CN101845007A - 端炔基标签化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种端炔基标签化合物及其制备方法。本发明提供的端炔基标签化合物,其结构通式如式I所示,R0为R-X-、笏基保护氨基端半胱氨酸酯基或笏基保护氨基端赖氨酸酯基;其中,R-X-中,R为SH-或-NH2,X为主链碳原子个数为1~6、总碳原子个数为1~10的烷基链或含有酯基或酰胺基的主链碳原子个数为2~8、总碳原子个数为2~12的烷基链。本发明提供的端炔基标签化合物,不仅能修饰蛋白质、多肽或类似物分子,为其提供一个可专一性捕获的末端,还可在后续的专一性捕获中在蛋白质末端产生一个质谱信号增益标签。本发明提供的化合物在生命分析,尤其是生物质谱,蛋白质翻译后修饰位点测定领域具有广阔的应用。
Description
技术领域
本发明涉及端炔基标签化合物及其制备方法。
背景技术
蛋白质或多肽分子的质谱分析是生命分析化学中的一个重要问题。在利用质谱进行蛋白质化学,尤其是蛋白质翻译后修饰谱学的研究中,往往需要在蛋白质或多肽上加上一个标签分子片段,进而改善其质谱信号,添加质谱质量标签或创造一个捕获位点。
近年以来,在蛋白质或者多肽分子上的修饰主要集中在小分子质谱信号增益标签,以及小分子可捕获标签方面。第一种标签分子在修饰蛋白质或者多肽分子之后,具有增强其质谱信号,添加质谱质量标签的功能。第二种标签分子在修饰蛋白质或者多肽分子的之后,另一端可以亲和方式或者可逆化学反应和蛋白质或者树脂结合,而后被释放出来,从而达到蛋白质或者多肽分子的富集和分离功能。
因此,利用点击化学的原理,设计具有端炔及巯基/硫醚/氨基结构的标签化合物,以修饰蛋白质或多肽分子,从而达到分离富集与质谱信号增益标签添加的多重目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种对蛋白质或多肽具有分离富集与质谱信号增益标签添加功能的具有端炔基结构的标签化合物及其制备方法。
本发明提供的端炔基标签化合物,其结构通式如式I所示,
(式I)
式I结构通式中,R0为R-X-、笏基保护氨基端半胱氨酸酯基或笏基保护氨基端赖氨酸酯基;
其中,R-X-中,R为SH-或-NH2,X为主链碳原子个数为1~6、总碳原子个数为1~10的烷基链或含有酯基或酰胺基的主链碳原子个数为2~8、总碳原子个数为2~12的烷基链。
当X为含酯基或酰胺基的烷基链的标签化合物时,本发明提供的制备上述端炔基标签化合物的方法,包括如下步骤:
1)将巯基羧酸或半胱氨酸进行巯基保护反应;
2)将所述步骤1)得到的产物进行酯化或酰胺化反应;
3)将所述步骤2)得到的产物进行巯基的脱保护反应,得到所述端炔基标签化合物。
该方法中,所述步骤1)中,巯基保护反应是按照下述a-d中的任意一种方法进行的:
a、将巯基羧酸或半胱氨酸与S,S-二苯基-S-甲氧基硫腈于有机溶剂中进行反应;
所述巯基羧酸或半胱氨酸与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1∶2;反应时间为30℃,反应时间为4小时;
b、将巯基羧酸或半胱氨酸溶于乙醇和氨水的混合液中,加入苄氯进行反应;
所述巯基羧酸或半胱氨酸与苄氯的摩尔比为1∶1-2,优选1∶1.2;反应时间为30分钟,反应温度为25℃;所述乙醇和氨水的混合液中,乙醇和氨水的体积比为3∶1-3;
c、将巯基羧酸或半胱氨酸溶于有机溶剂中,加入苄氯和碳酸铯进行反应;
所述巯基羧酸或半胱氨酸与苄氯、碳酸铯的摩尔比为1(1)∶1-2(1.2)∶0.2-1优选1∶1.2∶0.5);反应时间为2小时,反应温度为20℃;所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺;
d、在碱性条件下,将巯基羧酸或半胱氨酸与对甲基苯磺酰氯于有机溶剂中进行反应;
