CN110387408A - 用于检测人cyp2c19基因分型的引物探针组合物、试剂、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于检测人cyp2c19基因分型的引物探针组合物、试剂、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物、试剂、试剂盒及检测方法，属于基因检测技术领域，本发明所揭示的引物探针组合物中第一引物探针预混液含有SEQ ID NO.1～4所示核苷酸序列的引物与探针，第二引物探针预混液含有SEQ ID NO.5～8所示核苷酸序列的引物与探针，第三引物探针预混液含有SEQ ID NO.9～12所示核苷酸序列的引物与探针。本发明所揭示的引物探针组合物通过荧光定量PCR扩增，能够有效地区分CYP2C19*2、CYP2C19*3与CYP2C19*17这三种基因分型，具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，并能够缩短检测时间并降低对CYP2C19基因分型检测的检测成本，从而能够为个体化用药提供准确的依据，提高了基因分型检测的准确性。

Description

用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物、试剂、试剂 盒及检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物、试剂、试剂盒及检测方法。
背景技术
CYP2C19是细胞色素P450(CytochromeP450,CYP)酶系的重要一员。P450同功酶也称药酶，是由一系列结构和功能相关的酶组成的酶家族，是体内药物代谢的主要酶系。研究发现CYP2C19可影响到氯吡格雷、奥美拉唑、地西泮、苯妥英钠等许多重要临床应用药物的代谢，而其基因多态性是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一。2010年美国FDA要求氯吡格雷药物标签上注明CYP2C19与疗效的关系，并建议使用前检测CYP2C19基因型。
编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1型。CYP2C19*2型、CYP2C19*3型和CYP2C19*17型是中国人群中较常见的等位基因型。其中CYP2C19*2型和CYP2C19*3型可引起CYP2C19基因编码的酶活性丧失，代谢底物的能力减弱，使血药浓度增高，从而引起与血药浓度相关的药物不良反应，CYP2C19*17型可引起CYP2C19基因编码的酶活性增强，代谢底物的能力增强。对于药物代谢慢的人群，长期按正常剂量服用，就会出现严重毒副作用：主要是肝损害、造血系统损害、中枢神经系统损害等，严重时可导致死亡。根据CYP2C19基因型改变而引起酶代谢活性的改变，可将人群根据酶的代谢能力分为4类：超强代谢型，强代谢型，中间代谢型和弱代谢型。由于病人普遍存在动脉粥样硬化，尤其是支架内血栓的风险，正在或考虑接受抗血小板治疗(如氯吡格雷)。因此检查CYP2C19基因SNP类型，将有助于选择合适的抗血小板治疗方案。
目前检测基因多态性的方法有直接测序法、荧光定量PCR法和基因芯片法。直接测序法耗时长、敏感性低，费用高，因此在适用用于医院等场所进行使用。基因芯片法的基因测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片法检测基因多态性不仅制备成本昂贵且所依赖的检测仪器的成本更加不菲，同时利用基因芯片测试CYP2C19基因分型时也需要耗时至少8小时，且容易存在容易出现假阳性的缺陷，即将阴性样本误判为阳性样本。
而荧光定量PCR法(qPCR)是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。因此，相对于上述直接测序法与基因芯片法对CYP2C19基因位点是否发生突变(即基因分型)进行基因测序的过程中，荧光定量PCR法对CYP2C19基因位点的多态性检测具有特异性强、检测成本低廉、灵敏度高、准确性强等诸多优点。
发明内容
本发明的目的在于揭示一种用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物、试剂、试剂盒及检测方法，用于实现对CYP2C19位点的基因分型CYP2C19*2，CYP2C19*3及CYP2C19*17实现快速检测，并降低检测成本与检测时间，从而为不同人群由于CYP2C19位点的基因分型所存在的差异性，从而为接受抗血小板治疗所使用的处方药物(例如氯吡格雷)的服用量提供准确依据，提高接受抗血小板治疗的治疗效果。
为实现上述第一发明目的，本发明提供了一种用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物，其特征在于，包括：
用于检测CYP2C19*2并由引物L-1F、引物L-1R、野生探针L-1W、突变探针L-1M所组成的第一引物探针预混液；
用于检测CYP2C19*3并由引物L-2F、引物L-2R、野生探针L-2W、突变探针L-2M所组成的第二引物探针预混液；
用于检测CYP2C19*17并由引物L-3F、引物L-3R、野生探针L-3W、突变探针L-3M所组成的第三引物探针预混液；
所述引物L-1F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
所述引物L-1R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
所述野生探针L-1W具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
