CN104854121B - 用于核酸测序分析的标记的寡核苷酸探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于生成用于PCR反应中以检测靶核酸的标记的寡核苷酸探针的方法，所述标记的寡核苷酸探针含有荧光罗丹明衍生的染料。

Description

用于核酸测序分析的标记的寡核苷酸探针

发明领域

本发明涉及通过使用荧光标记的寡核苷酸用于检测和分析核酸序列的方法。本发明具有用于基因分型、病原体检测和体外诊断的应用。

发明背景

核酸扩增技术的开发已改革了遗传分析和工程科学。例如，聚合酶链反应（PCR）通常使用所选择的引物核酸用于扩增特异性靶核酸，例如以促进靶核酸的检测作为诊断、法医取证或其他应用的一部分。引物通常成对发挥作用，其设计为朝向彼此延伸以覆盖所选择的靶区域。典型PCR循环包括在此期间双链核酸的链彼此分开的高温（例如85℃或更高）变性步骤，在此期间引物与分开的单链杂交的低温（例如45-65℃）退火步骤，和在此期间核酸聚合酶延伸引物的中间温度（例如约72℃）延伸步骤。还利用双温热循环操作。这些一般包括高温变性步骤和底物退火-延伸步骤。

检测扩增产物的多种策略已得到开发，并且最广泛使用的方法之一是5'核酸酶或TaqMan®测定。5'核酸酶测定通常利用某些DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性，以在PCR过程期间切割5'核酸酶寡核苷酸探针。该测定允许扩增靶和释放检测标记物两者，一般无需求助于扩增产物的多个处理步骤。5'核酸酶探针通常包括标记部分，例如荧光报道染料和猝灭染料。当探针完整时，报道染料与猝灭染料的接近一般导致报道荧光的抑制。在5'核酸酶反应期间，探针的切割使报道染料和猝灭染料彼此分开，导致来自报道物的可检测的荧光增加。PCR产物或扩增子的累积通常通过实时监控这种荧光增加间接地进行检测。

TaqMan®技术也可以用于单步测定中的DNA扩增和基因组检测。在该形式中，使用两种寡核苷酸探针，每个等位基因各一种，其设计为与含有等位基因特异性核苷酸的DNA模板区域杂交。探针各自用不同的荧光染料进行标记。在PCR扩增步骤期间，与模板完全匹配的探针被消化，导致来自相应染料的荧光信号增加。然而，具有单个核苷酸错配的探针不能对模板DNA稳定退火，并且无法通过核酸酶活性降解。来自“错配”探针的相应报道染料仍被猝灭剂分子猝灭，并且未显示出荧光信号。由于更复杂的荧光检测仪器的可用性，可以通过采用多重探针在这类测定中执行多重基因或一种基因的多重等位基因位置的基因分型，所述多重探针各自用每种独特的荧光报道染料进行标记。

发明概述

本发明涉及用于生成用于PCR反应中以检测靶核酸的标记的寡核苷酸探针的方法，所述标记的寡核苷酸探针含有荧光罗丹明衍生的染料。在第一个方面，本发明涉及制备用作PCR反应中的杂交探针的标记的寡核苷酸的方法，其包括：

提供罗丹明衍生物荧光染料，其中所述荧光染料附着有双功能接头分子；经由双功能接头分子使反应基团与荧光染料结合，用于将所述荧光染料掺入寡核苷酸内；

将荧光染料掺入寡核苷酸的两个内部核苷酸之间，前提是荧光染料不掺入寡核苷酸的5'末端处。

在第二个方面，本发明涉及用于检测测试样品中的靶核酸或核酸的靶等位基因的存在或不存在的方法，其包括：

使用与靶核酸杂交的标记的探针寡核苷酸执行PCR反应，其中标记的探针寡核苷酸的特征在于具有：罗丹明衍生物荧光染料，所述罗丹明衍生物附着有双功能接头分子；以及与双功能接头分子结合的反应基团，用于将荧光染料掺入寡核苷酸的两个内部核苷酸之间，前提是荧光染料不掺入寡核苷酸的5'末端处；检测来自荧光染料的信号，其中所述信号的强度代表靶核酸的存在或不存在。