所述碱性条件的pH值为9-12;所述巯基羧酸或半胱氨酸与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1∶1-2,优选1∶1.2;反应时间为室温,反应时间为1-6小时;
所述步骤2)中,酯化反应是按照如下方法进行的:将所述步骤1)得到的产物与炔基醇、N,N’-二环己基二亚胺于有机溶剂中进行反应;
所述步骤1)得到的产物与炔基醇、N,N’-二环己基二亚胺的摩尔比为1∶1-1.5∶1-2;所述反应温度为20-80℃,所述反应时间为8小时;
所述步骤2)中,酰胺化反应是按照如下方法进行的:将所述步骤1)的产物与炔基胺、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺进行反应;
所述步骤1)得到的产物与炔基胺、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1∶1.5-4∶0.9-1∶1-2∶1-3,优选1∶2∶0.9∶1∶2;所述反应温度为20-80℃,反应时间为1.5-6小时。
所述步骤3)中,巯基的脱保护反应是按照e-h方法中的任意一种进行的:
e、将所述步骤2)的产物溶于乙醇,通入氨气并加入钠丝,回流反应;
f、将所述步骤2)的产物溶于苯甲醚,通入氟化氢进行反应;
g、在惰性气氛保护下,将所述步骤2)的产物用乙酸乙酯溶解后,加入三氟乙酸进行反应;
h、将步骤2)得到的产物用浓氨水溶解;浓氨水的质量百分比浓度为25-28%。
所述有机溶剂为苯、N,N-二甲基甲酰胺或乙腈。
在上述步骤之后,还可对产物进行纯化;具体步骤可为:反应完毕后将反应溶剂除去,以硅胶柱色谱进行纯化,流动相选取含有羧酸的洗脱剂,羧酸可为甲酸或乙酸等。
当X为笏基保护氨基端半胱氨酸酯基或笏基保护氨基端赖氨酸酯基时,按照上述方法的步骤2)-3)进行制备,仅将步骤2)的起始反应物替换为芴甲氧羰酰基半胱氨酸巯基三苯甲基。
当X为烷基链的标签化合物时,本发明提供的制备上述端炔基标签化合物的方法,包括如下步骤:
1)将炔基醇进行羟基保护反应;
2)制备硫代乙酸的铯盐;
3)将所述步骤1)得到的产物进行取代反应;
4)所述步骤3)得到的产物进行保护基脱除反应,得到所述端炔基标签化合物。
该方法中,所述步骤1)是按照如下方法进行的:在甲基苯磺酰氯和氯仿的混合液中加入炔基醇和吡啶进行反应;
所述炔基醇为3-丁炔-1-醇;所述反应温度为0-10℃,反应时间为2-10小时;
炔基醇、甲基苯磺酰氯、氯仿和吡啶的摩尔比为1∶1.2-2∶8-20∶8-20;
所述步骤2)是按照如下方法进行的:将硫代乙酸、甲醇和碳酸铯混合进行反应,得到硫代乙酸的铯盐;
硫代乙酸、甲醇和碳酸铯的摩尔比为1∶0.4-4∶0.2-1;反应温度为40-85℃,反应时间为0.5-6小时;
所述步骤3)是按照如下方法进行的:将所述步骤1)的产物与所述硫代乙酸的铯盐进行反应;
所述步骤1)的产物与硫代乙酸的铯盐的摩尔比为1∶1.2-4。
所述步骤4)是按照如下方法进行的:将所述步骤3)得到的产物与氨水反应后,酸化,得到所述端炔基标签化合物。
本发明提供的端炔基标签化合物,不仅能修饰蛋白质、多肽或类似物分子,为其提供一个可专一性捕获的末端,还可在后续的专一性捕获中在蛋白质末端产生一个质谱信号增益标签。本发明提供的化合物在生命分析,尤其是生物质谱,蛋白质翻译后修饰位点测定领域具有广阔的应用。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
一、合成式II结构式所示的端炔基标签化合物
式II
在烧瓶中加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(芴甲氧羰酰基半胱氨酸巯基三苯甲基)585mg,3-丁炔-1-醇151μL,再加入干燥乙腈,加入50mg DMAP(4-二甲氨基吡啶)。体系完全澄清后加入适量2.2g DCC(1,3-二环己基碳二亚胺),自然升温至室温。反应8小时后,过滤除去不溶物,硅胶柱分离,将过滤所得溶液用油泵旋蒸,所得产物油泵抽干,称重。
