CN102936207B - 一种重要的生化试剂l-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的合成新方法 - Google Patents

一种重要的生化试剂l-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的合成新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重要的生化试剂L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的合成新方法，包括L-Leu-OH溶液在氢氧化钠作用下和BOC酸酐反应得到Boc-L-Leu-OH；Boc-L-Leu-OH和对硝基苯胺的吡啶溶液在三氯氧磷作用下缩合生成关键中间体Boc-L-Leu-pNA，该缩合方法新颖未见文献报道；Boc-L-Leu-pNA的冰乙酸溶液在氯化氢气体作用下生成Boc-L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐。该方法起始原料易得，反应步骤短，操作方便，收率高，成本低。

Description

一种重要的生化试剂L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的合成新方法
技术领域
本发明属生化试剂氨基酸对硝基苯胺领域，特别是涉及一种用于荧光肽酶底物的合成新方法。
背景技术：
氨基酸对硝基苯胺是一类很有价值并被广泛用于测定体液中蛋白水解酶活性的显色底物；L-亮氨酸-4-硝基苯胺是亮氨酸氨基肽酶底物；此外L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐还可作为重氮染料和硫化染料(如恶唑禾草灵、荧光增白剂KCB)的中间体。然而由于对硝基苯胺是很弱的亲核试剂，此类化合物的合成非常的困难收率很低。
但如今已知有许多制备关键中间体Boc-L-亮氨酸-4-硝基苯胺(Boc-L-Leu-pNA)的方法，由于对硝基苯胺的亲核活性很弱，用普通的缩合试剂如DCC，DCC/HOBt，或酸酐法进行直接缩合收率都很低(0-30％)。文献1：(Shioiri，Takayuki；Murata，Mitsuo；Hamada，Yasumasa；Chemical andPharmaceutical Bulletin；1987；35(7)；2698-2704)用了系列的改进后的缩合方法，然而效果依然不尽人意，该文献该法采用多种方法和缩合剂，出现有发生不反应或收率很低等结果，而且使用到剧毒试剂(如氯甲酸乙酯)此外用于合成的化学试剂很贵，成本较高(见table 1)。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种合成重要用作生化分析试剂及重氮染料和硫化染料(如恶唑禾草灵、荧光增白剂KCB)的中间体L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的新方法，本发明的制备工艺解决了对硝基苯胺活性弱，难于酰胺化的难点；该方法具有原料易得，操作简单，成本低等优点；该方法得到的目标化合物纯品L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐纯度达到98％以上，总收率在74％以上。
本发明的反应方程式如下：
本发明一种重要的生化试剂L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的合成新方法，包括：
(1)磁力搅拌下将氢氧化钠水溶液加入化合物L-亮氨酸2的二氧六环/水的混合溶液中，在冰水浴下，滴加BOC酸酐的二氧六环的混合溶液。反应完全后，经中和酸化，萃取，洗涤，干燥得到乙酸乙酯溶液。再经浓缩后得到化合物Boc-L-亮氨酸3的初品。该中间体不用进一步纯化直接用于下一步反应。
(2)机械搅拌下N2保护条件下中间体3及对硝基苯胺的吡啶溶液，冰盐浴下，滴加三氯氧磷。反应完全后将反应液缓慢倒入冰水中搅拌，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取三遍，有机相用NaHCO3水溶液水洗，再用饱和的氯化钠水溶液水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸干。初品经柱层析的到化合物Boc-L-亮氨酸-4-硝基苯胺4。
(3)将化合物4的冰乙酸溶液在冰水浴降温条件下缓慢通HCl气体。原料反应完全后将事先准备好的冷冻乙醚缓慢加入到反应瓶中，有白色固体析出，过滤，滤饼用冷冻乙醚漂洗三遍，室温下自然晾干得到化合物L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐1。
所述步骤(1)中的L-亮氨酸：氢氧化钠：boc酸酐的物质的量比例为1∶2：2～3；混合溶剂为二氧六环和水其比例为1∶1。
所述步骤(2)中的boc保护的L-亮氨酸中间体3：对硝基苯胺：三氯氧磷的物质的量比例为1∶1～5∶1～1.5；无水惰性保护气体条件，如氮气、氩气；溶剂为吡啶。
所述步骤(3)中的溶剂为冰乙酸，酸性气体为无水氯化氢气体。
本发明制备的生化试剂L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐可用于生化领域，主要用于生化分析。
本发明的第一步反应中间体3毛收率大于100％，纯度92％以上，外观为无色粘稠液体；第二步产物反应中间体4收率大于80％，纯度97％以上，外观为浅黄色胶状固体，第三步产物反应反应收率大于80％，产品纯度大于98％，外观为微黄色粉末状固体。
有益效果
(1)本发明的制备工艺具有原料易得，操作简单，成本低等优点；
(2)本发明的制备工艺克服了对硝基苯胺活性弱难于酰胺化的难点；
(3)该方法得到的目标化合物纯品L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐纯度达到98％以上，总收率在74％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限至本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
第一步反应：制备中间体3
磁力搅拌下于500mL四口烧瓶中加入化合物2(12.2g，93.1mmol，1eq)，二氧六环/水(60mL/60mL)，配置氢氧化钠(7.5g，210.4mmol，2eq)的165mL水溶液，将该溶液缓慢加入瓶中，温度变化不明显，待固体完全溶解后，冰水浴下，滴加BOC酸酐(42.6g，210.4mmol，2.26eq)与二氧六环(42mL)的混合溶液。滴完后室温继续反应。TLC监控原料反应完全后，用稀盐酸调节至酸性。反应液用乙酸乙酯萃取(200mL*3)。有机相用饱和的氯化钠溶液洗三遍(100mL*3)，硫酸钠干燥，减压浓缩得到21.8g无色粘稠液体中间体3。产率：101％(未提纯)；纯度：92.7％(HPLC)。该中间体不用纯化直接用于下一步反应。
第二步反应：制备中间体4
机械搅拌下于500ml四口瓶中加入中间体3(23g，107mmol，1eq)，吡啶(200mL)及对硝基苯胺(14.76g，107mmol，1eq)，N2保护条件下开始冰盐浴条件下，滴加三氯氧磷(20g，128.5mmol，1.2eq)，TLC监控，直到反应完全。将反应液缓慢倒入冰水(500mL)中搅拌10min，过滤，滤饼用少量的乙酸乙酯冲洗后弃去，滤液用乙酸乙酯(200mL*3)萃取三遍，有机相用5％的NaHCO3水溶液水洗两边，再用饱和的氯化钠水溶液水洗三遍，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸得到初品。初品经柱层析得到29g浅黄色胶状固体中间体4。产率：80％；纯度：97.2％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.42(s，1H)，8.09(d，J＝8.8Hz，2H)，7.61(d，Ｊ＝8.8Hz，2H)，5.07(d，J＝7.2Hz，1H)，4.13(s，1H)，1.81(m，3H)，1.47(s，9H)，0.96(dd，Ｊ＝6.0Hz，18Hz，6H)。
第三步反应：制备化合物1
磁力搅拌，室温下，于500mL四口瓶中分别加入化合物4(21.4g，64.2mmol，1.0eq)和100mL冰乙酸，在冰水浴降温条件下，缓慢通HCl气体至反应液中，反应1.5h后TLC监控，原料反应完全。将事用(50mL*3)的冷冻乙醚漂洗三遍，室温下自然晾干。得到13.7g微黄色粉末状固体化合物1。产率：80.5％；HPLC：98.02％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.70(bs，1H)，8.45(bs，2H)，8.24(m，2H)，7.95(m，2H)，4.14(m，1H)，1.70(m，3H)，0.92(m，6H)。

