CN110804663A - 检测人cyp2c19基因突变的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

检测人cyp2c19基因突变的引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测人CYP2C19基因突变的引物、试剂盒及检测方法，引物包括用于检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的引物和探针、用于检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的引物和探针。本发明的方法设置了阴性对照和阳性对照，能分别有效地避免因污染造成的假阳性结果和评价本次扩增试剂质量是否达标；外控反应液能准确反映待测模板质量，防止因模板量不足或抑制剂过强引起的假阴性结果，也能监测因模板量过高可能造成的假阳性，同时在突变检测反应液中均添加了内参引物探针，通过内参的扩增能有效避免假阴性出现，最终确保试剂盒检测结果准确无误。本发明的试剂盒及检测方法灵敏度高、特异性强，可以指导多种病症患者根据个体的基因组信息实现个体化用药。

Description

检测人CYP2C19基因突变的引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于检测人CYP2C19基因突变的引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
药物效应动力学是研究药物对机体的作用、作用规律及作用机制的科学，其内容包括药物与作用靶位之间相互作用所引起的生化、生理学和形态学变化，侧重于解释药物如何与作用靶点发生作用。对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量，实现个体化用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应的发生。
近年来随着人类基因组学的发展，药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具，部分上市的新药仅限于特定基因型的适应症患者。
细胞色素P450(cytochrome P450)是主要的肝细胞Ⅰ相代谢酶之一。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因为它们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，从而产生血药浓度的个体差异。CYP2C19基因多态性对酸相关性疾病及幽门螺杆菌感染的治疗疗效、慢性肝病及肝移植患者的药物选择、抗癫痫药物及抗抑郁药物剂量的调整以及肿瘤高危性的判断、免疫抑制剂不良反应的大小等均有影响。CYP2C19至少存在14种突变基因和18种等位基因突变，正常野生型表现为快代谢型(EM)，绝大多数突变型等位基因，因碱基的突变、插入或缺失而造成酶代谢能力降低，表现为慢代谢型(PM)，这对治疗的个体反应和药物毒副作用都产生重要影响。而CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占东方人弱代谢表型(PM)的99％，以上通过对患者的CYP2C19基因进行检测，得到特定位点的基因型，以基因检测结果来确定药物的选择，就可以实现个体化用药，避免对免疫抑制剂不良反应。
目前常用的CYP2C19基因突变检测方法主要采用Taqman荧光探针法，但Taqman荧光探针法灵敏度低、假阳性率高、耗时较长，通量小。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提出一种用于检测人CYP2C19基因突变的引物、试剂盒及检测方法。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提供一种用于检测人CYP2C19基因突变的引物和探针，包括用于检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的引物和探针、用于检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的引物和探针，所述检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的探针序列如SEQ ID NO.3所示；所述检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的探针序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测人CYP2C19基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述的用于检测人CYP2C19基因突变的引物和探针。
进一步地，所述试剂盒还包括内参基因和外控基因。
更进一步地，所述内参基因包括内参特异性引物SEQ ID NO:7-8和内参检测探针SEQ ID NO:9。
更进一步地，所述外控基因包括外控特异性引物SEQ ID NO:10-11和外控检测探针SEQ ID NO:12。
本发明的第三个目的是提供一种基于上述任一项所述试剂盒检测人CYP2C19基因突变的方法，包括如下步骤：
(1)获取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；
(2)将已知浓度的DNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；
(3)配组三组反应液、阳性质控和阴性质控，每组反应液均由反应液1、反应液2和反应液3组成；所述反应液1的组成为：PCR缓冲液、DNA聚合酶、SEQ ID NO.1-2所示引物、SEQID NO.3所示探针、SEQ ID NO:7-8所示内参引物、SEQ ID NO:9所示内参探针；所述反应液2的组成为：PCR缓冲液、DNA聚合酶、SEQ ID NO.4-5所示引物、SEQ ID NO.6所示探针、SEQ IDNO:7-8所示内参引物、SEQ ID NO:9所示内参探针；所述反应液3的组成为：PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控特异性引物SEQ ID NO:10-11和外控检测探针SEQ ID NO:12；
