CN104292117B

CN104292117B - 酸敏感连接单元的合成及其在dna测序中的用途

Info

Publication number: CN104292117B
Application number: CN201410186697.6A
Authority: CN
Inventors: 沈玉梅; 龚兵; 邵志峰; 赵小东; 刘亚智; 李小卫; 伍新燕; 魏晓飞; 汤道年
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-07-15
Filing date: 2014-05-05
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2034-05-05
Also published as: CN104292117A

Abstract

本发明公开了一种酸敏感连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。该酸敏感连接单元，结构式为：其中R为NH₂或N₃，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数；R₁，R₂均为脂肪族烷基，或R₁，R₂均为芳香族衍生物，或R₁为苯基、萘基、苯基的衍生物、或萘基的衍生物，R₂为脂肪族烷基或氢；或R₂为苯基、萘基、苯基的衍生物、或萘基的衍生物，R₁为脂肪族烷基或氢，或R₁、R₂构成环己基、环戊基或环丁基。该酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素连接得到的可逆终端可用于DNA合成测序。该类可逆终端可用于DNA测序；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

Description

酸敏感连接单元的合成及其在DNA测序中的用途

技术领域

本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于DNA测序的化合物，具体涉及一类酸敏感连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3ˊ-羟基阻断外，为了不影响下一个指示核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使这个连接单元断裂，继续DNA链的延长，从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键,偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物,苯甲酰甲基酯衍生物及其光可裂解连接单元)；亲电子试剂/酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而酸敏感连接单元却从来没有用于DNA测序(Bioorganic&Medicinal Chemistry2012,20,571-582)。

可裂解连接单元对DNA测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。发明人在前期工作中,发展了一种酸敏感可裂解连接单元,该类连接单元包含四氢吡喃醚和四氢呋喃醚两种结构(申请号：201110331659.1；201210132695)，这类基于缩醛的连接单元可用于DNA合成测序,但是在DNA测序体系中基于该类连接单元的可逆终端即使在pH＝1.6的情况下完全断裂所需要的时间也需要25min,这时候DNA链已经损伤很严重,如果将pH值提高到1.8，该可逆终端在DNA测序体系中即使延长时间、提高温度均不能使之完全断裂，所以该体系实际上很难用于测序。然而从理论上讲一个测序循环的完成是可行的。所以设计、合成对酸更为敏感的连接单元并用于DNA测序,具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酸敏感连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。本发明设计合成的一类新的酸敏感连接单元及其可逆终端，该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率地连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的价值。与前期工作(申请号：201110331659.1；201210132695)相比，本发明所陈述的缩酮及缩醛结构的酸敏感可裂解连接单元,在温和的条件下,具有非常快的断裂速度,应用于DNA测序时,具有更高的效率.并且前期工作(申请号：201110331659.1；201210132695)中最好的一个连接单元,在DNA测序系统中，需要在pH为1.6时，25min才能将连接单元断裂，此时DNA链已经受到了非常明显损伤，所以这种连接单元是不能真正地用于DNA测序的(具体见实施例29)。而本发明的连接单元，在室温下，实施例14的可逆终端pH＝2.88，3min断裂完全；而实施例24的可逆终端pH＝2.88，2min断裂完全；实施例15的可逆终端pH＝2.88，5min断裂完全；实施例16的可逆终端pH＝2.88，10min断裂完全；实施例14的可逆终端pH＝3.45，10min断裂完全；实施例24的可逆终端，pH＝3.45，9min断裂完全；实施例15的可逆终端pH＝3.45，14min断裂完全；实施例16的可逆终端pH＝3.45，18min断裂完全；在这两种pH条件下，DNA模板均无损伤。实施例11、17、18、19、20、21、22的可逆终端，室温下，pH＝2.95，3min断裂完全；pH＝3.31，10min断裂完全。在这两种pH条件下，DNA模板均无任何损伤。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种酸敏感连接单元，其结构式如式(Ⅰ)所示：

其中R为NH₂或N₃，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数；R₁，R₂均为脂肪族烷基，或R₁，R₂均为芳香族衍生物，或R₁为苯基、萘基、苯基的衍生物、或萘基的衍生物，R₂为脂肪族烷基或氢；或R₂为苯基、萘基、苯基的衍生物、或萘基的衍生物，R₁为脂肪族烷基或氢，或R₁、R₂构成环己基、环戊基或环丁基。

优选的，其中R为NH₂或N₃，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数；R₁＝R₂＝甲基，或R₁＝苯基或萘基、R₂＝甲基或乙基，或R₂＝苯基或萘基、R₁＝甲基或乙基，或R₁、R₂构成环己基、环戊基或环丁基。

优选的，所述R₁＝R₂＝甲基，R为NH₂或N₃，m,n为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁＝R₂＝甲基，m为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁、R₂构成环己基，R为NH₂或N₃，m,n为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁、R₂构成环己基，m为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁、R₂构成环戊基，R为NH₂或N₃，m,n为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁、R₂构成环戊基，m为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁＝苯基，R₁＝甲基，R为NH₂或N₃，m,n为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁＝对甲氧基苯基，R₁＝H，R为NH₂或N₃，m为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁＝2,4,6-三甲氧基苯基，R₁＝H，R为NH₂或N₃，m为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁＝4-甲氧基-1-萘基，R₁＝H，R为NH₂或N₃，m为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁＝乙基，R₁＝甲基，R为NH₂或N₃，m,n为0～10中任一整数。

优选的，所述R₁＝R₂＝甲基，R为NH₂或N₃，m＝1,n＝0。

第二方面，本发明涉及前述酸敏感连接单元的合成方法，包括如下步骤：

A、在水和甲醇存在的条件下，碳酸钾和化合物C反应，得到化合物D所述碳酸钾和化合物C的摩尔比为(2.5～3.5)：1；

B、在三乙胺存在的条件下，化合物TsCl和化合物D反应，得到化合物 E所述TsCl和化合物D的摩尔比为1：(2.0～4.0)；

C、在80℃下，NaN₃和化合物E反应，得到化合物F所述NaN₃和化合物E的摩尔比为(1.5～3.5)：1；

D、在甲醇存在的条件下，Pd/C、氢气和化合物F反应，得到化合物G

优选的，所述化合物A中m为0～44中任一整数，所述化合物A1中n＝m；所述化合物中R₁＝R₂＝甲基。

优选的，所述化合物A中m为0～44中任一整数，所述化合物A1中n＝m；所述化合物中R₁、R₂构成环己基。

优选的，所述化合物A中m为0～44中任一整数，所述化合物A1中n＝m；所述化合物中R₁、R₂构成环戊基。

优选的，所述化合物A中m为0～44中任一整数，所述化合物A1中n＝m；所述化合物中R₁＝苯基，R₂＝甲基。

优选的，所述化合物C可通过包括如下步骤的方法制备而得：

A、在浓硫酸存在的条件下，摩尔比为1.0：(2.5～3.5)的乙酸与化合物A或化合物A1反应，得到化合物B或化合物B1其中，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数；

B、在PPTS、5A分子筛存在条件下，化合物B、B1和反应，得到化合物C所述:PPTS:化合物B:化合物B1的摩尔比为1:(0.1～0.5):(1.0～1.5):(1.0～1.5)，且化合物B、B1为等摩尔，所述R₁，R₂均为脂肪族烷基。

优选的，所述化合物C可通过包括如下步骤的方法制备而得：

步骤一，在pTSA存在条件下，原甲酸三甲酯与化合物A反应生成化合物B，其中，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数，

步骤二，在PPTS、5A分子筛存在条件下，化合物B和乙二醇单乙酸酯反应，得化合物C其中，R₁＝苯基、R₂＝甲基，或R₂＝苯基、R₁＝乙基，或R₁、R₂构成环己基、环戊基或环丁基。

优选的，所述化合物C可通过包括如下步骤的方法制备而得：

步骤一，在pTSA、4A分子筛存在条件下，4-甲氧基-1-萘甲醛与化合物A反应生成化合物C其中，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数；R₁＝对甲氧基苯基、R₂＝H，或R₂＝H、R₁＝4-甲氧基-1-萘基。

第三方面，本发明涉及前述的酸敏感连接单元在DNA测序中的用途，所述酸敏感缩酮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端，所述可逆终端可用于DNA合成测序。

第四方面，本发明涉及一种可逆终端，所述可逆终端由前述的酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素连接而得。

优选的，R为NH₂时，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤：

A、所述酸敏感连接单元与TAMRA(5/6)FITC荧光素Cy5或荧光素Cy3.5以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下反应，得化合物H改为化合物TAMRA-OH，化合物FITC-OH化合物Cy5-OH或化合物Cy3.5-OH所述TAMRA(5/6)、FITC、Cy5或Cy3.5与酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1：(1～3)：(3～10)；

B、在TEA存在的条件下，化合物TAMRA-OH、化合物FITC-OH、化合物Cy5-OH或化合物Cy3.5-OH和DSC反应，得到反应中间体，所述中间体直接与 dUTP(AP3)dCTP(AP₃)dATP(AP3)或dGTP(AP3)反应，得到化合物dUTP-acid labile linker-TAMRA、dCTP-acid labile linker-FITC、化合物dATP-acid labilelinker-Cy5或化合物dGTP-acid labile linker-Cy3.5；所述化合物TAMRA-OH、FITC-OH、Cy5-OH或Cy3.5-OH与DSC、TEA和dUTP(AP3)、dCTP(AP₃)、dATP(AP3)或dGTP(AP3)的摩尔比为1：(5～12)：(6～15)：(2～4)。

优选的，所述核苷酸dCTP(AP₃)是通过如下步骤合成的：

A、化合物F₂的合成：在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0:(1.2～2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F₂

B、化合物dC(AP₃)的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，化合物F₂和dC-I反应，得化合物dC(AP3)所述dC-I、F₂、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1:(2～3):0.072:0.025:(1.5～2)；

C、化合物dCTP(AP3)的合成：化合物dC(AP3)与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dCTP(AP₃)；所述E-4、E-3和dC(AP3)的摩尔比为2:2:1。

优选的，所述核苷酸dATP(AP3)是通过如下步骤合成的：

B、化合物dA(AP3)的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，化合物F₂和dA-I反应，得化合物dA(AP3)所述dA-I、F₂、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1:(2～3):0.072:0.025:(1.5～2)；

C、化合物dATP(AP3)的合成：化合物dA(AP3)与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dATP(AP₃)；所述E-4、E-3和dA(AP3)的摩尔比为2:2:1。

优选地，所述核苷酸dGTP(AP3)是通过如下步骤合成的：

B、化合物dG₃的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，化合物F₂和dG₁ 反应，得化合物dG₃ 所述dG₁、F₂、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1:(2～3):0.072:0.025:(1.5～2)；

C、化合物dGTP(AP3)的合成：化合物dG₃与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dGTP(AP₃)，所述E-4、E-3和dG₃的摩尔比为2:2:1。

优选的，所述核苷dG₁是通过如下步骤合成的：

A、化合物dG₁-B的合成：dG₁-A在碱性条件下，用新戊酰

B、化合物dG₁-C的合成：化合物dG₁-B用NIS在嘌呤碱基的7位接上碘得到化合物dG₁-C；

C、化合物dG₁-D的合成：化合物dG₁-C在碱性条件下去

D、化合物dG₁ 的合成：化合物dG₁-D在碱性条件下去甲基，得化合物dG₁。

优选的，所述核苷dG₁是通过如下步骤合成的：

E、化合物G005的合成：Sm-1与Sm-2在酸性条件下反应，得化合物G005；

F、化合物G006的合成：化合物G005在三氯氧磷的作用下，反应得到化合物G006；

G、化合物G007的合成：化合物G006在碱性条件下与新戊酰氯反应得化合物G007；

H、化合物G008的合成：化合物G007用NIS在嘌呤碱基的7位接上碘得到化合物G008；

I、化合物G009的合成：化合物G008与化合物发生糖苷化反应，得化合物G009；

J、化合物dG₁-D的合成：化合物G009在碱性条件下去保护基得化合物dG₁-D；

K、化合物dG₁ 的合成：化合物dG₁-D在碱性条件下去甲基，得化合物dG₁。

A、所述酸敏感连接单元与TAMRA(5/6)以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下反应，得化合物H；所述TAMRA(5/6)、酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1：(1～3)：(3～10)；

B、在TEA存在的条件下，化合物H和DSC反应，得到反应中间体，该中间体直接与dUTP(AP3)反应，得到化合物K；所述化合物H、DSC、TEA和dUTP(AP3)的摩尔比为1：(5～12)：(6～15)：(2～4)。

优选的，R为N₃时，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤：

A、所述酸敏感连接单元Y011在碱性条件下与DSC反应，得DSC-Y011化合物，不经分离纯化继续在碱性条件下与dUTP-NH2反应得Y013化合物

B、荧光素FITC与丙炔胺反应得化合物Y014

C、Y013化合物与Y014化合物发生点击化学反应得最终产物可逆终端；

A、所述酸敏感连接单元与FITC以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下反应，得化合物FITC-OH所述FITC、酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1：(1～3)：(3～10)；

B、在TEA存在的条件下，化合物FITC-OH和DSC反应，得到反应中间体，该中间体直接与dCTP(AP₃)反应，得最终产物即可逆终端dCTP-acidlabile linker-FITC；所述化合物FITC-OH、DSC、TEA和dCTP(AP₃)的摩尔比为1：(5～12)：(6～15)：(2～4)；

所述核苷酸dCTP(AP₃)是通过如下步骤合成的：

B、化合物dC(AP₃)的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，化合物F₂和dC-I反应，得化合物dC(AP3)所述dC-I、F₂、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1:(2～3):0.072:0.025:(1.5～2)；

C、化合物dCTP(AP3)的合成：化合物dC(AP3)与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dCTP(AP₃)；

所述E-4、E-3和dC(AP3)的摩尔比为2:2:1。

A、所述酸敏感连接单元与荧光素Cy5发生亲核取代反应得到反应产物Cy5-OH该产物需要用制备HPLC纯化；

B、将上述反应产物Cy5-OH与DSC反应后，不经分离纯化直接与之前合成的dATP(AP3)反应得到最终产物即可逆终端dATP-acidlabile linker-Cy5，该产物需要用HPLC纯化；

所述核苷酸dATP(AP3)是通过如下步骤合成的：

C、化合物dATP(AP3)的合成：化合物dA(AP3)与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dATP(AP₃)；

所述E-4、E-3和dA(AP3)的摩尔比为2:2:1。

A、所述酸敏感连接单元与荧光素Cy3.5发生亲核取代反应得到反应产物Cy3.5-OH该产物需要用制备HPLC纯化；

B、将上述反应产物Cy3.5-OH与DSC反应后，不经分离纯化直接与之前合成的dGTP(AP3)反应得到最终产物即可逆终端dGTP-acidlabile linker-Cy3.5，该产物需要用HPLC纯化；

所述核苷酸dGTP(AP3)是通过如下步骤合成的：

C、化合物dGTP(AP3)的合成：化合物dG₃与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dGTP(AP₃)，

