CN106588722B

CN106588722B - 硫代缩酮连接单元的合成及其在dna测序中的用途

Info

Publication number: CN106588722B
Application number: CN201510684831.XA
Authority: CN
Inventors: 沈玉梅; 王雪里; 谭连江; 邵志峰; 龚兵
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2035-10-20
Also published as: CN106588722A

Abstract

本发明公开了一种硫代缩酮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。该连接单元的结构式为：其中R＝OH或者COOH；R₁＝R₂＝甲基，或R₁＝苯基、对甲氧基苯基、2，4，6‑三甲氧基苯基、萘基或对甲氧基萘基，R₂＝H，或R₁、R₂共同构成环己基、环戊基。该连接单元与核苷酸及荧光素连接得到的荧光素标记核苷酸可用于DNA测序。与现有技术相比，本发明合成的基于硫代缩酮结构的连接单元的可逆终止剂用于DNA测序时，其延伸效率接近100％，并且在模板为连续多个相同碱基时，一次只延伸一个可逆终止剂；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

Description

硫代缩酮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途

技术领域

本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于DNA测序的连接单元，具体涉及一种硫代缩酮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学具有非常重要的意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量待测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终止剂”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3′-羟基阻断外，为了不影响下一个标记核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下一个标记核苷酸并入之前，在温和条件下使这个连接单元断裂，然后继续DNA链延伸，完成一次测序循环，从而读出DNA的碱基序列。而连接单元对合成法测序的读长和效率有极其重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，以提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键，偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及其它光可裂解连接单元)；亲电子试剂/酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而硫代缩酮连接单元却从来没有用于DNA测序。

可裂解连接单元的性质对DNA测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。发明人在前期工作中，发展了一类酸敏感连接单元(201110331659.1，201210132695.X，201310015235.3，201410186697.6，201410203327.9，201510401611.1)以及还原敏感连接单元(201310462509.3，201310401580.0，201410692943.5，201510031230.9，201510388164.0)在DNA测序中的应用。

基于酸敏感连接单元的可逆终止剂用于DNA测序时，不可避免地在一定程度上对DNA链造成损伤，基于偶氮连接单元的可逆终止剂断裂后残留在DNA链上的分子痕较大，在一定程度上影响了下一个可逆终止剂的延伸效率；而基于硫代缩酮结构的连接单元在一定程度上能够克服上述缺点，所以有望在DNA测序领域带来新的机遇。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硫代缩酮连接单元的合成及其在DNA测序中的应用。本发明设计合成的硫代缩酮连接单元及可逆终止剂，该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的价值。

与前期工作相比，本发明是基于硫代缩酮结构的氧化敏感可裂解连接单元，在氧化剂存在条件下，硫代缩酮和缩醛连接单元均可快速完全断裂。该类连接单元的断裂机理和条件与酸敏感连接单元的断裂完全不同，所以，基于硫代缩酮和缩醛结构的连接单元在DNA测序体系中有望克服文献已报道的其它连接单元用于DNA测序的不足。比如：酸敏感可逆终止剂需要在酸性条件下，将标记的荧光素切掉，从而实现下一个可逆终止剂在DNA链上的延伸；而本发明的硫代缩酮结构的连接单元只需要在弱的氧化剂条件下，将标记的荧光素切掉，避免了对DNA不利的酸性条件的使用，有助于克服酸敏感连接单元用于测序的不足和弱点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种氧化敏感硫代缩酮连接单元，结构式如式(I)所示：其中，R＝OH或者COOH；R₁＝R₂＝甲基，或R₁＝苯基、对甲氧基苯基、2，4，6-三甲氧基苯基、萘基或对甲氧基萘基，R₂＝H，或R₁、R₂共同构成环己基、环戊基。

