转时间;试剂耗材简单,流程化运行实验,不需要荧光染料或者探针类的昂贵试剂;由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比),理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别,从而具有高的灵敏度,相比RT‑PCR偏差更小;反应可以在微量体系中进行,单个反应孔中实现高度多重性的能力,最高能达到40重的检测能力,提高检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法和试剂盒,属于分子生物学技术领域。
背景技术
药物体内代谢、转运的遗传变异及其表达水平的变化会影响药物的体内浓度和敏感性,导致药物反应性个体差异。近年来随着基因检测技术的不断发展,药物基因组检测越来越精准,也越来也方便。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价的重要工具。目前,药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提。
个体化降压药用药说明:1)利尿剂类:氢氯噻嗪、呋塞米、托拉塞米、布美他尼
根据遗传药理学和基因组药理学数据库(PharmGKB-The Pharmacogenetics&Pharmacogenomics knowledgebase)指导建议,ADD1基因与利尿剂类药物的疗效相关(等级:2B)。ADD1是一种α/β异源二聚体骨骼肌膜蛋白,可影响细胞内钠-钾泵功能。该基因发生突变能够增强Na+-K+-ATP酶的活性,增加肾小管对钠的重吸收而升高血压,从而影响利尿剂的作用。
2)钙离子拮抗剂:维拉帕米、硝苯地平
根据遗传药理学和基因组药理学数据库(PharmGKB-The Pharmacogenetics&Pharmacogenomics knowledgebase)指导建议,CACNA1C基因与钙离子拮抗剂的疗效相关(等级:3)。L型钙离子通道α1亚基的α1C亚型是二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂调节心血管功能和降低血压的主要作用靶点,其基因CACNA1C SNPs可能与钙离子通道阻滞剂降压疗效存在一定关系。
根据遗传药理学和基因组药理学数据库(PharmGKB-The Pharmacogenetics&Pharmacogenomics knowledgebase)指导建议,CACNA1C基因与硝苯地平的疗效相关(等级:3)。CYP3A5参与多种药物的代谢。CYP3A5基因第3内含子内22893位存在6986A>G的突变(rs776746,CYP3A5*3),该SNP可导致CYP3A5mRNA异常剪接,引起终止密码子过早剪切CYP3A5蛋白,从而使其失去酶的活性,因此CYP3A5*3纯合子个体肝脏和肠道CYP3A5蛋白表达和活性显著下降。CYP3A5*1等位基因频率存在显著种族差异,白种人群中为10%--15%,中国人群中为28%,而黑种人群则高达60%--80%。该基因突变导致药物代谢速率减慢,血药浓度升高,毒副反应增强,建议酌情减少药物剂量。
3)β受体阻滞剂:阿替洛尔、美托洛尔、卡维地洛
根据遗传药理学和基因组药理学数据库(PharmGKB-The Pharmacogenetics&Pharmacogenomics knowledgebase)指导建议,CACNA1C基因与阿替洛尔的疗效相关(等级:3)。该基因突变使得个体对药物敏感性增加,药物疗效增强。
根据《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中指导建议,β肾上腺素受体(β-adrenergic receptor)为肾上腺素受体的一个亚家族,属于G蛋白偶联受体超家族,包含β1、β2和β3三种不同亚型。该类受体通过与Gs蛋白偶联调节细胞内cAMP和L型Ca2+通道的开放频率,是β受体激动剂和β受体阻滞剂的作用靶点。β1受体编码基因ADRB1多态性可影响β受体阻断剂如美托洛尔的疗效。ADRB1Gly389Arg(rs1801253)多态性导致位点Arg389和Gly389两种类型的受体,其中Arg389型受体与G蛋白偶联效率高于Gly389型受体。Arg389纯合子高血压患者应用美托洛尔后血压下降的程度是Gly389Arg杂合子基因型个体的3倍;Arg389纯合子基因型心衰患者应用卡维地洛和美托洛尔治疗后左室射血分数改善情况更佳。建议临床医师在应用β1受体阻滞药前进行ADRB1多态性检测,并根据其基因型调整用药剂量,以提高疗效,减少不良反应的发生。
根据《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中指导建议,CYP2D6又称异喹胍4’-羟化酶,CYP第二亚家族中的重要成员。人群中CYP2D6的活性呈现强代谢者(EM)、中间代谢者(IM)、弱代谢者(PM)和超强代谢者(UM)四态分布的现象。白种人群中CYP2D6PM的发生率高达5~10%,而在东方人群中PM的发生率约为1%。导致CYP2D6酶活性缺失的多态性可影响安替比林、可待因、β受体阻滞剂如美托洛尔和卡维地洛、氯丙咪嗪、去甲替林、地昔帕明、多虑平、丙咪嗪、马普替林、奥匹哌醇、三甲丙咪嗪、昂丹司琼、曲马多和他莫昔芬等的体内代谢,从而影响这些药物的疗效和不良反应的发生,临床需根据个体的基因型进行剂量的调整。
4)血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂:洛沙坦、缬沙坦、奥美沙坦
根据《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中指导建议,CYP2C9是细胞色素P450酶(CYP)第二亚家族中的重要成员,占肝微粒体P450蛋白总量的20%。CYP2C9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢。CYP2C9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化,甚至导致严重药物不良反应的发生。洛沙坦是一种常用的抗高血压药物,在体内主要经CYP2C9代谢活化为具有降压作用的代谢产物E-3174。携带CYP2C9*3等位基因的个体服用洛沙坦后E-3174的生成减少,洛沙坦的代谢率降低。口服单剂量洛沙坦后1h~6h后,CYP2C9*1/*3基因型个体中洛沙坦的降压作用下降,需适当增加用药剂量以增强降压疗效。