附图简述

图1显示（A）罗丹明染料核心和（B）L-苏氨醇的化学结构。

图2显示JA270（羧酸类似物）的化学结构。

图3显示5染料参考试剂（5染料混合物，2 µM混合物）中的UPLC柱中的寡核苷酸洗脱模式，所述5染料参考试剂在同一天的上午（顶部）和夜间（顶部）运行。

图4显示使用荧光检测的5染料参考试剂的UPLC分析，所述5染料参考试剂含有内部标记的JA270寡核苷酸。

图5显示如通过UPLC分析的，“主混合物（mastermix）”溶液中存在的寡核苷酸。

图6显示如通过UPLC分析的，在4℃下贮存3天后的相同“主混合物”溶液中存在的寡核苷酸。

图7显示使用R33探针（图7 a）和R34探针（图7 b）生成的PCR生长曲线，所述R33探针和R34探针已与阳性对照质粒模板（RR）或阴性对照质粒模板（CC）一起贮存0天、3周或6周。

发明详述

定义

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有由本发明所属领域技术人员通常理解的含义。下述参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（第2版1994）；The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker编辑1988）；TheGlossary of Genetics，第5版，R. Rieger等人（编辑），Springer Verlag（1991）；和Hale &Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology（1991）。如本文使用的，除非另有说明，否则下述术语具有归于其的含义。

术语“核酸”指核苷酸（例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等）的聚合物，并且包含脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、DNA-RNA杂交体、寡核苷酸、多核苷酸、适体、肽核酸（PNA）、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等，其包含以线性或分支方式共价连接在一起的核苷酸。核酸通常是单链或双链的，并且一般含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括可以具有替代主链的核酸类似物，包括例如磷酰胺（Beaucage等人（1993）Tetrahedron 49（10）:1925）；硫代磷酸酯（Mag等人（1991）Nucleic Acids Res. 19:1437；和美国专利号5,644,048），二硫代磷酸酯（Briu等人（1989）J. Am. Chem. Soc. 111:2321），O-甲基亚磷酰胺键（参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues: APractical Approach，Oxford University Press（1992）），以及肽核酸主链和键（参见Egholm（1992）J. Am. Chem. Soc. 114:1895）。其他类似物核酸包括具有带正电的主链（Denpcy等人（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非离子主链（美国专利号5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863）和非核糖主链的那些，包括在美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的那些。含有一种或多种碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内（参见Jenkins等人（1995）Chem. Soc. Rev.第169-176页），并且类似物也在例如Rawls，C & E News Jun. 2，1997第35页中描述。可以完成磷酸核糖主链的这些修饰，以促进另外部分例如标记物的添加，或改变此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。

除通常在核酸中发现的天然存在的杂环碱基（例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）之外，核苷酸类似物也可以包括非天然存在的杂环碱基，例如Seela等人（1999）Helv. Chim. Acta 82:1640中所述的那些。核苷酸类似物中使用的某些碱基充当解链温度（Tm）改性剂。例如，这些碱基中的一些包括7-脱氮嘌呤（例如7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等）、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN（例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等）等等。参见例如美国专利号5,990,303。其他代表性杂环碱基包括例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6氮杂胞苷；5-氟胞苷；5 -氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等等。

“核苷”指核酸组分，其包含与糖部分（核糖或脱氧核糖）、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等价物（例如碳环）共价连接的碱基或碱性基团（包含至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基等等）。例如，当核苷包含糖部分时，碱基通常连接至该糖部分的1'位置。如上所述，碱基可以是天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、双脱氧核糖核苷和碳环核苷。

“核苷酸”指核苷的酯，例如核苷的磷酸酯，具有与核苷的糖部分的5'位置共价连接的一个、两个、三个或更多个磷酸基。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。“寡核苷酸”是有时用于描述较短的多核苷酸的术语。寡核苷酸可以包含对应于指定的核苷酸序列区域的至少6个核苷酸，例如至少约10-12个核苷酸，或至少约15-30个核苷酸。

