CN103539697B - 还原敏感偶氮连接单元的合成及其在dna测序中的用途 - Google Patents
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- CN103539697B CN103539697B CN201310462509.3A CN201310462509A CN103539697B CN 103539697 B CN103539697 B CN 103539697B CN 201310462509 A CN201310462509 A CN 201310462509A CN 103539697 B CN103539697 B CN 103539697B
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Abstract
本发明公开了一种还原敏感偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途;该还原敏感偶氮连接单元结构式如下:其中m为0~44中任一整数,n为0~44中任一整数。该还原敏感偶氮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端,所述可逆终端用于DNA合成测序。与现有技术相比,本发明合成了一类新的可裂解连接单元,并用于合成了基于这种连接单元的可逆终端;该类可逆终端在温和的条件下可以实现高效率的裂解,可用于DNA合成测序;同时,其合成所需原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,可用于大规模推广使用。
Description
技术领域
本发明属于化学合成和生物化学领域,涉及可用于DNA合成测序的化合物,具体涉及一类还原敏感型偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。
背景技术
DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后,DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。
合成法测序(Sequencing By Synthesis,SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定,并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物,分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸,实现高通量并行的DNA序列信息的检测。
在合成法测序中,首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料,又叫“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3′-羟基阻断外,为了不影响下一个指示核苷酸的并入和识别,还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子,例如荧光素,连接起来。然后,在下一个指示核苷酸并入之前,在温和的条件下使这个连接单元断裂,继续DNA链的延长,从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响,因此,人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元,来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键,偶氮化合物);光裂解(邻硝基苄基衍生物,苯甲酰甲基酯衍生物及其它光可裂解连接单元);亲电子试剂/酸敏感(酸裂解;叠氮化合物);金属作用下的裂解;氧化剂敏感等。然而还原敏感连接单元却从来没有用于DNA测序(Bioorganic&Medicinal Chemistry2012,20,571-582)。
可裂解连接单元对DNA测序的读长和效率有重要的影响,而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高,用于测序时读长太短等缺点,因此,设计、合成新的可裂解连接单元,并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。文献(Eur.J.Org.Chem.2010,4360-4364)报道了不同的偶氮苯为还原性连接单元应用于蛋白质组学,不同的偶氮化合物在连二亚硫酸钠作用下有很好的裂解速率,而还原剂对DNA链没有损伤,还未有报道偶氮化合物作为可裂解连接单元应用于DNA测序上,所以设计、合成对还原敏感的连接单元并用于DNA测序具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种还原敏感偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。本发明设计合成的一类新的还原敏感偶氮连接单元(可逆终端),该类化合物合成原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,易于实现大量合成;该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能,发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解,具有应用于DNA测序的价值。所以,基于偶氮结构的连接单元在DNA测序体系中能够提高测序效率。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
第一方面,本发明涉及一种还原敏感偶氮连接单元,其结构式如式(I)所示:
其中m为0~44中任一整数,n为0~44中任一整数。
优选的,所述m为0~10中任一整数,n为0~10中任一整数。
优选的,所述m=1,n为0~10中任一整数。
第二方面,本发明涉及一种上述的还原敏感偶氮连接单元的合成方法,包括如下步骤:
第一步、在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)存在的条件下,碳酸钾、化合物E和化合物G反应,得到化合物H所述碳酸钾、化合物E和化合物G的摩尔比为(1.0~1.5):(3.0~5.5):1.0。
第二步、在冰浴的条件下,TFA(三氟乙酸)和化合物H反应,得到化合物I所述TFA和化合物H的摩尔比为(3.0~8.0):1.0。
优选的,所述化合物E的合成包括如下步骤:
A、在甲苯存在的条件下,摩尔比为(1.0~3.5):1.0的48%HBr水溶液与化合物A反应,得到化合物B其中,n为0~44中任一整数;
B、在氨水存在条件下,化合物B和氨水反应,得到化合物C所述氨水与化合物B的摩尔比为(1.0~30):1.0;
C、在水、甲醇和氢氧化钠存在的条件下,BOC酸酐和化合物C反应,得到化合物D所述BOC酸酐和化合物C的摩尔比为(1.0~3.5):1.0;