根据《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中指导建议,有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1,又称OATP-C、OATP2或LST1)特异地表达在肝细胞基底膜上,在肝细胞摄取和清除内源性和外源性物质如他汀类药物、瑞格列奈、依那普利拉、替莫普利、缬沙坦、奥美沙坦等中发挥重要作用。OATP1B1由SLCO1B1基因编码,该基因第5外显子521T>C(Val174Ala)多态性是亚洲人群中的主要遗传变异,等位基因频率为10~15%,该多态性显著降低OATP1B1对其底物的摄取能力,使血药浓度升高。
5)血管紧张素转换酶抑制剂:福辛普利、依那普利、赖诺普利、卡托普利、替莫普利
根据卫计委发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中指导建议,ACE I/D多态性可影响血浆ACE的水平,DD基因型个体血浆ACE的活性升高,依那普利治疗后ACE活性下降更明显;在初治的高血压患者中,DD型患者福辛普利的降压疗效增强;在高血压合并左心室肥大和舒张期充盈障碍的患者中,DD基因型患者服用依那普利和赖诺普利后心功能改善程度优于ID和II基因型患者;II基因型患者应用赖诺普利或卡托普利时肾功能下降更明显。为取得最佳疗效,建议临床上在选择ACEI类药物进行治疗前对ACEI/D多态性进行检测,以指导选择合适的ACEI类药物。
但目前的分子检测方法主要以限制性片段长度多态性分析、PCR测序、基因芯片为主,普遍存在低通量、低分辨率、高背景信号、高成本等缺陷。
MassArray分子量阵列技术是世界上领先的基因突变分析技术。MassArray结合了简单、可靠的引物延伸反应和先进的MALDI-TOF质谱技术,可以快速经济地进行基因型分析,达到目前市场上最高的准确率和性价比。基于MassArray分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术可以便捷的设计多达40种的基因型检测。实验设计灵活,价格低廉。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题,本发明的第一目的是提供一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法。
本发明的第二目的是提供一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测试剂盒。
为了实现上述目的,本发明采用的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法,所述心脑血管用药相关基因多态性位点包括ADD1-RS4961、CYP2C9*3-RS1057910、CACNA1C-RS1051375、CYP2D6*10-RS1065852、SLCO1B1-RS4149056、CYP3A5-RS776746、ADRB1-RS1801253中的至少一种;优选的,所述心脑血管用药相关基因多态性位点由ADD1-RS4961、CYP2C9*3-RS1057910、CACNA1C-RS1051375、CYP2D6*10-RS1065852、SLCO1B1-RS4149056、CYP3A5-RS776746、ADRB1-RS1801253组成;
所述检测方法包括以下步骤:
1)PCR扩增引物的制备:PCR扩增引物为根据所选择的待检测的个体化用药相关基因设计的特异性针对每种基因的扩增引物,所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列,所述扩增引物(包括正向引物和反向引物)在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基,在5'端具有标签序列,优选在5'端具有相同的标签序列,更优选,所述标签序列为acgttggatg,以区分扩增引物与延伸引物;
其中,扩增引物包括SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:14序列中的至少一对,优选的,扩增引物由SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:14序列组成;
2)质谱延伸引物的制备:所述质谱延伸引物的长度为15-28个碱基并且其3'端位于个体化用药相关基因突变位点在延伸方向上的上一个碱基,延伸引物在发生延伸反应时,只延伸一个碱基,延伸的碱基即为个体化用药相关基因突变位点;
其中,延伸产物和延伸引物之间的分子量差异不小于9Da;按照引物间,引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体,引物自身不形成发夹结构,以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物,特别地,用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计:各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da,各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da,延伸引物与延伸产物的分子量在4500-8500Da之间;
其中,延伸引物包括SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:21序列中的至少一对,优选的,延伸引物由SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:21组成;