所述E-4、E-3和dG₃的摩尔比为2:2:1；

所述核苷dG₁是通过如下步骤合成的：

A、化合物dG₁-B的合成：dG₁-A在碱性条件下，用新戊酰氯保护得化合物dG₁-B；

C、化合物dG₁-D的合成：化合物dG₁-C在碱性条件下去保护基得化合物dG₁-D；

D、化合物dG₁ 的合成：化合物dG₁-D在碱性条件下去甲基，得化合物dG₁；

所述核苷dG₁也可以通过如下步骤合成：

本发明具有如下有益效果：本发明合成了一类新的酸敏感可裂解连接单元，并用于合成了基于这种连接单元的四色荧光标记四个不同碱基的可逆终端；该类可逆终端均可用于DNA合成测序及单分子测序；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1的酸敏感连接单元的合成示意图；

图2为实施例2的酸敏感连接单元的合成示意图；

图3为实施例3的酸敏感连接单元的合成示意图；

图4为实施例4的酸敏感连接单元的合成示意图；

图5为实施例5的酸敏感连接单元的合成示意图；

图6为实施例6的酸敏感连接单元的合成示意图；

图7为实施例7的酸敏感连接单元的合成示意图；

图8为实施例8的酸敏感连接单元的合成示意图；

图9为实施例9的酸敏感连接单元的合成示意图；

图10为实施例10的酸敏感连接单元的合成示意图；

图11为实施例11合成基于酸敏感连接单元的可逆终端的总的示意图；

图12为实施例11的基于丙酮叉连接单元的可逆终端的合成示意图；

图13为实施例11的核苷酸dUTP的合成示意图；

图14为实施例11中化合物F₃合成核苷酸dUTP的具体合成示意图；

图15为实施例4的基于酸敏感连接单元的可逆终端的合成示意图；

图16为实施例5的基于酸敏感连接单元的可逆终端的合成示意图；

图17为实施例6的基于酸敏感连接单元的可逆终端的合成示意图；

图18为实施例7的基于酸敏感连接单元的可逆终端的合成示意图；

图19为实施例8的基于酸敏感连接单元的可逆终端的合成示意图；

图20为实施例9的基于酸敏感连接单元的可逆终端的合成示意图；

图21为实施例10的基于酸敏感连接单元的可逆终端的合成示意图；

图22为实施例1的基于酸敏感连接单元(R＝N₃)的可逆终端的合成示意图；

图23(A)为实施例20中dCTP(AP3)的合成示意图；

图23(B)为实施例1的基于酸敏感连接单元的可逆终端dCTP-linker-FITC的合成示意图；

图24(A)为dATP(AP3)的合成示意图；

图24(B)为实施例1的基于酸敏感连接单元的可逆终端dATP-linker-Cy5的合成示意图；

图25(A)为dGTP(AP3)的合成示意图；

图25(B)为dG-I的合成示意图；

图25(C)为实施例1的基于酸敏感连接单元的可逆终端dGTP-linker-Cy3.5的合成示意图；

图26为实施例11的可逆终端的¹H-NMR谱图；

图27为实施例11的可逆终端的³¹P NMR谱图；

图28为实施例11的可逆终端的HRMS谱图；

图29为实施例11的可逆终端的HPLC谱图；

图30为实施例23的酸敏感连接单元的合成示意图；

图31为实施例11、17、18、19、20、21、22的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图；其中，a为荧光扫描示意图，b为GR染色示意图；

图32为实施例12的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图；其中，a为荧光扫描示意图，b为GR染色示意图；

图33为实施例13的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图；其中，a为荧光扫描示意图，b为GR染色示意图；

图34为实施例14、15、16、24的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图；其中，a为荧光扫描示意图，b为GR染色示意图；

图35为实施例24的酸敏感连接单元以及相应的可逆终端的合成示意图；

图36为前期合成的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图；其中，a为荧光扫描示意图，b为GR染色示意图；

图37为荧光核苷酸dUTP(实施例11、12、13、14、15、24)的DNA链延伸反应；

图38为实施例20中荧光标记的dCTP可逆终端DNA链延伸反应；

图39为实施例22中荧光标记的dGTP可逆终端DNA链延伸反应；

图40为实施例21中的荧光标记的dATP可逆终端DNA链延伸反应。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。

本发明所得中间产物及最终产物采用NMR等进行表征。

实施例1、当m＝n＝0,R ₁ ＝R ₂ ＝Me,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感缩酮连接单元的合成示意图如图1所示，具体步骤如下：

第一步、化合物MAG的合成：

称取乙二醇(18.61g，300mmol)和乙酸(6g，99.9mmol)于100ml单口瓶中搅拌，滴加0.112ml浓硫酸于反应中，在25度下搅拌24h，加入17ml饱和碳酸氢钠溶液搅拌过夜，向反应中加入12ml水并用二氯甲烷50*8萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂用DCM：MeOH30:1柱层析得纯品6.3g。产率60.6％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.20(t,2H,J＝4.8Hz),3.82(t,2H,J＝4.8Hz),2.09(s,3H),1.93(s,1H).

第二步、化合物Y008的合成：

将MAG(6.3g，60.6mmol)于150ml单口瓶中，加入87ml无水THF，加入PPTS(0.725g，2.89mmol)搅拌15min，加入28.8g5A分子筛搅拌15min，加入2-甲氧基丙烯(2.4ml，25.9mmol)在室温下搅拌48h，加入碳酸钾粉末使呈中性，过滤旋去滤液得粗品7.3g，PE：EA3:1柱层析分离得纯品3.8g。产率59.4％¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.20(t,4H,J＝4.8Hz),3.66(t,4H,J＝4.8Hz),2.08(s,6H),1.38(s,6H).

第三步、化合物Y009的合成：

取Y008(2g，8.06mmol)于100ml单口瓶中，加入20ml甲醇搅拌，加入碳酸钾(3.339g，24.19mmol)及1ml水于25度下搅拌过夜，将反应液用硅藻土过滤，将滤液旋干，用二氯甲烷溶解过滤旋干得产品1.23g。产率93.2％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.72(t,4H,J＝4.4Hz),3.58(t,4H,J＝4.8Hz),2.57(bs,2H),1.41(s,6H).

第四步、化合物Y010的合成：

将Y009(1g，6.098mmol)溶于7.5ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.43ml EtN₃(三乙胺)，再逐滴加入溶于1.5ml DCM中的TsCl(0.291g，1.524mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA2.5:1柱层析过柱，得a纯品380mg。产率78.4％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.79(d,2H,J＝8.0Hz),7.34(d,2H,J＝8.0Hz),4.14(t,2H,J＝4.8Hz),3.71～3.63(m,4H),3.49(t,2H,J＝4.8Hz),2.45(s,3H),1.32(s,6H).

第五步、化合物Y011的合成：

称取Y010(187mg，0.59mmol)于单口瓶中，加入2.5ml DMF搅拌后再加入NaN₃(84.1mg，1.29mmol)于80℃下搅拌过夜，冷却至室温后加入10ml水并用乙酸乙酯15*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE：EA3:1柱层析得纯品39mg，产率35％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.74(t,2H,J＝4.8Hz),3.64～3.57(m,4H),3.37(t,2H,J＝4.8Hz),2.09(s,1H),1.40(s,6H).

第六步、化合物Y012的合成：

将Y011(46mg，0.243mmol)溶于3ml甲醇中，并加入5mg Pd/C(10％)抽真空，充入氢气于25℃下搅拌过夜，过滤并旋干溶剂，用DCM：MeOH10:1柱层析分离得纯品25mg。产率64％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.73(t,2H,J＝4.4Hz),3.60～3.57(m,4H),2.89(t,2H,J＝4.8Hz),2.83(s,1H),1.38(s,6H).

实施例2、当m＝n＝3,R ₁ ＝R ₂ ＝Me,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感缩酮连接单元的合成示意图如图2所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y1的合成：

称取三缩四乙二醇(58.2g，300mmol)和乙酸(6g，99.9mmol)于100ml单口瓶中搅拌，滴加0.112ml浓硫酸于反应中，在25度下搅拌24h，加入17ml饱和碳酸氢钠溶液搅拌过夜，向反应中加入30ml水并用二氯甲烷50*8萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂用DCM：MeOH20:1柱层析得纯品15.576g。产率66％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.21(t,2H,J＝4.8Hz),3.67～3.63(m,12H),3.45(t,2H,J＝4.8Hz),2.07(s,3H).

第二步、化合物Y2的合成：

将Y1(14.3g，60.6mmol)于150ml单口瓶中，加入87ml无水THF，加入PPTS(0.725g，2.89mmol)搅拌15min，加入28.8g5A分子筛搅拌15min，加入2-甲氧基丙烯(2.4ml，25.9mmol)在室温下搅拌48h，加入碳酸钾粉末使呈中性，过滤旋去滤液，PE：EA3:1柱层析分离得纯品7.293g。产率55％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.22～4.20(m,4H),3.68～3.65(m,28H),2.07(s,6H),1.38(s,6H).

第三步、化合物Y3的合成：

取Y2(4.127g，8.06mmol)于100ml单口瓶中，加入20ml甲醇搅拌，加入碳酸钾(3.339g，24.19mmol)及1ml水于25度下搅拌过夜，将反应液用硅藻土过滤，将滤液旋干，用二氯甲烷溶解过滤旋干得产品3.243g。产率94％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.76～ 3.74(m,28H),3.61(t,4H,J＝4.8Hz),2.59(bs,2H),1.41(s,6H).

第四步、化合物Y4的合成：

将Y3(2.61g，6.1mmol)溶于7.5ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.43ml EtN₃，再逐滴加入溶于1.5ml DCM中的TsCl(0.291g，1.524mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA2.5:1柱层析过柱，得纯品656mg。产率74％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.81(d,2H,J＝8.0Hz),7.36(d,2H,J＝8.0Hz),4.18～4.15(m,2H),3.73～3.52(m,30H),2.47(s,3H),1.34(s,6H).

第五步、化合物Y5的合成：

称取Y4(687mg，1.18mmol)于单口瓶中，加入5.0ml DMF搅拌后再加入NaN₃(168mg，2.58mmol)于80℃下搅拌过夜，冷却至室温后加入20ml水并用乙酸乙酯25*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE：EA3:1柱层析得纯品214mg，产率40％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.77(t,2H,J＝4.8Hz),3.68～3.60(m,28H),3.39(t,2H,J＝4.8Hz),2.1(s,1H),1.42(s,6H).

第六步、化合物Y6的合成：

将Y5(222mg，0.49mmol)溶于6ml甲醇中，并加入22mg Pd/C(10％)抽真空，充入氢气于25°下搅拌过夜，过滤并旋干溶剂，用DCM：MeOH10:1柱层析分离得纯品136mg。产率65％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.78(t,2H,J＝4.8Hz),3.64～3.60(m,28H),2.91(t,2H,J＝4.8Hz),2.78(s,1H),1.41(s,6H).

实施例3、当m＝n＝10,R ₁ ＝R ₂ ＝Me,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感缩酮连接单元的合成示意图如图3所示，具体步骤如下：

第一步、化合物H1的合成：

称取十一乙二醇(50.2g，100mmol)和乙酸(2g，33.3mmol)于250ml单口瓶中搅拌，滴加0.04ml浓硫酸于反应中，在25度下搅拌24h，加入8ml饱和碳酸氢钠溶液搅拌过夜，向反应中加入20ml水并用二氯甲烷50*8萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂用DCM：MeOH20:1柱层析得纯品11.412g。产率63％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.22(t,2H,J＝4.8Hz),3.68～3.63(m,40H),3.46(t,2H,J＝4.8Hz),2.07(s,3H).

第二步、化合物H2的合成：

将H1(16.48g，30.3mmol)于100ml单口瓶中，加入50ml无水THF，加入PPTS(0.363g，1.445mmol)搅拌15min，加入15g5A分子筛搅拌15min，加入2-甲氧基丙烯(1.2ml，12.95mmol)在室温下搅拌48h，加入碳酸钾粉末使呈中性，过滤旋去滤液，PE：EA3:1柱层析分离得纯品7.6g。产率52％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.21～4.20(m,4H),3.68～3.64(m,84H),2.07(s,6H),1.38(s,6H).

第三步、化合物H3的合成：

取H2(9.092g，8.06mmol)于100ml单口瓶中，加入20ml甲醇搅拌，加入碳酸钾(3.339g，24.19mmol)及1ml水于25度下搅拌过夜，将反应液用硅藻土过滤，将滤液旋干，用二氯甲烷溶解过滤旋干得产品7.876g。产率93.6％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.77～3.74(m,84H),3.61(t,4H,J＝4.8Hz),2.60(bs,2H),1.41(s,6H).

第四步、化合物H4的合成：

将H3(12.53g，12mmol)溶于15ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.86ml EtN₃，再逐滴加入溶于3.0ml DCM中的TsCl(0.582g，3.0mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA2.5:1柱层析过柱，得纯品2.516g。产率70％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.81(d,2H,J＝8.0Hz),7.36(d,2H,J＝8.0Hz),4.17～4.15(m,2H),3.74～3.49(m,86H),2.47(s,3H),1.35(s,6H).

第五步、化合物H5的合成：

称取H4(707mg，0.59mmol)于单口瓶中，加入2.5ml DMF搅拌后再加入NaN₃(84.1mg，1.29mmol)于80°下搅拌过夜，冷却至室温后加入10ml水并用乙酸乙酯15*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE：EA3:1柱层析得纯品202mg，产率32％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.77(t,2H,J＝4.8Hz),3.68～3.60(m,84H),3.39(t,2H,J＝4.8Hz),2.10(s,1H),1.42(s,6H).

第六步、化合物H6的合成：

将H5(513mg，0.48mmol)溶于6ml甲醇中，并加入51mg Pd/C(10％)抽真空，充入氢气于25°下搅拌过夜，过滤并旋干溶剂，用DCM：MeOH10:1柱层析分离得纯品300mg。产率60％。¹H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.78(t,2H,J＝4.8Hz),3.65～3.60(m,84H),2.91(t,2H,J＝4.8Hz),2.79(s,1H),1.41(s,6H).

实施例4、当m＝n＝0,R ₁ +R ₂ ＝环己基,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感缩酮连接单元的合成示意图如图4所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y018的合成：

称取环己酮(30g，0.31mol)及原甲酸三甲酯(39g，0.37mol)于单口瓶中，加入pTSA(0.57g，0.003mol)室温搅拌2h，用分馏柱分离，甲酸甲酯、甲醇先分离出来，然后是原甲酸三甲酯，收集125～138℃的馏分，为目标产物，得16.7g。¹H NMR(400MHz, CDCl₃):δppm4.61(t,1H,J＝3.6Hz),3.50(s,3H),2.07～2.03(m,4H),1.70～1.64(m,2H),1.59～1.51(m,2H).