D、在三乙胺、DMAP(4-二甲氨基吡啶)存在的条件下,化合物TsCl和化合物D反应,得到化合物E所述三乙胺、DMAP、TsCl(对甲基苯磺酰氯)和化合物D的摩尔比为(1.0~5.0):(0.1~0.5):(1.0~4.0):1.0。
优选的,所述化合物G的合成包括如下步骤:
在水、甲醇存在的条件下,亚硝酸钠、4-氨基苯乙醇和化合物F反应,得到化合物G所述亚硝酸钠、4-氨基苯乙醇和化合物F的摩尔比为(1.0~4.5):1.0;(1.0~1.5);其中,m为0~44中任一整数。
第三方面,本发明涉及一种前述的还原敏感偶氮连接单元在DNA测序中的用途,其特征在于,所述还原敏感偶氮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端,所述可逆终端用于DNA合成测序。
第四方面,本发明涉及一种可逆终端,所述可逆终端由前述的还原敏感偶氮连接单元与核苷酸及荧光素连接而得。
优选的,所述连接具体包括如下步骤:
A、以无水DMF为溶剂,在TEA存在的条件下,所述还原敏感偶氮连接单元与TAMRA(5/6)反应,得化合物J所述TAMRA(5/6)、还原敏感偶氮连接单元和TEA的摩尔比为1:(1~3):(3~10);
B、在DMAP、DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)存在的条件下,化合物J和DSC(N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)反应,得到中间体K该中间体K与dUTP(AP3)反应,得到化合物L所述化合物J、DSC、DMAP、DIPEA和dUTP(AP3)的摩尔比为1:(5~12):(2~3):(2~4):(2~8)。
优选的,所述核苷酸dUTP(AP3)是通过包含如下步骤的方法合成的:
A、化合物F2的合成:在冰水浴搅拌条件下,摩尔比为1.0:(1.2~2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应,得化合物F2
B、化合物F3的合成:在CuI、Pd(PPh3)4(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下,化合物F2和F1 反应,得化合物F3 所述F1、F2、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1:(2~3):0.072:0.025:(1.5~2);
C、化合物dUTP(AP3)的合成:化合物F3与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应,反应产物去保护,得化合物dUTP(AP3)所述E-4、E-3和F3的摩尔比为2:2:1。
第五方面,本发明涉及一种前述的可逆终端在DNA测序中的用途。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明合成了一类新的可裂解连接单元,并用于合成了基于这种连接单元的可逆终端;该类可逆终端可用于DNA合成测序;同时,其合成所需原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,可用于大规模推广使用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为实施例1的还原敏感偶氮连接单元的合成示意图;
图2为实施例2的还原敏感偶氮连接单元的合成示意图;
图3为实施例3的还原敏感偶氮连接单元的合成示意图;
图4为实施例4的基于偶氮连接单元的可逆终端的合成示意图;
图5为实施例4的核苷酸dUTP的合成示意图;
图6为实施例4中化合物F3合成核苷酸dUTP的具体合成示意图;
图7为实施例4的可逆终端的1H-NMR谱图;
图8为实施例4的可逆终端的31P NMR谱图;
图9为实施例4的可逆终端的HRMS谱图;
图10为实施例4的可逆终端的HPLC谱图;
图11为实施例4的可逆终端在DNA测序体系中不同酸性条件下的断裂效果示意图;其中,a为荧光扫描示意图,b为GR染色示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。
本发明所得中间产物及最终产物采用NMR等进行表征。
实施例1、当n=2时,还原敏感偶氮连接单元的合成
本实施例的还原敏感偶氮连接单元的合成示意图如图1所示,具体步骤如下:
第一步、化合物LYZ001的合成:
将三乙二醇(9g,60mmol)溶于甲苯中,溶解后加入48%HBr溶液,加热回流,用碳酸氢钠吸收挥发出来的气体,并控制温度115度搅拌3d,加入饱和碳酸氢钠溶液使其呈中性后旋除溶剂,加入30ml水,并用DCM60mL*3萃取,旋除有机层后得5.2g,产率40.9%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.68(t,2H,J=6.0Hz),3.58(t,2H,J=4.6Hz),3.51~3.55(m,4H),3.44(t,2H,J=4.6Hz),3.35(t,2H,J=6.3Hz).
第二步、化合物LYZ002的合成:
将LYZ001(3.7g,17.36mmol)溶于30ml氨水中,并于70度下搅拌24h,旋除溶剂后加入15ml水,用二氯甲烷20*3洗涤,将有机相旋除后得2.4g,产率93%。1H NMR(400MHz,D2O):δppm3.82~3.71(m,8H),3.66~3.62(m,2H),3.21(t,2H,J=4.8Hz).
第三步、化合物LYZ003的合成:
将LYZ002(2.6g,17.4mmol)溶于10ml甲醇和5ml水的混合液中,将0.695g氢氧化钠溶于10ml水后加入到反应中,将DIBOC(4.167g,19.1mmol)溶于5ml甲醇后加入到反应中搅拌过夜,旋除溶剂后,加入15ml水,并于二氯甲烷20*3萃取,将有机相旋除后柱层析EA:DCM1:1得纯品2.15g。产率49.6%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.74(t,2H,J=4.4Hz),3.65~3.59(m,6H),3.55(t,2H,J=5.2Hz),3.32~3.30(m,2H),1.43(s,9H).
第四步、化合物LYZ004的合成:
将LYZ003(2.15g,8.63mmol)溶于25ml二氯甲烷中,依次加入三乙胺(1.08g)、DMAP(0.105g)、TsCl(2.056g,10.8mmol)于室温下搅拌过夜,加入10ml1%HCl溶液并用二氯甲烷20*3萃取,旋除有机相后用PE:EA2:1柱层析得纯品2.7g,产率77.7%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.77(d,2H,J=8.0Hz),7.32(d,2H,J=8.0Hz),4.96(s,1H),4.14(t,2H,J=4.8Hz),3.66(t,2H,J=4.8Hz),3.54~3.45(m,6H),3.27~3.24(m,2H),2.42(s,3H),1.41(s,9H).