第二方面，本发明涉及一种氧化敏感硫代缩酮连接单元的合成方法，所述方法包括如下步骤：

S1、三氟乙酸乙酯与2-巯基乙醇盐酸盐在三乙胺作用下反应，得到2-巯基三氟乙酰胺；

S2、丙酮、环戊酮、环己酮、苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、1，4，6-三甲氧基苯甲醛、萘醛或对甲氧基萘醛，与所述2-巯基三氟乙酰胺以及3-巯基丙酸甲酯反应，得到硫代缩酮化合物

S3、硫代缩酮化合物在PBS缓冲溶液中，将甲酯转化为硫代缩酮羧酸化合物

S4、硫代缩酮羧酸化合物进一步去掉氨基的保护基，即得所述氧化敏感硫代缩酮连接单元

优选的，步骤S1中，所述反应是在氮气保护以及甲醇存在的条件下进行的。

优选的，步骤S1中，所述三氟乙酸乙酯与2-巯基乙醇盐酸盐、三乙胺的摩尔比为1∶(1～1.5)∶(1.5～2.5)。更优选为1∶1.05∶2。

优选的，步骤S1中，所述反应是在0℃反应2.5～3.5h后，在室温下继续反应10～14h。

优选的，步骤S1具体包括：在氮气保护下，2-巯基乙醇盐酸盐和三乙胺溶解于甲醇中得混合液，冷却至0℃；然后在搅拌下滴加三氟乙酸乙酯于所述混合液中进行反应。

优选的，步骤S1具体还包括：反应结束后，真空下旋除溶剂，残留物加入乙酸乙酯溶解，用水和饱和食盐水依次洗涤.有机相用硫酸钠干燥，柱层析纯化，即得所述2-巯基三氟乙酰胺。

优选的，步骤S2中，丙酮、环戊酮、环己酮、苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、1，4，6-三甲氧基苯甲醛、萘醛或对甲氧基萘醛，与2-巯基三氟乙酰胺以及3-巯基丙酸甲酯的摩尔比为(0.8～1.2)∶1∶(1～1.5)。更优选为1.03∶1∶1.12。

优选的，步骤S2中，所述反应是在氮气保护以及乙腈存在的条件下进行的。

优选的，步骤S2具体包括：氮气保护下，丙酮、环戊酮、环己酮、苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、1，4，6-三甲氧基苯甲醛、萘醛或对甲氧基萘醛，与2-巯基三氟乙酰胺以及3-巯基丙酸甲酯溶解于乙腈中，冷却至0℃后加入三氟化硼乙醚；在0℃继续反应1～3h。

优选的，步骤S2还包括：反应结束后，加入15％碳酸钠溶液，乙酸乙酯萃取(100mL×3).有机相用5％碳酸钠溶液洗涤，干燥、旋除溶剂，用硅胶柱分离纯化，即得所述硫代缩酮化合物。

优选的，步骤S3中，所述转化是在丙酮和猪肝酯酶存在的条件下进行的。所述猪肝酯酶与硫代缩酮化合物的质量比为0.1～0.3∶1；更优选为0.2∶1。所述丙酮和PBS缓冲液的体积比为0.05～0.15∶1；更优选为0.1∶1。

优选的。步骤S3中，每1ml PBS缓冲液中加入所述硫代缩酮化合物0.05～0.1mmol。更优选0.095mmol。

优选的，步骤S3具体包括：硫代缩酮化合物溶解于丙酮，然后溶解于PBS缓冲液再加入猪肝酯酶，得混合物；混合液在室温下搅拌，当pH＜6.0时，滴加2M NaOH溶液直到pH＞7.0；反应6h之后，在反应混合物中加入饱和食盐水，用乙酸乙酯萃取，从有机相中分离得到未反应的硫代缩酮化合物，水相的pH调到2，用乙酸乙酯萃取，从有机相中分离得到无色液体，即得硫代缩酮羧酸化合物。

