CN104003902B

CN104003902B - 三氮烯连接单元的合成及其在dna测序中的用途

Info

Publication number: CN104003902B
Application number: CN201410203327.9A
Authority: CN
Inventors: 沈玉梅; 龚兵; 魏晓飞; 伍新燕; 邵志峰; 李小卫; 赵小东
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2034-05-14
Also published as: CN104003902A

Abstract

本发明公开了一种三氮烯连接单元的合成及其在DNA测序中的用途；该三氮烯连接单元结构式如下：其中-CH₂OH和-CH₂N₃分别连接于三氮烯结构的邻位、对位或间位。该酸敏感的三氮烯连接单元与核苷酸及荧光素连接得到的可逆终端可用于DNA合成测序。与现有技术相比，本发明合成了一类新的酸敏感连接单元，并用于合成了基于这种连接单元的可逆终端；该类可逆终端可用于DNA合成测序；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

Description

三氮烯连接单元的合成及其在DNA测序中的用途

技术领域

本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于DNA合成测序的化合物，具体涉及一类三氮烯连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

合成法测序(SequencingBySynthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”(reversibleterminator)。这类核苷酸除了要求3′-羟基阻断外，为了不影响下一个指示核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使这个连接单元断裂，继续DNA链的延长，从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键，偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及其它光可裂解连接单元)；亲电子试剂/酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而三氮烯连接单元却从来没有用于DNA测序(Bioorganic&MedicinalChemistry2012，20，571-582)。这是因为含双官能团的三氮烯连接单元对酸很敏感，其合成过程以及与核苷酸和荧光素的后续反应，其要求均很高。

可裂解连接单元对DNA测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。到目前为止还没有报道三氮烯化合物作为可裂解连接单元应用于DNA测序，所以设计、合成三氮烯连接单元并用于DNA测序具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种三氮烯连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。本发明设计合成的一类新的三氮烯连接单元(可逆终端)，该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效裂解，具有应用于DNA测序的价值。所以，基于三氮烯连接单元在DNA测序体系中能够大大提高测序效率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种三氮烯连接单元，其结构式如式(I)所示：

其中，-CH₂OH连接于三氮烯结构的邻位、对位或间位；-CH₂N₃连接于三氮烯结构的邻位、对位或间位。

优选的，所述-CH₂OH为邻位时，-CH₂N₃为邻位或间位。

优选的，所述-CH₂OH为间位时，-CH₂N₃为间位。

第二方面，本发明涉及一种上述的三氮烯连接单元的合成方法，包括如下步骤：

A、在酸性条件下，于亚硝酸钠水溶液中，冰浴下发生重氮化反应5min～2h后，缓慢加入得化合物A

B、在三乙胺存在的条件下，化合物TsCl(对甲基苯磺酰氯)和化合物A发生酯化反应，得到化合物B

C、在70～90℃下，NaN₃和化合物B发生取代反应，即得所述三氮烯连接单元步骤C中，优选反应温度为80℃。

优选的，步骤B中，所述TsCl和化合物A的摩尔比为1∶(2.0～4.0)。

优选的，步骤C中，所述NaN₃和化合物B的摩尔比为(1.5～3.5)∶1。

第三方面，本发明涉及一种前述的还原敏感型三氮烯连接单元在DNA测序中的用途，所述三氮烯连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端，所述可逆终端用于DNA合成测序。

第四方面，本发明涉及一种用于DNA合成测序的可逆终端，所述可逆终端由前述的三氮烯连接单元与核苷酸及荧光素连接而得；所述可逆终端的结构式如下式所示：

优选的，所述连接具体包括如下步骤：

A、以无水DMF为溶剂，在TEA(三乙胺)存在的条件下，所述还原敏感三氮烯连接单元与炔基化的TAMRA(5/6)发生点击反应，得化合物C

B、在DMAP、DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)存在的条件下，化合物C和DSC(N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)发生酯化反应，得到中间体所述中间体与dUTP(AP3)反应，即得所述可逆终端。