第五步、化合物LYZ010的合成:
称取4-氨基苯乙醇(274mg,2mmol)溶于5ml中,于冰浴下缓慢加入0.5ml浓盐酸。称取亚硝酸钠(145mg,2.1mmol)溶于10ml水中,于0度缓慢滴加到反应中,搅拌40min,称取4-乙基苯酚(244mg,2mmol)及氢氧化钠(80mg,2mmol)于冰水浴中加入15ml乙醇及45ml水搅拌溶解。将生成的重氮盐于冰水浴中缓慢滴加到4-乙基苯酚溶液中,搅拌5h,此时有大量沉淀生成,过滤,滤渣用水10ml洗涤三次,抽干得225mg。产率41.7%.。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm12.72(s,1H),7.80(d,2H,J=8.4Hz),7.75(d,1H,J=2.4Hz),7.37(d,2H,J=8.4Hz),7.18(dd,1H,J=2.4Hz,8.4Hz),6.95(d,2H,J=8.4Hz),3.90(t,2H,J=6.4Hz),2.94(t,2H,J=6.4Hz),2.69(q,2H,J=7.6Hz),1.75(s,1H),1.29(t,3H,J=7.6Hz).13CNMR(100MHz,CDCl3):δppm150.8,149.5,142.3,137.2,135.8,133.2,131.8,130.1,122.4,118.0,63.4,39.1,27.9,15.7.
第六步、化合物LYZ011的合成:
将LYZ004(50mg,0.124mmol)碳酸钾(19mg,0.136mmol)置于10ml单口瓶中,并将溶于5mlDMF的LYZ010(101mg,0.372mmol)加入到瓶中,抽真空,氮气保护并于120度下搅拌2.5h,反应冷却后溶于20ml乙酸乙酯中,并用水洗涤,旋除溶剂柱层析分离得56mg。产率90.3%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.85(d,2H,J=8.4Hz),7.47(d,1H,J=2.0Hz),7.36(d,2H,J=8.4Hz),7.25(dd,1H,J=2.0Hz,8.4Hz),7.03(d,1H,J=8.4Hz),5.05(s,1H),4.34(t,2H,J=4.8Hz),3.95~3.91(m,4H),3.78(t,2H,J=4.8Hz),3.60(t,2H,J=4.8Hz),3.49(t,2H,J=5.2Hz),3.26~3.23(m,2H),2.94(t,2H,J=6.4Hz),2.65(q,2H,J=7.6Hz),1.40(s,9H),1.24(t,3H,J=7.6Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δppm154.6,152.0,142.7,142.1,137.6,131.7,129.8,123.2,116.2,115.5,79.3,71.0,70.3,70.3,69.9,63.4,40.4,39.2,28.5,28.1,15.7.
第七步、化合物LYZ012的合成:
称取LYZ011(60mg,0.12mmol)于单口瓶中,并置于冰浴中,加入1mlTFA冰浴下搅拌1h,加入饱和碳酸氢钠淬灭,并用乙酸乙酯萃取,旋除溶剂后硅胶板分离得20mg。产率41.7%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.63(d,2H,J=8.0Hz),7.46(d,1H,J=2.0Hz),7.40(d,2H,J=8.4Hz),7.29(dd,1H,J=2.0Hz,8.8Hz),6.97(d,1H,J=8.4Hz),4.32~4.30(m,2H),3.92~3.91(m,4H),3.76~3.68(m,4H),3.62~3.58(m,4H),2.91(s,2H),2.75(s,2H),2.64(q,2H,J=7.6Hz),1.24(t,3H,J=7.6Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δppm154.1,253.3,143.3,141.8,137.4,132.3,129.9,122.6,116.7,113.3,70.8,69.7,69.5,68.2,67.1,62.7,40.1,38.6,28.1,15.7.
实施例2、当n=0时,还原敏感偶氮连接单元的合成
本实施例的还原敏感偶氮连接单元的合成示意图如图2所示,具体步骤如下:
第一步、化合物LYZ015的合成:
将乙二醇(3.72g,60mmol)溶于甲苯中,溶解后加入48%HBr溶液,加热回流,用碳酸氢钠吸收挥发出来的气体,并控制温度115度搅拌3d,加入饱和碳酸氢钠溶液使其呈中性后旋除溶剂,加入30ml水,并用DCM60mL*3萃取,旋除有机层后得3.72g,产率50%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.68(t,2H,J=6.3Hz),3.35(t,2H,J=6.3Hz).
第二步、化合物LYZ016的合成:
将LYZ015(2.15g,17.36mmol)溶于30ml氨水中,并于70度下搅拌24h,旋除溶剂后加入15ml水,用二氯甲烷20*3洗涤,将有机相旋除后得1.006g,产率95%。1H NMR(400MHz,D2O):δppm3.65(t,2H,J=4.8Hz),3.21(t,2H,J=4.8Hz).