第二步、化合物Y019的合成：

将乙二醇单乙酸酯(5.22g，50.2mmol)溶于75mL无水THF中，依次加入对甲苯磺酸(477mg，2.5mmol)和5A分子筛(23.75g)并在室温下搅拌15min。然后加入化合物Y018(2.25g，20.1mmol)并在室温下搅拌48h。加入475mg NaHCO₃淬灭反应并搅拌10min后过滤，将滤液旋除后用PE：EA6:1柱层析得淡黄色油状物(2.1g，46％)¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.21(t,4H,J＝4.8Hz),3.64(t,4H,J＝4.8Hz),2.07(s,6H),1.66(m,4H),1.59(m,4H),1.51(m,2H).

第三步、化合物Y020的合成：

将得到的Y019(2g，6.94mmol)溶于20m L甲醇中，加入碳酸钾(2.886g，20.9mmol)和1ml水，并在室温下搅拌15h，用硅藻土过滤，并用甲醇洗涤，旋除溶剂后用二氯甲烷溶解，过滤旋干得淡黄色油状物1.38g。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.75(t,4H,J＝4Hz),3.58(t,4H,J＝4.8Hz),2.35(bs,2H),1.69(m,4H),1.52(m,4H),1.43(m,2H).

第四步、化合物Y021的合成：

将Y020(1.36g，6.69mmol)溶于15ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.775ml EtN₃，再逐滴加入溶于5ml DCM中的TsCl(425mg，2.23mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA2:1柱层析得到460mg，产率57％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.79(d,2H,J＝8.4Hz),7.33(d,2H,J＝8.4Hz),4.15(t,2H,J＝4.8Hz),3.71～3.66(m, 2H),3.62(t,2H,J＝4.8Hz),3.46(t,2H,J＝4.8Hz),2.44(s,3H),1.60～1.57(m,4H),1.46～1.34(m,6H).

第五步、化合物Y022的合成：

称取Y021(416mg，1.162mmol)于单口瓶中，溶于3mlDMF，加入NaN₃于80摄氏度下搅拌过夜，向反应中加入15ml水，并用EA15*3萃取，最后将有机相合并，用饱和食盐水15ml洗涤，硅胶板分离得180mg。产率67.7％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.75～3.73(m,2H),3.62～3.55(m,4H),3.36(t,2H,J＝4.8Hz),2.06(s,1H),174～1.61(m,4H),1.57～1.49(m,4H),1.47～1.37(m,2H).

第六步、化合物Y023的合成：

称取Y023(170mg，0.742mmol)于单口瓶中，加入17mgPd/C及10mL甲醇抽真空后，通入氢气于室温下搅拌过夜，过滤，得117mg，产率77.7％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.72(t,2H,J＝4.4Hz),3.57～3.50(m,4H),2.84(t,2H,J＝5.2Hz),2.26(s,3H),1.67～1.64(m,4H),1.53～1.46(m,4H),1.42～1.37(m,2H).

实施例5、当m＝n＝0,R ₁ +R ₂ ＝环戊基,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感缩酮连接单元的合成示意图如图5所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y026的合成：

称取环戊酮(26g，0.309mol)及原甲酸三甲酯(39.36g，0.371mol)于单口瓶中，于冰浴中加入pTSA(0.588g，0.00309mol)搅拌20min后，室温搅拌2h，用分馏柱分离，甲酸甲酯、甲醇先分离出来，然后是原甲酸三甲酯，收集106～114℃的馏分，为目标产物，得16.7g，产率55％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.46～4.44(m,1H), 3.59(s,3H),2.35～2.28(m,4H),1.92～1.83(m,2H)。

第二步、化合物Y027的合成：

将乙二醇单乙酸酯(5.5g，52.88mol)溶于55mL无水THF中，并依此加入PPTS(0.664g，2.64mmol))和5A分子筛(22.5g)及化合物Y026(2.748g，28.41mmol)，在室温下搅拌48h。加入668mg NaHCO₃淬灭反应并搅拌10min后过滤，将滤液旋除后用PE：EA7:1柱层析得油状物(3.7g，51％)¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.22-4.19(t,4H,J＝4.8Hz),3.67-3.65(t,4H,J＝4.8Hz),2.07(s,6H),1.79(m,4H),1.69(m,4H).

第三步、化合物Y028的合成：

将得到的Y027(2g，7.3mmol)溶于20m L甲醇中，加入碳酸钾(3.023g，21.3mmol)和1.023ml水，并在室温下搅拌3h，用硅藻土过滤，并用甲醇洗涤，旋除溶剂后用二氯甲烷溶解，过滤旋干得油状物720mg。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.75-3.71(m,4H),3.61-3.58(m,4H),1.84-1.77(m,4H),1.71-1.65(m,4H)。

第四步、化合物Y029的合成：

将Y028(720mg，3.79mmol)溶于8ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.35ml EtN₃，再逐滴加入溶于2ml DCM中的TsCl(255mg，1.26mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA3:1柱层析得244mg，产率56％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.79(d,2H,J＝8.4Hz),7.33(d,2H,J＝8.4Hz),4.15(t,2H,J＝4.8Hz),3.71～3.66(m,2H),3.64(t,2H,J＝4.8Hz),3.48(t,2H,J＝4.8Hz),2.44(s,3H),1.77～1.70(m,4H),1.66～1.60(m,4H).

第五步、化合物Y030的合成：

称取Y029(210mg，0.61mmol)于单口瓶中，溶于1.5mlDMF，加入NaN₃于80摄氏度下搅拌过夜，向反应中加入15ml水，并用EA10*3萃取，最后将有机相合并，用饱和食盐水15ml洗涤，旋除有机相后，用硅胶板分离(PE：EA1.5:1)得88mg。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.74(t,2H,J＝4.8Hz),3.64～3.57(m,4H),3.37(t,2H,J＝4.8Hz),2.07(s,1H),1.86～1.78(m,4H),1.72～1.64(m,4H).

第六步、化合物Y031的合成：

称取Y030(80mg，0.372mmol)于单口瓶中，加入8mgPd/C及5mL甲醇抽真空后，通入氢气于室温下搅拌过夜，过滤，得42mg，产率59.7％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.73(t,2H,J＝4.4Hz),3.60～3.52(m,4H),2.85(t,2H,J＝5.2Hz),1.93(s,3H),1.81～1.78(m,4H),1.70～1.65(m,4H).

实施例6、当m＝n＝0,R ₁ ＝苯基,R ₂ ＝甲基,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感缩酮连接单元的合成示意图如图6所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y036的合成：

称取苯乙酮(0.309mol)及原甲酸三甲酯(39.36g，0.371mol)于单口瓶中，于冰浴中加入pTSA(0.588g，0.00309mol)搅拌20min后，室温搅拌2h，分离纯化，收集目标产物，产率55％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.26-7.34(m,5H),4.46～4.44(m,2H),3.59(s,3H)。

第二步、化合物Y037的合成：

将乙二醇单乙酸酯(5.5g，52.88mol)溶于55mL无水THF中，并依此加入PPTS(0.664g，2.64mmol))和5A分子筛(22.5g)及化合物Y036(28.41mmol)，在室温下搅拌48h。加入668mg NaHCO₃淬灭反应并搅拌10min后过滤，将滤液旋除后用PE：EA7:1柱层析得油状物(3.7g，51％)¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.26-7.34(m,5H),4.22-4.19(t,4H,J＝4.8Hz),3.67-3.65(t,4H,J＝4.8Hz),2.07(s,6H),1.40(s,3H).

第三步、化合物Y038的合成：

将得到的Y037(7.3mmol)溶于20m L甲醇中，加入碳酸钾(3.023g，21.3mmol)和1.023ml水，并在室温下搅拌3h，用硅藻土过滤，并用甲醇洗涤，旋除溶剂后用二氯甲烷溶解，过滤旋干得油状物720mg。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.26-7.34(m,5H),3.75-3.71(m,4H),3.61-3.58(m,4H),1.40(s,3H)。

第四步、化合物Y039的合成：

将Y038(3.79mmol)溶于8ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.35ml EtN₃，再逐滴加入溶于2ml DCM中的TsCl(255mg，1.26mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA3:1柱层析得244mg，产率56％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.79(d,2H,J＝8.4Hz),7.33(d,2H,J＝8.4Hz),7.26-7.32(m,5H),4.15(t,2H,J＝4.8Hz),3.71～3.66(m,2H),3.64(t,2H,J＝4.8Hz),3.48(t,2H,J＝4.8Hz),2.44(s,3H),1.40(s,3H).

第五步、化合物Y040的合成：

称取Y039(210mg，0.61mmol)于单口瓶中，溶于1.5ml DMF，加入NaN₃于80摄氏度下搅拌过夜，向反应中加入15ml水，并用EA10*3萃取，最后将有机相合并，用饱和食盐水15ml洗涤，旋除有机相后，用硅胶板分离,得88mg。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.26-7.34(m,5H),3.74(t,2H,J＝4.8Hz),3.64～3.57(m,4H),3.37(t,2H,J＝4.8Hz),2.07(s,1H),1.41(s,3H).

第六步、化合物Y041的合成：

称取Y040(0.372mmol)于单口瓶中，加入8mg Pd/C及5mL甲醇抽真空后，通入氢气于室温下搅拌过夜，过滤，产率61％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.26-7.34(m,5H),3.73(t,2H,J＝4.4Hz),3.60～3.52(m,4H),2.85(t,2H,J＝5.2Hz),1.93(s,3H),1.40(s,3H).

实施例7、当m＝n＝0,R ₁ ＝对甲氧基苯基,R ₂ ＝H,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感连接单元的合成示意图如图7所示，具体步骤如下：

第一步、如下所述反应产物的合成

将MAG(2.72g，20mmol)置于单口瓶中，于冰浴下加入pTSA(0.656g，3.45mmol)及4A(10.4g)分子筛搅拌十分钟后，加入p-MBA搅拌4d后加入3mL TEA，过滤，并用EA洗涤，PE:EA:TEA8:1:1柱层析得1.6g。¹H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.37(d,2H,J＝8.8Hz),6.87(d,2H,J＝8.8Hz),5.61(s,1H),4.25～4.21(m,4H),3.79(s,3H),3.73～3.63(m,4H),2.07～2.05(m,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δppm170.3,159.3,130.2,127.7,113.5,100.7,63.1,63.0,55.1,20.6.

第二步、化合物Y035的合成

称取Y034(600mg,1.84mmol)于单口瓶中，溶于5.26mL甲醇中，并加入K₂CO₃(762mg,5.52mmol)及0.263mL水于室温下搅拌过夜，过滤旋干溶剂后再次溶于DCM中并过滤，旋除溶剂后得484mg.¹H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.38(d,2H,J＝8.8Hz),6.90(d,2H,J＝8.8Hz),5.55(s,1H),3.81(s,3H),3.78～3.74(m,4H),3.69～3.66(m,4H)；13C NMR(100MHz,CDCl₃):δppm160.0,130.3,128.0,113.8,102.6,67.8,61.8,55.4.

第三步、化合物Y036的合成

称取Y035(420mg,1.74mmol)于单口瓶中，加入6mLDCM溶解并置于冰浴中，加入TEA(293mg,2.9mmol)搅拌，将TsCl(111mg,0.58mmol)溶于2mL DCM中并加入到反应中搅拌过夜，旋除溶剂后，PE：EA：TEA2:1:0.1柱层析得122mg。¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm7.77(d,2H,J＝8.0Hz),7.40(d,2H,J＝8.0Hz),7.30(d,2H,J＝8.4Hz),6.88(d,2H,J＝8.4Hz),5.49(s,1H),4.18～4.09(m,2H),3.80(s,3H),3.66～3.46(m,6H),2.44(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl₃):δppm161.3,146.4,134.4,131.4,131.0,129.1,129.0,114.4,102.8,71.0,67.9,63.7,62.2,55.7,21.6.

第四步、化合物Y037的合成

称取Y036(100mg,0.253mmol)于单口瓶中，并溶于3mLDMF中，加入NaN3(36.1mg,0.556mmol)于80℃下搅拌过夜，加入15mL水，用EA15*3萃取后合并有机相用饱和食盐水洗涤后旋除溶剂得56mg。¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm7.42(d,2H,J＝8.4Hz),6.91(d,2H,J＝8.8Hz),5.60(s,1H),3.79(s,3H),3.77～3.54(m,6H),3.42(t,2H,J＝4.8Hz).

13C NMR(100MHz,CDCl₃):δppm161.4,131.7,129.1,114.6,103.0,67.9,65.4,62.3,55.7,52.1.

第五步、化合物Y038的合成

称取Y037(50mg,0.187mmol)于单口瓶中，加入5mL甲醇及5mg Pd/C，抽真空后注入氢气，于室温下搅拌过夜，过滤，旋除溶剂后得40mg。¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm7.41(d,2H,J＝8.4Hz),6.91(d,2H,J＝8.8Hz),5.55(s,1H),3.79(s,3H),3.71～3.50(m,6H),2.82(t,2H,J＝5.6Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δppm161.3,132.1,129.1,114.5,103.3,68.1,67.9,62.3,55.7,42.3.

实施例8、当m＝n＝0,R ₁ ＝4-甲氧基-1-萘基,R ₂ ＝H,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感连接单元的合成示意图如图8所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y041的合成

称取61.69g5A分子筛于单口瓶中，加入120mL无水THF，依次加入MAG(8.936g，85.92mmol)、pTSA(0.613g，3.22mmol)搅拌10min后加入4-甲氧基-1-萘甲醛后搅拌 48h，后向反应液中加入TEA是呈中性，过滤，滤液用EA洗涤，旋除溶剂后PE：EA6:1柱层析(2％TEA)得产品2.5g。¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm8.26～8.20(m,2H),7.66(d,2H,J＝8.0Hz),7.54～7.44(m,2H),6.68(d,1H,J＝8.0Hz),6.07(s,1H),4.23～4.19(m,4H),4.01(s,3H),3.75(t,2H,J＝4.8Hz),1.94(s,6H).13CNMR(100MHz,CDCl₃):δppm172.7,157.4,132.9,127.6,127.1,126.7,126.2,126.0,125.2,123.3,103.5,102.0,64.7,64.6,56.0,20.7.

第二步、化合物Y042的合成

称取Y041(2.4g,6.38mmol)于单口瓶中，溶于19mL甲醇中，并加入K₂CO₃(2.643g,19.15mmol)及0.95mL水于室温下搅拌,过滤旋干溶剂后再次溶于DCM中并过滤，旋除溶剂后得1.85g.¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm8.30～8.23(m,2H),7.72(d,1H,J＝8.0Hz),7.52～7.44(m,2H),6.88(d,1H,J＝8.0Hz),6.08(s,1H),4.01(s,3H),3.69～3.30(m,8H).13C NMR(100MHz,CDCl₃):δppm156.0,131.7,126.2,125.7,125.4,125.3,124.6,123.8,121.9,102.2,101.0,67.0,61.0,54.6.