优选的，步骤A中，所述TAMRA(5/6)、三氮烯连接单元和TEA(三乙胺)的摩尔比为1∶(1～3)∶(3～10)。

优选的，步骤B中，所述化合物C、DSC、DMAP、DIPEA和dUTP(AP3)的摩尔比为1∶(5～12)∶(2～3)∶(2～4)∶(2～8)。

所述核苷酸dUTP(AP3)是通过包含如下步骤的方法合成的：

A、化合物F₂的合成：在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0∶(1.2～2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F₂

B、化合物F₃的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，化合物F₂和F₁ 反应，得化合物F₃ 所述F₁、F₂、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA(三乙胺)的摩尔比为1∶(2～3)∶0.072∶0.025∶(1.5～2)；

C、化合物dUTP(AP3)的合成：化合物F₃与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dUTP(AP3)所述E-4、E-3和F₃的摩尔比为2∶2∶1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明合成了一类新的可裂解连接单元，并用于合成了基于这种连接单元的可逆终端；该类可逆终端可用于DNA合成测序；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1中化合物A的NMR谱图；

图2为实施例2中化合物A的NMR谱图

图3为实施例3中化合物A的NMR谱图；

图4为实施例4、5、6的可逆终端的生物学评价结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。

本发明所得中间产物及最终产物采用NMR等进行表征。

实施例1、当CH ₂ OH为邻位时，CH ₂ N ₃ 为邻位时三氮烯连接单元的合成

本实施例的三氮烯连接单元的合成具体包括如下步骤：

第一步、

将邻氨基苯甲醇(123mg，1mmol)加入300mg浓盐酸和1.5mL水中，冰水浴下反应10min后，缓慢滴加0.6mL质量分数15％的亚硝酸钠水溶液，冰水浴下反应10min，缓慢加入邻氨基苯甲醇(123mg，1mmol)后，冰水浴下反应30min后，加入6.4mL质量分数15％的醋酸钠水溶液，反应混合液有淡黄色絮状物沉淀生成，过滤后，柱层析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶1，体积分数1％三乙胺]，得化合物A，淡黄色固体182mg，产率70.8％。NMR谱图如图1所示。

¹ HNMR(400MHz，MeOD)：δ＝7.68(d，1H，Ar，J＝7.5Hz)，7.60(d，1H，Ar，J＝7.5Hz)，7.50(d，1H，Ar，J＝6.7Hz)，7.31(t，4H，Ar，J＝7.6Hz)，7.04(s，1H，Ar)，4.90(s，2H，OCH₂Ar)，4.75(s，2H，OCH₂Ar).

第二步、

将上述反应物(6.098mmol)溶于7.5mlDCM中搅拌，在冰浴下加入0.43mL三乙胺，再逐滴加入溶于1.5mLDCM中的TsCl(0.291g，1.524mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE∶EA2.5∶1柱层析过柱，得纯品380mg。产物C₂₁H₂₁N₃O₄S的HRMS，计算值411.1253，实际测定值为：411.1260。

第三步、

称取上述反应物(0.59mmol)于单口瓶中，加入2.5mlDMF搅拌后再加入NaN₃(84.1mg，1.29mmol)于80℃下搅拌过夜，冷却至室温后加入10ml水并用乙酸乙酯15*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE∶EA3∶1柱层析得纯品39mg。产物C₂₁H₂₁N₆O的HRMS，计算值282.1229，实际测定值为：282.1224。

实施例2、当CH ₂ OH为间位时，CH ₂ N ₃ 为间位时三氮烯连接单元的合成

本实施例的三氮烯连接单元的合成具体包括如下步骤：

第一步、

将间氨基苯甲醇(123mg，1mmol)加入1.25mL1M稀盐酸和1mL水中，冰水浴下反应10min后，缓慢滴加0.6mL质量分数15％的亚硝酸钠水溶液，冰水浴下反应10min后，缓慢加入1mL1M间氨基苯甲醇/四氢呋喃溶液，冰水浴下反应30min后，加入6.4mL质量分数15％的醋酸钠水溶液，反应混合液有淡黄色絮状物沉淀生成，过滤后，柱层析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶1，体积分数1％三乙胺]，得化合物A，淡黄色固体11.4mg，产率4.4％。¹H-NMR谱图如图2所示。