第三步、化合物LYZ017的合成:
将LYZ016(1.061g,17.4mmol)溶于10ml甲醇和5ml水的混合液中,将0.695g氢氧化钠溶于10ml水后加入到反应中,将DIBOC(4.167g,19.1mmol)溶于5ml甲醇后加入到反应中搅拌过夜,旋除溶剂后,加入15ml水,并于二氯甲烷20*3萃取,将有机相旋除后柱层析EA:DCM1:1得纯品1.4g。产率50%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.74(t,2H,J=4.4Hz),3.31(t,2H,J=4.4Hz),1.43(s,9H).
第四步、化合物LYZ004的合成:
将LYZ017(1.39g,8.63mmol)溶于25ml二氯甲烷中,依次加入三乙胺(1.08g)、DMAP(0.105g)、TsCl(2.056g,10.8mmol)于室温下搅拌过夜,加入10ml1%HCl溶液并用二氯甲烷20*3萃取,旋除有机相后用PE:EA2:1柱层析得纯品2.039g,产率75%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.77(d,2H,J=8.0Hz),7.32(d,2H,J=8.0Hz),4.14(t,2H,J=4.8Hz)3.25(t,2H,J=4.8Hz),2.42(s,3H),1.41(s,9H).
第五步、化合物LYZ010的合成:
称取4-氨基苯乙醇(274mg,2mmol)溶于5ml中,于冰浴下缓慢加入0.5ml浓盐酸。称取亚硝酸钠(145mg,2.1mmol)溶于10ml水中,于0度缓慢滴加到反应中,搅拌40min,称取4-乙基苯酚(244mg,2mmol)及氢氧化钠(80mg,2mmol)于冰水浴中加入15ml乙醇及45ml水搅拌溶解。将生成的重氮盐于冰水浴中缓慢滴加到4-乙基苯酚溶液中,搅拌5h,此时有大量沉淀生成,过滤,滤渣用水10ml洗涤三次,抽干得225mg。产率41.7%.。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm12.72(s,1H),7.80(d,2H,J=8.4Hz),7.75(d,1H,J=2.4Hz),7.37(d,2H,J=8.4Hz),7.18(dd,1H,J=2.4Hz,8.4Hz),6.95(d,2H,J=8.4Hz),3.90(t,2H,J=6.4Hz),2.94(t,2H,J=6.4Hz),2.69(q,2H,J=7.6Hz),1.75(s,1H),1.29(t,3H,J=7.6Hz).13CNMR(100MHz,CDCl3):δppm150.8,149.5,142.3,137.2,135.8,133.2,131.8,130.1,122.4,118.0,63.4,39.1,27.9,15.7.
第六步、化合物LYZ019的合成:
将LYZ018(39mg,0.124mmol)碳酸钾(19mg,0.136mmol)置于10ml单口瓶中,并将溶于5mlDMF的LYZ010(101mg,0.372mmol)加入到瓶中,抽真空,氮气保护并于120度下搅拌2.5h,反应冷却后溶于20ml乙酸乙酯中,并用水洗涤,旋除溶剂柱层析分离得45mg。产率88.2%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.85(d,2H,J=8.4Hz),7.47(d,1H,J=2.0Hz),7.36(d,2H,J=8.4Hz),7.25(dd,1H,J=2.0Hz,8.4Hz),7.03(d,1H,J=8.4Hz),5.05(s,1H),4.34(t,2H,J=4.8Hz),3.95~3.91(m,2H),3.26~3.23(m,2H),2.94(t,2H,J=6.4Hz),2.65(q,2H,J=7.6Hz),1.40(s,9H),1.24(t,3H,J=7.6Hz).
第七步、化合物LYZ020的合成:
称取LYZ019(50mg,0.12mmol)于单口瓶中,并置于冰浴中,加入1mlTFA冰浴下搅拌1h,加入饱和碳酸氢钠淬灭,并用乙酸乙酯萃取,旋除溶剂后硅胶板分离得17mg。产率45%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.63(d,2H,J=8.0Hz),7.46(d,1H,J=2.0Hz),7.40(d,2H,J=8.4Hz),7.29(dd,1H,J=2.0Hz,8.8Hz),6.97(d,1H,J=8.4Hz),4.32~4.30(m,2H),3.92~3.90(m,2H),3.62~3.58(m,2H),2.91(s,2H),2.75(s,2H),2.64(q,2H,J=7.6Hz),1.24(t,3H,J=7.6Hz).
实施例3、当n=10时,还原敏感偶氮连接单元的合成
本实施例的还原敏感偶氮连接单元的合成示意图如图3所示,具体步骤如下:
第一步、化合物LYZ021的合成:
将PEG500(30.12g,60mmol)溶于甲苯中,溶解后加入48%HBr溶液,加热回流,用碳酸氢钠吸收挥发出来的气体,并控制温度115度搅拌3d,加入饱和碳酸氢钠溶液使其呈中性后旋除溶剂,加入30ml水,并用DCM60mL*3萃取,旋除有机层后得33.84g,产率35%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.68(t,2H,J=6.0Hz),3.58~3.44(m,40H),3.35(t,2H,J=6.3Hz).