Claims (3)

1.一种生化试剂L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的合成方法，包括(1)磁力搅拌下将氢氧化钠水溶液加入化合物L-亮氨酸2的二氧六环/水的混合溶液中，在冰水浴下，滴加Boc酸酐的二氧六环的混合溶液；滴完后室温反应完全后，经中和酸化，萃取，洗涤，干燥得到乙酸乙酯溶液；再经浓缩后得到化合物Boc-L-亮氨酸3的初品，该中间体不用进一步纯化直接用于下一步反应；(3)将化合物4的冰乙酸溶液在冰水浴降温条件下缓慢通入HCl气体，原料反应完全后将事先准备好的冷冻乙醚缓慢加入反应瓶中，有白色固体析出，过滤，滤饼用冷冻乙醚漂洗三遍，室温下自然晾干得到化合物L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐1；其特征在于，还包括(2)机械搅拌下N2保护条件下中间体3及对硝基苯胺的吡啶溶液，冰盐浴下，滴加三氯氧磷，反应完全后将反应液缓慢倒入冰水中搅拌，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取三遍，有机相用NaHCO3水溶液水洗，再用饱和的氯化钠溶液水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸干，粗品经柱层析得到化合物Boc-L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐4。
2.根据权利要求1所述的一种重要的生化试剂L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的合成方法，其特征在于：所述步骤(1)中的L-亮氨酸∶氢氧化钠∶boc酸酐的物质的量比例为1∶2∶2～3；混合溶剂为二氧六环和水其比例为1∶1。
3.根据权利要求1所述的一种重要的生化试剂L-亮氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的合成方法，其特征在于：所述步骤(2)中的boc-L-亮氨酸∶对硝基苯胺∶三氯氧磷的物质的量比例为1∶1～5∶1～1.5。
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