CN104725453A - 基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途 - Google Patents
基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104725453A CN104725453A CN201510031230.9A CN201510031230A CN104725453A CN 104725453 A CN104725453 A CN 104725453A CN 201510031230 A CN201510031230 A CN 201510031230A CN 104725453 A CN104725453 A CN 104725453A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- azo
- connector element
- formula
- reaction
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 0 C*c(c(*)c1*)c(*C)c(C=C*)c1O*(C)CCO Chemical compound C*c(c(*)c1*)c(*C)c(C=C*)c1O*(C)CCO 0.000 description 2
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C247/00—Compounds containing azido groups
- C07C247/02—Compounds containing azido groups with azido groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
- C07C247/08—Compounds containing azido groups with azido groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being unsaturated
- C07C247/10—Compounds containing azido groups with azido groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being unsaturated and containing rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途,其结构式如式VI所示:其中,荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种;R1、R2、R3、R4、R6为各种取代基,R5为除-C2H5以外的取代基、且R1、R2、R3、R4、R5、R6不同时为H;n为0~10的整数。与现有技术相比,本发明合成了一类新的基于偶氮连接单元的可逆终端;该类可逆终端在温和的条件下可以实现高效率的剪切,可用于DNA测序;同时,其合成所需原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,可用于大规模推广使用。
Description
技术领域
本发明属于DNA测序技术领域,具体涉及一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途。
背景技术
DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后,DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。
合成法测序(Sequencing By Synthesis,SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定,并在固定的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物,分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸,实现高通量并行的DNA序列信息的检测。
在合成法测序中,首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料,即“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3ˊ-羟基阻断外,为了不影响下一个标记核苷酸的并入和识别,还要求通过一个可剪切的连接单元把核苷酸和荧光素连接起来。然后,在下一个标记核苷酸并入之前,在温和条件下使该连接单元断裂,实现DNA链的延伸,从而读出DNA碱基序列。该连接单元的性能对DNA测序的读长和效率有至关重要的影响。因此,人们一直致力于发展新的可剪切连接单元,以提高DNA测序的效率。目前已有文献报道的连接单元有还原敏感型(二硫键和偶氮化合物);光敏感(邻硝基苄基醇,苯甲酰甲基酯衍生物及其它连接单元);亲电子试剂/酸敏感型;金属剪切型以及氧化剂敏感等。
而现有的可剪切连接单元存在剪切条件不够温和、效率不高,用于测序时读长太短等诸多缺点。因此,设计、合成新的可剪切连接单元,并探索合适的剪切条件对提高测序效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。偶氮化合物在偶氮还原酶或者连二亚硫酸钠等还原剂作用下可以实现快速、完全剪切,相比酸敏感连接单元,还原剂对DNA 链没有任何损伤,在具体的实验过程中,只需要通过调节还原剂的用量即可很方便地调节剪切速度。目前关于偶氮化合物作为连接单元应用于DNA测序的报道很少,所以设计、合成基于偶氮连接单元的可逆终端并用于DNA测序具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供基于偶氮连接单元可逆终端的合成及其在DNA测序中的用途。本发明设计合成的一类新的基于偶氮连接单元的可逆终端,该类化合物合成原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,易于实现大量合成;该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能,发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解,具有应用于DNA测序的巨大潜力。所以,基于偶氮结构的可逆终端在DNA测序体系中能够提高测序效率。
本发明是通过以下技术方案实现的:
第一方面,本发明提供了一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸,其结构式如式VI所示:
其中,荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种;R1、R2、R3、R4、R6为各种取代基,R5为除-C2H5以外的取代基、且R1、R2、R3、R4、R5、R6不同时为H;n为0~10的整数。
作为优选方案,所述R1为-H,R2为-H、-COOH或-COOMe,R3为-H,R4为-OH,R5为-H,R6为-H或-OH。
作为优选方案,其结构如式VII、式VIII或式IX所示:
第二方面,本发明提供了一种如所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸的制备方法,其包括如下步骤:
将偶氮连接单元中的氨基与荧光素的羧基在缩合剂作用下发生缩合反应形成酰胺化合物荧光素-所述荧光素-I中的叠氮基与 dUTP-P中的炔基发生点击反应,即得所述基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸。
第三方面,本发明还一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸中的偶氮连接单元,其结构式如式I所示:
其中,R1、R2、R3、R4、R6为各种吸电子或供电子的烷基或芳基取代基,R5为除-C2H5以外的取代基、且R1、R2、R3、R4、R5、R6不同时为-H;n为0~10的整数。
作为优选方案,
当所述R1、R2、R3、R5均为-H,R4和R6均为-OH时,结构如式(II)所示:
式II的偶氮连接单元当连二亚硫酸钠溶液为1mM时,t1/2=3354s。
当所述R1、R2、R3、R5、R6均为-H,R4为-OH,结构如式(III)所示:
式III所述偶氮连接单元当连二亚硫酸钠为1mM时,t1/2=4s;
当所述R1、R3、R5、R6均为-H,R2为-COOH,R4为-OH,结构如式(IV)所示:
式IV所示的偶氮连接单元当连二亚硫酸钠为1mM时,t1/2<1s;
当所述R1、R3、R5、R6均为-H,R2为-COOMe,R4为-OH,结构如式(V)所示:
式V所示的偶氮连接单元当连二亚硫酸钠为6mM时,t1/2<1s;当连二亚硫酸钠为1mM时,t1/2=13s。
第四方面,本发明也提供了一种制备式I所示偶氮连接单元的方法,所述制备方法包括如下步骤:
将化合物A在浓盐酸和亚硝酸钠的作用下进行重氮化反应后,与化合物B在氢氧化钠、乙醇和水的混合溶液反应得到化合物C将化合物C在三氟乙酸中脱保护基,得到目标产物I
优选地,化合物A的制备方法为:
用氯甲酸苄基碳酸酯对二取代4-碘苯胺中的氨基进行保护后,与对甲苯磺酸丙炔酯进行Sonogashira偶联反应,得到化合物A1将化合物A1在Pd/C的催化下加氢得到化合物A2最后将化合物A2与叠氮化钠进行亲核取代反应后,得产物A
例如:用氯甲酸苄基碳酸酯对4-碘苯胺中的氨基进行保护后,与对甲苯磺酸丙炔酯进行Sonogashira偶联反应,得到化合物A11将化合物A11在 Pd/C的催化下加氢得到化合物A21最后将化合物A21与叠氮化钠进行亲核取代反应后得产物A31或将2-氨基-5-碘苯甲酸通过氯甲酸苄基碳酸酯和硫酸二甲酯分别保护氨基和羧基后得中间体化合物A41其与对甲苯磺酸丙炔酯进行sonogashira偶联反应,得化合物A5在Pd/C催化作用下加氢反应得产物A61 再与叠氮化钠进行亲核取代反应后脱保护基,得产物 A71
所述化合物B的制备方法为:在氮气保护下,将四取代苯酚与化合物B1在碳酸钾的DMF溶液中,于120℃下进行反应,得到目标产物B,其中,所述的四取代苯酚也包括间三苯酚和间二苯酚;
如在氮气保护下,使间苯三酚和间苯二酚分别与化合B在碳酸钾的DMF溶液中,于120℃下进行反应,分别得到化合物
B11和B12
化合物B1的制备方法为:将聚乙二醇在48wt%的氢溴酸溶液中进行回流反应得到的单溴代中间产物在氨水中进行水解,将水解产物用叔丁氧羰基Boc和对甲基苯磺酰基Ts进行-NH2和-OH的保护,得到化合物B1
第五方面,本发明提供了一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸在DNA测序中的用途。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