第二步、化合物LYZ022的合成:
将LYZ021(9.791g,17.36mmol)溶于30ml氨水中,并于70度下搅拌24h,旋除溶剂后加入15ml水,用二氯甲烷20*3洗涤,将有机相旋除后得7.828g,产率90%。1H NMR(400MHz,D2O):δppm3.82~3.71(m,40H),3.66~3.62(m,2H),3.21(t,2H,J=4.8Hz).
第三步、化合物LYZ023的合成:
将LYZ022(8.717g,17.4mmol)溶于10ml甲醇和5ml水的混合液中,将0.695g氢氧化钠溶于10ml水后加入到反应中,将DIBOC(4.167g,19.1mmol)溶于5ml甲醇后加入到反应中搅拌过夜,旋除溶剂后,加入15ml水,并于二氯甲烷20*3萃取,将有机相旋除后柱层析EA:DCM1:1得纯品5.02g。产率48%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.74(t,2H,J=4.4Hz),3.65~3.54(m,40H),3.32~3.30(m,2H),1.43(s,9H).
第四步、化合物LYZ004的合成:
将LYZ023(5.187g,8.63mmol)溶于25ml二氯甲烷中,依次加入三乙胺(1.08g)、DMAP(0.105g)、TsCl(2.056g,10.8mmol)于室温下搅拌过夜,加入10ml1%HCl溶液并用二氯甲烷20*3萃取,旋除有机相后用PE:EA2:1柱层析得纯品4.561g,产率70%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.77(d,2H,J=8.0Hz),7.32(d,2H,J=8.0Hz),4.96(s,1H),4.14(t,2H,J=4.8Hz),3.66(t,2H,J=4.8Hz),3.54~3.45(m,38H),3.27~3.24(m,2H),2.42(s,3H),1.41(s,9H).
第五步、化合物LYZ010的合成:
称取4-氨基苯乙醇(274mg,2mmol)溶于5ml中,于冰浴下缓慢加入0.5ml浓盐酸。称取亚硝酸钠(145mg,2.1mmol)溶于10ml水中,于0度缓慢滴加到反应中,搅拌40min,称取4-乙基苯酚(244mg,2mmol)及氢氧化钠(80mg,2mmol)于冰水浴中加入15ml乙醇及45ml水搅拌溶解。将生成的重氮盐于冰水浴中缓慢滴加到4-乙基苯酚溶液中,搅拌5h,此时有大量沉淀生成,过滤,滤渣用水10ml洗涤三次,抽干得225mg。产率41.7%.。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm12.72(s,1H),7.80(d,2H,J=8.4Hz),7.75(d,1H,J=2.4Hz),7.37(d,2H,J=8.4Hz),7.18(dd,1H,J=2.4Hz,8.4Hz),6.95(d,2H,J=8.4Hz),3.90(t,2H,J=6.4Hz),2.94(t,2H,J=6.4Hz),2.69(q,2H,J=7.6Hz),1.75(s,1H),1.29(t,3H,J=7.6Hz).13CNMR(100MHz,CDCl3):δppm150.8,149.5,142.3,137.2,135.8,133.2,131.8,130.1,122.4,118.0,63.4,39.1,27.9,15.7.
第六步、化合物LYZ011的合成:
将LYZ024(94mg,0.124mmol)碳酸钾(19mg,0.136mmol)置于10ml单口瓶中,并将溶于5mlDMF的LYZ010(101mg,0.372mmol)加入到瓶中,抽真空,氮气保护并于120度下搅拌2.5h,反应冷却后溶于20ml乙酸乙酯中,并用水洗涤,旋除溶剂柱层析分离得93mg。产率88%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.85(d,2H,J=8.4Hz),7.47(d,1H,J=2.0Hz),7.36(d,2H,J=8.4Hz),7.25(dd,1H,J=2.0Hz,8.4Hz),7.03(d,1H,J=8.4Hz),5.05(s,1H),4.34(t,2H,J=4.8Hz),3.95~3.91(m,4H),3.78~3.23(m,40H),2.94(t,2H,J=6.4Hz),2.65(q,2H,J=7.6Hz),1.40(s,9H),1.24(t,3H,J=7.6Hz).
第七步、化合物LYZ026的合成:
称取LYZ025(102mg,0.12mmol)于单口瓶中,并置于冰浴中,加入1mlTFA冰浴下搅拌1h,加入饱和碳酸氢钠淬灭,并用乙酸乙酯萃取,旋除溶剂后硅胶板分离得36mg。产率40%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.63(d,2H,J=8.0Hz),7.46(d,1H,J=2.0Hz),7.40(d,2H,J=8.4Hz),7.29(dd,1H,J=2.0Hz,8.8Hz),6.97(d,1H,J=8.4Hz),4.32~4.30(m,2H),3.92~3.91(m,4H),3.76~3.48(m,40H),2.91(s,2H),2.75(s,2H),2.64(q,2H,J=7.6Hz),1.24(t,3H,J=7.6Hz).