¹H-NMR(400MHz，MeOD)：δ＝7.78(d，1H，Ar，J＝2.0Hz)，7.71(dd，1H，Ar，J＝8.52.2Hz)，7.61(d，2H，Ar，J＝7.9Hz)，7.38(dd，3H，Ar，J＝15.37.4Hz)，6.81(d，1H，Ar，J＝8.6Hz)，5.12(s，2H，OCH2Ar)，4.65(s，2H，OCH2Ar).

第二步、

将上述反应物(6.098mmol)溶于7.5mLDCM中搅拌，在冰浴下加入0.43mL三乙胺，再逐滴加入溶于1.5mlDCM中的TsCl(0.291g，1.524mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE∶EA2.5∶1柱层析过柱，得纯品380mg。产物C₂₁H₂₁N₃O₄S的HRMS，计算值411.1253，实际测定值为：411.1247。

第三步、

称取上述反应物(0.59mmol)于单口瓶中，加入2.5mLDMF搅拌后再加入NaN₃(84.1mg，1.29mmol)于80℃下搅拌过夜，冷却至室温后加入10ml水并用乙酸乙酯15*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE∶EA3∶1柱层析得纯品39mg。产物C₂₁H₂₁N₆O的HRMS，计算值282.1229，实际测定值为：282.1225。

实施例3、当CH ₂ OH为邻位时，CH ₂ N ₃ 为间位时三氮烯连接单元的合成

本实施例的三氮烯连接单元的合成具体包括如下步骤：

第一步、

将邻氨基苯甲醇(123mg，1mmol)加入1.25mL1M稀盐酸和1mL水中，冰水浴下反应10min后，缓慢滴加0.6mL质量分数15％的亚硝酸钠水溶液，冰水浴下反应10min后，缓慢加入间氨基苯甲醇(123mg，1mmol)后，冰水浴下反应30min后，加入7.5mL质量分数15％的醋酸钠水溶液，反应混合液有淡黄色絮状物沉淀生成，过滤后，柱层析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶1，体积分数1％三乙胺]，得化合物A，淡黄色固体13.2mg，产率5.1％。NMR谱图如图3所示。

¹HNMR(400MHz，MeOD)：δ＝7.68(d，1H，Ar，J＝7.7Hz)，7.60(d，1H，Ar，J＝7.3Hz)，7.50(d，1H，Ar，J＝6.7Hz)，7.30(m，4H，Ar)，7.05(d，1H，Ar，J＝6.9Hz)，4.90(s，2H，OCH₂Ar)，4.74(s，2H，OCH₂Ar).

第二步、

将上述反应物(6.098mmol)溶于7.5mlDCM中搅拌，在冰浴下加入0.43ml三乙胺，再逐滴加入溶于1.5mLDCM中的TsCl(0.291g，1.524mmol)室温下搅拌过夜。旋除溶剂用PE∶EA2.5∶1柱层析过柱，得纯品380mg。产物C₂₁H₂₁N₃O₄S的HRMS，计算值411.1253，实际测定值为：411.1261。

第三步、

称取上述反应物(0.59mmol)于单口瓶中，加入2.5mLDMF搅拌后再加入NaN₃(84.1mg，1.29mmol)于80℃下搅拌过夜，冷却至室温后加入10mL水并用乙酸乙酯15*4萃取，最后合并有机相再用饱和食盐水洗涤分层，旋除有机层后用PE∶EA3∶1柱层析得纯品39mg。产物C₂₁H₂₁N₆O的HRMS，计算值282.1229，实际测定值为：282.1234。

实施例4、基于三氮烯连接单元的可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例1的可裂解连接单元-还原敏感偶氮连接单元的合成得到的，其合成包括如下具体步骤：

第一步、

称取上述原料(0.019mmol)于单口瓶中，加入炔基TAMRA(0.019mmol)并加入无水DMF和三乙胺溶解，室温搅拌3h，旋除溶剂，硅胶板分离得产物，产率84％。

HRMS：calcforC₄₂H₄₀N₉O₅[M]⁺750.3152，found750.3160.