第三方面，本发明涉及一种氧化敏感硫代缩酮连接单元的合成方法，所述方法包括如下步骤：

R1、三氟乙酸乙酯与2-巯基乙醇盐酸盐在三乙胺作用下反应，得到2-巯基三氟乙酰胺；

B2、丙酮、环戊酮、环己酮、苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、1，4，6-三甲氧基苯甲醛、萘醛或对甲氧基萘醛，与所述2-巯基三氟乙酰胺以及含羟基保护基的2-巯基乙醇(羟基用四氢吡喃等保护)反应，得到硫代缩酮化合物

B3、硫代缩酮化合物在弱酸性溶液中，去羟基保护基，得化合物A

B4、化合物A进一步去掉氨基的保护基，即得所述氧化敏感硫代缩酮连接单元

第四方面，本发明涉及一种氧化敏感硫代缩酮连接单元在DNA测序中的用途，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终止剂，所述可逆终止剂可用于DNA合成测序。

第五方面，本发明涉及一种可逆终止剂，所述可逆终止剂由所述的氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素连接而得。

优选的，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素的连接包括如下步骤：

A1、以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元与TAMRA(5/6)反应，得化合物G

A2、在TEA存在的条件下，化合物G和DSC反应，得到中间体H该中间体H不需要分离纯化直接与dUTP(AP3)反应，得到化合物II及所述可逆终止剂。

优选的，步骤A1中，所述TAMRA(5/6)、酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1∶(1～3)∶(3～10)。

优选的，步骤A2中，所述化合物G、DSC、TEA和dUTP(AP3)的摩尔比为1∶(5～12)∶(6～15)∶(2～4)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明合成了一类新的可裂解连接单元，并用于合成了基于这种该类连接单元的可逆终止剂；并且将该类可逆终止剂成功地用于DNA测序；该类硫代缩酮可逆终止剂与酸敏感缩酮可逆终止剂相比，不需要在酸性条件下将连接单元断裂，从而避免了酸对DNA链的损伤，有助于延长测序的读长。同时基于硫代缩酮结构的连接单元用于3′-OH未保护可逆终止剂，在参与DNA链延伸时，能严格保证一次只延伸一个可逆终止剂。同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

2)相比Y012连接单元，本发明所述连接单元为硫代缩酮连接单元，首先其合成方法完全不同；其次该类连接单元断裂时的反应机理不同，所用试剂也完全不同。更难得的是本发明的连接单元，保留了Y012这类连接单元在参与DNA链延伸时，能够很好地控制一次只延伸一个可逆终止剂，并且延伸效率几乎为100％。也就是说，该类连接用于DNA测序时，既保留了酸敏感连接单元等在参与DNA链延伸时，一次只延伸一个并且延伸效率几乎为100％的优良性质，同时又避免了酸性环境对DNA的损伤。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制实施例所作的详细描述，本发明的其他特征、目的和优点会变得更明显：

图1为实施例1的氧化敏感硫代缩酮连接单元的合成示意图；

图2为基于实施例8所述可逆终止剂的合成示意图；

图3为实施例9所述的可逆终止剂的DNA链延伸胶图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。

本发明所得中间产物及最终产物采用NMR等进行表征。

实施例1、当R₁＝R₂＝Me该类连接单元的合成

本实施例的氧化敏感硫代缩酮连接单元的合成示意图如图1所示，具体步骤如下：

第一步、化合物5的合成：

在氮气保护下，2-巯基乙醇盐酸盐(10g，88mmol)和三乙胺(24mL，0.17mol)溶解于甲醇中(0.25L).混合液冷却至0℃，然后在搅拌下滴加三氟乙酸乙酯(10mL，84mmol)于反应混合液中.在0℃反应3h后与室温下继续反应12h.真空下旋除溶剂，残留物加入乙酸乙酯(0.10L)溶解，用水(50mL)和饱和食盐水(50mL)依次洗涤.有机相用硫酸钠干燥，柱层析纯化得到化合物5(yield 7.9g，54％).¹H NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ1.48(1H，t，J＝8.6Hz)，2.75(2H，dt，J＝8.6，6.6Hz)，3.55(2H，q，J＝6.5Hz)，7.44(1H，br s).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ23.5，42.7，115.8(q，J＝285Hz)，157.7(q，J＝37Hz).

同时分离到副产物(yield 3.2g，21％)f.¹H NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ2.91(4H，t，J＝6.4Hz)，3.72(4H，q，J＝6.2Hz)，6.59(1H，br s).

第二步、化合物6的合成：

氮气保护下，硫醇衍生物5(5.7g，33mmol)，3-巯基丙酸甲酯(4.4g，37mmol)以及丙酮(2.0g，34mmol)溶解于乙腈(50mL).反应混合物冷却至0℃后加入三氟化硼乙醚(13mL，0.11mol).在0℃继续反应2h之后.在反应混合物中加入15％碳酸钠溶液(0.30L).乙酸乙酯萃取(100mL×3).有机相用5％碳酸钠溶液洗涤(0.30L)，干燥、旋除溶剂，用硅胶柱分离纯化，得预期产物硫代缩酮6(yield 4.2g，37％).¹H NMR(300MHz，CDCl₃，TMS)：δ1.61(6H，s)，2.63(2H，t，J＝7.1Hz)，2.88(4H，overlapped m)，3.60(2H，q，J＝6.4Hz)，3.71(3H，s)，7.53(1H，br s).¹³C NMR(75.5MHz，CDCl₃)：δ25.1，29.2，30.8，33.5，39.2，51.9，56.3，115.9(q，J＝288Hz)，157.4(q，J＝37Hz)，172.6.MS(ESI)：m/z＝356.0579，calcd.for C₁₁H₁₈F₃NNaO₃S₂ ⁺m/z(M+Na)⁺＝356.0573.

同时得到两个副产物：

硫代缩酮9(yield 2.2g，23％).¹H NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ1.60(6H，s)，2.62(4H，t，J＝7.4Hz)，2.87(4H，t，J＝7.4Hz)，3.70(6H，s).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ25.3，30.9，34.4，51.9，56.4，172.5.MS(ESI)：m/z＝303.0708，calcd.for C₁₁H₂₀NaO₄S₂ ⁺m/z(M+Na)⁺＝303.0695.

硫代缩酮8(yield 3.5g，26％).¹H NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ1.63(6H，s)，2.85(4H，t，J＝6.7Hz)，3.60(4H，q，J＝6.4Hz)，6.80(2H，br s).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ29.5，31.1，39.5，56.6，115.9(q，J＝287Hz)，157.6(q，J＝37Hz).MS(ESI)：m/z＝409.0450，calcd.for C₁₁H₁₆F₆N₂NaO₂S₂ ⁺m/z(M+Na)⁺＝409.0450.

第三步、化合物10的合成：

硫代缩酮6(63mg，0.19mmol)溶解于丙酮(0.20mL).然后将其溶解于PBS缓冲液(2.0mL)再加入PLE(猪肝酯酶)(13mg，≥195units).混合液在室温下搅拌.当pH＜6.0时，滴加2M NaOH溶液(10μL)直到pH＞7.0.反应6h之后，在反应混合物中加入饱和食盐水(3.0mL)，用乙酸乙酯萃取.从有机相中分离得到未反应的硫代缩酮6(10mg，16％).水相的pH调到2，用乙酸乙酯萃取(5.0mL×7).从有机相中分离得到无色液体(yield 44mg，73％).¹H NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ1.61(6H，s)，2.67(2H，t，J＝7.1Hz)，2.86and 2.89(1H，overlapped t and t，J＝6.7Hz and 7.0Hz，correspondingly)，3.59(2H，q，J＝6.4Hz)，3.71(3H，s)，7.27(1H，br s)，9.27(1H，br s).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ25.0，29.3，30.9，33.7，39.3，56.5，115.9(q，J＝286Hz)，157.5(q，J＝37Hz)，176.9.MS(ESI)：m/z＝342.0419，calcd.for C₁₀H₁₆F₃NNaO₃S₂ ⁺m/z(M+Na)⁺＝342.0416.化合物10去保护既得硫代缩酮连接单元。

实施例2、当R₁与R₂共同构成环己基时，该类连接单元的合成

第一步、化合物5的合成：同实施例1。

第二步、化合物6-1的合成：

氮气保护下，硫醇衍生物5(5.7g，33mmol)，3-巯基丙酸甲酯(4.4g，37mmol)以及环己酮(34mmol)溶解于乙腈(50mL).反应混合物冷却至0℃后加入三氟化硼乙醚(13mL，0.11mol).在0℃继续反应2h之后.在反应混合物中加入15％碳酸钠溶液(0.30L).乙酸乙酯萃取(100mL×3).有机相用5％碳酸钠溶液洗涤(0.30L)，干燥、旋除溶剂，用硅胶柱分离纯化，得预期产物硫代缩酮6-1.

第三步、化合物10-1的合成：

硫代缩酮6-1(63mg，0.19mmol)溶解于丙酮(0.20mL).然后将其溶解于PBS缓冲液(2.0mL)再加入PLE(猪肝酯酶)(13mg，≥195units).混合液在室温下搅拌.当pH＜6.0时，滴加2M NaOH溶液(10μL)知道pH＞7.0.反应6h之后，在反应混合物中加入饱和食盐水(3.0mL)，用乙酸乙酯萃取.从有机相中分离得到未反应的硫代缩酮6-1(10mg，16％).水相的pH调到2，用乙酸乙酯萃取(5.0mL×7).从有机相中分离得到无色液体，化合物10-1去保护既得硫代缩酮连接单元。

实施例3、当R₁与R₂共同构成环戊基时，该类连接单元的合成

第一步、化合物5的合成：同实施例1。

第二步、化合物6-2的合成：

氮气保护下，硫醇衍生物5(5.7g，33mmol)，3-巯基丙酸甲酯(4.4g，37mmol)以及环戊酮(34mmol)溶解于乙腈(50mL).反应混合物冷却至0℃后加入三氟化硼乙醚(13mL，0.11mol).在0℃继续反应2h之后.在反应混合物中加入15％碳酸钠溶液(0.30L).乙酸乙酯萃取(100mL×3).有机相用5％碳酸钠溶液洗涤(0.30L)，干燥、旋除溶剂，用硅胶柱分离纯化，得预期产物硫代缩酮6-2.

第三步、化合物10-2的合成：

硫代缩酮6-2(63mg，0.19mmol)溶解于丙酮(0.20mL).然后将其溶解于PBS缓冲液(2.0mL)再加入PLE(猪肝酯酶)(13mg，≥195units).混合液在室温下搅拌.当pH＜6.0时，滴加2M NaOH溶液(10μL)知道pH＞7.0.反应6h之后，在反应混合物中加入饱和食盐水(3.0mL)，用乙酸乙酯萃取.从有机相中分离得到未反应的硫代缩酮6-2(10mg，16％).水相的pH调到2，用乙酸乙酯萃取(5.0mL×7).从有机相中分离得到无色液体，化合物10-2去保护既得硫代缩酮连接单元。

实施例4、当R₂为H，R₁为苯基时，该类连接单元的合成

第一步、化合物5的合成：同实施例1。

第二步、化合物6-3的合成：

氮气保护下，硫醇衍生物5(5.7g，33mmol)，3-巯基丙酸甲酯(4.4g，37mmol)以及苯甲醛(34mmol)溶解于乙腈(50mL).反应混合物冷却至0℃后加入三氟化硼乙醚(13mL，0.11mol).在0℃继续反应2h之后.在反应混合物中加入15％碳酸钠溶液(0.30L).乙酸乙酯萃取(100mL×3).有机相用5％碳酸钠溶液洗涤(0.30L)，干燥、旋除溶剂，用硅胶柱分离纯化，得预期产物硫代缩酮6-3.

第三步、化合物10-3的合成：

硫代缩酮6-3(63mg，0.19mmol)溶解于丙酮(0.20mL).然后将其溶解于PBS缓冲液(2.0mL)再加入PLE(猪肝酯酶)(13mg，≥195units).混合液在室温下搅拌.当pH＜6.0时，滴加2M NaOH溶液(10μL)知道pH＞7.0.反应6h之后，在反应混合物中加入饱和食盐水(3.0mL)，用乙酸乙酯萃取.从有机相中分离得到未反应的硫代缩酮6-3(10mg，16％).水相的pH调到2，用乙酸乙酯萃取(5.0mL×7).从有机相中分离得到无色液体，化合物10-3去保护既得硫代缩酮连接单元。

实施例5、当R₂为H，R₁为对甲氧基苯基时，该类连接单元的合成

第一步、化合物5的合成：同实施例1。

第二步、化合物6-4的合成：

氮气保护下，硫醇衍生物5(5.7g，33mmol)，3-巯基丙酸甲酯(4.4g，37mmol)以及对甲氧基苯甲醛(34mmol)溶解于乙腈(50mL).反应混合物冷却至0℃后加入三氟化硼乙醚(13mL，0.11mol).在0℃继续反应2h之后.在反应混合物中加入15％碳酸钠溶液(0.30L).乙酸乙酯萃取(100mL×3).有机相用5％碳酸钠溶液洗涤(0.30L)，干燥、旋除溶剂，用硅胶柱分离纯化，得预期产物硫代缩酮6-4.

第三步、化合物10-4的合成：

硫代缩酮6-4(63mg，0.19mmol)溶解于丙酮(0.20mL).然后将其溶解于PBS缓冲液(2.0mL)再加入PLE(猪肝酯酶)(13mg，≥195units).混合液在室温下搅拌.当pH＜6.0时，滴加2M NaOH溶液(10μL)知道pH＞7.0.反应6h之后，在反应混合物中加入饱和食盐水(3.0mL)，用乙酸乙酯萃取.从有机相中分离得到未反应的硫代缩酮6-4(10mg，16％).水相的pH调到2，用乙酸乙酯萃取(5.0mL×7).从有机相中分离得到无色液体，化合物10-4去保护既得硫代缩酮连接单元。

实施例6、当R₂为H，R₁为2，4，6-三甲氧基苯基时，该类连接单元的合成

第一步、化合物5的合成：同实施例1。

第二步、化合物6-5的合成

氮气保护下，硫醇衍生物5(5.7g，33mmol)，3-巯基丙酸甲酯(4.4g，37mmol)以及2，4，6-三甲氧基苯甲醛(34mmol)溶解于乙腈(50mL).反应混合物冷却至0℃后加入三氟化硼乙醚(13mL，0.11mol).在0℃继续反应2h之后.在反应混合物中加入15％碳酸钠溶液(0.30L).乙酸乙酯萃取(100mL×3).有机相用5％碳酸钠溶液洗涤(0.30L)，干燥、旋除溶剂，用硅胶柱分离纯化，得预期产物硫代缩酮6-5.

第三步、化合物10-5的合成：

硫代缩酮6-5(63mg，0.19mmol)溶解于丙酮(0.20mL).然后将其溶解于PBS缓冲液(2.0mL)再加入PLE(猪肝酯酶)(13mg，≥195units).混合液在室温下搅拌.当pH＜6.0时，滴加2M NaOH溶液(10μL)知道pH＞7.0.反应6h之后，在反应混合物中加入饱和食盐水(3.0mL)，用乙酸乙酯萃取.从有机相中分离得到未反应的硫代缩酮6-5(10mg，16％).水相的pH调到2，用乙酸乙酯萃取(5.0mL×7).从有机相中分离得到无色液体，化合物10-5去保护既得硫代缩酮连接单元。

实施例7、当R₂为H，R₁为对甲氧基萘基时，该类连接单元的合成

第一步、化合物5的合成：同实施例1。

第二步、化合物6-6的合成：

氮气保护下，硫醇衍生物5(5.7g，33mmol)，3-巯基丙酸甲酯(4.4g，37mmol)以及对甲氧基萘甲醛(34mmol)溶解于乙腈(50mL).反应混合物冷却至0℃后加入三氟化硼乙醚(13mL，0.11mol).在0℃继续反应2h之后.在反应混合物中加入15％碳酸钠溶液(0.30L).乙酸乙酯萃取(100mL×3).有机相用5％碳酸钠溶液洗涤(0.30L)，干燥、旋除溶剂，用硅胶柱分离纯化，得预期产物硫代缩酮6-6.

第三步、化合物10-6的合成：

硫代缩酮6-6(63mg，0.19mmol)溶解于丙酮(0.20mL).然后将其溶解于PBS缓冲液(2.0mL)再加入PLE(猪肝酯酶)(13mg，≥195units).混合液在室温下搅拌.当pH＜6.0时，滴加2M NaOH溶液(10μL)知道pH＞7.0.反应6h之后，在反应混合物中加入饱和食盐水(3.0mL)，用乙酸乙酯萃取.从有机相中分离得到未反应的硫代缩酮6-6(10mg，16％).水相的pH调到2，用乙酸乙酯萃取(5.0mL×7).从有机相中分离得到无色液体，化合物10-6去保护既得硫代缩酮连接单元。

实施例8、基于该类可裂解连接单元的可逆终端的合成

本实施例的可逆终端是基于实施例1的可裂解连接单元的合成得到的，其合成示意图如图2所示，具体步骤如下：

第一步、化合物M1的合成：

将F1(10mg，0.061mmol)至于单口瓶中，加入溶于1.5ml无水DMF的TAMRA(5/6)(20mg，0.038mmol)，再加入TEA(无水三乙胺)80uL于室温下搅拌3.5h，旋除溶剂后用分析型HPLC进行分析：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，30％～60％CH₃OH(20min)，60％～80％CH₃OH(20min)，可见光检测器：546nm。在t＝22.8min时有产物峰生成，制备HPCL分离得到15mg，产率69％.

第二步、化合物M2的合成：

称取M1(9mg，0.0156mmol)于单口瓶中，加入1.5ml MeCN(乙腈)，及三乙胺22uL，搅拌，加入DSC(N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)(26mg，0.102mmol)后抽真空氮气保护搅拌4h后，得中间体

将dUTP(AP3)(16mg，0.031mmol)溶于1.5mL Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液加入到中间体中反应搅拌2h，用分析型HPLC进行分析：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：A，0.1％TEA水溶液和B，CH₃OH，梯度洗涤，0％～20％CH₃OH(35min)，可见光检测器：546nm。在t＝27.9min时有产物峰生成，制备HPLC分离得化合物M2 2.8mg.产率16.1％。

本实施例中核苷酸dUTP(AP3)为已知化合物。

本实施例中的碱基也可以为C，A，G；所用荧光素可以为其它荧光素。

实施例9、对合成的可逆终止剂的生物学评价

为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA测序，本实施例检测了实施例2的可逆终止剂的特性：是否可以被DNA聚合酶所识别，从而作为DNA聚合酶的底物参与DNA的延伸反应以及当模板上有连续多个相同的碱基时，是否一次只能延伸一个可逆终止剂；