以硅胶柱进行分离。
得到的产物用乙酸乙酯溶解之后,加入TFA(三氟乙酸),氩气保护下,震荡2h。而后用氮气吹干此物,得到最终产物。
二、利用式II结构式所示的端炔基标签化合物进行蛋白质/多肽的修饰
将磷酸化多肽Kemptide(序列为LRRApSLG)配制成0.1~10mg/mL,优选为1mg/L的水溶液,取20微升蛋白质/多肽水溶液,加入100微升饱和氢氧化钡水溶液,在45℃下温育3小时,滴加1mol/L硫酸至pH为4,过滤取滤液,得到消除之后的蛋白质/多肽溶液。
在上述溶液中加入100微升式II结构式所示化合物的乙醇溶液,其中,式II结构式所示化合物的质量百分比2%~30%(优选10%),在45℃下温育2小时,得到修饰之后的蛋白质/多肽溶液。
以RP-HPLC(反相高效液相色谱)法对反应液进行分离,采用C18分析柱,H2O∶AcCN从20∶80到80∶20进行梯度洗脱。可以观测到磷酸化多肽Kemptide色谱峰的消失,并在保留时间更长处出现一个新的峰。质谱检测为Kemptide失去磷酸基团并与一个标签化合物分子加成的峰。
实施例2
一、合成式IV结构式所示的端炔基标签化合物
(式IV)
向10mL2N氢氧化钠的溶液中加入210μL巯基乙酸,于冰水浴中边搅拌边缓慢滴加2.15mL对甲基苯磺酰氯,滴加后期测定体系的pH值,加氢氧化钠控制pH值为9~10。搅拌反应1小时后,用乙醚洗掉过量对甲基苯磺酰氯,重复乙醚洗涤步骤两次后,用15mL乙酸乙酯稀释,用6M盐酸酸化至pH值为1,分离出有机相,水相用乙酸乙酯萃取。合并有机相,用5%(wt)氯化钠溶液洗涤至中性,无水硫酸钠干燥,旋蒸得到粘稠液体。
在上一步的烧瓶中加入10mL的干燥乙腈,加入50mg DMAP(4-二甲氨基吡啶)。等到体系完全变成澄清的时候,加入2.2g DCC,撤掉冷却,让温度自然升高到室温。反应8小时之后,过滤除去不溶物。滤液经减压蒸去溶剂,再溶于1mL混合溶剂中,该混合溶剂为石油醚-乙酸乙酯(9∶1,V∶V)。若有必要,可再次过滤去除残留的脲.粗产物溶液以石油醚-乙酸乙酯(8∶2,V∶V)为洗脱液经过硅胶短柱快速层析,得粘稠状目标产物。
将上一步的产物以浓氨水溶解,室温之下,1小时脱保护反应之后以石油醚-乙酸乙酯(8∶2,V∶V)为洗脱液经过硅胶短柱快速层析,得粘稠状目标产物。
二、利用式II结构式所示的端炔基标签化合物进行蛋白质/多肽的修饰
将磷酸化多肽Kemptide(序列为LRRApSLG)配制成0.1-10mg/mL,优选为1mg/L的水溶液,取20微升蛋白质/多肽水溶液,加入100微升饱和氢氧化钡水溶液,在45℃下温育3小时,滴加1mol/L硫酸至pH为4,过滤取滤液,得到消除之后的蛋白质/多肽溶液。
在上述溶液中加入100微升式IV结构式所示化合物的乙醇溶液,其中,式II结构式所示化合物的质量百分比为2%~30%,优选10%,在45℃下温育2小时,得到修饰之后的蛋白质/多肽溶液。
以RP-HPLC(反相高效液相色谱)法对反应液进行分离,采用C18分析柱,H2O∶AcCN从20∶80到80∶20进行梯度洗脱。可以观测到磷酸化多肽Kemptide色谱峰的消失,并在保留时间更长处出现一个新的峰。质谱检测为Kemptide失去磷酸基团并与一个标签化合物分子加成的峰。
实施例3
一、合成式II结构式所示的端炔基标签化合物SS-01
式XI
1、3-丁炔-1-醇的甲基苯磺酰基保护