实施例4、基于还原敏感偶氮连接单元的可逆终端的合成
本实施例的可逆终端是基于实施例1的可裂解连接单元-还原敏感偶氮连接单元的合成得到的,其合成示意图如图4所示,具体步骤如下:
第一步、化合物LYZ013的合成:
称取LYZ012(7.6mg,0.019mmol)于单口瓶中,加入TAMRA(10mg,0.019mmol)并加入无水DMF和三乙胺溶解,室温搅拌3h,旋除溶剂,硅胶板分离得13mg。产率84%。产物的1H-NMR谱图、31P NMR谱图、HRMS谱图、HPLC谱图分别如图7、8、9、10所示。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm8.51(d,1H,J=2.0Hz),8.01~7.98(m,1H,),7.76(d,2H,J=8.4Hz),7.38~7.34(m,3H),7.25~7.20(m,2H),7.16(d,2H,J=9.2Hz),7.10(d,1H,J=8.4Hz),6.94~6.88(m,4H),4.30(t,2H,J=4.8Hz)3.96~3.92(m,2H)3.83~3.77(m,4H),3.72~3.68(m,4H),3.62~3.58(m,2H),3.27~3.25(m,12H),2.87(t,2H,J=6.8Hz),2.56(q,2H,J=7.6Hz),1.17(t,3H,J=7.6Hz).
HRMS:calc forC47H50N5O8[M-H]+812.3659,found812.3657.
第二步、化合物LYZ014的合成:
称取LYZ013(13mg,0.016mmol)于单口瓶中,加入2ml无水乙腈,依次加入DSC(24.6mg,0.096mmol)(隔2h分两次加入)、DMAP(3.9mg,0.032mmol)、DIPEA(5.2g,0.04mmol),搅拌6h后硅胶板分离将未反应的除去,将得到的产品溶于0.8ml乙腈中,将dUTP(AP3)(20mg,38.4mmol)溶于1.5mlNa2CO3/NaHCO3缓冲液中并加入到反应中,在加入6uL三乙胺,室温搅拌3h。用分析型HPLC进行分析:柱子:C18,5μm,4.6×250mm;流速:1mL/min;流动相:A,8.6mM TEA,100mM HFIP水溶液和B,CH3OH,梯度洗涤,15%~15%CH3OH(5min),15%~40%CH3OH(5min),40%~70%CH3OH(30min)可见光检测器:546nm。在t=30min时有产物峰生成,分离得2.1mg,即可逆终端。其1H-NMR谱图、31P NMR谱图、HRMS谱图、HPLC谱图分别如图7、8、9、10所示:
1H NMR(400MHz,D2O):δppm8.25(s,1H),7.83(s,1H),7.41(d,2H,J=7.2Hz),7.16(s,2H),6.92~6.66(m,7H),6.55~6.49(m,2H),6.40(s,2H),5.93(s,1H),4.49(s,1H),4.24~3.99(m,8H),3.87~3.68(m,9H),3.10~3.03(m,12H),2.87(s,2H),2.19~2.07(m,3H),1.97~1.92(m,1H),0.65(s,3H)
31P NMR(D20,162MHz):δ-6.76,-10.82,-20.07
HRMS:calc for C60H66N8O23P3[M+3H]+1359.3454,found1359.3459
本实施例中核苷酸dUTP(AP3)的合成示意图如图5、6所示,具体包括如下步骤:
第一步、化合物F2的合成:
向一单口瓶中加入60ml甲醇,冰水浴下搅拌,加入丙炔胺(60mmol,3.3042g),搅拌15分钟后缓慢加入三氟乙酸甲酯(86.7mmol,11.0957g),10分钟后撤去冰水浴,室温下反应24小时。反应用TLC板进行监测,PE:EA=8:1,烤板,Rf=0.5产生新点为产物F2。减压蒸馏(51℃,280Pa),得3.53g,产率39%。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ2.32(t,J=4.0Hz,1H),4.13-4.15(m,2H),6.92(s,1H)。
第二步、化合物F3的合成:
向一单口瓶中加入F1(0.7mmol,247mg),再称取9.7mgCuI和20.3mg Pd(PPh3)4(四(三苯基膦)钯)加入反应瓶中,抽真空,氮气保护,铝箔包裹,加入2.3ml DMF,搅拌溶解,加入0.2ml TEA,称取F2(254mg,1.7mmol)用DMF溶解后加入上述反应瓶中,室温搅拌,反应过夜。TLC板监测,EA为展开剂,Rf=0.35为原料F1,Rf=0.32为产物F3,两点位置非常接近。待反应结束后,减压蒸干溶剂,直接柱层析分离,20:1DCM:MeOH为淋洗剂,得214mg,产率61%。
1H NMR(DMSO-D6,300MHz):δ2.11(t,J=5.1Hz,2H),3.56-3.58(m,2H),3.78(m,1H),4.21(d,J=5.1Hz,3H),5.08(t,J=5.1Hz,1H),5.23(d,J=4.2Hz,1H),6.09(t,J=6.6Hz,1H),8.18(s,1H),10.05(t,J=4.8Hz,1H),11.63(s,1H).