本发明合成了一类新的偶氮连接单元,并通过改变苯环上不同取代基及其位置,极大地改变了对还原剂的敏感性,有些改变看起来只是很小的一点改变,却极大地影响了其断裂速度,而断裂速度对DNA测序是至关重要的因素。该类偶氮苯连接单元中取代 基的改变对断裂速度的影响之大,所产生的意想不到的效果,是本领域的人无法预测的。
并在此基础上合成了基于该类连接单元的可逆终端,而且应用Click点击反应将核苷酸与偶氮连接单元连接起来,极大地提高了反应效率,有效减少了副反应的生成,更为后续的分离纯化带来极大方便,这一点在核苷酸衍生物以及测序试剂的合成中是很重要的。
该类基于偶氮连接单元的可逆终端可用于DNA测序,并且该类可逆终端在DNA聚合酶的作用下接上DNA引物的效率为100%,而且在还原剂/弱酸性条件下,断裂的效率也为100%。
该类可逆终端相比二硫键可逆终端在剪切之后不需要保护,因为剪切产物为氨基化合物,而二硫键可逆终端剪切之后为巯基化合物,巯基不稳定,必须立刻加以保护,否则会发生不必要的副反应。
该类可逆终端相比酸敏感可逆终端对结构的依赖性大大降低,对于酸敏感可逆终端而言,要想提高剪切速度,只能从可逆终端结构的变化来调整,而偶氮可逆终端,除了结构的变化之外,更可以方便地从还原剂的加入量来调节,而还原剂对DNA链是没有影响的,但是酸性太强会损失DNA链。所以偶氮苯可逆终端的使用对于测序效率的提高以及读长的改善等都有了更大的改善、调节空间,更好的调控性、可行性。这些都是以前的所有文献不曾报道过的。
最后,其合成所需原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,可用于大规模推广使用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为本发明的偶氮连接单元(I)的结构式;
图2为实施例1中间体B1的合成示意图;
图3为实施例2中间体A31,A71的合成示意图;
图4为实施例3中间体B11,B12的合成示意图;
图5为实施例4的偶氮连接单元(II)的合成示意图;
图6为实施例5的偶氮连接单元(III)的合成示意图;
图7为实施例6的偶氮连接单元(V)和(IV)的合成示意图;
图8为实施例7中间体dUTP-P的合成示意图;
图9为基于偶氮连接单元(I)的可逆终端(VI)的结构示意图;
图10为实施例8的基于偶氮连接单元(IV)的可逆终端(VII)的合成示意图;
图11为实施例9的基于偶氮连接单元(V)的可逆终端(VIII)的合成示意图;
图12为实施例10的基于偶氮连接单元(III)的可逆终端(IX)的合成示意图;
图13为实施例11中与连二硫酸钠浓度关联的可逆终端在DNA测序中的实验结果图,其中,a为DNA链延伸反应PAGE电泳图;b为断裂反应荧光扫描结果图,图中,M:DNA marker 20bp;Lane 1:对照模板;Lane 2:DNA链延伸反应阳性对照;Lane 3:含可逆终端的链延伸产物10uM连二亚硫酸钠室温作用2h的断裂;Lane 4:含可逆终端的链延伸产物8mM连二亚硫酸钠室温作用2h的断裂;Lane5-9:含可逆终端的链延伸产物10mM连二亚硫酸钠室温作用10min、20min、30min、1h和2h的断裂;
图14为实施例11中与反应时间相关联的可逆终端在DNA测序中的实验结果图,其中,a为DNA链延伸反应PAGE电泳图;b为断裂反应荧光扫描结果图,图中:M:DNA marker 20bp;Lane 1-5:含有偶氮键可逆终端链延伸产物10mM连二亚硫酸钠分别处理15min、10min、8min、5min和3min的断裂;Lane 6:DNA链延伸反应阳性对照;Lane7:对照模板;
图15为实施例11中同时与反应时间和连二硫酸钠浓度相关联的可逆终端在DNA测序中的实验结果图,其中,a为DNA链延伸反应PAGE电泳图;b为断裂反应荧光扫描结果图,图中,M:DNA marker 20bp;Lane 1-2:含有偶氮键可逆终端链延伸产物30mM连二亚硫酸钠分别处理5min和3min的断裂;Lane 3:DNA链延伸反应阳性对照;Lane 4:对照模板;Lane 5-7:含有偶氮键可逆终端链延伸产物20mM连二亚硫酸钠分别处理3min、5min和8min的断裂;
图16为实施例11中的DNA链延伸反应荧光扫描结果图,图中,Lane 1为Primer(Oligo 1);Lane 2为含有dUTP(AP3)-azo-TAMRA的链延伸产物;
图17为实施例12中的可逆终端的分子结构图;
图18为实施例12中的DNA链延伸反应结果毛细管电泳图;
图19为实施例12中的DNA链断裂反应荧光结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技 术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。
本发明所得中间产物及最终产物采用NMR等进行表征。
实施例1、中间体化合物B1的合成
本实施例中间体化合物B1的合成示意图如图2所示,具体步骤如下:
(1)化合物15的合成:将聚乙二醇(9g,60mmol)溶于70mL甲苯中,然后加入10.2mL 48%HBr水溶液,加热回流,用碳酸氢钠吸收放出来的气体,控制反应温度为115℃,搅拌反应3天。反应液冷却后加入饱和碳酸氢钠水溶液,使其呈中性,然后旋除溶剂,再加入30mL水,并用CH2Cl2萃取(3*60mL)。合并有机相,无水硫酸钠干燥,旋除有机溶剂后得5.2g化合物15,产率41%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 3.68(t,2H,J=6.0Hz),3.58(t,2H,J=4.6Hz),3.51-3.55(m,4H),3.44(t,2H,J=4.6Hz),3.35(t,2H,J=6.3Hz)。
(2)化合物16的合成:将化合物15(3.7g,17.36mmol)溶于30mL氨水中,在70℃下搅拌24h。反应结束后旋除溶剂,然后加入15mL水,用二氯甲烷洗涤(3*20mL),无水硫酸钠干燥后,将有机溶剂旋除后得2.4g化合物16,产率93%。1H NMR(400MHz,D2O):δppm 3.82-3.71(m,8H),3.66-3.62(m,2H),3.21(t,2H,J=4.8Hz)。
(3)化合物17的合成:将化合物16(2.6g,17.4mmol)溶于10mL甲醇和5mL水的混合液中,将0.695g氢氧化钠溶于10mL水后加入到上述溶液中,然后往其中加入(Boc)2O(4.167g,19.1mmol)的甲醇(5mL)溶液,搅拌过夜。反应结束后,旋除溶剂,再加入15mL水,并用二氯甲烷萃取(3*20mL),无水硫酸钠干燥后,将有机溶剂旋除,残余物以1:1EtOAc/CH2Cl2为淋洗剂进行柱层析,得2.15g化合物17,产率50%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 3.74(t,2H,J=4.4Hz),3.65-3.59(m,6H),3.55(t,2H,J=5.2Hz),3.32-3.30(m,2H),1.43(s,9H)。
(4)化合物B1的合成:将化合物17(2.15g,8.63mmol)溶于25mL二氯甲烷中,依次加入三乙胺(1.08g,10.7mmol)、DMAP(0.105g,0.86mmol)、TsCl(2.056g,10.8mmol),在室温下搅拌过夜。反应结束后,加入10mL 1%HCl水溶液,用二氯甲烷萃取(3*20mL),无水硫酸钠干燥后,旋除有机溶剂,残余物以2:1重量比的PE/EtOAc为淋洗剂进行柱层析,得2.7g化合物B1,产率78%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.77(d,2H,J=8.0Hz),7.32(d,2H,J=8.0Hz),4.96(s,1H),4.14(t,2H,J= 4.8Hz),3.66(t,2H,J=4.8Hz),3.54-3.45(m,6H),3.27-3.24(m,2H),2.42(s,3H),1.41(s,9H)。
实施例2、中间体化合物A31,A71的合成
本实施例中间体化合物A31,A71的合成示意图如图3所示,具体步骤如下:
(1)化合物2的合成:4-碘苯胺(4.38g,20mmol)溶于30ml乙酸乙酯中,加入2ml三乙胺,冰水浴下滴加入氯甲酸苄酯(3.4g,20mmol),搅拌至室温反应4h,反应液水相,有机相无水硫酸钠干燥,旋蒸干溶剂得产品化合物27.27g,产率97%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.89–7.71(m,4H),7.40–7.24(m,5H),7.10(s,1H),4.65(s,2H);
(2)化合物A11的合成:向一单口瓶中加入化合物2(0.7mmol,247mg),再称取9.7mg CuI和20.3mg Pd(PPh3)4加入反应瓶中,抽真空,氮气保护,铝箔包裹,加入2.3ml DMF,搅拌溶解,加入0.2ml TEA,称取对甲苯磺酸丙炔酯(357mg,1.7mmol)用2.7ml DMF溶解后加入上述反应瓶中,室温搅拌,反应过夜,待反应结束后,减压蒸干溶剂,直接柱层析分离得249mg,产率82%.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.78–7.68(m,2H),7.64–7.51(m,4H),7.47–7.39(m,2H),7.34–7.28(m,5H),7.10(s,1H),4.62(d,J=16.1Hz,4H),2.42(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ154.95,141.19,137.56,136.76,135.47,130.43,129.68,129.01,128.39,128.19,128.16,83.98,83.11,66.81,51.28,21.15;HRMS:calc for C24H22NO5S[M+H]+436.1140,found 436.1179.
(3)化合物A21的合成:将化合物A11(87mg,0.2mmol)溶于3mL甲醇中,再加入14mg Pd/C(10%),抽真空换气,然后充入氢气于25℃下搅拌过夜。反应混合液过滤,滤液旋干溶剂后得50mg化合物A21,产率82%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.90–7.64(m,2H),7.60–7.32(m,2H),7.01–6.71(m,2H),6.48–6.18(m,2H),4.02(t,J=14.4Hz,2H),3.45(s,2H),2.65(t,J=12.2Hz,2H),2.43(s,3H),1.82(tt,J=14.4,12.1Hz,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ146.25,141.19,136.76,131.27,129.68,129.34,128.39,116.32,66.69,34.34,29.65,21.15;HRMS:calc for C16H19NO3S[M+H]+306.1086,found 306.1166.