如本文使用的，术语“野生型”指当从天然存在的来源分离时，具有该基因或等位基因的特征的基因或等位基因。野生型基因或野生型等位基因是最常在群体中观察到的那种，并且任意指定为基因或等位基因的“正常”或“野生型”形式。

相比之下，术语“突变型”或“突变的”指当与野生型基因或等位基因相比较时，展示序列中的修饰的基因或等位基因。术语“突变”指通常保守的核酸序列的核苷酸序列中的变化，导致形成与正常（未改变的）或野生型序列不同的突变体形式。突变一般可以分成两个一般类别，即碱基对置换（例如单核苷酸置换）和移码突变。后者允许一个到几个核苷酸对的插入或缺失。

术语“等位基因”指相差仅一个或几个碱基的两个序列。

术语“互补的”或“互补性”在提及沃森-克里克碱基配对原则相关的多核苷酸的反向平行链中使用。术语“完全互补的”或“100%互补的”指具有在反向平行链之间的所有碱基的沃森-克里克配对的互补序列，即在多核苷酸双链体中的任何两个碱基之间不存在错配。然而，即使在不存在完全互补性的情况下，在反向平行链之间也形成双链体。术语“部分互补的”或“不完全互补的”指反向平行多核苷酸链之间小于100%完全的任何碱基比对（例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或未配对碱基）。部分互补链之间的双链体一般比完全互补链之间的双链体更不稳定。

术语“样品”指含有或推测含有核酸的任何组合物。这包括分离自个体的组织或流体样品，例如皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪、血细胞、器官和肿瘤，并且还包括由取自个体的细胞建立的体外培养物样品，包括福尔马林固定的石蜡包埋组织（FFPET）和由其分离的核酸。

术语“基本序列”指多核苷酸或寡核苷酸中的核苷酸序列。核苷酸修饰例如含氮碱基修饰、糖修饰或其他主链修饰不是基本序列的一部分。标记物例如与寡核苷酸缀合的生色团也不是基本序列的一部分。因此，两个寡核苷酸可以共享相同基本序列，但就修饰和标记物而言不同。

术语“引物”指这样的寡核苷酸，其与靶核酸中的序列杂交，并且能够在适合于此类合成的条件下充当沿核酸互补链的合成起始点。如本文使用的，术语“探针”指与靶核酸中的序列杂交且通常被可检测标记的寡核苷酸。探针可以具有修饰，例如使得探针无法通过核酸聚合酶延伸的3'末端修饰，以及一种或多种生色团。具有相同序列的寡核苷酸可以充当一个测定中的引物和不同测定中的探针。

如本文使用的，术语“双功能接头分子”指可以通过与两种或更多种另外化合物同时化学相互作用，将它们连接在一起的化合物。在本发明中，例如，双功能接头分子可以具有适合于偶联至标记物例如荧光染料的一个功能结构域，以及能够偶联至寡核苷酸的5'末端位置、3'末端位置或内部位置的另一个功能结构域或其他功能结构域。在本发明中，双功能接头分子可以例如包含L-苏糖醇。能够将标记连接到寡核苷酸的内部位置内的多种双功能接头分子已在美国专利号5,585,481、美国专利号6,130,323和Nelson等人，Nucl. Acid.Res. 20: 6253-6259，1992中描述。

如本文使用的，术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶”指待扩增、检测或两者的核酸序列的一部分。