在三口烧瓶中加入4.55g的甲基苯磺酰氯与10mL氯仿,搅拌均匀并用冰水浴冷却至3℃;将混合均匀的0.701g 3-丁炔-1-醇和2.06g吡啶滴入烧瓶中,通过冰水浴和控制滴加速度使反应温度在6-8℃,滴加完毕,维持8-10℃继续搅拌反应5h;将反应混合物倾入40mL冰水中搅拌洗涤,再用冷水洗涤两次,用pH值8-9的碳酸钠水溶液(温度在3℃以下)充分搅拌洗涤两次,最后用蒸馏水洗涤至pH值稳定在6.57-6.70;静置分净水层,有机层用无水硫酸钠干燥后,先常压后减压蒸馏,蒸出所有溶剂,得无色油状液态产物,用无水乙醇重结晶,得白色片状结晶。
2、制备硫代乙酸的铯盐
379μL硫代乙酸中加入5mL甲醇,并加入1.63g碳酸铯,搅拌至碳酸铯完全溶解,旋蒸至干。
3、甲基苯磺酰基保护的3-丁炔-1-醇的取代反应
将第一步获得的产物用尽可能少的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解,加入上一步的产物烧瓶中。加热到70℃左右,回流反应5小时。加入适量的石油醚之后,用水逐步将DMF洗去。最后,将石油醚旋蒸除去。获得产品。
4、保护基脱除反应
取第三步的产物,加入30mL 1N的氨水,搅拌5小时,此后使用4mol/L的盐酸进行酸化。产物用乙醚进行萃取,干燥之后,减压蒸馏获得产物。产物在氮气环境下进行保存。
二、利用式II结构式所示的端炔基标签化合物进行蛋白质/多肽的修饰
将磷酸化多肽Kemptide(序列为LRRApSLG)配制成0.1~10mg/mL,优选为1mg/L的水溶液,取20微升蛋白质/多肽水溶液,加入100微升饱和氢氧化钡水溶液,以及100微升式XI结构式所示SS-01标签化合物的质量百分比2%~30%,优选为10%乙醇溶液,在45℃下温育4小时,得到修饰之后的蛋白质/多肽溶液。
以RP-HPLC(反相高效液相色谱)法对反应液进行分离,采用C18分析柱,H2O∶AcCN从20∶80到80∶20进行梯度洗脱。可以观测到磷酸化多肽Kemptide色谱峰的消失,并在保留时间更长处出现一个新的峰。质谱检测为Kemptide失去磷酸基团并与一个标签化合物分子加成的峰。
实施例4
一、合成式XII结构式所示的端炔基标签化合物SS-11
(式XII)
2N氢氧化钠的溶液10mL中加入巯基乙酸210μL,在冰水浴中,搅拌之下,缓慢滴加2.15mL的对甲基苯磺酰氯。滴加后期测量pH值,加氢氧化钠使得pH值控制在9~10,搅拌反应进行1小时之后,首先使用乙醚洗掉过量的对甲基苯磺酰氯,两次,再用乙酸乙酯15mL稀释,用6M盐酸酸化到pH值为1,分离出有机相,水相用乙酸乙酯萃取。合并有机相使用5%氯化钠洗到中性,再用无水硫酸钠干燥,旋蒸得到粘稠液体。
在上一步产物中加入0.28g 3-丁炔-1-胺,DIEA(N,N-二异丙基乙胺)0.26g,HOBT(1-羟基苯并三氮唑)0.14g,HBTU(苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐,可商业购得)0.34g溶于20mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中,于60度下回流搅拌4小时,反应完毕除去反应溶剂,以硅胶柱色谱进行纯化,流动相选取乙酸乙酯∶石油醚∶乙酸=20∶80∶1比例的混合液。
将上一步产物以浓氨水溶解,于室温进行1小时的脱保护反应,以石油醚-乙酸乙酯(8∶2,V∶V)为洗脱液经过硅胶短柱快速层析,得到粘稠状目标产物。
二、利用式II结构式所示的端炔基标签化合物进行蛋白质/多肽的修饰
将磷酸化多肽Kemptide(序列为LRRApSLG)配制成0.1~10mg/mL,优选为1mg/L的水溶液,取20微升蛋白质/多肽水溶液,加入100微升饱和氢氧化钡水溶液,以及100微升式式XII结构式所示SS-10标签化合物的质量百分比2%~30%,优选为10%乙醇溶液,在45℃下温育4小时,得到修饰之后的蛋白质/多肽溶液。