(4)化合物A31的合成:称取化合物A21(180mg,0.59mmol)于单口瓶中,加入2.5mL DMF,搅拌溶解后再加入NaN3(84.1mg,1.29mmol),于80℃下搅拌过夜,然后冷却至室温,加入10mL水并用乙酸乙酯萃取(15mL*4),合并有机相后再用饱和食盐水洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥后,旋除有机溶剂,柱层析得75mg化合物A31,产率74%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.87(d,J=15.0Hz,1H),6.35(d,J=15.0Hz,1H),3.44(s,1H),2.51(t,J=12.1Hz,1H),1.45(t,J=12.1Hz,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3) δ146.25,131.27,129.34,116.32,51.99,32.86,29.16;HRMS:calc for C9H13N4[M+H]+177.1602,found 177.1633.
(5)化合物5的合成:2-氨基-5-碘苯甲酸(5.26,20mmol)溶于30ml乙酸乙酯中,加入2ml三乙胺,冰水浴下滴加入氯甲酸苄酯(3.4g,20mmol),搅拌至室温反应4h,反应液水相,有机相无水硫酸钠干燥,旋蒸干溶剂得产品7.68g,产率96%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.79(d,J=2.9Hz,1H),7.98(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),7.63(d,J=15.0Hz,1H),7.43–7.25(m,5H),4.65(s,2H).
(6)化合物A41的合成:化合物5(3.97g,10mmol)溶于30ml甲醇中,冰水浴下加入3ml浓硫酸,90℃搅拌回流反应过夜,反应液中加入适量2M的氢氧化钠溶液至中性,旋蒸干溶剂,加入乙酸乙酯溶解水洗萃取三次,有机相无水硫酸钠干燥,旋蒸干溶剂得粗产品4.08g,硅胶柱层析得产品1.68g,产率42%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.57(d,J=2.9Hz,1H),7.83(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),7.51(d,J=15.0Hz,1H),7.41–7.21(m,5H),4.64(s,2H),3.94(s,3H).
(7)化合物A51的合成:向一单口瓶中加入A41(0.7mmol,287mg),再称取9.7mg CuI和20.3mg Pd(PPh3)4加入反应瓶中,抽真空,氮气保护,铝箔包裹,加入2.3ml DMF,搅拌溶解,加入0.2ml TEA,称取对甲苯磺酸丙炔酯(357mg,1.7mmol)用2.7ml DMF溶解后加入上述反应瓶中,室温搅拌,反应过夜,待反应结束后,减压蒸干溶剂,直接柱层析分离得284mg,产率83%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.70–8.37(m,1H),8.29(s,1H),7.91–7.69(m,4H),7.55–7.42(m,2H),7.41–7.24(m,5H),4.63(d,J=16.5Hz,4H),3.95(s,3H),2.43(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ168.19,154.96,141.19,140.09,137.56,136.76,135.78,133.00,129.68,129.01,128.39,128.18,124.02,121.68,115.75,81.68,78.54,66.81,52.13,51.28,21.15;HRMS:calc for C26H23NO7S[M+H]+494.1159,found 493.1205。
(8)化合物A61的合成:将化合物A51(98mg,0.2mmol)溶于3mL甲醇中,再加入5mg Pd/C(10%),抽真空换气,然后充入氢气于25℃下搅拌过夜。反应混合液过滤,滤液旋干溶剂后得68mg化合物A61,产率94%。1H NMR(500MHz,Chloroform)δ7.73(ddd,J=34.4,18.4,3.3Hz,3H),7.53–7.34(m,2H),7.08(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),6.81(d,J=15.0Hz,1H),5.39(s,2H),4.02(t,J=9.7Hz,2H),3.95(s,3H),2.65(t,J=11.1Hz,2H),2.43(s,3H),1.97–1.71(m,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ168.52,150.73,141.19,136.76,135.51,130.99,130.19,129.68,128.39,116.07,113.60,66.69,52.13,34.78,29.65,21.15;HRMS:calc for C18H22NO5S[M+H]+364.1140,found 364.1166。
(9)化合物A71的合成:称取化合物A61(217mg,0.6mmol)于单口瓶中,加入 2.5mL DMF,搅拌溶解后再加入NaN3(84.1mg,1.29mmol),于80℃下搅拌过夜,然后冷却至室温,加入10mL水并用乙酸乙酯萃取(15mL*4),合并有机相后再用饱和食盐水洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥后,旋除有机溶剂,残余物以2:1重量比的PE/EtOAc为淋洗剂进行柱层析,得100mg化合物A71,产率71%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.67(d,J=3.1Hz,1H),7.08(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),6.81(d,J=15.0Hz,1H),5.46(s,2H),3.95(s,3H),2.51(t,J=15.8Hz,2H),1.45(t,J=15.8Hz,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ168.52,150.73,135.51,130.99,130.19,116.07,113.60,52.06,33.07,29.16;HRMS:calc for C11H15N4O2[M+H]+235.1117,found 235.1157。
实施例3、中间体化合物B11和B12的合成
本实施例中间体化合物B11,B12的合成示意图如图4所示,具体步骤如下:
(1)化合物B11的合成:将化合物间苯三酚(47mg,0.372mmol),碳酸钾(19mg,0.136mmol)溶于3mL DMF置于10mL单口瓶中,将化合物B1(50mg,0.124mmol)溶解于3ml DMF并加入到反应瓶中,氮气保护在120℃下搅拌2.5h。冷却至室温后,加入20mL乙酸乙酯,然后用水洗涤,无水硫酸钠干燥后,旋除有机溶剂,残余物经柱层析分离得27mg化合物B11,产率59%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.00–5.87(m,3H),4.72(brs,2H),4.59(s,1H),4.30(s,1H),3.76(s,1H),3.66(t,J=8.1Hz,2H),3.51(s,4H),3.04(t,J=8.1Hz,2H),1.42(s,9H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ162.52,160.08,158.57,95.67,95.49,80.89,72.20,70.17,69.96,67.73,40.06,28.33;HRMS:calc for C17H28NO7[M+H]+358.1788,found 358.1793.
(2)化合物B12的合成:将化合物间苯二酚(40mg,0.372mmol),碳酸钾(19mg,0.136mmol)溶于3mL DMF置于10mL单口瓶中,将化合物B1(50mg,0.124mmol)溶解于3ml DMF并加入到反应瓶中,氮气保护在120℃下搅拌2.5h。冷却至室温后,加入20mL乙酸乙酯,然后用水洗涤,无水硫酸钠干燥后,旋除有机溶剂,残余物经柱层析分离得30mg化合物B12,产率71%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.00–5.86(m,3H),4.71(brs,H),4.58(s,1H),4.30(s,1H),3.79(s,1H),3.67(t,J=8.1Hz,2H),3.55(s,4H),3.05(t,J=8.1Hz,2H),1.45(s,9H)。
实施例4、偶氮连接单元(II)的合成
本实施例偶氮连接单元的合成示意图如图5所示,具体步骤如下:
(1)化合物1c的合成:称取A31(352mg,2mmol)溶于5mL水中,于冰浴下缓慢加入0.5mL浓盐酸。称取亚硝酸钠(145mg,2.1mmol)溶于10mL水中,于0℃缓慢滴加到上述反应液中,搅拌40min。称取B11(714mg,2mmol)及氢氧化钠(80 mg,2mmol),于冰水浴中加入15mL乙醇及45mL水搅拌溶解。将生成的重氮盐于冰水浴中缓慢滴加到B11的氢氧化钠水溶液中,搅拌5h,有大量沉淀生成。过滤,固体用水10mL洗涤三次,抽干得520mg化合物1c,产率52%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.66–8.36(m,2H),7.53–7.30(m,2H),6.16(dd,J=15.2,2.9Hz,2H),5.70(s,1H),4.76(d,J=5.5Hz,2H),4.31(dd,J=21.3,7.3Hz,2H),3.77(t,J=14.1Hz,2H),3.67(t,J=9.4Hz,2H),3.52(s,4H),3.04(t,J=9.4Hz,2H),2.63(t,J=11.2Hz,2H),1.42(s,9H),1.35(t,J=11.2Hz,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.98,164.37,163.05,158.57,150.36,144.83,131.03,126.45,125.31,99.18,93.11,80.89,72.20,70.17,69.96,68.31,51.99,40.06,32.86,29.16,28.33;HRMS:calc for C26H37N6O7[M+H]+545.2645,found 545.2688。
(2)化合物Ⅱ的合成:称取化合物1c(60mg,0.12mmol)于单口瓶中,在冰浴下加入1mL三氟乙酸,继续在冰浴下搅拌1h,然后加入饱和碳酸氢钠淬灭反应,用乙酸乙酯萃取,无水硫酸钠干燥后,旋除溶剂,残余物使用硅胶板分离,得24mg化合物Ⅱ,产率50%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.54–8.29(m,2H),7.52–7.23(m,2H),6.11(dd,J=15.1,3.0Hz,2H),5.87(s,1H),4.78(s,1H),4.27(t,J=6.6Hz,2H),3.74(t,J=6.6Hz,
2H),3.64(t,J=14.3Hz,2H),3.49(s,4H),3.04(t,J=14.3Hz,2H),2.61(t,J=11.4Hz,2H),1.46(t,J=11.4Hz,2H),1.08(s,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.98,164.37,163.05,150.36,144.83,131.03,126.45,125.31,99.18,93.11,73.59,70.17,69.96,68.31,51.99,41.52,32.86,29.16;HRMS:calc for C21H30N6O5[M+H]+445.2121,found 445.2109。
实施例5、偶氮连接单元(III)的合成
本实施例偶氮连接单元的合成示意图如图6所示,具体步骤如下:
(1)2c的合成:称取A31(352mg,2mmol)溶于5mL水中,于冰浴下缓慢加入0.5mL浓盐酸。称取亚硝酸钠(145mg,2.1mmol)溶于10mL水中,于0℃缓慢滴加到上述反应液中,搅拌40min。称取B12(682mg,2mmol)及氢氧化钠(80mg,2mmol),于冰水浴中加入15mL乙醇及45mL水搅拌溶解。将生成的重氮盐于冰水浴中缓慢滴加到B12的氢氧化钠水溶液中,搅拌4h,有大量沉淀生成。过滤,固体用水20mL洗涤三次,抽干得610mg化合物2c,产率63%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.62–8.35(m,2H),7.74(d,J=14.9Hz,1H),7.55–7.38(m,2H),6.70(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),6.62(d,J=3.1Hz,1H),4.38(s,1H),4.31(t,J=13.6Hz,2H),3.77(t,J=13.6Hz,2H),3.67(t,J=8.6Hz,2H),3.52(s,4H),3.04(t,J=8.6Hz,2H),2.63(t,J=15.8Hz,2H),1.48(t,J=15.8Hz,2H),1.42(s,9H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ163.60,161.45,158.57,150.36,144.83,131.14,130.92,126.45,125.36,110.41,101.03,80.89,72.20,70.17,69.96,68.31, 51.99,40.06,32.86,29.16,28.33;HRMS:calc for C26H36N6O6Na[M+Na]+551.2696,found 551.2702.