第三步、化合物Y043的合成

称取Y042(1.8g,6.16mmol)于单口瓶中，加入23mL DCM溶解并置于冰浴中，加入TEA(1.43mL,10.28mmol)搅拌，将TsCl(392mg,2.06mmol)溶于2mL DCM中并加入到反应中搅拌过夜，旋除溶剂后，PE：EA2:1(2％TEA)柱层析得540mg。¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm8.27～8.24(m,1H),8.17～8.14(m,1H),7.65(d,2H,J＝8.0Hz),7.59(d,1H,J＝8.0Hz),7.51～7.43(m,2H),7.25(d,2H,J＝8.0Hz),6.85(d,1H,J＝8.0Hz),6.97(s,1H),4.18～4.12(m,2H),4.02(s,3H),3.74～3.63(m, 4H),3.56～3.53(m,2H),2.36(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl₃):δppm157.4,146.2,134.3,132.9,130.9,128.9,127.6,127.0,126.7,126.2,126.0,125.1,123.2,103.5,101.9,71.0,68.3,64.0,62.3,56.0,21.5.

第四步、化合物Y044的合成

称取Y043(330mg,0.740mmol)于单口瓶中，并溶于10mLDMF中，加入NaN3(106mg,1.63mmol)于80℃下搅拌过夜，加入50mL水，用EA55*3萃取后合并有机相用饱和食盐水洗涤后旋除溶剂后PE:EA2:1(2％TEA柱层析)得140mg。¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm8.30～8.24(m,2H),7.72(d,1H,J＝8.0Hz),7.54～7.44(m,2H),6.88(d,1H,J＝8.0Hz),6.12(s,1H),4.01(s,3H),3.74～3.59(m,6H),3.40～3.35(m,2H).13CNMR(100MHz,CDCl₃):δppm157.4,132.9,127.6,127.0,126.7,126.3,126.0,125.1,123.2,103.5,102.1,68.1,65.5,62.3,56.0.

第五步、化合物Y045的合成

称取Y044(130mg,0.41mmol)于单口瓶中，加入8mL甲醇及13mg Pd/C，抽真空后注入氢气，于室温下搅拌过夜，过滤，旋除溶剂后得85mg。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.26(t,2H,J＝8.8Hz),7.70(d,1H,J＝8.0Hz),7.54～7.43(m,2H),6.88(d,1H,J＝8.0Hz),6.05(s,1H),4.01(s,3H),3.71～3.68(m,2H),3.66～3.57(m,4H),2.78(t,2H,J＝5.2Hz).13C NMR(100MHz,MeOD)δ157.3,133.0,127.6,127.1,126.8,126.7,126.0,125.1,123.3,103.6,102.6,68.6,68.1,62.3,56.0, 42.3.

实施例9、当R ₁ ＝R ₂ ＝甲基，m＝1，n＝0,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感缩酮连接单元的合成示意图如图9所示，具体步骤如下：

第一步、化合物MAG和MAG-2的合成：

称取乙二醇(18.61g，300mmol)和乙酸(6g，99.9mmol)于100ml单口瓶中搅拌，滴加0.112ml浓硫酸于反应中，在25度下搅拌24h，加入17ml饱和碳酸氢钠溶液搅拌过夜，向反应中加入12ml水并用二氯甲烷50*8萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂用DCM：MeOH30:1柱层析得纯品6.3g。产率60.6％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.20(t,2H,J＝4.8Hz),3.82(t,2H,J＝4.8Hz),2.09(s,3H),1.93(s,1H).将上述乙二醇换成二聚乙二醇得化合物MAG-2。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.20(t,2H,J＝4.8Hz),3.82(m,6H),2.09(s,3H).

第二步、化合物H2的合成：

将H1(16.48g，30.3mmol)于100ml单口瓶中，加入50ml无水THF，加入PPTS(0.363g，1.445mmol)搅拌15min，加入15g5A分子筛搅拌15min，加入2-甲氧基丙烯(1.2ml，12.95mmol)在室温下搅拌48h，加入碳酸钾粉末使呈中性，过滤旋去滤液，PE：EA3:1柱层析分离得纯品7.6g。产率52％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.20(t,8H,J＝4.8Hz),3.66(t,4H,J＝4.8Hz),2.08(s,6H),1.38(s,6H).

第三步、化合物H3的合成：

取H2(9.092g，8.06mmol)于100ml单口瓶中，加入20ml甲醇搅拌，加入碳酸钾(3.339g，24.19mmol)及1ml水于25度下搅拌过夜，将反应液用硅藻土过滤，将滤液旋干，用二氯甲烷溶解过滤旋干得产品7.876g。产率93.6％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.72(t,8H,J＝4.4Hz),3.58(t,4H,J＝4.8Hz),2.57(bs,2H),1.41(s,6H).

第四步、化合物H4的合成：

将H3(12.53g，12mmol)溶于15ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.86ml EtN₃，再逐滴加入溶于3.0ml DCM中的TsCl(0.582g，3.0mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA2.5:1柱层析过柱，得纯品2.516g。产率70％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.79(d,2H,J＝8.0Hz),7.34(d,2H,J＝8.0Hz),4.14(t,2H,J＝4.8Hz),3.71～3.63(m,8H),3.49(t,2H,J＝4.8Hz),2.45(s,3H),1.32(s,6H).

第五步、化合物H5的合成：

称取H4(707mg，0.59mmol)于单口瓶中，加入2.5ml DMF搅拌后再加入NaN₃(84.1mg，1.29mmol)于80°下搅拌过夜，冷却至室温后加入10ml水并用乙酸乙酯15*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE：EA3:1柱层析得纯品202mg，产率32％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.74(t,2H,J＝4.8Hz),3.64～3.57(m,8H),3.37(t,2H,J＝4.8Hz),2.09(s,1H),1.40(s,6H).

第六步、化合物H6的合成：

将H5(513mg，0.48mmol)溶于6ml甲醇中，并加入51mg Pd/C(10％)抽真空，充入氢气于25°下搅拌过夜，过滤并旋干溶剂，用DCM：MeOH10:1柱层析分离得纯品300mg。产率60％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.73(t,2H,J＝4.4Hz),3.60～3.57(m,8H),2.89(t,2H,J＝4.8Hz),2.83(s,1H),1.38(s,6H).

实施例10、当R ₁ ＝甲基，R ₂ ＝乙基，n＝m＝0时；该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感连接单元的合成示意图如图10所示，具体步骤如下：

第一步、化合物MAG的合成：

第二步、化合物Y008的合成：

将MAG(6.3g，60.6mmol)于150ml单口瓶中，加入87ml无水THF，加入PPTS(0.725g，2.89mmol)搅拌15min，加入28.8g5A分子筛搅拌15min，加入2-甲氧基丙烯(2.4ml，25.9mmol)在室温下搅拌48h，加入碳酸钾粉末使呈中性，过滤旋去滤液得粗品7.3g，PE：EA3:1柱层析分离得纯品3.8g。产率59.4％.¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm4.20(t,4H,J＝4.8Hz),3.66(t,4H,J＝4.8Hz),2.08(s,6H),1.76(q,2H),1.38(s,3H),0.96(t,3H).

第三步、化合物Y009的合成：

取Y008(2g，8.06mmol)于100ml单口瓶中，加入20ml甲醇搅拌，加入碳酸钾(3.339g，24.19mmol)及1ml水于25度下搅拌过夜，将反应液用硅藻土过滤，将滤液旋干，用二氯甲烷溶解过滤、旋干,得产品1.23g。产率93.2％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.72(t,4H,J＝4.4Hz),3.58(t,4H,J＝4.8Hz),2.57(bs,2H),1.76(q,2H),1.38(s,3H),0.96(t,3H).

第四步、化合物Y010的合成：

将Y009(1g，6.098mmol)溶于7.5ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.43ml EtN₃(三乙胺)，再逐滴加入溶于1.5ml DCM中的TsCl(0.291g，1.524mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA2.5:1柱层析过柱，得a纯品380mg。产率78.4％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm7.79(d,2H,J＝8.0Hz),7.34(d,2H,J＝8.0Hz),4.14(t,2H,J＝4.8Hz),3.71～3.63(m,4H),3.49(t,2H,J＝4.8Hz),2.45(s,3H),1.76(q,2H),1.38(s,3H),0.96(t,3H).

第五步、化合物Y011的合成：

称取Y010(187mg，0.59mmol)于单口瓶中，加入2.5ml DMF搅拌后再加入NaN₃(84.1mg，1.29mmol)于80℃下搅拌过夜，冷却至室温后加入10ml水并用乙酸乙酯15*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE：EA3:1柱层析得纯品39mg，产率35％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.74(t,2H,J＝4.8Hz),3.64～3.57(m,4H),3.37(t,2H,J＝4.8Hz),2.09(s,1H),1.76(q,2H),1.38(s,3H),0.96(t,3H).

第六步、化合物Y012的合成：

将Y011(46mg，0.243mmol)溶于3ml甲醇中，并加入5mg Pd/C(10％)抽真空，充入氢气于25℃下搅拌过夜，过滤并旋干溶剂，用DCM：MeOH10:1柱层析分离得纯品25mg。产率64％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δppm3.73(t,2H,J＝4.4Hz),3.60～3.57(m,4H),2.89(t,2H,J＝4.8Hz),2.83(s,1H),1.76(q,2H),1.39(s,3H),0.94(t,3H).

实施例11、基于该类可裂解连接单元的可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例1的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11(当R₁＝R₂＝Me,碱基为U,荧光素为TAMRA时,为图12所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y016的合成：

将Y012(10mg，0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的TAMRA(20mg，0.038mmol)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，30％～60％CH₃OH(20min)，60％～80％CH₃OH(20min)，可见光检测器：546nm。在t＝22.8min时有产物峰生成，制备HPCL分离得到15mg，产率69％。¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δppm8.52(d,1H,J＝1.6Hz),8.06(dd,1H,J＝2.0Hz；8.0Hz),7.36(d,1H,J＝7.6Hz),7.25(d,2H,J＝9.2Hz),7.02(dd,2H,J＝2.8Hz；9.6Hz),6.91(d,2H,J＝2.4Hz),3.72(t,2H,J＝6Hz),3.67～3.60(m,4H),3.59～3.55(m,2H),3.27(s,12H)),1.40(s,6H).

第二步、化合物Y017的合成：

称取Y016(9mg，0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(16mg，0.031mmol)溶于1.5mL Na2CO3/NaHCO3缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，0％～20％CH₃OH(35min)，可见光检测器：546nm。在t＝27.9min时有产物峰生成,制备HPLC分离得化合物Y0172.8mg.产率16.1％。产物的¹H-NMR，³¹P NMR，HRMS和HPLC谱图如图26、27、28、29所示，其中HPLC谱图对应的峰值表如表1所示：¹H-NMR(400MHz,D₂O):δppm8.31(s,1H),8.27(d,1H,J＝7.6Hz),7.68(s,1H),7.52(d,1H,J＝7.6Hz),7.26(d,2H,J＝9.2Hz),7.01(d,1H,J＝9.6Hz),6.95(d,1H,J＝9.6Hz),6.86(d,1H,J＝9.6Hz),6.75(s,1H),6.66(s,1H),5.70(s,1H),4.40(s,1H),4.04～4.00(m,4H),3.87～4.73(m,7H),3.62～3.58(m,2H),3.24(d,12H,J＝11.2),2.19～1.91(m,2H),1.47(d,6H,J＝10Hz).³¹P NMR(D₂O,162MHz):δ-5.11,-10.56,-19.06。HRMS:calcfor C₄₅H₅₂N₆O₂₂P₃[M+3H]⁺1121.2348,found1121.2373；calc for C₄₅H₅₁N₆O₂₂P₃Na[M+2H+Na]⁺1143.2167,found1143.2161；calc.for C₄₅H₅₁N₆O₂₂P₂[M+2H]⁺1041.2684,found1041.2681.

表1

本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成示意图如图13、14，具体包括如下步骤：

第一步、化合物F₂的合成：

向一单口瓶中加入60ml甲醇，冰水浴下搅拌，加入丙炔胺(60mmol，3.3042g)，搅拌15分钟后缓慢加入三氟乙酸甲酯(86.7mmol，11.0957g)，10分钟后撤去冰水浴，室温下反应24小时。反应用TLC板进行监测，PE:EA＝8:1，烤板，R_f＝0.5产生新点为产物F2。减压蒸馏(51℃，280Pa)，得3.53g,产率39％。¹H NMR(CDCl₃,300MHz):δ2.32(t,J＝4.0Hz,1H),4.13-4.15(m,2H),6.92(s,1H)。

第二步、化合物F₃的合成：

向一单口瓶中加入F1(0.7mmol，247mg)，再称取9.7mgCuI和20.3mg Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入2.3ml DMF，搅拌溶解，加入0.2ml TEA，称取F2(254mg,1.7mmol)用DMF溶解后加入上述反应瓶中，室温搅拌，反应过夜。TLC板监测，EA为展开剂，Rf＝0.35为原料F1，Rf＝0.32为产物F3，两点位置非常接近。待反应结束后，减压蒸干溶剂，直接柱层析分离，20:1DCM:MeOH为淋洗剂，得214mg,产率61％。

¹H NMR(DMSO-D₆,300MHz):δ2.11(t,J＝5.1Hz,2H),3.56-3.58(m,2H),3.78(m,1H),4.21(d,J＝5.1Hz,3H),5.08(t,J＝5.1Hz,1H),5.23(d,J＝4.2Hz,1H),6.09(t,J＝6.6Hz,1H),8.18(s,1H),10.05(t,J＝4.8Hz,1H),11.63(s,1H).

第三步、化合物dUTP(AP3)的合成：

在手套箱中分别称取化合物F₃(6mmol)、三正丁胺焦磷酸盐(E-4)150mg(0.32mmol)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)66mg(0.32mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.5mL无水DMF中，再加入0.6mL新蒸的三正丁胺，搅拌半小时。把2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮溶于0.5mL无水DMF中，激烈搅拌下通过注射器加入上述三正丁胺焦磷酸盐溶液，搅拌半小时。然后将该混合液注入到F₃中，搅拌1.5h。加入5mL3％碘(9:1Py/H2O)溶液。15min后加入4mL水，搅拌2h。加入0.5mL3M NaCl溶液，再加入30mL无水乙醇，-20℃冷冻过夜，离心(3200r/min，25℃)20min。倾去上清液，得沉淀，抽干溶剂。再依次加入TEAB溶液和浓氨水，室温搅拌过夜。减压蒸干溶剂，出现白色固体，得dUTP-NH₂。用分析型HPLC进行分析，条件：柱子：C18,10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mMTEAAc和CH₃CH₂OH，梯度洗涤，0％-20％CH₃CH₂OH(35min)；紫外检测器：254nm。在t＝13.5min时有产物峰生成。¹H NMR(D₂O,400MHz):δ2.34-2.48(m,2H),4.03(s,2H),4.20-4.29(m,3H),4.61-4.64(m,1H),6.27(t,J＝6.4Hz,1H),8.38(s,1H)。³¹P NMR(D2O,161MHz):δ-22.22,-11.45,-9.90。HRMS:calc for C₁₂H₁₉N₃O₁₄P₃[M+H]⁺522.0080,found522.0070；calcfor C₁₂H₁₈N₃O₁₄P₃Na[M+Na]⁺543.9899,found543.9883。

实施例12、基于该类可裂解连接单元的可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例4的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11(当R₁与R₂构成环己基,碱基为U,荧光素为TAMRA时,为图15)所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y032的合成：

将Y023(0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的TAMRA(20mg，0.038mmol)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后HPLC分离，得到19mg。1H NMR(400MHz,CD₃OD):δppm8.52(d,1H,J＝1.6Hz),8.06(dd,1H,J＝2.0Hz；8.0Hz),7.36(d,1H,J＝7.6Hz),7.25(d,2H,J＝9.2Hz),7.02(dd,2H,J＝2.8Hz；9.6Hz),6.91(d,2H,J＝2.4Hz),3.72(t,2H,J＝4.4Hz),3.57～3.50(m,4H),2.84(t,2H,J＝5.2Hz),2.26(s,3H),1.67～1.64(m,4H),1.53～1.46(m,4H),1.42～1.37(m,2H).