第三步、化合物dUTP(AP3)的合成:
在手套箱中分别称取化合物F360mg(0.16mmol)、三正丁胺焦磷酸盐(E-4)150mg(0.32mmol)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)66mg(0.32mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.5mL无水DMF中,再加入0.6mL新蒸的三正丁胺,搅拌半小时。把2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮溶于0.5mL无水DMF中,激烈搅拌下通过注射器加入上述三正丁胺焦磷酸盐溶液,搅拌半小时。然后将该混合液注入到F3中,搅拌1.5h。加入5mL3%碘(9:1Py/H2O)溶液。15min后加入4mL水,搅拌2h。加入0.5mL3M NaCl溶液,再加入30mL无水乙醇,-20℃冷冻过夜,离心(3200r/min,25℃)20min。倾去上清液,得沉淀,抽干溶剂。再依次加入TEAB溶液和浓氨水,室温搅拌过夜。减压蒸干溶剂,出现白色固体,得dUTP-NH2。用分析型HPLC进行分析,条件:柱子:C18,10μm,4.6×250mm;流速:1mL/min;流动相:20mMTEAAc和CH3CH20H,梯度洗涤,0%-20%CH3CH2OH(35min);紫外检测器:254nm。在t=13.5min时有产物峰生成。
1H NMR(D2O,400MHz):δ2.34-2.48(m,2H),4.03(s,2H),4.20-4.29(m,3H),4.61-4.64(m,1H),6.27(t,J=6.4Hz,1H),8.38(s,1H)。31P NMR(D2O,162MHz):δ-22.22,-11.45,-9.90。
HRMS:calc for C12H19N3O14P3[M+H]+522.0080,found522.0070;calc for C12H18N3O14P3Na[M+Na]+543.9899,found543.9883。
实施例5、对合成的可逆终端的生物学评价
为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA测序,本实施例检测了实施例4的可逆终端两个方面的特性:
1)是否可以被DNA聚合酶所识别,作为DNA聚合酶的底物参与DNA的延伸反应;
2)参与DNA链延伸后能否去掉该可逆终端所携带的荧光基团,以便下一轮的延伸反应。
这两方面是高通量合成测序(sequencing by synthesis)的核心。因此配制DNA延伸反应体系:将可逆终端与DNA模板、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow缓冲液充分混合,30℃静置15分钟,72℃处理10分钟以灭活klenow DNA聚合酶活性,然后针对还原敏感可逆终端检测在Na2S2O4的浓度为30mM条件下可逆终端所携带的荧光基团是否可以断裂。具体如下:
1)按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应:10×Klenowbuffer10uL,BSA(10mg/mL)1uL,DMSO20uL,NaCl(1M)25uL,Klenow(exo-)pol(5U/uL)1.32uL,dUTP(100uM)6uL,模板DNA(962.2ng/uL)1.25uL,ddH2O35.43uL,总体积100uL。
将反应体系置于30℃水浴箱中处理15分钟,再置于72℃水浴中处理10分钟以灭活DNA聚合酶。将反应产物用于后续的可逆终端荧光基团的断裂反应。
2)还原敏感可逆终端荧光基团的断裂反应
在DNA链延伸反应体系(170uL)中加入Na2S2O4溶液,调节Na2S2O4的浓度为30mM,室温下5min后取样30uL,编号①,母液再次加入Na2S2O4,调节Na2S2O4的浓度为30mM,室温下5min后取样30uL,编号②,以此类推,详见下表1,取断裂反应产物进行12%PAGE电泳分析,见下表1:
表1
图11为本发明的可逆终端在DNA测序体系中相同浓度不同次数还原性条件下的断裂效果示意图,其中,a为荧光扫描示意图,b为GR染色示意图;由图11可知:通过分批次加入还原剂Na2S2O4的加料方式,连接在核苷酸上的荧光素已经被完全切掉,也就是说,偶氮连接单元已经完全断裂.同时DNA链却没有受到丝毫损伤。
Lane1:dUTP(L014)插入
Lane2:dUTP(L014)插入,第一次加入Na2S2O4,C=30mM,5min后
Lane3:dUTP(L014)插入,第二次加入Na2S2O4,C=30mM,5min后
Lane4:dUTP(L014)插入,第三次加入Na2S2O4,C=30mM,5min后
Lane5:dUTP(L014)插入,第四次加入Na2S2O4,C=30mM,5min后
Lane6:dUTP(L014)插入,第五次加入Na2S2O4,C=30mM,5min后
Lane7:dUTP(L014)插入,第六次加入Na2S2O4,C=30mM,5min后
Lane8:dUTP(L014)插入,第七次加入Na2S2O4,C=30mM,3min后
Lane9:dUTP(L014)插入,第八次加入Na2S2O4,C=30mM