(2)III的合成:称取化合物2c(58mg,0.12mmol)于单口瓶中,在冰浴下加入1mL三氟乙酸,继续在冰浴下搅拌1h,然后加入饱和碳酸氢钠淬灭反应,用乙酸乙酯萃取,无水硫酸钠干燥后,旋除溶剂,残余物使用硅胶板分离,得29mg化合物III,产率65%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.56–8.46(m,2H),7.74(d,J=14.8Hz,1H),7.58–7.36(m,2H),6.70(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),6.62(d,J=3.1Hz,1H),4.78(s,1H),4.32(dd,J=21.4,7.4Hz,2H),3.77(t,J=14.2Hz,2H),3.67(t,J=10.4Hz,2H),3.52(s,4H),3.07(t,J=10.4Hz,2H),2.63(t,J=12.7Hz,2H),1.54(t,J=12.7Hz,2H),1.46(s,2H). 13C NMR(125MHz,CDCl3)δ163.60,161.45,150.36,144.83,131.14,130.92,126.45,125.36,110.41,101.03,73.59,70.17,69.96,68.31,51.99,41.52,32.86,29.16;HRMS:calc for C21H28N6O4K[M+K]+467.2172,found 467.2163。
实施例6、偶氮连接单元(V)和(IV)的合成
本实施例偶氮连接单元的合成示意图如图7所示,具体步骤如下:
(1)3c的合成:称取A71(468mg,2mmol)溶于10mL水中,于冰浴下缓慢加入0.5mL浓盐酸。称取亚硝酸钠(145mg,2.1mmol)溶于10mL水中,于0℃缓慢滴加到上述反应液中,搅拌40min。称取B12(682mg,2mmol)及氢氧化钠(80mg,2mmol),于冰水浴中加入15mL乙醇及45mL水搅拌溶解。将生成的重氮盐于冰水浴中缓慢滴加到B12的氢氧化钠水溶液中,搅拌4h,有大量沉淀生成。过滤,固体用水20mL洗涤三次,抽干得726mg化合物3c,产率67%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.04(dd,J=24.6,8.9Hz,2H),7.77–7.62(m,2H),6.69(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),6.61(d,J=2.9Hz,1H),4.85(s,1H),4.35–4.26(m,3H),3.91(s,3H),3.77(t,J=13.5Hz,2H),3.67(t,J=14.6Hz,2H),3.52(s,4H),3.04(t,J=14.6Hz,2H),2.63(t,J=15.8Hz,2H),1.72(t,J=15.8Hz,2H),1.42(s,9H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ166.84,163.60,161.45,158.57,151.55,142.30,136.20,131.03,127.61,125.36,123.93,120.67,110.41,101.03,80.89,72.20,70.17,69.96,68.31,52.06,40.06,33.07,29.16,28.33.HRMS:calc for C28H39N6O8[M+H]+587.2751,found 587.2801。
(2)V的合成:称取化合物3c(65mg,0.12mmol)于单口瓶中,在冰浴下加入1mL三氟乙酸,继续在冰浴下搅拌2h,然后加入饱和碳酸氢钠淬灭反应,用乙酸乙酯萃取,无水硫酸钠干燥后,旋除溶剂,残余物使用硅胶板分离,得20mg化合物V,产率36%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.04(dd,J=24.6,9.1Hz,2H),7.77–7.59(m,2H),6.69(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),6.61(d,J=2.9Hz,1H),4.84(s,1H),4.31(t,J=7.1Hz,2H),3.91 (s,3H),3.77(t,J=7.1Hz,2H),3.67(t,J=9.0Hz,2H),3.52(s,4H),3.07(t,J=9.0Hz,2H),2.72(s,2H),2.63(t,J=11.6Hz,2H),1.58(t,J=11.6Hz,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ166.84,163.60,161.45,151.55,142.30,136.20,131.03,127.61,125.36,123.93,120.67,110.41,101.03,73.59,70.17,69.96,68.31,52.06,41.52,33.07,29.16;HRMS:calc for C28H39N6O8Na[M+Na]+509.2227,found 509.2230。
(3)IV的合成:称取化合物V(44mg,0.10mmol)于单口瓶中,加入3ml二甲基亚砜溶剂,加热至110℃,加入0.4ml 4M的氢氧化钠溶液搅拌反应30min,冷却至室温加入10ml水溶液,用乙酸乙酯萃取,无水硫酸钠干燥后,旋除溶剂得39mg化合物IV,产率93%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.21(d,J=2.9Hz,1H),8.10(d,J=14.8Hz,1H),7.81–7.68(m,2H),6.68(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),6.60(d,J=3.0Hz,1H),4.81(s,1H),4.30(t,J=6.8Hz,2H),3.76(t,J=6.8Hz,2H),3.66(t,J=14.1Hz,2H),3.51(s,4H),3.06(t,J=14.2Hz,2H),2.62(t,J=15.8Hz,2H),1.50(t,J=15.8Hz,2H),0.98(s,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ168.62,163.60,161.45,147.95,142.82,134.18,131.03,129.80,125.36,122.12,117.35,110.41,101.03,73.59,70.17,69.96,68.31,51.99,41.52,33.07,29.16;HRMS:calc for C28H39N6O8Na[M+Na]+495.2070,found 495.2088。
实施例7、中间体化合物dUTP-P的合成
本实施例中中间体化合物dUTP-P的合成示意图如图8所示,具体步骤如下:
(1)dU-P的合成:向一单口瓶中加入dU-I(0.7mmol,247mg),再称取9.7mg CuI和20.3mg Pd(PPh3)4加入反应瓶中,抽真空,氮气保护,铝箔包裹,加入2.3mL DMF,搅拌溶解,加入0.2mL TEA,称取1,6-庚二炔(156mg,1.7mmol)用DMF溶解后加入上述反应瓶中,室温搅拌,反应过夜,待反应结束后,减压蒸干溶剂,直接柱层析分离得151mg,产率68%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.38(s,1H),9.11(s,1H),7.57(t,J=14.7Hz,1H),4.40(td,J=14.4,2.0Hz,1H),4.18(td,J=5.7,2.0Hz,1H),3.84(dd,J=24.8,14.4Hz,1H),3.59(dd,J=24.8,14.4Hz,1H),2.52(ddd,J=24.9,14.8,5.6Hz,1H),2.27–2.12(m,4H),2.01–1.90(m,2H),1.86–1.73(m,2H),1.59(s,1H),1.41(s,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ161.60,152.24,149.71,102.46,97.88,87.13,86.57,84.40,71.74,70.73,68.24,62.01,39.49,27.84,19.04,18.67;HRMS:calc for C16H18N2O5[M+H]+319.3245,found 319.3266.