以RP-HPLC(反相高效液相色谱)法对反应液进行分离,采用C18分析柱,H2O∶AcCN从20∶80到80∶20进行梯度洗脱。可以观测到磷酸化多肽Kemptide色谱峰的消失,并在保留时间更长处出现一新峰。质谱检测为Kemptide失去磷酸基团并与一个标签化合物分子加成的峰。
Claims (16)
2.根据权利要求1所述的化合物,其特征在于:所述式I结构通式中,R0为R-X-;所述R-X-中,R为SH-或-NH2,X为含有酯基或酰胺基的主链碳原子个数为2~8、总碳原子个数为2~12的烷基链。
3.根据权利要求1所述的化合物,其特征在于:所述式I结构通式中,R0为R-X-;所述R-X-中,R为SH-或-NH2,X为主链碳原子个数为1~6、总碳原子个数为1~10的烷基链。
4.根据权利要求1所述的化合物,其特征在于:所述式I结构通式中,R0为笏基保护氨基端半胱氨酸酯基或笏基保护氨基端赖氨酸酯基。
6.一种制备权利要求2所述端炔基标签化合物的方法,包括如下步骤:
1)将巯基羧酸或半胱氨酸进行巯基保护反应;
2)将所述步骤1)得到的产物进行酯化或酰胺化反应;
3)将所述步骤2)得到的产物进行巯基的脱保护反应,得到所述端炔基标签化合物。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,巯基保护反应是按照下述a-d中的任意一种方法进行的:
a、将巯基羧酸或半胱氨酸与S,S-二苯基-S-甲氧基硫腈于有机溶剂中进行反应;
b、将巯基羧酸或半胱氨酸溶于乙醇和氨水的混合液中,加入苄氯进行反应;
c、将巯基羧酸或半胱氨酸溶于有机溶剂中,加入苄氯和碳酸铯进行反应;
d、在碱性条件下,将巯基羧酸或半胱氨酸与对甲基苯磺酰氯于有机溶剂中进行反应;
所述步骤2)中,酯化反应是按照如下方法进行的:将所述步骤1)得到的产物与炔基醇、N,N’-二环己基二亚胺于有机溶剂中进行反应;
所述步骤2)中,酰胺化反应是按照如下方法进行的:将所述步骤1)的产物与炔基胺、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺进行反应;
所述步骤3)中,巯基的脱保护反应是按照e-h方法中的任意一种进行的:
e、将所述步骤2)的产物溶于乙醇,通入氨气并加入钠丝,回流反应;
f、将所述步骤2)的产物溶于苯甲醚,通入氟化氢进行反应;
g、在惰性气氛保护下,将所述步骤2)的产物用乙酸乙酯溶解后,加入三氟乙酸进行反应;
h、将所述步骤2)得到的产物用浓氨水溶解。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,方法a中,所述巯基羧酸或半胱氨酸与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1∶2;反应时间为30℃,反应时间为4小时;
方法b中,所述巯基羧酸或半胱氨酸与苄氯的摩尔比为1∶1-2,优选1∶1.2;反应时间为30分钟,反应温度为25℃;所述乙醇和氨水的混合液中,乙醇和氨水的体积比为3∶1-3;
方法c中,所述巯基羧酸或半胱氨酸与苄氯、碳酸铯的摩尔比为1∶1-2∶0.2-1,优选1∶1.2∶0.5;反应时间为2小时,反应温度为20℃;所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺;
方法d中,所述碱性条件的pH值为9-12;所述巯基羧酸或半胱氨酸与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1∶1-2,优选1∶1.2;反应时间为室温,反应时间为1-6小时;
所述步骤2)中,酯化反应中,所述步骤1)得到的产物与炔基醇、N,N’-二环己基二亚胺的摩尔比为1∶1-1.5∶1-2;所述反应温度为20-80℃,所述反应时间为8小时;
