CN101285094A - 引物、成套引物、使用其的核酸扩增方法和变异检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及引物、成套引物、使用其的核酸扩增方法和变异检测方法。提供可有效地检测核酸的双螺旋结构的引物。该引物是包含至少一个右述式(16)所示结构的标记核酸。B为具有核酸碱基骨架的原子团;E为具有脱氧核糖骨架、核糖骨架或者由这些的任意一个衍生的结构的原子团,或具有肽结构或者肽类似物结构的原子团;Z11和Z12分别为显示荧光性的原子团,可以相同也可以不同。
Description
技术领域
本发明涉及用于扩增目的核酸序列的成套引物、使用其的核酸扩增方法和变异检测方法。
背景技术
疾病的基因诊断、基因的表达解析等中,需要检测具有某些特定序列的目的核酸,该检测中广泛利用荧光。具体而言,已知使用荧光物质的方法,其中所述荧光物质的荧光强度随着目的核酸序列的增加而增大。作为前述的荧光物质代表性的例如为嵌入双螺旋结构、通过激发光照射而发出荧光的物质。若使用用这样的荧光物质进行标记的引物进行目的核酸序列的扩增,例如通过前述引物与模板DNA的目的核酸序列杂交形成双链体,前述荧光物质发出荧光。因此,若测定前述引物的荧光物质的荧光强度,则可以检测例如有无扩增和扩增量、目的核酸序列中的检测目标有无变异等。
但是,现有的荧光物质有时即使在例如不形成双螺旋结构的情况下也发出荧光。另外,在仅消除标记有荧光物质的探针和引物的荧光的目的下,利用FRET的方法是有效的(非专利文献1~4等),但是存在例如导入2种荧光染料导致的成本等的问题。
另外,作为与DNA或RNA相互作用而荧光强度增大的荧光染料,已知作为花青染料的一种的噻唑橙。有过尝试使噻唑橙以共价键结合到DNA上来制备荧光探针的例子,但是通过与含有嘌呤碱基的单链体DNA的相互作用也发出强的荧光(非专利文献5),形成双螺旋时的荧光强度的增加变小,可以说是不成功的(非专利文献6和7)。
进一步,近年来发明人等报道了划时代的方法,该方法通过仅在等温条件下进行目的核酸序列的核酸扩增,就可以简便且迅速地进行基因变异的检测(非专利文献8~10、专利文献1~2)。在该方法中也使用前述这样的荧光物质,但期待可更有效地进行检测的荧光物质。
非专利文献1:Tyagi,S.,Kramer,F.R.(1996)Nat.Biotechnol.14,303-308。
非专利文献2:Nazarenko,I.A.,B hatnagar,S.K.,Hohman,R.J.(1997)Nucleic Acids Res.25,2516-2521。
非专利文献3:Gelmini,S.,Orlando,C.,Sestini,R.,Vona,G.,Pinzani,P.,Ruocco,L.,Pazzagli,M.(1997)Clin.Chem.43,752-758。
非专利文献4:Whitcombe,D.,Theaker,J.,Guy,S.P.,Brown,T.,Little,S.(1999)Nat.Biotechnol.17,804-807。
非专利文献5:Biopolymers 1998,46,39-51。
非专利文献6:Analytica Chimica Acta 2002,470,57-70。
非专利文献7:Chemistry-A European Journal 2006,12,2270-2281。
非专利文献8:Mitani Y.,Lezhava A.,Kawai Y.,Kikuchi T.,Oguchi-Katayama A.,Kogo Y.,Itoh M.,Miyagi T.et al.2007.“Rapid SNP diagnostics using asymmetric isothermalamplification and a new mismatch-suppression technology.”Nat.Methods 4(3):257-262。
专利文献1:日本特许第3897926号公报
专利文献2:日本特许第3942627号公报
发明内容
因此,本发明的目的在于提供引物和成套引物、以及使用其的核酸扩增方法和变异检测方法,其中,所述引物和成套引物用于在例如目的核酸的扩增中使用,可有效地检测核酸的双螺旋结构。
用干解决问题的方法
为了解决前述问题,本发明的引物,其特征在于,其为用于扩增目的核酸序列的引物,该引物是包含至少一个下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示结构的标记核酸。
式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中,
B为具有天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸碱基骨架的原子团,
E为(i)具有脱氧核糖骨架、核糖骨架、或者由这些的任意一个衍生的结构的原子团,或
(ii)具有肽结构或者肽类似物结构的原子团,
Z11和Z12分别为显示荧光性的原子团,可以相同也可以不同,
L1、L2和L3分别为linker(桥原子或原子团),主链长(主链原子数)为任意,主链中可以分别含有或不含有C、N、O、S、P和Si,主链中可以分别含有或不含有单键、双键、三键、酰氨键、酯键、二硫键、亚氨基、醚键、硫醚键和硫酯键,L1、L2和L3相互间可以相同也可以不同、
D为CR、N、P、P=O、B或者SiR,R为氢原子、烷基或任意的取代基,
b为单键、双键或者三键,
或者,前述式(16)和(16b)中,可以是L1和L2为前述linker,L3、D和b不存在,L1和L2直接与B结合,
其中,
式(16)、(17)和(18)中,E为前述(i)的原子团,磷酸桥中的至少一个O原子可以用S原子取代,
式(16b)、(17b)和(18b)中,E为前述(ii)的原子团,
式(17)和(17b)中,各B可以相同也可以不同,各E可以相同也可以不同。
本发明的成套引物,其特征在于,其为用于扩增目的核酸序列的成套引物,包含一对引物,前述一对引物的至少一个引物为本发明的引物。
本发明的核酸扩增用试剂盒,其特征在于,其为扩增目的核酸序列的核酸扩增方法中所使用的核酸扩增用试剂盒,包含本发明的引物或成套引物
另外,本发明的变异检测用试剂盒,其特征在于,其为检测目的核酸序列中有无变异的变异检测方法中所使用的变异检测用试剂盒,包含本发明的核酸扩增用试剂盒。
本发明的核酸扩增方法,其特征在于,其为扩增核酸试样中的目的核酸序列的方法,包含下述(A)工序、下述(B)或(B’)工序:
(A)准备前述核酸试样的工序,
(B)使用本发明的引物或成套引物扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序,
(B’)包含下述(B1’)工序和(B2’)工序的工序,
(B1’)使用引物或包含一对引物的成套引物扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序,
(B2’)前述(B1’)工序中扩增的单链体核酸序列,与探针进行杂交的工序,其中,该探针由包含至少一个前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示结构的的标记核酸形成。
本发明的变异检测方法,其特征在于,其为核检测酸试样中的目的核酸序列中有无变异的方法,包含下述(a)~(c)工序:
(a)通过本发明的核酸扩增方法扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序,
(b)分别测定前述(a)工序的前后的荧光强度的工序,
(c)通过比较前述(b)工序中测定的前述(A)工序前后的荧光强度来检测有无变异的工序。
发明效果
本发明的引物和本发明的成套引物为含有前述式所示的结构的标记核酸,由此在用于例如目的核酸序列的扩增方法时,可有效地检测前述目的核酸序列的扩增。另外,由于这样可有效地检测扩增,进一步可以优异的灵敏度检测目的核酸序列中有无目的变异等。本发明由于在核酸的检测灵敏度等方面如此优异,因此可以用于例如研究、临床、诊断、试管内基因检测、生物体内基因检测等广泛的用途中。
附图说明
图1为示意性地示出本发明的原理的图。
图2表示实施例的化合物的1H和13CNMR光谱。
图3表示实施例的其它化合物的1H和13CNMR光谱。
图4表示提纯的DNA寡聚物5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’的MALDI TOF MS谱图。箭头为来自提纯的生成物的质量峰(4101.9)。由分子量计算值4102.8(C134H176N52O76P12)计算出的[M-H]-的计算值为4101.8,两值一致。
图5表示DNA寡聚物5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’和生物素衍生物的反应生成物的MALDI TOF MS谱图。箭头为来自提纯的生成物的质量峰(4554.3)。由分子量计算值4555.4(C134H176N52O76P12)计算出的[M-H]-的计算值为4554.4,两值一致。
图6表示实施例的化合物(用染料标记的DNA)的1HNMR光谱(DMSO-d6)。
图7表示图6的化合物(用染料标记的DNA)的反相HPLC的图。
图8表示图6的化合物(用染料标记的DNA)的MALDI TOFMS谱图。
图9表示实施例的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的UV光谱。
图10表示使用488nm的激发光的情况下,图9的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的荧光光谱。
图11为表示使用510nm的激发光的情况下,图9的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的荧光光谱。
图12为表示其它实施例的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的UV光谱。
图13为表示图12的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的荧光光谱。
图14为表示另一个实施例中的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的UV光谱。
图15为表示图14的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的荧光光谱。
图16为表示另一个实施例中的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的UV光谱。
图17为表示图16的荧光DNA寡聚物为单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品的荧光光谱。
图18为表示实施例中的数种荧光DNA寡聚物的吸收光谱、激发光谱和发光光谱的图表。
图19为表示实施例中的其它荧光DNA寡聚物的吸收光谱、激发光谱和发光光谱的图表。
图20为表示在各种温度和浓度下测定实施例的荧光DNA寡聚物的吸收光谱的吸收光谱。
图21为表示实施例的荧光DNA寡聚物进行杂交的双链体的CD光谱。
图22为表示实施例中的其它荧光DNA寡聚物的吸收光谱、激发光谱和发光光谱的图表。
图23为表示实施例中的其它荧光DNA寡聚物进行杂交形成双链体时的荧光发光的图。
图24为表示实施例中的其它荧光DNA寡聚物的吸收光谱和发光光谱的图。
图25为表示与实施例的荧光DNA寡聚物进行杂交的RNA链被RNase H消化时的荧光变化的图。
图26为表示改变互补DNA链相对于实施例的荧光DNA寡聚物的浓度比来观测荧光发光强度的变化的图。
图27为表示参考例的印迹分析中荧光发光状态的图。
图28为表示将参考例的荧光DNA寡聚物导入细胞时的微分干涉测定照片。
图29为表示将参考例的荧光DNA寡聚物导入细胞时的荧光观察时的照片。
图30为表示将图28和图29叠加的照片。
图31A为表示将参考例中的其它荧光DNA寡聚物导入细胞时的荧光观察时的照片。
图31B为表示将参考例中的其它荧光DNA寡聚物导入细胞时的荧光观察时的照片。
图32为表示将与图28~30相同的DNA寡聚物注入细胞核后的荧光随时间变化的图。
图33为表示将参考例中的其它荧光DNA寡聚物导入细胞时的荧光观察时的照片。
图34为表示实施例中的包含目的核酸序列的区域、各种引物的序列的图。
图35为表示实施例中的通过SMAP法进行等温扩增反应时的扩增概况的图表。
图36为图35的局部放大图。
图37为表示实施例中的包含H3N2的目的核酸序列的区域和各种引物的序列的图。
图38为表示实施例中的通过SMAP法进行等温扩增反应时的扩增概况的图表,A为对反应液a和b、B为对反应液c和d分别在FAM的波长(492nm/516nm)和Cy5的波长(635nm/665nm)下检测荧光强度的结果。
图39为表示实施例中的通过SMAP法进行等温扩增反应时的扩增概况的图表,对反应液e和f分别在FAM的波长(492nm/516nm)和Cy5的波长(635nm/665nm)下检测荧光强度的结果。
图40为表示实施例中的通过SMAP法进行等温扩增反应时的扩增概况的图表,对反应液b、c、e和f分别在FAM的波长(492nm/516nm)和Cy5的波长(635nm/665nm)下测定荧光强度的结果。
图41A为表示实施例中的通过SMAP法进行等温扩增反应时的扩增概况的图表,对反应液i分别在FAM的波长(492nm/516nm)和Cy5的波长(635nm/665nm)下测定荧光强度的结果。
图41B为表示实施例中的通过SMAP法进行等温扩增反应时的扩增概况的图表,B为对反应液g、h、i、j和k在FAM的波长(492nm/516nm)下测定荧光强度的结果,C为对反应液g、h、i、j和k在Cy5的波长(635nm/665nm)下测定荧光强度的结果。
图42为表示实施例中的通过PCR法进行扩增反应时的扩增概况的图表,图42B为实施例中的进行PCR反应时的扩增产物的电泳照片。
图43为表示实施例中的融解曲线的图表。
图44为表示实施例中的通过LAMP法进行等温扩增反应时的扩增概况的图表。
图45为表示本发明的SMAP法中通过第一引物进行核酸合成的作用机理的图。
图46为表示本发明的SMAP法中的第二引物的一个例子的图。
图47A为表示本发明的SMAP法的作用机理的示意图。
图47B为表示本发明的SMAP法的作用机理的示意图。
具体实施方式
下面,对本发明的实施方式进行更具体地说明。
[引物和成套引物]
如前所示,本发明的引物,其特征在于,其为用于扩增目的核酸序列的引物,该引物是包含至少一个下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示结构的标记核酸。另外,这些的互变异构体或者立体异构体、或他们的盐,也包括在本发明的标记核酸内。另外,本发明的成套引物,其特征在于,其为用于扩增目的核酸序列的成套引物,包含一对引物,前述一对引物的至少一个引物为本发明的引物。以下将具有显示荧光性的原子团Z11和Z12的、下述各式所示的结构称为“标记结构”,将含有前述标记结构的前述标记核酸,即本发明的引物称为“标记引物”。
本发明中,“目的核酸序列”不仅是指扩增目的的核酸序列,还包含与其互补的序列。
式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中,
B为具有天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸碱基骨架的原子团,
E为(i)具有脱氧核糖骨架、核糖骨架、或者由这些的任意一个衍生的结构的原子团,或
(ii)具有肽结构或者肽类似物结构的原子团,
Z11和Z12分别为显示荧光性的原子团,可以相同也可以不同,
L1、L2和L3分别为linker(桥原子或原子团),主链长(主链原子数)为任意,主链中可以分别含有或不含有C、N、O、S、P和Si,主链中可以分别含有或不含有单键、双键、三键、酰氨键、酯键、二硫键、亚氨基、醚键、硫醚键和硫酯键,L1、L2和L3相互间可以相同也可以不同、
D为CR、N、P、P=O、B或者SiR,R为氢原子、烷基或任意的取代基,
b为单键、双键或者三键,
或者,前述式(16)和(16b)中,可以是L1和L2为前述linker,L3、D和b不存在,L1和L2直接与B结合,
其中,
式(16)、(17)和(18)中,E为前述(i)的原子团,磷酸桥中的至少一个O原子可以用S原子取代,
式(16b)、(17b)和(18b)中,E为前述(ii)的原子团,
式(17)和(17b)中,各B可以相同也可以不同,各E可以相同也可以不同。
前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中,L1、L2和L3的主链长(主链原子数)分别优选为2以上的整数。L1、L2和L3的主链长(主链原子数)上限没有特别限制,例如为100以下,更优选30以下,特别优选10以下。
Z11和Z12优选显示激发子效果的原子团。由此,例如形成双螺旋结构时的荧光的增大变大,可以更有效地检测双螺旋结构。其中,本发明中,Z11和Z12即使不为显示激发子效果的原子团,另外,即使在1分子中仅导入1个显示荧光性的原子团(染料)也可以有效地检测双螺旋结构。
Z11和Z12只要是具有荧光性的原子团即可,前述具有荧光性的原子团没有特别限制。Z11和Z12更优选例如各自独立为由噻唑橙、噁唑黄、花青、半花菁、其它花青染料、甲基红、偶氮染料或这些的衍生物衍生的基团。另外,也可以适当应用由其它公知的染料衍生的基团。通过与DNA等核酸结合而改变荧光强度的荧光染料已经被报道了多种。代表性的例子已知:溴乙啶嵌入DNA的双螺旋结构而显示强的荧光,多用于DNA检测中。另外,已知芘基甲酰胺(pyrene carboxamide)或prodan这样的可根据微观的极性控制荧光强度的荧光染料。另外,前述噻唑橙为苯并噻唑环和喹啉之间用次甲基连接的荧光染料,通常显示微弱的荧光,但通过嵌入具有双螺旋结构的DNA可赋予强的荧光发光。此外还可列举例如荧光黄或Cy3等染料。
Z11和Z12更优选各自独立为下述式(7)~(9)的任意一个所示的原子团。
式(7)~(9)中,
X1和X2为S或O,
n为0或正的整数,
R1~R10、R13~R21各自独立为氢原子、卤原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或氨基,
R11和R12之中,一方为与前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中的L1或者L2结合的连接基,另一方为氢原子或低级烷基,
R15在式(7)、(8)或(9)中存在多个的情况下,可以相同也可以不同,
R16在式(7)、(8)或(9)中存在多个的情况下,可以相同也可以不同、
Z11中的X1、X2和R1~R21、Z12中的X1、X2和R1~R21相互间可以相同也可以不同。
前述式(7)~(9)中,R1~R21中前述低级烷基为碳原子数1~6的直链或支链烷基,前述低级烷氧基进一步优选为碳原子数1~6的直链或支链烷氧基。
前述式(7)~(9)中,R11和R12中,前述连接基进一步优选为碳原子数2以上的聚亚甲基羰基(polymethylenecarbonyl),用羰基部分与前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中的L1或者L2结合。前述聚亚甲基羰基的碳原子数上限没有特别限制,例如为100以下,优选50以下,更优选30以下,特别优选10以下。
Z11和Z12为前述式(7)~(9)所示的情况下,更优选各自独立为式(19)或(20)所示的基团。
式(19)和(20)中,X1表示-S-或-O-。R1~R10、R13和R14分别独立表示氢原子、卤原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或氨基。R11和R12的一方表示与前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)(18)和(18b)中的L1和L2结合的连接基,R11和R12的另一方表示氢原子、或低级烷基。
前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中,B可以具有天然核酸碱基骨架,但如前所述,也可以具有人工核酸碱基骨架。例如B优选为Py(嘧啶环)、Py der.、Pu(嘌呤环)、或Pu der.所示的结构。其中,
前述Py是指在下述式(11)记载的6元环之中,在1位具有与E结合的共价结合臂,在5位具有与linker部结合的共价结合臂的原子团,
前述Py der.是指前述Py的6元环的全部原子的至少一个用N、C、S或O原子取代的原子团,前述N、C、S或O原子可适当具有电荷、氢原子或取代基,
前述Pu是指下述式(12)记载的缩合环之中,在9位具有与E结合的共价结合臂,在8位具有与linker部结合的共价结合臂的原子团,
前述Pu der.是指前述Pu的5元环的全部原子的至少一个用N、C、S或O原子取代的原子团,前述N、C、S或O原子可以适当具有电荷、氢原子或取代基。
前述标记引物所包含的前述标记结构的数量没有特别的限制,例如为1~10个左右,优选为1~20个左右。另外,前述标记引物中,包含前述标记结构的部位也没有特别限制。
本发明的标记引物(标记核酸)和包含其的本发明的成套引物以及后述的核酸试样和目的核酸序列中,各核酸的基本骨架没有特别限制,可以为例如寡聚核苷酸、修饰寡聚核苷酸、寡聚核苷、修饰寡聚核苷、多核苷酸、修饰多核苷酸、多核苷、修饰多核苷、DNA、修饰DNA、RNA、修饰RNA、LNA、PNA(Peptide nucleic acid,肽核酸)、或这些嵌合分子的任意一个,也可以为其它结构。另外,前述核酸的基本骨架可以为天然的,也可以为人工合成的。前述核酸,在本发明的引物或成套引物的情况下,只要可以形成例如碱基对结合即可;在核酸试样或目的核酸序列的情况下,只要发挥例如作为互补链合成的模板的作用即可。因此,前述核酸例如可以部分或整体完全为由人工的结构形成的核苷酸衍生物。作为构成前述核酸的人工碱基可列举例如2-氨基-6-(N,N-二甲基氨基)嘌呤嘧啶-2-酮、5-甲基嘧啶-2-酮、2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤、吡咯-2-甲醛、9-甲基咪唑[(4,5)-b]嘧啶、5-碘代-2-氧代-(1H)嘧啶2-氧代-(1H)嘧啶、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤、7-(2-噻吩基)-咪唑并[4,5-b]嘧啶等等,但不限于这些。作为本发明的引物,基本骨架优选例如寡聚核苷酸、多核苷酸、DNA、这些的修饰体。本发明中“核苷酸”是指例如脱氧核糖核酸和核糖核酸的任意一种,“寡聚核苷酸”和“多核苷酸”可以由例如脱氧核糖核酸和核糖核酸的任意一种构成,也可以包含两种。本发明中,核酸的构成碱基数量没有特别限制。核酸这一词语通常与多核苷酸这一词语同义。寡聚核苷酸这一词语通常用作表示多核苷酸之中特别是构成碱基数少的多核苷酸的词语。通常将例如2~100碱基长度、更一般来说将2~50碱基长度左右的多核苷酸称为“寡聚核苷酸”,但并不限定于该数值。多核苷酸这一词语在本发明中也包括例如多核苷酸和寡聚核苷酸以及肽核酸、吗啉代核酸、甲基磷酸酯核酸、S-寡聚核酸等人工合成核酸。
前述肽核酸(PNA)通常具有用肽主链置换寡聚核苷酸的脱氧核糖主链的结构。作为前述肽主链可列举例如通过酰氨键结合的N-(2-氨基乙基)甘氨酸的重复单位。作为与PNA的肽主链结合的碱基可列举例如胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、硫尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤等天然存在的碱基、溴代胸腺嘧啶、氮杂腺嘌呤和氮杂鸟嘌呤等人工碱基,但不限于这些。
LNA通常为糖-磷酸骨架中,核糖的2’位的氧原子和4’位的碳原子之间用亚甲基桥结合的、具有2个环状结构的核酸。包含LNA的寡聚核苷酸与DNA退火时,双链体的构象发生变化,热稳定性上升。LNA由于与通常的寡聚核苷酸相比对核酸的结合力强,可通过例如寡聚的设计条件而成为更可靠、牢固的杂交。
本发明的标记引物通过包含至少一个具有前述的荧光性原子团的标记结构,与例如不含有前述荧光性原子团的未标记核酸相比,对靶的特异性高,杂交变强。即本发明的标记引物与例如基本骨架为相同碱基序列且为相同核酸片段长的未标记核酸相比,融解温度(Tm值)提高。因此,可比前述未标记核酸更牢固地与靶进行杂交。所以,通过本发明的标记引物例如可有效、特异性高地检测。
本发明的标记核酸由于具有这样的特征,通过与例如现有的PNA或LAN等同样提高Tm值,而成为提高扩增特异性的应用技术。另外,通过使本发明的标记引物的基本骨架为PNA或LNA,可比未标记的PNA或LAN进一步提高Tm值,因而可进一步提高杂交的效率。特别是如后面所述,在识别1个碱基~数个碱基变异的情况下或检测插入或缺失的情况下,使用本发明的标记核酸(也包括例如标记PNA、标记LNA等),可有效、特异性高的检测。若将本发明的标记核酸用作例如引物或探针,通过对靶序列是完全匹配还是错配,Tm值的差别大、杂交效率不同。因此,1个碱基识别等变异的检测变得更容易。另外,本发明中的标记引物与未标记核酸相比,Tm值变高,可应用于例如与特定区域牢固地结合、覆盖该区域、不能作为扩增的模板的PCR clamp法、PNA PCR clamp法、LNA PCR clamp法、PNA-LNA PCR clamp法中。
本发明的引物和本发明的成套引物所包含的各引物的碱基数没有特别限制,各引物可以为相同碱基数,也可以分别为不同的碱基数。作为前述碱基数的具体例子,因为是引物而优选为10~100bp左右的寡聚核苷酸,进一步优选为10~50bp左右,特别优选为10~30bp左右。
本发明的引物的序列没有特别限制,只要具有前述标记结构即可。另外,构成本发明的前述一对引物的各引物的序列没有特别限制,只要至少一个引物具有前述标记结构即可。另外,前述各引物的序列可如下设定:例如根据扩增目的目的核酸序列的序列,例如DNA或RNA中的前述目的核酸序列的附近的序列信息而适当设定,或者,根据应用本发明的引物和成套引物的核酸扩增反应(核酸扩增法)的种类而适当设定。各引物的序列可通过目前公知的方法而设定,通常,为了使DNA或RNA等核酸中的目的核酸序列包含在扩增产物中,而设计成在严格条件下与前述核酸进行杂交。“严格条件”如下决定:例如依据本发明的引物、或本发明的成套引物中的各引物和其互补链形成的双链的融解温度Tm(℃)、以及杂交溶液的盐浓度等而决定。作为具体例子,可以参考J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis:Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring HarborLaboratory(1989)等。例如在比所使用的引物的融解温度稍低的温度下进行杂交时,引物可与具有目的核酸序列的核酸特异性地杂交。这样的引物可以使用市售的引物构建软件例如Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research公司生产)等进行设计。本发明的引物(标记核酸)可以与例如碱基序列与前述标记核酸的碱基序列相同的的未标记的引物(未标记核酸)一起使用。由此可以充分抑制进行标记导致的成本提高。另外,本发明的引物这样与未标记核酸一起使用时,也可以获得充分的检测灵敏度。本发明的标记核酸与未标记核酸的比例没有特别限制,例如,在两者的总计中,前述标记核酸优选为0.01~100%、更优选为1~100%,进一步优选为5~50%,特别优选为10~50%。
本发明的标记引物,每1分子中可以仅具有1个荧光性的原子团(染料),但优选具有2个以上。由此,例如前述具有荧光性的原子团(染料)成为具有激发子效果。根据激发子效果,抑制例如单链体状态下的荧光强度,可更有效地检测双螺旋结构。另外激发子效果(exciton coupling)是指例如多个染料并行聚集形成H缔合体(H-aggregate)而基本不显示荧光发光的效果。该效果认为因如下的原因产生:染料的激发状态通过Davydov splitting分裂为2个能级,向上位能级的激发→向下位能级的内转换(internal conversion)→发光在热力学上被禁止。其中,这些说明并不对本发明进行限制。能够发生激发子效果,可以如下确认:形成H缔合体的染料的吸收带比单一的染料的吸收带出现在短波长。作为显示这样的效果的染料可列举例如前述的噻唑橙和其衍生物、噁唑黄和其衍生物、花青和其衍生物、半花菁和其衍生物、甲基红和其衍生物、其它通常被称为花青染料、偶氮染料的染料群。
这些染料通过嵌入而易于结合到形成双螺旋的DNA-DNA双链体或DNA-RNA双链体、或者硫代磷酸酯核酸、PNA(肽核酸)、LNA(BNA)这样的人工核酸与DNA或者RNA形成的双链体上。预先将多个这样的染料导入引物时,通常的单链体状态(也就是杂交前仅引物的状态)下,由于激发子效果而强烈猝灭,但与目的DNA或者RNA杂交后,缔合体分解,各染料随机嵌入双链体。此时染料间没有电子的相互作用,因此不产生激发子效果而显示强的荧光发光。此时的染料的吸收带与单一的染料的吸收带相同,表示染料间未产生激发子效果。另外,染料嵌入双链体时,由于染料自身具有的结构上的扭转消失,荧光发光进一步变强。
所以例如通过设计引物而使多个染料表现出激发子效果,可实现与目的序列杂交所带来的荧光的极其明确的出现和消失。另外,仅仅是在引物序列上仅结合1分子染料,不会出现激发子效果,但是,例如由于形成双链体所导致的染料的嵌入会使染料的结构平坦化等,因此也可能比单链体时发出更强的荧光。另外,即使结合有2分子以上的染料,在各染料相隔不显示电子相互作用的距离的情况下,不出现激发子效果。即,为了发挥激发子效果,2分子以上的染料必须以被配置在可以充分接近的距离这样的方式结合在本发明的化合物或核酸的分子上。即,本发明中的标记引物优选在前述引物内的一个核苷酸上结合2个以上的染料,或在连续的2个以上的核苷酸上各结合1个染料。
本发明的引物和成套引物,为了例如可以提高核酸扩增的效率,可以进一步包含外引物。作为外引物,可列举例如可以在模板核酸上,在位于目的核酸序列的外侧的部分提供互补链合成起点的引物。本发明的成套引物包含外引物的情况下,除前述成套引物的标记引物之外,前述外引物也为标记核酸,或者代替前述成套引物的标记引物,前述外引物为标记核酸。
本发明的引物和成套引物如后面所述可应用在核酸扩增方法中,因此可以进一步包含可在核酸扩增中使用的药品。作为前述药品可以含有例如DNA聚合酶等聚合酶;dNTP mix(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)等底物、Tris-HCl buffer、トライシンbuffer、磷酸钠buffer、磷酸钾buffer等缓冲液;氯化镁、醋酸镁、硫酸镁等催化剂;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)或氨基乙酸甜菜碱(N,N,N-trimethylglycine)等添加物;国际公开第99/54455号说明书中记载的酸性物质、阳离子络合物;酶稳定剂等。作为前述酶稳定剂没有限制,可以列举例如甘油、牛血清白蛋白、糖类等,其中,优选糖类,更优选为单糖或寡糖,更优选为海藻糖、山梨醇、甘露醇、或这些2种以上的混合物。另外,本发明的引物和成套引物例如可以提高核酸扩增率,因此可以进一步包含融解温度调整剂。作为前述融解温度调整剂可列举例如二甲基亚砜(DMSO)、氨基乙酸甜菜碱、甲酰胺或者甘油、或这些的任意的组合等,优选DMSO。另外,在供于核酸扩增方法的核酸试样如后所述含有RNA,将其作为模板的情况下,优选进一步包含逆转录酶。另外本发明的引物和成套引物中,这些药品的比例等没有限制,本领域技术人员可以适当决定。
本发明的引物和成套引物可以应用于目前公知的各种核酸扩增方法中,其反应形式没有任何限制。作为前述核酸扩增方法可列举例如等温扩增法、聚合酶链反应(PCR)法等。下面,将等温扩增法中所使用的本发明的引物和成套引物分别称为“等温扩增用引物”、“等温扩增用成套引物”,将PCR法中所使用的本发明的引物和成套引物称为“PCR用引物”、“PCR用成套引物”。
等温扩增用引物和成套引物
前述等温扩增法通常是指在等温下进行核酸扩增反应的方法。作为这样的方法可列举例如日本特公平7-114718号公报等中公开的链置换型扩增(SDA;strand displacementamplification)法;美国专利第5824517号说明书、国际公开第99/09211号说明书或国际公开第95/25180号说明书等中公开的改良SDA法;日本专利第2650159号公报等中公开的依赖核酸序列的扩增(NASBA;nucleic acid sequence based amplification)法;国际公开第00/28082号说明书等中公开的环状介导等温扩增(LAMP;Loop-Mediated Isothermal Amplification)法;国际公开第02/16639号说明书等中公开的ICAN(Isothermal andChimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids,等温的和嵌合引物起始的核酸扩增)法;自主序列复制系统(3SR;self-sustainedsequence replication)法;TMA(transcription-mediated amplification,转录介导的扩增)法;日本专利第2710159号公报中公开的Qβ复制酶(Qβreplicase)法;日本专利第389726号公报、专利第3942627号公报和NATUREMETHODS(Vol.4,No.3,March 2007,pp.257-262)、MitaniY.,Lezhava A.,Kawai Y.,Kikuchi T.,Oguchi-Katayama A.,Kogo Y.,Itoh M.,Miyagi T.et al.2007.“Rapid SNP diagnosticsusing asymmetric isothermal amplification and a new mismatch-suppression technology.”Nat.Methods 4(3):257-262.等中公开的方法(下面称为“SMAP(Smart Amplification Process)法”)、Invader法、RCA(rolling cycle amplification)法等。
前述等温扩增法的情况下,优选使用具有链置换(stranddisplacement)能力(链置换活性)的聚合酶。因此,本发明的等温扩增用引物和成套引物优选包含具有链置换能力的聚合酶。前述具有链置换能力的聚合酶可以是例如常温性、嗜温性和耐热性的任意一个。另外,前述具有链置换能力的聚合酶可以是例如天然来源的酶,也可以是通过基因工程等制备的酶,另外,还可以是人工加入变异的突变(mutant)酶。作为这样的聚合酶优选例如DNA聚合酶,更优选基本不具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。作为具有链置换能力的DNA聚合酶的具体例子,可列举例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus;下面称为“B.st”)、多孔热芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax、下面称为“B.ca”)等嗜热性芽孢杆菌属细菌来源的DNA聚合酶、这些酶的5’→3’核酸外切酶活性缺失的突变体、大肠杆菌(E.coli)来源的DNA聚合酶I、其Klenow片断等。此外,可列举例如Vent DNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶、DeepVent DNA聚合酶、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶、Φ29噬菌体DNA聚合酶、MS-2噬菌体DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pfu turbo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、9°Nm DNA聚合酶、Therminater DNA聚合酶、Aac DNA聚合酶、Gca DNA聚合酶、Bsm DNA聚合酶等。
作为前述具有链置换能力的聚合酶,优选进一步同时具有逆转录活性的DNA聚合酶。作为前述DNA聚合酶可以使用例如BcaBEST DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶等。通过这样的DNA聚合酶可以用1种聚合酶进行例如由全RNA或者mRNA的逆转录反应和cDNA为模板的DNA聚合酶反应。另外,可以将DNA聚合酶与MMLV逆转录酶等前述逆转录酶组合使用。
本发明的等温扩增用引物和成套引物,为了可以提高例如特异性,优选进一步包含错配识别蛋白。作为前述错配识别蛋白(也称为“错配识别蛋白质”)只要是可识别例如双链核酸中的错配并与其错配的部位结合的蛋白质即可,可以使用例如本领域技术人员公知的蛋白质。另外,前述错配识别蛋白只要可以识别例如双链核酸中的错配,还可以是由野生型蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸置换、缺失、增加和/或插入的氨基酸序列所形成的蛋白质(突变体)。作为前述错配识别蛋白质,已知有例如MutS蛋白质(例如日本特表平9-504699号公报)、MutM蛋白质(例如日本特开2000-300265号公报)、与GFP(Green Fluorescence Protein)结合的MutS蛋白质(国际公开第99/06591号说明书)、Taq MutS、这些的类似物等多种物质(Radman,M.et al.,Annu.Rev.Genet.20:523-538(1986);Radaman,M.etal.,Sci.Amer.,August 1988,pp40-46;Modrich,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989);Lahue,R.S.etal.,Science 245:160-164(1988);Jiricny,J.et al,.Nucl.AcidsRes.16:7843-7853(1988);Su,S.S.et al.,J.Biol.Chem.263:6829-6835(1988);L ahue,R.S.et al.,Mutat.Res.198:37-43(1988);Dohet,C.et al.,Mol.Gen.Gent.206:181-184(1987);Jones,M.etal.,Gentics 115:605-610(1987);Salmonella typhimurium的MutS(Lu,A.L.,Genetics 118:593-600(1988);HaberL.T.etal.,J.Bacteriol.170:197-202(1988);Pang,P.P.et al.,J.Bacteriol.163:1007-1015(1985));和Priebe S.D.etal.,J.Bacterilo.170:190-196(1988)等)。本发明中,优选例如MutS、MSH2、MSH6、MutH、MutL、酵母来源的错配识别蛋白质。
另外,前述错配识别蛋白为了防止例如与不含错配的双链核酸结合,优选通过活化剂进行活化。前述活化剂没有特别的限制,可列举例如ATP(腺苷5’-三磷酸)、ADP(腺苷5’-二磷酸)、ATP-γ-S(腺苷5’-O-(3-硫代三磷酸))、AMP-PNP(腺苷5’-[β,γ-亚氨基]三磷酸)等,此外也可以是一个可与错配识别蛋白结合的核苷酸。活化可通过例如前述错配识别蛋白和前述活化剂在室温下孵育数秒钟到数分间钟而进行。
作为本发明的等温扩增用引物和成套引物,为了防止例如前述错配识别蛋白与单链体核酸结合,优选进一步包含单链体结合蛋白质(SSB)。作为前述SSB没有特别限制,可以使用目前公知的蛋白质。作为SSB的具体例子可列举例如来自Escherichia coli、果蝇和非洲爪蟾的单链体结合蛋白质、T4噬菌体来源的基因32蛋白质,以及来自其它种的这些蛋白质。这种情况下,作为前述错配识别蛋白可列举MutS、MutH、MutL、HexA、MSH1~6、Rep3、RNaseA、尿嘧啶-DNA糖苷酶、T4核酸内切酶VII、解离酶等,优选MutS、MSH2、MSH6、或这些的2种以上的混合物,更优选MutS。
作为本发明的等温扩增用成套引物可列举例如非对称型的成套引物,即前述一对引物中一个引物的形态和另一个引物的形态不同(下面,称为“非对称型成套引物”);对称型的成套引物,即前述一对引物中一个引物的形态和另一个引物的形态相同(下面,称为“对称型成套引物”)。前述非对称型成套引物适用于例如前述SMAP法,前述对称型成套引物适用于LAMP法。另外,对这些非对称型成套引物和对称型成套引物将在后面叙述。
PCR用引物和成套引物
PCR法是目前广为人知的核酸扩增方法,相对于等温扩增方法,其为通过改变反应温度,进行例如双链核酸的解离、解离的单链与引物的退火、从引物开始的核酸合成的方法。作为PCR法中所使用的聚合酶可使用例如Taq DNA聚合酶等目前公知的聚合酶。
另外,相对于各种核酸扩增方法的本发明的引物和成套引物的具体例子,与本发明的核酸扩增方法合并在一起在后面叙述。
另外,本发明中的标记引物的效果,与现有的单链体状态猝灭型荧光引物(分子信标(molecular beacon)等)相比,可列举例如以下的优点。但是,这些也是例示,均不限制本发明。
(1)仅使用1种染料的情况下,合成容易。
(2)本发明的DNA引物的末端为自由端的情况下,作为引物容易使用。
(3)引物不必形成发夹结构等特殊的高级结构,因此不需要茎序列等与序列识别不相关的序列(没有多余的序列,也没有序列的约束)。
(4)可以在引物的多个部位(期望的部位)导入荧光染料。
(5)1分子中包含2个以上染料结构的情况下,因为受染料间的位置关系的约束,S/N比(杂交前后的荧光强度比)大。
[标记引物的材料]
本发明中的标记引物(前述标记核酸)可以由例如以下所示的化合物、核酸和标记物质来制备。这些化合物、核酸可以作为例如本发明中的前述标记引物而使用,另外也可以作为其合成原料或者合成中间体而使用。对于本发明中的化合物、核酸和标记物质,更详细为如下所述。
前述化合物为具有由单核苷或单核苷酸衍生的结构的化合物,前述结构为下述式(1)、(1b)或(1c)所示的化合物、其互变异构体或者立体异构体、或这些的盐。
前述式(1)、(1b)和(1c)中,
B为具有天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸碱基骨架的原子团,
E为
(i)具有脱氧核糖骨架、核糖骨架、或者由这些的任意一个衍生的结构的原子团,或
(ii)具有肽结构或者肽类似物结构的原子团,
Z11和Z12分别为氢原子、保护基、或显示荧光性的原子团,可以相同也可以不同,
Q在:
E为前述(i)的原子团的情况下为O,
E为前述(ii)的原子团的情况下为NH,
X在:
E为前述(i)的原子团的情况下为氢原子、可用酸脱保护的羟基的保护基、磷酸基(单磷酸酯基)、二磷酸基(二磷酸酯基)、或三磷酸基(三磷酸酯基),
E为前述(ii)的原子团的情况下为氢原子或氨基的保护基,
Y在:
E为前述(i)的原子团的情况下为氢原子、羟基的保护基、或亚磷酰氨基,
E为前述(ii)的原子团的情况下为氢原子或保护基,
L1、L2和L3分别为linker(桥原子或原子团),主链长(主链原子数)为任意,主链中可以分别含有或不含有C、N、O、S、P和Si,主链中可以分别含有或不含有单键、双键、三键、酰氨键、酯键、二硫键、亚氨基、醚键、硫醚键和硫酯键,L1、L2和L3相互间可以相同也可以不同、
D为CR、N、P、P=O、B或者S iR,R为氢原子、烷基或任意的取代基,
b为单键、双键或者三键,
或前述式(1)中,可以是L1和L2为前述linker,L3、D和b不存在,L1和L2直接与B结合,
前述式(1b)中,T在:
E为前述(i)的原子团的情况下为磷酸桥(PO4 -),1个以上的氧原子(O)可以用硫原子(S取代),
E为前述(ii)的原子团的情况下为NH。
前述式(1)、(1b)和(1c)中,E优选为具有例如DNA、修饰DNA、RNA、修饰DNA、LNA、或PNA(肽核酸)的主链结构的原子团。
另外,前述式(1)和(1c)中,
所示的原子团为下述式(2)~(4)的任意一个所示的原子团,
前述式(1b)中,
所示的原子团优选下述式(2b)~(4b)的任意一个所示的原子团。
前述式(2)~(4)和(2b)~(4b)中,
A为氢原子、羟基、烷基、或吸电子基团,
M和J分别为CH2、NH、O或S,可以相同也可以不同,
B、X和Y分别与前述式(1)、(1b)或(1c)相同,
前述式(2)、(3)、(2b)和(3b)中,磷酸桥中的1个以上O原子可以用S原子取代。
从易于合成等观点出发,E优选例如具有DNA、修饰DNA、RNA、或修饰RNA的主链结构的原子团,但也可以为具有LNA、或PNA(肽核酸)的主链结构的原子团。
前述式(2)和(2b)中,A中优选例如前述烷基为甲氧基,前述吸电子基团为卤素。
前述式(1)、(1b)或(1c)中,L1、L2和L3的主链长(主链原子数)优选分别为2以上的整数。L1、L2和L3的主链长(主链原子数)与前述同样地上限没有特别限制,例如为100以下。
前述化合物优选例如下述式(5)、(6)、(6b)或(6c)所示化合物、其互变异构体或者立体异构体、或这些的盐。
前述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中,l、m和n为任意,可以相同也可以不同;B、E、Z11、Z12、X、Y和T与前述式(1)和(1b)相同。前述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中,l、m和n分别优选为2以上的整数。l、m和n的上限没有特别限制,例如为100以下,更优选为30以下,特别优选为10以下。
前述化合物中,Z11和Z12优选显示激发子效果的原子团。由此,例如成为双螺旋结构时的荧光的增大大,可以更有效地检测双螺旋结构。其中,前述化合物中,Z11和Z12即使不为显示激发子效果的原子团,另外,即使在1分子中仅导入1个显示荧光性的原子团(染料),也可以有效地检测双螺旋结构。
Z11和Z12优选例如如前所述具有荧光性的原子团。前述具有荧光性的原子团没有特别限制。Z11和Z12更优选例如各自独立为由噻唑橙、噁唑黄、花青、半花菁、其它花青染料、甲基红、偶氮染料或这些的衍生物衍生的基团。另外,也可以适当应用由其它公知的染料衍生的基团。通过与DNA等核酸结合而改变荧光强度的荧光染料已经被报道了有多种。代表性的例子已知:溴乙啶嵌入DNA的双螺旋结构而显示强的荧光,多用于DNA检测中。另外,已知芘基甲酰胺(pyrene carboxamido)或prodan这样的可根据微观的极性控制荧光强度的荧光染料。另外,前述噻唑橙为用次甲基连接苯并噻唑环和喹啉环的荧光染料,通常显示微弱的荧光,但通过嵌入具有双螺旋结构的DNA可赋予强的荧光发光。此外还可列举例如荧光黄或Cy3等染料。
另外,Z11和Z12更优选各自独立为例如下述式(7)~(9)的任意一个所示的原子团。
式(7)~(9)中,
X1和X2为S或O,
n为0或正的整数,
R1~R10、R13~R21各自独立为氢原子、卤原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或氨基,
R11和R12之中,一方为与前述式(1)、(1b)或(1c)中的L1或者L2,前述式(5)、(6)、(6b)或(6c)中的NH结合的连接基,另一方为氢原子或低级烷基,
R15在式(7)、(8)或(9)中存在多个的情况下,可以相同也可以不同,
R16在式(7)、(8)或(9)中存在多个的情况下,可以相同也可以不同、
Z11中的X1和R1~R21、Z12中的X1和R1~R21相互间可以相同也可以不同。
式(7)~(9)中,R1~R21中,前述低级烷基为碳原子数1~6的直链或支链烷基,前述低级烷氧基进一步优选为碳原子数1~6的直链或支链烷氧基。
式(7)~(9)中,R11和R12中,前述连接基进一步优选为碳原子数2以上的聚亚甲基羰基,以羰基部分与前述式(1)、(1b)或(1c)中的L1或者L2、前述式(5)、(6)、(6b)或(6c)中的NH结合。前述聚亚甲基羰基的碳原子数,其上限没有特别限制,但例如为100以下。
Z11和Z12为前述式(7)~(9)所示情况下,更优选例如各自独立为式(19)或(20)所示的基团。
式(19)和(20)中,X1表示-S-或-O-。R1~R10、R13和R14分别独立表示氢原子、卤原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或氨基。R11和R12的一方表示与前述式(1)、(1b)或(1c)中的L1或L2、(5)、(6)、(6b)或(6c)中的NH结合的连接基,R11和R12的另一方表示氢原子、或低级烷基。
前述化合物可以是具有例如下述式(10)所示的结构的化合物、其互变异构体或者立体异构体、或这些的盐。
式(10)中,
E、Z11、Z12、Q、X和Y与前述式(1)相同。
前述式(1)、(1b)和(1c)中,B可以具有天然核酸碱基骨架,但如前所述,也可以具有人工核酸碱基骨架。
例如B优选为Py、Py der.、Pu、或Pu der.所示的结构。其中,
前述Py是指在下述式(11)记载的6元环之中,在1位具有与E结合的共价结合臂,在5位具有与linker部结合的共价结合臂的原子团,
前述Py der.是指前述Py的6元环的全部原子的至少一个用N、C、S或O原子取代的原子团,前述N、C、S或O原子可适当具有电荷、氢原子或取代基,
前述Pu是指下述式(12)记载的缩合环之中,在9位具有与E结合的共价结合臂,在8位具有与linker部结合的共价结合臂的原子团,
前述Pu der.是指前述Pu的5元环的全部原子的至少一个用N、C、S或O原子取代的原子团,前述N、C、S或O原子可以适当具有电荷、氢原子或取代基。
前述化合物例如可以为下述式(13)或(14)所示化合物、其互变异构体或者立体异构体、或这些的盐。
前述式(13)和(14)中,E、Z11、Z12、Q、X和Y与前述式(1)相同,Py、Py der.、Pu和Pu der.如前述的定义的同样。
前述化合物具有亚磷酰氨基的情况下,前述亚磷酰氨基优选用例如下述式(15)表示。
-P(OR22)N(R23)(R24) (15)
式(15)中,R22为磷酸基的保护基,R23和R24为烷基、或芳基。
更优选前述式(15)中R15为氰基乙基,R16和R17中,前述烷基为异丙基,前述芳基为苯基。
前述化合物中,例如前述式(1)所示化合物可以为下述式(21)所示化合物。
式(21)中,A表示氢原子或羟基。优选A为氢原子。B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶的残基。例如腺嘌呤和鸟嘌呤以8位与双键结合,胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶以5位与双键结合。Z11和Z12各自独立地表示显示荧光性的原子团、氢原子或氨基的保护基,特别优选噻唑橙衍生物、或噁唑黄衍生物的残基。X表示氢原子、可用酸脱保护的羟基的保护基、或单磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基。Y为氢原子、羟基的保护基、或亚磷酰氨基团。
前述式(21)所示化合物更优选例如用下述式(22)表示。
式(22)中,A表示氢原子或羟基。Z11和Z12各自独立地表示显示荧光性的原子团、氢原子或氨基的保护基,特别优选噻唑橙衍生物、或噁唑黄衍生物的残基。X表示氢原子、可用酸脱保护的羟基的保护基、或单磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基。Y为氢原子、羟基的保护基、或亚磷酰氨基团。
前述式(21)或(22)的化合物中,Z11和Z12为氢原子或氨基的保护基团的情况下,由于一分子中具有2个氨基(或被保护的氨基),可以利用这些氨基在一分子中导入2分子的标记分子。例如通过结合荧光物质、化学发光物质等来制造标记核酸,可提高核酸检测的灵敏度。进而Z11和Z12为显示荧光性的原子团的情况下,通过用特定的荧光物质进行标记可简便地进行核酸的检测。
另外,前述式(21)或(22)的化合物中,Z11和Z12为显示荧光性的原子团的化合物是用2分子的荧光性分子例如用噻唑橙衍生物或噁唑黄衍生物进行修饰的核苷或核苷酸。由包含这样的化合物的单链体核酸形成的引物通过发生激发耦合导致的猝灭,在仅引物的状态下荧光极弱,但通过与DNA或RNA进行杂交而显示强的荧光发光。即,例如噻唑橙衍生物或噁唑黄衍生物的荧光被其扭转结构强烈抑制,但噻唑橙衍生物或噁唑黄衍生物通过与DNA结合,结构的扭转消失并被固定化而显示强的荧光。荧光可以通过使用例如488nm、514nm的AR激光激发而检测,但不限于这些。
前述式(1)、(1b)或(1c)所示化合物可以供于例如本发明的标记引物(标记核酸)合成中。即,前述化合物可以作为核酸的标记物质(核酸标签化药品)而使用。例如,通过,将前述式(1)、(1b)或(1c)所示化合物作为核苷酸底物而使用,将单链体核酸作为模板,进行核酸合成反应,或使用前述式(1)、(1b)或(1c)所示的化合物通过化学合成(例如使用核酸自动合成仪的亚磷酰胺法等化学合成法)合成单链体核酸,可以制造在一分子中包含至少1分子以上前述化合物的核酸。此时,前述原子团Z11和Z12可以分别为显示荧光性的原子团、氢原子或保护基。前述原子团Z11和Z12如果是例如显示荧光性的原子团,则可以制造本发明的标记引物;如果是氢原子或保护基,进一步通过将这些原子或基团用显示荧光性的原子团取代,则可以制造本发明的标记引物。
本发明的标记引物所包含的前述式(1)、(1b)或(1c)的化合物的数量没有特别的限制,但例如为1~100个左右,优选为1~20个左右。
前述化合物或核酸(本发明的标记引物)可以具有例如下述式(23)~(25)的任意一个所示的结构。由此,可以作为例如导入了染料的荧光引物而优选使用。但是,作为荧光引物的适当的化合物并不限于这些。
式(23)中,碱基B上连接有2个染料(Fluo)。碱基B与linker结合的部位没有特别限制,例如可以以嘧啶4位、5位或者6位,嘌呤2位、3位、6位、7位或者8位之中的一个位置与linker进行连接。Linker:具有1个碱基连接部位,在途中分枝成2个以上,在末端与染料连接。与碱基或者染料的连接方法除使用通过对双键或三键的金属催化反应、成环缩合反应、麦克尔加成反应等形成的键之外、还可以使用酰氨键、酯键、二硫键、通过亚胺形成反应等形成的键。对linker来讲,长度(l,m,n)自由,可以含有单键、双键、三键、酰氨键、酯键、二硫键、胺、亚胺、醚键、硫醚键、硫酯键等。另外,优选不影响二聚化所引起的激发子效果。分枝部(X)为碳、硅、氮、磷、硼各原子,可以发生质子化(protonation)(例如NH+)或氧化(例如P=O)。染料优选使用通过二聚化而显示激发子效果的物质,与linker连接的部位可以是染料的任意部分。式(23)中示出了作为DNA部分结构的脱氧核糖核酸,但作为替代,核酸骨架除了为核糖核酸(RNA)外,还可以是2’O-甲基RNA或2’-氟DNA等糖修饰核酸、硫代磷酸酯(phosphorothioate)核酸等磷酸修饰核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。
式(24)中,碱基B上连接有2个染料(Fluo)。碱基B与linker结合的部位没有特别限制,例如可以以嘧啶4位、5位或者6位,嘌呤2位、3位、6位、7位或者8位之中的两个位置与linker进行连接。2个Linker:具有1个碱基连接部位,以另一个末端与染料连接。与碱基或者染料的连接方法除使用通过对双键或三键的金属催化反应、成环缩合反应、麦克尔加成反应等形成的键之外,还可以使用酰氨键、酯键、二硫键、通过亚胺形成反应等形成的键。对linker来讲,长度(l,m)自由,可以含有单键、双键、三键、酰氨键、酯键、二硫键、胺、亚胺、醚键、硫醚键、硫酯键等。另外,优选不影响通过二聚化引起的激发子效果。染料优选使用通过二聚化而显示激发子效果的物质,与linker连接的部位可以是染料的任意部分。式(24)中示出了作为DNA部分结构的脱氧核糖核酸,作为替代,核酸骨架除了为核糖核酸(RNA)外,还可以是2’O-甲基RNA或2’-氟DNA等糖修饰核酸、硫代磷酸酯核酸等磷酸修饰核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。
式(25)中,相连的核苷酸的各碱基(B1,B2)上分别连接有1个染料(Fluo)。各碱基与linker结合的部位没有特别限制,例如可以以嘧啶4位、5位或者6位,嘌呤2位、3位、6位、7位或者8位之中的两个位置与linker进行连接。2个Linker:具有1个碱基连接部位,以另一个末端与染料连接。与碱基或者染料的连接方法除使用通过对双键或三键的金属催化反应、成环缩合反应、麦克尔加成反应等形成的键之外,还可以使用酰氨键、酯键、二硫键、通过亚胺形成反应等形成的键。对linker来讲,长度(l,m)自由,可以含有单键、双键、三键、酰氨键、酯键、二硫键、胺、亚胺、醚键、硫醚键、硫酯键等。另外,优选不影响通过二聚化引起的激发子效果。染料优选使用通过二聚化而显示激发子效果的物质,与linker连接的部位可以是染料的任意部分。式(25)中示出了作为DNA部分结构的脱氧核糖核酸,作为替代,核酸骨架除了为核糖核酸(RNA)外,还可以是2’O-甲基RNA或2’-氟DNA等糖修饰核酸、硫代磷酸酯核酸等磷酸修饰核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。
另外,在前述化合物或核酸(例如本发明的标记核酸)存在互变异构体或立体异构体(例如:几何异构体、构象异构体和光学异构体)等异构体的情况下,任意的异构体均可在本发明中使用。另外,前述化合物或核酸的盐可以是酸加成盐(acidaddition salt)也可以是碱加成盐。进一步,形成前述酸加成盐的酸可以是无机酸也可以是有机酸,形成前述碱加成盐的碱可以是无机碱也可以是有机碱。作为前述无机酸没有特别的限制,可列举例如硫酸、磷酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、次氟酸、次氯酸、次溴酸、次碘酸、亚氟酸、亚氯酸、亚溴酸、亚碘酸、氟酸、氯酸、溴酸、碘酸、高氟酸、高氯酸、高溴酸和高碘酸等。前述有机酸也没有特别的限制,可列举例如对甲苯磺酸、甲基磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、安息香酸和醋酸等。作为前述无机碱没有特别的限制,可列举例如氢氧化铵、碱金属氢氧化物、碱土类金属氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐等,更具体而言,可列举例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙和碳酸钙等。前述有机碱也没有特别的限制,可列举例如乙醇胺、三乙胺和三(羟甲基)氨基甲烷等。这些盐的制造方法也没有特别的限制,可用如下的方法等制造:例如在前述给电子体、电子受体连接分子上,通过公知的方法将前述这样的酸或碱适当加成的方法。另外,取代基等存在异构体的情况下,可以为任意异构体,例如称为“萘基”的情况下可以是1-萘基也可以是2-萘基。
另外,本发明中,作为烷基没有特别的限制,可以列举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基等,结构中包含烷基的基团(烷基氨基、烷氧基等)也同样。另外,作为全氟烷基没有特别的限制,可以列举例如由甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基等衍生的全氟烷基,作为结构中包含全氟烷基的基团(全氟烷基硫酰基、全氟基羰基等)也同样。本发明中,作为酰基没有特别的限制,可以列举例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、环戊酮基(cyclohexanoyl)、苯偶酰基、环氧基羰基等,作为结构中包含羰基的基团(羰基氧基、烷酰氧基等)也同样。另外,本发明中羰基的碳原子数中包括羰基碳,例如碳原子数1的烷酰基(羰基)是指甲酰基。进一步本发明中“卤素”是指任意的卤元素,可列举例如氟、氯、溴和碘。另外,本发明中,作为氨基的保护基没有特别限制,可以使用例如三氟乙酰基、甲酰基、C1~6烷基-羰基(例如乙酰基、乙基羰基等)、C1~6烷基-硫羰基、叔丁基氧羰基(下面,也称为Boc)、苄氧羰基、烯丙基氧羰基、芴基甲氧基羰基、芳基羰基(例如苯基羰基、萘基羰基等)、芳基硫羰基(例如苯基硫羰基、萘基硫羰基等)、C1~6烷基氧-羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基等)、C7~10芳烷基-羰基(例如苄羰基等)、甲基、芳烷基(例如苄基、二苯基甲基、三苯甲基等)等。这些基团可以用1~3个卤原子(例如氟、氯、溴等)、硝基等取代,作为其具体例子,可列举对硝基苄氧羰基、对氯苄氧羰基、间氯苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基等。另外,作为本发明中羟基的保护基(包含可用酸脱保护的基团)没有特别限制,可列举例如二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、Pixyl基等。
作为前述化合物或核酸(本发明的标记核酸)特别优选例如后述实施例中记载的化学式102~106、110、113、114、116~118、120、121、122、123、124、ODN1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN6、ODN7、ODN8、ODN9、ODN10、ODN(anti4.5S)和ODN(antiB1)以及这些的几何异构体、立体异构体和盐。特别是化合物110、113、114、116~118、120、121、122、123、124、ODN1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN6、ODN7、ODN8、ODN9、ODN10、ODN(anti4.5S)和ODN(antiB1)由于噻唑橙和DNA以独特的结构共价结合,核酸检测灵敏度等特别优异。进一步,1分子中包含2个噻唑橙结构的化合物110、113、117、118、120、121、122、123、124、ODN1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN9、ODN(anti4.5S)和ODN(antiB1)作为单链体DNA荧光引物,抑制单链体状态的荧光,通过与互补的DNA或RNA形成双螺旋而使荧光强度增加而可更加有效地使用。
下面,对本发明中的标记物质进行说明。以下所示的标记物质可以作为本发明中的标记引物(标记核酸)而使用。
即,前述标记物质为复合体标记物质,其以如下所述结构为特征性化学结构:
(i)标记物质,其一个分子内的两个平面化学结构不在同一平面内,以某一特定的角度而存在,该分子嵌入核酸或groovebinding(沟结合)时,两个平面化学结构通过配置成在同一平面内并列而产生荧光发光,或
(ii)2个以上染料分子群形成的标记物质,其由于2个以上染料分子并行聚集而产生的激发子效果,不显示荧光发光,但这些分子嵌入核酸或groove binding(沟结合)时,由于前述聚集状态解体而产生荧光发光,或
(iii)在同一分子内具有2个以上的染料分子的化学结构,其由于2个以上染料分子并行聚集而产生的激发子效果,不显示荧光发光,但这些分子嵌入核酸或groove binding(沟结合)时,由于前述聚集状态解体而产生荧光发光。
前述(ii)或(iii)的情况下,前述染料分子优选前述(i)记载的分子。另外,前述(iii)的情况下,优选在与应被标记的核酸结合的linker分子上具有结合2个以上染料分子的结构,其通过另一个linker分子而成为分支结构来进行结合,或不通过另一个linker分子而直接结合。
本发明的标记物质优选为:前述原子团Z11和Z12为显示荧光性的原子团的前述本发明的化合物、其互变异构体或者立体异构体、或这些的盐、或前述本发明的核酸。例如,通过其为本发明的化合物或核酸中Z11和Z12为显示激发子效果的原子团,在成为双螺旋结构时荧光的增大变大,可更有效地检测双螺旋结构。其中,本发明的化合物或核酸中,Z11和Z12即使不为显示激发子效果的原子团,另外,即使在1分子中仅导入1个显示荧光性的原子团(染料),也可以作为核酸等的标记物质而使用,可有效地检测双螺旋结构。作为本发明的标记物质的形态例如为单链体核酸的荧光引物的形态,但不限于此,标记单核苷酸、标记寡聚核苷酸、双链体核酸等任意的形态均可。
另外,本发明的标记物质是例如标记单核苷酸、标记寡聚核苷酸、标记核酸或标记核酸类似物的标记物质,
是用前述(i)~(iii)的任意一个中记载的标记物质,或Z11和Z12为显示荧光性的原子团的前述本发明的化合物、其互变异构体或者立体异构体、或者这些的盐、或前述本发明的核酸进行标记的标记物质。
或者,本发明的标记物质是例如标记单核苷酸、标记寡聚核苷酸、标记核酸或标记核酸类似物的标记物质,
是通过与单核苷酸、寡聚核苷酸、核酸或核酸类似物中的一个或其以上的碱基分子或主链构成分子结合的linker分子,用前述(i)~(iii)的任意一个中记载的标记物质、或Z11和Z12为显示显示荧光性的原子团的前述本发明的化合物、其互变异构体或者立体异构体、或者这些的盐、或前述本发明的核酸进行标记的标记物质。
或者,本发明的标记物质是例如标记单核苷酸、标记寡聚核苷酸、标记核酸或标记核酸类似物的标记物质,
是通过与单核苷酸、寡聚核苷酸、核酸或核酸类似物中的一个或其以上的碱基分子的嘧啶核5位的碳原子或嘌呤核8位的碳原子结合的linker分子,用前述(i)~(iii)的任意一个中记载的标记物质、或Z11和Z12为显示显示荧光性的原子团的前述本发明的化合物、其互变异构体或者立体异构体、或者这些的盐、或用前述本发明的核酸进行标记的标记物质。
[化合物和标记引物的制造方法]
本发明中,前述化合物、核酸和标记引物(标记核酸)的制造方法没有特别限制,可以适当使用公知的合成方法(制造方法)。作为一个例子,当为前述式(21)所示化合物的情况下,可通过如下的制造方法进行制造,该方法包括如下的工序:活化下述式(26)所示的化合物的羧基之后,使其与三(2-氨基乙基)胺反应的工序;氨基保护工序;进行用保护基保护上述得到的化合物中存在的羟基的反应和进行对得到的化合物中存在的羟基加成磷酸或亚磷酰氨基的反应的工序。
式(26)中,A表示氢原子或羟基。B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶的残基。
作为在本发明的化合物、核酸或标记引物(标记核酸)的制造中可应用的制造方法(合成方法),是例如以下的方法。即,首先作为DNA的简便的标签化法,广泛使用使DNA中的活性氨基和标签化剂中被活化的羧基在缓冲溶液中反应的方法。该方法可应用于本发明的化合物或核酸的任意一个的制造中,特别是可应用于linker或染料的导入中。作为氨基的导入法,有利用GLEN RESEARCH公司销售的氨基Amino modifier亚磷酰胺的方法等。
前述原子团Z11和Z12例如可以由保护基变换为氢原子(脱保护基)、进一步用具有荧光性的原子团(染料)取代氢原子。脱保护基的方法没有特别限制,可以适当应用公知的方法。用具有荧光性的原子团(染料)取代的方法也没有特别限制,例如可以使Z11和Z12为氢原子的本发明的化合物或核酸与荧光性分子(染料)适当进行反应。例如Z11和Z12的至少一方为活性氨基时,由于与荧光性分子(染料)容易反应而优选,更优选Z11和Z12的两方为活性氨基。荧光性分子(染料)没有特别限制,可以是例如前述式(7)~(9)的任意一个所示化合物(其中,R11和R12均为氢原子或者低级烷基、或羧基聚亚甲基)。另外,核酸(多核苷酸、多核苷、寡聚核苷酸或寡聚核苷)的情况下,脱保护基的工序和用具有荧光性的原子团(染料)进行取代的工序可以在聚合(核酸合成)之前或之后。例如从防止染料部分受损的观点出发,在合成工序中优选在聚合(核酸合成)之后导入具有荧光性的原子团(染料)。
作为染料如前所述,没有特别限制、可使用所有染料,优选例如花青染料,特别优选噻唑橙。花青染料例如是可以用具有杂原子的2个杂环以次甲基linker结合的化学结构。通过改变杂环的种类、次甲基linker的长度或导入杂环的取代基等,可合成各种激发波长、发光波长的荧光染料。另外,用于DNA导入的linker导入也比较容易。另外噻唑橙在水中基本不发出荧光,但通过与DNA或RNA相互作用而发出强的荧光。认为通过与核酸的相互作用可抑制染料分子间的相互作用,且可抑制染料分子的2个杂环之间的次甲基linker附近的旋转,这关系到荧光强度的增加。另外噻唑橙染料的使用方法为已知、例如可参考H.S.Rye,M.A.Quesada,K.Peck,R.A.Mathies and A.N.Glazer,High-sensitivity two-color detection of double-stranded DNAwith a confocal fluorescence gel scanner using ethidiumhomodimer and thiazole orange,Nucleic Acids Res.,1991,19,327-33;和L.G.Lee,C.H.Chen and L.A.Chiu,Thiazoleorange:a new dye for reticulocyte analysis,Cytometry,1986,7,508-17来使用。
本发明中,前述化合物、核酸或标记引物(标记核酸)的基本骨架,如前所述没有特别限制,可以是例如寡聚核苷酸、修饰寡聚核苷酸、寡聚核苷、修饰寡聚核苷、多核苷酸、修饰多核苷酸、多核苷、修饰多核苷、DNA、修饰DNA、RNA、修饰RNA、LNA、或PNA(肽核酸)的任意一个,也可以是其它结构。以DNA、修饰DNA、RNA、或修饰RNA为基本骨架时,容易合成、用染料的置换(染料分子的导入)等也容易进行,故优选。在LNA或PNA中导入染料分子的方法没有特别限制,可以适当应用公知的方法。具体而言,可以参考例如AnalyticalBiochemistry 2000,281,26-35.Svanvik,N.,Westman,G.,Wang,D.,Kubista,M.(2000)Anal Biochem.281,26-35.Hrdlicka,P.J.,B abu,B.R.,Sorensen,M.D.,Harrit,N.,Wengel,J.(2005)J.Am.Chem.Soc.127,13293-13299.等。
以寡聚核苷酸、修饰寡聚核苷酸、寡聚核苷、修饰寡聚核苷、多核苷酸、修饰多核苷酸、多核苷、修饰多核苷、DNA、修饰DNA、RNA、或修饰RNA为基本骨架的核酸合成方法是已知的,可通过例如所谓的亚磷酰胺法等合成。其原料即亚磷酰胺药品可以用公知的方法简单地合成。在本发明的核酸为DNA特别是短的寡聚DNA的情况下,例如可用DNA自动合成仪等简单地合成。另外,例如通过PCR等,也可以合成长链状的核酸(DNA)等。DNA和染料分子的结合部位如前所述没有特别限制,但特别优选例如胸苷的5位。已知从胸苷的5位伸出各种取代基的核苷酸衍生物的三磷酸通过DNA聚合酶的导入效率比较好。由此,例如不仅在本发明的核酸为短的寡聚DNA的情况下可简单合成,其为长链DNA的情况下也可简单合成。
特别是,例如利用噻唑橙的为单链体DNA的本发明的荧光引物(标记核酸)具有如下优点:例如,(1)仅对例如用DNA自动合成仪合成的DNA,在缓冲溶液中加入染料即可制备,可容易地合成;(2)通过使酶制备的长链DNA和染料反应,还可制备长链的荧光引物,等。另外,可以用例如500nm附近的较长波长的光激发。
本发明的成套引物可以含有例如具有检测波长不同的荧光性原子团的2种以上的本发明的标记引物。作为用于对2种以上的目的核酸序列分别扩增的引物,若同时使用具有不同的荧光性原子团的本发明的标记引物,就可以在同一反应液中进行扩增,且可用各荧光性原子团相应的检测波长下来检测各目的核酸序列的扩增。
本发明的成套引物在以检测目的核酸序列中的变异部位为目的情况下,优选包含例如具有与前述目的核酸序列中包含变异部位的区域完全互补的序列的引物、具有与前述包含变异部位的区域除前述变异部位外完全互补的序列的引物。将完全互补的引物称为完全匹配引物,将与除变异部位以外互补的引物称为错配引物。本发明中,错配引物可以是例如除变异部位以外,进而除数个碱基以外互补的序列(以下同样)。这样,通过使错配引物共存,可抑制例如完全匹配引物与模板中的错配区域进行杂交,使更高特异性的扩增成为可能。
[核酸扩增方法]
本发明的核酸扩增方法是以下的第一核酸扩增方法和第二核酸扩增方法。
(1)第一核酸扩增方法
本发明的第一核酸扩增方法,其特征在于,其为扩增核酸试样中的目的核酸序列的方法,包含下述(A)和(B)工序,
(A)准备前述核酸试样的工序,
(B)使用本发明的引物或本发明的成套引物,扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序。
本发明的核酸扩增方法只要使用本发明的标记引物、或包含其的本发明的成套引物即可,其它条件和工序没有任何限制。核酸扩增的条件等可根据例如采用的核酸扩增法的种类、扩增目的目的核酸序列的序列信息等适当设定。
根据本发明的核酸扩增方法,由于使用本发明的标记引物、或包含其的本发明的成套引物,可仅检测例如核酸扩增反应液的荧光强度来判断目的核酸序列有无扩增。这是由于例如以下这样的理由。由于引物与包含目的核酸序列的DNA或RNA等杂交时,形成双链体核酸,前述标记引物的原子团(染料)嵌入或沟结合到前述双链核酸上。此时,由于不产生例如前述这样的前述原子团(染料)的激发子效果,前述原子团产生荧光发光。另一方面,未杂交的情况下,由于产生激发子效果,前述原子团不产生荧光发光。因此,例如引物不与模板杂交的情况下,或不发生扩增的情况下,不能发现产生荧光发光的原子团或产生荧光发光的原子团不增加。所以,若检测荧光强度,其增加的情况下可判断为目的核酸序列进行了扩增,非增加的情况下可判断为目的核酸序列未扩增。
扩增的目的核酸序列的检测方法可通过例如图1示意性地表示。该图(A)(左侧的记为“Non-Hybrid”的图)表示由于激发子效果而猝灭的引物,该图(B)(右侧的记为“Hybrid”的图)表示由于双链体形成而嵌入,进行荧光发光的引物。图中,符号1表示本发明的引物(荧光引物)。2表示显示荧光性的原子团(染料)。1’表示引物(荧光引物)1的互补链。3表示由1和1’形成的双链体核酸。另外,图的上部为电子迁移图。“Allowed”表示允许跃迁。“Forbidden”表示禁阻跃迁。“Emissive”表示可荧光发光。“Non-emissive”表示理论上不能荧光发光。即认为单链体状态下(图1(A)),基态状态的染料2进行缔合,根据激发耦合理论而相互作用,前述染料缔合体的激发状态分离成2个能级,从而抑制发光。从低能级的发光在理论上禁阻,缔合体的单重态激发态停留在低发射状态。另一方面,杂交形成双链体时(图1(B)),染料2嵌入或沟结合到双链体核酸3,激发耦合消失而产生荧光。其中,图1是示意性地表示本发明的目的核酸的检测机理的一例的示意图,本发明不受示意图1和其说明任何限制。激发子效果中,通过控制2个染料间的距离而可以控制荧光发光。通过将该系统安装到用于判断序列的DNA上,可以得到序列选择性荧光发光。本发明的核酸扩增方法、核酸检测方法、变异检测方法或试剂盒中,通过从例如试样的下方照射可见光,可进行杂交的检测,即使用目视也可以明确判断。另外,本发明中,可在例如荧光单元、微板块、凝胶、毛细管、塑料管等容器中观察杂交。进一步,本发明中可以从例如与目的核酸混合后马上观测杂交。
荧光强度的检测可以与例如前述(B)工序的核酸扩增反应同时进行,可连续或间歇地进行,也可以在前述(B)工序结束后进行。在前述(B)工序的反应结束后进行的情况下,优选合并作为背景,在前述(B)工序的反应开始前也进行检测。荧光强度的检测可以通过例如向反应液照射可见光来进行,可在荧光单元、微板块、凝胶、毛细管、塑料管等容器中进行观察。另外,荧光强度的检测可以以目视进行,也可以使用例如real time PCR装置等市售的荧光测定仪等来进行。
作为前述核酸试样,可列举例如包含DNA或RNA的试样。前述DNA可以是例如基因组DNA、cDNA和合成DNA的任意一个。RNA可以是例如总RNA、mRNA、rRNA、siRNA、hnRNA、合成RNA、已剪接RNA、未剪接(unspliced)RNA的任意一个。
这些核酸可以由例如血液、组织、细胞等生体来源试样,从食品、土壤、排水等分离的微生物来源试样来制备。另外,前述生体来源试样可列举例如动物、植物等。另外,核酸试样的制备方法没有特别限制,可通过目前公知的方法进行。作为具体例子可列举例如通过表面活化剂的溶解处理、声波处理、使用玻璃珠等的振荡搅拌、使用French press的方法等。另外,在存在内源性核酸酶的情况下,优选将分离的核酸进行提纯。核酸的提纯可以通过例如苯酚抽提、层析、离子交换、凝胶电泳、密度梯度离心等来进行。
本发明的核酸扩增方法中,前述(B)工序中可以使用例如具有检测波长不同的2种以上荧光性原子团的本发明的标记引物。具体而言,扩增2种以上的目的核酸序列的情况下,作为用于分别扩增各目的核酸序列的引物,优选同时使用具有不同的荧光性的原子团的2种以上的本发明的标记引物。由此,例如可以以同一反应液进行2种以上的目的核酸序列的扩增,且可在与各荧光性原子团相应的检测波长下,检测各目的核酸序列的扩增。
本发明的核酸扩增反应,在以检测目的核酸序列中的变异部位为目的进行扩增的情况下,例如前述(b)工序中优选使用例如:具有与前述目的核酸序列中包含变异部位的区域完全互补的序列的本发明的标记引物(标记完全匹配引物)、具有与前述包含变异部位的区域除前述变异部位外完全互补的序列的引物(错配引物)。这样,通过使错配引物共存,可抑制例如完全匹配引物与模板中的错配区域进行杂交,使更高特异性的扩增成为可能。前述错配引物例如可以是未标记引物,也可以是本发明的标记引物。
本发明的核酸扩增方法,如前所述,在应用的核酸扩增反应的形式上没有限制、可应用于例如SDA法、改良SDA法、NASBA法、LAMP法、ICAN法、自主序列复制系统法、TMA法、Qβ复制酶法、SMAP法等的等温扩增法、PCR法等。下面,将使用等温扩增法的本发明的核酸扩增方法称为“本发明的等温扩增法”,将使用PCR的本发明的核酸扩增方法称为“本发明的PCR法”。
等温扩增法
本发明的等温扩增法如前所述是在等温下进行核酸扩增的方法。前述(B)工序的核酸扩增反应的条件没有特别限制,本领域技术人员可以适当决定。反应温度优选设定为例如引物的融解温度(Tm)附近的温度或其以下,进而考虑引物的融解温度(Tm),优选设定严格的水平。作为反应温度的具体例子例如为约20℃~约75℃,优选约35℃~约65℃。
对本发明的等温扩增方法,列举使用前述这样的非对称型成套引物的方法、使用对称型成套引物的方法的例子进行说明。另外本发明不限于此。
SMAP法
核酸扩增方法中,SMAP法例如可以以优异的特异性扩增目的核酸序列,因此通过基因扩增可以判断例如基因中的变异、特别是有无一个碱基变异、有无碱基的缺失或插入等。因此,可以说通过应用本发明的成套引物,例如可实施更高灵敏度且高精度的SMAP法。
前述非对称型的成套引物,如前所示是具有一个引物的形态和另一个引物的形态不同的非对称型的一对引物的成套引物,其中,优选应用于前述SMAP法。下面,将该成套引物称为“SMAP用成套引物”。
作为前述SMAP用成套引物的具体例子,例如非对称型的一对引物包含第一引物和第二引物,
前述第一引物,在3’末端部分包含与目的核酸序列的3’末端部分的序列(A)杂交的序列(Ac’),且在前述序列(Ac’)的5’侧包含序列(B’),该序列(B’)与在前述目的核酸序列中比前述序列(A)更靠近5’侧的序列(B)的互补序列(Bc)杂交,
前述第二引物,在3’末端部分包含与前述目的核酸序列的互补序列的3’末端部分的序列(C)杂交的序列(Cc’),且在前述序列(Cc’)的5’侧包含折叠序列(D-Dc’),该折叠序列(D-Dc’)在同一链上含有相互杂交的2个核酸序列。
利用第一引物进行的核酸合成的作用机理在图45中示意地示出。首先,决定作为模板的核酸中的目的核酸序列,决定其目的核酸序列的3’末端部分的序列(A)和比序列(A)更靠近5’侧的序列(B)。第一引物包含序列(Ac’)而形成,进而在其5’侧包含序列(B’)。序列(Ac’)为与序列(A)杂交的序列,序列(B’)为与序列(B)的互补序列(Bc)杂交的序列。在此,第一引物在前述序列(Ac’)和前述序列(B’)之间,可以包含对反应没有影响的插入序列。这样的引物与模板核酸退火时,成为引物中的序列(Ac’)与目的核酸序列的序列(A)杂交的状态(图45(a))。以该状态发生引物延伸反应时,可合成包含目的核酸序列的互补序列的核酸。且在合成的核酸的5’末端侧存在的序列(B’)与该核酸中存在的序列(Bc)杂交,由此在合成的核酸的5’末端部分形成茎-环结构。其结果,模板核酸上的序列(A)成为单链体,具有与前面的第一引物相同的序列的其它引物与该部分杂交(图45(b))。然后通过链置换反应,发生从新杂交的第一引物开始的延伸反应,同时先前合成的核酸从模板核酸分离(图45(c))。
上述的作用机理中,序列(B’)与序列(Bc)杂交的现象,代表性的是由于在同一链上存在互补区域而发生杂交。通常双链体核酸解离成单链体时,从其末端或这以外的较不稳定的部分开始部分地解离。上述通过第一引物的延伸反应中生成的双链体核酸在较高温度下,末端部分的碱基对处于解离和结合的平衡状态、整体上保持双链体。这样的状态下,在同一链上存在末端解离的、部分互补的序列时,作为亚稳定状态,可形成茎-环结构。该茎环结构并不稳定地存在,相同的其它引物与通过该结构的形成而脱落的互补链部分(模板核酸上的序列(A))结合,立即通过聚合酶进行延伸反应,由此先前合成的链被置换而游离,同时可以生成新的双链体核酸。
本发明的优选方式中的第一引物的设计基准如下。首先,为了在通过引物的延伸合成模板核酸的互补链之后,新的引物有效与该模板核酸退火,通过合成的互补链的5’末端形成茎-环结构而使模板核酸上的前述序列(A)的部分成为单链体是必须的。因此序列(Ac’)的碱基数X与目的核酸序列中的夹在前述序列(A)和前述序列(B)中的区域的碱基数Y之差(X-Y)相对于X的比例(X-Y)/X变得重要。其中,在模板核酸上,比序列(A)更靠近5’侧的、到与引物的杂交无关的部分不必成为单链体。另外,为了新的引物有效与模板核酸退火,必须有效形成上述的茎-环结构。且对于有效形成茎-环结构、即有效地使序列(B’)和序列(Bc)杂交来说,前述序列(B’)和前述序列(Bc)之间的距离(X+Y)变得重要。通常用于引物延伸反应的最适温度最高为72℃附近,在这样低的温度下,延伸链较难在长的区域内解离。所以认为为了使序列(B’)与序列(Bc)有效进行杂交,两序列之间的碱基数优选为少。另一方面,认为为了序列(B’)与序列(Bc)杂交,模板核酸上的前述序列(A)的部分成为单链体,则序列(B’)和序列(Bc)之间的碱基数优选为多。
从以上这样的观点出发,本发明的优选实施方式的前述第一引物,在构成引物的序列(Ac’)和序列(B’)之间不存在插入序列的情况下,设计为使(X-Y)/X例如为-1.00以上,优选为0.00以上,进一步优选为0.05以上,进一步优选为0.10以上;另外,(X-Y)/X例如为1.00以下,优选为0.75以下,进一步优选为0.50以下,进一步优选为0.25以下。进一步(X+Y)优选为15以上,进一步优选为20以上,进一步优选为30以上;另外,优选为50以下,进一步优选为48以下,进一步优选为42以下。
另外,构成引物的序列(Ac’)和序列(B’)之间存在插入序列(碱基数为Y’)的情况下,本发明的优选实施方式的前述第一引物设计为使{X-(Y-Y’)}/X例如为-1.00以上,优选为0.00以上,进一步优选为0.05以上,进一步优选为0.10以上;另外,{X-(Y-Y’)}/X例如为1.00以下,优选为0.75以下,进一步优选为0.50以下,进一步优选为0.25以下。进一步(X+Y+Y’)优选为15以上,进一步优选为20以上,进一步优选为30以上;另外,优选为100以下,进一步优选为75以下,进一步优选为50以下。
前述第一引物为在赋予的条件下可维持必要的特异性,同时具有可与目的核酸的碱基对结合的左右的链长。该引物的链长优选为15~100核苷酸,更优选为20~60核苷酸。另外,构成前述第一引物的序列(Ac’)和序列(B’)的长度分别为优选为5~50核苷酸、更优选为7~30核苷酸。另外,根据需要,序列(Ac’)和序列(B’)之间,可以插入不影响反应的插入序列(intervening sequence)。
本发明的成套引物所包含的第二引物,如上所述,在3’末端部分包含与前述目的核酸序列的互补序列(对第一引物杂交的链来说为相反侧的链)的3’末端部分的序列(C)杂交的序列(Cc’)而构成,且在前述序列(Cc’)的5’侧包含折叠序列(D-Dc’),该折叠序列(D-Dc’)在同一链上含有相互杂交的2个核酸序列。这样的第二引物的结构例如如图46所示,但并不限定于图46所示的序列或核苷酸数。构成第二引物的序列(Cc’)的长度优选为5~50核苷酸、更优选为10~30核苷酸。另外,前述折叠序列(D-Dc’)的长度优选为2~1000核苷酸、更优选为2~100核苷酸、进一步优选为4~60核苷酸、进一步优选为6~40核苷酸,通过折叠序列的内部杂交而形成的碱基对的核苷酸数优选为2~500bp,更优选为2~50bp,进一步优选为2~30bp,进一步优选为3~20bp。折叠序列(D-Dc’)的核苷酸序列可以是所有的序列,没有特别限定,但优选为不与目的核酸序列杂交的序列。另外,根据需要,序列(Cc’)和折叠序列(D-Dc’)之间,可以插入不影响反应的插入序列。
使用图47(图47A和图47B)对这些第一引物和第二引物的核酸扩增反应所考虑的作用机理进行说明。另外,为了简化说明图47中进行杂交的2个序列设为相互互补的序列,但本发明并不受此限定。首先,第一引物与目的核酸的有义链杂交,发生该引物的延伸反应(图47A(a))。接着,在延伸链(-)上形成茎-环结构,新的第一引物与由此成为单链体的目的核酸有义链上的序列(A)进行杂交(图47A(b)),发生该引物的延伸反应,先前合成的延伸链(-)脱离。接着,第二引物与脱离的延伸链(-)上的序列(C)杂交(图47A(c)),发生该引物的延伸反应而合成延伸链(+)(图47A(d))。在生成的延伸链(+)的3’末端和延伸链(-)的5’末端形成茎-环结构(图47A(e)),从游离型的3’末端即延伸链(+)的环前端发生延伸反应,同时前述延伸链(-)脱离(图47A(f))。通过从环前端的前述延伸反应,生成发夹型双链体核酸,该发夹型双链体核酸是延伸链(-)夹着序列(A)和序列(Bc)与延伸链(+)的3’侧结合而形成的,第一引物与该序列(A)和序列(Bc)杂交(图47A(g)),通过该延伸反应生成延伸链(-)(图47A(h)和(i))。另外,通过前述发夹型双链体核酸的3’末端存在的折叠序列来提供游离型的3’末端(图47A(h)),通过由此开始的的延伸反应(图47B(i)),生成在两端具有折叠序列、夹着来自于第一和第二引物的序列而交互包含延伸链(+)和延伸链(-)的单链体核酸(图47B(j))。由于该单链体核酸通过其3’末端存在的折叠序列来提供游离型的3’末端(互补链合成起点)(图47B(k)),反复进行同样的延伸反应,每1次延伸反应链长变为2倍(图47B(l)和(m))。另外,图47B(i)中,从脱离的第一引物开始的延伸链(-)通过其3’末端存在的折叠序列提供游离型的3’末端(互补链合成起点)(图47B(n)),通过由此开始的延伸反应在两端形成茎-环结构,生成夹着来自于引物的序列而交互包含延伸链(+)和延伸链(-)的单链体核酸(图47B(o))。该单链体核酸中,通过3’末端的成环依次提供互补链合成起点,因此不断地发生由此开始的延伸反应。这样自动延长的单链体核酸在延伸链(+)和延伸链(-)之间包含来自于第一引物和第二引物的序列,因此各引物可进行杂交而发生延伸反应,由此显著地扩增目的核酸的有义链和反义链。
另外,本发明的SMAP用成套引物除第一引物和第二引物以外,还可以包含第三引物。前述第三引物例如为与前述目的核酸序列或其互补序列杂交,且对目的核酸序列或其互补序列的杂交与其它引物不竞争的引物。本发明中“不竞争”是指该引物与目的核酸进行杂交不妨碍其它引物的互补链合成起点的付与。
通过第一引物和第二引物扩增目的核酸序列的情况下,如上所述,扩增产物为交互具有目的核酸序列和其互补序列的序列。其扩增产物的3’末端存在折叠序列或环结构、由此,由提供的互补链合成起点不断发生延伸反应。第三引物在这样的扩增产物部分成为单链体的状态时,优选可与存在于其单链体部分的目的序列进行退火的引物。由此,在扩增产物中的目的核酸序列内提供新的互补链合成起点,发生由此开始的的延伸反应,因此核酸扩增反应能更迅速地进行。
前述第三引物没有限制,可以是1种,例如为了提高核酸扩增反应的迅速性和特异性,也可以同时使用2种以上的第三引物。这些第三引物例如由与代表性的第一引物和第二引物不同的序列构成,只要与这些的引物不竞争,也可以在部分重叠区域进行杂交。第三引物的链长优选为2~100核苷酸、更优选为5~50核苷酸、进一步优选为7~30核苷酸。
前述第三引物其主要目的在于发挥用于使例如第一引物和第二引物的核酸扩增反应更迅速地进行的辅助作用。所以前述第三引物优选具有比第一引物和第二引物各自的3’末端的Tm低的Tm的序列。另外,第三引物向扩增反应液的添加量优选例如比第一引物和第二引物各自的添加量少。
作为前述第三引物可以列举例如国际公开第02/24902号说明书中记载这样的、以具有可形成环的结构的序列为模板,在其环部分可赋予互补链合成的起点的序列,但不限于此。即例如只要是目的核酸序列内,在任意部位提供互补链合成起点均可。
前述SMAP用成套引物中,例如前述第一引物和前述第二引物的任意一方或前述两方的引物可以是前述标记核酸,前述第三引物也可以是前述标记核酸。另外,也可以是第一引物和第二引物的任意一方或者两方和第三引物均为前述标记核酸。
另外,在例如后述的变异检测方法中应用本发明的SMAP法的情况下,优选前述SMAP用引物如下进行设计。即前述SMAP用成套引物优选如下设计;将在目的部位具有变异的核酸序列(下面,“称为变异型核酸序列”)或在前述目的部位不具有变异的核酸序列(下面,称为“野生型核酸序列”)作为目的核酸序列,产生目的变异的部位包含于序列(A)、序列(B)或者序列(C)或配置于序列(A)和序列(B)之间、序列(A)和序列(C)之间。
作为前述成套引物,使用将在目的部位具有变异的核酸序列(变异型序列)作为目的核酸序列而设计的成套引物的情况下,例如核酸扩增反应后存在扩增产物则表示变异型序列存在,不存在扩增产物或扩增产物减少则表示变异型序列不存在。另一方面,使用将在目的部位不具有变异的核酸序列(野生型序列)作为目的核酸序列而设计的成套引物的情况下,例如核酸扩增反应后存在扩增产物则表示变异型序列不存在,不存在扩增产物或扩增产物减少则表示变异型序列存在。在此“扩增产物减少”是指得到的扩增产物的量比核酸试样中存在目的核酸序列的情况下得到的扩增产物的量减少。
作为前述成套引物,优选例如使前述目的部位包含于前述序列(A)而设计的成套引物。只要是这样的成套引物,例如在核酸试样中包含目的核酸序列(例如野生型序列)的情况下,核酸扩增反应中,由于第一引物与序列(A)进行退火而得到扩增产物。另一方面,核酸试样中包含与前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如变异型序列)的情况下,核酸扩增反应中,第一引物难以与序列(A)退火,因此得不到扩增产物或得到的扩增产物的量显著减少。第一引物所包含的序列(Ac’)优选与前述序列(A)互补的序列。
另外,作为前述成套引物,优选例如前述目的部位包含于前述序列(C)而设计的成套引物。只要是这样的成套引物,例如在核酸试样中包含目的核酸序列(例如野生型序列)的情况下,核酸扩增反应中,由于第二引物与序列(C)进行退火得到扩增产物。另一方面,核酸试样中包含与前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如变异型序列)的情况下,核酸扩增反应中,第二引物难以与序列(C)退火,因此得不到扩增产物或得到的扩增产物的量显著减少。第二引物所包含的序列(Cc’)优选与前述序列(C)互补的序列。
另外,作为前述引物,优选例如前述目的部位包含前述序列(B)而设计的成套引物。只要是这样的成套引物,例如核酸试样中包含目的核酸序列(例如野生型序列)的情况下,核酸扩增反应中第一引物与序列(A)退火、进行延伸反应后,前述引物所包含的序列(B’)与延伸链上的序列(Bc)进行杂交。因此,可有效地形成茎-环结构。通过该茎-环结构的有效形成,其它的第一引物可与模板退火,前述的图45所示的作用机理可有效地进行而得到扩增产物。另一方面,核酸试样中包含与前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如变异型序列)的情况下,核酸扩增反应中的前述茎-环结构的形成较难,因而阻碍前述图45所示的作用机理而得不到扩增产物或得到的扩增产物的量显著减少。另外,第一引物所包含的序列(B’)优选与前述序列(b)相同的序列。
另外,作为前述成套引物,优选例如前述目的部位配置于前述序列(A)和前述序列(b)之间而设计的成套引物。通过这样的成套引物,在核酸试样中包含目的核酸序列(例如野生型序列)的情况下,核酸扩增反应中,第一引物与序列(A)退火、进行延伸反应后,前述引物所包含的序列(B’)与延伸链上的序列(Bc)杂交而有效地形成茎-环结构。通过该茎-环结构的有效形成,其它的第一引物可与模板退火,前述图45所示的作用机理有效地进行而得到扩增产物。另一方面,在核酸试样中包含与前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如变异型序列)的情况下,第一引物所包含的序列(B’)和延伸链上的序列(Bc)不能维持适当的距离,因此核酸扩增反应中的上述茎-环结构的形成较难。所以这种情况下,阻碍了前述图45所示作用机理而得不到扩增产物或得到的扩增产物的量显著减少。
另外,作为前述成套引物优选前述目的部位配置于前述序列(A)和前述序列(C)之间而设计的成套引物。根据这样的成套引物,核酸试样中包含目的核酸序列的情况下(例如野生型序列)、核酸扩增反应中,第一引物与序列(A)退火、进行延伸反应后,前述引物所包含的序列(B’)与延伸链上的序列(Bc)进行杂交,因此有效地形成茎-环结构。通过该茎-环结构的有效形成,其它的第一引物可与模板退火,前述图45所示的作用机理有效地进行而得到扩增产物。另一方面,核酸试样中包含与前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如变异型序列)的情况下,得不到扩增产物或得到的扩增产物的量显著减少。例如在核酸试样中由于序列(A)和序列(C)之间中的长的序列的插入、而包含与目的核酸序列不同的核酸序列的情况下,核酸扩增的速度(效率)显著降低而得不到扩增产物或得到的扩增产物的量显著减少。另外,核酸试样中由于序列(A)和序列(C)之间中的序列的缺失而包含与目的核酸序列不同的核酸序列且由于该缺失而丢失序列(B)的部分或全部的情况下,第一引物所包含的序列(B’)不能与延伸链杂交而不能或难以形成茎-环结构。因此,阻碍了前述图45所示的作用机理而得不到扩增产物或得到的扩增产物的量显著减少。进一步核酸试样中由于序列(A)和序列(C)之间的序列的缺失而包含与目的核酸序列不同的核酸序列且不因该缺失序列而导致(B)部分缺失的情况下,核酸扩增的速度(效率)降低而得不到扩增产物或得到的扩增产物的量显著减少。
LAMP法
前述对称型的成套引物如前所示是具有一个引物的形态和另一个引物的形态相同的对称型的一对引物的成套引物,其优选应用于前述LAMP法。下面,将该成套引物称为“LAMP用成套引物”。
例如LAMP法需要4种引物,它们识别6个区域,由此可扩增目的基因。即该方法中,首先第一引物与模板链退火,发生延伸反应。接着,通过被设计在比第一引物更靠近上游侧的第二引物的链置换反应,第一引物的延伸链从模板链分离。此时,由于脱落的第一引物延伸产物的构成,在延伸链的5’末端部分形成茎-环结构。与此相同的反应也在双链体核酸的另一条链、或者脱落的第一引物延伸产物的3’末端侧进行。且通过反复进行这些反应而扩增目的核酸。LAMP法中的模板如下:例如在3’末端和5’末端,在同一链上分别具有由末端区域互补的碱基序列形成的区域,该相互间互补的碱基序列在退火时在两者之间形成碱基对可结合的环(“也称为哑铃型模板核酸”)。LAMP法可以按照例如国际公开第00/28082号说明书、国际公开第01/034838号说明书等进行。
PCR法
PCR法如前所示通过改变反应温度,可进行例如双链核酸的解离、引物与解离的单链的退火、由引物开始的核酸合成、目的核酸序列的扩增。PCR法的条件没有特别限制,本领域技术人员可适当设定。
本发明的引物的荧光强度可通过例如控制结合的染料部分的激发子相互作用而有效地改变。本发明中,特别是由于:通过使用激发子相互作用的方法而发挥作为on-off探针的作用,可得到足够高的猝灭性能,且例如与现有的检测相比,可得到很多明显不同的优点。利用激发子效果的引物所显示的光物理学性质,不仅非常有特征而且用于DNA序列测定(序列决定)、基因型分型(基因型解析)和基因表达观测的新型的荧光DNA引物的设计上也是适宜的。
(2)第二核酸扩增方法
本发明的第二核酸扩增方法为扩增核酸试样中的目的核酸序列的方法,其特征在于,包含下述(A)工序和下述(B’)工序:
(A)准备前述核酸试样的工序;
(B)使用引物或包含一对引物的成套引物扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序;
(B’)包含下述(B1’)工序和(B2’)工序的工序:
(B1’)使用引物或包含一对引物的成套引物扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序;
(B2’)前述(B1’)工序中扩增的单链体核酸序列与探针进行杂交的工序,其中该探针由包含至少一个下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示结构的标记核酸形成。
本发明的第二核酸扩增方法中,前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示的结构是与前述同样的标记结构,具体例子也可列举前述那样物质。另外,本发明的第二核酸扩增方法中,将包含前述标记结构的前述标记核酸称为“标记探针”。
本发明中的前述标记探针只要含有前述核酸结构即可,其它构成没有特别限制。作为前述标记探针可以与例如前述的标记引物同样进行设计、制造。另外,前述探针的序列没有特别限制,可根据例如检测目的的目的核酸序列的序列、DNA或RNA中的前述目的核酸序列的附近的序列信息等而适当设定。
本发明的第二核酸扩增方法中的引物和成套引物没有特别限制、可以根据例如目的的目的核酸序列、核酸扩增反应的种类等而适当设定。另外,本发明中的核酸扩增方法的种类没有特别限制,可列举前述这样的SMAP法或LAMP法等各种等温扩增法和PCR法等,可与前述第一核酸扩增方法同样进行。
根据本发明的第二核酸扩增方法,由于使用前述标记探针可仅检测例如核酸扩增反应液的荧光强度来判断例如目的核酸序列有无扩增。这是根据例如以下这样的理由。探针与互补的核酸序列杂交时,由于形成双链体核酸,前述标记引物的原子团(染料)嵌入或沟结合到前述双链体核酸上。此时,例如不产生前述这样的前述原子团(染料)的激发子效果,因而前述原子团产生荧光发光。另一方面,未杂交的情况下,由于产生激发子效果,前述原子团不产生荧光发光。因此,例如探针不与通过核酸扩增反应而得到的扩增产物杂交的情况下和不进行扩增的情况下,看不到产生荧光发光的原子团或其的增加。所以,若检测荧光强度,在增加的情况下判断为目的核酸序列进行了扩增,在非增加的情况下判断目的核酸序列未进行扩增。
前述标记探针可以在例如前述(B1’)工序的核酸扩增反应之前添加到反应液中,也可以在前述(B1’)工序的核酸扩增反应之后添加到反应液中。前者的情况下,荧光强度的检测与例如前述(B1’)工序的核酸扩增反应同时进行,可以连续或间歇地进行,可以在前述(B1’)工序结束后进行。前述(B1’)工序在反应结束后进行的情况下,合并作为背景,优选在前述(B1’)工序的反应开始前也进行检测。另一方,分别进行前述(B1’)工序和(B2’)工序的情况下,优选在前述(B1’)工序的核酸扩增反应之后将例如前述标记探针添加到反应液中。这种情况下,荧光强度的检测在例如(B1’)工序之后进行。此时,作为背景,优选在例如前述(B1’)工序之后,合并检测前述标记探针的添加前或者添加后的荧光强度。检测方法的具体例子如前所述。
(1)本发明中的探针可以在液相中的均质检测(使用96孔微孔板或毛细管等)中使用。
(2)本发明的探针可以用作PCR探针。可作为DNA扩增反应中的扩增曲线的检测(real time PCR)、代替TaqMan探针的廉价的方法来应用。可用作引物的标记、或者内部标记探针。
(3)本发明的探针可用作DNA芯片中的捕捉探针或者标记探针。其为高通量而不需要药品的体系,不需要标记过程·洗涤过程。可大大避免人为产生的误差。可在玻璃或代替玻璃的固相载体材料(金、ITO、铜等基板、钻石或塑料等可粘贴多样品的材料)上,进行同时多项(高通量)的解析。
(4)本发明的探针可以在玻璃珠、纤维、或水凝胶上固定化。可在半液体·半固体的环境下检测基因。具有液体样的测定环境同时可像固体那样搬运。
(5)本发明的探针可用作印迹分析(Southern blot、Northern blot、dot blot等)用的探针。可仅使目的基因片段发光而进行检测。根据本发明的方法,杂交操作之后不需要洗涤。
(6)本发明的探针可用作细胞内核酸的检测·追踪的探针。由此可在时间空间上解析细胞内的DNA/RNA。可以使用荧光显微镜或细胞分类仪(Cell Sorter)。可应用于DNA的标记、RNA的转录·拼接的追踪、RNAi的功能解析等中。本发明的方法不必洗涤,因此适于生物细胞的功能追踪。
(7)本发明的探针可用作荧光in situ杂交(FISH)的探针。根据本发明的方法可以进行组织的染色等。本发明的方法不需要洗涤,因此人为产生的误差小。即本发明的探针作为不识别目的生物分子时不发出荧光的荧光染料而发挥作用,若使用该探针,可以确立不需要复杂的洗涤工序的生物成像(bio-imaging)。这关系到以高可靠性、低劳动量实时观测荧光。
另外,本发明的荧光探针(标记物质)的效果与现有的单链体状态猝灭型荧光探针(分子信标等)相比,可列举例如以下的优点。其中,这些也是例示不对本发明进行任何限制。
(1)仅使用1种染料的情况下,合成容易。
(2)本发明的DNA引物的末端为自由端的情况下,作为PCR探针容易使用。
(3)引物不必形成发夹结构等特殊的高级结构,因此不需要茎序列等与序列识别不相关的序列(没有多余的序列,也没有序列的约束)。
(4)可以在引物的多个部位(期望的部位)导入荧光染料。
(5)1分子中包含2个以上染料结构的情况下,因为受染料间的位置关系的约束,S/N比(杂交前后的荧光强度比)大。
本发明的探针的荧光强度可通过例如控制结合的染料部分的激发子相互作用而有效地改变。本发明中,特别是由于:通过使用激发子相互作用的方法而发挥作为on-off探针的作用,可得到足够高的猝灭性能,且与例如现有的检测相比可得到很多明显不同的优点。这样的on-off荧光核苷酸的设计,对于确立不需要洗涤的生物成像分析来说非常重要。利用激发子效果的探针所显示的光物理学性质,不仅非常有特征而且用于DNA序列测定(序列决定)、基因型分型(基因型解析)、DNA构象转变(conformational transition)和基因表达观测的新型的荧光DNA引物的设计上也是适宜的。
另外,若使用本发明的探针(核酸),通过对例如目的核酸序列进行定量,可以马上检测该序列发生的扩增·分解·蛋白结合等现象,同时还可以对这些现象的量进行定量。该检测和定量通过以下的说明而成为可能,但该说明为例示,并不限定本发明。即首先,本发明的探针(核酸)以一定的物质量比与前述目的核酸序列进行杂交形成双链体。形成的双链体的物质量与前述目的核酸序列的物质量成正比例,因此通过测定前述双链体的荧光强度,可以检测目的核酸序列,同时可以对其物质量进行定量。这种情况下,本发明的探针(核酸)由于被抑制荧光发光而不妨碍前述双链体的荧光强度测定,使正确的测定成为可能。
[变异检测方法]
本发明的变异检测方法,其特征在于,其为检测核酸试样中目的核酸序列中有无变异的方法,包含下述(a)~(c)工序:
(a)通过本发明的核酸扩增方法扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序;
(b)分别测定前述(a)工序的前后的荧光强度的工序;
(c)通过比较前述(b)工序中测定的前述(a)工序前后的荧光强度来检测有无变异的工序。
本发明的变异检测方法只要通过使用前述本发明的引物或成套引物的核酸扩增方法扩增目的核酸序列即可,其它条件和工序没有任何限制。荧光强度的测定方法和测定条件等可根据例如前述本发明的标记引物的原子团的种类等而适当设定。另外,前述(b)工序中的荧光强度的测定方法没有特别限制,与前述同样。
本发明中“变异”是指核酸序列中相对于作为对照的核酸序列存在不同的碱基(双链体核酸的情况下为碱基对)。作为前述变异可列举例如碱基的置换、缺失或插入。作为前述对照,涉及例如某特定的碱基序列,其标准的碱基序列可列举例如标准的基因型即野生型(wildtype;也称为正常型(normal type))的核酸序列。
根据本发明的变异检测方法,由于使用本发明的标记引物或包含其的本发明的成套引物,仅通过检测前述(b)和(c)工序中核酸扩增反应液的荧光强度,比较反应前后的荧光强度的变化即可判断有无变异。这是根据例如以下这样的理由。引物与包含目的核酸序列的DNA或RNA等杂交,由此形成双链体核酸时,前述标记引物的原子团(染料)嵌入或沟结合到前述双链核酸。这种情况下,由于不产生例如前述这样的前述原子团(染料)的激发子效果,前述原子团产生荧光发光。另一方面,未杂交的情况下,由于发生激发子效果、前述原子团不产生荧光发光。因此,例如将一个引物设计成包含检测目的变异的序列的互补序列的情况下,模板中的目的核酸序列具有变异时,前述引物与目的核酸序列杂交进行核酸合成,结果发生扩增而产生荧光发光。但是前述目的核酸序列不具有变异时,前述引物不与目的核酸序列杂交,结果不进行扩增而不产生荧光发光。因此,若检测荧光强度,则增加的情况下可判断为存在目的变异,在非增加的情况下则可判断为不存在目的变异。另外将前述引物设计成与野生型互补的序列的情况下,相反地荧光强度增加的情况下可判断为不存在目的变异,非增加的情况下可判断为存在目的变异。
本发明中,任意的引物均可以为前述标记引物。另外,本发明的成套引物可以包含例如检测目的的碱基为变异型的引物(变异型引物)、前述碱基为野生型的引物(野生型引物)。这种情况下,变异型引物和野生型引物优选例如分别是具有不同的检测条件的荧光性原子团的标记引物。由此,核酸试样所包含的变异型DNA和野生型DNA的量的解析也成为可能。
本发明的变异检测方法可以使用前述(a)工序中例如具有检测波长不同的荧光性原子团的2种以上的本发明的标记引物。具体而言,检测2种以上的目的核酸序列的变异的情况下,优选作为用于分别扩增前述(a)工序中各目的核酸序列的引物,通过同时使用具有不同的荧光性原子团的2种以上的本发明的标记引物,通过前述(c)工序中与前述各荧光性原子团相应的各检测波长测定各自的荧光强度。由此,例如在同一反应液中进行2种以上的目的核酸序列的扩增且在与各荧光性原子团相应的检测波长下,可检测各目的核酸序列的变异扩增。
本发明的变异检测方法在以检测目的核酸序列中的变异部位的检测为目的进行扩增的情况下,例如前述(a)工序中优选使用具有与前述目的核酸序列中包含变异部位的区域完全互补的序列的本发明的标记引物(标记完全匹配引物)、具有与前述包含变异部位的区域除前述变异部位外完全互补的序列的引物(错配引物)。这样,通过使错配引物共存,可抑制例如完全匹配引物与模板中的错配区域进行杂交,使更高特异性的扩增成为可能。前述错配引物例如可以是未标记引物,也可以是本发明的标记引物。
[特异性的提高方法]
另外,本发明包含进一步提高引物对目的核酸序列的特异性的方法。本发明的第一的特异性提高方法,其特征在于,作为用于扩增前述目的核酸序列的前述引物使用具有本发明的荧光原子团的标记引物。即通过将引物结构设计成包含至少一个前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示的结构的标记核酸,如前所示可提高引物对目的核酸序列的特异性。另外本发明由于前述结构的标记核酸,与不含前述结构的未标记核酸相比,提高Tm值因此也称为Tm值的提高方法。另外标记引物的具体例子、使用方法等如前所述。
本发明的第二的特异性提高方法,其特征在于,作为用于扩增前述目的核酸序列的前述引物,使用具有与前述目的核酸序列中包含变异部位的区域完全互补的序列的权利要求1所述的引物(标记完全匹配引物)、进一步作为提高前述引物的特异性的引物,同时使用具有与前述包含变异部位的区域除前述变异部位外完全互补的序列的引物(错配引物)。像这样,通过同时使用本发明的标记完全匹配引物和错配引物,可以抑制标记完全匹配引物与例如模板中的错配区域进行杂交,可以提高标记完全匹配引物的特异性。另外标记引物或错配引物的具体例子、使用方法等如前所述。
[试剂盒]
本发明的核酸扩增用试剂盒是在扩增目的核酸序列的核酸扩增方法中所使用的试剂盒,其特征在于,包含本发明的引物或成套引物。本发明的核酸扩增用试剂盒只要包含本发明的引物或成套引物即可,其它构成和含有比例等没有任何限制。另外,应用本发明的变异检测用试剂盒的变异检测方法没有任何限制,可应用于例如前述这样的利用各种等温扩增法或PCR法等的方法。
本发明的变异检测用试剂盒是检测目的核酸序列中有无变异的变异检测方法中所使用的试剂盒,其特征在于,包含本发明的核酸扩增用试剂盒。本发明的变异检测用试剂盒只要包含本发明的核酸扩增用试剂盒即可,其它构成和含有比例等没有任何限制。另外,应用本发明的变异检测用试剂盒的变异检测方法没有任何限制,可应用于例如前述这样的利用各种等温扩增法或PCR法等的方法。
本发明的核酸扩增用试剂盒以及变异检测用试剂盒可在例如本发明的核酸扩增方法以及变异检测方法中使用。本发明的核酸扩增用试剂盒以及变异检测用试剂盒可进一步含有例如如前所述的聚合酶、错配识别蛋白等。
另外,本发明的核酸扩增用试剂盒以及变异检测用试剂盒可以进一步具备核酸合成手段和荧光强度测定手段等。前述核酸合成手段没有特别限制,可列举例如公知的自动核酸合成仪等,前述荧光强度测定手段也没有特别限制,可列举例如公知的荧光测定器等。
[装置]
接着,本发明的核酸扩增装置为用于实施本发明的核酸扩增方法的核酸扩增装置,其特征在于,具备:反应部,实施核酸扩增反应;温度控制单元,控制前述反应部的温度;检测单元,检测前述反应部的荧光强度。另外,本发明的变异检测装置为用于实施本发明的变异检测方法的变异检测装置,其特征在于,具备:反应部,实施核酸扩增反应;温度控制单元,控制前述反应部的温度;检测单元,检测前述反应部的荧光强度。另外,这些各装置例如还可以具备向例如前述反应部供给药品的药品供给单元、容纳前述药品的容纳部等作为其它的构成。
以上这样的本发明的各方法、各试剂盒和各装置在研究、临床、诊断等中极其有用。
[实施例]
通过以下的实施例对本发明进行更具体的说明,但本发明不受以下实施例的限制。另外,以下“ODN”是指寡聚DNA(DNA寡聚物)。
[测定条件等]
药品、溶剂使用一般市售的物质。生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯使用PIERCE公司的制品。化合物提纯用的硅胶使用Wako GEL C-200(和光纯药)。1H、13C和31PNMR光谱通过JEOL(日本电子株式会社)的JNM-α400(商品名)进行测定。耦合常数(J值)用赫兹(Hz)表示。化学位移用ppm表示,内标使用二甲基亚砜(δ=2.48in1HNMR,δ=39.5in13CNMR)和甲醇(δ=3.30in1HNMR,δ=49.0in13CNMR)。31PNMR测定中,作为外标使用H3PO4(δ=0.00)。ESI质谱使用Bruker公司的Bruker Daltonics APEC-II(商品名)进行测定。DNA自动合成仪使用Applied Biosystems公司的392DNA/RNA synthesizer(商品名)。反相HPLC使用Gilson公司的装置Gilson Chromatograph,Model 305(商品名)和CHEMCO公司的CHEMCOBOND 5-ODS-H制备柱(商品名,10×150mm)进行分离,通过UV检测器Model 118(商品名)在波长260nm下进行检测。DNA的质量通过MALDI-TOF MS进行测定。MALDI-TOF MS使用Appplied Byosystems公司的Perseptive Voyager Elite(商品名),在加速电压21kV、负离子模式下进行测定,使用2’,3’,4’-三羟基乙酰苯酮作为基质,以T8([M.H].2370.61)和T17([M.H].5108.37)作为内标。UV光谱和荧光光谱分别使用株式会社岛津制作所的Shimadzu UV-2550(商品名)分光光度计、RF-5300PC(商品名)荧光分光光度计进行测定。荧光寿命在株式会社堀场制作所的小型高性能荧光寿命测定仪器HORIBAJOBIN YVON FluoroCube(商品名)上安装NanoLED-05A(商品名)进行测定。双链体核酸的融点(Tm)的测定在包含100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中,在最终双链体浓度2.5μM下进行。试样的吸光度在波长260nm下测定,从10℃到90℃的范围内以0.5℃/min的速度加热同时进行追踪。从通过这样观测的特性,将最初产生变化的温度作为融点Tm。
吸收光谱、荧光光谱和CD光谱测定没有特别限制,在链浓度2.5μM(单链体或双链体)下,在包含100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中,使用光程长度1cm的测定皿进行。激发和荧光发光的带宽为1.5nm。荧光量子效率(ΦF)如下算出:将9,10-二苯基蒽作为对照物质,基于乙醇中的9,10-二苯基蒽的量子效率ΦF=0.95而算出。发光光谱的面积使用instrumentation softwar通过积分而算出。量子效率(ΦF)通过下述式(1)算出。
ΦF(S)/ΦF(R)=[A(S)/A(R)]×[(Abs)(R)/(Abs)(S)]×[n(S) 2/n(R) 2] (1)
上述式(1)中,ΦF(S)为试样(Sample)的荧光量子效率,ΦF(R)为对照物质(Reference)的荧光量子效率。A(S)为试样的荧光光谱面积,A(R)为对照物质的荧光光谱面积。(Abs)(S)为激发波长下的试样溶液的光密度,(Abs)(R)为激发波长下的对照物质溶液的光密度。n(S)为试样溶液的折射率,n(R)为对照物质溶液的折射率,作为n(S)=1.333和n(R)=1.383而计算。
[实施例1~3]
按照下述路线1,合成(制造)2个活性氨基分别用三氟乙酰基保护的化合物102和103,进而合成亚磷酰胺104。
路线1反应药品和反应条件(a)(i)N-
hydroxysuccinimide,EDC/DMF,(ii)tris(2-aminoethyl)
-amine/CH
3
CN,(iii)CF
3
COOEt,Et
3
N;(b)
DMTrCl/pyridine;(c)2-cyanoethyl-N,N,N’,N’-
tetraisopropyl phosphoramidite,1H-tetrazole/CH
3
CN
对前述路线1更详细为如下所示。
[实施例1:2-[2-[N,N-双(2-三氟乙酰氨基乙基)]
-氨基乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基)-2’-脱氧尿苷(2
-[2-[N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-
aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2’-deoxyuridine,化
合物102)的合成]
起始原料(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷((E)-5-(2-carboxyvinyl)-2′-deoxyuri dine,化合物101)是依据Tetrahedron 1987,43,20,4601-4607进行合成的。即,首先向430mg的醋酸钯(II)(FW224.51)和1.05g的三苯基膦(FW262.29)加入71mL的1,4-二噁烷,再加入7.1mL的三乙胺(FW101.19,d=0.726),在70℃下加热搅拌。反应溶液从红褐色变为黑褐色之后,加入使14.2g的2’-脱氧-5-碘代尿苷(FW354.10)和7.0mL甲基丙烯酸甲酯(FW86.09,d=0.956)悬浮于1,4-二噁烷后的产物,在125℃下进行1小时加热回流。之后,趁热过滤,用甲醇洗涤残留物,回收滤液。从滤液中减压蒸馏去除溶剂之后,用硅胶柱提纯生成物(5-10%甲醇/二氯甲烷)。对富集馏分的溶剂进行减压蒸馏,在减压状态下对残留的白色固体进行干燥。向干燥的固体加入约100mL的超纯水、3.21g的氢氧化钠(FW40.00),在25℃下通宵搅拌。此后,加入浓盐酸使溶液为酸性,过滤生成的沉淀,用超纯水洗涤,在减压下进行干燥。由此,得到目的化合物(化合物101)8.10g(收率68%)的白色粉末。此外,前述白色粉末是目的化合物101由1HNMR测定值与文献值的一致得以确认。另外,13CNMR测定值记录如下。
(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷(化合物101):
13CNMR(DMS O-d6):δ168.1,161.8,149.3,143.5,137.5,117.8,108.4,87.6,84.8,69.7,60.8,40.1。
接下来,将1.20g的(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷101(分子量298.25)和925mg的N-羟基琥珀酰亚胺(分子量115.09)和1.54g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(分子量191.70)放入装有搅拌器的梨形烧瓶,加入20mL的DMF,在25℃下搅拌16小时。加入约1mL的醋酸,加入300mL的二氯甲烷和100mL的超纯水,剧烈搅拌。除去水层,再加入100mL的超纯水,同样洗涤2次。过滤生成沉淀,用二氯甲烷洗涤,减压下进行干燥。从滤液中蒸馏去除溶剂,在生成的沉淀中加入二氯甲烷,与前述方法同样回收沉淀。使回收的全部沉淀悬浮于80mL的乙腈,进行剧烈搅拌。一次性向其中加入3.0mL的三(2-氨基乙基)胺(分子量146.23,d=0.976),在25℃下再搅拌10分钟。之后,加入4.8mL的三氟醋酸乙酯(分子量142.08,d=1.194),再加入5.6mL的三乙胺(分子量101.19,d=0.726),在25℃下搅拌3小时。蒸馏去除溶剂后,用硅胶柱提纯(5-10%Me OH/CH2Cl2)。蒸馏去除溶剂后,将其溶解在少量的丙酮中,加入乙醚后产生白色沉淀。过滤,用乙醚洗涤后,在减压下进行干燥,得到了884mg(33.5%)的目的物质(化合物102)。
此外,除使原料,溶剂等的使用量、反应时间以及工序发生若干变化外,与前述方法同样进行合成时,可以使收率提高到37%。即,将597mg(2.0mmol)的(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷101(分子量298.25)和460mg(4.0mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(分子量115.09)(767mg,4.0mmol)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(分子量191.70)放入装有搅拌器的梨形烧瓶,加入5.0mL的DMF,在25℃下搅拌3小时。加入约0.5mL的醋酸,加入约100mL的二氯甲烷和100mL的超纯水,进行剧烈搅拌。过滤产生的沉淀,用水洗涤,在减压下进行通宵干燥。将得到的白色残渣悬浮于50mL的乙腈,进行激烈地搅拌。一次性向其中加入3.0mL(20mmol)的三(2-氨基乙基)胺(分子量146.23,d=0.976),在25℃下再搅拌10分钟。之后,加入4.8mL的三氟醋酸乙酯(分子量142.08,d=1.194),再加入5.6mL(40mmol)的三乙胺(分子量101.19,d=0.726),在25℃下搅拌16小时。蒸馏去除溶剂后,用硅胶柱提纯(5-10%MeOH/CH2Cl2)。蒸馏去除溶剂后,使其溶解在少量的丙酮中,加入乙醚后产生白色沉淀。过滤,用乙醚洗涤后,在减压下进行干燥,得到了453mg(37%)的目的物质(化合物102)。下面示出化合物102的仪器分析值。另外,图2示出1HNMR光谱。
2-[2-[N,N-双(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨基乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基)-2’-脱氧尿苷(化合物102):1HNMR(CD3OD):δ8.35(s,1H),7.22(d,J=15.6Hz,1H),7.04(d,J=15.6Hz,1H),6.26(t,J=6.6Hz,1H),4.44-4.41(m,1H),3.96-3.94(m,1H),3.84(dd,J=12.2,2.9Hz,1H),3.76(dd,J=12.2,3.4Hz,1H),3.37-3.30(m,6H),2.72-2.66(m,6H),2.38-2.23(m,2H).13CNMR(CD3OD):δ169.3,163.7,159.1(q,J=36.4Hz),151.2,143.8,134.3,122.0,117.5(q,J=286Hz),110.9,89.1,87.0,71.9,62.5,54.4,53.9,41.7,38.9,38.7.HRMS(ESI)calcd for C22H29F6N6O8([M+H]+)619.1951,found 619.1943。
[实施例2:5’-O-二甲氧基三苯甲基-(2-[2-[N,N
-双(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨基乙基]氨基甲酰基-(E)
-乙烯基)-2’-脱氧尿苷(5’-O-DMTr-(2-[2-[N,N-
bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)
-vinyl)-2’-deoxyuridine,化合物103)的合成]
用DMTr基保护化合物102的5’-羟基,得到了化合物103。即,首先,将618mg的化合物102(分子量618.48)和373mg的4,4’-二甲氧基三苯甲基(分子量338.83)放入装有搅拌器的梨形烧瓶,加入10mL的吡啶,在25°下搅拌16小时。加上少量水,蒸馏去除溶剂,用硅胶柱提纯(2-4%MeOH,1%Et3N/CH2Cl2)。将含有目的化合物103的馏分蒸馏去除溶剂,得到735.2mg(79.8%)的目的物质(化合物103)。下面示出化合物103仪器分析值。此外,图3示出1HNMR光谱图。
5’-O-二甲氧基三苯甲基-(2-[2-[N,N-双(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨基乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基)-2’-脱氧尿苷(化合物103):
1HNMR(CD3OD):δ7.91(s,1H),7.39-7.11(m,9H),7.02(d,J=15.6Hz,1H),6.93(d,J=15.6Hz,1H),6.80-6.78(m,4H),6.17(t,J=6.6Hz,1H),4.38-4.35(m,1H),4.06-4.04(m,1H),3.68(s,6H),3.32-3.22(m,8H),2.66-2.55(m,6H),2.40(ddd,J=13.7,5.9,2.9Hz,1H),2.33-2.26(m,1H).13CNMR(CD3OD):δ168.9,163.7,160.1,159.1(q,J=36.9Hz),151.0,146.1,143.0,137.0,136.9,134.1,131.24,131.16,129.2,128.9,128.0,122.5,117.5(q,J=286.7Hz),114.2,110.9,88.1,87.9,87.6,72.6,65.0,55.7,54.2,53.9,41.7,38.9,38.6.HRMS(ESI)calcd forC43H47F6N6O10([M+H]+)921.3258,found 921.3265。
[实施例3:5’-O-(二甲氧基三苯甲基)-(2-[2-[N,N
-双(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨基乙基]氨基甲酰基-(E)
-乙烯基)-2’-脱氧尿苷-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-
二异丙基)]-亚磷酰胺(5’-O-DMTr-(2-[2-[N,N-bis
(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)
-vinyl)-2’-deoxyuridine,3’-[(2-cyanoethyl)-(N,N
-diisopropyl)]-phosphoramidite,化合物104)的合成]
使188mg(0.20mmol)的化合物103(分子量920.85)与CH3CN共沸,加入28.6mg(0.40mmol)的1H-四唑(分子量70.05),用真空泵整晚进行抽气干燥。向该干燥物中加入5.1mL的CH3CN进行溶解后,进行搅拌,一次性加入194μL(0.60mmol)的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(分子量301.41,d=0.949),在25℃下搅拌2小时。加入50mL的乙酸乙酯和50mL的饱和碳酸氢钠水溶液的混合物,进行分液,用饱和食盐水洗涤有机层后,用硫酸镁对其进行干燥。通过过滤除去硫酸镁后,蒸馏去除溶剂。假定本次分液的粗生成物与CH3CN共沸后,可按照100%的收率得到生成物(化合物104),使其成为0.1M的CH3CN溶液,用于DNA合成。此外,得到化合物104是由前述粗生成物的31PNMR(CDCl3)和HRMS(ESI)进行确认的。这些值在下面示出。
化合物104:
31PNMR(CDCl3)δ149.686,149.430:HRMS(ESI)calcdfor C52H64F6N8O11P([M+H]+)1121.4336,found 1121.4342。
[实施例4:DNA寡聚物的合成]
路线2
使用化合物104通过DNA自动合成仪合成寡聚DNA,以1μmol规模,用通常的亚磷酰胺法(DMTr OFF)来进行,合成了序列5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(13聚物,X的结构按照化学式105)(序列号1)的DNA寡聚物。用浓氨水(质量百分比为28%)在55℃下进行16小时脱保护。用speed_vac使氨水挥发,通过0.45μm过滤器后,用反相HPLC分析截取的DNA寡聚物,提纯在约10.5分钟出现的峰(CHEMCOBOND 5-ODS-H(商品名)10×150mm,3mL/min,5-30%CH3CN/50mMTEAA缓冲液pH7(20分钟),在260nm下检测)。通过MALDI TOFMS谱图的负离子模式,测定提纯的生成物的分子量,验证了前述5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’序列(13聚物,X的结构按照化学式105)这一序列具有预测的分子量(基于C134H176N52O76P12的计算值4102.8)([M-H]-的实测值4101.9,计算值4101.8)。图4示出MALDI TOF MS谱图的谱图。
此外,除用浓氨水进行的脱保护在55℃下进行4小时后再在25℃下进行16小时、反相HPLC的TEAA(醋酸三乙胺)缓冲液(pH7)浓度为0.1M、反相HPLC的展开时间设置为30分钟以外,可与上述同样合成5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(13聚物,X的结构按照化学式105)。并且,用同样的方法,能合成如表1所示的各ODN为原料的DNA(包含化学式105所示的核苷酸)。
为了确定合成的各个DNA的浓度,通过牛肠碱性磷酸酶(50U/mL),蛇毒磷酸二酯酶(0.15U/mL)以及核酸酶P1(50U/mL),在25℃下用16小时对提纯的各DNA进行完全消化。用安装了CHEMCOBOND 5-ODS-H(商品名)柱(4.6×150mm)的HPLC对得到的消化液进行分析。此时,作为流动相使用0.1M的TEAA(pH7.0),流速为1.0mL/min。将前述合成的DNA的峰面积与标准溶液的峰面积进行比较而确定其浓度,所述标准溶液是分别含有0.1mM浓度的dA,dC,dG以及dT的溶液。并且,前述合成的DNA,还通过MALDI TOF MS谱图进行了鉴定。下面示出其质量分析值。此外,[105]表示在该位置插入有化学式105所示的核苷酸。
GCAAT[105]TAACGC,calcd for C134H177N52O76P12([M+H]+)4103.8,found 4107.0;
TTTTTT[105]TTTTTT,calcd for C138H187N30O90P12([M+H]+)4077.8,found 4076.9;
TGAAGGGCTT[105]TGAACTCTG,calcd for C205H265N77O122P19([M+H]+)6348.2,found 6348.7;
GCCTCCT[105]CAGCAAATCC[105]ACCGGCGTG,calcdfor C285H376N108O169P27([M+H]+)8855.0,found 8854.8;
CCTCCCAAG[105]GCTGGGAT[105]AAAGGCGTG,calcdfor C289H376N116O168P27([M+H]+)8999.1,found 9002.2。
[实施例5:含具有2个氨基的核苷酸的DNA寡聚物的生物
素修饰]
路线3
通过使合成的DNA寡聚物5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(化合物105,使用前述化合物4作为X)和生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯进行反应,用2个生物素对2个氨基进行标签化(前述路线3)。即,首先,将30μL的5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(化合物105,链浓度320μM)和10μL的Na2CO3/NaHCO3缓冲液(1M,pH9.0)和60μL的H2O进行混合,加入100μL生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯DMF溶液(20mM),充分混合。在25℃下静置16小时之后,加入800μL的H2O,通过0.45μm的过滤器,用反相HPLC提纯约14分钟时出现的峰(CHEMCOBOND 5-ODS-H10×150mm,3mL/min,5-30%CH3CN/50mM TEAA缓冲液(20分钟),在260nm下检测)。通过MALDI TOF MS谱图的负离子模式测定前述通过HPLC提纯得到的生成物,在4554.3出现峰。该峰的值与由2个生物素分子与2个氨基反应的目的生成物6的分子量4555.4(基于C154H204N56O80P12S2的计算值)求出的[M-H]-的计算值4554.4一致。图5示出MALDI TOFMS的谱图。
使用该化合物6(单链体状态)合成双链体DNA及RNA,比较单链体状态和双链体状态的荧光强度。结果,确认了单链体状态下荧光DNA寡聚物(引物(化合物6))的荧光发光被抑制,与互补的核酸形成双螺旋时荧光发光强。
下述的实施例6~13中,合成下述化学式b及c所示的羧基亚甲基linker的噻唑橙衍生物,将它们以N-羟基琥珀酰亚胺酯的形式活化,通过与具有活性氨基的DNA寡聚物进行反应(寡聚核苷酸),制备有荧光性的各种寡聚核苷酸(荧光DNA寡聚物)。即,制造了各种寡聚核苷酸(荧光DNA寡聚物),这些寡聚核苷酸对从染料伸出的亚甲基linker长度和含有从胸苷5位伸出的含氨基的linker进行了各种改变。结果,任意一种荧光DNA寡聚物(荧光DNA引物)均抑制单链体状态DNA荧光引物的荧光发光,与互补核酸形成双螺旋时荧光发光强。此外,下述化学式b以及c中的n表示linker长度(桥原子数)。
[实施例6:1个分子中具有2个噻唑橙衍生结构的化合物的
合成]
路线4
如上述路线4所示,合成了1个分子中具有2个噻唑橙衍生结构的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110。更详细如下所示。
噻唑橙衍生物107的合成参考Organic Letters 2000,6,517-519,按照下述路线5进行。
路线5
(1)N-甲基喹啉碘化物(化合物111)的合成
首先,根据前述文献的记载合成N-甲基喹啉碘化物(化合物111)。具体而言,在42mL无水二噁烷中,加入2.4mL喹啉和4mL甲基碘,在150℃下搅拌1小时之后,通过过滤收集沉淀,用乙醚及石油醚洗涤,干燥,得到N-甲基喹啉碘化物(化合物111)。
(2)3-(4-羧基丁基)-2-甲基苯并噻唑溴化物(化
合物112)的合成
将8mL的2-甲基苯噻唑(FW149.21,d=1.173)和9.4g的5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)(FW181.03)在110℃下搅拌16小时。室温下冷却粗生成物,使生成的固体悬浮于20mL甲醇中,再加入40mL乙醚。过滤生成的沉淀,用二噁烷洗涤直到2-甲基苯并噻唑的气味消失,再用乙醚进行洗涤,在减压下干燥得到9.8g的白色粉末。测定该白色粉末的1HNMR,为2位被烷基化的目的物3-(4-羧基丁基)-2-甲基苯并噻唑溴化物(化合物112)和2位未被烷基化的3-(4-羧基丁基)-苯并噻唑溴化物的混合物。质子峰的比为未被烷基化∶烷基化=10∶3。将这些粗生成物直接用于下面的反应。
(3)1-甲基-4-[{3-(4-羧基丁基)-2(3H)-苯
并噻唑亚基}甲基]喹啉溴化物(化合物107)的合成
将2.18g前述(2)中得到的含有3-(4-羧基丁基)-2-甲基苯并噻唑溴化物(化合物112)的粗生成物和700mg的N-甲基喹啉碘化物(化合物111)(FW271.10)置于10mL的二氯甲烷中,在3.6mL的三乙胺(FW101.19,d=0.726)的存在下,在25℃下搅拌2小时。之后,加入50mL乙醚,过滤回收产生的沉淀,用乙醚洗涤,在减压下进行干燥。将该沉淀悬浮于50mL超纯水中,过滤回收,用超纯水洗涤,在减压下进行干燥。再将前述沉淀悬浮于50mL乙腈中,过滤回收,用乙腈洗涤,在减压下使其干燥,得到307.5mg的红色粉末(收率25.3%)。该红色粉末为目的物(化合物107)是将1HNMR光谱与文献值进行对比而确认的。
此外,也可以通过下述方法合成3-(4-羧基丁基)-2-甲基苯并噻唑溴化物(化合物112)以及1-甲基-4-[{3-(4-羧基丁基)-2(3H)-苯并噻唑亚基}甲基]喹啉溴化物(化合物107)。即,首先,将11.7mL(92mmol)的2-甲基苯并噻唑(FW149.21,d=1.173)和13.7g(76mmol)的5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)(FW181.03)在150℃下搅拌1小时。在室温下冷却粗生成物,将产生的固体悬浮于50mL甲醇中,再加入乙醚200mL。过滤生成的沉淀,用乙醚洗涤,在减压下进行干燥,得到19.2g的淡紫色粉末。该粉末是目的化合物112(3-(4-羧基丁基)-2-甲基苯并噻唑溴化物和2-甲基苯并噻唑溴化物的混合物。1HNMR(in DMSO-d6)测定该混合物,通过将8.5ppm的峰(来自目的化合物112)和8.0ppm的峰(来自2-甲基苯并噻唑溴化物)的峰面积比,计算出目的化合物112的收量为9.82g(14mmol,32%)。不提纯该混合物(粗生成物)直接用于下面的反应。此外,除将5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)变成4-溴代丁酸(4-溴代丁酸)以外,同样合成了linker(与羧基相连的聚亚甲基链)的碳原子数n=3的3-(4-羧基丙基)-2-甲基苯并噻唑溴化物,收率为4%。另外,除将5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)变成6-溴代己酸以外,同样合成了linker(与羧基相连的聚亚甲基链)的碳原子数n=5的3-(4-羧基戊基)-2-甲基苯并噻唑溴化物,收率为35%。并且,除将5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)变成7-溴代庚酸以外,同样合成了linker(与羧基相连的聚亚甲基链)的碳原子数n=6的3-(4-羧基丙基)-2-甲基苯并噻唑溴化物,收率为22%。
接下来,在3.24g含有化合物112即(3-(4-羧基丁基)-2-甲基苯并噻唑溴化物和2-甲基苯并噻唑溴化物的前述混合物(粗生成物)中,加入1.36g(5.0mmol)的N-甲基喹啉碘化物(化合物111)(FW271.10)、7.0mL(50mmol)的三乙胺(FW101.19,d=0.726)和100mL的二氯甲烷,得到透明溶液。将该溶液在25℃下搅拌16小时。之后,减压蒸馏去除溶剂。向残渣中加入丙酮(200mL),过滤回收得到的沉淀,用丙酮洗涤。然后将得到的残渣进行减压干燥,用蒸馏水(50mL)洗涤干燥后的红色残渣。对其再进行过滤回收,用蒸馏水洗涤,在减压下使之干燥,得到目的物(化合物107)红色粉末(654mg,1.39mmol,28%)。红色粉末为目的物(化合物107)是将1HNMR光谱与文献值进行对比而确认的。下面示出1HNMR以及13CNMR(DMS O-d6)峰值和HRMS(ESI)的测定值。此外,图6中示出化合物107的1HNMR光谱(DMSO-d6)。
化合物107:1HNMR(DMS O-d6):δ8.74(d,J=8.3Hz,1H),8.51(d,J=7.3Hz,1H),7.94-7.89(m,3H),7.74-7.70(m,1H),7.65(d,J=8.3Hz,1H),7.55-7.51(m,1H),7.36-7.32(m,1H),7.21(d,J=7.3Hz,1H),6.83(s,1H),4.47(t,J=7.1Hz,2H),4.07(s,3H),2.22(t,J=6.6Hz,1H),1.77-1.63(m,4H):13CNMR(DMSO-d6,60℃)δ174.6,158.8,148.4,144.5,139.5,137.6,132.7,127.9,126.8,125.5,124.1,123.7,123.6,122.4,117.5,112.6,107.6,87.4,45.6,42.0,35.5,26.2,22.3:HRMS(ESI)calcd for C23H23N2O2S([M.Br]+)391.1480,found 391.1475。
此外,用与上述化合物107同样的方法,由3-(4-羧基丙基)-2-甲基苯并噻唑溴化物和2-甲基苯并噻唑溴化物的混合物,合成了linker(与羧基相连的聚亚甲基链)碳原子数n=3的4-((3-3-(4-羧基丙基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基-1-甲基喹啉溴化物,收率为43%。下面示出仪器分析值。
4-((3-3-(4-羧基丙基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基-1-甲基喹啉溴化物:
1HNMR(DMSO-d6)δ8.85(d,J=8.3Hz,1H),8.59(d,J=7.3Hz,1H),8.02.7.93(m,3H),7.78.7.70(m,2H),7.61.7.57(m,1H),7.42.7.38(m,1H),7.31(d,J=6.8Hz,1H),7.04(s,1H),4.47(t,J=8.1Hz,2H),4.13(s,3H),2.52.2.48(m,2H),1.99.1.92(m,2H):13CNMR(DMSO-d6,60℃)δ174.3,158.9,148.6,144.5,139.5,137.7,132.7,127.9,126.7,125.6,124.1,124.0,123.7,122.5,117.5,112.5,107.6,87.7,45.6,42.0,31.6,22.4:HRMS(ESI)calcd forC22H21N2O2S([M.Br]+)377.1324,found 377.1316。
此外,用与前述化合物107同样的方法,由前述3-(4-羧基戊基)-2-甲基苯并噻唑溴化物和2-甲基苯并噻唑溴化物的混合物,合成了linker(与羧基相连的聚亚甲基链)碳原子数n=5的4-((3-(3-羧基戊基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉溴化物,收率为26%。下面示出仪器分析值。
4-((3-(3-羧基戊基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉溴化物:
1HNMR(DMSO-d6)δ8.70(d,J=8.3Hz,1H),8.61(d,J=6.8Hz,1H),8.05.8.00(m,3H),7.80.7.73(m,2H),7.60.7.56(m,1H),7.41.7.35(m,2H),6.89(s,1H),4.59(t,J=7.3Hz,2H),4.16(s,3H),2.19(t,J=7.3Hz,1H),1.82.1.75(m,2H),1.62.1.43(m,4H):13CNMR(DMSO-d6,60℃)δ174.5,159.0,148.6,144.7,139.7,137.8,132.9,127.9,126.9,125.2,124.2,123.8,123.6,122.6,117.8,112.6,107.7,87.4,45.6,42.1,36.0,26.3,25.9,24.9:HRMS(ESI)calcd for C24H25N2O2S([M.Br]+)405.1637,found405.1632。
接下来,用与前述化合物107同样的方法,由前述3-(4-羧基己基)-2-甲基苯并噻唑溴化物和2-甲基苯并噻唑溴化物的混合物,合成了linker(与羧基相连的聚亚甲基链)碳原子数n=6的4-((3-(3-羧基己基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉溴化物,收率为22%。下面示出仪器分析值。
4-((3-(3-羧基己基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉溴化物:
1HNMR(DMSO-d6)δ8.72(d,J=8.3Hz,1H),8.62(d,J=6.8Hz,1H),8.07.8.01(m,3H),7.81.7.75(m,2H),7.62.7.58(m,1H),7.42.7.38(m,2H),6.92(s,1H),4.61(t,J=7.3Hz,2H),4.17(s,3H),2.18(t,J=7.3Hz,1H),1.82.1.75(m,2H),1.51.1.32(m,6H):13CNMR(DMSO-d6,60℃)δ174.0,159.1,148.6,144.7,139.8,137.8,132.9,127.9,126.8,125.0,124.2,123.8,123.6,122.6,118.0,112.7,107.8,87.4,45.5,42.1,33.4,27.9,26.4,25.5,24.1:HRMS(ESI)calcd for C25H27N2O2S([M.Br]+)419.1793,found419.1788。
(4)N-羟基琥珀酰亚胺酯109合成
将9.4mg(20μmol)的1-甲基-4-[{3-(4-羧基丁基)-2(3H)-苯并噻唑亚基}甲基]喹啉溴化物(化合物107)(FW471.41)、4.6mg(40μmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(化合物108)(FW115.09)、以及7.6mg(40μmol)的EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)(FW191.70)在1mL的DMF中于25℃下搅拌16小时,得到染料(化合物107)的羟基被活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯(化合物109)。不对此反应生成物进行提纯,将反应溶液(染料20mM)直接用于与寡聚DNA(寡聚核苷酸)105的反应。
接下来,除使用改变linker(聚亚甲基linker)碳原子数的化合物代替化合物107作为原料以外,用与前述化合物109相同的方法,合成了linker(聚亚甲基linker)碳原子数n=3的4-((3-(4-(琥珀酰亚胺基氧)-4-氧代丁基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉溴化物。并且,同样合成了linker(聚亚甲基linker)碳原子数n=5的4-((3-(4-(琥珀酰亚胺基氧)-4-氧代己基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉溴化物和linker(聚亚甲基linker)碳原子数n=6的4-((3-(4-(琥珀酰亚胺基氧)-4-氧代庚基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉溴化物。
(5)用2分子噻唑橙修饰的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110
的合成
与前述实施例4同样,通过DNA自动合成仪以常规方法,合成具有两个活性氨基的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)105。化合物105的序列与实施例4同样使用5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(X为前述化合物104)。接下来,使DNA寡聚物(寡聚核苷酸)105与N-羟基琥珀酰亚胺酯(化合物109)进行反应,合成在1个分子中存在2个由噻唑橙衍生的结构的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110。即,首先,将30μL的5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(化合物105,链浓度320μM)、10μL的Na2CO3/NaHCO3缓冲液(1M,pH9.0)和60μL的H2O混合,加入100μL N-羟基琥珀酰亚胺酯(化合物109)的DMF溶液(20mM),充分混合。在25℃下静置16小时之后,加入800μL的H2O,通过孔径0.45μm的过滤器,以反相HPLC提纯出现在约14.5分钟的峰(CHEMCOBOND 5-ODS-H10×150mm,3mL/min,5-30%CH3CN/50mM TEAA缓冲液(20分钟),在260nm下检测)。图7示出反相HPLC的图。分离提纯箭头指向的峰所表示的馏分。将用HPLC提纯得到的生成物通过MALDITOF MS的负离子模式进行测定,在4848.8处出现峰,确认其为DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110。图8示出DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110的MALDI TOF MS谱图。该图中,箭头指向的是来自前述提纯的生成物的质量峰(4848.8)。该峰的值与从带2个正电荷的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110的分子M(C180H220N56O78P12S2)去掉3个质子的[M2+-3H+]-计算的计算值4848.8一致。此外,左右的峰是来自作为标准物质而加入的DNA的T8聚体和T18聚体的峰。
[实施例7:DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110作为荧光引物的
使用]
对实施例6中提纯的DNA寡聚物(寡聚核苷酸110)(带有两分子染料的DNA)进行脱盐,冷冻干燥之后,制成水溶液,通过UV吸收确定浓度(X与T近似)。之后,在链浓度2.5μM、磷酸缓冲液50mM(pH7.0)、NaCl 100mM的条件下,对荧光引物(DNA寡聚物110)处于单链体状态、DNA-DNA双螺旋、DNA-RNA双螺旋的各种状态进行UV测定。图9中示出这3个样品的谱图。如图所示,由于形成双螺旋,500nm附近的UV吸收的最大波长发生了移动。
接下来,同样在链浓度2.5μM、磷酸缓冲液50mM(pH7.0)、NaCl 100mM的条件下,通过488nm的激发光(带宽1.5nm)激发后进行荧光测定。图10分别示出荧光引物(荧光DNA寡聚物)是单链体状态时、DNA-DNA双螺旋时、DNA-RNA双螺旋时的3个样品各自的光谱。如图所示,发现与单链体状态的荧光引物的530nm的荧光强度相比,DNA-DNA中观察到15倍的荧光强度的增加,DNA-RNA中观察到22倍的荧光强度的增加。
此外,使用510nm的激发光代替488nm的激发光也能得到同样的结果。在图11中示出其光谱。
[实施例8:使linker的长度发生各种变化的化合物的合成以
及其作为荧光引物的使用]
使linker长度n发生各种变化地合成下述化学式113所示的化合物(DNA寡聚物)。合成中,除将原料5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)变为相应于linker长度而改变碳原子数(链长)的化合物以外,与前述实施例1~4及6采用同样进行。在本实施例中,下述化合物113的序列为5’-d(C GCAATXTAACGC)-3’(X为染料导入部分)。并且,将各化合物与实施例7一样作为荧光引物使用,通过荧光测定评价性能。其结果可确认:只要在如下所示的linker长度范围内,通过与目的核酸的杂交可获得比引物单链体接近约10倍或超过10倍的荧光增大。此外,通过引物和目的核酸得到的双链体表现出比天然序列的双链体更高的热稳定性。
[表1]
5′-d(CGCAATTTAACGC)-3′/5′-d(GCGTTAAATTGCG)-3′Tm(℃)58
5′-d(CGCAATTTAACGC)-3′/5′-r(GCGUUAAAUUGCG)-3′Tm(℃)46
测定条件:引物(化合物113)2.5μM,磷酸缓冲液50mM(pH7.0),NaCl 100mM,互补链2.5μM
荧光的最大波长是用488nm(1.5nm宽度)的光激发时的值。
量子效率以9,10-二苯基蒽为参照物质进行计算。
图12中示出实施例8中linker长度n=4时的吸收光谱。关注在400~600nm下的吸收,单链体状态时的吸收带与杂交后的吸收带相比出现在短波长一侧,明确显示单链体状态下的染料二聚物导致形成H缔合体。
此外,图13中同时示出实施例8中的linker长度n=4时的激发光谱和荧光发光光谱。该图中,左侧(短波长一侧))的曲线表示激发光谱,右侧(长波长一侧)的曲线表示荧光发光光谱。此外,该图中,附注的括号内分别表示激发光谱下参照的荧光发光的波长,荧光发光光谱下参照的激发波长。由激发光谱可知:荧光发光的吸收,只在图12的长波长一侧的吸收带,短波长一侧的吸收不参与荧光发光。就是说,明确显示激发子效果发挥控制荧光发光的作用。因此,荧光发光在杂交后加强,在单链体状态下极弱。由此,能明确区别杂交前后的状态。
[实施例9]
使linker长度n发生各种变化地合成下述化学式114所示的1分子中仅包含1个染料结构的化合物(DNA寡聚物)。合成中,除将原料5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)变为链长与linker长度相应的碳原子数(链长)的化合物和使用双(2-氨基乙基)甲基胺代替化合物102的合成中使用的三(2-氨基乙基)胺以外,与前述实施例1~4及6同样进行。n=3、4、5、6的化合物可以分别用同样的方法进行合成。
更具体而言,按照下述路线合成。下述路线是n=4的情况,n为其它数值的情况也同样合成。
(E)-5-(3-(2-(N-甲基-N-(2-(2,2,2-三氟乙酸纤维)乙基)胺基)乙氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)-2’-脱氧尿苷((E)-5-(3-(2-(N-Methyl-N-(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)-3-oxoprop-1-enyl)-2′-deoxyuridine)(102’)的合成
将1.19g(4.0mmol)的(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷101(分子量298.25)和921mg(8.0mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(分子量115.09)和1.53g(8.0mmol)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(分子量191.70)放入装有搅拌器的梨形烧瓶,加入1.0mL的DMF,在25℃下搅拌8小时。加入约1mL的醋酸,加入250mL的二氯甲烷和250mL的超纯水,剧烈搅拌。过滤产生的沉淀,用水洗涤,在减压下通宵干燥。将得到的白色残渣悬浮于100mL的乙腈中,剧烈搅拌。向其中一次性加入2.34g(20mmol)的N-甲基-2,2’-二胺基二乙基胺(分子量146.23,d=0.976),在25℃下再搅拌10分钟。之后,加入4.8mL(40mmol)的三氟醋酸乙酯(分子量142.08,d=1.194),5.6mL(40mmol)的三乙胺(分子量101.19,d=0.726)以及50mL的乙醇,在25℃下搅拌16小时。从得到的混合物中减压蒸馏去除溶剂,用硅胶柱提纯(10-20%MeOH/CH2Cl2)。从含有目的物的馏分中减压蒸馏去除溶剂,使其溶解于少量的丙酮中,加入乙醚后产生白色沉淀。过滤,用乙醚洗涤后,在减压下进行干燥,得到750mg(76%)的目的物(化合物102’)的白色粉末。下面示出仪器分析值。
化合物102’:
1HNMR(CD3OD)δ8.29(s,1H),7.17(d,J=15.6Hz,1H),6.97(d,J=15.6Hz,1H),6.21(t,J=6.3Hz,1H),4.40.4.36(m,1H),3.92.3.90(m,1H),3.80(dd,J=11.7,2.9Hz,1H),3.72(dd,J=11.7,3.4Hz,1H),3.37.3.25(m,5H),2.60.2.53(m,5H),2.33.2.19(m,5H):13CNMR(CD3OD)δ169.2,158.7(q,J=36.4Hz),151.2,143.7,143.6,134.1,122.2,117.5(q,J=286.2Hz),111.0,89.2,87.0,72.1,62.6,57.4,56.7,42.4,41.8,38.5,38.3:HRMS(ESI)calcd forC19H27F3N5O7([M+H]+)494.1863,found 494.1854。
[(E)-5-(3-(2-(N-甲基-N-(2-(2,2,2-三氟乙酰氨基)乙基)胺基)乙氨基)-3-氧代丙基-1-烯醇)-5’O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧尿苷-3’O-(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺((E)-5-(3-(2-(N-Methyl-N-(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)-3-oxoprop-1-enyl)-5′O-(4,4′-dimethoxytrityl)-2′-deoxyuridine 3′O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidite)(化合物104’)合成]
首先,将296mg(0.60mmol)的化合物102’(分子量494.19)与224mg(0.66mmol)的4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(分子量338.83)放入装有搅拌器的梨形烧瓶,加入4mL的吡啶,在25℃下搅拌2小时。加入1mL水,减压蒸馏去除溶剂,用硅胶柱进行提纯(1.5%MeOH以及1%Et3N/CH2Cl2)。浓缩含有作为目标物102’的三苯甲基化物(104’的中间体)的馏分,向残渣中加入饱和碳酸氢钠水溶液。用乙酸乙酯萃取前述混合物,再用饱和食盐水洗涤,在减压下进行干燥,得到了白色泡状三苯甲基化物(366mg,77%)。
1HNMR(CD3OD)δ7.94(s,1H),7.42.7.17(m,9H),7.01(d,J=15.6Hz,1H),6.95(d,J=15.6Hz,1H),6.86.6.83(m,4H),6.21(t,J=6.3Hz,1H),4.41.4.38(m,1H),4.09.4.06(m,1H),3.75(s,6H),3.40.3.30(m,6H),2.59(t,J=6.8Hz,2H),2.53(t,J=6.8Hz,2H),2.46.2.31(m,5H):13CNMR(CD3OD)δ169.2,158.7(q,J=36.4Hz),151.2,143.7,143.6,134.1,122.2,117.5(q,J=286.2Hz),111.0,89.2,87.0,72.1,62.6,57.4,56.7,42.4,41.8,38.5,38.3:HRMS(ESI)calcd for C40H45F3N5O9([M+H]+)796.3169,found 796.3166。
将159mg(0.20mmol)前述102’三苯甲基化物(分子量920.85)以及28.6mg(0.40mmol)1H-四唑(分子量70.05)置于圆底烧瓶内,用真空泵整晚进行抽气干燥。再向其中加入4.0mL的CH3CN溶解试剂后,进行搅拌,一次性加入191μL(0.60mmol)的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(分子量301.41,d=0.949),在25℃下搅拌2小时。用TLC确认反应结束后,加入饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯进行萃取,用饱和食盐水洗涤有机层后,用硫酸镁进行干燥。通过过滤除去硫酸镁,减压蒸馏去除溶剂后得到包含目的化合物104’的粗生成物。不对此组成物进行提纯直接用于DNA合成。此外,得到了化合物104’由前述粗生成物31PNMR(CDCl3)和HRMS(ESI)来确认。下面示出这些值。
化合物104’:
31PNMR(CDCl3)δ149.686,149.393:HRMS(ESI)calcdfor C49H61F3N7O10P([M+H]+)996.4248,found 996.4243。
DNA105’的合成与前述化合物105同样进行。下面示出仪器分析值。
DNA105’:
CGCAAT[105’]TAACGC,calcd for C133H174N51O76P12([M+H]+)4074.8,found 4072.0;
CGCAAT[105’][105’]AACGC,calcd for C140H187N54O77P12([M+H]+)4230.0,found 4228.9。
导入了噻唑橙的DNA114的合成与前述化合物113同样进行。下面示出仪器分析值。
CGCAAT[114](4)TAACGC,calcd for C156H194N53O77P12S(M+)4447.3,found 4445.6;CGCAAT[114](4)[114](4)AACGC,calcd for C186H228N58O79P12S2([M.H]+)4976.0,found 4976.9。
对合成的DNA寡聚物(ODN)中具有5’-d(CGCAAT[114](n)TAACGC)-3’序列的ODN(仅包含1个染料的引物),与实施例7及8同样观测荧光情况。在下述表2、图14及15示出其结果。图14表示吸收光谱,图15表示激发光谱及发光光谱。图15中,左侧(短波长一侧)的曲线表示激发光谱,右侧(长波长一侧)的曲线表示荧光发光光谱。此外,该图中,附注的波长分别表示激发光谱中参照的荧光发光的波长、荧光发光光谱中参照的激发波长。按照图示,因为化合物114在1个分子中只有1个染料结构,不形成H缔合体,因此不产生激发子效果(吸收光谱中观察不到向短波长一侧的移动)。因此,单链体状态下的荧光淬灭比具有2个染料结构的化合物弱,双链体和单链体的荧光强度比Ids/Iss比较小。但是,由于形成双链体所导致的染料嵌入,使得染料的结构平坦化,如下述表2所示,双链体状态比单链体状态得到更大的荧光强度。此外,对于单链体,将激发波长从488nm变为在UV吸收光谱中的λmax(有2个λmax时为长波长一侧),得到量子效率ΦF=0.120的测定结果。并且,对于DNA-DNA双链体,将激发波长从488nm变为在UV吸收光谱中的λmax(有2个λmax时为长波长一侧),得到量子效率ΦF=0.307,双链体和单链体的荧光强度比为Ids/Iss=3.4的测定结果。
[表2]
测定条件:引物2.5μM,磷酸缓冲50mM(pH7.0),NaCl100mM,互补链2.5μM
荧光的最大波长是用488nm(1.5nm宽)的光进行激发时的值。
以9,10-二苯基蒽为参照物计算量子效率。
[实施例10]
除用下述化学式115所示的化合物代替前述化合物107作为染料以外,与实施例9同样合成1分子中仅含有1个染料结构的化合物(DNA寡聚物)。使链长n从1~4发生各种变化地进行合成。序列与前述化合物105的序列5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(X为染料导入部分)相同。
下述化合物116是n=2时的情况。对化合物116与实施例7~9同样进行荧光强度的评价,发现DNA-RNA双链体的状态下比单链体状态下的荧光强度增加。
[荧光寿命测定]
对实施例8(染料2个)以及实施例9(染料1个)的DNA寡聚物(寡聚核苷酸),分别测定单链体和双链体状态下荧光强度的寿命。作为测定对照的DNA寡聚物在下述序列X的位置插入导入有染料的核苷酸。
5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(序列号1)
5’-d(GCGTTAAATTGCG)-3’(序列号2)
下述表3示出前述荧光寿命测定的结果。表中,T为荧光寿命(ns)。CHISQ为测定误差。T1表示从激发完成开始的经过时间。T2表示实施例8的染料2个的引物经过时间T1后进一步经过的时间,实施例9的染料1个的引物从激发完成开始的经过时间。T3表示经过时间T2后进一步经过的时间。表中,“%”所表示的数值为分别经过时间T1,T2或T3期间的荧光衰减率(将激发完成后的荧光强度设为100%),对各引物(DNA寡聚物)合计为100%。按照表3所示,包含染料2个的引物(实施例8)单链体状态下,为极短的猝灭过程(激发后经0.0210ns荧光衰减率81.54%),显示出激发子效果的存在。其它情况下没有发现。该用2个染料标记的ODN的单链体状态下的荧光猝灭,在荧光强度随杂交特异性且急剧的变化中发挥了关键作用。另外,按照表3可知,荧光猝灭特性与二次函数或三次函数特性一致。另外,对下述表3的染料2个的双链体再次在相同条件下测定(其中,省略了T 1测定)时,T2=2.05中的荧光衰减率为44%,T3=4.38的荧光衰减率为56%,T=3.33(ns),CHISQ=1.09,得到与下述表3极相近的值。即,可知该实施例的引物在该荧光寿命测定中的再现性优异。
[表3]
染料1个单链体 | 染料1个双链体 | 染料2个单链体 | 染料2个双链体 | |
T1 | - | - | 0.0210ns(81.54%) | 0.551ns(2.73%) |
T2 | 0.934ns(39.19%) | 1.58ns(24.63) | 1.28ns(8.99%) | 2.33ns(50.30%) |
T3 | 3.12ns(60.81) | 3.60ns(75.37%) | 3.76ns(9.48%) | 4.57ns(46.97%) |
T | 2.26 | 3.10 | 0.489 | 3.33 |
CHISQ | 1.32 | 0.96 | 1.11 | 1.04 |
在链2.5μM、磷酸缓冲液50mM(pH7.0)、NaCl 100mM、455nm(prompt)600nm(decay)下测定
[实施例11]
除用下述化学式115’所示化合物代替前述化合物107作为染料以外,与实施例8同样合成下述化学式117所示的DNA寡聚物。n=3、4、5、6的化合物可分别用同样的方法进行合成。进一步与实施例8同样作为荧光引物使用,通过荧光测定对性能进行评价。在下述表4中示出其结果。按照表4所示,化合物117与实施例8的DNA寡聚物(化合物113)吸收带不同,但同样显示出良好的激发子效果。这表明在本发明中使用吸收带不同的荧光引物可进行多色下的检测。
[表4]
[实施例12]
合成下述序列所示DNA寡聚物(化合物118)。X为具有与实施例9同样染料结构的核苷酸(下述式作为化学式118)。按照下述序列所示,该DNA寡聚物是2个导入有染料的核苷酸连续排列。染料的导入和DNA寡聚物的合成通过与前述各实施例同样的方法来进行。
5’-d(TTTTTTXXTTTTT)-3’(序列号3)
进一步,将该DNA寡聚物与前述各实施例同样作为荧光引物使用,通过荧光测定对性能进行评价。
引物2.5μM(链浓度),
磷酸缓冲液50mM(pH7.0),
NaCl 100mM,
互补链2.5μM(链浓度)。
在图16和17中示出其结果。图16为表示吸收光谱的图,图17为同时表示激发光谱和荧光发光光谱的图。图17中,左侧(短波长侧)的曲线表示激发光谱,右侧(长波长侧)的曲线表示荧光发光光谱。按照图示,像这样,2个导入有染料的核苷酸连续排列的情况下,染料间距离可以靠近而显示激发子效果,可通过荧光强度明确地对与目的核酸杂交前后的状态进行区分。
[实施例13]
对linker长度n和核酸序列进行各种改变来合成前述化学式113或114所示的化合物(DNA寡聚物)即下述表5所示的各ODN。另外“ODN”如前所述是指寡聚DNA(DNA寡聚物)。合成中,除将原料即5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)变为与linker长度相应的碳原子数(链长)的化合物、在寡聚DNA合成中适当改变序列以外,与前述实施例1~4、6、8、9或12同样进行。另外ODN1与实施例8中合成的寡聚DNA(DNA寡聚物)相同,ODN4和ODN5与实施例9中合成的寡聚DNA(DNA寡聚物)相同。在合成中,噻唑橙的N-羟基琥珀酰亚胺酯(化合物109)使用活性氨基的50当量或其以上。合成后,反相HPLC的展开时间根据需要为20~30分钟或其以上。另外,下面例如[113](n)或[114](n)表示在该位置插入化学式113或114所示的核苷酸。n为linker长度。另外,下述表5中ODN1’表示与ODN1互补的DNA链。同样,ODN2’表示与ODN2互补的DNA链,ODN3’表示与ODN3互补的DNA链。
[表5]
合成的各ODN与前述实施例4同样通过酶消化来决定浓度。进一步,合成的各ODN通过MALDI TOF MS谱图进行鉴定。以下示出其质量分析值。
ODN1(n=3),CGCAAT[113](3)TAACGC,calcd forC178H213N56O78P12S2([M.H]+)4820.7,found 4818.9;ODN1(n=4),CGCAAT[113](4)TAACGC,calcd for C180H217N56O78P12S2([M.H]+)4848.8,found 4751.4;
ODN1(n=5),CGCAAT[113](5)TAACGC,calcd forC182H221N56O78P12S2([M.H]+)4876.8,found 4875.6;
ODN1(n=6),CGCAAT[113](6)TAACGC,calcd forC184H225N56O78P12S2(([M.H]+)4904.9,found 4903.6;
ODN2,TTTTTT[113](4)TTTTTT,calcd forC184H227N34O92P12S2([M.H]+)4822.8,found 4821.4;
ODN3,TGAAGGGCTT[113](4)TGAACTCTG,calcd forC251H305N81O124P19S2([M.H]+)7093.2,found 7092.3;
ODN(anti4.5S),GCCTCCT[113](4)CAGCAAATCC[113](4)ACCGGCGTG,calcd for C377H456N116O173P27S4([M.3H]+)10344.9,found 10342.7;
ODN(antiB1),CCTCCCAAG[113](4)GCTGGGAT[113](4)AAAGGCGTG,calcd for C381H456N124O172P27S4([M.3H]+)10489.0,found 10489.8。
在前述表5的ODN中,对于包含序列和linker长度进行各种变化的[113](n)的ODN(ODN1、ODN2、ODN3),在与互补链杂交前后,分别对吸光谱图,激发光谱和发光光谱进行测定。将结果综合在下述表6、图18和图19中示出。
[表6]
测定条件:在2.5μM DNA,50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0),100mM氯化钠下以b488nm激发,
以cλmax激发(有2个λmax时,以长波长侧的λmax激发),
d双链体状态和单链体状态的λem的荧光强度比。
另外,表6中,ODN1(n=3~6)为与前述实施例8的寡聚DNA(5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’,X为染料113导入部分)相同的结构。其中,实施例8中,荧光量子效率ΦF和双链(双链体)状态和单链(单链体)状态的荧光强度比(Ids/Iss)以波长488nm激发进行测定,但该实施例(实施例13)中,如上所述,以UV吸收光谱中的λmax激发进行测定。因此,前述表1(实施例8)和前述表6(实施例13)中即使是相同物质,ΦF和Ids/Iss也不同。
图18是表示含有[113](4)的ODN的吸收光谱,激发光谱和发光光谱的图表。该图(a)、(b)和(c)中左侧的图表表示吸收光谱,横轴为波长,纵轴为吸光度。右侧的图表表示激发光谱和发光光谱,横轴为波长,纵轴为发光强度。各测定是以包含100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中的含[113](4)的ODN作为试样,在25℃下进行。图18中的各图表中,黑线表示单链体ODN(ss)的测定结果,灰线表示与对应的互补链DNA杂交的ODN(ds)的测定结果。
图18(a)表示ODN1(n=4)(2.5μM)的测定结果。激发光谱中,ss中测定波长534nm的发光强度,ds中测定波长528nm的发光强度。发光光谱中,ss中以波长519nm激发进行测定,ds中以波长514nm激发进行测定。
图18(b)表示ODN2的测定结果。左侧的图表中链浓度为2.5μM,右侧的图表中链浓度为1μM。激发光谱中,ss中测定波长534nm的发光强度,ds中测定波长537nm的发光强度。发光光谱中,ss中以波长517nm激发进行测定,ds中以波长519nm激发进行测定。
图18(c)表示ODN3的测定结果。链浓度为2.5μM。激发光谱中,ss中测定波长535nm的发光强度,ds中测定波长530nm的发光强度。发光光谱中,ss中以波长518nm激发进行测定,ds中以波长516nm激发进行测定。
图19为表示ODN1(n=3、5和6)的吸收光谱,激发光谱和发光光谱的图表。该图(a)、(b)和(c)中,左侧的图表表示吸收光谱,横轴为波长,纵轴为吸光度。右侧的图表表示激发光谱和发光光谱,横轴为波长,纵轴为发光强度。各测定将包含100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中的ODN1(n=3、5或6)作为试样,在25℃下进行。图19中的各图表中,黑线表示单链体ODN(ss)的测定结果,灰线表示与对应的互补链DNA杂交的ODN(ds)的测定结果。
图19(a)表示ODN1(n=3)(2.5μM)的测定结果。激发光谱中,ss中测定波长537nm的发光强度,ds中测定波长529nm的发光强度。发光光谱中,ss中以波长521nm激发进行测定,ds中以波长511nm激发进行测定。
图19(b)表示ODN1(n=5)(2.5μM)的测定结果。激发光谱中,ss中测定波长538nm的发光强度,ds中测定波长529nm的发光强度。发光光谱中,ss中以波长520nm激发进行测定,ds中以波长512nm激发进行测定。
图19(c)表示ODN1(n=6)的测定结果。链浓度为2.5μM。激发光谱中,ss中测定波长536nm的发光强度,ds中测定波长528nm的发光强度。发光光谱中,ss中以波长523nm激发进行测定,ds中以波长514nm激发进行测定。
按照表6、图18和图19所示,各含有[113](n)的ODN试样,在400~550nm范围内观测到2个吸收带。短波长侧(~480nm)的吸收带在含有1(n)的ODN试样为单链体状态时更强,长波长侧(~510nm)的吸收带在含有1(n)的ODN试样与互补链杂交时明显(优势性)显现。长波长侧(~510nm)的吸收带为噻唑橙单体的代表性的吸收带。发光光谱中,在~530nm观测到单一的宽的吸收带。通过含有[113](n)的ODN试样与互补链杂交,发光强度明显变化。即与目的DNA链杂交的含有[113](n)的ODN试样显示强的荧光,杂交前的含有[113](n)的ODN试样仅显示与杂交后相比极弱的荧光。特别是由多嘧啶序列形成的ODN2的荧光在单链(单链体)状态下基本完全猝灭。最大发光波长下的ODN2的双链(双链体)状态和单链(单链体)状态的荧光强度比(Ids/Iss)达到160。使20-mer的通常的ODN3’链与ODN3进行杂交的情况下,杂交前后发光强度明显不同。进一步按照表6、图18(a)和图19可知,将该实施例的ODN1中linker长度n从3变为6的情况下,任意的linker长度都得到大的Ids/Iss值。这样,表6所示的ODN由于引物的序列和linker长度而在猝灭性能上存在差异,但均显示出良好的猝灭性能。
另外,按照前述表6所示,ODN1(n=4)/ODN1’的融点(Tm)比天然双链体5’-CGCAATTTAACGC-3’/ODN1’上升7~9℃。该Tm值的上升表明引物中的2个阳离子性染料有效地结合在与目的序列一起形成的双链体上。进一步,按照图18和19可知,激发光谱与化合物的结构无关,在510nm附近显示单一的宽峰。该波长与吸收带的一个波长显示出良好的一致。即与荧光发光相关的吸收仅在510nm附近的吸收带,480nm附近的吸收带基本不影响发光。另外,从染料缔合导致吸收带从510nm的附近移动到480nm附近,可预测激发耦合能量为1230cm-1。这与被报道的花青染料的H缔合体的耦合能量同等。其中,这些理论的考察并不限定本发明。
[吸收光谱]
在各种温度和浓度下,测定前述ODN1(n=4)的吸收光谱以确认温度和浓度对吸收带的影响。图20的吸收光谱中表示出该结果。该图(a)和(b)中,横轴为波长,纵轴为吸光度。各测定将包含100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中的ODN1(n=4)作为试样来进行。
图20(a)表示改变溶液温度时的吸收光谱变化。ODN浓度为2.5μM。谱图从10℃起,至90℃,每隔10℃进行测定。
图20(b)表示改变溶液浓度时的吸收光谱变化。测定温度为25℃。ODN浓度为0.5,0.75,1.0,1.2,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0和5.0μM。
另外,插入图为表示波长479nm下的吸光度的对数(纵轴)与波长509nm下的吸光度的对数(横轴)的关系的图表。
按照图20(a)所示,改变试样温度进行测定时,2个吸收带的吸光度比发生若干变化。即随着试样温度的上升,479nm的吸收带逐渐减少,509nm的吸收带增大。但是,该变化按照该图可知极微弱。这表明,在本发明的引物的ODN1(n=4)中,伴随温度变化的结构变化极微弱,可基本上不受温度影响地使用。另外,按照该图所示,487nm下,观测到等吸收点,该点显示2个光谱构成要素的存在。
另一方面,按照图20(b)所示,增加ODN1(n=4)的试样浓度时,在两方的吸收带中观测到吸光度的增加。另外,按照插入图所示,以log(Abs479)对log(Abs509)作图,即各吸收带中的吸光度的对数的比显示为直线。这表明2个光谱构成要素的比与ODN浓度无关,而是基本为一定。即,本发明的引物的ODN1(n=4)由于即使改变溶液中的浓度,结构也基本不变,可在浓度上不受影响地使用。
另外,图20(a)和(b)的谱图变化的主要原因可进行如下说明,但这些说明为理论考察的一例,并不限定本发明。即,首先,ODN1(n=4)通过双色性系统而形成分子内H缔合体。图20(a)中的谱图变化推测为是由于温度上升,导致H缔合体的结构发生若干松弛。另外,认为:前述分子内H缔合体已在分子内完成(在分子内未形成H缔合体),因此即使浓度上升,也基本没有分子间相互作用等导致的结构变化,如图20(b)和插入图所示,2个光谱构成要素的比基本为一定。另外,认为在ODN1(n=4)的试样溶液中存在分子内H缔合体和染料单体(染料部分未缔合)的2个构象模式。短波长侧(479nm)的吸收带推测来自于分子内H缔合体。长波长侧的吸收带(509nm)由于加热而增大,因此推测其来自于染料单体。
[CD光谱]
对ODN1(n=4)/ODN1’的CD光谱进行测定。链浓度为2.5μM,在包含100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中、25℃下进行测定。在图21的CD光谱中示出其测定结果。该图中,横轴为波长(nm),纵轴为角度θ。按照图示,ODN1(n=4)/ODN1’双链体表示450~550nm中分裂型的Cotton效果(split-effect)。即,进行测定的CD对显示出噻唑橙染料嵌入DNA双链体时的代表性的图案。即ODN1(n=4)的染料部分嵌入形成的双链体DNA,强烈阻碍二色性缔合体(H缔合体)的形成。该CD测定的结果加上前述Tm测定结果表明:ODN1(n=4)中的染料部分与双链体DNA结合时,2个染料部分都嵌入大沟,形成热学上稳定的双链体结构。但是,该理论的考察不对本发明进行限定。形成的双链体结构在热学上稳定,这表明本发明的引物(核酸)可在互补的序列的检测中有效地使用。
[实施例14]
对前述ODN5(CGCAAT[114](4)[114](4)AACGC)双链体状态和单链体状态的吸收光谱、激发光谱和发光光谱进行测定。其结果在下述表7和图22中示出。
[表7]
测定条件:在2.5μM DNA,50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0),100mM氯化钠下,以b488nm激发,
以cλmax激发(有2个λmax时,以长波长侧的λmax激发),
d双链体状态和单链体状态的λem的荧光强度比。
图22是表示ODN5即含有[114](4)的ODN的吸收光谱、激发光谱和发光光谱的图表。ODN5的链浓度为2.5μM,在包含100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中、25℃下进行测定。黑线表示单链体ODN5(ss)的测定结果,灰线表示与ODN1’杂交的双链体ODN5(ds)的测定结果。(a)为吸收光谱,横轴为波长,纵轴为吸光度。(b)为激发光谱和发光光谱,横轴为波长,纵轴为发光强度。激发光谱中,对ss测定了波长534nm的发光强度,对ds测定了波长514nm的发光强度。发光光谱中,对ss以波长528nm进行激发,对ds以波长519nm激发。
按照前述表7和图22所示,2个[114](4)核苷酸相连的序列的ODN5的发光抑制与仅包含一个含有[114](4)核苷酸的单链体ODN4(前述实施例9的表2)相比,显示出更有效的荧光猝灭。ODN5的吸收光谱,在单链体状态下,吸收带向短波长侧移动。这表明ODN5所包含的2个[114](4)核苷酸形成分子内H缔合体。该缔合与用含有[113](n)的ODN观测的相同,关系到单链体ODN5的猝灭。即,认为:ODN5内的2个[114](4)核苷酸的染料部分由于H缔合而在前述染料间发生激发耦合,这是荧光发光抑制(猝灭)的原因。由此确认包含2个[114](4)核苷酸的ODN5与含有[113](n)的ODN同样在互补链检测有用。
[实施例15]
用肉眼对ODN1(n=4)与互补的ODN1’杂交时的荧光进行测定。图23示出其测定结果。该图左组是包含ODN1(n=4)单链体的组,该图右组是包含ODN1(n=4)/ODN1’双链体的组,分别表示照射150W卤素灯后的状态。各组中的链浓度分别为2.5μM,磷酸缓冲液(磷酸钠缓冲液)50mM(pH7.0)并包含NaCl 100mM。按照图示,照射150W卤素灯后,包含ODN1(n=4)单链体的图左组基本未发出荧光,但包含ODN1(n=4)/ODN1’双链体的图右组显示极明显的淡绿色的荧光。另外,即使将互补的DNA链ODN1’换成对应的互补的RNA链也得到同样的结果。进一步,ODN2和ODN2’也得到同样的结果。进一步,在ODN2和ODN2’的情况下,即使将ODN2’换成对应的互补的RNA(A13聚体)也得到同样的结果。另外,这些情况下的链浓度为5μM。另外,此外对前述表6的全部ODN得到相同的结果。这样,根据该实施例的ODN,由于依赖荧光强度而明显变化,可杂交的目的序列通过裸眼可容易地判定。这表明这些ODN在可视性基因分析中有用。
[实施例16]
除使用下述化学式119所示化合物代替前述化合物107作为染料以外,与实施例8同样合成下述化学式120所示DNA寡聚物。
可以分别用同样的方法合成上述式120中N=3、4、5和6的化合物(寡聚DNA)。进一步,将序列5’-d(CGCAAT[120](5)TAACGC)-3’所示ODN(ODN6(n=5))用作荧光引物,测定吸收光谱和荧光发光光谱进行性能评价。测定条件与实施例7同样。在图24中示出其测定结果。图24(a)为吸收光谱,横轴为波长(nm),纵轴为吸光度。图24(b)为荧光发光光谱,横轴为波长(nm),纵轴为发光强度。黑线表示单链体ODN的谱图,灰色的线表示互补的ODN杂交形成的双链体ODN的谱图。按照图24(a)所示,双链体ODN通过双螺旋形成,600nm附近的UV吸收的最大波长发生移动。另外,按照图24(b)所示,双链体ODN比单链体荧光强度大幅度增加。由这些事实,可认为单链体状态下表现出激发子效果。即该实施例的ODN(化合物120)与实施例8的ODN(化合物113)和实施例11的ODN(化合物117)吸收带不同但同样显示出良好的激发子效果。这表明本发明中使用吸收带不同的荧光引物,可用多色检测。
[实施例17:与RNA的双链体形成]
在温箱中,使前述ODN2(序列5’-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3’)与其对应的互补的RNA链(RNA A13mer)形成双链体ODN,测定荧光发光光谱。进一步,在其中添加RNaseH,观察谱图的变化。在图25中示出其结果。该图中,横轴为时间,纵轴为荧光强度。图中,黑线表示在中途添加RNase H的前述双链体ODN的谱图变化,灰色的线表示对照,即表示未添加RNase H的前述双链体ODN的谱图变化。在37℃下边搅拌边使用前述荧光分光器进行测定。按照图示,当添加RNaseH后,与前述ODN2杂交的RNA被消化,前述ODN2重新成为单链体,由此荧光强度逐渐减少。
[实施例18]
改变相对于前述ODN1(n=4)(序列5’-d(CGCAAT[113](4)TAACGC)-3’)为互补DNA链的ODN1’(序列5’-d(GCGTTAAATTGCG)-3’)的浓度比,观测荧光发光强度的变化。作为测定条件,将ODN1(n=4)的链浓度固定在1.0μM,磷酸缓冲液50mM(pH7.0)、NaCl 100mM、激发波长为488nm(1.5nm宽度)。在互补链ODN1’的浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0或3.0μM的各浓度下,分别进行测定。在图26中示出其测定结果。该图中横轴表示相对于ODN1(n=4)的ODN1’的当量数。纵轴表示荧光λmax(529nm)下的荧光发光强度(相对值)。按照图示,荧光发光强度在ODN1’的当量数为1以下时,相对于前述当量数以极高的精度显示正比例关系,在前述当量数超过1后没有变化。这表明ODN1(n=4)于ODN1’正确地以1∶1的物质量比(分子数比)进行杂交。
如上所述,ODN1’(目的DNA)的物质量与ODN1(n=4)为同量以下时,荧光强度对目的DNA的浓度成比例地增大。ODN1(n=4)由于也可以作为例如探针使用,在存在ODN1’(目的DNA)的体系中,若添加过量的ODN1(n=4)(探针),则通过荧光强度测定可对前述目的DNA进行定量。另外,通过追踪前述荧光强度的增加和减少还可测定前述目的DNA的增加和减少。
为了对体系中的前述目的DNA进行定量,可以例如图26那样,预先制作工作曲线。例如,ODN1’(目的DNA)浓度未知的试样与该实施例在相同条件下进行测定时的荧光强度为80,则从图26可知前述ODN1’(目的DNA)浓度为约0.55μM。
实际应用中,通过在上述方法中,对核酸中的ODN1’(目的DNA)序列进行定量,在马上检测该序列发生扩增·分解·蛋白结合等现象的同时,可以对这些现象量进行定量。
[参考例1:点印迹解析]
为了观察此次合成的新型荧光DNA寡聚物的、杂交引起的荧光特性变化,使用前述ODN(antiB1)和ODN(anti4.5S),通过点印迹进行DNA解析。目的DNA序列使用包含B1 RNA序列的短链DNA片段。该序列是啮齿类基因组中的一个短分散型核内折叠序列。另外,前述短链DNA片段包含4.5S RNA序列。该序列是从啮齿类细胞分离的一个低分子核内RNA,与B1家族具有广泛的同源性。该参考例中制备ODN(antiB1)和ODN(anti4.5S)作为印迹用的DNA寡聚物,通过在这些中整合2个[113](4)核苷酸而具有高灵敏度和高荧光强度。另外DNA寡聚物ODN(antiB1)和ODN(anti4.5S)的结构按照前述实施例13的表5中的记载。
该参考例的点印迹解析更具体而言如以下这样进行。即,首先通过前述DNA自动合成仪制备下述(1)和(2)的2个DNA片段。
(1)包含下述4.5S RNA序列和其互补DNA的DNA双链体。
5’-d(GCCGGTAGTGGTGGCGCACGCCGGTAGGATTTGCTGAAGGAGGCAGAGGCAGGAGGATCACGAGTTCGAGGCCAGCCTGGGCTACACATTTTTTT)-3’(序列号11)
(2)包含下述B1 RNA序列和其互补DNA的DNA双链体。
5’-d(GCCGGGCATGGTGGCGCACGCCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATTTCTGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGTGAG)-3’(序列号12)
前述DNA双链体在含有0.5M氢氧化钠和1M氯化钠的水溶液中变性。将一定分量该变性DNA点在正电荷尼龙膜(Roche公司)上(点样)。将该正电荷尼龙膜片在含有0.5M磷酸钠和1M氯化钠水溶液中浸湿后,在含0.5M磷酸钠、1M氯化钠和100μg/mL鲑鱼精子DNA的水溶液中、50℃下孵育30分钟。然后,将前述正电荷尼龙膜片在包含0.5M磷酸钠和1M氯化钠的DNA寡聚物水溶液(DNA寡聚物为150pmol的ODN(anti4.5S)或ODN(antiB1))中在50℃下孵育1小时。将其冷却到室温后,除去杂交缓冲液,并加入新的磷酸缓冲液,通过BioRad公司的VersaDoc imaging system(商品名)观测前述正电荷尼龙膜片所发出的荧光。作为激发光,使用和研药株式会社的UV透射照明器(trans-illuminator)Model-2270(商品名)所发出的光通过UV/蓝色光转换板(Converter Plate)(UVP)而变换的光。
在图27中示出测定结果。
图27(a)为表示在尼龙膜上不同序列的DNA印迹的状态的示意图。上段的4个斑点显示含4.5S RNA序列的DNA,下段的4个的斑点表示含B1 RNA的DNA。
图27(b)为表示在含ODN(anti4.5S)溶液中孵育后的荧光发光的图。
图27(c)为表示在含ODN(antiB1)溶液中孵育后的荧光发光的图。
按照图27所示,印迹斑点的荧光在印迹分析后,可不进行反复洗涤而在室温下用荧光成像装置读取。孵育前述探针的结果,若添加了ODN(anti4.5S)则得到来自4.5S序列的斑点的强的荧光发光,但来自B1序列的斑点的荧光发光为可忽视的程度。对照性地,通过ODN(antiB1)添加,B1斑点显示强的荧光,从4.5S斑点仅观测到极弱的荧光。像这样,通过该参考例中制备的DNA寡聚物在印迹后在不需要多级的复杂的洗涤工序和抗体或酶处理工序这点上,可实现与现有的印迹分析明显不同的分析。另外,与分子信标等on-off寡聚物不同,本发明中的DNA寡聚物容易导入多个荧光性染料标记部分,由此可进一步提高荧光强度。这是本发明较大的优点。前述荧光性染料标记部分例如可以像该参考例那样包含[113](4)核苷酸。这样,通过该参考例对组合有2个[113](4)核苷酸的DNA寡聚物通过与目的DNA片段的杂交导致荧光特性变化进行了确认,同样可知还可将组合2个[113](4)核苷酸的DNA寡聚物用作引物。
[参考例2]
将包含实施例8中的linker长度n=4的染料的多聚T DNA寡聚物(前述ODN2)通过使用小玻璃管的微注射(microinjection)法导入细胞,通过具备汞灯和冷却CCD照相机和荧光滤镜(YFP用)的倒立型显微镜测定荧光发光。图28~30中示出其结果。图28为微分干涉测定时的照片,图29为荧光观察时的照片,图30为图28和图29的叠加。按照图示,本发明的荧光DNA寡聚物(标记物质)与在细胞内表达的mRNA的多聚A末端序列结合而发光。即,本发明中的标记DNA寡聚物不仅检测试管内基因有效,检测生物体内基因也有效。
[参考例3]
进一步,通过常规方法使常用的荧光染料Cy5结合到前述ODN2(序列5’-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3’)上,进而用前述方法将其导入细胞。这里,在合成前述ODN2的过程中,通过DNA自动合成仪将Cy5追加到前述ODN2的5’末端而结合(序列5’-Cy5-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3’)。荧光发光通过激光扫描共聚焦显微镜进行测定。在图31中示出其结果。图31A表示通过633nm激发、获得650nm以上的荧光、且为来自Cy5的荧光。图31B表示通过488nm激发而获得505-550nm的荧光、且来自2个噻唑橙部分的荧光。按照图示,ODN2与在细胞内表达的mRNA的多聚A末端序列结合而发光。由此可追踪细胞内mRNA的分布。本发明的化合物或核酸可以像这样导入多种的染料(显示荧光性的原子团)。像这样例如由于各染料的荧光的λmax不同,还可通过多色进行检测。
[参考例4]
用前述的方法将前述ODN2(序列5’-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3’)注入细胞核,从即刻(0秒后)到约4分半钟后通过前述激光扫描共聚焦显微镜追踪荧光发光(激发488nm,获得荧光505-550nm)。在图32中示出其结果。该图分成11个图,从左到右、从上向下表示ODN2注入后的经过。各图中的经过时间(ODN2注入后)按照下述表8。按照图示可确认ODN2注入后即刻集中在细胞核中但随着杂交的mRNA(多聚A)逐渐分散到细胞整体。根据本发明还可像这样追踪mRNA。
[表8]
0秒 | 8秒 | 38秒 | 68秒 |
98秒 | 128秒 | 158秒 | 188秒 |
218秒 | 248秒 | 278秒 | - |
[参考例5]
合成将前述ODN2中[113](4)的两侧的T分别增加到24个的ODN。将其设为ODN7。合成与ODN2合成方法同样进行。另外,ODN7的序列为5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[113](4)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)-3’)(序列号13)。将其用与实施例22同样的方法注入细胞核,测定荧光强度定。在图33中表示经过一定时间后的荧光照片。ODN7注入后即刻集中在细胞核,但与实施例22同样随着杂交的mRNA(多聚A)逐渐分散到细胞整体,最终像图33那样在细胞核周围呈现分散的状态。
[参考例6:通过多色(multi color)的检测]
按照实施例11、16等的叙述,本发明中的荧光DNA寡聚物通过改变吸收波长、发光波长等,由此可通过多色进行互补链检测。该通过多色的检测可以像例如前述化合物113、117和120那样通过改变染料(显示荧光性的原子团)部分的结构而实现。该参考例中进而合成多种荧光DNA寡聚物进行通过多色的互补链检测。
首先,合成包含下述式(121)所示核苷酸结构的DNA链(荧光DNA寡聚物)且这些DNA链对染料(显示荧光性的原子团)部分的结构进行了各种改变。下述式(121)中“Dye”是指染料部分。
具体而言,合成了前述式(121)中“Dye”的部分分别为下述式所示化合物(DNA链)113、120、122、123和124的DNA链。n分别为linker长度(碳原子数)。分别合成化合物113、120、122、123和124中n=3、4、5和6的化合物。合成方法除分别用对应的结构的染料代替前述染料107以外,与前述实施例1~4、6、8、9、12、13或16同样进行。代替前述染料107的染料合成也除了适当改变原料的结构以外与前述染料107合成(前期实施例6的路线5)同样进行。另外,化合物113和120分别为与前述各实施例的化合物113和120相同的结构。
对上述化合物113、120、122、123和124分别合成序列5’-d(CGCAATX(n)TAACGC)-3’所示的ODN。X为113、120、122、123或124。n为linker长度。序列5’-d(CGCAAT[113](n)TAACGC)-3’所示的ODN与前述ODN1相同。序列5’-d(CGCAAT[120](n)TAACGC)-3’所示的ODN与前述ODN6相同。将序列5’-d(CGCAAT[122](n)TAACGC)-3’所示的ODN设为ODN8。将序列5’-d(CGCAAT[123](n)TAACGC)-3’所示的ODN设为ODN9。序列5’-d(CGCAAT[124](n)TAACGC)-3’所示的ODN设为ODN10。分别合成ODN1、ODN6、ODN8、ODN9和ODN10中n=3、4、5和6的ODN。
ODN1(n=4)、ODN6(n=4)、ODN8(n=4)、ODN9(n=4)和ODN10(n=4)分别与作为互补链的ODN1’形成双链体后,对荧光发光光谱进行测定。除激发波长以外的测定条件与前述各实施例同样。其结果在下述表9中示出。下述表9中,Ex表示激发波长,Em表示荧光发光的最大波长。另外,激发波长Ex与吸收的最大波长λmax基本相等。
[表9]
从表9可知,各ODN在形成双链体时,在从456nm到654nm的较宽波长范围内,分别显示出不同的荧光发光的最大波长Em。即,使用该实施例(实施例24)中合成的ODN可进行通过多色的互补链DNA的检测。进一步,确认该实施例的化合物(DNA链)113、120、122、123和124、ODN1、ODN6、ODN8、ODN9和ODN10可以与前述各实施例同样使用,可用多色进行所有的互补链RNA的检测、点印迹解析、细胞内mRNA的检测等。
[实施例19]
使用包含本发明的标记引物的SMAP用成套引物进行EGFRexon21的突变L858R(2573T>G)的检测。
(1)模板DNA、细胞系
模板DNA从包含exon21点突变L858R的肺癌细胞系NCL-H1975中提取(American Type Culture Collection)。前述细胞系为对各突变具有1个正常的等位基因的杂合子(heterozygote)。从前述细胞系按照常规方法进行基因组DNA的提取,并稀释至40ng/μL。将其称为完全匹配检测用的模板DNA。另外,作为错配检测用的模板DNA使用对exon21等位基因为野生型纯合子的人基因组DNA(Promega公司生产)。另外,使用将这些模板DNA在98℃下进行加热处理3分钟然后迅速冷却物质,用于后述的分析。
(2)引物
作为SMAP用成套引物准备4种引物。将这些引物再加上包含exon21中的目的核酸序列的区域(目的区域)在图34中示出。该图中,A为前述目的区域(序列号14)、B为Folding Primer(FP;第2引物;序列号15)、Turn-back Primer(TP;第1引物;序列号16)、Boost Primer(BP;第三引物;序列号17)和Outer Primer2(OP2;序列号18)。在该图A中,下划线FP中的小写“g”为检测目的的突变,在野生型的情况下,该部位为小写“t”。该图A中,下划线处FP为Folding Primer的3’末端所包含的序列。该图A中,虚线框TP1为Turn-back Primer的5’末端所包含的序列,虚线框TP2的互补链为Turn-back Primer的3’末端所包含的序列。另外,该图A中下划线处BP为Boost Primer的序列,该图B中下划线处BP的用粗体表示的核苷酸残基(T)为用后述的荧光性原子团标记的碱基(标记结构)。另外,该图A中,下划线处OP2的互补链为Outer Primer2的序列。
前述FP设计为突变检测用探针,其3’末端的第3个核苷酸残基与目的的突变部位具有同源性。模板DNA上存在目的的变异的情况下,包含前述变异的区域与突变检测用的FP在变异碱基部位同源,发生从该引物FP起始的延伸不会被阻碍。
该实施例中,如前所述,将Boost Primer作为标记引物。该标记引物,在图34B的Boost Primer中,前述标记化的核苷酸残基的结构用前述式(121)表示,前述式(121)中“Dye”部分分别用前述参考例6中的前述式(113)表示(噻唑橙)。前述式(113)中,linker长度为n=4。前述式(113)所示的荧光性原子团的检测波长为激发波长510nm/荧光波长530nm。该标记引物除作为序列号17的寡聚物以外,用与前述实施例8和参考例6同样的方法进行合成。
(3)SMAP反应
制备25μL下述组成的反应液,使其在60℃下进行反应。前述反应中,边维持60℃的等温状态,边通过Mx3005P system(商品名、Stratagene公司生产)实时监视反应液的荧光强度。另外,作为比较例,使用相同序列的未标记Boost Primer来代替进行标记的Boost Primer(标记引物),且下述反应液中除添加检测用的作为嵌入剂SYBR(注册商标)GreenI(Moleculor Probes,Inc)以外,同样实时监视荧光强度。另外,前述嵌入剂添加到反应液中,使其成为10万倍稀释。
[表10]
反应液组成
Tris-HCl(PH8.0) 20mM
KCl 10mM
(NH4)2SO4 10mM
硫酸镁 8mM
Tween20 0.1%
氨基乙酸甜菜碱 0.6M
dNTPs 1.4mM
引物4种 FP 2.0μM
TP 2.0μM
BP 1.0μM
OP 0.25μM
AacDNA聚合酶* 6单位
基因组DNA 40ng
共25μL
*Kabushiki Kaisha DNAFORM生产
荧光强度的检测以结合FAM的波长(激发波长492nm/荧光波长516nm)和Hex的波长(激发波长535nm/荧光波长555nm)的波长范围进行。由此,对标记引物的荧光强度(实施例)和SYBR(注册商标)GreenI的荧光强度的两方进行测定。将这些结果在图35和图36中示出。(在图中,1循环表示1分钟。)图35为表示通过SMAP法进行等温扩增时的扩增概况的图表,图36为其部分的放大图。该图A和B中,a-●为使用完全匹配检测用的模板DNA和标记引物(标记BP)的等温扩增反应的结果;b-■为使用错配检测用的模板和标记引物(标记BP)的等温扩增反应的结果;c-▲为使用完全匹配检测用的模板DNA和SYBR(注册商标)GreenI的等温扩增反应的结果;d-◆为使用错配检测用的模板和SYBR(注册商标)GreenI的等温扩增反应的结果。
如该图所示,可以确认:使用SYBR(注册商标)GreenI的比较例(▲、◆)从25循环附近开始,在完全匹配(▲)和错配(◆)之间荧光强度有显著性差异。具体而言,比较达到平台的荧光强度,完全匹配(▲)为错配(◆)的约1.4倍左右的荧光强度。与此相反,可以确认使用标记引物的实施例(●、■)中,从36循环附近开始,完全匹配的荧光强度的急剧增加,可以确认完全匹配(●)和错配(■)之间有极大的差异。具体而言,例如比较50循环附近的荧光强度时,完全匹配(●)为错配(■)的约7.3倍左右的荧光强度。这即使通过目视也可充分确认其不同。根据本发明,如该图所示,完全匹配的荧光强度极高,因此可以说也可通过目视确认变异。另外,如图35的放大图即图36所示,实施例的错配(■)的荧光强度比比较例的错配(◆)的荧光强度低,因此根据实施例可知可降低背景。认为这是由于可以排除在使用SYBR(注册商标)GreenI等嵌入剂时也可以看出的,核酸试样所包含的DNA引起的荧光;不包含目的序列的区域的非特异性地扩增引起的荧光。另外,错配即使通过60分钟的反应也没确认其扩增。从以上的结果,可以说根据本发明可以极高的灵敏度确认目的核酸序列的扩增以及有无变异。
[实施例20]
使用包含本发明的标记引物的SMAP用成套引物,进行人流感H3N2亚型中的野生型和Tamiflu耐性变异型的检测。
(1)模板DNA
从东京大学medical center获得具有H3N2亚型的野生型复制片段的质粒和具有119号的谷氨酸变成缬氨酸的变异型复制片段的质粒。且由H3N2亚型的RNA通过RT-PCR扩增作为模板的质粒DNA。得到的质粒DNA在95℃下加热5分钟,作为模板DNA以供后述分析。
(2)引物
准备以下所示的6种引物作为SMAP用成套引物。这些引物再加上包含H3N2亚型中的目的核酸序列的区域(目的区域)在图37中示出。该图中,A为表示野生型的目的区域(序列号19)和变异型的目的区域(序列号20)的简图。该图中,B为Turn-back Primer(TP;第1引物;序列号21)、Folding Primer(FP;第2引物;序列号22)、野生型用Boost Primer(BPw;第三引物;序列号23)、变异型用Boost Primer(BPm;第三引物;序列号24)、Outer Primer1(OP1;序列号25)和Outer Primer2(OP2;序列号26)。该图A中,在野生型的情况下,119E(wild)的下划线BPw处的小写“a”为检测目的的碱基;在变异型的情况下,119V(mutant)的下划线处BPm中的小写“t”为检测目的的碱基。该图B中,119E(野生型)的BPw中从3’末端开始的第2个碱基“T”为与检测目的的突变(A)互补的碱基,119V(变异型)的下划线BPm中从3’末端开始的第2个碱基“A”为与检测目的的突变(T)互补的碱基。该图A中虚线框TP1的互补链为Turn-back Primer的5’末端所包含的序列,虚线框TP2为Turn-backPrimer的3’末端所包含的序列。该图A中,下划线处FP的互补链为Folding Primer的3’末端所包含的序列。另外,该图A中,下划线处BPw的互补链为野生型用Boost Primer的序列,下划线处BPm的互补链为变异型用Boost Primer序列。另外,该图A中,下划线处OP1为Outer Primer1序列,下划线处OP2的互补链为Outer Primer2序列。
该实施例中,将野生型和变异型的Boost Primer作为标记引物。图37中,BPw和BPm的划有下划线的粗体字的核苷酸残基(T)分别为用荧光性原子团进行标记的碱基(标记结构)。前述野生型Boost Primer中,前述标记的核苷酸残基的结构用前述式(121)表示,前述式(121)中,“Dye”部分分别用前述参考例6中的前述式(113)表示。前述式(113)中,linker长度为n=4。前述式(113)所示的荧光性原子团的检测波长为激发波长510nm/荧光波长530nm。另外,前述变异型Boost Primer中,前述标记的核苷酸残基的结构用前述式(121)表示,前述式(121)中,“Dye”部分分别用前述参考例6中的前述式(120)表示。前述式(120)中,linker长度为n=4。前述(120)所示的荧光性原子团的检测波长为激发波长630nm/荧光波长650nm。这些标记引物除分别将碱基序列设为序列号23(BPw)和序列号24(BPm)以外,用与前述实施例8或参考例6同样的方法进行合成。
(3)SMAP反应
在冰上制备25μL下述组成的反应液,并在60℃下反应。前述反应中,边维持60℃的等温状态,边通过Mx3005P system(商品名,Stratagene公司生产)实时监视反应液的荧光强度。荧光强度的检测以FAM的波长(492nm-516nm)和Cy5的波长(635nm-665nm)作为检测波长范围。由此对标签化的各BoostPrimer的荧光强度进行测定。通过FAM波长可以检测野生型检测用的BPw的荧光原子团,通过Cy5波长可以检测变异型检测用的BPm的荧光原子团。前述反应液中的模板DNA的种类和比例以及Boost Primer的种类和比例在下述表12中示出(实施例20-1~20-2)。下述表12中示出前述反应液中的Boost Primer中的野生型检测用和变异型检测用的浓度、模板DNA中的野生型和变异型的拷贝数。这些结果在图38~41中示出。在图中,1循环表示1分钟。
[表11]
反应液组成
Tris-HCl(PH8.0) 20mM
KCl 10mM
(NH4)2SO4 10mM
硫酸镁 8mM
Tween20 0.1%
氨基乙酸甜菜碱 0.6M
dNTPs 1.4mM
引物FP 2.0μM
TP 2.0μM
BP 1.0μM
OP1 0.25μM
OP2 0.25μM
AacDNA聚合酶* 6单位
模板DNA(质粒) 6000拷贝
共25μL
*Kabushiki Kaisha DNAFORM生产
[表12]
图38为表示实施例20-1的反应液a到d进行等温扩增时的扩增概况的图表。该图A为对使用野生型检测用Boost Primer的实施例20-1的反应液a和b分别用FAM的波长(492nm/516nm)和Cy5的波长(635nm/665nm)的检测荧光强度的结果;该图B为对使用变异型检测用Boost Primer的实施例20-1的反应液c和d分别用FAM的波长(492nm/516nm)和Cy5的波长(635nm/665nm)的检测荧光强度的结果。该图A和B中■和□表示野生型DNA(野生型质粒)的结果,●和○表示变异型DNA(变异型质粒)的结果。如该图A所示可以确认:使用野生型检测用Boost Primer的情况下,与野生型检测用Boost Primer为完全匹配的野生型DNA(■)从27循环附近开始在FAM的波长下,荧光强度急剧增加。与此相对,与野生型检测用Boost Primer为错配的变异型DNA(●)即使到45循环也不能确认荧光强度的增加。另外,这些2个反应液中,在Cy5的波长下没能确认荧光强度的增加(□和○)。另一方、如该图B所示,可以确认使用变异型检测用Boost Primer的情况下,与变异型检测用BoostPrimer为完全匹配的变异型DNA(○)从27循环附近开始在Cy5的波长下,荧光强度的急剧增加。与此相对,与变异型检测用Boost Primer为错配的野生型DNA(□)即使到45循环也没能确认荧光强度的增加。另外,这2个反应液情况下,在FAM的波长下没能确认荧光强度的增加(■和●)。由这些结果可知,使用野生型检测用Boost Primer在FAM的波长下可进行野生型DNA的检测,进而使用变异型检测用Boost Primer在Cy5的波长下可进行变异型DNA的检测。另外,这些结果即使通过目视也可充分确认其不同(下面同样)。
图39为表示对实施例20-1的反应液e和f,进行等温扩增时的扩增概况的图表。前述反应液中,作为Boost Primer,包括野生型检测用和变异型检测用的两方。该图中■、□、●和○表示与图38同样的结果。如图39所示,可以确认:包含野生型DNA的反应液e在FAM的波长下、从27循环附近开始,荧光强度的急剧增加(■)。与此相对,可以确认:在Cy5的波长下、即使在45循环也没能确认荧光强度的增加(□)。另一面,可确认:包含变异型DNA的反应液f,在Cy5的波长下,从29循环附近荧光强度急剧增加(○)。与此相对,FAM的波长下,即使45循环也没有荧光强度的急剧增加,根本不能确认扩增(●)。由这些结果可知,可通过使用野生型检测用Boost Primer和变异型检测用Boost Primer两方,在一个反应液中实施FAM波长下野生型的检测和Cy5的波长下变异型的检测。
图40为表示对实施例20-1的反应液b、c、e、f进行等温扩增时的扩增概况的图表。可以确认:使用野生型检测用BoostPrimer的反应液b,从50循环附近开始野生型检测用BoostPrimer的变异型DNA的错配的扩增(■)。另外,可以确认:使用变异型检测用Boost Primer的反应液c,从52循环附近开始变异型检测用Boost Primer的野生型DNA的错配的扩增(□)。与此相对,使用野生型检测用和变异型检测用的Boost Primer两方的反应液e和f,没有荧光强度的急剧增加,即使90循环也没能确认错配的扩增。这是由于在反应液中野生型检测用BoostPrimer和变异型检测用Boost Primer的两方共存,由此在完全匹配的Boost Primer和错配的Boost Primer之间发生竞争,作为错配的Boost Primer与DNA的结合被抑制。由这些结果可知,通过使用野生型检测用Boost Primer和变异型检测用Boost Primer两方可以抑制错配的扩增。
图41为表示对实施例20-2的反应液g~k进行等温扩增时的扩增概况的图表。前述反应液,作为Boost Primer使用野生型检测用和变异型检测用的两方;另外,模板DNA包括野生型DNA和变异型DNA的两方。该图A中▲表示对实施例20-2的反应液i在FAM的波长下检测的结果;△表示对前述反应液i在Cy5的波长下检测的结果。如该图A所示,可以确认FAM和Cy5的两方的波长荧光强度的急剧增加。从该结果可知,即使两方BoostPrimer共存,各Boost Primer可以扩增完全匹配的DNA,进而可在各自的波长下检测扩增。该图B表示对实施例20-2的反应液g~k在FAM的波长检测的结果,该图C表示对前述反应液g~k在Cy5的波长下检测荧光强度的结果。前述各反应液如前述表12所示,改变了作为模板DNA的野生型DNA和变异型DNA的含量。如该图B所示,即使减少与野生型检测用Boost Primer完全匹配的野生型DNA的比例,也可以确认FAM的波长下荧光强度的增加。另外,如该图C所示,即使减少与变异型检测用BoostPrimer完全匹配的变异型DNA的比例,也可以确认Cy5的波长下荧光强度的增加。从这些的结果可知,使用野生型检测用BoostPrimer和变异型检测用Boost Primer两方的情况下,即使减少反应液中所包含的野生型DNA的含量,FAM的波长下野生型的检测也可以进行;即使减少反应液中所包含的变异型DNA的含量,Cy5的波长下变异型的检测也可以进行。
[实施例21]
通过使用包含本发明的标记引物的成套引物的PCR,进行EGFR基因的exon21的扩增。
(1)模板DNA
使用Human Genomic DNA(Promega公司生产)。
(2)引物
使用由未标记正义(forward)引物(F1)和标记反向引物(reverse primer)(Labeled-R1)组成的成套引物。另外,标记R1如下进行标记:将划下划线的核苷酸残基(T)用荧光原子团进行标记。前述标记的核苷酸残基的结构如前述式(121)所示,前述式(121)中“Dye”部分如前述参考例6中的前述式(113)所示。前述式(113)中,linker长度为n=4。前述式(113)所示的荧光性原子团的检测波长为激发波长510nm/荧光波长530nm。除将该标记R1碱基序列设为序列号28以外,用与前述实施例8或参考例6同样的方法进行合成。
F1:5’-AAACACCGCAGCATGTC-3’(序列号27)
Labeled-R1:5’-TAAAGCCACCTCCTTAC-3’(序列号28)
另外exon21的区域(序列号30)中的F1和labeled-R1的位置关系按照以下的下划线处所示。
5’-AAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTG
F1
CGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTA-3’
labeled-R1
使用由前述F1和labeled-R1组成的成套引物。且使用PrimeSTAR(注册商标)HS DNA Polymerase(Takara),按照产品说明书中记载的方法进行PCR。并且,使用Mx3000P system(Stratagene公司生产)对PCR反应液的荧光强度を进行实时监视。具体而言,98℃预热10秒(Pre-heating)后,将98℃10秒、69℃10秒、72℃10秒作为1循环,进行40循环的PCR。其结果在图42A中示出。该图为表示PCR扩增曲线的图表,扩增中使用包含labeled-R1的前述成套引物。
另外,PCR结束后,对9μl反应液,使用4%NuSieve GTGAgarose(Takara Bio Inc)在100V下进行电泳。并对电泳后的凝胶用溴乙锭(EtBr)进行染色,由此检测核酸。其电泳照片的结果如图42B所示。该图中泳道1表示通过使用包含标记引物(labeled-R1)的成套引物的PCR的核酸扩增物,泳道2表示每阶梯差25bp的ladder marker进行电泳的结果。
如图42A所示,可以确认,标记引物即使PCR也进行扩增。这点即使通过目视也可充分确认其不同。另外,如图42B所示,用电泳确认的使用标记引物的核酸扩增物时,确认了目的条带目的。从以上可以明确用前述荧光原子团(510/530)进行标记的引物在PCR中也可有效发挥作用。
[实施例22]
通过使用包含本发明的标记引物的成套引物的PCR进行EGFR基因的exon21的扩增,进行融解曲线解析。
(1)模板DNA
使用Human Genomic DNA(Promega公司生产)。
(2)引物
使用由未标记正义(forward)引物(F1)和标记反向引物(reverse primer)(Labeled-R1)组成的成套引物(实施例)以及未标记正义引物(F1)和未标记反向引物(R1)组成的成套引物(对照例)。前述标记R1(labeled-R1)与前述实施例21同样。另外,exon21的区域(序列号30)中的R1的位置关系与标记R1相同。
F1:5’-AAACACCGCAGCATGTC-3’(序列号27)
R1:5’-TAAAGCCACCTCCTTAC-3’(序列号29)
Labeled-R1:5’-TAAAGCCACCTCCTTAC-3’(序列号28)
使用SYBR(注册商标)Premix EX Taq(注册商标)(Takara公司生产),按照产品说明书中记载的方法进行PCR,所述SYBR使用由F1、R1组成的通常的成套引物和由F1、Labeled-R1组成的标记成套引物。并用Mx3000P system(Stratagene公司生产)实时监视PCR反应液的荧光强度。具体而言,95℃10秒的预热后,将95℃30秒、60℃1分和72℃30秒作为1循环,进行40循环的PCR。PCR结束后,接着在融解曲线测定步骤中进行95℃1分、55℃30秒的处理,以升温速度2℃/1分钟使温度上升至至95℃,进行95℃30秒钟的处理,实时监视55℃~95℃的荧光强度。将这些结果示于图43。该图为融解曲线的图表,该图中■(labeled-primer)为使用由F1、labeled-R1组成的标记成套引物的实施例的结果(FAM的波长492nm/516nm),●(regular primer)为使用由F1、R1组成的成套引物的对照例的结果(FAM的波长492nm/516nm)。
如图43所示,使用标记引物的PCR的融解曲线(实施例)与使用未标记引物的PCR的融解曲线(对照例)相比,在高的温度下显示出峰。由该结果可知:本发明中的标记核酸(引物)比未标记引物提高了Tm值。从这样Tm值提高可知,本发明中的标记核酸比通常的未标记引物更牢固地与互补的DNA结合。即,可知本发明的标记核酸与例如一般所使用的LNA或PNA等提高Tm值的寡聚核苷酸具有同样的功能。由该结果可以说本发明的标记核酸可发展为称为例如提高扩增的特异性的应用技术。另外,本发明中的标记核酸由于提高了Tm值,当然可应用于使用LNA或PNA的实验体系中,使例如LNA或PNA具有所不具备的发出荧光的能力,因此,可以推测其在分子生物学的方法中,比LNA或PNA更容易拓宽使用用途。
[实施例23]
使用包含本发明的标记引物的LAMP用成套引物,对包含EGFRexon21的突变L858R的区域进行扩增。
(1)模板DNA
模板DNA与实施例19同样从包含exon21点突变L858R的肺癌细胞系NCL-H1975中进行提取(American Type CultureCollection)。
(2)成套引物
制备与包含前述突变的区域完全匹配的LAMP用成套引物。成套引物包含下述LF(序列号31)、LR(序列号32)、标记或未标记的BP(序列号33)、和OP(序列号34)。成套引物中的各引物的比例为LF∶LR∶BP∶OP=8∶8∶4∶1。
LF(EGFRex21(M)LF Primer)5’-CCAAAATCTGGGAACGTACTGGTGAAACA-3’
LR(EGFRex21(M)LR Primer)5’-CGAGCCAAACGCCTCCTTCTGCATGGTATT-3’
BP(Boost Primer;EGFR exon21 BP3)5’-TGGGTGCGGAAGAGAAAG-3’
OP(Outer Primer2;EGFR exon21 OP3)5’-TAAAGCCACCTCCTTAC-3’
前述标记BP通过下述荧光原子团对设定的核苷酸进行标记。下述表的序列中划有粗下划线的核苷酸为标记部位。下述BP-1中,前述标记的核苷酸残基的结构用前述式(121)表示,前述式(121)中“Dye”部分分别用前述参考例6中的前述式(113)表示。前述式(113)中的linker长度为n=4。前述式(113)所示荧光性原子团的检测波长是激发波长510nm/荧光波长530nm。另外,下述BP-2中,前述标记的核苷酸残基的结构用前述式(121)表示,前述式(121)中“Dye”部分分别用前述参考例6中的前述式(123)表示。前述式(123)中的linker长度为n=4。前述式(123)所示荧光性原子团的检测波长是激发波长530nm/荧光波长550nm。这些标记引物除碱基序列分别为序列号33(BP)以外,用与前述实施例8或参考例6同样的方法进行合成。
[表13]
制备25μL下述组成的反应液,使其在60℃下反应1小时。前述反应中,边维持60℃的等温状态,边通过Mx3000P(商品名、Stratagene公司生产)实时监视反应液的荧光强度。另外,对照例使用未标记的成套引物,进一步使SYBR(注册商标)GreenI(Moleculor Probes,Inc)在反应液中的浓度为10万倍稀释地添加SYBR,同样进行测定。
[表14]
反应液组成
Tris-HCl(PH8.0) 20mM
KCl 10mM
(NH4)2SO4 10mM
硫酸镁 8mM
Tween20 0.1%
氨基乙酸甜菜碱 0.6M
dNTPs 1.4mM
引物LF 2.0μM
LR 2.0μM
BP or labeled-BP 1.0μM
OP 0.25μM
AacDNA聚合酶* 6单位
基因组DNA 40ng
共25μL
*Kabushiki Kaisha DNAFORM生产
在图44中示出这些结果。该图为表示通过LAMP法进行等温扩增时的扩增概况的图表,●为使用BP-1的实施例23-1的结果,■为使用BP-2的实施例23-2的结果,▲为对照例的结果。在图中,1循环表示为1分钟。
如该图所示,根据使用本发明的标记引物的实施例23-1~23-2可知,其与对照例同样,在LAMP法中也可以确认扩增。另外,使用用前述式(113)的荧光原子团(510/530)进行标记的BP-1的实施例23-1比使用用前述式(123)的荧光原子团(530/550)进行标记的BP-2的实施例23-2,在平台中的荧光值非常高。这即使通过目视也可充分确认其不同。由此可知前述荧光原子团作为本发明的引物中的标记检测灵敏度非常优异。
按照以上,本发明的引物为包含前述式所示的结构的标记核酸,用于例如目的核酸序列的扩增方法时,可有效检测前述目的核酸序列的扩增。另外,由于可以如此有效地检测扩增,进一步还可以以优异的灵敏度检测目的核酸序列中有无目的的变异等。本发明由于在核酸的检测灵敏度等上优异,可以用于例如研究、临床、诊断、试管内基因检测、生物体内基因检测等广泛的用途中。
序列表
<110>独立行政法人理化学研究所(RIKEN)
<110>达纳福股份有限公司(KABUSHIKI KAISHA DNAFORM)
<120>引物、成套引物、使用其的核酸扩增方法和变异检测方法
<130>TF08002-04
<150>JP 07/059921
<151>2007-03-09
<150>JP 07/246253
<151>2007-09-21
<150>JP 07/248257
<151>2007-09-25
<150>JP 07/335352
<151>2007-12-26
<150>JP 08/035325
<151>2008-02-15
<160>34
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA寡聚物
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<400>1
cgcaatntaa cgc 13
<210>2
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA寡聚物
<400>2
gcgttaaatt gcg 13
<210>3
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA寡聚物
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<400>3
ttttttnntt ttt 13
<210>4
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA寡聚物
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<400>4
ttttttnttt ttt 13
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<213>人工的
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<400>6
tgaagggctt ntgaactctg 20
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<213>人工的
<220>
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<400>7
cagagttcaa aagcccttca 20
<210>8
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA寡聚物
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<400>8
cgcaatnnaa cgc 13
<210>9
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA寡聚物
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<400>9
gcctcctnca gcaaatccna ccggcgtg 28
<210>10
<211>28
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<220>
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<220>
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<222>(10)..(10)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<400>10
cctcccaagn gctgggatna aaggcgtg 28
<210>11
<211>95
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA片段
<400>11
gccggtagtg gtggcgcacg ccggtaggat ttgctgaagg aggcagaggc aggaggatca 60
cgagttcgag gccagcctgg gctacacatt ttttt 95
<210>12
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA片段
<400>12
gccgggcatg gtggcgcacg cctttaatcc cagcacttgg gaggcagagg caggcggatt 60
tctgagttcg aggccagcct ggtctacaga gtgag 95
<210>13
<211>49
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>DNA寡聚物
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>n表示被修饰的嘧啶
<400>13
tttttttttt tttttttttt ttttnttttt tttttttttt ttttttttt 49
<210>14
<211>120
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>14
tgaaaacacc gcagcatgtc aagatcacag attttgggcg ggccaaactg ctgggtgcgg 60
aagagaaaga ataccatgca gaaggaggca aagtaaggag gtggctttag gtcagccagc 120
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>15
aggacgctga gatgcgtcct gatcacagat tttgggcgag 40
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>16
cgagccaaac gcctccttct gcatggtatt 30
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>17
tgggtgcgga agagaaag 18
<210>18
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>18
taaagccacc tccttac 17
<210>19
<211>183
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
aacattacag gatttgcacc cttttctaag gacaattcga ttaggctttc cgctggtggg 60
gacatctggg tgacaagaga accttatgtg tcatgcgatc ctgacaagtg ttatcaattt 120
gcccttggac agggaacaac actaaacaac gtgcattcaa atgacacagt acgtgatagg 180
acc 183
<210>20
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taaagccacc tccttac 17
Claims (49)
1.引物,其特征在于,其为用于扩增目的核酸序列的引物,该引物是包含至少一个下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示结构的标记核酸,
式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中,
B为具有天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸碱基骨架的原子团,
E为(i)具有脱氧核糖骨架、核糖骨架、或者由这些的任意一个衍生的结构的原子团,或
(ii)具有肽结构或者肽类似物结构的原子团,
Z11和Z12分别为显示荧光性的原子团,可以相同也可以不同,
L1、L2和L3分别为linker(桥原子或原子团),主链长(主链原子数)为任意,主链中可以分别含有或不含有C、N、O、S、P和Si,主链中可以分别含有或不含有单键、双键、三键、酰氨键、酯键、二硫键、亚氨基、醚键、硫醚键和硫酯键,L1、L2和L3相互间可以相同也可以不同,
D为CR、N、P、P=O、B或者S iR,R为氢原子、烷基或任意的取代基,
b为单键、双键或者三键,
或者,前述式(16)和(16b)中,可以是L1和L2为前述linker,L3、D和b不存在,L1和L2直接与B结合,
其中,
式(16)、(17)和(18)中,E为前述(i)的原子团,磷酸桥中的至少一个O原子可以用S原子取代,
式(16b)、(17b)和(18b)中,E为前述(ii)的原子团,
式(17)和(17b)中,各B可以相同也可以不同,各E可以相同也可以不同。
2.根据权利要求1所述的引物,前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中,L1、L2和L3的主链长(主链原子数)分别为2以上的整数。
3.根据权利要求1所述的引物,
前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中,
Z11和Z12为显示激发子效果的原子团。
4.根据权利要求1所述的引物,前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中,Z11和Z12各自独立为由噻唑橙、噁唑黄、花青、半花菁、其它花青染料、甲基红、偶氮染料或这些的衍生物衍生的基团。
5.根据权利要求1所述的引物,
Z11和Z12各自独立为下述式(7)~(9)的任意一个所示的原子团,
式(7)~(9)中,
X1和X2为S或O,
n为0或正的整数,
R1~R10、R13~R21各自独立为氢原子、卤原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或氨基,
R11和R12之中,一方为与前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中的L1或者L2结合的连接基,另一方为氢原子或低级烷基,
R15在式(7)、(8)或(9)中存在多个的情况下,可以相同也可以不同,
R16在式(7)、(8)或(9)中存在多个的情况下,可以相同也可以不同、
Z11中的X1、X2和R1~R21、Z12中的X1、X2和R1~R21相互间可以相同也可以不同。
6.根据权利要求5所述的引物,前述式(7)~(9)中,
R1~R21中,前述低级烷基为碳原子数1~6的直链或支链烷基,前述低级烷氧基为碳原子数1~6的直链或支链烷氧基。
7.根据权利要求5所述的引物,前述式(7)~(9)中,
R11和R12中前述连接基为碳原子数2以上的聚亚甲基羰基,以羰基部分与前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中的L1或者L2结合。
8.根据权利要求1~7任一项所述的引物,进一步包含具有与前述标记核酸相同的碱基序列的未标记核酸作为引物。
9.成套引物,其特征在于,其为用于扩增目的核酸序列的成套引物,包含一对引物,前述一对引物的至少一个引物为权利要求1~7任一项所述的引物。
10.根据权利要求9所述的成套引物,前述成套引物为等温扩增法中所使用的成套引物。
11.根据权利要求10所述的成套引物,前述等温扩增法为选自SDA(strand displacement amplification)法;改良SDA法;NASBA(nucleic acid sequence based amplification,依赖核酸序列的扩增)法;LAMP法;ICAN(Isothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acids)法;自主序列复制系统(3SR;self-sustainedsequence replication)法;TMA(transcription-mediated amplification)法;Qβ复制酶(Qβreplicase)法;SMAP(Smart Amplification Process)法、Invader法、RCA(rolling cycle amplification,滚环扩增)法中的至少一种。
12.根据权利要求10所述的成套引物,进一步包含具有链置换能力的聚合酶。
13.根据权利要求10~12任一项所述的成套引物,进一步包含错配识别蛋白。
14.根据权利要求13所述的成套引物,前述错配识别蛋白为选自MutS、MSH2和MSH6中的至少一个蛋白质。
15.根据权利要求10~14任一项所述的成套引物,前述一对引物为:一个引物的形态和另一个引物的形态不同的非对称型。
16.根据权利要求15所述的成套引物,前述一对引物包含第一引物和第二引物,
前述第一引物,在3’末端部分包含与目的核酸序列的3’末端部分的序列(A)杂交的序列(Ac’),且在前述序列(Ac’)的5’侧包含序列(B’),该序列(B’)与在前述目的核酸序列中比前述序列(A)更靠近5’侧的序列(B)的互补序列(Bc)杂交,
前述第二引物,在3’末端部分包含与前述目的核酸序列的互补序列的3’末端部分的序列(C)杂交的序列(Cc’),且在前述序列(Cc’)的5’侧包含折叠序列(D-Dc’),该折叠序列(D-Dc’)在同一链上含有相互杂交的2个核酸序列。
17.根据权利要求15或16所述的成套引物,前述第一引物和前述第二引物的任意一个为前述标记核酸。
18.根据权利要求15~17任一项所述的成套引物,其中,前述成套引物进一步包含第三引物,
前述第三引物为与前述目的核酸序列或其互补序列杂交的引物,且该第三引物对目的核酸序列或其互补序列的杂交与其它引物不竞争,
前述第三引物,在前述第一引物或第二引物的扩增产物的一部分为单链体的状态时,可以与其单链体部分存在的目的核酸序列退火,由此在前述扩增产物中的目的核酸序列上提供新的互补链合成起点。
19.根据权利要求18所述的成套引物,其中,
前述第一引物和前述第二引物的任意一个、以及前述第三引物为前述标记核酸;
或者,
代替前述第一引物和前述第二引物的任意一个,前述第三引物为前述标记核酸。
20.根据权利要求10~14任一项所述的成套引物,前述一对引物为:一个引物的形态和另一个引物的形态相同的对称型。
21.根据权利要求20所述的成套引物,前述成套引物为LAMP法中所使用的成套引物。
22.根据权利要求9所述的成套引物,前述成套引物为聚合酶链反应(PCR)法中所使用的成套引物。
23.根据权利要求9~22任一项所述的核酸扩增方法,其包含具有检测波长不同的荧光性原子团的2种以上权利要求1~8任一项所述的引物。
24.核酸扩增用试剂盒,其特征在于,其为扩增目的核酸序列的核酸扩增方法中所使用的核酸扩增用试剂盒,该核酸扩增用试剂盒包含权利要求1~8任一项所述的引物或权利要求9~23任一项所述的成套引物。
25.根据权利要求21所述的核酸扩增用试剂盒,其为用于等温扩增法中的核酸扩增用试剂盒,该核酸扩增用试剂盒包含权利要求10~21任一项所述的成套引物。
26.根据权利要求24所述的核酸扩增用试剂盒,其为用于PCR法中的核酸扩增用试剂盒,该核酸扩增用试剂盒包含权利要求22所述的成套引物。
27.根据权利要求24~26任一项所述的核酸扩增用试剂盒,其包含具有检测波长不同的荧光性原子团的2种以上权利要求1~8任一项所述的引物。
28.变异检测用试剂盒,其特征在于,其为检测目的核酸序列中有无变异的变异检测方法中所使用的变异检测用试剂盒,该变异检测用试剂盒包含权利要求24~27任一项所述的核酸扩增用试剂盒。
29.核酸扩增方法,其特征在于,其为扩增核酸试样中的目的核酸序列的方法,包含下述(A)工序、下述(B)或(B’)工序:
(A)准备前述核酸试样的工序,
(B)使用权利要求1~8任一项所述的引物或权利要求9~23任一项所述的成套引物扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序,
(B’)包含下述(B1’)工序和(B2’)工序的工序:
(B1’)使用引物或包含一对引物的成套引物扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序,
(B2’)前述(B1’)工序中扩增的单链体核酸序列与探针进行杂交的工序,其中该探针由包含至少一个下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示结构的标记核酸形成,
式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中,
B为具有天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸碱基骨架的原子团,
E为(i)具有脱氧核糖骨架、核糖骨架、或者由这些的任意一个衍生的结构的原子团,或
(ii)具有肽结构或者肽类似物结构的原子团,
Z11和Z12分别为显示荧光性的原子团,可以相同也可以不同,
L1、L2和L3分别为linker(桥原子或原子团),主链长(主链原子数)为任意,主链中可以分别含有或不含有C、N、O、S、P和Si,主链中可以分别含有或不含有单键、双键、三键、酰氨键、酯键、二硫键、亚氨基、醚键、硫醚键和硫酯键,L1、L2和L3相互间可以相同也可以不同、
D为CR、N、P、P=O、B或者SiR,R为氢原子、烷基或任意的取代基,
b为单键、双键或者三键,
或者,前述式(16)和(16b)中,可以是L1和L2为前述linker,L3、D和b不存在,L1和L2直接与B结合,
其中,
式(16)、(17)和(18)中,E为前述(i)的原子团,磷酸桥中的至少一个O原子可以用S原子取代,
式(16b)、(17b)和(18b)中,E为前述(ii)的原子团,
式(17)和(17b)中,各B可以相同也可以不同,各E可以相同也可以不同。
30.根据权利要求29所述的核酸扩增方法,前述(B)或(B’)工序中的核酸扩增为利用等温扩增法的核酸扩增反应。
31.根据权利要求30所述的成套引物,前述等温扩增法为选自SDA(strand displacement amplification)法;改良SDA法;NASBA(nucleic acid sequence based amplification,依赖核酸序列的扩增)法;LAMP法;ICAN(Isothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acids)法;自主序列复制系统(3SR;self-sustainedsequence replication)法;TMA(transcription-mediated amplification)法;Qβ复制酶(Qβreplicase)法;SMAP(Smart Amplification Process)法、Invader法、RCA(rolling cycle amplification,滚环扩增)法中的至少一种。
32.根据权利要求30或31所述的核酸扩增方法,前述等温扩增法为使用具有链置换能力的聚合酶的扩增法。
33.根据权利要求30~32任一项所述的核酸扩增方法,前述(B)或(B’)工序中,在错配识别蛋白的存在下进行核酸扩增。
34.根据权利要求33所述的核酸扩增方法,前述错配识别蛋白为选自MutS、MSH2和MSH6中的至少一个蛋白质。
35.根据权利要求29~34任一项所述的核酸扩增方法,前述(B)工序中的前述成套引物为权利要求10~21任一项所述的成套引物。
36.根据权利要求30~34任一项所述的核酸扩增方法,前述(B)工序中的成套引物为权利要求15~19任一项所述的成套引物。
37.根据权利要求30~34任一项所述的核酸扩增方法,前述(B)工序中的成套引物为权利要求20或21所述的成套引物。
38.根据权利要求29所述的核酸扩增方法,前述(B)或(B’)工序中的核酸扩增为利用PCR法的核酸扩增反应。
39.根据权利要求38所述的核酸扩增方法,前述(B)工序中的成套引物为权利要求22所述的成套引物。
40.根据权利要求29~39任一项所述的核酸扩增方法,前述(B)工序中,使用具有检测波长不同的荧光性原子团的2种以上权利要求1~7任一项所述的引物。
41.根据权利要求29~40任一项所述的核酸扩增方法,
前述目的核酸序列为具有变异的核酸序列,
前述(B)工序中,使用:具有与前述目的核酸序列中包含变异部位的区域完全互补的序列的权利要求1~8任一项所述的引物、和具有与前述包含变异部位的区域除前述变异部位外完全互补的序列的引物。
42.变异检测方法,其特征在于,其为检测核酸试样中的目的核酸序列中有无变异的方法,该变异检测方法包含下述(a)~(c)工序:
(a)通过权利要求29~41任一项所述的核酸扩增方法扩增核酸试样中的目的核酸序列的工序,
(b)分别测定前述(a)工序的前后的荧光强度的工序,
(c)通过比较前述(b)工序中测定的前述(a)工序前后的荧光强度来检测有无变异的工序。
43.根据权利要求42所述的变异检测方法,前述变异为碱基的置换、缺失或插入。
44.根据权利要求42所述的变异检测方法,
前述(a)工序中,使用具有检测波长不同的荧光性原子团的2种以上权利要求1~8任一项所述的引物来扩增目的核酸,
前述(c)工序中,通过与前述各荧光性原子团相应的各检测波长测定各自的荧光强度。
45.根据权利要求42所述的变异检测方法,前述(a)工序中,使用:具有与前述目的核酸序列中包含变异部位的区域完全互补的序列的权利要求1~8任一项所述的引物、和具有与前述包含变异部位的区域除前述变异部位外完全互补的序列的引物。
46.特异性的提高方法,其特征在于,其为提高引物对目的核酸序列的特异性的方法,作为用于扩增前述目的核酸序列的前述引物,使用权利要求1~8任一项所述的具有荧光原子团的引物。
47.特异性的提高方法,其特征在于,其为提高引物对目的核酸序列的特异性的方法,
作为用于扩增前述目的核酸序列的前述引物,使用具有与前述目的核酸序列中包含变异部位的区域完全互补的序列的权利要求1~8任一项所述的引物,
进一步,作为提高前述引物的特异性的引物,同时使用具有与前述包含变异部位的区域除前述变异部位外完全互补的序列的引物。
48.核酸扩增装置,其特征在于,其为用于实施权利要求29~41任一项所述的核酸扩增方法的核酸扩增装置,
该核酸扩增装置具备:反应部,其用于实施核酸扩增反应;温度控制单元,其用于控制前述反应部的温度;检测单元,其用于检测前述反应部的荧光强度。
49.变异检测装置,其特征在于,其为用于实施权利要求42~45所述的变异检测方法的变异检测装置,
该变异检测装置具备:反应部,其用于实施核酸扩增反应;温度控制单元,其用于控制前述反应部的温度;检测单元,其用于检测前述反应部的荧光强度。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20081015 |