在上述合成中,加入的1,6-庚二炔可以为1.4~2.1mmol中的任一值,TEA可以为1.05~1.4mmol中的任一值。
(2)dUTP-P的合成:在手套箱中分别称取化合物dU-P 51mg(0.16mmol)、三正丁胺焦磷酸盐150mg(0.32mmol)、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮66mg(0.32mmol) 置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.5mL无水DMF中,再加入0.6mL新蒸的三正丁胺,搅拌半小时。把2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮溶于0.5mL无水DMF中,激烈搅拌下通过注射器加入上述三正丁胺焦磷酸盐溶液,搅拌半小时。然后将该混合液注入到F3中,搅拌1.5h。加入5mL 3wt%碘(9:1体积比的Py/H2O作为溶剂)溶液。15min后加入4mL水,搅拌2h。加入0.5mL 3M NaCl溶液,再加入30mL无水乙醇,-20℃冷冻过夜,离心(3200r/min,25℃)20min。倾去上清液,得沉淀,抽干溶剂。再依次加入TEAB溶液和浓氨水,室温搅拌过夜。减压蒸干溶剂,出现白色固体,得dUTP-P。用分析型HPLC进行分析,条件:柱子:C18,10μm,4.6×250mm;流速:1mL/min;流动相:20mM三乙胺乙酸盐和CH3CH2OH,梯度洗涤,0~20%乙醇(35min);紫外检测器:254nm。在t=16.5min时有产物峰生成。制备HPLC分离得产品22mg,产率24%。1H NMR(500MHz,D2O)δ8.83(s,1H),7.38–7.19(m,1H),4.40(td,J=11.3,2.0Hz,1H),4.26(ddd,J=24.5,16.8,11.3Hz,1H),4.16–4.06(m,1H),4.08–3.91(m,2H),2.27–2.12(m,4H),2.00–1.67(m,4H),1.56(s,1H).31P NMR(202MHz,D2O):δ-22.90,-11.20,-10.30;HRMS:calc for C16H22N2O14P3[M+H]+559.2642,found 559.2593;calc for C16H21N2O14P3Na[M+Na]+581.2642,found 581.2688。
实施例8、基于偶氮连接单元(IV)的可逆终端(VII)的合成
本实施例的可逆终端是基于偶氮连接单元(IV)得到的,其合成示意图如图10所示,具体步骤如下:
(1)化合物TAMRA-IV的合成:TAMRA-IV的合成路线如图10所示:在酰胺化反应条件下,取化合物IV与TAMRA进行酰胺化反应,得化合物TAMRA-IV;
所述步骤具体为:称取TAMRA(0.043g,0.1mmol),HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.057g,0.15mmol),IV(71mg,0.15mmol)于10ml的干燥的单口烧瓶中,冰水浴下氮气保护下加入NMM(N-甲基吗啉)(17μL,0.1mmol),干燥的DMF 8ml搅拌30min后升温至35℃反应24h,停止反应,反应液倒入50ml无水乙醚中沉淀,离心得粗产品135mg,柱层析得73mg化合物TAMRA-IV,产率83%。1H NMR(500MHz,D2O)δ8.23(d,J=1.4Hz,1H),8.15–8.04(m,2H),7.90(d,J=7.5Hz,1H),7.80(dd,J=7.5,1.6Hz,1H),7.74(d,J=7.5Hz,1H),7.51(d,J=1.4Hz,1H),6.91(d,J=7.5Hz,1H),6.70(dd,J=7.5,1.4Hz,1H),6.62(d,J=1.4Hz,1H),6.45(d,J=6.0Hz,2H),6.33(dd,J=7.5,1.4Hz,1H),6.19(dd,J=20.7,6.2Hz,2H),5.89(d,J=11.0Hz,1H),4.82(s,1H),4.31(t,J=7.1Hz,2H),3.74(dt,J=8.1,5.6Hz,4H),3.52(s,4H),3.28(t,J=4.1Hz,2H),3.01(s,6H),2.90(s,6H),2.63(t,J=7.9Hz,2H),1.47 (t,J=7.9Hz,2H).13C NMR(125MHz,D2O)δ173.20,168.62,166.82,163.60,161.45,158.50,154.81,153.76,152.95,147.95,142.82,140.57,138.58,134.18,133.47,133.18,131.03,129.80,127.99,127.05,125.36,122.46,122.12,119.62,117.35,113.66,113.06,112.48,110.41,105.18,101.03,99.08,96.89,72.20,70.17,69.96,68.31,51.99,47.81,41.92,41.00,33.07,29.16.HRMS(ESI)calcd for C47H47N8O10Na 907.3493(M+Na+),found 907.3506.
(2)化合物VII的合成:合成路线如图10所示,所述步骤具体为:在两口瓶中,将等当量的dUTP-P和TAMRA-IV溶于适量THF,使得两化合物的浓度为10mmol/ml。体系抽充氮气三次,加氮气球,使反应在氮气保护下进行。将0.6倍摩尔量的无水CuSO4固体和2倍摩尔量的抗坏血酸钠(VcNa)混合,抽真空,加入去离子水震荡得黄色悬浊液,再注入反应体系中,室温搅拌36h。旋蒸除去溶剂,制备HPLC分离,产率67%。 1H NMR(500MHz,D2O)δ9.20(s,1H),8.87(s,1H),8.23(d,J=1.4Hz,1H),8.15–8.04(m,2H),7.93–7.77(m,3H),7.74(d,J=7.5Hz,1H),7.57–7.49(m,2H),7.29(s,1H),6.91(d,J=7.5Hz,1H),6.81(d,J=11.0Hz,1H),6.70(dd,J=7.5,1.4Hz,1H),6.62(d,J=1.4Hz,1H),6.33(dd,J=7.5,1.4Hz,1H),6.17(d,J=1.6Hz,1H),5.89(t,J=5.4Hz,2H),4.75(s,1H),4.46(t,J=5.3Hz,2H),4.40(dd,J=2.0,1.3Hz,1H),4.34–4.22(m,3H),4.05–3.96(m,2H),3.77(t,J=3.5Hz,2H),3.71(t,J=4.0Hz,2H),3.52(s,4H),3.28(t,J=4.0Hz,2H),3.22(s,6H),2.90(s,6H),2.72(ddd,J=12.2,7.4,2.8Hz,1H),2.63(t,J=6.0Hz,2H),2.44(t,J=7.9Hz,2H),2.23–2.13(m,4H),2.01–1.89(m,3H),-0.24(s,1H).31P NMR(202MHz,D2O)δ-7.00,-10.30,-21.70;HRMS:calc for C63H64N10O24P3[M-H]-1437.3386,found 1437.3393;calc for C63H63N10O24P3Na[M-2H+Na]-1459.3386,found 1459.3355。
需要说明的是,本实施例中,化合物中dUTP-P的量在0.01~0.03mmol范围内均可实现上述反应。所用碱基除了U之外,还可以为C、A、G其它不同的碱基,同样可以得到基于偶氮连接单元的荧光素标记核苷酸,其中的荧光素除了TAMRA,也可以为其它的荧光素。
实施例9、基于偶氮连接单元(V)的可逆终端(VIII)的合成
本实施例的可逆终端是基于偶氮连接单元(V)得到的,其合成示意图如图11所示,具体步骤如下:
(1)化合物TAMRA-V的合成:TAMRA-V的合成路线如图11所示:在酰胺化反应条件下,取化合物V与TAMRA进行酰胺化反应,得化合物TAMRA-V;
所述步骤具体为:称取TAMRA(0.043g,0.1mmol),HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.057g,0.15mmol),V(74mg,0.15mmol)于 10ml的干燥的单口烧瓶中,冰水浴下氮气保护下加入NMM(N-甲基吗啉)(17μL,0.1mmol),干燥的DMF 8ml搅拌1h后升温至35℃反应18h,停止反应,反应液倒入50ml无水乙醚中沉淀,离心得粗产品135mg,柱层析得80mg化合物TAMRA-V,产率88%。
1H NMR(500MHz,D2O)δ8.05(ddd,J=26.7,16.0,8.9Hz,3H),7.89(d,J=15.0Hz,1H),7.79–7.62(m,2H),7.50(d,J=2.9Hz,1H),6.90(d,J=14.9Hz,1H),6.72–6.56(m,2H),6.45(s,1H),6.27(ddd,J=58.2,25.7,3.0Hz,3H),5.88(d,J=21.8Hz,1H),4.83(s,1H),4.30(t,J=7.1Hz,2H),3.91(s,3H),3.77(t,J=7.1Hz,2H),3.71(t,J=7.3Hz,2H),3.52(s,4H),3.28(t,J=7.3Hz,2H),2.98(s,6H),2.90(s,6H),2.63(t,J=15.8Hz,2H),1.43(t,J=15.8Hz,2H).13C NMR(125MHz,D2O)δ173.20,166.83,163.60,161.45,158.50,154.81,153.76,152.95,151.55,142.30,140.57,138.58,138.59,136.20,133.47,133.18,131.03,127.99,127.61,127.05,125.36,123.93,122.46,120.67,119.62,113.66,113.06,112.48,110.41,105.18,101.03,99.08,96.89,72.20,70.17,69.96,68.31,52.06,52.04,47.81,41.92,41.00,33.07,29.16.HRMS(ESI)calcd for C47H47N8O10Na 921.3650(M+Na+),found 921.3622.