第二步、

称取上述原料(0.016mmol)于单口瓶中，加入2ml无水乙腈，依次加入DSC(24.6mg，0.096mmol)(隔2h分两次加入)、DMAP(3.9mg，0.032mmol)、DIPEA(5.2g，0.04mmol)，搅拌6h后硅胶板分离将未反应的除去，将得到的产品溶于0.8ml乙腈中，将dUTP(AP3)(20mg，38.4mmol)溶于1.5mlNa₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中并加入到反应中，在加入6uL三乙胺，室温搅拌3h。用分析型HPLC进行分析：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，8.6mMTEA(三乙胺)，100mMHFIP水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，15％～15％CH₃0H(5min)，15％～40％CH₃OH(5min)，40％～70％CH₃OH(30min)可见光检测器：546nm。在t＝30min时有产物峰生成，分离得最终产物，即可逆终端。

HRMS：calcforC₅₅H₅₂N₁₂O₂₀P₃[M+3H]⁺1293.2656，found1293.2661。

本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成，具体包括如下步骤：

第一步、化合物F₂的合成：

向一单口瓶中加入60ml甲醇，冰水浴下搅拌，加入丙炔胺(60mmol，3.3042g)，搅拌15min后缓慢加入三氟乙酸甲酯(86.7mmol，11.0957g)，10min后撤去冰水浴，室温下反应24小时。反应用TLC板进行监测，PE∶EA＝8∶1，烤板，Rf＝0.5产生新点为产物F2。减压蒸馏(51℃，280Pa)，得3.53g，产率39％。

¹HNMR(CDCl₃，300MHz)：δ2.32(t，J＝4.0Hz，1H)，4.13-4.15(m，2H)，6.92(s，1H)。

第二步、化合物F₃的合成：

向一单口瓶中加入F1(0.7mmol，247mg)，再称取9.7mgCuI和20.3mgPd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入2.3mlDMF，搅拌溶解，加入0.2mlTEA(三乙胺)，称取F2(254mg，1.7mmol)用DMF溶解后加入上述反应瓶中，室温搅拌，反应过夜。TLC板监测，EA为展开剂，Rf＝0.35为原料F1，Rf＝0.32为产物F3，两点位置非常接近。待反应结束后，减压蒸干溶剂，直接柱层析分离，20∶1DCM∶MeOH为淋洗剂，得214mg，产率61％。

¹HNMR(DMSO-D₆，300MHz)：δ2.11(t，J＝5.1Hz，2H)，3.56-3.58(m，2H)，3.78(m，1H)，4.21(d，J＝5.1Hz，3H)，5.08(t，J＝5.1Hz，1H)，5.23(d，J＝4.2Hz，1H)，6.09(t，J＝6.6Hz，1H)，8.18(s，1H)，10.05(t，J＝4.8Hz，1H)，11.63(s，1H).

第三步、化合物dUTP(AP3)的合成：

在手套箱中分别称取化合物F₃60mg(0.16mmol)、三正丁胺焦磷酸盐(E-4)150mg(0.32mmol)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)66mg(0.32mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.5mL无水DMF中，再加入0.6mL新蒸的三正丁胺，搅拌半小时。把2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮溶于0.5mL无水DMF中，激烈搅拌下通过注射器加入上述三正丁胺焦磷酸盐溶液，搅拌半小时。然后将该混合液注入到F₃中，搅拌1.5h。加入5mL3％碘(9∶1Py/H2O)溶液。15min后加入4mL水，搅拌2h。加入0.5mL3MNaCl溶液，再加入30mL无水乙醇，-20℃冷冻过夜，离心(3200r/min，25℃)20min。倾去上清液，得沉淀，抽干溶剂。再依次加入TEAB溶液和浓氨水，室温搅拌过夜。减压蒸干溶剂，出现白色固体，得dUTP-NH₂。用分析型HPLC进行分析，条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mMTEAAc和CH₃CH₂OH，梯度洗涤，0％-20％CH3CH2OH(35min)；紫外检测器：254nm。在t＝13.5min时有产物峰生成。

¹HNMR(D₂O，400MHz)：δ2.34-2.48(m，2H)，4.03(s，2H)，4.20-4.29(m，3H)，4.61-4.64(m，1H)，6.27(t，J＝6.4Hz，1H)，8.38(s，1H)。³¹PNMR(D₂O，162MHz)：δ-22.22，-11.45，-9.90。

HRMS：calcforC₁₂H₁₉N₃O₁₄P₃[M+H]⁺522.0080，found522.0070；calcforC₁₂H₁₈N₃O₁₄P₃Na[M+Na]⁺543.9899，found543.9883。

实施例5、基于三氮烯连接单元的可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例3的可裂解连接单元-还原敏感偶氮连接单元的合成得到的，其合成包括如下具体步骤：

第一步、

HRMS：calcforC₄₂H₄₀N₉O₅[M]⁺750.3152，found750.3147.

第二步、

称取上述原料(0.016mmol)于单口瓶中，加入2mL无水乙腈，依次加入DSC(24.6mg，0.096mmol)(隔2h分两次加入)、DMAP(3.9mg，0.032mmol)、DIPEA(5.2g，0.04mmol)，搅拌6h后硅胶板分离将未反应的除去，将得到的产品溶于0.8ml乙腈中，将dUTP(AP3)(20mg，38.4mmol)溶于1.5mlNa₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中并加入到反应中，在加入6uL三乙胺，室温搅拌3h。用分析型HPLC进行分析：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，8.6mMTEA(三乙胺)，100mMHFIP水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，15％～15％CH₃OH(5min)，15％～40％CH₃OH(5min)，40％～70％CH₃OH(30min)可见光检测器：546nm。在t＝30min时有产物峰生成，分离得最终产物，即可逆终端。

HRMS：calcforC₅₅H₅₂N₁₂O₂₀P₃[M+3H]⁺1293.2656，found1293.2649。

实施例6、基于三氮烯连接单元的可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例2的可裂解连接单元-还原敏感偶氮连接单元的合成得到的，其合成包括如下具体步骤：

第一步、

HRMS：calcforC₄₂H₄₀N₉O₅[M]⁺750.3152，found750.3159.

第二步、

HRMS：calcforC₅₅H₅₂N₁₂O₂₀P₃[M+3H]⁺1293.2656，found1293.2659。

同时也合成了基于其它三个碱基的可逆终端：dCTP-三氮烯联接单元-荧光素，dATP-三氮烯联接单元-荧光素以及dGTP-三氮烯联接单元-荧光素。除了本实施例阐述的荧光素TAMRA，其它的荧光素如FITC，Cy系列等均可以用于合成可逆终端，从而用于DNA测序。

实施例7、对合成的可逆终端的生物学评价

为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA测序，本实施例检测了实施例4、5、6的可逆终端两个方面的特性：

1)是否可以被DNA聚合酶所识别，作为DNA聚合酶的底物参与DNA的延伸反应；

2)参与DNA链延伸后能否去掉该可逆终端所携带的荧光基团，以便下一轮的延伸反应。

这两方面是高通量合成测序(sequencingbysynthesis)的核心。因此配制DNA延伸反应体系：将可逆终端与DNA模板、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow缓冲液充分混合，30℃静置15min，75℃处理10min以灭活klenowDNA聚合酶活性，然后针对酸敏感可逆终端检测不同酸性条件下(pH2.95、pH3.31)可逆终端所携带的荧光基团是否可以断裂。具体如下：