(4)分别向第一组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl已稀释备用的样本DNA作为模板；分别向第二组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl阳性质控品作为阳性对照；分别向第三组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl阴性质控品作为阴性对照；离心后上机扩增；
(5)荧光PCR检测并进行结果分析。
进一步地，所述阳性质控包括CYP2C19*2等位基因5号外显子和CYP2C19*3等位基因4号外显子突变质粒。
进一步地，所述步骤(1)中PCR反应液中每一种引物的终浓度均为100-400nm，每一种探针的终浓度均为100-400nm。
因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明的检测方法及试剂盒设置了阴性对照和阳性对照，能分别有效地避免因污染造成的假阳性结果和评价本次扩增试剂质量是否达标；外控反应液能准确反映待测模板质量，防止因模板量不足或抑制剂过强引起的假阴性结果，也能监测因模板量过高可能造成的假阳性，同时在突变检测反应液中均添加了内参引物探针，通过内参的扩增能有效避免假阴性出现，最终确保试剂盒检测结果准确无误。本发明CYP2C19基因突变的检测试剂盒及检测方法灵敏度高、特异性强，可以指导多种病症患者根据个体的基因组信息实现个体化用药。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
CYP2C19至少存在14种突变基因和18种等位基因突变，CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占东方人弱代谢表型(PM)的99％以上。CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因编码的酶无活性，CYP2C19*2等位基因变异的外显子5第681位处的碱基发生变异(G/A)形成了一个异常剪接点，使得转录时在外显子5的始端丢失了40个碱基对(643-682bp)，从而在翻译时丢失了215-227位氨基酸，使215位氨基酸开头的阅读框架发生移动，因此在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生1个终止密码，使蛋白合成过早被终止，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质丧失了催化活性。CYP2C19*3等位基因是在外显子4第636位发生G/A突变，产生了提前的终止密码，蛋白合成终止，使CYP2C19酶活性丧失。
1、引物及探针的设计合成
本发明提供了用于检测人CYP2C19基因突变的引物和探针，包括用于检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的引物和探针、用于检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的引物和探针。检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.1：tgctgtacagtggcctgttta
SEQ ID NO.2：gtcaacatagaatcaatactaca
SEQ ID NO.3：5`-FAM-tacagttaacacaaaaggtatact-MGB-3`
SEQ ID NO.4：ctaggttgtg ttgaatctattcgg
SEQ ID NO.5：atcgtcactgttatgtgtaatctca
SEQ ID NO.6：5`-FAM-taccaattctctgcttgagagtcctcg-BHQ1-3`
2、内参基因和外控基因的设计合成
本申请基于避免假阴性出现而设计内参基因，基于防止因模板量不足或抑制剂过强引起的假阴性结果而设计外控基因，内参特异性引物为SEQ ID NO:7-8，内参检测探针SEQ ID NO:9，外控特异性引物为SEQ ID NO:10-11，外控检测探针为SEQ ID NO:12。
SEQ ID NO.7：ggccccgtagcccaactcaa
SEQ ID NO.8：ggctaagtgcatcctggcacat
SEQ ID NO.9：5`-VIC-agccttaatacaccgcgtggataacg-BHQ1-3`
SEQ ID NO.10：ggccaagtcttgtgcatc
SEQ ID NO.11：agacaatttagtccgcggacgacg
SEQ ID NO.12：5`-FAM-taccaattctctgcttgagagtcctcg-BHQ1-3`
3、基于上述引物、探针的试剂盒的制备
(1)反应液1：
反应液1由PCR缓冲液、DNA聚合酶、SEQ ID NO.1-2所示引物、SEQ ID NO.3所示探针、SEQ ID NO:7-8所示内参引物、SEQ ID NO:9所示内参探针组成，各组份含量如表1：
表1
组份 含量
5×Buffer(TrispH8.0，KCl) 5μL
MgCl2(250mM) 0.25μ
dNTPMix(10mM) 2μL
引物、探针混合液 2.625μL
化学修饰热启动Taq酶(5U) 0.2μL
去离子水 12.925μL
引物SEQ ID NO.1(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：2(10μM)0.5μl，突变检测探针SEQ IDNO：3(10μM)0.5μl，内参引物SEQ ID NO：7(10μM)0.1875μl，SEQ ID NO：8(10μM)0.1875μl，内参探针SEQ ID NO：9(10μM)0.25μl。
(2)反应液2：
反应液2由PCR缓冲液、DNA聚合酶、SEQ ID NO.4-5所示引物、SEQ ID NO.6所示探针、SEQ ID NO:7-8所示内参引物、SEQ ID NO:9所示内参探针组成，各组份含量如表2：
表2
组份 含量
5×Buffer(TrispH8.0，KCl) 5μL
MgCl2(250mM) 0.25μ
dNTPMix(10mM) 2μL
引物、探针混合液(10μM) 2.625μL
化学修饰热启动Taq酶(5U) 0.2μL
去离子水 12.925μL
引物SEQ ID NO.4(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：5(10μM)0.5μl，突变检测探针SEQ IDNO：6(10μM)0.5μl，内参引物SEQ ID NO：7(10μM)0.1875μl，SEQ ID NO：8(10μM)0.1875μl，内参探针SEQ ID NO：9(10μM)0.25μl。
(3)反应液3：
反应液3由PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控特异性引物SEQ ID NO:10-11和外控检测探针SEQ ID NO:12组成，各组份含量如表3：
表3
组份 含量
5×Buffer(TrispH8.0，KCl) 5μL
MgCl2(250mM) 0.25μ
dNTPMix(10mM) 2μL
外控引物、探针混合液(10μM) 1.5μL
化学修饰热启动Taq酶(5U) 0.2μL
去离子水 14.05μL
外控引物SEQ ID NO：10(10μM)0.5μl，SEQ ID NO：11(10μM)0.5μl，外控检测探针SEQ ID NO：12(10μM)0.5μl。
(4)阳性对照
阳性质控品包括CYP2C19*2等位基因5号外显子和CYP2C19*3等位基因4号外显子突变质粒，本发明的突变质粒是将突变序列插入到PUC57载体上形成的，每一个突变类型都有一个对应的PUC57质粒。
(5)阴性对照
阴性质控品为18兆以上无核酸酶水。
4、样本检测
本实施例选取5个外周血液样本进行提取DNA，并对提取出的DNA进行检测相应位点的突变情况。
(1)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定
本实施例中待测样本为新鲜血液，新鲜血液(EDTA抗凝管必须在4小时以内离心取血浆，streck管必须在24小时以内离心取血浆)离心获取血浆，采用QIAamp CirculatingNucleicAcid Kit纯化血浆游离DNA。用nanodrop2000对提取的DNA进行浓度及纯度测定，260/280在1.7-2.1之间。本实施例中4例样本DNA浓度检测如下表：
表4
样本号 突变类型 浓度(ng/μl) 260/280
1 野生型 42.3 1.75
2 CYP2C19*2等位基因5号外显子变异 72.5 1.73
3 CYP2C19*3等位基因4号外显子变异 42.1 1.92
4 野生型 51.3 1.80
(2)将步骤(1)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成5ng/μl备用。
(3)分别向第一组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl已稀释备用的样本DNA作为模板；分别向第二组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl阳性质控品作为阳性对照；分别向第三组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl阴性质控品作为阴性对照；离心后上机扩增。
荧光检测通道选择FAM，VIC/HEX检测通道，其中突变和外控通道选择FAM通道，内参选择VIC通道。
PCR程序为：50℃30min，(95℃15s，60℃40s)×30cycles，60℃同时收集2种荧光信号。
(4)荧光PCR检测并进行结果分析
阴性质控品：FAM通道、VIC通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，Ct值≥37。
阳性质控品：FAM通道Ct值≤30，VIC通道Ct值＜34，扩增曲线有明显指数增长期。
外控反应液：FAM通道Ct值23≤Ct≤30，样本DNA加入量适中；FAM通道Ct值＞30，样本基因组DNA提取质量较差，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变，突变DNA含量较低的样本建议重新提取样本，增加基因组DNA加入量；FAM通道Ct值＜23，样本加入量过高，建议稀释后重新检测。
表5样本突变类型判定标准
Figure BDA0002270302280000091
本实施例中扩增结果显示，阴性质控品FAM、VIC通道均没有扩增曲线，阳性质控品FAM通道Ct值均小于24，VIC通道Ct值均小于34，外控反应液FAM通道Ct值均在23≤Ct≤30之间，因此，样本质控均合格，可根据突变类型判定标准对样本突变有无及突变类型进行判定。
本实施例中4例样本的检测结果如表6所示。同时将4例样本基因组DNA采用Sanger金标准进行测序检测，将两者的检测能力进行比较，两者检测结果一致，试剂盒准确度高，适用样本性广。
表64例外周血样本DNA荧光定量检测和sanger测序结果
Figure BDA0002270302280000101
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 爱尔生基因医学科技有限公司