(2)目标产物VIII的合成:合成路线如图11所示,所述步骤具体为:在两口瓶中,将等当量的dUTP-P和TAMRA-V溶于适量THF,使得两化合物的浓度为10mmol/ml。体系抽充氮气三次,加氮气球,使反应在氮气保护下进行。将0.6倍摩尔量的无水CuSO4固体和2倍摩尔量的抗坏血酸钠(VcNa)混合,抽真空,加入去离子水震荡得黄色悬浊液,再注入反应体系中,室温搅拌34h。旋蒸除去溶剂,制备HPLC分离,产率57%。1H NMR(500MHz,D2O)δ9.40(s,1H),9.23(s,1H),8.16–7.85(m,5H),7.79–7.62(m,2H),7.58–7.46(m,2H),7.25(s,1H),6.91(d,J=14.9Hz,1H),6.70(dd,J=14.9,3.1Hz,1H),6.62(dd,J=12.8,9.7Hz,3H),6.33(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),6.17(d,J=3.1Hz,1H),5.89(d,J=21.8Hz,1H),4.93(s,1H),4.76(s,1H),4.62(td,J=6.6,3.1Hz,1H),4.55–4.16(m,6H),4.01(ddd,J=24.5,17.0,15.7Hz,1H),3.91(s,3H),3.74(dt,J=18.1,11.7Hz,4H),3.52(s,4H),3.34(s,6H),3.28(t,J=9.0Hz,3H),2.90(s,6H),2.63(td,J=15.7,0.8Hz,2H),2.44(td,J=15.6,0.6Hz,2H),2.34–2.24(m,2H),2.25–2.07(m,4H),2.05–1.89(m,2H).31P NMR(202MHz,D2O)δ-7.01,-10.32,-21.70;HRMS:calc for C64H66N10O24P3[M-H]-1451.3543,found 1451.3580;calc for C64H65N10O24P3Na[M-2H+Na]-1473.3543,found 1473.3577。
需要说明的是,本实施例中,化合物中dUTP-P的量在0.01~0.03mmol范围内均可实现上述反应。所用碱基除了U之外,还可以为C、A、G其它不同的碱基,同样可以得到基于偶氮连接单元的荧光素标记核苷酸,其中的荧光素除了TAMRA,也可以为其 它的荧光素。
实施例10、基于偶氮连接单元(III)的可逆终端(IX)的合成
本实施例的可逆终端是基于偶氮连接单元(III)得到的,其合成示意图如图12所示,具体步骤如下:
(1)化合物TAMRA-III的合成:TAMRA-III的合成路线如图11所示:在酰胺化反应条件下,取化合物III与TAMRA进行酰胺化反应,得化合物TAMRA-III;
所述步骤具体为:称取TAMRA(0.043g,0.1mmol),HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)(0.057g,0.15mmol),III(70mg,0.15mmol)于10ml的干燥的单口烧瓶中,冰水浴下氮气保护下加入NMM(N-甲基吗啉)(17μL,0.1mmol),干燥的DMF 8ml搅拌1h后升温至35℃反应18h,停止反应,反应液倒入50ml无水乙醚中沉淀,离心得粗产品135mg,柱层析得68mg化合物TAMRA-III,产率81%。1H NMR(500MHz,D2O)δ8.59–8.42(m,2H),8.07(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),7.95–7.81(m,1H),7.74(d,J=15.0Hz,1H),7.47(ddd,J=16.1,10.8,3.3Hz,3H),6.91(d,J=15.0Hz,1H),6.70(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),6.67–6.57(m,2H),6.52–6.25(m,3H),6.17(d,J=3.1Hz,1H),5.89(d,J=21.8Hz,1H),4.31(t,J=14.0Hz,2H),3.83–3.62(m,4H),3.52(s,4H),3.28(t,J=8.2Hz,2H),3.11(s,6H),2.90(s,6H),2.63(t,J=15.8Hz,2H),1.48(t,J=15.8Hz,2H).13C NMR(125MHz,D2O)δ173.20,166.82,163.60,161.45,158.50,154.81,153.76,152.95,150.36,144.83,140.57,138.58,133.47,133.18,131.14,130.92,127.99,127.05,126.45,125.36,122.46,119.62,113.66,113.06,112.48,110.41,105.18,101.03,99.08,96.89,72.20,70.17,69.96,68.31,51.99,47.81,41.92,41.00,32.86,29.16.HRMS(ESI)calcd for C46H48N8O8Na 863.3595(M+Na+),found 863.3609.
(2)目标产物IX的合成:合成路线如图12所示,所述步骤具体为:在两口瓶中,将等当量的dUTP-P和TAMRA-III溶于适量THF,使得两化合物的浓度为10mmol/ml。体系抽充氮气三次,加氮气球,使反应在氮气保护下进行。将0.6倍当量的无水CuSO4固体和3倍当量的抗坏血酸钠(VcNa)混合,抽真空,加入去离子水震荡得黄色悬浊液,再注入反应体系中,室温搅拌48h。旋蒸除去溶剂,制备HPLC分离纯化,产率66%。 1H NMR(500MHz,D2O)δ9.27(s,1H),9.14(s,1H),8.60–8.42(m,2H),8.07(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),7.95–7.66(m,5H),7.47(ddd,J=16.1,10.8,3.3Hz,3H),6.91(d,J=15.0Hz,1H),6.85(s,1H),6.75–6.57(m,3H),6.33(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),6.24–6.11(m,2H),5.89(d,J=21.8Hz,1H),4.49–4.36(m,4H),4.34–4.19(m,3H),4.10–3.91(m,1H),3.85–3.66(m,4H),3.52(s,4H),3.28(t,J=10.1Hz,2H),2.92(s,6H),2.90(s,6H),2.75(ddd,J=24.8,14.8,5.4Hz,1H),2.67–2.57(m,2H),2.53–2.37(m,3H),2.26–1.91(m,6H).31P NMR(202MHz,D2O)δ-7.05,-10.33,-21.72;HRMS:calc for C62H64N10O22P3[M-H]-1393.3488,found 1393.3499;calc for C62H63N10O22P3Na[M-2H+Na]-1415.3488,found 1415.3448.