1)按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：10×Klenowbuffer10uL，BSA(10mg/mL)1uL，DMSO20uL，NaCl(1M)25uL，Klenow(exo-)pol(5U/uL)1.32uL，dUTP(10uM)6uL，模板DNA(853ng/uL)1.25uL，ddH₂O35.43uL，总体积100uL。

将反应体系置于30℃水浴箱中处理15min，再置于75℃水浴中处理10min以灭活DNA聚合酶。将反应产物用于后续的可逆终端荧光基团的断裂反应。

2)酸敏感可逆终端荧光基团的断裂反应

在DNA链延伸反应体系中加入13.5uL0.24MHCl，调节pH至3.05，室温处理30min，再用1MTris调节pH至8.0，取断裂反应产物进行12％PAGE电泳分析，如图4所示，由图4可知，酸敏感可逆终端可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸，并且在pH3.05和pH3.40的酸性条件下，可逆终端所携带的荧光基团完全断裂，效果很好。完全可以用于测序。图4中各标示的含义如下：

Lane1：dUTP插入

Lane2：dUTP插入，pH＝3.05，1.5min后，中和成pH＝8.0

Lane3：dUTP插入，pH＝3.05，3min后，中和成pH＝8.0

Lane4：dUTP插入，pH＝3.05，10min后，中和成pH＝8.0

Lane5：dUTP插入，pH＝3.40，2min后，中和成pH＝8.0

Lane6：dUTP插入，pH＝3.40，5min后，中和成pH＝8.0

Lane7：dUTP插入，pH＝3.40，10min后，中和成pH＝8.0

Lane8：dUTP插入，pH＝3.40，20min后，中和成pH＝8.0

结论：室温下，pH＝3.05，3min断裂完全；pH＝3.40，10min断裂完全。在这两种pH条件下，DNA模板均无明显损伤。

基于其它三个碱基的可逆终端：dCTP-三氮烯联接单元-荧光素，dATP-三氮烯联接单元-荧光素以及dGTP-三氮烯联接单元-荧光素也同样能够为相应的DNA聚合酶识别并实现链延伸反应，同时在温和的条件下可快速完全断裂，其断裂速度与断裂条件与上述基于dUTP的可逆终端非常类似。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种三氮烯连接单元，其结构式如式(I)所示：

2.根据权利要求1所述的三氮烯链接单元，其特征在于，-CH₂OH连接于三氮烯结构的邻位、对位或间位；-CH₂N₃连接于三氮烯结构的邻位、对位或间位。

3.一种根据权利要求1所述的三氮烯连接单元的合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

B、在三乙胺存在的条件下，化合物TsCl和化合物A发生酯化反应，得到化合物B

C、在70～90℃下，NaN₃和化合物B发生取代反应，即得所述三氮烯连接单元

4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤B中，所述TsCl和化合物A的摩尔比为1:(2.0～4.0)。

5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤C中，所述NaN₃和化合物B的摩尔比为(1.5～3.5):1。

6.一种根据权利要求1所述的三氮烯连接单元在DNA测序中的用途，其特征在于，所述三氮烯连接单元与核苷酸及荧光素连接得到用于DNA合成测序的可逆终端；所述可逆终端的结构式如下式所示：

7.一种用于DNA合成测序的可逆终端，其特征在于，所述可逆终端由根据权利要求1所述的三氮烯连接单元与核苷酸及荧光素连接而得；所述可逆终端的结构式如下式所示：

8.一种根据权利要求7所述的用于DNA合成测序的可逆终端的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

A、以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，所述三氮烯连接单元与炔基化的6-TAMRA发生点击反应，得化合物C

B、在DMAP、N，N-二异丙基乙胺存在的条件下，化合物C和N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯发生酯化反应，得到中间体所述中间体与反应，即得所述可逆终端。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述炔基化的6-TAMRA、三氮烯连接单元和TEA的摩尔比为1:(1～3):(3～10)。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述化合物C、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、DMAP、N，N-二异丙基乙胺和的摩尔比为1:(5～12):(2～3):(2～4):(2～8)。