所述步骤2)中,酰胺化反应中,所述步骤1)得到的产物与炔基胺、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1∶1.5-4∶0.9-1∶1-2∶1-3,优选1∶2∶0.9∶1∶2;所述反应温度为20-80℃,反应时间为1.5-6小时。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法,其特征在于:所述有机溶剂为苯、N,N-二甲基甲酰胺或乙腈。
10.一种制备权利要求3所述端炔基标签化合物的方法,包括如下步骤:
1)将炔基醇进行羟基保护反应;
2)制备硫代乙酸的铯盐;
3)将所述步骤1)得到的产物进行取代反应;
4)所述步骤3)得到的产物进行保护基脱除反应,得到所述端炔基标签化合物。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于:所述步骤1)是按照如下方法进行的:在甲基苯磺酰氯和氯仿的混合液中加入炔基醇和吡啶进行反应;
所述步骤2)是按照如下方法进行的:将硫代乙酸、甲醇和碳酸铯混合进行反应,得到硫代乙酸的铯盐;
所述步骤3)是按照如下方法进行的:将所述步骤1)的产物与所述硫代乙酸的铯盐进行反应;
所述步骤4)是按照如下方法进行的:将所述步骤3)得到的产物与氨水反应后,酸化,得到所述端炔基标签化合物。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述炔基醇为3-丁炔-1-醇;所述反应温度为0-10℃,反应时间为2-10小时;
炔基醇、甲基苯磺酰氯、氯仿和吡啶的摩尔比为1∶1.2-2∶8-20∶8-20;
所述步骤2)中,硫代乙酸、甲醇和碳酸铯的摩尔比为1∶0.4-4∶0.2-1;反应温度为40-85℃,反应时间为0.5-6小时;
所述步骤3)中,所述步骤1)的产物与硫代乙酸的铯盐的摩尔比为1∶1.2-4。
13.一种制备权利要求4所述端炔基标签化合物的方法,包括如下步骤:
1)将芴甲氧羰酰基半胱氨酸巯基三苯甲基进行酯化或酰胺化反应;
2)将所述步骤1)得到的产物进行巯基的脱保护反应,得到所述端炔基标签化合物。
14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,酯化反应是按照如下方法进行的:将芴甲氧羰酰基半胱氨酸巯基三苯甲基与炔基醇、N,N’-二环己基二亚胺于有机溶剂中进行反应;
所述步骤1)中,酰胺化反应是按照如下方法进行的:将芴甲氧羰酰基半胱氨酸巯基三苯甲基与炔基胺、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺进行反应;
所述步骤2)中,巯基的脱保护反应是按照e-h方法中的任意一种进行的:
e、将所述步骤1)的产物溶于乙醇,通入氨气并加入钠丝,回流反应;
f、将所述步骤1)的产物溶于苯甲醚,通入氟化氢进行反应;
g、在惰性气氛保护下,将所述步骤1)的产物用乙酸乙酯溶解后,加入三氟乙酸进行反应;
h、将所述步骤1)得到的产物用浓氨水溶解;浓氨水的质量百分比浓度为25-28%。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,酯化反应中,芴甲氧羰酰基半胱氨酸巯基三苯甲基与炔基醇、N,N’-二环己基二亚胺的摩尔比为1∶1-1.5∶1-2;所述反应温度为20-80℃,所述反应时间为8小时;
所述步骤1)中,酰胺化反应中,芴甲氧羰酰基半胱氨酸巯基三苯甲基与炔基胺、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1∶1.5-4∶0.9-1∶1-2∶1-3,优选1∶2∶0.9∶1∶2;所述反应温度为20-80℃,反应时间为1.5-6小时。
16.根据权利要求13-15任一所述的方法,其特征在于:所述有机溶剂为苯、N,N-二甲基甲酰胺或乙腈。
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