术语“杂交的”和“杂交”指两个核酸之间的碱基配对相互作用，其导致双链体形成。它不要求两个核酸在其全长上具有100%互补性，以实现杂交。

术语“选择性杂交”和“特异性杂交”指核酸占优势地（杂交分子的50%或更多）或几乎唯一地（杂交分子的90%或更多）与复杂混合物中存在的特定核酸杂交，在所述复杂混合物中还存在其他核酸。例如，在典型PCR条件下，引物与靶核酸特异性杂交，以排斥溶液中也存在的非靶核酸。特异性杂交的引物驱动靶核酸的扩增，以产生靶核酸的扩增产物，其至少是最占优势的扩增产物，并且优选是几乎唯一的（例如代表样品中所有扩增产物的90%或更多）扩增产物。优选地，非特异性扩增产物以如此少量存在，使得它是无法检测的，或以如此少量检测到，以便可容易地区别于特异性扩增产物。类似地，探针与靶核酸特异性杂交，以排斥反应混合物中也存在的非靶核酸。特异性杂交的探针允许靶核酸的特异性检测，以生成可检测信号，其至少是最占优势的信号，并且优选是几乎唯一的（例如代表样品中所有扩增产物的90%或更多）信号。

等位基因特异性探针

等位基因特异性杂交依赖于下述：通过使对于变体序列之一特异性的寡核苷酸与得自扩增核酸样品的扩增产物杂交，区别相差至少一个碱基的两个DNA分子。等位基因特异性测定还可以包含两个等位基因特异性寡核苷酸，例如用于第一变体的等位基因特异性探针和针对第二变体的等位基因特异性探针，其中相对于另一种，探针与一种变体区别地杂交。等位基因特异性杂交通常采用短寡核苷酸，例如长度15-35个核苷酸。设计此类探针的原则和指导是本领域可获得的。杂交条件应足够严格，使得在等位基因之间的杂交强度中存在显著差异，并且优选基本上是二元应答，由此探针与等位基因中的仅一个杂交。一些探针设计为与靶DNA区段杂交，使得目的位点与探针的中心位置比对，但该设计并不需要。

等位基因的量和/或存在通过测量与样品杂交的等位基因特异性探针的量进行测定。通常，寡核苷酸用标记物例如荧光标记进行标记。例如，在导致与等位基因优先杂交的杂交条件下，对于靶核酸的等位基因特异性的等位基因特异性探针与得自生物样品的核酸杂交。测量荧光强度以测定特异性寡核苷酸是否已杂交。

在单个核苷酸多态性位点处存在的核苷酸通过在足够严格的杂交条件下与寡核苷酸杂交进行鉴定，所述寡核苷酸在涵盖多态性位点的区域中与等位基因基本上互补，并且在该位点处与靶等位基因确切互补。在此类足够严格的杂交条件下，稳定双链体仅在探针和靶等位基因之间形成。这些探针寡核苷酸可以为长度约10 - 约35个核苷酸，优选长度约15 - 约35个核苷酸。

基本上而不是确切的互补寡核苷酸的使用在测定形式中可能是期望的，在所述测定形式中杂交条件的最佳化是有限的。例如，在多靶固定探针测定形式中，将每种靶的探针固定到单个固体支持物上。通过使固体支持物与含有靶DNA的溶液接触同时进行杂交。因为所有杂交均在相同条件下进行，所以杂交条件不能对于每种探针分开最佳化。当测定形式妨碍调整杂交条件时，将错配掺入探针内可以用于调整双链体稳定性。特定引入的错配对双链体稳定性的作用是众所周知的，并且双链体稳定性可以照常规进行评估和凭经验进行测定，如上所述。取决于探针的确切大小和序列的合适杂交条件可以使用本文提供的指导经验性地选择并且是本领域众所周知的。寡核苷酸探针检测序列中的单个碱基对差异的用途在例如Conner等人，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282，以及美国专利号5,468,613和5,604,099中描述。

完全匹配和单碱基错配的杂交双链体之间的稳定性中的变化比例取决于杂交寡核苷酸的长度。由较短的探针序列形成的双链体由于错配的存在按比例地更失稳。在实践中，长度约15 - 约35个核苷酸的寡核苷酸对于序列特异性检测是优选的。此外，因为杂交寡核苷酸的末端由于热能而经历连续的随机解离和再退火，所以在任一末端处的错配使杂交双链体失稳小于内部发生的错配。优选地，为了区别靶序列中的单碱基对变化，选择与靶序列杂交的探针序列，使得突变位点在探针的内部区域中出现。

5′-核酸酶测定

靶核酸的检测可以使用“TaqMan®”或“5′-核酸酶测定”来执行，如美国专利号5,210,015；5,487,972；和5,804,375；以及Holland等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:7276-7280中所述。在TaqMan®测定中，在扩增区内杂交的标记的检测探针在扩增反应期间存在。这样修饰探针，以便阻止探针充当DNA合成的引物。使用具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶执行扩增。在扩增的每个合成步骤期间，与待延伸的引物下游的靶核酸杂交的任何探针被DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性降解。因此，新靶链的合成也导致探针降解，并且降解产物的累积提供了靶序列合成的量度。

任何适合于检测降解产物的方法均可用于5'核酸酶测定中。通常，检测探针用两种荧光染料进行标记，所述荧光染料之一能够猝灭另一染料的荧光。染料附着至探针，通常报道或检测染料附着至5'末端，并且猝灭染料附着至内部位点，使得当探针处于非杂交状态时猝灭发生，并且使得通过DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性的探针切割在两种染料之间发生。扩增导致探针在染料之间的切割，伴随猝灭的消除和可由初始猝灭的染料观察到的荧光增加。降解产物的累积通过测量反应荧光中的增加进行监控。美国专利号5,491,063和5,571,673描述了用于检测探针降解的替代方法，所述探针降解伴随扩增而发生。

用于检测靶核酸的5'核酸酶测定可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶。因此，在一些实施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是热稳定和热活性的核酸聚合酶。此类热稳定的聚合酶包括但不限于来自真细菌栖热菌属（Thermus）、热袍菌属（Thermatoga）和栖热腔菌属（Thermosipho）的多个物种的天然和重组形式的聚合酶，以及其嵌合形式。例如，可以用于本发明方法中的栖热菌属物种聚合酶包括水生栖热菌（Thermus aquaticus）（Taq）DNA聚合酶、嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）（Tth）DNA聚合酶、栖热菌属物种Z05（Z05）DNA聚合酶、栖热菌属物种sps17（sps17）和栖热菌属物种Z05（例如美国专利号5,405,774；5,352,600；5,079,352；4,889,818；5,466,591；5,618,711；5,674,738和5,795,762中描述的）。可以用于本发明的方法中的热袍菌属聚合酶包括例如海栖热袍菌（Thermatoga maritima）DNA聚合酶和新阿波罗栖热袍菌（Thermatoga neapolitana）DNA聚合酶，而可以使用的栖热腔菌聚合酶的例子是非洲栖热腔菌（Thermosipho africanus）DNA聚合酶。海栖热袍菌和非洲栖热腔菌DNA聚合酶的序列公开于国际申请栖热腔菌中。新阿波罗栖热袍菌的序列可以在国际申请WO 97/09451中发现。

在5'核酸酶测定中，扩增检测通常与扩增同时（即，“实时”）。在一些实施方案中，扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在一些实施方案中，扩增检测是定性的（例如，靶核酸的存在或不存在的终点检测）。在一些实施方案中，扩增检测在扩增之后。在一些实施方案中，扩增检测是定量的，并且扩增检测在扩增之后。

探针可以用任何数目的标记物进行标记，但通常为荧光标记物。在一些实施方案中，荧光团部分选自荧光素家族染料、聚卤素荧光素（polyhalofluorescein）家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花青素家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯合的镧系元素家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料和BODIPY®家族染料。

测定通常包含由荧光标记物和猝灭剂部分标记的探针。在一些实施方案中，猝灭剂部分选自荧光素家族染料、聚卤素荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花青素家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯合的镧系元素家族染料、BODIPY®家族染料、偶氮家族染料；三苯甲烷家族染料、低荧光猝灭剂部分（即“低暗供体（dim donors）”）和非荧光猝灭剂部分（例如所谓的“黑暗猝灭剂”，包括Black Hole Quenchers™（BHQ））。

罗丹明衍生的染料

罗丹明是含有如图1A中所示的核心结构的荧光染料。几种罗丹明衍生物，例如羧基四甲基罗丹明（TAMRA）和磺酰罗丹明101酰基氯（德克萨斯红）也是荧光染料，通常用于成像目的。其荧光发射最大值在600 nm范围内的新型罗丹明衍生物已公开于美国专利号6,184,379,（‘379）。这些衍生物具有可以由下式表示的结构：

其中Ca、Cb、Cc和Cd各自指示C原子，Ca和Cb通过单键或双键连接在一起，并且Cc和Cd通过单键或双键连接在一起；X1、X2、X3、X4、X7和X10是氢，并且X5、X6、X8、X9、X10、X11和X12是甲基；

R1和R2是相同的或不同的，并且选自氢和具有1-20个C原子的烷基，其中烷基残基任选由至少一个羟基、卤素、磺酸、氨基、羧基或烷氧基羰基取代，并且至少R1含有可活化基团；A1、A2、A3、B1是氯或氟，并且B2是氯、氟或氢。两种特定化合物JA270和JF9也在‘379专利中描述，其中JA270的羧酸类似物（图2）显示作为荧光团是特别合适的，所述荧光团可以用于荧光共振能量转移系统（FRET）中。

特别优选的JA270用途将是作为TaqMan®测定中附着至寡核苷酸探针的荧光团，其可以通过同样附着至该探针的适当猝灭剂分子猝灭。此外，为了使JA270作为荧光标记物的效用达到最大，期望将双功能接头附着至JA270，所述双功能接头允许将标记物放置在探针寡核苷酸序列内的任何地方。合适的双功能接头将是L-苏糖醇或（2R,3R）-2-氨基-1,3-丁二醇（图1B），其可以与JA270形成酰胺键，并且可以在两个羧基部分处附着有用于寡核苷酸合成的标准反应基团例如亚磷酰胺，以及阻断基团例如4,4’二甲氧基三苯甲基（DMT）。如本发明中所述，JA270染料置于探针寡核苷酸的内部位点中显示出乎意料的探针稳定性和功能的改善。

载脂蛋白E（apoE）基因中的多态性

ApoE是多个组蛋白种类的主要组分，并且在血浆胆固醇水平的控制中起关键作用。编码apoE的基因以异质形式存在，其中一些已知区别地影响转录活性，或者编码结构和功能上不同的蛋白质同种型。apoE的三个主要同种型，命名为apoE2、apoE3和apoE4，对于低密度脂蛋白（LDL）受体具有不同的结合亲和力，并且与不同水平的血浆脂质和脂蛋白结合。三个主要同种型的特征在于在apoE多肽链的位置112处，对于apoE2和apoE3形式存在胱氨酸（Cys），以及对于apoE4形式存在精氨酸（Arg），并且在位置158处，对于apoE2形式存在Cys，以及对于apoE3和apoE4形式存在Arg。氨基酸112和158的可变性基于apoE基因的核苷酸位置334和472处分别存在的单核苷酸多态性（SNP）。在任一位置处，Cys由密码子TGC决定，并且Arg由密码子CGC决定。这些等位基因在本文中被称为334T/C和472 T/C等位基因。组合334T/472T、334T/472C和334C/472C分别形成已知的同种型特异性apoE等位基因ε2、ε3和ε4。

对apoE基因分型的兴趣很高是由于其公认为提供有价值信息，以鉴定处于心血管和神经系统疾病危险中的个体。特别地，发现apoE等位基因ε4的存在与外周和冠状动脉疾病以及神经变性病症的发病机制相关，所述神经变性病症包括散发和迟发家族型阿尔茨海默氏病。常用于基因分型的方法包括PCR限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析，以及PCR随后为测序或质谱法，但两者均是耗时和低流通量方法。通过使用等位基因特异性引物或等位基因特异性探针的实时PCR的基因分型也已得到描述（Calero等人，J. Neurosci Methods. 2009，183（2）:238-40；Koch等人，Clin. Chem. Lab Med. 2002，40:1123-1131），并且已显示为快速和有效的替代方案。因此存在开发用于实时PCR测定例如TaqMan®技术中的试剂的需要，所述实时PCR测定可以快速和准确地将apoE等位基因进行基因分型。

提供下述实施例和附图以帮助理解本发明，所述本发明的真实范围在所附权利要求中阐述。应当理解可以在所述操作中作出修饰，而不背离本发明的精神。

实施例

实施例1 用于校准的JA270标记的对照寡核苷酸的分析

产生待用于荧光检测校准的参考试剂溶液，并且含有以2μM浓度的五种10聚体脱氧胸苷（dT）寡核苷酸，全部使用五种不同的荧光染料在5'末端核苷酸处进行标记。五种荧光染料是FAM、HEX、JA270、香豆素-343和Cy5.5。通过具有光电二极管阵列（PDA）的WatersAcquity UPLC System和荧光检测，来分析该参考溶液的纯度和稳定性。层析在AcquityOST C8 1.7μm粒子柱上执行。移动相由作为缓冲液A的0.1M乙酸己基铵（HAA）pH 7.0和作为缓冲液B的100%乙腈组成，并且寡核苷酸首先跨越30-60%缓冲液B的梯度分离0.6分钟，随后为60-95%缓冲液B 1.4分钟，流速为1mL/分钟。在同一天的上午（顶部）和夜间（顶部）执行的实验的寡核苷酸洗脱模式显示于图3中。有趣的是，JA270峰在夜间运行中大小降低很多，提示该特定寡核苷酸可能的稳定性问题。怀疑由于JA270染料的大小和疏水性，该特定寡核苷酸将从溶液中析出。为了减少JA270标记的寡核苷酸的疏水性，决定合成JA270标记的10聚体dT，其中将JA270置于内部位置而不是5'末端处。通过将L-苏糖醇接头附着至染料的羧酸部分，并且添加反应性亚磷酰胺基团，JA270染料的内部放置成为可能，所述反应性亚磷酰胺基团允许与寡核苷酸内的内部磷酸盐的连接。再次执行UPLC分析，并且结果显示于图4中所示的表和条形图上。通过将JA270染料置于寡核苷酸的内部位点，即使在贮存一个月后，JA270标记的10聚体dT的稳定性也可以得到维持。

实施例2 JA270标记的探针用于apoE基因分型的分析

使用TaqMan®技术和等位基因特异性TaqMan®探针寡核苷酸，开发用于将apoE基因的ε2、ε3和ε4等位基因进行基因分型的测定，制备“主混合物”寡核苷酸溶液且含有下述探针：

选择性用于334T等位基因的5'末端FAM标记的22聚体探针

选择性用于334C等位基因的5'末端HEX标记的22聚体探针

选择性用于472C等位基因的5'末端JA270标记的22聚体探针

选择性用于472T等位基因的5'末端Cy5.5标记的22聚体探针。

通过使用Acquity OST C18 1.7µm粒子柱的UPLC，就正确组成和稳定性分析“主混合物”溶液。移动相由作为缓冲液A的0.1M三乙基乙酸铵（TEAA）pH 7.0和作为缓冲液B的100%乙腈组成，并且寡核苷酸跨越5-60%缓冲液B的梯度分离3分钟，流速为1 mL/分钟。“新鲜”溶液在第0天时的洗脱概况显示于图5中，其中可以观察到所有四种探针和两种PCR引物的寡核苷酸峰。然而，如图6中可见的，当该溶液在4℃下贮存三天后进行分析时，JA270标记的寡核苷酸的峰已消失。类似于被认为是在实施例1中在5'末端处标记的JA270标记的参考dT寡核苷酸的不稳定性原因，JA-270标记的apoE探针的不稳定性也被认为是由于寡核苷酸的聚集及其从溶液中析出。

为了解决不稳定性问题，JA270标记的探针的长度首先从22聚体寡核苷酸增加到25聚体寡核苷酸。25聚体探针的一个形式仍将JA270置于5'末端处（指名为探针R33），而在另一个形式中，JA270染料目前内部置于核苷酸12和13之间（指名为探针R34）。通过将L-苏糖醇接头附着至JA270上的羧酸部分，染料的内部放置成为可能。随后在下表1和2中列出的缓冲液和条件下，使用两种探针R33和R44执行实时PCR测定。携带472C等位基因的阳性对照质粒模板和携带472T等位基因的阴性对照质粒模板，用于比较R33和R34探针生成等位基因特异性PCR生长曲线的性能。如图7中所示，其中JA270染料内部放置的R34探针显示良好的稳定性，其中在使用贮存三周或六周的探针的生长曲线中没有明显变化。相比之下，在由已贮存三周或六周的探针生成的生长曲线中，在5'末端处标记的R33探针展示荧光信号中的巨大跌幅。该结果明确显示将JA270染料置于探针寡核苷酸内的内部位点极大增加探针的稳定性和性能。

Claims (8)

1.一种制备用作PCR反应中的杂交探针的标记的寡核苷酸的方法，其包括：

（a）提供罗丹明衍生物荧光染料，其中所述荧光染料附着有双功能接头分子；

（b）经由双功能接头分子使反应基团与荧光染料键合，用于将所述荧光染料掺入寡核苷酸内；

（c）将所述荧光染料掺入所述寡核苷酸的两个内部核苷酸之间，前提是所述荧光染料不掺入所述寡核苷酸的5'末端处，

其中所述双功能接头分子是L-苏糖醇或（2R,3R）-2-氨基-1,3-丁二醇，

其中所述荧光染料是具有通式的化合物：

其中Ca、Cb、Cc和Cd各自指示C原子，Ca和Cb通过单键或双键连接在一起，并且Cc和Cd通过单键或双键连接在一起；

X1、X2、X3、X4、X7和X10是氢，并且X5、X6、X8、X9、X11和X12是甲基；

R1和R2是相同的或不同的，并且选自氢和具有1-20个C原子的烷基，其中烷基残基任选由至少一个羟基、卤素、磺酸、氨基、羧基或烷氧基羰基基团取代，并且至少R1含有可活化基团；

A1、A2、A3、B1是氯或氟，并且B2是氯、氟或氢。

2.权利要求1的方法，其中所述荧光染料是：

。

3.权利要求1的方法，其中所述标记的寡核苷酸进一步包含在所述标记的寡核苷酸的5'末端处附着的猝灭剂分子。

4.一种用于检测测试样品中的靶核酸或核酸的靶等位基因的存在或不存在的方法，其包括：

使用与靶核酸杂交的标记的探针寡核苷酸执行PCR反应，其中所述标记的探针寡核苷酸的特征在于具有：

罗丹明衍生物荧光染料，所述罗丹明衍生物附着有双功能接头分子；和

与所述双功能接头分子键合的反应基团，用于将所述荧光染料掺入所述寡核苷酸的两个内部核苷酸之间，前提是所述荧光染料不掺入所述寡核苷酸的5'末端处，其中所述双功能接头分子是L-苏糖醇或（2R,3R）-2-氨基-1,3-丁二醇；

检测来自所述荧光染料的信号，其中所述信号的强度代表所述靶核酸的存在或不存在；

其中所述荧光染料是具有通式的化合物：

其中Ca、Cb、Cc和Cd各自指示C原子，Ca和Cb通过单键或双键连接在一起，并且Cc和Cd通过单键或双键连接在一起；

X1、X2、X3、X4、X7和X10是氢，并且X5、X6、X8、X9、X11和X12是甲基；

R1和R2是相同的或不同的，并且选自氢和具有1-20个C原子的烷基，其中烷基残基任选由至少一个羟基、卤素、磺酸、氨基、羧基或烷氧基羰基基团取代，并且至少R1含有可活化基团；

A1、A2、A3、B1是氯或氟，并且B2是氯、氟或氢。

5.权利要求4的方法，其中所述荧光染料是：

。

6.权利要求4的方法，其中所述标记的寡核苷酸进一步包含在所述标记的寡核苷酸的5'末端处附着的猝灭剂分子。

7.权利要求4的方法，其中所述靶核酸是载脂蛋白E基因。

8.权利要求4的方法，其中核酸的靶等位基因是载脂蛋白E基因的334T/C等位基因或472 T/C等位基因。