<120> 检测人CYP2C19基因突变的引物、试剂盒及检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgctgtacag tggcctgttt a 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcaacatag aatcaatact aca 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacagttaac acaaaaggta tact 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaggttgtg ttgaatctat tcgg 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcgtcactg ttatgtgtaa tctca 25
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taccaattct ctgcttgaga gtcctcg 27
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggccccgtag cccaactcaa 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggctaagtgc atcctggcac at 22
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agccttaata caccgcgtgg ataacg 26
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggccaagtct tgtgcatc 18
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agacaattta gtccgcggac gacg 24
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
taccaattct ctgcttgaga gtcctcg 27

Claims (8)

1.一种用于检测人CYP2C19基因突变的引物和探针，其特征在于，包括用于检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的引物和探针、用于检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的引物和探针，所述检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的引物序列如SEQ IDNO.1-2所示，检测CYP2C19*2等位基因5号外显子突变的探针序列如SEQ ID NO.3所示；所述检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，检测CYP2C19*3等位基因4号外显子突变的探针序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种用于检测人CYP2C19基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测人CYP2C19基因突变的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测人CYP2C19基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因和外控基因。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测人CYP2C19基因突变的试剂盒，其特征在于，所述内参基因包括内参特异性引物SEQ ID NO:7-8和内参检测探针SEQ ID NO:9。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测人CYP2C19基因突变的试剂盒，其特征在于，所述外控基因包括外控特异性引物SEQ ID NO:10-11和外控检测探针SEQ ID NO:12。
6.一种基于权利要求2-5任一项所述试剂盒检测人CYP2C19基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；
(2)将已知浓度的DNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；
(3)配组三组反应液、阳性质控和阴性质控，每组反应液均由反应液1、反应液2和反应液3组成；所述反应液1的组成为：PCR缓冲液、DNA聚合酶、SEQ ID NO.1-2所示引物、SEQ IDNO.3所示探针、SEQ ID NO:7-8所示内参引物、SEQ ID NO:9所示内参探针；所述反应液2的组成为：PCR缓冲液、DNA聚合酶、SEQ ID NO.4-5所示引物、SEQ ID NO.6所示探针、SEQ IDNO:7-8所示内参引物、SEQ ID NO:9所示内参探针；所述反应液3的组成为：PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控特异性引物SEQ ID NO:10-11和外控检测探针SEQ ID NO:12；
(4)分别向第一组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl已稀释备用的样本DNA作为模板；分别向第二组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl阳性质控品作为阳性对照；分别向第三组反应液1、反应液2和反应液3中各加入2μl阴性质控品作为阴性对照；离心后上机扩增；
(5)荧光PCR检测并进行结果分析。
7.根据权利要求6所述的检测人CYP2C19基因突变的方法，其特征在于，所述阳性质控包括CYP2C19*2等位基因5号外显子和CYP2C19*3等位基因4号外显子突变质粒。
8.根据权利要求6所述的检测人CYP2C19基因突变的方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR反应液中每一种引物的终浓度均为100-400nm，每一种探针的终浓度均为100-400nm。
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