结论:在还原剂C=30mM,第五次加入后,荧光基团被完全切除,也就是说偶氮连接单元完全断裂。
基于实施例5的实验结果,通过对基于偶氮连接单元的可逆终端的结构分析,可以看出,当m为0~44中任一整数,以及n为0~44中任一整数时,所有的可逆终端均可用于DNA测序并具有非常类似的结果,这是因为:首先m,n的变化并不影响DNA聚合酶对可逆终端的识别;其次更不会影响在还原剂作用下偶氮连接单元的断裂;当然如果m,n的数值很大,比如m=44,n=44时,如此长链会直接影响到下一个可逆终端顺利并入待测的DNA链,所以m为0~10中任一整数,n为0~10中任一整数是一种更优的选择,其效果会更好。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (11)
1.一种还原敏感偶氮连接单元,其结构式如式(Ⅰ)所示:
(Ⅰ),其中m为0~44中任一整数,n为0~44中任一整数。
2.如权利要求1所述的还原敏感偶氮连接单元,其特征在于,所述m为0~10中任一整数,n为0~10中任一整数。
3.如权利要求2所述的还原敏感偶氮连接单元,其特征在于,所述m=1,n为0~10中任一整数。
4.一种如权利要求1所述的还原敏感偶氮连接单元的合成方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步、在DMF存在的条件下,碳酸钾、化合物E和化合物G反应,得到化合物H所述碳酸钾、化合物E和化合物G的摩尔比为(1.0~1.5):(3.0~5.5):1.0;
第二步、在冰浴的条件下,TFA和化合物H反应,得到化合物I所述TFA和化合物H的摩尔比为(3.0~8.0):1.0。
5.如权利要求4所述的还原敏感偶氮连接单元的合成方法,其特征在于,所述化合物E的合成包括如下步骤:
A、在甲苯存在的条件下,摩尔比为(1.0~3.5):1.0的48%HBr与化合物A反应,得到化合物B其中,n为0~44中任一整数;
B、在氨水存在条件下,化合物B和氨水反应,得到化合物C所述氨水与化合物B的摩尔比为(1.0~30):1.0;
C、在水、甲醇和氢氧化钠存在的条件下,BOC酸酐和化合物C反应,得到化合物D所述BOC酸酐和化合物C的摩尔比为(1.0~3.5):1.0;
D、在三乙胺、DMAP存在的条件下,化合物TsCl和化合物D反应,得到化合物E所述三乙胺、DMAP、TsCl和化合物D的摩尔比为(1.0~5.0):(0.1~0.5):(1.0~4.0):1.0。
6.如权利要求4所述的还原敏感偶氮连接单元的合成方法,其特征在于,所述化合物G的合成包括如下步骤:
在水、甲醇存在的条件下,亚硝酸钠、4-氨基苯乙醇和化合物F反应,得到化合物G所述亚硝酸钠、4-氨基苯乙醇和化合物F的摩尔比为(1.0~4.5):1.0;(1.0~1.5);其中,m为0~44中任一整数。
7.一种如权利要求1所述的还原敏感偶氮连接单元在DNA测序中的用途,其特征在于,所述还原敏感偶氮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端,所述可逆终端用于DNA合成测序。
8.一种可逆终端,其特征在于,所述可逆终端由如权利要求1所述的还原敏感偶氮连接单元与核苷酸及荧光素连接而得。
9.如权利要求8所述的可逆终端,其特征在于,所述连接具体包括如下步骤:
A、以无水DMF为溶剂,在TEA存在的条件下,所述还原敏感偶氮连接单元与TAMRA(5/6)反应,得化合物J所述TAMRA(5/6)、还原敏感偶氮连接单元和TEA的摩尔比为1:(1~3):(3~10);
B、在DMAP、DIPEA存在的条件下,化合物J和DSC反应,得到中间体K该中间体K与dUTP(AP3)反应,得到化合物L所述化合物J、DSC、DMAP、DIPEA和dUTP(AP3)的摩尔比为1:(5~12):(2~3):(2~4):(2~8)。
10.如权利要求9所述的可逆终端,其特征在于,所述dUTP(AP3)是通过包含如下步骤的方法合成的:
A、化合物F2的合成:在冰水浴搅拌条件下,摩尔比为1.0:(1.2~2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应,得化合物F2
B、化合物F3的合成:在CuI、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下,化合物F2和F1 反应,得化合物F3 所述化合物F1、化合物F2、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1:(2~3):0.072:0.025:(1.5~2);
C、化合物dUTP(AP3)的合成:化合物F3与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮在三乙胺和碘存在下反应,反应产物去保护,得化合物dUTP(AP3);所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮和化合物F3的摩尔比为2:2:1。
11.一种如权利要求8所述的可逆终端在DNA测序中的用途。
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