3)检测模板的制备:采用适当的商业化试剂盒提取待测样本DNA,临床样本采用Tiangen基因组DNA提取试剂盒;
4)以步骤3)中提取的DNA为模板,使用步骤1)中所述PCR扩增引物进行PCR扩增,获得靶序列扩增产物;
5)通过SAP酶处理,除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP;
6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板,使用步骤2)中的所述质谱延伸引物通过延伸反应,在延伸引物的3'端连接一个碱基,从而得到延伸产物;
7)纯化步骤6)中获得的延伸产物;
8)将纯化后的产物在质谱仪上进行质谱检测,所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析,得到分型结果。
另外,本发明还提供了一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测试剂盒,所述试剂盒包括PCR扩增引物、质谱延伸引物;
所述PCR扩增引物为根据所选择的待检测的个体化用药相关基因设计的特异性针对每种基因的扩增引物,所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列,所述扩增引物(包括正向引物和反向引物)在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基,在5'端具有标签序列,优选在5'端具有相同的标签序列,更优选所述标签序列为acgttggatg,以区分扩增引物与延伸引物;
其中,扩增引物包括SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:14序列中的至少一对,优选的,扩增引物由SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:14序列组成;
所述质谱延伸引物的长度为15-28个碱基并且其3'端位于个体化用药相关基因突变位点的在延伸方向上的上一个碱基,延伸引物在发生延伸反应时,只延伸一个碱基,延伸的碱基即为个体化用药相关基因突变位点;
所述延伸引物包括SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:21序列中的至少一对,优选的,延伸引物由SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:21组成。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1)本发明中使用的试剂耗材,相对简单且性能稳定,不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂。
2)反应可以在微量体系中进行,减少了样品和各种消耗品的使用。
3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即不需要经过任何形式的信号转换),因此,理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别,从而具有高的灵敏度;质谱技术还有自动化、高通量检测等特点,因此,质谱技术与多引物延伸技术相结合,可以在一个反应体系中同时检测多个用药相关位点,从而大大减少了工作量,提高了检测通量。
4)本发明采用飞行时间质谱基因分型系统,通过设计一套全新的质谱延伸引物,实现了对上述药物的个体化用药相关基因的检测和分型,与其它方法相比,能够同时准确检测出心脑血管用药相关基因多态性位点相关性,具有高通量、自动化、低成本等显著优点。
附图说明
图1为本发明以样本提取的DNA为模板,对ADD1-rs4961进行检测的质谱峰图,其分析结果为纯合G,显示对利尿剂类药物疗效正常。
图2为本发明以样本提取的DNA为模板,对ADD1-rs4961进行检测的质谱峰图,其分析结果为纯合GT,显示对利尿剂类药物疗效增强。
图3为本发明以样本提取的DNA为模板,对ADD1-rs4961进行检测的质谱峰图,其分析结果为纯合G,显示对利尿剂类药物疗效增强。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了,下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限制本发明的范围。
首先,本发明的心脑血管用药相关基因多态性位点的检测试剂盒,包括:
1)PCR反应液Mix:包括1×PCR反应缓冲液(购自AgenaBioscience公司)、上述PCR扩增引物(由上海生工生物合成);
2)PCR反应Taq酶(购自Agena Bioscience公司);
3)SAP反应缓冲液(购自Agena Bioscience公司);
4)SAP酶(购自Agena Bioscience公司);
5)Extension反应液Mix:包括反应缓冲液(购自AgenaBioscience公司)、上述质谱延伸引物(由上海生工生物合成);
6)Extension反应Taq酶(购自Agena Bioscience公司);
7)MassARRAY芯片(购自Agena Bioscience公司)。
另外,下述实施例中,如无特殊说明,均为常规方法。
引物序列由上海生工生物合成,PCR扩增试剂、SAP酶、Extension反应液、MassARRAY芯片均购自AgenaBioscience公司,PCR扩增仪为AB公司9700型号,质谱分析仪为Agena Bioscience公司MassARRAY Compact Analyzer。
实施例1
一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法,包括以下步骤:
1)PCR扩增引物的制备:根据所选择的待检测的药物代谢酶和作用靶点药物的个体化用药相关基因,设计出特异性针对每种个体化用药相关基因的扩增引物,扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列,所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的至少15个碱基,在5'端具有10个碱基(acgttggatg)的标签序列,以区分扩增引物与延伸引物;
2)质谱延伸引物的制备:设计延伸引物,所述延伸引物的长度为15-28个碱基,并且其3'端位于用药相关突变位点的在延伸方向上的上一个碱基,延伸引物在发生延伸反应时,只延伸一个碱基,延伸的碱基即为用药相关突变位点,其中,延伸引物的野生型延伸产物与突变型延伸产物之间的分子量差异不小于9Da(Da=道尔顿),且各个用药相关突变位点的延伸产物间的分子量差异不小于30Da,按照引物之间、引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体、引物自身不形成发夹结构以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物;
特别地,用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计:各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da,各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da,延伸引物与延伸产物的分子量在4300-8500Da之间。
本发明设计的针对所述的个体化用药相关基因突变位点信息如表1所示,扩增引物参见表2,延伸引物参见表3。
表1降压用药相关基因突变信息
表2针对所述PCR扩增的PCR扩增引物序列
表3针对所述延伸反应的质谱延伸引物
SEQ ID NO: | 延伸引物名称 | 引物序列5'→3' | 延伸碱基 |
15 | ADD1-UEP | TGCTTCCATTCTGCC | G |
16 | CYP2C9*3-UEP | GGAACGAGGTCCAGAGATAC | C |
17 | CACNA1C-UEP | GTGGCCCTCCACAGTGCTGAC | G |
18 | CYP2D6*10-UEP | GCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTAC | G |
19 | SLCO1B1-UEP | ATTCAACGAAGCATATTACCCATGAAC | T |
20 | CYP3A5-UEP | CCAAACAGGGAAGAGATA | C |
21 | ADRB1-UEP | GGAAGGCGCGCGCAGCAGAGCAGTC | G |
3)检测模板的制备:突变样本为医院受检2名肿瘤患者的肿瘤组织(编号为2-A和2-B)和正常人组织样本4份(编号为3-A、4-A、5-A、6-A等)提取DNA(采用Tiangen DNA试剂盒提取,操作方法按照试剂盒说明书提取);
4)以步骤3)中提取的DNA为模板,使用步骤1)中所述PCR扩增引物进行PCR扩增,获得靶序列扩增产物;PCR扩增反应体系参见表4;其中,所有试剂购买自Agena Bioscience公司。
表4 PCR扩增反应体系
PCR反应条件为94℃,2分钟;94℃变性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸1分钟,共扩增45循环;最终72℃延伸5分钟。在本实施例中,使用步骤3)中提取的DNA作为PCR扩增的DNA模板。同时,将无菌双蒸水作为阴性对照。将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试,以验证检测的有效性。
5)通过SAP酶处理,除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。SAP酶反应体系见表5。所有试剂购买自Agena Bioscience公司。
表5 SAP酶反应体系
试剂 | 体积/反应 |
水(HPLE级) | 1.53μl |
SAP酶缓冲液 | 0.17μl |
SAP酶 | 0.30μl |
步骤4)中获得PCR扩增产物 | 5.0μl |
总体积 | 7.0μl |
SAP酶反应条件为37℃温育40分钟,以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP;85℃温育5分钟,以使SAP酶失活。
6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板,使用步骤2)中的质谱延伸引物通过延伸反应,在延伸引物的3’端连接一个碱基,从而得到延伸产物。延伸反应体系见表6。所有试剂购买自Agena Bioscience公司。
表6延伸反应体系
试剂 | 体积/反应 |
水(HPLE级) | 0.619μl |
iPLEX缓冲液 | 0.200μl |
iPLEXddNTP混合物 | 0.200μl |
表3中的延伸引物混合物 | *0.940μl |
iPLEX酶 | 0.041μl |
步骤(5)中获得的产物 | 7.00μl |
总体积 | 9.00μl |
*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。
延伸反应条件为94℃,30秒;94℃变性5秒,52℃退火5秒,80℃延伸5秒,共扩增40个循环,且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环;最终72℃延伸3分钟。
7)采用树脂(购买自Agena Bioscience公司)纯化步骤6)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂,16.00μl水,垂直摇匀一小时。经过本步反应后,树脂将与反应体系中的阳离子充分结合,从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天,也可在-20℃保存数周。所得的纯化产物在4000rpm离心5分钟后,取上清直接用于质谱检测。