需要说明的是,本实施例中,化合物中dUTP-P的量在0.01~0.03mmol范围内均可实现上述反应。所用碱基除了U之外,还可以为C、A、G其它不同的碱基,同样可以得到基于偶氮连接单元的荧光素标记核苷酸,其中的荧光素除了TAMRA,也可以为其它的荧光素。
实施例11、对合成的可逆终端的生物学评价
本实施例基于实施例9所述可逆终端VIII。连二亚硫酸钠溶液处理含有偶氮键可逆终端的DNA链延伸反应产物的结果列于图13,测试浓度由10uM到30mM不等,测试温度均为室温。10mM的连二亚硫酸钠作用15min可很好地将含有偶氮键的可逆终端完全断裂,20mM、30mM的连二亚硫酸钠作用3min均能将含有偶氮键的可逆终端完全断裂,而10uM连二亚硫酸钠两小时内难以断裂偶氮键,可见,偶氮键的断裂速度可以随着还原剂连二亚硫酸钠的浓度的增加而变快。值得注意的是,20mM、30mM的连二亚硫酸钠均能有效断裂偶氮键,说明其完全可以应用于高通量测序反应。而它们的断裂时间很短,并且是在常温下。则说明了偶氮键可逆终端断裂所需的条件是非常温的和,从而可以更高效的应用于测序。
在室温下分别用10uM、8mM以及10mM的连二亚硫酸钠处理含有偶氮键可逆终端的DNA链延伸反应产物,作用时间从10min至2h。取断裂反应产物进行12%PAGE电泳分析,结果见图13。图13a为DNA链延伸反应PAGE电泳;图13b为断裂反应荧光扫描结果;其中,M:DNA marker 20bp;Lane 1:对照模板;Lane 2:DNA链延伸反应阳性对照;Lane 3:含可逆终端的链延伸产物10uM连二亚硫酸钠室温作用2h的断裂;Lane 4:含可逆终端的链延伸产物8mM连二亚硫酸钠室温作用2h的断裂;Lane5-9:含可逆终端的链延伸产物10mM连二亚硫酸钠室温作用10min、20min、30min、1h和2h的断裂。
由图13可知,还原剂敏感可逆终端可以被DNA聚合酶识别,作为其底物参与DNA链的延伸。10uM连二亚硫酸钠处理DNA链延伸产物,不能有效断裂偶氮键可逆终端;而8mM和10mM连二亚硫酸钠室温下分别作用10min至2h,均能有效断裂偶氮键可逆终端并恢复3’端粘性,继续聚合第二个核苷酸,说明其完全可以应用于高通量测序反应
在室温下用10mM连二亚硫酸钠处理含有偶氮键可逆终端的DNA链延伸反应产物,作用时间从3min至15min,取断裂反应产物进行12%PAGE电泳分析,结果见图14,图14a为DNA链延伸反应PAGE电泳;图14b为断裂反应荧光扫描结果,其中,M:DNA marker 20bp;Lane 1-5:含有偶氮键可逆终端链延伸产物10mM连二亚硫酸钠分别处理15min、10min、8min、5min和3min的断裂;Lane 6:DNA链延伸反应阳性对照;Lane7:对照模板。
从图中结果可以看出,含有偶氮键可逆终端的DNA链延伸产物在10mM的连二亚硫酸钠室温作用3min、5min、8min后荧光扫描结果显示仍有荧光信号,说明这个浓度下连二亚硫酸钠不能完全将偶氮键断裂;作用10min后有微弱的荧光信号,15min后荧光信号基本检测不到,显示10mM的连二亚硫酸钠处理15min时断裂偶氮键效果较好。
在室温下分别用20mM和30mM的连二亚硫酸钠处理含有偶氮键可逆终端的DNA链延伸反应产物,作用时间从3min至8min。取断裂反应产物进行12%PAGE电泳分析,结果见图15,图15a为DNA链延伸反应PAGE电泳,图15b为断裂反应荧光扫描结果,其中,M:DNA marker 20bp;Lane 1-2:含有偶氮键可逆终端链延伸产物30mM连二亚硫酸钠分别处理5min和3min的断裂;Lane 3:DNA链延伸反应阳性对照;Lane 4:对照模板;Lane 5-7:含有偶氮键可逆终端链延伸产物20mM连二亚硫酸钠分别处理3min、5min和8min的断裂。
由图15可知,含有偶氮键可逆终端的DNA链延伸产物在20mM的连二亚硫酸钠室温作用3min、5min、8min后荧光扫描结果检测不到荧光信号,说明20mM的连二亚硫酸钠作用3min就能完全将含有可逆终端偶氮键断裂。类似地,30mM连二亚硫酸钠室温作用3min、5min也能完全将可逆终端的偶氮键断裂。
本实施例所用测序模板序列如下:
5'GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo 1(SEQ.ID:1)
3'CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCATCGATCGCCATGTGC Oligo 2(SEQ.ID:2)
其中Oligo 1的5'端用荧光素Dylight 800标记。
1)配置毛细管电泳胶:取一50ml管,称量20g尿素于其中,并加入35ml ddH2O同时放在50℃水浴锅中溶解;完全溶解后用0.2nm滤网进行过滤;再取一新管加入5ml 10xTBE溶液和9ml的丙烯酰胺;将先前的尿素倒进此新管中,加ddH2O使其总体积达到50ml;最后加入50ul的APS和50ul的TEMED,混匀,迅速注入组装好的胶槽中。
2)按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应:
将反应体系置于PCR扩增仪中,30℃15min,75℃10min,16℃保存。
3)分离纯化以及DNA链解旋:
1、酚氯仿抽提:将扩增好的产物转移入1.5ml的eppendorf管中使总体积达到300uL,并加入相同体积的酚氯仿,混匀,常温下13000rmp离心10min;取出样品,分为三层,上层为水相DNA溶于其中,中层为不溶蛋白质层,下层为有机相;将上层水相转移至1.5ml的eppendorf管中。
2、乙醇沉淀:将经酚氯仿抽提过后的产物加入相当于其体积1%的糖原,10%NaCl(3M)以及2.5倍的100%的乙醇,混匀,放入-70℃冰箱30min~1h;拿出后立即4℃13000rmp离心30min;离心完后,会在离心管底部形成沉淀为DNA,将离心管的液体倒出再加入500uL80%的乙醇4℃13000rmp离心5min;离心完后,将液体倒出风干。
3、DNA溶解并变性:加入20uL ddH2O和1uL 0.1M NaOH,放入PCR仪中95℃5min后,立即冰水浴2min冷却,进行电泳分析。
4、毛细管电泳分析,DNA链延伸反应荧光扫描结构如图16所示,其中,Lane 1:Primer(Oligo 1);Lane 2:含有dUTP(AP3)-azo-TAMRA的链延伸产物。
从图16可以看出,dUTP(AP3)-azo-TAMRA可以被DNA聚合酶识别,作为其底物参与DNA链的延伸反应。
同理,实施例8所述可逆终端VII,以及实施例10所述可逆终端IX在同等的条件下,均可100%参与DNA链延伸反应,并且在还原剂连二亚硫酸钠的作用下可逆终端的偶氮键可完全断裂。即可逆终端VII,VIII,IX均可有效地用于DNA测序。但是与之形成鲜明对比的是连接单元II当连二亚硫酸钠溶液为1mM时,t1/2=3354s,从这几个简单的实施例可以看出,苯环上取代基的位置和种类对连接单元的断裂速度影响非常大。所以基于连接单元II的可逆终端,其断裂速度一定是非常慢的。
实施例12、对比实施例
本对比实施例提供了一种结构式如图17所示的可逆终端,其生物学评价如下:
先将oligo 2`与所有的oligo(3-6)结合即2`-3,2`-4,2`-5到2`-6:取oligo 2和其他的oligo样品5μL于PCR管中,然后在95℃下保温3min并且以0.1℃/S降至15℃保存待用。再配制毛细管电泳胶(配制方法如上所述)。
本实施例所用模板如下:
模板1:
GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo 2`(带荧光)(SEQ.ID:3)
CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCATCGATCGCCATGTCG Oilgo 3(SEQ.ID:4)
模板2:
GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo2`(带荧光)
CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCAACGATCGCCATGTGC Oligo 4(SEQ.ID:5)
模板3:
GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo2`(带荧光)
CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCAAAGATCGCCATGTGC Oligo 5(SEQ.ID:6)
模板4:
GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo2`(带荧光)
CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCAAAAGTCGCCATGTGC Oligo 6(SEQ.ID:7)
荧光可逆终端dUTP-azo-TAMRA的DNA链的延伸反应
按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应:
总体积100μL,将反应体系置于30℃15min,72℃10min,16℃保存。
经酚氯仿抽提,乙醇沉淀浓缩为固体后,溶于相应体积的水中使其的浓度达到40ng/μL,加入0.1M NaOH,95℃5min变性后,进行毛细管电泳分析。分析结果如图18所 示,其中,oligo 2为Marker,第二道至第四道分别为模板1,模板2,模板3,模板4。上面的四个平行条带都为加上一个dUTP,可以看出oligo 2的结合效率不高,但是每次只能延伸一个核苷酸。这样一个初步的评价结果表明该偶氮可逆终端不具有用于测序的实际价值。
连二亚硫酸钠溶液处理含有上述本实施例偶氮键可逆终端的DNA链延伸反应产物的结果列于上图,测试浓度由100uM到300mM不等,测试温度均为室温。100mM的连二亚硫酸钠作用60min也不能将含有偶氮键的可逆终端完全断裂,200mM、300mM的连二亚硫酸钠作用30min均不能将含有偶氮键的可逆终端完全断裂。可见,本对比实施例的偶氮键在我们所测试的条件下是很难断裂的,如图19所示,基本不能用于测序。
实施例13偶氮连接单元的断裂速率研究。
1.Na2S2O4溶液配制:
0.22g Na2S2O4溶解于10ml H2O中得121mM的盐溶液,
注意:溶液现配现用,所使用的H2O溶液先通N2除去水中的O2,
2.样品配制:1.0mg偶氮样品LYZ014,II,III,IV,V分别溶解于1.0ml的甲醇当中得2.5mM样品溶液。
3.使用除O2后H2O,加入少量盐酸调节pH=6左右(pH试纸检测)
4.断裂过程:取20μL的样品用pH=6的水溶液稀释至950μL,加入50μL新配制的Na2S2O4溶液震荡5~10秒钟即可断裂。
断裂时样品的浓度为50μM。
当所述R1、R2、R3、R5均为-H,R4和R6均为-OH时,结构如式(II)所示:
式II的偶氮连接单元当连二亚硫酸钠溶液为1mM时,t1/2=3354s。
当所述R1、R2、R3、R5、R6均为-H,R4为-OH,结构如式(III)所示:
式III所述偶氮连接单元当连二亚硫酸钠为1mM时,t1/2=4s;
当所述R1、R3、R5、R6均为-H,R2为-COOH,R4为-OH,结构如式(IV)所示:
式IV所示的偶氮连接单元当连二亚硫酸钠为1mM时,t1/2<1s;
当所述R1、R3、R5、R6均为-H,R2为-COOMe,R4为-OH,结构如式(V)所示:
式V所示的偶氮连接单元当连二亚硫酸钠为6mM时,t1/2<1s;当连二亚硫酸钠为1mM时,t1/2=13s。
式LYZ014所示的偶氮连接单元当连二亚硫酸钠为1mM时,t1/2=210s;式LYZ014所示的偶氮连接单元当连二亚硫酸钠为1mM时,t1/2=210s。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (8)
1.一种基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸,其结构式如式VI所示:
其中,荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、Alexa、Squaring染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种;R1、R2、R3、R4、R6为各种取代基,R5为除-C2H5以外的取代基、且R1、R2、R3、R4、R5、R6不同时为H;n为0~10的整数。
2.如权利要求1所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸,其特征在于,所述R1为-H,R2为-H、-COOH或-COOMe,R3为-H,R4为-OH,R5为-H,R6为-H或-OH。
3.如权利要求1所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸,其特征在于,其结构如式VII、式VIII或式IX所示:
4.一种如权利要求1所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
将偶氮连接单元I中的氨基与荧光素的羧基在缩合剂作用下发生缩合反应形成酰胺化合物荧光素-I所述荧光素-I中的叠氮基与dUTP-P中的炔基发生点击反应,即得所述基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸。
5.一种如权利要求1所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸中的偶氮连接单元,其结构式如式I所示:
其中,R1、R2、R3、R4、R6为各种吸电子或供电子的烷基或芳基取代基,R5为除 -C2H5以外的取代基、且R1、R2、R3、R4、R5、R6不同时为-H;n为0~10的整数。
6.如权利要求5所述的偶氮连接单元,其特征在于,包括式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)中的任意一种结构:
当所述R1、R2、R3、R5均为-H,R4和R6均为-OH时,结构如式(II)所示:
当所述R1、R2、R3、R5、R6均为-H,R4为-OH,结构如式(III)所示:
当所述R1、R3、R5、R6均为-H,R2为-COOH,R4为-OH,结构如式(IV)所示:
当所述R1、R3、R5、R6均为-H,R2为-COOMe,R4为-OH,结构如式(IV)所示:
7.一种如权利要求5所述的偶氮连接单元的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
将化合物A在浓盐酸和亚硝酸钠的作用下进行重氮化反应 后,与化合物B在氢氧化钠、乙醇和水的混合溶液反应得到化合物C将化合物C在三氟乙酸中脱保护基,得到目标产物I。
8.一种如权利要求1~4中任意一项所述的基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸在DNA测序中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510031230.9A CN104725453B (zh) | 2015-01-21 | 2015-01-21 | 基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510031230.9A CN104725453B (zh) | 2015-01-21 | 2015-01-21 | 基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104725453A true CN104725453A (zh) | 2015-06-24 |
CN104725453B CN104725453B (zh) | 2017-12-15 |
Family
ID=53449929
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510031230.9A Active CN104725453B (zh) | 2015-01-21 | 2015-01-21 | 基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104725453B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085591A (zh) * | 2015-07-03 | 2015-11-25 | 上海交通大学 | 荧光标记偶氮修饰核苷酸及其在dna测序中的用途 |
CN108251516A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-07-06 | 上海交通大学 | Dna单分子测序方法与测序系统 |
CN113603615A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-11-05 | 利尔化学股份有限公司 | 一种5-卤代-2[(烷氧基羰基)氨基]-3-甲基苯甲酸的制备方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002099141A1 (en) * | 2001-06-06 | 2002-12-12 | Epoch Biosciences, Inc. | Fluorescent quenching detection reagents and methods |
CN1583730A (zh) * | 2004-06-04 | 2005-02-23 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 一锅法区域选择性合成5-碘代-1,4-二取代-1,2,3-三氮唑化合物 |
WO2005084367A2 (en) * | 2004-03-03 | 2005-09-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry |
WO2008069973A2 (en) * | 2006-12-01 | 2008-06-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
CN101372478A (zh) * | 2008-10-16 | 2009-02-25 | 同济大学 | 一种含2-溴乙烯基-1,2,3-三氮唑化合物及其制备方法 |
CN102675262A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-09-19 | 上海交通大学 | 四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途 |
CN103539697A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-29 | 上海交通大学 | 还原敏感偶氮连接单元的合成及其在dna测序中的用途 |
-
2015
- 2015-01-21 CN CN201510031230.9A patent/CN104725453B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002099141A1 (en) * | 2001-06-06 | 2002-12-12 | Epoch Biosciences, Inc. | Fluorescent quenching detection reagents and methods |
WO2005084367A2 (en) * | 2004-03-03 | 2005-09-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry |
CN1583730A (zh) * | 2004-06-04 | 2005-02-23 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 一锅法区域选择性合成5-碘代-1,4-二取代-1,2,3-三氮唑化合物 |
WO2008069973A2 (en) * | 2006-12-01 | 2008-06-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
CN101372478A (zh) * | 2008-10-16 | 2009-02-25 | 同济大学 | 一种含2-溴乙烯基-1,2,3-三氮唑化合物及其制备方法 |
CN102675262A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-09-19 | 上海交通大学 | 四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途 |
CN103539697A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-29 | 上海交通大学 | 还原敏感偶氮连接单元的合成及其在dna测序中的用途 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085591A (zh) * | 2015-07-03 | 2015-11-25 | 上海交通大学 | 荧光标记偶氮修饰核苷酸及其在dna测序中的用途 |
CN105085591B (zh) * | 2015-07-03 | 2018-02-09 | 上海交通大学 | 荧光标记偶氮修饰核苷酸及其在dna测序中的用途 |
CN108251516A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-07-06 | 上海交通大学 | Dna单分子测序方法与测序系统 |
CN108251516B (zh) * | 2017-12-06 | 2021-04-02 | 上海交通大学 | Dna单分子测序方法与测序系统 |
CN113603615A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-11-05 | 利尔化学股份有限公司 | 一种5-卤代-2[(烷氧基羰基)氨基]-3-甲基苯甲酸的制备方法 |
CN113603615B (zh) * | 2020-11-03 | 2023-01-06 | 利尔化学股份有限公司 | 一种5-卤代-2[(烷氧基羰基)氨基]-3-甲基苯甲酸的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104725453B (zh) | 2017-12-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7038063B2 (en) | Atropisomers of asymmetric xanthene fluorescent dyes and methods of DNA sequencing and fragment analysis | |
JP2003514058A (ja) | 水溶性ローダミン色素およびその結合体 | |
CN104292117B (zh) | 酸敏感连接单元的合成及其在dna测序中的用途 | |
US6750357B1 (en) | Rhodamine-based fluorophores useful as labeling reagents | |
CN104277051A (zh) | 4-氨基-噻吩并[3,2-c]吡啶-7-羧酸衍生物 | |
EP2221347A1 (en) | Sulfonated diarylrhodamine dyes | |
CN104725453A (zh) | 基于偶氮连接单元的荧光标记核苷酸及其用途 | |
CN103539697B (zh) | 还原敏感偶氮连接单元的合成及其在dna测序中的用途 | |
CN111704648B (zh) | 以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物及制备方法与应用 | |
CN107226783A (zh) | 一种溶酶体靶向荧光探针及其制备方法 | |
CN102443018B (zh) | 荧光标记的o6-苄基鸟嘌呤及其制备和应用 | |
CN110642803B (zh) | 一种二氢噻唑杂环化合物的合成方法及在生物分子修饰中的应用 | |
CN103204819A (zh) | 氘代地西泮及其制备方法 | |
CN107814796B (zh) | 一种基于苯并呋咱的环境敏感染料及其制备方法和应用 | |
CN104693258B (zh) | 基于分子胶的荧光标记核苷酸及其在dna测序中的用途 | |
CN104945285A (zh) | 同位素标记丹磺酰氯-13c2的合成方法 | |
CN104003902B (zh) | 三氮烯连接单元的合成及其在dna测序中的用途 | |
CN106188149B (zh) | 一种近红外金属铱配合物及其制备方法和应用 | |
CN102757296B (zh) | 一种对化合物进行[18f]标记的方法 | |
CN105062465B (zh) | 一类环境敏感型的α1-肾上腺素能受体近红外荧光配体及其应用 | |
CN108530483B (zh) | 基于香豆素骨架的Wittig试剂及其制备方法和用途 | |
CN104387790A (zh) | 一种含噻吩基团的苯并吲哚盐染料及其制备方法和用途 | |
CN102295720A (zh) | 荧光基团芘接枝的聚(甲基)丙烯酸二甲氨基乙酯的阳离子聚电解质的制备方法 | |
CN109516984A (zh) | 一种2-巯基-5-氰基嘧啶类衍生物及其制备方法和应用 | |
CN1407052A (zh) | 新型稀土荧光标记物及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |