CN109750097A

CN109750097A - 一种早期评估紫杉烷类药物化疗不良反应风险的诊断试剂盒

Info

Publication number: CN109750097A
Application number: CN201910071930.9A
Authority: CN
Inventors: 郭亮; 荆强; 史鑫; 周晨希
Original assignee: Jinan No4 People's Hospital
Current assignee: Jinan No4 People's Hospital
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-05-14

Abstract

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，公开了一种早期评估紫杉烷类药物化疗不良反应风险的诊断试剂盒，是用于预测紫杉烷类化疗药物引起受试者发生骨髓抑制风险的诊断试剂盒，所述试剂盒包括四对SNPs位点基因型的特异性扩增引物与四条特异性延伸引物，针对的检测基因为药物转运体基因SLC15A1、药物代谢基因UGT1A1、核受体基因NR1I2和核受体基因HNF4α。本发明所用的检测位点为紫杉烷类化疗药物相关骨髓抑制的易感SNPs，通过检测，能够有效评估紫杉烷相关骨髓抑制的发病风险，促进紫杉烷精准用药的实现。

Description

一种早期评估紫杉烷类药物化疗不良反应风险的诊断试剂盒

技术领域：

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种早期评估紫杉烷类药物化疗不良反应风险的诊断试剂盒。

背景技术：

紫杉烷类药物包括紫杉醇和多西紫杉醇，被广泛用于多种实体瘤的标准治疗中，例如乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞型肺癌和头颈癌。然而，紫杉烷在癌症治疗过程中常引起药物不良反应，例如骨髓抑制、周围神经病变和胃肠道毒性。特别得，骨髓抑制在大约80％的接受紫杉烷治疗的患者中出现，是紫杉烷治疗终止的主要原因之一。

骨髓抑制是指血细胞减少，包括中性粒细胞减少症，白细胞减少症，贫血或血小板减少症。其中，中性粒细胞减少症在紫杉烷治疗中最为常见。由于血液中的红细胞和白细胞都源于骨髓干细胞，血液中的血细胞寿命短，常常需要不断补充，为了达到及时补充的目的，作为血细胞前体的干细胞必须快速分裂，但紫杉烷类化疗药物常常导致正常骨髓细胞受到抑制。骨髓抑制增加感染败血症的风险，严重的骨髓抑制会危及患者的生命。

紫杉烷类药物不良反应在不同个体中的发生率不同。研究表明，基于患者基因组成的个体化用药已经显示能减少药物不良反应的发生。因此，明确基因和紫杉烷的关联并发现骨髓抑制的基因标记是十分重要的。单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)普遍存在于机体基因序列中，是第三代遗传标记。SNP的存在能影响基因的结构或功能，赋予个体对环境暴露、药物治疗等的不同反应，从而产生不同的表型，因此SNP可能是导致个体疾病发生发展差异的重要遗传基础。

一些SNP位点在不同种族中的分布不同，比如之前的大部分骨髓抑制研究是在高加索人群中完成的，其研究结果可能不适用于汉族患者，因为两个种族的基因频率并不完全相同，不能精确的用于中国汉族人群的临床用药指导，并且之前的骨髓抑制研究结果需要在中国汉族人群中做进一步验证。有研究表明，这种基于种族的遗传差异可能是中国人群骨髓抑制的发生率更高的原因之一。因此建立简单、可靠、快速的早期评估骨髓抑制易感性的无创检测方法，能够检测出骨髓抑制发生相关的SNP位点，及时筛查出易感高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施，对于骨髓抑制易感性早期风险诊断和个体化医疗具有重要意义。

发明内容：

本发明在SLC15A1rs2297322、UGT1A1rs4148323、NR1I2rs3732359、HNF4αrs6130615四个SNPs位点可用于评估紫杉烷类化疗药物骨髓抑制毒性相关的基础上，提供一种早期评估紫杉烷类药物化疗不良反应风险的诊断试剂盒。

一种早期评估紫杉烷类药物化疗不良反应风险的诊断试剂盒，是用于预测紫杉烷类化疗药物引起受试者发生骨髓抑制风险的诊断试剂盒，所述试剂盒包括四对SNPs位点基因型的特异性扩增引物与四条特异性延伸引物，针对的检测基因为药物转运体基因SLC15A1、药物代谢基因UGT1A1、核受体基因NR1I2和核受体基因HNF4α；所述的特异性扩增引物是指针对SLC15A1rs2297322、UGT1A1rs4148323、NR1I2rs3732359、HNF4αrs6130615四个SNPs位点，能特异性扩增出包含这四个SNPs位点的DNA片段的引物对；所述的特异性延伸引物是针对SLC15A1rs2297322、UGT1A1rs4148323、NR1I2rs3732359、HNF4αrs6130615四个SNPs位点而设计，能通过DNA测序技术检测出上述四个SNPs位点基因型的特异性延伸引物。

所述的特异性扩增引物序列如下：SLC15A1rs2297322前引物序列为SEQ ID NO:1，后引物序列为SEQ ID NO:2；UGT1A1rs4148323前引物序列为SEQ ID NO:3，后引物序列为SEQ ID NO:4；NR1I2rs3732359前引物序列为SEQ ID NO:5，后引物序列为SEQ ID NO:6；HNF4αrs6130615前引物序列为SEQ ID NO:7，后引物序列为SEQ ID NO:8。

所述的特异性延伸引物序列如下：SLC15A1rs2297322延伸引物序列为SEQ ID NO:9；UGT1A1rs4148323延伸引物序列为SEQ ID NO:10；NR1I2rs3732359延伸引物序列为SEQID NO:11；HNF4αrs6130615延伸引物序列为SEQ ID NO:12。

上述SNPs位点的引物信息如下表所示：

表1.相关SNPs位点的引物信息

表1中Alleles：等位基因；MAF：最小等位基因频率；1st-PCRP：PCR扩增的前引物；2nd-PCRP：PCR扩增的后引物；UEP_SEQ：单碱基延伸引物。

所述的试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。如，试剂盒的每一人份包括PCR反应体系、SAP消化反应体系和延伸反应体系；其中，PCR反应体系包括PCR反应缓冲液、dNTP混合液、镁离子、DNA聚合酶、扩增引物混合液和水；SAP消化反应体系包括SAP混合液、SAP酶和水；延伸反应体系包括延伸反应缓冲液、反应用酶、反应终止子和水。

所述试剂盒的检测样本为外周血。

现有的与紫杉烷类化疗药物骨髓抑制相关的风险预测通常使用高加索人群数据，不同群体的遗传差异会导致预测效果大打折扣，本发明针对中国人群中紫杉烷相关骨髓抑制的易感位点进行分析，能够有效预测骨髓抑制的发病风险，有助于实现个体化治疗指导、改善患者的预后，提高临床用药的有效性和安全性。

本发明所述的紫杉烷类化疗药物骨髓抑制诊断试剂盒只需要外周血而不需要其它组织样品，通过特性扩增引物及延伸引物检测SNP，再通过SNP质谱评价接受紫杉烷类化疗药物的癌症患者的血液毒性反应(毒副反应)，有助于反映患者对紫杉烷类化疗药物骨髓抑制毒性的易患程度，检测方便精确、稳定可靠，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。因此，该试剂盒投入生产实践，可以帮助指导高危人群的筛检和更有效的个体化治疗。

具体实施方式：

为能清楚说明本方案的技术特点，下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段是本领域技术人员所熟知的常规技术手段。

实施例一

本实施例为样品收集与整理、基因组DNA样品准备、基因型检测、统计分析和结果分析。

1.样品收集与整理

自2012至2015年从济南市第四人民医院收集了大量的癌症患者血标本，通过对样品资料的整理，从中选择了124例符合下列标准的标本：(1)年龄在18至80岁的癌症患者；(2)无主要脏器的功能障碍，首次化疗前血常规、肝肾功能及心脏功能基本正常；(3)所有患者至少接受基于紫杉醇或多西紫杉醇的化疗一周期；(4)除有骨转移的患者，所有患者基线嗜中性细胞绝对计数大于1.5×10⁹/L；(5)有患者的年龄，性别，身高，体重，肿瘤类型和肿瘤分期等基线信息；(6)有详细的评价药物毒性的信息，记录了每个患者的血细胞计数，包括白细胞计数，嗜中性细胞绝对计数，血小板计数和血红蛋白浓度。对上述纳入病患，依据知情同意原则患者签署知情同意书。上海伦理委员会和中国人类遗传资源管理办公室同意了本实验方法。患者的招募，血样收集，临床数据收集和使用均按相关的指导完成。

对筛选出的符合条件的124例肿瘤患者，使用Common Terminology Criteria forAdverse Event version 3.0(CTCAE 3.0)评估骨髓抑制。本研究中，中性粒细胞减少症，白细胞减少症，贫血或血小板减少症任何一项及更多发生即被定义为骨髓抑制。在治疗过程中，每个患者发生的最高的骨髓抑制分级被记录用于数据分析。根据收集得到的骨髓抑制分级将患者分为严重药物不良反应组(ADR Gruop)与对照组(Control group)。严重药物不良反应组的患者在紫杉烷治疗后患III或IV级骨髓抑制，而对照组中的患者患0-II级骨髓抑制。ADR组和对照组的年龄、性别、身高和体重没有显著差异，在肿瘤类型和肿瘤分期方面也没有显著差异(表2)。在84名患有严重骨髓抑制的患者中，22名发生III或IV级白细胞减少症，29名发生III或IV级中性粒细胞减少症(表2)。中性粒细胞减少症的ADR组与对照组的性别分布存在差异(p＝0.044)，这可能是由于女性乳腺癌患者比例最大。因此，选择性别作为与中性粒细胞减少相关研究的协变量。

表2ADR组和对照组的临床特点的比较

2.基因组DNA样品准备

所有血样在DNA抽提前放于-80℃保存。基因组DNA使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)从外周血中抽提，并储存于-20℃。基因组DNA样品抽提之后应用紫外分光光度计进行浓度测定，通常能得到纯度(紫外2600D与2800D比值)在1.6～2.0的DNA。然后用去离子水稀释为浓度10～20ng/μl。

3.基因型检测

对包含SLC15A1基因上rs2297322、UGT1A1基因上rs4148323、NR1I2基因上rs3732359、HNF4α基因上rs6130615多态位点的DNA片段进行特异性扩增，并对所获得的DNA片段进行测序，得到rs2297322、rs4148323、rs3732359和rs6130615位点的基因型数据。

4.统计分析

对比上述两组患者的基线信息，运用卡方检测和t检测。对所有SNP进行哈迪-温伯格平衡(HWE)检测，检查SNP的基因型分布。MAF<0.01,HWE<0.01的SNP以及基因分型成功率<0.95的样本被剔除。利用加性模型，显性模型和隐性模型分别进行多元逻辑回归来评估每个SNP的分型对药物不良反应发生的贡献。P值<0.05的SNP位点被认为与骨髓抑制显著相关。为了降低假阳性率，我们将结果缩小为p<0.01或在随后的验证分析中被验证。以上所有的数据分析使用专门的统计学分析软件Plink1.07和SPSS17.0完成。

5.结果分析

本发明的研究中SLC15A1的rs2297322与骨髓抑制的相关性较强(REC，p<0.01，OR＝3.571，95％CI：1.358-9.394)。同时，位于核受体基因HNF4α的rs6130615(1132C>T)在骨髓抑制(REC,OR＝2.807,95％CI＝1.077-7.316,p＝0.035)和白细胞减少症(REC，OR＝2.933，95％CI：1.017-8.464，p＝0.047)两次分析中均显示出显著相关性。位于UGT1A1的Rs4148323显示骨髓抑制的风险增加最高(REC，OR＝11.86，95％CI：1.336-105.200，p＝0.026)。位于NR1I2的rs3732359与骨髓抑制的相关性较强(ADD,OR＝1.970,95％CI:1.147-3.383,p＝0.014)。

药物转运基因SLC15A1基因rs2297322(350G>A)突变与紫杉烷相关骨髓抑制有关。验证分析中证实其增加发生白细胞减少症和中性粒细胞减少症的风险。SLC15A1编码肽转运蛋白1(PepT-1)，负责多肽的吸收，在寡肽和拟肽药物的代谢中起重要作用。

HNF4α是多种药物代谢基因的调控基因。它调节孕烷X受体基因(PXR，NR1I2)的功能，在NR1I2介导的CYP3A4转录中起关键作用。NR1I2和CYP3A4与紫杉烷清除有关。NR1I2被紫杉烷激活并诱导CYP3A4表达。HNF4αrs6130615位于3′-UTR区，可改变HNF4αmRNA与靶mRNA之间的碱基配对。因此，它能抑制HNF4α基因3′-UTR的功能。HNF4αrs6130615(1132C>T)突变可能降低HNF4α的表达。体内研究也表明，HNF4α的缺失可引起CYP3A表达的减少或缺失。以上这些结果表明HNF4αrs6130615可能通过调节HNF4α的表达及其对NR1I2调控，从而改变CYP3A4的酶活性，进而影响紫杉醇的清除。表明核受体基因对紫杉烷血液毒性的预测的重要性。

UGT1A1rs4148323(211G>A)，是亚洲人群特有的突变，本发明的研究中证明了UGT1A1rs4148323能增加紫杉烷诱导的骨髓抑制的发生率。UGT1A1rs4148323已被证明能降低UGT1A1的活性，并导致各种外源化学物质和药物的代谢降低。与其他患者相比，携带UGT1A1211G>A的患者具有较低的UGT1A1活性和较慢的紫杉烷代谢速率。因此，UGT1A1211G>A突变最终导致药物清除率的降低和药物积聚的增加。

综上所述，药物转运体基因SLC15A1的rs2297322、药物代谢基因UGT1A1rs4148323、核受体基因NR1I2rs3732359和位于核受体基因HNF4α的rs6130615是紫杉烷相关的骨髓抑制的遗传因子。

实施例二

本实施例为基于PCR技术和DNA测序技术的诊断试剂盒的应用。

1、DNA抽提

按照产品说明书使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)从外周血中抽提DNA，并储存于-20℃。

2、PCR反应

使用诊断试剂盒中PCR反应组件，其中含下列引物对：

SLC15A1rs2297322前引物序列为SEQ ID NO:1，后引物序列为SEQ ID NO:2；

UGT1A1rs4148323前引物序列为SEQ ID NO:3，后引物序列为SEQ ID NO:4；

NR1I2rs3732359前引物序列为SEQ ID NO:5，后引物序列为SEQ ID NO:6；

HNF4αrs6130615前引物序列为SEQ ID NO:7，后引物序列为SEQ ID NO:8。

以上引物对的详细信息参见本说明书表1。

PCR扩增的反应体系包括PCR反应缓冲液、dNTP混合液、镁离子、DNA聚合酶、扩增引物混合液和水。具体地，根据检测的样本数按0.1μl dNTP Mix(25mM),0.5μl 10×PCRBuffer,0.4μl Mgcl₂(25mM)，1μl扩增引物Mix，0.2μl Hotstar Taq(5U/μl)，去离子水1.8μl来配置混合液。

在ABI9700PCR仪上进行下列反应：95℃2min；45个循环：95℃30s、56℃30s、72℃60s；72℃5min；4℃hold。

3、SAP消化反应

使用诊断试剂盒中的SAP消化反应组件，其中SAP消化反应体系包括SAP混合液、SAP酶和水。具体地，根据检测的样本数按10×SAP buffer 0.17μl,SAP Enzyme 0.3μl,去离子水1.53μl来配置SAP酶混合液。

在ABI9700PCR仪上进行SAP酶消化：37℃40min，85℃5min，4℃hold。

4、延伸反应

使用诊断试剂盒中的延伸反应组件，其中，含有下列延伸反应引物：

SLC15A1rs2297322延伸引物序列为SEQ ID NO:9；

UGT1A1rs4148323延伸引物序列为SEQ ID NO:10；

NR1I2rs3732359延伸引物序列为SEQ ID NO:11；

HNF4αrs6130615延伸引物序列为SEQ ID NO:12。

以上引物的详细信息参见本说明书的表1。

延伸反应体系包括延伸反应缓冲液、反应用酶、反应终止子和水。具体地，根据检测样本数按10×gold buffer 0.2μl，Termination mix 0.2μl,延伸引物Mix 0.94μl，Hotstar Taq(5U/μl)0.041μl,去离子水0.619μl来配置延伸混合液。

在ABI9700PCR仪上进行延伸反应：94℃30s；40个外部循环：94℃5s、5个内部循环(52℃5s,80℃5s)；72℃3min；4℃hold。

5、基因型分析

使用MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪将反应产物点至SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDITOF质谱分析，检测结果采用Typer V4.0软件分型并输出结果。

实施例三

本实施例提供紫杉烷类化疗药物相关骨髓抑制发病风险基因检测服务。

1、DNA抽提

由医院检验科医师对受检者进行血样采样，基因组DNA使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)从全血中抽提。

2、基因型检测

使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组的SLC15A1rs2297322、UGT1A1rs4148323、NR1I2rs3732359、HNF4αrs6130615四个SNPs位点分别进行DNA测序，确定这四个SNPs位点的基因型。

3、骨髓抑制发病风险的评估

通过对受检者SNPs基因型的分析，出具骨髓抑制发病风险的评估分析报告。报告详细说明受检者SLC15A1rs2297322、UGT1A1rs4148323、NR1I2rs3732359、HNF4αrs6130615的四个SNPs的基因型信息及发病风险评估结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南市第四人民医院

<120> 一种早期评估紫杉烷类药物化疗不良反应风险的诊断试剂盒

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs2297322的前引物

<400> 1

acgttggatg agtgagcacc aactcacacg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs2297322的后引物

<400> 2

acgttggatg atgacctcac agaccacaac 30

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs2297322的延伸引物

<400> 3

gaatggcacc cccgaca 17

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs4148323的前引物

<400> 4

acgttggatg ctgacgcctc gttgtacatc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs4148323的后引物

<400> 5

acgttggatg acatcctccc tttggaatgg 30

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs4148323的延伸引物

<400> 6

cttcaaggtg taaaatgctc 20

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs3732359的前引物

<400> 7

acgttggatg actcaggaag cgaacaaacg 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs3732359的后引物

<400> 8

acgttggatg aagtgtcaag gtgtggaagg 30

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs3732359的延伸引物

<400> 9

gcaagcgacc aaggat 16

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs6130615的前引物

<400> 10

acgttggatg agccccaagc ctcattactc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs6130615的后引物

<400> 11

acgttggatg aacacagcag ttctgcagag 30

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs6130615的延伸引物

<400> 12

cttggggtgg atgatataat g 21

Claims

1.一种早期评估紫杉烷类药物化疗不良反应风险的诊断试剂盒，是用于预测紫杉烷类化疗药物引起受试者发生骨髓抑制风险的诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括四对SNPs位点基因型的特异性扩增引物与四条特异性延伸引物，针对的检测基因为药物转运体基因SLC15A1、药物代谢基因UGT1A1、核受体基因NR1I2和核受体基因HNF4α；

所述的特异性扩增引物是指针对SLC15A1rs2297322、UGT1A1rs4148323、NR1I2rs3732359、HNF4αrs6130615四个SNPs位点，能特异性扩增出包含这四个SNPs位点的DNA片段的引物对；

所述的特异性延伸引物是针对SLC15A1rs2297322、UGT1A1rs4148323、NR1I2rs3732359、HNF4αrs6130615四个SNPs位点而设计，能通过DNA测序技术检测出上述四个SNPs位点基因型的特异性延伸引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性扩增引物序列如下：SLC15A1rs2297322前引物序列为SEQ ID NO:1，后引物序列为SEQ ID NO:2；

UGT1A1rs4148323前引物序列为SEQ ID NO:3，后引物序列为SEQ ID NO:4；

NR1I2rs3732359前引物序列为SEQ ID NO:5，后引物序列为SEQ ID NO:6；

HNF4αrs6130615前引物序列为SEQ ID NO:7，后引物序列为SEQ ID NO:8。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性延伸引物序列如下：SLC15A1rs2297322延伸引物序列为SEQ ID NO:9；

UGT1A1rs4148323延伸引物序列为SEQ ID NO:10；

NR1I2rs3732359延伸引物序列为SEQ ID NO:11；

HNF4αrs6130615延伸引物序列为SEQ ID NO:12。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测样本为外周血。