8)将纯化后的产物在Agena Bioscience MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测。所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件(由Agena Bioscience公司提供)进行分析,得到分型结果。
检测结果:质谱峰图分析结果如图1-图3所示。
图1为本发明以样本提取的DNA为模板,对ADD1-rs4961进行检测的质谱峰图,其分析结果为纯合G,显示对利尿剂类药物疗效正常。
图2为本发明以样本提取的DNA为模板,对ADD1-rs4961进行检测的质谱峰图,其分析结果为纯合GT,显示对利尿剂类药物疗效增强。
图3为本发明以样本提取的DNA为模板,对ADD1-rs4961进行检测的质谱峰图,其分析结果为纯合G,显示对利尿剂类药物疗效增强。
采用本发明的检测方法和检测试剂盒,与一代测序相比,不到一天的快速周转时间;试剂耗材简单,流程化运行实验,不需要荧光染料或者探针类的昂贵试剂;由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比),理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别,从而具有高的灵敏度,相比RT-PCR偏差更小;反应可以在微量体系中进行,单个反应孔中实现高度多重性的能力,最高能达到40重的检测能力,提高检测效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 阔然医学检验实验室(徐州)有限公司
<120> 心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法和试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 1
acgttggatg tgaactctgg ccggggcga 29
<210> 2
<211> 29
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<211> 30
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acgttggatg tcaacaacgc caacaacacc 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 6
acgttggatg gcccgtggcc ctccacagt 29
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 7
acgttggatg agtccacatg cagcaggttg 30
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 8
acgttggatg tggtggacct gatgcaccg 29
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 9
acgttggatg aatctgggtc atacatgtgg 30
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 10
acgttggatg ccaatggtac tatgggagtc 30
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<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
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acgttggatg acccagctta acgaatgctc 30
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 12
acgttggatg gtaatgtggt ccaaacaggg 30
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<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 13
acgttggatg atcatctact gccgcagcc 29
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<213> 人类基因组(human genomic)
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acgttggatg ggtctccgtg ggtcgcgtg 29
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<213> 人类基因组(human genomic)
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tgcttccatt ctgcc 15
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<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 16
ggaacgaggt ccagagatac 20
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<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
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gtggccctcc acagtgctga c 21
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<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
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gcgccaacgc tgggctgcac gctac 25
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<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 19
attcaacgaa gcatattacc catgaac 27
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<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 20
ccaaacaggg aagagata 18
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 21
ggaaggcgcg cgcagcagag cagtc 25
Claims (10)
1.一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法,其特征在于,所述心脑血管用药相关基因多态性位点包括ADD1-RS4961、CYP2C9*3-RS1057910、CACNA1C-RS1051375、CYP2D6*10-RS1065852、SLCO1B1-RS4149056、CYP3A5-RS776746、ADRB1-RS1801253中的至少一种;
所述检测方法包括以下步骤:
1)PCR扩增引物的制备:PCR扩增引物为根据所选择的待检测的个体化用药相关基因设计的特异性针对每种基因的扩增引物,所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列,所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基,在5'端具有标签序列,以区分扩增引物与延伸引物;
2)质谱延伸引物的制备:所述质谱延伸引物的长度为15-28个碱基并且其3'端位于个体化用药相关基因突变位点在延伸方向上的上一个碱基,延伸引物在发生延伸反应时,只延伸一个碱基,延伸的碱基即为个体化用药相关基因突变位点;
3)检测模板的制备:提取待测样本DNA;
4)以步骤3)中提取的DNA为模板,使用步骤1)中所述PCR扩增引物进行PCR扩增,获得靶序列扩增产物;
5)通过SAP酶处理,除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP;
6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板,使用步骤2)中的所述质谱延伸引物通过延伸反应,在延伸引物的3'端连接一个碱基,从而得到延伸产物;
7)纯化步骤6)中获得的延伸产物;
8)将纯化后的产物在质谱仪上进行质谱检测,所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析,得到分型结果。
2.根据权利要求1所述的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法,其特征在于,所述步骤1)中,扩增引物在5'端具有相同的标签序列。
3.根据权利要求2所述的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法,其特征在于,所述的标签序列为acgttggatg。
4.根据权利要求1所述的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法,其特征在于,所述步骤1)中的扩增引物包括SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:14序列中的至少一对。
5.根据权利要求1所述的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测方法,其特征在于,所述步骤2)中的延伸引物包括SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:21序列中的至少一对。
6.一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括PCR扩增引物、质谱延伸引物;
所述PCR扩增引物为根据所选择的待检测的个体化用药相关基因设计的特异性针对每种基因的扩增引物,所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列,所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基,在5'端具有标签序列,以区分扩增引物与延伸引物;
所述质谱延伸引物的长度为15-28个碱基并且其3'端位于个体化用药相关基因突变位点的在延伸方向上的上一个碱基,延伸引物在发生延伸反应时,只延伸一个碱基,延伸的碱基即为个体化用药相关基因突变位点。
7.根据权利要求6所述的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测试剂盒,其特征在于,所述扩增引物在5'端具有相同的标签序列。
8.根据权利要求7所述的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测试剂盒,其特征在于,所述的标签序列为acgttggatg。
9.根据权利要求6-8任一项所述的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测试剂盒,其特征在于,所述扩增引物包括SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:14序列中的至少一对。
10.根据权利要求6-8任一项所述的一种心脑血管用药相关基因多态性位点的检测试剂盒,其特征在于,所述延伸引物包括SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:21序列中的至少一对。
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