所述突变探针L-1M具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
所述引物L-2F具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
所述引物L-2R具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
所述野生探针L-2W具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
所述突变探针L-2M具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；
所述引物L-3F具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列；
所述引物L-3R具有如SEQ ID NO.10所示核苷酸序列；
所述野生探针L-3W具有如SEQ ID NO.11所示核苷酸序列；
所述突变探针L-3M具有如SEQ ID NO.12所示核苷酸序列。
作为本发明的进一步改进，所述野生探针L-1W、突变探针L-1M、野生探针L-2W、突变探针L-2M、野生探针L-3W、突变探针L-3M的3’端标记有荧光淬灭基团，所述野生探针L-1W的5’端标记有荧光报告基团。
作为本发明的进一步改进，所述荧光淬灭基团选自DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种。
另一方面，本发明还提出了一种用于检测人CYP2C19基因分型的试剂，所述试剂包括如上述任一项发明创造所揭示的引物探针组合物。
另一方面，本发明还提出了一种用于检测人CYP2C19基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上述第二个发明所揭示的试剂。
作为本发明的进一步改进，所述试剂盒还包括：
内参试剂、Taq酶、扩增预混液、阴性质控样品及阳性质控样品；
所述阴性质控样品为TE缓冲液，阳性质控样品为杂合质粒和β-globin质粒的混合液，所述内参试剂包括：内参引物M-26F、内参引物M-26R、内参探针M-01D；
所述内参引物M-26F具有如SEQ ID NO.13所示核苷酸序列；
所述内参引物M-26R具有如SEQ ID NO.14所示核苷酸序列；
所述内参探针M-01D具有如SEQ ID NO.15所示核苷酸序列；
作为本发明的进一步改进，所述扩增预混液由PCR缓冲液、dNTPs和MgCl2组成，
所述MgCl2浓度为2.5～6mM，所述dNTPs浓度为0.1～0.8mM，所述Taq酶浓度为8～12U/μl。
作为本发明的进一步改进，所述杂合质粒由CYP2C19*2质粒、CYP2C19*3质粒及CYP2C19*17质粒组成；
所述CYP2C19*2质粒具SEQ ID NO.16所示核苷酸序列；
所述CYP2C19*3质粒具SEQ ID NO.17所示核苷酸序列；
所述CYP2C19*17质粒具SEQ ID NO.18所示核苷酸序列；
所述β-globin质粒具SEQ ID NO.19所示核苷酸序列。
最后，本发明还揭示了一种检测人CYP2C19基因分型的检测方法，应用如上述第一个发明所揭示的引物探针组合物或者如上述第二个发明所述的试剂或者如上述第三个发明所揭示的试剂盒。
作为本发明的进一步改进，以待测样本的DNA为模板，利用所述引物探针组合物进行实时荧光qPCR反应，根据检测到的荧光信号判定人CYP2C19的基因分型；
所述基因分型为CYP2C19*2、CYP2C19*3与CYP2C19*17。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
在本发明所揭示的引物探针组合物、基于该引物探针组合物的试剂、试剂盒及检测方法中，通过对CYP2C19基因的基因分型CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2C19*17进行荧光定量PCR扩增，并利用特异性荧光标记的探针对扩增产物进行检测，能有效区分CYP2C19基因的多态型别，具有稳定、快速和特异性高的特点，并相对于直接测序法和基因芯片法，能够缩短检测时间并降低对CYP2C19基因分型检测的检测成本。
附图说明
图1为CYP2C19*2基因检测位点野生样本的扩增曲线；
图2为CYP2C19*2基因检测位点突变样本的扩增曲线；
图3为CYP2C19*2基因检测位点杂合样本的扩增曲线；
图4为CYP2C19*3基因检测位点野生样本的扩增曲线；
图5为CYP2C19*3基因检测位点突变样本的扩增曲线；
图6为CYP2C19*3基因检测位点杂合样本的扩增曲线；
图7为CYP2C19*17基因检测位点野生样本的扩增曲线；
图8为CYP2C19*17基因检测位点突变样本的扩增曲线；
图9为CYP2C19*17基因检测位点杂合样本的扩增曲线；
图10为CYP2C19*2基因检测位点野生质粒在VIC信号通道中检测灵敏性的扩增曲线；
图11为CYP2C19*2基因检测位点突变型质粒在FAM信号通道中的检测灵敏性的扩增曲线；
图12为CYP2C19*3基因检测位点野生质粒在VIC信号通道中检测灵敏性的扩增曲线；
图13为CYP2C19*3基因检测位点突变型质粒在FAM信号通道中的检测灵敏性的扩增曲线；
图14为CYP2C19*17基因检测位点野生质粒在VIC信号通道中检测灵敏性的扩增曲线；
图15为CYP2C19*17基因检测位点突变型质粒在FAM信号通道中的检测灵敏性的扩增曲线；
图16为CYP2C19*2基因检测位点阳性质控品的扩增曲线；
图17为CYP2C19*3基因检测位点阳性质控品的扩增曲线；
图18为CYP2C19*17基因检测位点阳性质控品的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
在本申请中，术语“sec”是时间单位：秒；术语“min”是时间单位：分钟。
本申请所揭示的用于检测人CYP2C19基因位点由于人群基因突变所导致的基因分型的高效特异性检测，以确定基于CYP2C19参与代谢的药物(例如，质子泵抑制剂、抗癫痫药、抗抑郁药、噻吩吡啶类药物抗血小板等药物)在不同人群中的服用量，提高复用上述基于CYP2C19参与代谢的药物的用药安全性。
例如，通过本申请所揭示的试剂可用于检测血液DNA样本中的CYP2C19基因位点上所具有的CYP2C19*2，CYP2C19*3及CYP2C19*17位点的多态性检测。通过检测患者CYP2C19基因型，判断患者代谢速率类型，合理调整氯吡格雷的用药剂量，是提高采用抗血小板治疗相关疾病治愈率，减少毒副作用的有效途径。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
一种用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物，其包括：
用于检测CYP2C19*2并由引物L-1F、引物L-1R、野生探针L-1W、突变探针L-1M所组成的第一引物探针预混液；该第一引物探针预混液与内参试剂、Taq酶、扩增预混液、阴性质控样品及阳性质控样品实现对人CYP2C19基因位点上的所形成的第一种突变，即CYP2C19*2进行特异性检测。
用于检测CYP2C19*3并由引物L-2F、引物L-2R、野生探针L-2W、突变探针L-2M所组成的第二引物探针预混液；该第二引物探针预混液与内参试剂、Taq酶、扩增预混液、阴性质控样品及阳性质控样品实现对人CYP2C19基因位点上的所形成的第二种突变，即CYP2C19*3进行特异性检测。
用于检测CYP2C19*17并由引物L-3F、引物L-3R、野生探针L-3W、突变探针L-3M所组成的第三引物探针预混液；第三引物探针预混液与内参试剂、Taq酶、扩增预混液、阴性质控样品及阳性质控样品实现对人CYP2C19基因位点上的所形成的第二种突变，即CYP2C19*17进行特异性检测。
所述引物L-1F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
所述引物L-1R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
所述野生探针L-1W具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
所述突变探针L-1M具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。
所述引物L-2F具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
所述引物L-2R具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
所述野生探针L-2W具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
所述突变探针L-2M具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；
所述引物L-3F具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列；
所述引物L-3R具有如SEQ ID NO.10所示核苷酸序列；
所述野生探针L-3W具有如SEQ ID NO.11所示核苷酸序列；
所述突变探针L-3M具有如SEQ ID NO.12所示核苷酸序列。
所述野生探针L-1W、突变探针L-1M、野生探针L-2W、突变探针L-2M、野生探针L-3W、突变探针L-3M的3’端标记有荧光淬灭基团，所述野生探针L-1W的5’端标记有荧光报告基团。
进一步的，本实施例还揭示了一种用于检测人CYP2C19基因分型的试剂，该实际包括上文所述的引物探针组合物。同理所述，该试剂可被制成一种用于检测人CYP2C19基因分型的试剂盒，且试剂盒包括上述用于检测人CYP2C19基因分型的试剂。
试剂盒还包括：内参试剂、Taq酶、扩增预混液、阴性质控样品及阳性质控样品。阴性质控样品为TE缓冲液，阳性质控样品为杂合质粒和β-globin质粒的混合液，所述内参试剂包括：内参引物M-26F、内参引物M-26R、内参探针M-01D。所述内参引物M-26F具有如SEQID NO.13所示核苷酸序列；所述内参引物M-26R具有如SEQ ID NO.14所示核苷酸序列；所述内参探针M-01D具有如SEQ ID NO.15所示核苷酸序列。
荧光定量PCR(qPCR)技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。用荧光PCR检测人乳头瘤病毒，结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后续处理的问题，减少了污染，是用于CYP2C19基因位点上所具有的CYP2C19*2，CYP2C19*3及CYP2C19*17位点的多态性检测检测的理想手段。
荧光淬灭基团选自DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种。最优选的，上述野生探针L-1W、突变探针L-1M、野生探针L-2W、突变探针L-2M、野生探针L-3W、突变探针L-3M的3’端标记的荧光淬灭基团为MGB，5’端标记的荧光报告基团为VIC或者FAM，内参探针M-01D的5’端标记的荧光报告基团为CY5。
具体的，在本实施例中，检测CYP2C19*2基因分型的引物L-1F的序列5'-3'具体为：ATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGA；检测CYP2C19*2基因分型的引物L-1R的序列5'-3'具体为：CGATTCTTGGTGTTCTTTTACTTTCTC；检测CYP2C19*2基因分型的野生探针L-1W的序列5'-3'具体为：VIC-ATTTCCCGGGAACCCA-MGB；检测CYP2C19*2基因分型的突变探针L-1M的序列5'-3'具体为：FAM-ATTTCCCAGGAACCCA-MGB；内参引物M-26F的序列5'-3'具体为：CTGACACAACTGTGTTCACTAGCA；内参引物M-26R的序列5'-3'具体为：GCCTCACCACCAACTTCAT；内参探针M-01D的序列5'-3'具体为：CCACAGGGCAGTAACGGCAGACT。
同理所述，在本实施例中，检测CYP2C19*3基因分型的引物L-2F的序列5'-3'具体为：TGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGA；检测CYP2C19*3基因分型的引物L-2R的序列5'-3'具体为：AGTGGTTTCTCAGGAAGCAAAAA；检测CYP2C19*3基因分型的野生探针L-2W的序列5'-3'具体为：VIC-CACCCCCTGGATCCA-MGB；检测CYP2C19*3基因分型的突变探针L-2M的序列5'-3'具体为：FAM-CACCCCCTGAATCCA-MGB。
同理所示，在本实施例中，检测CYP2C19*17基因分型的引物L-3F的序列5'-3'具体为：GAAGCCTGTTTTATGAACAGGATGA；检测CYP2C19*17基因分型的引物L-3R的序列5'-3'具体为：ATTTGAGCTGAGGTCTTCTGATGCC；检测CYP2C19*17基因分型的野生探针L-3W的序列5'-3'具体为：VIC-CTCAAAGCATCTCTGA-MGB；检测CYP2C19*17基因分型的突变探针L-3M的序列5'-3'具体为：FAM-CTCAAAGTATCTCTGA-MGB。
在本实施例中，在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端(即3’端与5’端)分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。本实施例中所揭示的试剂(该试剂含有前文所述的用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物)或者试剂盒可应用于qPCR的平台上，通过设计一组特异性引物对CYP2C19基因的多态型别CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2C19*17进行定量PCR扩增，并利用特异性荧光标记的探针对扩增产物进行检测，能有效区分CYP2C19基因的多态型别，具有稳定、快速和特异性高的特点，且检测成本低廉等诸多优点。
试剂盒中所包含的内参引物M-26F具有如SEQ ID NO.13所示核苷酸序列；内参引物M-26R具有如SEQ ID NO.14所示核苷酸序列；内参探针M-01D具有如SEQ ID NO.15所示核苷酸序列。扩增预混液(APmix)由PCR缓冲液、dNTPs和MgCl2组成；具体的，MgCl2浓度为2.5～6mM，所述dNTPs浓度为0.1～0.8mM，所述Taq酶浓度为8～12U/μl。
所述杂合质粒由CYP2C19*2质粒、CYP2C19*3质粒及CYP2C19*17质粒组成。
CYP2C19*2质粒具SEQ ID NO.16所示核苷酸序列，该CYP2C19*2质粒为Z质粒，核苷酸序列如下所示：
AGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCATTTCCCAGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACT。
CYP2C19*3质粒具SEQ ID NO.17所示核苷酸序列，该CYP2C19*3质粒为Z质粒，核苷酸序列如下所示：
TCCTGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGGATCCACCCCCTGAATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACC。
CYP2C19*17质粒具SEQ ID NO.18所示核苷酸序列，该CYP2C19*17质粒为Z质粒，核苷酸序列如下所示：
AGTGGTTCTATTTAATGTGAAGCCTGTTTTATGAACAGGATGAATGTGGTATATATTCAGAATAACTAATGTTTGGAAGTTGTTTTGTTTTGCTAAAACAAAGTTTTAGCAAACGATTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGCATCTCTAAGGCCCTCAAAGTATCTCTGGATGTAAGAGATAATGCGCCACGATGGGCATCAGAAGACCTCAGCTCAAATCCCAGTTCTGCCAGCTATG。
β-globin质粒具SEQ ID NO.19所示核苷酸序列，核苷酸序列如下所示：
TATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGGTGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGACTTTTATGCCCAGCCC。
通过上文所揭示的用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物、试剂及试剂盒，本申请还揭示了一种检测人CYP2C19基因分型的检测方法。该检测方法应用上述引物探针组合物或者上述试剂或者上述试剂盒。以待测样本的DNA为模板，利用所述引物探针组合物进行实时荧光qPCR反应，根据检测到的荧光信号判定人CYP2C19的基因分型。具体的，该检测方法能够检测的在人CYP2C19基因位点上所的基因分型为CYP2C19*2、CYP2C19*3与CYP2C19*17。
本实施例中所揭示的引物、探针的序列设计如下表一所示
表一
接下来，申请人对本发明所揭示的试剂盒对人CYP2C19基因位点上的三种基因分型的检测过程作进一步的阐述。
首先，引物探针组合物的设计与合成，具体参上述表一所示。
然后，制备待测样本。
将5μL待测样本的基因组样本DNA分别加入已装有3种PCR反应液的反应孔中，待测样本的基因组DNA推荐浓度为10～20ng/μL。封上荧光定量PCR级别的封闭膜或盖上管盖，以2000rpm的转速，离心处理30sec，确保反应混合液全部离入管底。为了检验实验操作是否成功以及结果判断，在每次实验时，需设置阳性质控样品和阴性质控样品。
仪器：PCR扩增仪ABI7500、nanodrop2000、高速离心机、低速离心机、恒温干浴器、漩涡震荡仪、冰箱。
试剂盒的组成：本试剂盒包含L-APmix(扩增预混液)、L-PPmix1、L-PPmix2、L-PPmix3、L-Taq、L-PC1、L-PC2、L-PC3以及L-NC，以组成qPCR检测所依赖的PCR扩增体系组分，具体参表2所示。
表2
检测过程：
将5μl提取的样本DNA(所加入的DNA量≥10ng)小心加入至对应的PCR反应孔中，封上荧光定量PCR级别的封闭膜或盖上管盖，以2000转/分，离心30秒，以确保反应混合液全部离入管底。为了检验实验操作是否成功以及结果判断，在每次实验时，需设置PC和NC对照。
将PCR管或PCR 96孔板按顺序放入PCR仪，根据PCR仪设定表3中的反应程序，运行PCR反应程序，保存文件。
表3：PCR扩增反应程序
结果判定依据：
(1)PC在FAM信号通道、VIC信号通道和CY5信号通道下均有典型的扩增曲线，FAM信号通道、VIC信号通道的Ct值≤32；
(2)NC在FAM信号通道、VIC信号通道和CY5信号通道下均无典型的扩增曲线或无Ct值；
(3)所有样本检测中CY5信号通道有明显扩增曲线，Ct值＜36。
若同时满足上述三个要求，则表明此次实验成功，可以进行样品检测结果的分析，人CYP2C19的基因分型检测结果判断见表4。
表4：人CYP2C19基因检测试剂盒(荧光qPCR法)结果判断
从图1至图3所示，检测CYP2C19*2野生型样本，FAM信号通道中无Ct值，VIC信号通道中的Ct值≤36；检测CYP2C19*2突变型样本，VIC信号通道中无Ct值，FAM信号通道中的Ct值≤36；检测CYP2C19*2杂合型样本，FAM信号通道中的Ct值≤36，VIC信号通道中的Ct值≤36；
从图4至图6所示，检测CYP2C19*3野生型样本，FAM信号通道中无Ct值，VIC信号通道中的Ct值≤36；检测CYP2C19*3突变型样本，VIC信号通道中无Ct值，FAM信号通道中的Ct值≤36；检测CYP2C19*3杂合型样本，FAM信号通道中的Ct值≤36，VIC信号通道中的Ct值≤36；
从图7至图9所示，检测CYP2C19*17野生型样本，FAM信号通道中无Ct值，VIC信号通道中的Ct值≤36；检测CYP2C19*17突变型样本，VIC信号通道中无Ct值，FAM信号通道中的Ct值≤36；检测CYP2C19*17杂合型样本，FAM信号通道中的Ct值≤36，VIC信号通道中的Ct值≤36。
从图10至图15所示，所有检测质粒的Ct值均≤36，说明CYP2C19*2突变位点在VIC信号通道的检测限可以达到10000copies/μl，CYP2C19*2突变位点在FAM信号通道的检测限可以达到40000copies/μl；CYP2C19*3突变位点在VIC信号通道的检测限可以达到10000copies/μl；CYP2C19*3突变位点在FAM信号通道的检测限可以达到10000copies/μl；CYP2C19*17突变位点在VIC信号通道的检测限可以达到10000copies/μl；CYP2C19*17突变位点在FAM信号通道的检测限可以达到40000copies/μl。
从图16至图18所示，CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17的阳性质控品在FAM信号通道、VIC信号通道、CY5信号通道下均有典型的扩增曲线，且Ct值≤32，符合阳性质控品作为阳性对照组的判断标准，说明此次检测结果可信。
本实施例所揭示的TaqMan-MGB探针的原理如下所述。在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子MGB修饰基团，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记，可大大降低本底信号的强度，同时MGB基团可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计的更短，既降低了合成成本，大大增加了探针的稳定性，也使得探针设计的成功率大为提高。而且，TaqMan-MGB探针所具有的特异性检测效果较普通探针TaqMan高很多，因此利用Taqman-MGB法检测CYP2C19基因多态性可以精确辅助医生合理用药，减少不良反应和无效用药情况的发生，从而减少患者不必要的医疗支出。其中，基于该人CYP2C19基因分型检测所针对的病症即上文所述的基于CYP2C19参与代谢的药物，例如，质子泵抑制剂、抗癫痫药、抗抑郁药、噻吩吡啶类药物抗血小板等药物。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 无锡市申瑞生物制品有限公司
<120> 用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物、试剂、试剂盒及检测方法
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcaataat tttcccacta tcattga 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgattcttgg tgttctttta ctttctc 27
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atttcccggg aaccca 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atttcccagg aaccca 16
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtgatctgc tccattattt tccaga 26
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtggtttct caggaagcaa aaa 23
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccccctgg atcca 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccccctga atcca 15
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaagcctgtt ttatgaacag gatga 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atttgagctg aggtcttctg atgcc 25
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcaaagcat ctctga 16
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcaaagtat ctctga 16
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctgacacaac tgtgttcact agca 24
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcctcaccac caacttcat 19
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccacagggca gtaacggcag act 23
<210> 16
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcttggcat attgtatcta tacctttatt aaatgctttt aatttaataa attattgttt 60
tctcttagat atgcaataat tttcccacta tcattgatta tttcccggga accatttccc 120
aggaacccat aacaaattac ttaaaaacct tgcttttatg gaaagtgata ttttggagaa 180
agtaaaagaa caccaagaat cgatggacat caacaaccct cgggact 227
<210> 17
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcctgggctg tgctccctgc aatgtgatct gctccattat tttccagaaa cgtttcgatt 60
ataaagatca gcaatttctt aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc aggattgtaa 120
gcaccccctg gatccacccc ctgaatccag gtaaggccaa gttttttgct tcctgagaaa 180
ccacttacag tctttttttc tgggaaatcc aaaattctat attgacc 227
<210> 18
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agtggttcta tttaatgtga agcctgtttt atgaacagga tgaatgtggt atatattcag 60
aataactaat gtttggaagt tgttttgttt tgctaaaaca aagttttagc aaacgatttt 120
ttttttcaaa tttgtgtctt ctgttctcaa agcatctcta aggccctcaa agtatctctg 180
gatgtaagag ataatgcgcc acgatgggca tcagaagacc tcagctcaaa tcccagttct 240
gccagctatg 250
<210> 19
<211> 223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tattggtctc cttaaacctg tcttgtaacc ttgataccaa cctgcccagg gcctcaccac 60
caacttcatc cacgttcacc ttgccccaca gggcagtaac ggcagacttc tcctcaggag 120
tcaggtgcac catggtgtct gtttgaggtt gctagtgaac acagttgtgt cagaagcaaa 180
tgtaagcaat agatggctct gccctgactt ttatgcccag ccc 223

Claims (10)

1.一种用于检测人CYP2C19基因分型的引物探针组合物，其特征在于，包括：
用于检测CYP2C19*2并由引物L-1F、引物L-1R、野生探针L-1W、突变探针L-1M所组成的第一引物探针预混液；
用于检测CYP2C19*3并由引物L-2F、引物L-2R、野生探针L-2W、突变探针L-2M所组成的第二引物探针预混液；
用于检测CYP2C19*17并由引物L-3F、引物L-3R、野生探针L-3W、突变探针L-3M所组成的第三引物探针预混液；
所述引物L-1F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
所述引物L-1R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
所述野生探针L-1W具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
所述突变探针L-1M具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
所述引物L-2F具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
所述引物L-2R具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
所述野生探针L-2W具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
所述突变探针L-2M具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；
所述引物L-3F具有如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列；
所述引物L-3R具有如SEQ ID NO.10所示核苷酸序列；
所述野生探针L-3W具有如SEQ ID NO.11所示核苷酸序列；
所述突变探针L-3M具有如SEQ ID NO.12所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述野生探针L-1W、突变探针L-1M、野生探针L-2W、突变探针L-2M、野生探针L-3W、突变探针L-3M的3’端标记有荧光淬灭基团，所述野生探针L-1W的5’端标记有荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种。
4.一种用于检测人CYP2C19基因分型的试剂，其特征在于，所述试剂包括如权利要求1至3中任一项所述的引物探针组合物。
5.一种用于检测人CYP2C19基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求4所述的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
内参试剂、Taq酶、扩增预混液、阴性质控样品及阳性质控样品；
所述阴性质控样品为TE缓冲液，阳性质控样品为杂合质粒和β-globin质粒的混合液，所述内参试剂包括：内参引物M-26F、内参引物M-26R、内参探针M-01D；
所述内参引物M-26F具有如SEQ ID NO.13所示核苷酸序列；
所述内参引物M-26R具有如SEQ ID NO.14所示核苷酸序列；
所述内参探针M-01D具有如SEQ ID NO.15所示核苷酸序列；
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增预混液由PCR缓冲液、dNTPs和MgCl2组成，
所述MgCl2浓度为2.5～6mM，所述dNTPs浓度为0.1～0.8mM，所述Taq酶浓度为8～12U/μl。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述杂合质粒由CYP2C19*2质粒、CYP2C19*3质粒及CYP2C19*17质粒组成；
所述CYP2C19*2质粒具SEQ ID NO.16所示核苷酸序列；
所述CYP2C19*3质粒具SEQ ID NO.17所示核苷酸序列；
所述CYP2C19*17质粒具SEQ ID NO.18所示核苷酸序列；
所述β-globin质粒具SEQ ID NO.19所示核苷酸序列。
9.一种检测人CYP2C19基因分型的检测方法，其特征在于，应用权利要求1至3中任一项所述的引物探针组合物或者权利要求4所述的试剂或者权利要求5-8中任一项所述的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，以待测样本的DNA为模板，利用所述引物探针组合物进行实时荧光qPCR反应，根据检测到的荧光信号判定人CYP2C19的基因分型；
所述基因分型为CYP2C19*2、CYP2C19*3与CYP2C19*17。
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