第二步、化合物Y033的合成：

称取Y032(0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(AP₃)16mg，0.031mmol)溶于1.5mLNa2CO3/NaHCO3缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，HPLC分离得化合物Y0333.2mg.

¹H-NMR(400MHz,D₂O):δppm8.31(s,1H)8.27(d,1H,J＝7.6Hz),7.68(s,1H),7.52(d,1H,J＝7.6Hz),7.26(d,2H,J＝9.2Hz),7.01(d,1H,J＝9.6Hz),6.95(d,1H,J＝9.6Hz),6.86(d,1H,J＝9.6Hz),6.75(s,1H),6.66(s,1H),5.70(s,1H),4.40(s,1H),4.04～4.00(m,4H),3.87～4.73(m,7H),3.62～3.58(m,2H),3.24(d,12H,J＝11.2),2.19～1.91(m,2H),1.67～1.64(m,4H),1.53～1.46(m,4H),1.42～1.37(m,2H)；HRMS:calc for C₄₈H₅₃N₆O₂₂P₃M⁺1158.2448,found1158.2467；本实施例中核苷酸dUTP(AP₃)的合成示意图如图12、13所示。

实施例13、基于该类可裂解连接单元的可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例5的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11(当R₁与R₂构成环戊基,碱基为U,荧光素为TAMRA时,为图16)所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y034的合成：

将Y031(0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的TAMRA(20mg，0.038mmol)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后HPLC分离，得到18mg。1H NMR(400MHz,CD₃OD):δppm8.52(d,1H,J＝1.6Hz),8.06(dd,1H,J＝2.0Hz；8.0Hz),7.36(d,1H,J＝7.6Hz),7.25(d,2H,J＝9.2Hz),7.02(dd,2H,J＝2.8Hz；9.6Hz),6.91(d,2H,J＝2.4Hz),3.73(t,2H,J＝4.4Hz),3.60～3.52(m,4H),2.85(t,2H,J＝5.2Hz),1.93(s,3H),1.81～1.78(m,4H),1.70～1.65(m,4H).

第二步、化合物Y035的合成：

称取Y034(0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(16mg，0.031mmol)溶于1.5mL Na2CO3/NaHCO3缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，HPLC分离得化合物Y035,产率17％。

¹H-NMR(400MHz,D₂O):δppm8.31(s,1H)8.27(d,1H,J＝7.6Hz),7.68(s,1H),7.52(d,1H,J＝7.6Hz),7.26(d,2H,J＝9.2Hz),7.01(d,1H,J＝9.6Hz),6.95(d,1H,J＝9.6Hz),6.86(d,1H,J＝9.6Hz),6.75(s,1H),6.66(s,1H),5.70(s,1H), 4.40(s,1H),4.04～4.00(m,4H),3.87～4.73(m,7H),3.62～3.58(m,2H),3.24(d,12H,J＝11.2),2.19～1.91(m,2H),1.81～1.78(m,4H),1.70～1.65(m,4H)；HRMS:calc for C₄₇H₅₁N₆O₂₂P₃M⁺1144.2291,found1144.2286；本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成示意图如图12、13所示。

实施例14、基于该类可裂解连接单元的可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例6的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11(当R₁＝Ph，R₂＝Me,碱基为U,荧光素为TAMRA时，为图17)所示，具体步骤如下：

第一步、化合物Y042的合成：

将Y041(0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的TAMRA(20mg，0.038mmol)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后HPLC分离，得到18mg。1H NMR(400MHz,CD₃OD):δppm8.52(d,1H,J＝1.6Hz),8.06(dd,1H,J＝2.0Hz；8.0Hz),7.36(d,1H,J＝7.6Hz),7.30-7.34(m,5H),7.25(d,2H,J＝9.2Hz),7.02(dd,2H,J＝2.8Hz；9.6Hz),6.91(d,2H,J＝2.4Hz),3.73(t,2H,J＝4.4Hz),3.60～3.52(m,4H),2.85(t,2H,J＝5.2Hz),1.93(s,3H),1.40(s,3H).

第二步、化合物Y043的合成：

称取Y042(0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(16mg，0.031mmol)溶于1.5mL Na2CO3/NaHCO3缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，HPLC分离得化合物Y043,产率19％。

HRMS:calc for C₅₀H₅₁N₆O₂₂P₃M⁺1180.2291,found1180.2267；本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成示意图如图12、13所示。

实施例15、当m＝n＝0,R ₁ ＝对甲氧基苯基,R ₂ ＝H,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例7的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11所示，当R₁＝对甲氧基苯基，R₂＝H时，碱基为U，荧光素为TAMRA时，具体为图18，具体步骤如下：

称取Y038(6.9mg,0.0284mmol)于单口瓶中，加入TAMRA(15mg,0.0284mmol)后溶于1.5mL无水DMF溶解，加入TEA(40uL,0.284mmol)室温搅拌4h，旋除溶剂后，HPLC分离得13mg。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.52(d,1H,J＝1.6Hz),8.03(dd,1H,J＝1.6,7.6Hz),7.44(d,2H,J＝8.4Hz),7.35(d,1H,J＝8.0Hz),7.26(d,2H,J＝9.2Hz),7.01(dd,2H,J＝2.4,9.6Hz),6.92～6.88(m,4H),5.61(s,1H),3.83～3.56(m,11H),3.27(s,12H).

称取反应物(0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(16mg，0.031mmol)溶于1.5mLNa₂CO₃/NaHCO₃缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，HPLC分离得化合物Y043,产率19％。HRMS:calcfor C₅₀H₅₁N₆O₂₃P₃M⁺1196.2240,found1196.2249；本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成示意图如图12、13所示。基于类似的反应条件,我们合成了基于本实施例连接单元的可逆终端dCTP-linker-荧光素(合成过程参照实施例20)，dATP-linker-荧光素(合成过程参照实施例21)以及dGTP-linker-荧光素(合成过程参照实施例22)。所以基于该连接单元的可逆终端已完成U，C，A，G四种不同碱基分别标记荧光素的可逆终端，并一起用于生物学评价。

实施例16、当m＝n＝0,R ₁ ＝4-甲氧基-1-萘基,R ₂ ＝H,R＝NH ₂ 时，该类可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例8的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11，所示，R₁＝4-甲氧基-1-萘基，R₂＝H时，碱基为U，荧光素为TAMRA，为图19，具体步骤如下：

第一步、化合物Y042的合成：

将Y041(0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的TAMRA(20mg，0.038mmol)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后HPLC分离，得到18mg。HRMS:calc for C₄₁H₄₁N₃O₈ ⁺[M]⁺703.2894,found703.2887；

第二步、化合物Y043的合成：

称取Y042(0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(16mg，0.031mmol)溶于1.5mLNa2CO3/NaHCO3缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，HPLC分离得化合物Y043,产率19％。HRMS:calcfor C₅₄H₅₇N₆O₂₃P₃M⁺1250.2397,found1250.2385；本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成示意图如图12、13所示。

实施例17、当R ₁ ＝R ₂ ＝甲基，m＝1，n＝0,R＝NH ₂ 时，该类可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例9的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11所示，R₁＝R₂＝甲基时，碱基为U，荧光素为TAMRA，具体为图20，具体步骤如下：

第一步、化合物Y016的合成：

将Y012(10mg，0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的TAMRA(20mg，0.038mmol)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，30％～60％CH₃OH(20min)，60％～80％CH₃OH(20min)，可见光检测器：546nm。在t＝22.8min时有产物峰生成，制备HPCL分离得到15mg，产率69％。¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δppm8.52(d,1H,J＝1.6Hz),8.06(dd,1H,J＝2.0Hz；8.0Hz),7.36(d,1H,J＝7.6Hz),7.25(d,2H,J＝9.2Hz),7.02(dd,2H,J＝2.8Hz；9.6Hz),6.91(d,2H,J＝2.4Hz),3.72(t,2H,J＝6Hz),3.67～3.60(m,6H),3.59～3.55(m,4H),3.27(s,12H)),1.40(s,6H).

第二步、化合物Y017的合成：

称取Y016(9mg，0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(16mg，0.031mmol)溶于1.5mLNa2CO3/NaHCO3缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，0％～20％CH₃OH(35min)，可见光检测器：546nm。在t＝27.9min时有产物峰生成,制备HPLC分离得化合物Y0172.8mg.产率16.1％。HRMS:calc for C₄₇H₅₇N₆O₂₃P₃[M]⁺1166.2397,found1166.2384；本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成示意图如图12、13所示。

实施例18、当R ₁ ＝甲基，R ₂ ＝乙基，n＝m＝0时；R＝NH ₂ 时，该类可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例10的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11所示，R₁＝乙基，R₂＝甲基时，碱基为U，荧光素为TAMRA，为图21，具体步骤如下：

第一步、化合物Y016的合成：

将Y012(10mg，0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的TAMRA(20mg，0.038mmol)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，30％～60％CH₃OH(20min)，60％～80％CH₃OH(20min)，可见光检测器：546nm。在t＝22.8min时有产物峰生成，制备HPCL分离得到15mg，产率69％。¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δppm8.52(d,1H,J＝1.6Hz),8.06(dd,1H,J＝2.0Hz；8.0Hz),7.36(d,1H,J＝7.6Hz),7.25(d,2H,J＝9.2Hz),7.02(dd,2H,J＝2.8Hz；9.6Hz),6.91(d,2H,J＝2.4Hz),3.72(t,2H,J＝6Hz),3.67～ 3.60(m,4H),3.59～3.55(m,2H),3.27(s,12H)),1.76(q,2H),1.38(s,3H),0.96(t,3H).

第二步、化合物Y017的合成：

称取Y016(9mg，0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(16mg，0.031mmol)溶于1.5mLNa2CO3/NaHCO3缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，0％～20％CH₃OH(35min)，可见光检测器：546nm。在t＝27.9min时有产物峰生成,制备HPLC分离得化合物Y0172.8mg.产率16.1％。HRMS:calc for C₄₆H₅₄N₆O₂₂P₃[M+3H]⁺1135.2291,found1135.2283；本实施例中核苷酸dUTP(AP₃)的合成示意图如图12、13所示.

实施例19、当R ₁ ＝R ₂ ＝甲基，m＝n＝0,R＝N ₃ 时，该类可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例1的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图11，R₁＝R₂＝甲基时，碱基为U，荧光素为TAMRA，R＝N₃时，为图22，具体步骤如下：

1)称取Y011(9mg，0.0476mmol)于单口瓶中，抽真空氮气保护，2)称取DSC(18mg，0.0714mmol)于另一单口瓶中，抽真空氮气保护。3)向1)中加入600uL无水乙腈和20uL无水三乙胺搅拌后加入到2)中搅拌3h，溶于20ml乙酸乙酯中，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，旋除溶剂后，将dUTP(11mg)溶于1ml水及1ml甲醇中加入到3)中，与冰水浴下加入碳酸钾(10mg)，搅拌3.5h旋除溶剂，HPLC分析后，制备HPLC分离得10mg.¹HNMR(400MHz,D₂O):δppm8.08(s,1H),6.27(t,1H,J＝6.8Hz),4.63(s,1H),4.27～4.11(m,7H),3.73～3.64(m,4H),3.45(t,2H,J＝4.8Hz),2.37～2.30(m,2H),1.40(s,6H).³¹P NMR(D₂O,162MHz):δ-6.46,-11.25,-22.34.

将溶于750uL无水DMF的FITC(10mg，0.0257mmol)加入到氮气保护的单口瓶中，并置于0度下，依次加入丙炔胺(2.15mg，0.039mmol)及25uL三乙胺并在冰浴下搅拌1h，然后转移到室温下搅拌12h。旋除溶剂后硅胶板分离得10mg.¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm8.88(d,1H,J＝8.0Hz),7.59(d,1H,J＝8.0Hz),7.45(s,1H),6.72～6.67(m,4H),6.57～6.54(m,2H),5.20～5.19(m,1H),5.13～5.10(m,1H),4.69(s,2H).HRMS:calc for C24H15N2O5S[M-H]^-443.0702,found443.0696.

将Y013(10mg，0.0137mmol)和Y014(6mg，0.0137mmol)溶于MeCN和DMF的混合液中，依次加入CuI(5.2mg，0.0273mmol)及DIPEA(5.3mg，0.0411mmol)于室温下搅拌，得到最终产物.HRMS HRMS:calc for C₄₄H₄₉N₈O₂₃P₃S[M]⁺1182.1553,found1182.1559；,HPLC纯度91％.本实施例中核苷酸dUTP(AP₃)的合成示意图如图12、13所示.

实施例20、当R ₁ ＝R ₂ ＝甲基，m＝n＝0,R＝NH ₂ 时，该类可逆终端dCTP-丙酮叉-FITC 的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例1的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图23(A)和23(B)所示，具体步骤如下：(R₁＝R₂＝甲基，碱基为C，荧光素为FITC)

第一步、化合物FITC-OH的合成：

将Y012(10mg，0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的FITC(20mg)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，30％～60％CH₃OH(20min)，60％～80％CH₃OH(20min)，可见光检测器：546nm，制备HPCL分离得到18mg。HRMS:calc for C₂₈H₂₈N₂O₈S⁺[M]⁺552.1566,found552.1572；

第二步、化合物dCTP-acid labile linker-FITC的合成：

称取FITC-OH(9mg)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体

将dCTP(16mg)溶于1.5mL Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，0％～20％CH₃OH(35min)，可见光检测器：546nm。在t＝27.9min时有产物峰生成,制备HPLC分离得化合物dCTP-acid labile linker-FITC2.8mg.HRMS:calc forC41H45N6O22P3S[M]+1098.1520,found1098.1531；

本实施例中核苷酸dCTP(AP₃)的合成示意图如图23(A)所示，具体包括如下步骤：

1.化合物F₂的合成

向一单口瓶中加入60ml甲醇，冰水浴下搅拌，加入丙炔胺(60mmol，3.304g)，搅拌15分钟后缓慢加入三氟乙酸甲酯(86.7mmol，11.096g)，10分钟后撤去冰水浴，室温下反应24小时。反应完毕，旋出溶剂，减压蒸馏(51℃，280Pa)，得3.53g即F₂，产率39％。¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ2.34(t,J＝2.8Hz,1H),4.16(dd,J＝2.4Hz,J＝5.2Hz,2H),6.61(s,1H)。

2.化合物dC(AP3)的合成

向一单口瓶中加入dC-I即5-碘-2’-脱氧胞苷(0.70mmol，248mg)，再称取10mg CuI(25.2μmol)和20mg Pd(PPh₃)₄(17.6μmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入1.5ml DMF，搅拌溶解，加入0.2ml TEA，称取F₂(254mg,1.68mmol)用1ml DMF溶解后加入上述反应瓶中，室温搅拌，反应过夜。旋出溶剂，以DCM:MeOH＝5:1 为展开剂，TLC板分离纯化得得153mg，产率58％。¹H NMR(DMSO-D₆,400MHz):δ1.94-2.01(m,1H),2.12-2.18(m,1H),3.51(s,1H),3.55-3.62(m,2H),3.79(q,J＝3.2Hz,J＝6.8Hz,1H),4.20(d,J＝3.2Hz,1H),4.28(s,1H),5.05(t,J＝4.8Hz,1H),5.20(d,J＝3.6Hz,4H),6.10(t,J＝6.4Hz,1H),6.84(s,1H),7.81(s,1H),8.15(s,1H),9.96(s,1H).

3.化合物dCTP(AP3)的合成

在手套箱中分别称取化合物dC(AP3)90mg(0.24mmol)、三正丁胺焦磷酸盐264mg(0.48mmol)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮90mg(0.48mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.75mL无水DMF中，再加入0.9mL无水三正丁胺，搅拌半小时。把2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮溶于0.75mL无水DMF中，激烈搅拌下通过注射器加入上述三正丁胺焦磷酸盐溶液，搅拌半小时。然后将该混合液注入到8中，搅拌1.5h。加入4mL3％碘(9:1Py/H2O)溶液。15min后加入4mL水，搅拌2h。加入1mL3M NaCl溶液，再加入35mL无水乙醇，-20℃冷冻过夜，离心(3200r/min，25℃)20min。倾去上清液，得沉淀，抽干溶剂。加入2ml浓氨水室温搅拌6h。减压旋出溶剂，出现棕色固体，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18,10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mM TEAA和EtOH，梯度洗涤，0％-20％EtOH(35min)；紫外检测器：254nm]，保留时间t＝11min。RP-HPLC分离[条件：柱子：C18,5μm,9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mM TEAA和MeOH，0％-20％MeOH(35min),保留时间t＝16min；紫外可见检测器：254nm]，NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得42mg白色固体，产率24.5％。¹H NMR(D₂O,400MHz):δ2.27-2.33(m,1H),2.44-2.50(m,1H),4.05(s,2H),4.19-4.31(m,3H),4.56-4.59(m,1H),6.21(t,J＝6.0Hz,1H),8.37(s,1H).³¹P NMR(D₂O,162MHz):δ-22.55,-11.51,-10.31.ESI-HRMS:calc forC₁₂H₁₈N₄O₁₃P₃[M-H]^-519.0083,found519.0059.

实施例21、当R ₁ ＝R ₂ ＝甲基，m＝n＝0,R＝NH ₂ 时，该类可逆终端dATP-丙酮叉-Cy5的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例1的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图24(A)和24(B)所示，R₁＝R₂＝甲基，碱基为A，荧光素为Cy5，具体步骤如下：

第一步、化合物Cy5-OH的合成：

将Y012(10mg，0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的Cy5(20mg)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，30％～60％CH₃OH(20min)，60％～80％CH₃OH(20min)，可见光检测器：546nm，制备HPCL分离得到12mg。HRMS:calc for C₃₅H₄₆N₃O₄ ⁺[M]⁺572.3483,found572.3491；

第二步、化合物dATP-acid labile linker-Cy5的合成：

称取Cy5-OH(9mg)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体

将dATP(16mg)溶于1.5mL Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，0％～20％CH₃OH(35min)，可见光检测器：546nm。在t＝27.9min时有产物峰生成,制备HPLC分离得化合物2.6mgdATP-acid labilelinker-Cy5.HRMS:calc forC₅₄H₇₄N₈O₁₈P₃[M]⁺1215.4328,found1215.4342；

本实施例中核苷酸dATP(AP₃)的合成示意图如图24(A)所示，具体包括如下步骤：

1.化合物F₂的合成

2.化合物dA(AP₃)的合成

向一单口瓶中加入dA-I7-Deaza-7-碘-2’-脱氧腺苷(0.35mmol，132mg)，再称取5mg CuI(25.2μmol)和10mg Pd(PPh₃)₄(8.8μmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入1.5ml DMF，搅拌溶解，加入0.1ml TEA，称取化合物F₂(127mg,0.84mmol)用1ml DMF溶解后加入上述反应瓶中，室温搅拌，TLC跟踪反应进程。待反应完后，旋出溶剂，柱层析分离[V(DCM):V(MeOH)＝10:1]得129mg即dA(AP₃),产率92％。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ2.12-2.18(m,1H),2.41-2.46(m,1H),3.45-3.57(m,2H),3.78-3.81(m,1H),4.28-4.31(m,3H),5.06(t,J＝5.6Hz,1H),5.25(d,J＝4.0Hz,1H),6.43-6.47(m,1H),7.74(s,1H),8.09(s,1H),10.08(t,J＝5.2Hz,1H).

3.化合物dATP(AP₃)的合成

在手套箱中分别称取化合物dA(AP₃)32mg(0.08mmol)、三正丁胺焦磷酸盐88mg(0.16mmol)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮30mg(0.16mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.25mL无水DMF中，再加入0.3mL无水三正丁胺，搅拌半小时。把2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮溶于0.25mL无水DMF中，激烈搅拌下通过注射器加入上述三正丁胺焦磷酸盐溶液，搅拌半小时。然后将该混合液注入到dA(AP₃)中，搅拌1.5h。加入2mL3％碘(9:1Py/H2O)溶液。15min后加入3mL水，搅拌2h。加入0.7mL3M NaCl溶液，再加入20mL无水乙醇，-20℃冷冻过夜，离心(20min,3200rpm)。倾去上清液，得沉淀，抽干溶剂。加入1ml0.1MTEAB溶液溶解，2ml浓氨水室温搅拌过夜。旋出溶剂，出现棕色固体，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18,5μm,4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mM TEAA和EtOH,0-20％EtOH(40min)；紫外检测器波长：254nm],保留时间t＝18.6min，RP-HPLC分离[条件：柱子：C18,5μm,9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mM TEAA和MeOH，0-15％MeOH(30min)；紫外检测器波长：254nm]，保留时间t＝25min。NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得12.9mg白色固体。产率30％。¹HNMR(D₂O,400MHz):δ2.46-2.59(m,2H),4.10-4.24(m,5H),4.70(s,1H),6.49(t,J＝6.8Hz,1H),7.78(s,1H),8.02(s,1H).³¹P NMR(D₂O,162MHz):δ-22.07,-11.11,-9.29.ESI-HRMS:calc forC₁₄H₁₉N₅O₁₂P₃[M-H]^-542.0243,found542.0222.

实施例22、当R ₁ ＝R ₂ ＝甲基，m＝n＝0,R＝NH ₂ 时，该类可逆终端dGTP-丙酮叉-Cy3.5 的合成

本实施例的可逆终端dGTP-linker-Cy3.5是基于实施例1的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图25(A)、25(B)、25(C)所示，R₁＝R₂＝甲基，碱基为G，荧光素为Cy3.5，具体步骤如下：

第一步、化合物Cy3.5-OH的合成：

将Y012(10mg，0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的Cy3.5(20mg)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，30％～60％CH₃OH(20min)，60％～80％CH₃OH(20min)，可见光检测器：546nm，制备HPCL分离得到15mg。HRMS:calc for C₄₁H₄₈N₃O₄ ⁺[M]⁺646.3639,found646.3643；

第二步、化合物dGTP-acid labile linker-Cy3.5的合成：

称取Cy3.5-OH(9mg)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体

将dGTP(16mg)溶于1.5mL Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，用分析型HPLC进行分析：柱子：C18,5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，0％～20％CH₃OH(35min)，可见光检测器：546nm。在t＝27.9min时有产物峰生成,制备HPLC分离得化合物dGTP-acid labilelinker-Cy3.52.8mg.HRMS:calc forC₆₀H₇₄N₈O₁₈P₃ ⁺[M]⁺1287.4328,found1287.4411；

本实施例中核苷酸dGTP(AP₃)的合成示意图如图25(A)、25(B)所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

第一种方法，如图25(A)所示,具体合成方法分别包括如下步骤：

将化合物dG1-A(0.20g；0.714mmol)溶解于无水吡啶中，0℃下缓慢滴加新戊酰氯(0.75mL；7.14mmol)，0℃下搅拌1h后，加入2ml甲醇，搅拌10min，旋出溶剂，加入乙酸乙酯(200ml)和饱和碳酸氢钠溶液(50ml)萃取，分离有机相，依次加入饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，硅胶柱层析[V(乙酸乙酯):V(石油醚)＝1:1]，得0.39g白色固体即化合物dG1-B，产率92％。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.28(d,J＝3.7Hz,1H),6.66(dd,J＝5.9,8.6Hz,1H),6.51(d,J＝3.7Hz,1H),5.41(m,1H),4.33-4.36(m,2H),4.22(m,1H),4.08(s,3H),2.83-2.96(m,2H),2.54-2.70(m,2H),2.48-2.54(ddd,J＝2.0,5.9,14.2Hz,1H),1.15-1.23(m,27H).

将化合物dG1-B(0.42g；0.84mmol)溶于无水DMF中，剧烈搅拌下，加入4-碘代丁二酰亚胺(220mg；0.9mmol)，室温搅拌22h，旋出溶剂，加入100ml乙醚和50ml碳酸氢钠溶液萃取，分离出有机相，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，硅胶柱层析[V(乙酸乙酯):V(石油醚)＝1:1]，得0.5g白色固体即化合物dG1-C，产率91％。1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ7.43(s,1H),6.63(dd,J＝6.0,8.2Hz,1H),5.41(m,1H),4.33-4.36(m,2H),4.23(m,1H),4.09(s,3H),2.78-2.94(m,2H),2.57-2.70(m,2H),2.50-2.57(ddd,J＝2.3,6.0,14.2Hz,1H),1.17-1.24(m,27H).

将化合物dG₁-C溶解于0.5M的甲醇/甲醇钠(10ml)中，65℃下搅拌12h，再加入10ml饱和碳酸氢钠溶液，继续搅拌10min，旋出甲醇，加入50ml乙酸乙酯萃取，有机层分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物硅胶柱层析[V(甲醇):V(二氯甲烷)＝1:10]，得0.24g白色固体即化合物dG₁-D，产率74％。¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.17(s,1H),6.36(dd,J＝6.0,8.4Hz,1H),4.47(m,1H),3.99(s,3H),3.96(m,1H),3.77(dd,J＝3.4,12.0Hz,1H),3.70(dd,J＝3.7,12.0Hz,1H),2.55-2.64(ddd,J＝6.0,8.4,13.4Hz,1H),2.20-2.26(ddd,J＝2.4,5.9,13.4Hz,1H)。

将化合物dG₁-D置于氢氧化钠溶液(2N)中回流4h，冷却后加入2N盐酸溶液，调节溶液pH为6。浓缩，加入100ml二氯甲烷与甲醇混合液(V:V＝1:1)洗涤，合并有机相，浓缩得255mg白色固体即dG₁，产率98％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.48(s,1H),7.12(s,1H),6.35(s,1H),6.26(d,J＝0.8Hz,1H),4.27(s,1H),3.75(s,1H),3.49(t,J＝0.8Hz,1H),2.35–2.28(m,1H),2.09–2.01(m,1H).

向一单口瓶中加入化合物dG₁(0.25g,0.4mmol)，再称取CuI(22mg；1mmol)和Pd(PPh₃)₄(48mg；0.04mmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入10mlDMF，搅拌溶解，注入TEA(0.088g；0.8mmol)和三氟乙酰丙炔胺(0.2g；1.2mmol)，50℃搅拌13小时后，反应结束，旋出溶剂，将残余物溶于100ml乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析[V(乙酸乙酯):V(正己烷)＝1:3]，得0.1g白色固体即dG₃，产率39％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.24(s,1H),6.38(t,J＝0.8Hz,1H),4.49–4.46(m,1H),4.31(s,2H),3.94(d,J＝1.6Hz,1H),3.78–3.68(m,1H),3.54–2.47(m,1H),2.3–2.24(m,1H).

dGTP(AP₃):将化合物dG₃真空干燥12h，在手套箱中分别称取化合物dG₃(30mg,0.072mmol)、三正丁胺焦磷酸盐(80mg,0.145mmol)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(30mg,0.15mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.25mL无水DMF中，再加入0.3mL新蒸的三正丁胺，常温搅拌半小时后，把反应液注入2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮的无水DMF(0.25mL)溶液中，常温搅拌半小时。然后将该混合液注入到2中，搅拌1.5h。加入1mL3％碘(9:1Py/H2O)溶液，保持碘液颜色15min不退色。15min后加入2mL水，2h后，加入0.75mL3M NaCl溶液、20mL无水乙醇，-20℃冷冻12h，离心(20min,3200rpm)。倾去上清液，沉淀抽干溶剂后，加入浓氨水，室温搅拌5小时。减压旋出溶剂，出现棕色固体，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18,5μm,4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mM TEAA和EtOH，0-20％EtOH(35min),可见检测器波长：650nm]，保留时间t＝18min。RP-HPLC分离[条件：柱子：C18,5μm,9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mM TEAA和MeOH，0-15％MeOH(25min),紫外检测器波长：254nm]，保留时间t＝15min。NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得12mg白色固体即dGTP(AP₃)。产率26％。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.35(s,1H),6.22(t,J＝0.8Hz,1H),4.59(s,2H),4.06–3.92(m,5H),2.48–2.41 (m,1H),2.32–2.28(m,1H)；³¹P NMR(D₂O,162MHz):-10.65,-11.19,-22.91.ESI-HRMS:calc for C₂₂H₂₆N₆O₁₄P₃S₂[M-H]^-558.0192,found558.0179.

dG₁碘苷的第二种合成方法，如图25(B)所示：

将Sm-1(27.3g，138mmol)加入到70mL水中后，再加入3.0mL浓盐酸于90℃下搅拌0.5h，冷却至室温后加入醋酸钠(13.6g，165mmol)搅拌，将Sm-2(20.0g，159mmol)和醋酸钠(7.0g，85.4mmol)溶于150mL水中并加入到反应中，于80℃下搅拌2h后移至零摄氏度下搅拌1.5h，过滤，并用冰水及丙酮洗涤，抽干得15.4g，产率74％。

将G005(10.0g，66.6mmol)加入到100mL POCl₃中，回流2h，冷却至室温后旋除溶剂后，将120mL冰水加入到反应中，并将固体过滤，将滤液用氨水调节至pH＝2，并将沉淀物至于冰浴中2h后过滤，过滤的固体第一次用10mL冰水洗涤，第二次用30mL冰乙醚洗涤，抽干后得8.7g，产率78％。¹H NMR(400MHz,DMSO):δ＝11.43(s,1H,NH),7.07(d,1H,NHCHCH),6.46(s,2H,NH2),6.22(d,1H,CHNH)。

将G006(8.5g，50.42mmol)加入到120mL无水吡啶中，再加入新戊酰氯(21.68mL，176.20mmol)并于室温下搅拌2h后旋除溶剂，溶于1.7L二氯甲烷，有机相用0.1M盐酸溶液(2*350mL)洗涤后，旋除溶剂后柱层析DCM：MeOH10:1得8.15g，产率64％。¹HNMR(400MHz,[D6]-DMSO):δ＝9.98(s,1H,NHC(O)),7.50(d,J＝3.6Hz,1H,NHCHCH),6.49(d,J＝3.6Hz,1H,CHNH),1.20(s,9H,C(CH3)₃)。

将G007(3.10g，12.27mmol)溶于60mL THF中，氮气保护，锡箔纸包裹后，加入NIS(3.04g，13.51mmol)于室温下搅拌1h，加入500mL DCM，用200mL水洗涤，旋除溶剂后，柱层析DCM:MeOH99:1得3.76g，产率81％。¹H NMR(400MHz,DMSO):δ＝12.65(s,1H,CHNH),10.06(s,1H,NHC(O)),7.73(d,J＝2.4Hz,1H,CH),1.19(s,9H,C(CH3)₃)。

将G008(1.5g，4.0mmol)和硫酸铵(15mg，0.11mmol)在六甲基二硅氮烷(15mL，72.76mmol)中回流20h于氩气的保护中，旋除溶剂后加入40mL二氯乙烷，加入Sm-1(2.304，6.0mmol)和TMSOTf(1.25mL，6.47mmol)并于室温下搅拌至澄清后于50摄氏度下搅拌24h，加入60mL DCM，并用30mL饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，旋除有机相后，柱层析得1.48g，产率45％。¹H NMR(400MHz,D6-DMSO):δ＝10.29(s,1H),8.02(s,1H,),7.90-7.41(m,10H),6.35(s,1H),6.26(d,J＝0.8Hz,1H),4.27(s,1H),3.75(s,1H),3.49(t,J＝0.8Hz,1H),2.35–2.28(m,1H),2.09–2.01(m,1H),1.15(s,9H).