延伸反应的实验步骤：将碱基互补配对的引物和模板溶于Tris-EDTA缓冲液(TE，pH 7.5)中，按照以下条件退火：95℃保温3分钟，然后以0.1℃/秒的速率降温至4℃并保温。经过退火的引物和模板形成双链，可用于DNA延伸反应。在PCR管中依次加入：2μL 10xKlenow反应缓冲液，1.5μL氯化钠溶液(1M)，1.5μL经过退火的引物和模板(1μg/μL)，5μLdUTP-缩酮连接单元-TAMRA(1mM)，0.4μL(2U)of Klenow Fragment exo DNA聚合酶，9.6μL灭菌水，形成总体积为20μL的反应体系。混合均匀后，将此反应体系在37℃下保温15分钟，然后升温至72℃保温10分钟，最后自然冷却至16℃。经过酚氯仿抽提和乙醇沉淀，得到延伸产物。

实施效果：

1)图3为模板为一个和连续两个A的延伸产物测序胶图，从左至右，依次为Lane 1、Lane 2、Lane 3。由图3可知当模板为连续两个A时，一次只能延伸一个可逆终止剂。

Lane 1：24nt；

Lane 3：oligo 2-3，dUTP-硫代缩酮-TAMRA，延伸产物；

Lane 3：oligo 2-4，dUTP-硫代缩酮-TAMRA，延伸产物；

5’-GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG Oligo 2(5’-Dylight 800)(SEQ ID NO.1)

3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCATCGATCGCCATGTCG Oilgo 3(SEQ ID NO.2)

3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCAACGATCGCCATGTCG Oligo 4(SEQ ID NO.3)

结论：当模板为连续多个相同碱基时，化合物在聚合酶作用下参与DNA延伸反应时一次均只能延伸一个硫代缩酮修饰核苷酸，说明3’-未保护的可逆终止剂仍然可以一次只延伸一个，且延伸效率接近100％。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种氧化敏感硫代缩酮连接单元在非诊断和治疗目的的DNA测序中的用途，其特征在于，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元的结构式如式(Ⅰ)所示：其中，R＝OH或者COOH；R₁＝R₂＝甲基，或R₁＝苯基、对甲氧基苯基、2,4,6-三甲氧基苯基、萘基或对甲氧基萘基，R₂＝H，或R₁、R₂共同构成环己基、环戊基；

所述氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终止剂，所述可逆终止剂可用于DNA合成测序。

2.根据权利要求1所述的氧化敏感硫代缩酮连接单元在非诊断和治疗目的的DNA测序中的用途，其特征在于，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元的合成方法包括如下步骤：

S2、丙酮、环戊酮、环己酮、苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、1,4,6-三甲氧基苯甲醛、萘醛或对甲氧基萘醛，与所述2-巯基三氟乙酰胺以及3-巯基丙酸甲酯反应，得到硫代缩酮化合物

3.根据权利要求1所述的氧化敏感硫代缩酮连接单元在非诊断和治疗目的的DNA测序中的用途，其特征在于，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元的合成方法包括如下步骤：

B1、三氟乙酸乙酯与2-巯基乙醇盐酸盐在三乙胺作用下反应，得到2-巯基三氟乙酰胺；

B2、丙酮、环戊酮、环己酮、苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、1,4,6-三甲氧基苯甲醛、萘醛或对甲氧基萘醛，与所述2-巯基三氟乙酰胺以及含羟基保护基的2-巯基乙醇反应，得到硫代缩酮化合物

4.一种可逆终止剂，其特征在于，所述可逆终止剂由如权利要求1所述的氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素连接而得。

5.根据权利要求4所述的可逆终止剂，其特征在于，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素的连接包括如下步骤：

A2、在TEA存在的条件下，化合物G和DSC反应，得到中间体H该中间体H不需要分离纯化直接与dUTP(AP3)反应，得到化合物II即所述可逆终止剂。

6.根据权利要求5所述的可逆终止剂，其特征在于，步骤A1中，所述TAMRA(5/6)、酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1：(1～3)：(3～10)。

7.根据权利要求5所述的可逆终止剂，其特征在于，步骤A2中，所述化合物G、DSC、TEA和dUTP(AP3)的摩尔比为1：(5～12)：(6～15)：(2～4)。