将G009(1.056g，1.5mmol)加入到0.5MMeONa/MeOH(20.0mL)中，回流3h后用冰醋酸中和至中性后柱层析DCM：MeOH5:1得化合物dG₁-D490mg，产率80％。¹H-NMR(400MHz, CD₃OD)δ7.17(s,1H),6.36(dd,J＝6.0,8.4Hz,1H),4.47(m,1H),3.99(s,3H),3.96(m,1H),3.77(dd,J＝3.4,12.0Hz,1H),3.70(dd,J＝3.7,12.0Hz,1H),2.55-2.64(ddd,J＝6.0,8.4,13.4Hz,1H),2.20-2.26(ddd,J＝2.4,5.9,13.4Hz,1H)。

实施例23、当m＝n＝44,R ₁ ＝R ₂ ＝Me,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元的合成

本实施例的酸敏感缩酮连接单元的合成示意图如图30所示，具体步骤如下：

第一步、

称取聚乙二醇2000(100mmol)和乙酸(2g，33.3mmol)于250ml单口瓶中搅拌，滴加0.04ml浓硫酸于反应中，在25度下搅拌24h，加入8ml饱和碳酸氢钠溶液搅拌过夜，向反应中加入20ml水并用二氯甲烷50*8萃取，有机层用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂用DCM：MeOH20:1柱层析得纯品14.8g；

第二步、

将上一步产物(30.3mmol)于100ml单口瓶中，加入50ml无水THF，加入PPTS(0.363g，1.445mmol)搅拌15min，加入15g5A分子筛搅拌15min，加入2-甲氧基丙烯(1.2ml，12.95mmol)在室温下搅拌48h，加入碳酸钾粉末使呈中性，过滤旋去滤液，PE：EA3:1 柱层析分离得纯品7.6g；

第三步、

取上一步产物(8.06mmol)于100ml单口瓶中，加入20ml甲醇搅拌，加入碳酸钾(3.339g，24.19mmol)及1ml水于25度下搅拌过夜，将反应液用硅藻土过滤，将滤液旋干，用二氯甲烷溶解过滤旋干得产品7.876g；

第四步、

将上一步产物(12.53g，12mmol)溶于15ml DCM中搅拌，在冰浴下加入0.86mlEtN₃，再逐滴加入溶于3.0ml DCM中的TsCl(0.582g，3.0mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE：EA2.5:1柱层析过柱，得纯品2.516g；

第五步、

称取上一步产物(0.59mmol)于单口瓶中，加入2.5ml DMF搅拌后再加入NaN₃(84.1mg，1.29mmol)于80°下搅拌过夜，冷却至室温后加入10ml水并用乙酸乙酯15*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE：EA3:1柱层析得纯品202mg；

第六步、

将上一步产物(0.48mmol)溶于6ml甲醇中，并加入51mg Pd/C(10％)抽真空，充入氢气于25℃下搅拌过夜，过滤并旋干溶剂，用DCM：MeOH10:1柱层析分离得纯品300mg。

实施例24、当m＝n＝0,R ₁ ＝2,4,6三甲氧基苯基,R ₂ ＝H,R＝N ₃ 或NH ₂ 时，该类连接单元以及可逆终端的合成

本实施例的酸敏感连接单元的合成示意图如图35所示，具体步骤如下：

第一步、如下所述反应产物的合成

将MAG(2.72g，20mmol)置于单口瓶中，于冰浴下加入pTSA(0.656g，3.45mmol)及4A(10.4g)分子筛搅拌十分钟后，加入2,4,6-三甲氧基苯甲醛搅拌4d后加入3mL TEA，过滤，并用EA洗涤，PE:EA:TEA8:1:1柱层析得1.8g。¹H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.37-7.21(m,2H),5.61(s,1H),4.25-4.21(m,4H),3.79(s,9H),3.73–3.63(m,4H),2.07–2.05(m,6H)；

第二步、

称取上述原料(1.84mmol)于单口瓶中，溶于5.26mL甲醇中，并加入K₂CO₃(762mg,5.52mmol)及0.263mL水于室温下搅拌过夜，过滤旋干溶剂后再次溶于DCM中并过滤，旋除溶剂后得512mg.¹H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.38-7.10(m,2H),5.55(s,1H),3.81(s,9H),3.78–3.74(m,4H),3.69～3.66(m,4H)；

第三步、

称取上述原料(420mg)于单口瓶中，加入6mL DCM溶解并置于冰浴中，加入TEA(293mg,2.9mmol)搅拌，将TsCl(111mg,0.58mmol)溶于2mL DCM中并加入到反应中搅拌过夜，旋除溶剂后，PE：EA：TEA2:1:0.1柱层析得122mg。¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm7.77-7.30(m,6H),5.49(s,1H),4.18～4.09(m,2H),3.80(s,9H),3.66～3.46(m,6H),2.44(s,3H)；

第四步、

称取上述原料(0.253mmol)于单口瓶中，并溶于3mLDMF中，加入NaN₃(36.1mg,0.556mmol)于80℃下搅拌过夜，加入15mL水，用EA15ml x3萃取后合并有机相用饱和食盐水洗涤后旋除溶剂得56mg。1H NMR(400MHz,MeOD):δppm7.42-7.10(m,2H),5.60(s,1H),3.79(s,9H),3.77-3.54(m,6H),3.42(t,2H,J＝4.8Hz)；

第五步、

称取上述原料(0.187mmol)于单口瓶中，加入5mL甲醇及5mg Pd/C，抽真空后注入氢气，于室温下搅拌过夜，过滤，旋除溶剂后得40mg。¹H NMR(400MHz,MeOD):δppm7.41-6.91(m,2H),5.55(s,1H),3.79(s,9H),3.71-3.50(m,6H),2.82(t,2H,J＝5.6Hz)；

第六步、

称取上述原料(0.0284mmol)于单口瓶中，加入TAMRA(15mg,0.0284mmol)后溶于1.5mL无水DMF溶解，加入TEA(40uL,0.284mmol)室温搅拌4h，旋除溶剂后，HPLC分离得13mg。

称取反应物(0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL,搅拌，加入DSC(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体将dUTP(16mg，0.031mmol)溶于1.5mLNa2CO3/NaHCO3缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，HPLC分离得预期化合物,产率12％。HRMS:calcfor C₅₂H₅₅N₆O₂₅P₃M⁺1256.2452,found1256.2459；本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成示意图如图13、14所示。类似的反应条件,我们合成了基于本实施例连接单元的可逆终端dCTP-linker-荧光素(合成过程参照实施例20)，dATP-linker-荧光素(合成过程参照实施例21)以及dGTP-linker-荧光素(合成过程参照实施例22)。所以基于该连接单元的可逆终端已完成U，C，A，G四种不同碱基的可逆终端，并一起用于生物学评价。

实施例25、对合成的可逆终端的生物学评价

为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA测序，本实施例检测了实施例11、17、18、19、20、21、22的可逆终端两个方面的特性，其中，图31为实施例11、17、18、19、20、21、22的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图；其中，a为荧光扫描示意图，b为GR染色示意图；这几个可逆终端都具有类似的生物学评价结果：

1)是否可以被DNA聚合酶所识别，作为DNA聚合酶的底物参与DNA的延伸反应；

2)参与DNA链延伸后能否去掉该可逆终端所携带的荧光基团，以便下一轮的延伸反应。

这两方面是高通量合成测序(sequencing by synthesis)的核心。因此配制DNA延伸反应体系：将可逆终端与DNA模板、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow缓冲液充分混合，30℃静置15分钟，75℃处理10分钟以灭活klenow DNA聚合酶活性，然后针对酸敏感可逆终端检测不同酸性条件下(pH2.95、pH3.31)可逆终端所携带的荧光基团是否可以断裂。具体如下：

1)按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：10×Klenowbuffer10uL,BSA(10mg/mL)1uL,DMSO20uL,NaCl(1M)25uL,Klenow(exo-)pol(5U/uL)1.32uL,dUTP(10uM)6uL,模板DNA(853ng/uL)1.25uL,ddH₂O35.43uL，总体积100uL。

将反应体系置于30℃水浴箱中处理15分钟，再置于75℃水浴中处理10分钟以灭活DNA聚合酶。将反应产物用于后续的可逆终端荧光基团的断裂反应。

2)酸敏感可逆终端荧光基团的断裂反应

在DNA链延伸反应体系中加入13.5uL0.24M HCl，调节pH至2.95，室温处理30分钟，再用1M Tris调节pH至8.0，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图31所示，由图31可知，酸敏感可逆终端可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸，并且在pH2.95和pH3.31的酸性条件下，可逆终端所携带的荧光基团完全断裂，效果很好。完全可以用于测序。图31中各标示的含义如下：

Lane1:dUTP插入

Lane2:dUTP插入，pH＝2.95，1.5min后，中和成pH＝8.0

Lane3:dUTP插入，pH＝2.95，3min后，中和成pH＝8.0

Lane4:dUTP插入，pH＝2.95，10min后，中和成pH＝8.0

Lane5:dUTP插入，pH＝3.31，2min后，中和成pH＝8.0

Lane6:dUTP插入，pH＝3.31，5min后，中和成pH＝8.0

Lane7:dUTP插入，pH＝3.31，10min后，中和成pH＝8.0

Lane8:dUTP插入，pH＝3.31，20min后，中和成pH＝8.0

结论：室温下，实施例11、17、18、19、20、21、22的可逆终端在pH＝2.95，3min断裂完全；pH＝3.31，10min断裂完全。在这两种pH条件下，DNA模板均无损伤。

实施例26、对合成的可逆终端的生物学评价

为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA测序，本实施例检测了实施例12的可逆终端两个方面的特性，其中图32为实施例12的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图；其中，a为荧光扫描示意图，b为GR染色示意图。

这两方面是高通量合成测序(sequencing by synthesis)的核心。因此配制DNA延伸反应体系：将可逆终端与DNA模板、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow缓冲液充分混合，30℃静置15分钟，75℃处理10分钟以灭活klenow DNA聚合酶活性，然后针对酸敏感可逆终端检测不同酸性条件下(pH2.43、pH2.81)可逆终端所携带的荧光基团是否可以断裂。具体如下：

2)酸敏感可逆终端荧光基团的断裂反应

在DNA链延伸反应体系中加入13.5uL0.24M HCl，调节pH至2.43，室温处理30分钟，再用1M Tris调节pH至8.0，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图32所示，由图32可知，酸敏感可逆终端可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸，并且在pH2.43和pH2.81的酸性条件下，可逆终端所携带的荧光基团完全断裂，效果很好。完全可以用于测序。图32中各标示的含义如下：

Lane1:dUTP插入

Lane2:dUTP插入，pH＝2.43，3min后，中和成pH＝8.0

Lane3:dUTP插入，pH＝2.43，7min后，中和成pH＝8.0

Lane4:dUTP插入，pH＝2.43，14min后，中和成pH＝8.0

Lane5:dUTP插入，pH＝2.81，4min后，中和成pH＝8.0

Lane6:dUTP插入，pH＝2.81，8min后，中和成pH＝8.0

Lane7:dUTP插入，pH＝2.81，18min后，中和成pH＝8.0

Lane8:dUTP插入，pH＝2.81，30min后，中和成pH＝8.0

结论：室温下，pH＝2.43，14min断裂完全；pH＝2.81，18min断裂完全。在这两种pH条件下，DNA模板均无明显损伤。

实施例27、对合成的可逆终端的生物学评价

为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA测序，本实施例检测了实施例13的可逆终端两个方面的特性：

这两方面是高通量合成测序(sequencing by synthesis)的核心。因此配制DNA延伸反应体系：将可逆终端与DNA模板、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow缓冲液充分混合，30℃静置15分钟，75℃处理10分钟以灭活klenow DNA聚合酶活性，然后针对酸敏感可逆终端检测不同酸性条件下(pH2.58、pH3.01)可逆终端所携带的荧光基团是否可以断裂。具体如下：

2)酸敏感可逆终端荧光基团的断裂反应

在DNA链延伸反应体系中加入13.5uL0.24M HCl，调节pH至2.58，室温处理30分钟，再用1M Tris调节pH至8.0，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图33所示，由图33可知，酸敏感可逆终端可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸，并且在pH2.58和pH3.01的酸性条件下，可逆终端所携带的荧光基团完全断裂，效果很好。完全可以用于测序。图33中各标示的含义如下：

Lane1:dUTP插入

Lane2:dUTP插入，pH＝2.58，3min后，中和成pH＝8.0

Lane3:dUTP插入，pH＝2.58，7min后，中和成pH＝8.0

Lane4:dUTP插入，pH＝2.58，15min后，中和成pH＝8.0

Lane5:dUTP插入，pH＝3.01，4min后，中和成pH＝8.0

Lane6:dUTP插入，pH＝3.01，10min后，中和成pH＝8.0

Lane7:dUTP插入，pH＝3.01，15min后，中和成pH＝8.0

Lane8:dUTP插入，pH＝3.31，30min后，中和成pH＝8.0

结论：室温下，pH＝2.58，7min断裂完全；pH＝3.01，15min断裂完全。在这两种pH条件下，DNA模板均无明显损伤。

实施例28、对合成的可逆终端的生物学评价

为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA测序，本实施例检测了实施例14、15、16和24的可逆终端两个方面的特性，(其中图34为实施例14、15、16、24的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图；其中，a为荧光扫描示意图，b为GR染色示意图。)

这两方面是高通量合成测序(sequencing by synthesis)的核心。因此配制DNA延伸反应体系：将可逆终端与DNA模板、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow缓冲液充分混合，30℃静置15分钟，75℃处理10分钟以灭活klenow DNA聚合酶活性，然后针对酸敏感可逆终端检测不同酸性条件下(pH2.88、pH3.25)可逆终端所携带的荧光基团是否可以断裂。具体如下：

2)酸敏感可逆终端荧光基团的断裂反应

在DNA链延伸反应体系中加入13.5uL0.24M HCl，调节pH至2.88，室温处理30分钟，再用1M Tris调节pH至8.0，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图34所示，由图34可知，酸敏感可逆终端可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸，并且在pH2.88和pH3.45的酸性条件下，可逆终端所携带的荧光基团完全断裂，效果很好。完全可以用于测序。图34的标示以实施例14为例表示如下，

Lane1:dUTP插入

Lane2:dUTP插入，pH＝2.88，1.5min后，中和成pH＝8.0

Lane3:dUTP插入，pH＝2.88，3min后，中和成pH＝8.0

Lane4:dUTP插入，pH＝2.88，10min后，中和成pH＝8.0

Lane5:dUTP插入，pH＝3.45，2min后，中和成pH＝8.0

Lane6:dUTP插入，pH＝3.45，5min后，中和成pH＝8.0

Lane7:dUTP插入，pH＝3.45，10min后，中和成pH＝8.0

Lane8:dUTP插入，pH＝3.45，20min后，中和成pH＝8.0

结论：室温下，实施例14的可逆终端pH＝2.88，3min断裂完全；而实施例24的可逆终端pH＝2.88，2min断裂完全；实施例15的可逆终端pH＝2.88，5min断裂完全；实施例16的可逆终端pH＝2.88，10min断裂完全；实施例14的可逆终端pH＝3.45，10min断裂完全；实施例24的可逆终端，pH＝3.45，9min断裂完全；实施例15的可逆终端pH＝3.45，14min断裂完全；实施例16的可逆终端pH＝3.45，18min断裂完全；在这两种pH条件下，DNA模板均无任何损伤。

在DNA测序系统中，对于实施例24所合成的其他三种不同碱基的可逆终端dCTP-linker-荧光素，dATP-linker-荧光素以及dGTP-linker-荧光素具有与dUTP-linker-TAMRA同样的断裂速度和效率。见图35所示，其为实施例24的酸敏感连接单元以及相应的可逆终端的合成示意图，即可以有效地被DNA聚合酶识别并在弱酸性条件下快速完全断裂(pH＝2.88，2min断裂完全；pH＝3.45，9min断裂完全)，且在此过程中DNA链没有受到任何损伤。

在DNA测序系统中，对于实施例15所合成的其他三种不同碱基的可逆终端dCTP-linker-荧光素，dATP-linker-荧光素以及dGTP-linker-荧光素具有与dUTP-linker-TAMRA非常相似的断裂速度及效率。即可以有效地被DNA聚合酶识别并在弱酸性条件下快速完全断裂(pH＝2.88，5min断裂完全；pH＝3.45，14min断裂完全)，且在此过程中DNA链没有受到任何损伤。

实施例29、在同样的条件下，前期工作中合成的可逆终端(申请号： 201110331659.1；201210132695)在DNA测序系统中的测试结果如下：

测试结果见附图36所示：其中图36(a)为荧光扫描示意图，图36(b)为GR染色示意图。

附图36中标识含义如下所示：

Lane1:dUTP-THF-5(6)TAMRA(12)incorporation into DNA strand

Lane2:pH＝1.6，45℃，5min

Lane3:pH＝1.6，45℃，10min

Lane4:pH＝1.6，45℃，15min

Lane5:pH＝1.6，45℃，20min

Lane6:pH＝1.6，45℃，25min

Lane7:pH＝1.6，45℃，30min

结论：当反应条件为pH＝1.6，45oC，25min时，该可逆终端完全断裂，此时DNA链已受到明显损伤。所以前期合成的可逆终端并不能真正地用于测序。从实施例29(前期专利)可以看出,相比前期专利的可逆终端,本发明所述的酸敏感可逆终端(除了实施例29之外的可逆终端)能够在温和的条件下(弱酸性,室温)快速完全断裂,并且在这种条件下,DNA链一点也没有损伤,可真正地用于DNA测序。

实施例30、DNA链延伸反应

本实施例涉及的酸敏感可逆终端dUTP(实施例11、11、17、18、19、20、21、22、12、13、14、15、16、24)荧光核苷酸延伸反应测试

所用测序模板如下：

模板1：

GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo2(带荧光)

CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCATCGATCGCCATGTCG Oilgo3

模板2：

GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo2(带荧光)

CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCAACGATCGCCATGTGC Oligo4

模板3：

GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo2(带荧光)

CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCAAAGATCGCCATGTGC Oligo5

1)按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：

10×Klenow buffer 10uL,

BSA(10mg/mL)1uL,

DMSO20uL,

NaCl(1M)25uL,

Klenow(exo-)pol(5U/uL)1.32uL,

dUTP(10uM)X uL

模板DNA YuL,\

当模板DNA为模板1(100ng/uL)时，X＝35.38uL,Y＝7.3uL；

当模板DNA为模板2(1530ng/uL)时，X＝41.68uL,Y＝1uL；

当模板DNA为模板3(1880ng/uL)时，X＝41.68uL,Y＝1uL；

总体积100uL，将反应体系置于30℃中处理15分钟，再置于72℃中处理10分钟，冷却到16℃。

分离纯化：酚氯仿抽提，乙醇沉淀，固体溶于12uL水中，G-50柱分离纯化。纯化完毕，再加入1uL0.02mM NaOH，PCR,95℃5min,使DNA双链解离成单链。

毛细管电泳，其电泳图见图37所示：

操作方法为：

荧光扫描

Lane1：Primer(Oligo2带荧光基团)

Lane2：dUTP(模板1)插入

Lane3：dUTP(模板2)插入

Lane4：dUTP(模板3)插入

结论：由上图37所示可以看出，荧光核苷酸dUTP(实施例11、12、13、14、15、24)成功地进行了延伸反应，且一次延伸反应主要延伸一个荧光核苷酸即可逆终端。

实施例31、DNA链延伸反应

dNTP(AP3)-linker-Fluorophore的DNA链延伸反应测试(N＝C、A、G)

先将oligo2与所有的oligo(7-18)结合即2-7,2-8到2-18：取oligo2和其他的oligo个5ul于PCR管中，然后95℃3min并且以0.1℃/S降至15℃保存待用。再配制毛细管电泳胶(配制方法如上所述)。

1)所用模板如下：

AGCTGCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo7

AGCGGCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo8

AGGGGCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo9

GGGGGCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo10

GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG oligo2(带荧光)

荧光可逆终端dCTP-linker-FITC(实施例20以及15、24的关于dCTP的可逆终端)用于DNA链延伸反应。

按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：

总体积100uL，将反应体系置于30℃15min，72℃10min，16℃保存。

经酚氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩为固体后，溶于相应体积的水中使其的浓度达到40ng/ul，加入0.1M NaOH，95℃5min变性后，进行毛细管电泳分析，如图38所示：

从图38中可以看出oligo2为Marker,第二道至第四道分别为2-7(G),2-8(GG),2-9(GGGG),2-10(GGGGG)。上面的四个平行条带都为加上一个dCTP,即每次只能延伸一个荧光标记核苷酸即可逆终端。

2)所用模板如下：

AGCTCCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo11

AGCCCCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo13

GCCCCCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo14

GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG oligo2(带荧光)

荧光可逆终端dGTP-linker-T(实施例22以及实施例15、24中关于dGTP的可逆终端)用于DNA链延伸反应。

按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：

总体积100uL，将反应体系置于30℃15min,75℃10min，16℃保存。

酚氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩为固体后，溶于相应体积的水中使其的浓度达到40ng/ul，加入0.1M NaOH，95℃5min处理后，进行毛细管电泳分析。

由图39所示中oligo2为Marker，从第二道到第五道分别是2-11(c)，2-13(ccc)，2-14(cccc)，2-3(A)。则可以说明每次延伸反应只能接上一个荧光标记dGTP即可逆终端。

3)所用模板如下：

AGCATCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo15

AGCTTCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo16

AGTTTCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo17

GTTTTCCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTC oligo18

GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG oligo2(带荧光)

荧光可逆终端dATP-linker-T(实施例21以及实施例15、24中关于dATP的可逆终端)用于DNA链的延伸反应

按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：

总体积100uL，将反应体系置于30℃15min,75℃10min，16℃保存。

经酚氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩为固体后，溶于相应体积的水中使其的浓度达到40ng/ul，加入0.1M NaOH，95℃5min变性处理后，进行毛细管电泳分析。

从图40所示，可以看出2-15,2-16,2-17,2-18在一条直线上，则说明即使多T模板每次延伸反应也只能延伸一个荧光标记的dATP即可逆终端。

结论：从以上三个图可以得出结论，当模板为多T,多G，多C时,每次延伸反应都只能延伸一个相应的荧光标记核苷酸即可逆终端。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种酸敏感连接单元，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：

其中R为NH₂或N₃，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数；

R₁为甲基或乙基，R₂为甲基；

或R₁为苯基或萘基、R₂为甲基或乙基；

或R₁为苯基、对甲氧基苯基、2,4,6-三甲氧基苯基、萘基、4-甲氧基-1-萘基，R₂为氢；

或R₁、R₂构成环己基、环戊基。

2.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁＝R₂＝甲基，m为0～44中任一整数。

3.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁、R₂构成环己基，m为0～44中任一整数。

4.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁、R₂构成环戊基，m为0～44中任一整数。

5.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁＝苯基，R₂＝甲基，m为0～44中任一整数。

6.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁＝对甲氧基苯基，R₂＝H，R为NH₂或N₃，m为0～44中任一整数。

7.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁＝4-甲氧基-1-萘基，R₂＝H，R为NH₂或N₃，m为0～44中任一整数。

8.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁＝乙基，R₂＝甲基，R为NH₂或N₃，m,n为0～44中任一整数。

9.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁＝R₂＝甲基，R为NH₂或N₃，m＝1,n＝0。

10.如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述R₁＝2,4,6-三甲氧基苯基，R₂＝H，R为NH₂或N₃，m为0～44中任一整数。

11.一种如权利要求1～10任一项所述的酸敏感连接单元的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

B、在三乙胺存在的条件下，化合物TsCl和化合物D反应，得到化合物E所述TsCl和化合物D的摩尔比为1：(2.0～4.0)；

12.如权利要求11所述的酸敏感连接单元的合成方法，其特征在于，所述化合物C通过包括如下步骤的方法制备而得：

B、在PPTS、5A分子筛存在条件下，化合物B、B1和反应，得到化合物C所述:PPTS:化合物B:化合物B1的摩尔比为1:(0.1～0.5):(1.0～1.5):(1.0～1.5)，且化合物B、B1为等摩尔，所述R₁，R₂均为甲基或者R₂为甲基，R₁为乙基。

13.如权利要求11所述的酸敏感连接单元的合成方法，其特征在于，所述化合物C通过包括如下步骤的方法制备而得：

步骤一，在pTSA存在条件下，原甲酸三甲酯与化合物A反应生成化合物B，

步骤二，在PPTS、5A分子筛存在条件下，化合物B和乙二醇单乙酸酯反应，得化合物C其中，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数，R₁＝苯基、R₂＝甲基，或R₁、R₂构成环己基、环戊基。

14.如权利要求11所述的酸敏感连接单元的合成方法，其特征在于，所述化合物C通过包括如下步骤的方法制备而得：

步骤一，在pTSA、4A分子筛存在条件下，4-甲氧基-1-萘甲醛与化合物A反应生成化合物C其中，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数；R₂＝H、R₁＝4-甲氧基-1-萘基。

15.一种如权利要求1所述的酸敏感连接单元在DNA测序中的用途，其特征在于，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端，所述可逆终端可用于DNA合成测序。

16.一种可逆终端，其特征在于，所述可逆终端由如权利要求1所述的酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素连接而得。

17.如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH₂时，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤：

A、所述酸敏感连接单元与TAMRA(5/6)FITC荧光素Cy5或荧光素Cy3.5以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下反应，得化合物TAMRA-OH化合物FITC-OH化合物Cy5-OH或化合物Cy3.5-OH所述TAMRA(5/6)、FITC、Cy5或Cy3.5与酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1：(1～3)：(3～10)；

B、在TEA存在的条件下，化合物TAMRA-OH、化合物FITC-OH、化合物Cy5-OH或化合物Cy3.5-OH和DSC反应，得到反应中间体，所述中间体直接与dUTP(AP3)dCTP(AP₃)dATP(AP3)或dGTP(AP3)反应，得到化合物dUTP-acid labile linker-TAMRA、dCTP-acid labile linker-FITC、化合物dATP-acid labilelinker-Cy5或化合物dGTP-acid labile linker-Cy3.5；所述化合物TAMRA-OH、FITC-OH、Cy5-OH或Cy3.5-OH与DSC、TEA和dUTP(AP3)、dCTP(AP₃)、dATP(AP3)或dGTP(AP3)的摩尔比为1：(5～12)：(6～15)：(2～4)。

18.如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH₂时，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤：

A、所述酸敏感连接单元与TAMRA(5/6)以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下反应，得化合物H所述TAMRA(5/6)、酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1：(1～3)：(3～10)；

B、在TEA存在的条件下，化合物H和DSC反应，得到反应中间体该中间体直接与dUTP(AP3)反应，得到化合物K所述化合物H、DSC、TEA和dUTP(AP3)的摩尔比为1：(5～12)：(6～15)：(2～4)。

19.如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为N₃时，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤：

B、荧光素FITC与丙炔胺反应得化合物Y014

20.如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH₂时，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤：

B、在TEA存在的条件下，化合物FITC-OH和DSC反应，得到反应中间体该中间体直接与dCTP(AP₃)反应，得最终产物即可逆终端dCTP-acid labile linker-FITC所述化合物FITC-OH、DSC、TEA和dCTP(AP₃)的摩尔比为1：(5～12)：(6～15)：(2～4)。

21.如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH₂时，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤：

B、将上述反应产物Cy5-OH与DSC反应后，不经分离纯化直接与之前合成的dATP(AP3)反应得到最终产物即可逆终端dATP-acid labile linker-Cy5该产物需要用HPLC纯化。

22.如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH₂时，所述酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤：

B、将上述反应产物Cy3.5-OH与DSC反应后，不经分离纯化直接与之前合成的dGTP(AP3)反应得到最终产物即可逆终端dGTP-acid labile linker-Cy3.5该产物需要用HPLC纯化。